CN114732957B - 一种具有预应力的矿化肌腱复合材料及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有预应力的矿化肌腱复合材料及其制备方法与应用，所述矿化肌腱复合材料由胶原纤维和矿物复合得到，所述胶原纤维纵向并列有序排列，片状的矿物纳米颗粒沿胶原纤维纵向有序排列形成晶体，并且矿物纳米颗粒在并列有序排列的胶原纤维内部紧密填充。本发明提供的矿化肌腱复合材料内胶原纤维有序排列，碳酸钙矿物在胶原纤维内部沿其长轴方向定向沉积，得到预应力增韧高性能复合材料，该复合材料在人工骨领域有潜在的应用价值。

Description

一种具有预应力的矿化肌腱复合材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于含有大分子基质的复合材料技术领域，特别涉及一种具有预应力的矿化肌腱复合材料及其制备方法与应用。
背景技术
生物矿物因其优异的机械性能和室温形成过程而受到广泛关注。目前的主流观点认为矿物的高机械性能来自于他们独特的等级结构、组分设计、界面结合等。除此之外，生物矿物中预应力的存在和作用被逐渐发现，并认为对其机械性能有增强作用。最近，研究人员发现海星背腕板中单个棱镜虽然是单晶方解石，但是内部依然包含很多5nm的方解石纳米颗粒，且富含镁离子。富镁区域的纳米颗粒因较小的晶格参数导致自身受到拉伸力，而宿主晶体会受到相反的压缩力，进而提高了棱镜的断裂韧性。在口足类动物表皮中也发现其主要成分几丁质处于压缩状态。通过对比原始表皮、去除矿物的表皮以及去除矿物和蛋白的表皮，发现原始表皮中几丁质的压缩应变约0.10％，相应的预压应力约20MPa。目前生物矿物中预应力产生的原因还无法得知。
牙本质与骨骼这类矿物组织中含有大量的矿化胶原纤维。胶原纤维直径100～200nm，其内部由300nm长原胶原分子以1/4错位排列的方式组装而成，因此具有67nm的周期性结构，其中27nm的重叠区域与40nm的空缺区域沿纤维长轴交替排列。胶原纤维内部独特的空间能容纳片状羟基磷灰石晶体在其内部取向排列。通过同步辐射X射线衍射分析人牙本质中羟基磷灰石晶体沿(002)面的应变，发现晶体的压缩应变约0.08％。因为羟基磷灰石弹性模量E＝114GPa，换算后牙本质内晶体的压缩应力约90MPa。目前，具有预应力的人工胶原矿化材料尚未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种具有预应力的矿化肌腱复合材料及其制备方法与应用。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
提供一种具有预应力的矿化肌腱复合材料，所述矿化肌腱复合材料由胶原纤维和矿物复合得到，所述胶原纤维纵向并列有序排列，片状的矿物纳米颗粒沿胶原纤维纵向有序排列形成晶体，并且矿物纳米颗粒在并列有序排列的胶原纤维内部紧密填充。
按上述方案，所述矿化肌腱复合材料内矿物的质量百分含量为60～90％，矿化肌腱复合材料的表观压缩应力为0.7～5.0MPa。
按上述方案，所述胶原纤维直径为100～200nm。与矿物复合后直径增加至400～600nm。
按上述方案，所述矿物为碳酸钙，所述矿物纳米颗粒尺寸为30～50nm。
按上述方案，所述矿化肌腱复合材料由火鸡腿中提取的肌腱经过预处理和切片制样后在矿化溶液中进行矿化反应得到。
本发明还提供上述具有预应力的矿化肌腱复合材料的制备方法，具体步骤如下：
1)肌腱的预处理：用刀片切开火鸡的鸡腿，取出鸡腿中的肌腱并选取未矿化的部分，用氯化钠溶液和丙酮反复清洗以去除脂肪，然后在室温下保存于丙酮中，待用；
2)制备肌腱切片样品：将步骤1)预处理后的肌腱切成肌腱小条，用纯水冲洗(除去丙酮)，然后将所得肌腱小条放入塑料模具中，接着将树脂包埋剂慢慢注入塑料模具中，直至完全包裹肌腱小条，再将所得肌腱嵌入的树脂固定在金属板上，沿肌腱长轴方向冷冻切片得到肌腱切片样品；
3)合成矿化肌腱复合材料：用蠕动泵将含Na2CO3和NaCl的溶液A缓慢滴入含CaCl2的溶液B中，得到矿化溶液，用NaOH溶液调节矿化溶液pH值至9.0～9.5，将步骤2)所得肌腱切片样品浸泡于矿化溶液中进行矿化，矿化结束后取出样品用去离子水冲洗、室温干燥后得到矿化肌腱复合材料。
按上述方案，步骤1)所述肌腱来自20～25周龄的火鸡鸡腿。
按上述方案，步骤1)所述氯化钠溶液的浓度为0.1～0.2M(mol/L)，步骤1)用氯化钠溶液和丙酮清洗次数为3～5次。
按上述方案，步骤2)所述肌腱小条长度为10～20mm；步骤2)纯水冲洗次数为3～5次。
按上述方案，步骤2)所述塑料模具的尺寸为长20～30mm，宽2～3mm，深度2～3mm。
按上述方案，步骤2)所述树脂包埋剂为OCT包埋剂。
按上述方案，步骤2)所述肌腱切片样品厚度为40～200μm，长度为10～20mm，宽度为800～2000μm。
按上述方案，步骤3)所述溶液A中Na2CO3的浓度为10～20mM(mmol/L)，NaCl的浓度为150～300mM。
按上述方案，步骤3)所述溶液B中还含有HEPES缓冲液和PAA(聚丙烯酸，其数均分子量为5000～340W)，溶液B中CaCl2的浓度为10～20mM，HEPES缓冲液的浓度为10～20mM，PAA的浓度为100～400μg/mL。PAA的加入能够使碳酸钙形成无定形相，无定形相的碳酸钙进入胶原纤维内部矿化形成有序结构的碳酸钙晶体。
按上述方案，步骤3)蠕动泵滴加速率为2～3mL/min。
按上述方案，步骤3)所述溶液A中的CO3 2-与溶液B中Ca2+的摩尔比为1：1。矿化溶液中Ca2+和CO3 2-的最终浓度为5～10mM。
按上述方案，步骤3)所述NaOH溶液浓度为1～2M。
按上述方案，步骤3)所述矿化的工艺条件为：20～35℃下静置20～26h。
按上述方案，步骤3)去离子水冲洗次数为3～5次。
本发明还包括上述矿化肌腱复合材料在人工骨方面的应用。
本发明所述的矿化肌腱复合材料在矿化过程中矿物纳米颗粒在胶原纤维内部生长，该过程会导致胶原纤维分子构型的变化，使得纵向并列有序排列的胶原纤维分子收缩，进而将收缩应力传递至矿物晶体，使其处于压缩应力状态，储存预应力。
本发明的有益效果在于：1、本发明提供的矿化肌腱复合材料内胶原纤维有序排列，碳酸钙矿物在胶原纤维内部沿其长轴方向定向沉积，得到预应力增韧高性能复合材料，该复合材料在人工骨领域有潜在的应用价值；2、本发明提供的制备方法步骤简单，反应条件温和，有利于量化生产。
附图说明
图1为本发明对比例1所制备的矿化肌腱复合材料的初始矿化状态下(a)和矿化24小时后(b)的光学显微镜图、扫描电镜图(c)和矿化过程中产生收缩应力随时间变化曲线图(d)；
图2为对比例2所制备的矿化肌腱复合材料的初始矿化状态下(a)和矿化24小时后(b)的光学显微镜图、扫描电镜图(c)和矿化过程中产生收缩应力随时间变化曲线图(d)；
图3为对比例3所制备的矿化肌腱复合材料的初始矿化状态下(a)和矿化24小时后(b)的光学显微镜图、扫描电镜图(c)和矿化过程中产生收缩应力随时间变化曲线图(d)；
图4为实施例1所制备的矿化肌腱复合材料的初始矿化状态下(a)和矿化24小时后(b)的光学显微镜图、和矿化过程中产生收缩应力随时间变化曲线图(c)；
图5为实施例1中矿化24小时后矿化肌腱复合材料的扫描电镜图(a)和单根矿化胶原破碎区域的扫描电镜图(b)、X射线衍射图谱(c)和热重曲线(d)；
图6为实施例2所制备的矿化肌腱复合材料的初始矿化状态下(a)和矿化24小时后(b)的光学显微镜图、和矿化过程中产生收缩应力随时间变化曲线图(c)；
图7为实施例3所制备的矿化肌腱复合材料的初始矿化状态下(a)和矿化24小时后(b)的光学显微镜图、和矿化过程中产生收缩应力随时间变化曲线图(c)。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
本发明实施例所用PAA数均分子量为24W；所用火鸡的鸡腿来自20～25周龄的火鸡。
对比例1
一种去离子水中矿化的肌腱材料，具体制备步骤如下：
1)肌腱的预处理：用刀片切开火鸡的鸡腿，取出鸡腿中的肌腱并选取未矿化的部分，用0.1M氯化钠溶液和丙酮反复清洗3次以去除脂肪，然后在室温下保存于丙酮中，待用；
2)制备肌腱切片样品：首先将肌腱切成12mm的肌腱小条，用纯水冲洗3次，然后将这些肌腱小条放入尺寸为长20mm、宽2mm、深2mm的塑料模具中，接着将OCT包埋剂慢慢注入塑料模具中，直至完全包裹肌腱小条，再将所得肌腱嵌入的树脂固定在金属板上，沿肌腱长轴方向冷冻切片得到肌腱切片样品，样品的厚度为40μm，长度为12mm，宽度为800μm；
3)将步骤2)所得肌腱切片样品浸泡在去离子水中，静置24h后，取出样品，室温干燥后得到最终产物。
图1为本对比例所制备的肌腱样品的光学显微镜照片、扫描电镜图(c)和矿化过程中产生收缩应力随时间变化曲线图(d)，由图可知，初始状态下的肌腱(a)和在去离子水中浸泡24小时后的肌腱(b)在光学显微镜下观察形貌基本一致，从扫描电镜的结果可以看出基本为未矿化的状态，力学测试结果也显示无压缩应力生成，说明肌腱在去离子水中浸泡24小时并未发生矿化反应。
对比例2
一种氯化钠溶液中矿化的肌腱材料，具体制备步骤如下：
1)肌腱的预处理及储存：用刀片切开火鸡的鸡腿，取出鸡腿中的肌腱并选取未矿化的部分，用0.2M氯化钠溶液和丙酮反复清洗3次以去除脂肪，然后在室温下保存于丙酮中，待用；
2)制备肌腱切片样品：首先将肌腱切成16mm的肌腱小条，用纯水冲洗3次，然后将这些肌腱小条放入尺寸为长20mm、宽2mm、深2mm的塑料模具中，接着将OCT包埋剂慢慢注入塑料模具中，直至完全包裹肌腱小条，再将所得肌腱嵌入的树脂固定在金属板上，沿肌腱长轴冷冻切片得到肌腱切片样品，样品的厚度为120μm，长度为16mm，宽度为1500μm；
3)将步骤2)所得肌腱切片样品浸泡在150mM的氯化钠溶液中，静置24h后，取出样品，用去离子水冲洗3次，室温干燥后得到最终产物。
图2为本对比例所制备的肌腱样品的光学显微镜照片、扫描电镜图(c)和矿化过程中产生收缩应力随时间变化曲线图(d)，由图可知，初始状态下的肌腱(a)和在150mM氯化钠溶液中浸泡24小时后的肌腱(b)在光学显微镜下观察形貌基本一致，从扫描电镜的结果可以看出基本为未矿化的状态，力学测试结果也显示无压缩应力生成，说明肌腱在150mM氯化钠溶液中浸泡24小时并未发生矿化反应。
对比例3
一种矿化肌腱材料，具体制备步骤如下：
1)肌腱的预处理及储存：用刀片切开火鸡的鸡腿，取出鸡腿中的肌腱并选取未矿化的部分，用0.2M氯化钠溶液和丙酮反复清洗5次以去除脂肪，然后在室温下保存于丙酮中，待用；
2)制备肌腱切片样品：首先将肌腱切成18mm的肌腱小条，用纯水冲洗5次，然后将这些肌腱小条放入尺寸为长30mm、宽3mm、深3mm的塑料模具中，接着将OCT包埋剂慢慢注入塑料模具中，直至完全包裹肌腱小条，再将所得肌腱嵌入的树脂固定在金属板上，沿肌腱长轴冷冻切片得到肌腱切片样品，样品的厚度为200μm，长度为18mm，宽度为2000μm；
3)合成矿化肌腱复合材料：用蠕动泵以2mL/min的速率将25mL溶液A(含20mM的Na2CO3和150mM的NaCl)缓慢滴入25mL溶液B(含20mM的CaCl2，10mM的HEPES缓冲液)中，得到矿化溶液(Ca2+和CO3 2-达到10mM)，用NaOH溶液(1M)调节矿化溶液pH值至9.0，将步骤2)所得肌腱切片样品浸泡于pH值为9.0的矿化溶液中，室温矿化24小时后取出样品用去离子水冲洗3次，最后室温干燥得到矿化肌腱材料。
图3为本对比例所制备的肌腱材料样品的光学显微镜照片、扫描电镜图(c)和矿化过程中产生收缩应力随时间变化曲线图(d)，由图可知，在光学显微镜下观察肌腱形貌，初始状态下的肌腱(a)表面覆盖了少许矿物，矿化24小时后的肌腱(b)表面覆盖了较多的矿物，从扫描电镜的结果可以看出肌腱表面有矿物沉淀，但胶原纤维基本为未矿化的状态，力学测试结果也显示无压缩应力生成，说明肌腱在无PAA的矿化液中浸泡24小时并未发生矿化反应。
实施例1
一种矿化肌腱复合材料，其制备方法步骤如下：
1)肌腱的预处理及储存：用刀片切开火鸡的鸡腿，取出鸡腿中的肌腱并选取未矿化的部分，用0.1M氯化钠溶液和丙酮反复清洗3次以去除脂肪，然后在室温下保存于丙酮中，待用；
2)制备肌腱切片样品：首先将肌腱切成12mm的肌腱小条，用纯水冲洗3次，然后将这些肌腱小条放入尺寸为长20mm、宽2mm、深2mm的塑料模具中，接着将OCT包埋剂慢慢注入塑料模具中，直至完全包裹肌腱小条，再将所得肌腱嵌入的树脂固定在金属板上，沿肌腱长轴冷冻切片得到肌腱切片样品(-20～-40℃冷冻20min～1h后切片)，样品的厚度为40μm，长度为12mm，宽度为800μm；
3)合成矿化肌腱复合材料：用蠕动泵以2mL/min的速率将25mL溶液A(含20mM的Na2CO3和150mM的NaCl)缓慢滴入25mL溶液B(含20mM的CaCl2，10mM的HEPES缓冲液和400μg/mL的PAA)中，得到矿化溶液(Ca2+和CO3 2-达到10mM)，用NaOH溶液(1.5M)调节矿化溶液pH值至9.0，将步骤2)所得肌腱切片样品浸泡于pH值为9.0的矿化溶液中，室温矿化24小时后取出样品用去离子水冲洗3次，最后室温干燥得到矿化肌腱复合材料。
图4为本实施例所制备的肌腱样品的光学显微镜照片、和矿化过程中产生收缩应力随时间变化曲线图(c)，由图可知，在光学显微镜下观察肌腱形貌，初始状态下的肌腱(a)表面无矿化现象，矿化24小时后的肌腱(b)表面覆盖了很多矿物，力学测试结果显示有压缩应力随矿化时间的增加逐渐生成，肌腱在矿化液中反应24小时产生了5.0MPa的压缩应力。
图5为本实施例中矿化24小时后矿化肌腱复合材料的扫描电镜图(a)和单根矿化胶原破碎区域的扫描电镜图(b)、X射线衍射图谱(c)和热重曲线(d)，可以看出肌腱中的胶原纤维仍然保持纵向有序排列，单根胶原纤维直径约为600nm(未矿化的原始肌腱中单根胶原纤维直径为100～200nm)，且内部被结晶的矿物填充，片状的碳酸钙颗粒尺寸约30～50nm，晶体为球文石相。本实施例制备的矿化肌腱复合材料中矿物含量约74wt％。
实施例2
一种矿化肌腱复合材料，具体制备步骤如下：
1)肌腱的预处理及储存：用刀片切开火鸡的鸡腿，取出鸡腿中的肌腱并选取未矿化的部分，用0.2M氯化钠溶液和丙酮反复清洗3次以去除脂肪，然后在室温下保存于丙酮中，待用；
2)制备肌腱切片样品：首先将肌腱切成16mm的肌腱小条，用纯水冲洗3次，然后将这些肌腱小条放入尺寸为长20mm、宽2mm、深2mm的塑料模具中，接着将OCT包埋剂慢慢注入塑料模具中，直至完全包裹肌腱小条，再将所得肌腱嵌入的树脂固定在金属板上，沿肌腱长轴冷冻切片得到肌腱切片样品，样品的厚度为120μm，长度为16mm，宽度为1500μm；
3)合成矿化肌腱复合材料：用蠕动泵以3mL/min的速率将25mL溶液A(含20mM的Na2CO3和300mM的NaCl)缓慢滴入25mL溶液B(含20mM的CaCl2，20mM的HEPES缓冲液和400μg/mL的PAA)中，得到矿化溶液，用NaOH溶液(2M)调节矿化溶液pH值至9.25，将步骤2)所得肌腱切片样品浸泡于pH值为9.25的矿化溶液中，室温矿化24小时后取出样品用去离子水冲洗3次，最后室温干燥得到矿化肌腱复合材料。
图6为本实施例所制备的肌腱样品的光学显微镜照片和矿化过程中产生收缩应力随时间变化曲线图(c)，由图可知，在光学显微镜下观察肌腱形貌，初始状态下的肌腱(a)表面无矿化现象，矿化24小时后的肌腱(b)表面覆盖了较多矿物，力学测试结果显示有压缩应力随矿化时间的增加逐渐生成，肌腱在矿化液中反应24小时产生了2.2MPa的压缩应力。
实施例3
一种矿化肌腱复合材料，具体制备步骤如下：
1)肌腱的预处理及储存：用刀片切开火鸡的鸡腿，取出鸡腿中的肌腱并选取未矿化的部分，用0.2M氯化钠溶液和丙酮反复清洗5次以去除脂肪，然后在室温下保存于丙酮中，待用；
2)制备肌腱切片样品：首先将肌腱切成18mm的肌腱小条，用纯水冲洗5次，然后将这些肌腱小条放入尺寸为长30mm、宽3mm、深3mm的塑料模具中，接着将OCT包埋剂慢慢注入塑料模具中，直至完全包裹肌腱小条，再将所得肌腱嵌入的树脂固定在金属板上，沿肌腱长轴冷冻切片得到肌腱切片样品，样品的厚度为200μm，长度为18mm，宽度为2000μm；
3)合成矿化肌腱复合材料：用蠕动泵以3mL/min的速率将25mL溶液A(含10mM的Na2CO3和300mM的NaCl)缓慢滴入25mL溶液B(含10mM的CaCl2，20mM的HEPES缓冲液和400μg/mL的PAA)中，得到矿化溶液(Ca2+和CO3 2-达到5mM)，用NaOH溶液(1M)调节矿化溶液pH值至9.0，将步骤2)所得肌腱切片样品浸泡于pH值为9.0的矿化溶液中，室温矿化24小时后取出样品用去离子水冲洗3次，最后室温干燥得到矿化肌腱复合材料。
图7为本实施例所制备的肌腱样品的光学显微镜照片和矿化过程中产生收缩应力随时间变化曲线图(c)，由图可知，在光学显微镜下观察肌腱形貌，初始状态下的肌腱(a)表面无矿化现象，矿化24小时后的肌腱(b)表面覆盖了较少矿物，力学测试结果显示有压缩应力随矿化时间的增加逐渐生成，肌腱在矿化液中反应24小时产生了0.7MPa的压缩应力。

Claims (10)

1.一种具有预应力的矿化肌腱复合材料，其特征在于，所述矿化肌腱复合材料由胶原纤维和矿物复合得到，所述胶原纤维纵向并列有序排列，片状的矿物纳米颗粒沿胶原纤维纵向有序排列形成晶体，并且矿物纳米颗粒在并列有序排列的胶原纤维内部紧密填充；
其制备方法具体步骤如下：
1）肌腱的预处理：用刀片切开火鸡的鸡腿，取出鸡腿中的肌腱并选取未矿化的部分，用氯化钠溶液和丙酮反复清洗以去除脂肪，然后在室温下保存于丙酮中，待用；
2）制备肌腱切片样品：将步骤1）预处理后的肌腱切成肌腱小条，用纯水冲洗，然后将所得肌腱小条放入塑料模具中，接着将树脂包埋剂慢慢注入塑料模具中，直至完全包裹肌腱小条，再将所得肌腱嵌入的树脂固定在金属板上，沿肌腱长轴方向冷冻切片得到肌腱切片样品；
3）合成矿化肌腱复合材料：用蠕动泵将含Na2CO3和NaCl的溶液A缓慢滴入含CaCl2的溶液B中，得到矿化溶液，用NaOH溶液调节矿化溶液pH值至9.0~9.5，将步骤2）所得肌腱切片样品浸泡于矿化溶液中进行矿化，矿化结束后取出样品用去离子水冲洗、室温干燥后得到矿化肌腱复合材料。
2.根据权利要求1所述的矿化肌腱复合材料，其特征在于，所述矿化肌腱复合材料内矿物的质量百分含量为60~90%，矿化肌腱复合材料的表观压缩应力为0.7~5.0MPa。
3.根据权利要求1所述的矿化肌腱复合材料，其特征在于，所述矿物为碳酸钙，所述矿物纳米颗粒尺寸为30~50nm。
4.一种权利要求1-3任一项所述的矿化肌腱复合材料的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）肌腱的预处理：用刀片切开火鸡的鸡腿，取出鸡腿中的肌腱并选取未矿化的部分，用氯化钠溶液和丙酮反复清洗以去除脂肪，然后在室温下保存于丙酮中，待用；
2）制备肌腱切片样品：将步骤1）预处理后的肌腱切成肌腱小条，用纯水冲洗，然后将所得肌腱小条放入塑料模具中，接着将树脂包埋剂慢慢注入塑料模具中，直至完全包裹肌腱小条，再将所得肌腱嵌入的树脂固定在金属板上，沿肌腱长轴方向冷冻切片得到肌腱切片样品；
3）合成矿化肌腱复合材料：用蠕动泵将含Na2CO3和NaCl的溶液A缓慢滴入含CaCl2的溶液B中，得到矿化溶液，用NaOH溶液调节矿化溶液pH值至9.0~9.5，将步骤2）所得肌腱切片样品浸泡于矿化溶液中进行矿化，矿化结束后取出样品用去离子水冲洗、室温干燥后得到矿化肌腱复合材料。
5.根据权利要求4所述的矿化肌腱复合材料的制备方法，其特征在于，步骤1）所述肌腱来自20~25周龄的火鸡鸡腿；步骤1）所述氯化钠溶液的浓度为0.1~0.2 M，步骤1）用氯化钠溶液和丙酮清洗次数为3~5次。
6.根据权利要求4所述的矿化肌腱复合材料的制备方法，其特征在于，步骤2）所述肌腱小条长度为10~20mm；步骤2）纯水冲洗次数为3~5次；步骤2）所述树脂包埋剂为OCT包埋剂；步骤2）所述肌腱切片样品厚度为40~200 μm，长度为10~20 mm，宽度为800~2000 μm。
7.根据权利要求4所述的矿化肌腱复合材料的制备方法，其特征在于，步骤3）所述溶液A中Na2CO3的浓度为10~20mM，NaCl的浓度为150~300 mM。
8.根据权利要求4所述的矿化肌腱复合材料的制备方法，其特征在于，步骤3）所述溶液B中还含有HEPES缓冲液和聚丙烯酸，所述聚丙烯酸数均分子量为5000~340W，溶液B中CaCl2的浓度为10~20 mM，HEPES缓冲液的浓度为10~20 mM，PAA的浓度为100~400μg/mL；步骤3）蠕动泵滴加速率为2~3 mL/min。
9.根据权利要求4所述的矿化肌腱复合材料的制备方法，其特征在于，步骤3）所述溶液A中的CO3 2-与溶液B中Ca2+的摩尔比为1：1；步骤3）所述NaOH溶液浓度为1~2 M；步骤3）所述矿化的工艺条件为：20~35℃下静置20~26h。
10.权利要求1-3任一项所述的矿化肌腱复合材料在制备人工骨方面的应用。
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