CN107596382A - 一种兼具抑瘤和骨缺损修复的层层自组装体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种兼具边缘组织抑瘤治疗和瘤性骨缺损修复双重功效的层层自组装体及其制备方法，属于生物医用材料领域。采用层层自组装技术通过静电作用逐层交替构建了一个促粘附和成骨阴离子融合蛋白(rFN/CDH)仿生修饰兼有载抗肿瘤药紫杉醇的5β‑胆烷酸化乙二醇壳聚糖阳离子纳米粒(HGC‑PTX)的微纳米级双相钙磷陶瓷(BCP)界面。该结构具有理想的生物相容性和较好的亲水性等物理化学属性，并保持了HGC‑PTX纳米粒的抗癌作用和rFN/CDH蛋白质良好的促粘附促成骨活性，有望成为具有光明前景的抑瘤和骨修复材料。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，特别涉及组织工程骨修复领域。
背景技术
骨是成人难以再生的组织之一，某些暗示骨坏死的创伤、肿瘤、感染迫使外科医生切除被影响的骨，创建一个缺口从而消除受损的组织。骨肉瘤是好发于青少年的一种严重影响个人和社会的恶性肿瘤，分化低、转移早、致残致死率极高。尽管当前放/化疗、瘤段骨切除+灭活回植、肿瘤型关节假体、甚至截肢等多种治疗手段，但治疗远期效果仍不乐观。统计显示，即使经过积极的辅助化疗和外科手术，术后5年生存率仅60-70％，更甚于30-50％的患者在术后出现复发。此外，肿瘤切除造成的位于骨端(尤其关节周围)的瘤区缺损的修复重建仍是医学工作者面临的极大挑战。究其原因：1.异体骨移植、骨水泥充填等可暂时消除瘤骨缺损遗留的残腔，但术后早期即可出现骨吸收、病理骨折等严重并发症；2.根治性手术难以达到间室外“整块”切除，潜伏于血循环、肿瘤边缘组织内的卫星病灶易导致肿瘤复发和转移。
传统采用的自体骨移植仍是目前公认的金标准和主流治疗方法，然而，由于其有限的可用移植材料和因额外获取自体骨移植材料手术引发的并发症等原因，使其难以达到规模化和标准化使用。而作为一种替代措施，尽管异体骨移植较好的解决了取材有限的难题，但其仍然存在免疫原性不确定和疾病传播的可能性，故其使用亦受到限制。骨组织工程有望成为一种可以成功替代而被广泛接受的疗法，而寻找可替代的人工骨修复材料也成为组织修复和再生医学的一个重要目标。近年来随着组织工程学和纳米材料技术的发展，利用组织工程原理与纳米材料技术来构建一种理想的生物活性植骨材料即纳米材料组织工程骨，正在成为跨学科并处于国际前沿的研究热点与方向。
乙二醇壳聚糖是壳聚糖的衍生物，通过在壳聚糖的C6位的OH进行醚化反应使其在任何pH值的水溶液中都能溶解，改善了一些两亲性壳聚糖衍生物在pH7.4的生理环境中难以溶解的缺点，并具有壳聚糖的低毒、生物相容性好、可降解等特性。壳聚糖是迄今为止发现的唯一一种天然聚阳离子碱性多糖，有抑制细菌活性、消炎、控制高血压及免疫调节等生理活性，可以促进伤口愈合和组织修复，主要应用于新型伤口敷料和组织工程方面。5β-胆烷酸是胆酸去掉其C3，7，12位的三个羟基得到的衍生物，胆酸是存在于人体内的一种天然双亲分子，属甾类化合物，具有高度的生物活性和生物相容性。将5β-胆烷酸通过酰胺反应连接到乙二醇壳聚糖上，得到疏水改性的乙二醇壳聚糖衍生物，该两亲性衍生物合成条件温和简便，在水溶液中可自发形成纳米胶束，可装载疏水性药物，具有良好的生物相容和可降解性。其疏水内核可以实现对疏水分子的包覆，胶束的粒径、药物包覆效率及载药量、体内外释药行为均可通过改变亲疏水基团的比例加以调控。
双相钙磷陶瓷(BCP)属生物活性陶瓷，研究发现当HA/β-TCP双相钙磷陶瓷中的HA成分多于或等于β-TCP时，表现出较好的成骨性能。以磷酸钙为代表的生物陶瓷因其优良的组织相容性、表面可塑性、修饰仿生性和生物降解特性，成为颇具前景的骨修复材料，而基于磷酸钙的纳米颗粒亦得以开发应用于药物载体系统。
整合素是由α和β两类亚型组成的膜蛋白，通过细胞外区与细胞外基质(ECM)结合，又通过细胞内区连接细胞内信号分子和骨系统架，完成特定的细胞内外生物物理和生物化学信息交换。成骨细胞、骨祖细胞可表达多种整合素，包括α1β1，α2β1，α3β1，α4β1，α5β1，α6β1，α8β1和αvβ3。骨组织中大量表达层粘连蛋白、I型胶原、骨桥蛋白(OPN)和纤维连接蛋白，整合素β1亚家族成员特异性地与这些分子结合，从而使肿瘤细胞向骨组织归巢。其中α5β1和αvβ3为FN的受体，可介导细胞识别RGD序列，在成骨细胞生存、增殖、成骨基因表达、基质矿化等过程中发挥重要作用。
纤维连接蛋白(fibronectin，FN)是一种以二聚体形式存在于血浆、体液等细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)中的糖蛋白，主要功能涉及细胞迁移/粘附、创面愈合、胚胎形成、血液凝固等病理/生理过程。作为ECM的主要构成分子之一，纤维连接蛋白(fibronectin，FN)与αvβ3和α5β1整合素发生特异性作用的关键位点是位于3号域7-10位点的RGD(精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸)序列(FNIII7-10)。研究表明：FN是成骨发生过程中表达量最高的一种ECM蛋白，且其与成骨细胞的结合效率明显高于其他ECM蛋白，此现象揭示了FN是成骨的正相关因子或协同因子，因此FN成为目前组织工程中最为常用的促粘靶点之一。
钙粘附蛋白(Cadherin，CDH)是一种钙离子依赖的、主要参与细胞间连接，为多种细胞间通讯提供桥梁结构的通讯分子。CDH11，又称成骨细胞特异性CDH(osteoblasticcadherin，OB-CDH)，是特异表达与成骨细胞表面的一种CDH的亚型分子，其可通过“同嗜”效应，介导骨形成/维持微环境中不同种骨细胞，如成骨细胞、破骨细胞、巨噬细胞等的相互通讯和对话，进而发挥生物学作用。一般来说，当钙粘附蛋白激活或正常表达时，细胞尤其是上皮细胞间正常连接不受扰乱，仅仅是钙粘附蛋白受到抑制时，细胞才能从粘附的束缚中脱离并从原位迁移。因此，钙粘附蛋白活性的抑制能激发肿瘤细胞的释放，这在钙粘附蛋白基因受抑制或钙粘附蛋白分子功能缺失时发生，肿瘤转移的发生率的高低也与钙粘附蛋白的表达有关。
rFN/CDH(双嗜性分子重组纤维连接蛋白/钙粘附蛋白)是以FN和CDH11作为前体分子，通过基因拼接，融合得到的新型蛋白，它能显著地增强骨髓间充质干细胞的粘附、增殖和分化的能力(rFN/CDH制备方法详见国家发明专利，“纤连蛋白与钙粘附蛋白-11的融合蛋白，制备方法及应用”，专利号：ZL200910103100.6)。
当前再生医学领域中越来越要求生物材料界面具备良好的生物活性和生物功能，该领域的一个显著的研究进展就是开发仿生材料。这种仿生材料的特征就是植入物表面能够更好地模拟天然骨组织细胞外基质，并在特定的化学刺激缺乏的情况下能够刺激干细胞朝成骨方向分化。研究表明这种仿生策略是促使生物材料具备骨诱导特征的最有效的技术之一。该策略是在生物材料表面以精确的方式加入骨再生因子(如相关细胞外基质蛋白质、生长因子和人工肽等)。这些方式包括被动吸附、共价交联等。但是，这些方式也有许多不足之处。如需要大量蛋白质才能发挥有效的生物学功能；交联可能引起蛋白质聚集、变性、分布不均等。与这些方法相比较，层层自组装技术(Layer-by-layer assembly technique，LBL)是一种新的方式。
层层自组装技术是指以分子间的静电引力、氢键、共价键、配位键、电荷转移等为驱动力，将聚电解质逐层沉积到基质表面，重复数次得到多层膜结构。1966年，Iler首次尝试将带相反电荷的胶体粒子交替吸附在玻璃片表面，形成厚度可控的多层薄膜。1991年，Decher等人在此基础上提出了由带相反电荷的聚电解质在液/固界面通过静电作用层层交替沉积形成多层膜的新技术。静电作用是LBL技术制备多层复合薄膜材料最常见的驱动力，它利用表面带有相反电荷的不同电解质间相互交替吸附沉积，从而在基片上形成具有特定厚度的多层复合薄膜。
针对骨肉瘤的瘤性骨缺损修复和边缘组织的抑瘤治疗问题，本发明提供了一种兼具边缘组织抑瘤治疗和瘤性骨缺损修复双重功效的层层自组装体的制备方法，采用层层自组装技术构建了促粘附和成骨蛋白(rFN/CDH)仿生修饰兼有载抗肿瘤药紫杉醇的5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖纳米粒(HGC-PTX)的微纳米级双相钙磷陶瓷(BCP)界面，成功地将多聚阴离子蛋白质和多聚阳离子载药纳米粒通过静电作用交替构建了一个BCP-PEI-(rFN/CDH-PTX/HGC)n-rFN/CDH的精确多层结构。该结构具有理想的生物相容性和较好的亲水性等物理化学属性，并保持了HGC-PTX纳米粒的抗癌作用和rFN/CDH蛋白质良好的促粘附促成骨活性，有望成为具有光明前景的抑瘤和骨修复材料。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种兼具边缘组织抑瘤治疗和瘤性骨缺损修复双重功效的层层自组装体的制备方法，该方法采用层层自组装技术构建了促粘附和成骨蛋白(rFN/CDH)仿生修饰兼有载抗肿瘤药紫杉醇的5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖纳米粒(HGC-PTX)的微纳米级双相钙磷陶瓷(BCP)陶瓷界面，成功地将多聚阴离子蛋白质和多聚阳离子载药纳米粒通过静电作用逐层交替构建了一个BCP-PEI-(rFN/CDH-PTX/HGC)n-rFN/CDH的精确多层结构。自组装体系对紫杉醇的释放和界面上rFN/CDH的成骨效应之间存在1-2周的“窗口期”(紫杉醇一周内即可完成85％释放)，而成骨细胞的粘附和矿化行为发生于3周以后。此窗口期的存在有益于紫杉醇的降解以减少其对成骨细胞活力和成骨能力的抑制，以此可期望协调抗肿瘤和抗成骨之间的矛盾。其作用机制在于：1.通过EPR效应和特异性配受体作用(rFN/CDH-αvβ3整合素)，对循环系统和肿瘤间室外的残存肿瘤细胞实现募集，达到局部高浓度紫杉醇对肿瘤细胞的靶向杀伤2.通过rFN/CDH对成骨细胞、骨祖细胞的高效粘附促进材料-机体骨之间的骨性愈合。
本发明的另一目的在于提供了一种载抗肿瘤药的5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖纳米粒的制备方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案包括如下步骤：(1)阳离子5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载抗癌药纳米粒的制备(2)双相钙磷陶瓷基材的预处理(3)具有促粘附和促成骨作用的阴离子蛋白质水溶液的配制(4)阳离子5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载抗癌药纳米粒水溶液的配制(5)层层自组装体的制备。
所述步骤(1)中阳离子5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖的乙二醇壳聚糖分子量为82000-85000。
进一步，5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖中疏水取代基5β-胆烷酸的取代度为0.2-15％，优选取代度为4-6％。
所述步骤(1)中5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载抗癌药纳米粒中抗癌药为金属铂络合物类、紫杉烷类、喜树碱类、长春碱类、叶酸拮抗剂类、嘌呤拮抗剂类、嘧啶拮抗剂类、氮芥类、蒽醌类、鬼臼素类抗肿瘤药中的任一种，优选顺铂、阿霉素、紫杉醇。
所述步骤(2)中双相钙磷陶瓷基材由羟基磷灰石和β-磷酸三钙组成，且羟基磷灰石成分多于或等于β-磷酸三钙，优选由60％羟基磷灰石和40％β-磷酸三钙组成，多孔孔隙率60％-70％，大孔直径为200-500μm，在巨孔表面散有直径约50μm微孔的双相钙磷陶瓷。
所述步骤(3)中阴离子蛋白质水溶液为骨形态发生蛋白、纤维连接连蛋白和rFN/CDH融合蛋白中的任一种或多种，它们对骨断端处内源性骨髓的骨髓间充质干细胞有募集、诱导矿化成骨能力，优选为rFN/CDH融合蛋白(rFN/CDH制备方法详见国家发明专利，“纤连蛋白与钙粘附蛋白-11的融合蛋白，制备方法及应用”，专利号：ZL200910103100.6)。
所述步骤(4)中层层自组装体的层数为1-50层，优选为20-30层。
本发明具有如下优点：
一、制备工艺简单、无需特殊设备、成本低廉，易于实现工业化，通过简单的交替浸涂技术可实现材料表面组装分子在纳米、亚微米尺度的有规结构设计。
二、制备条件温和，可在常温水溶液中进行而避免了环境污染，可以保证生物分子(如蛋白质、核酸)具有维持生物活性的天然构象。
三、适用的基质材料种类多，对基质的形状大小没有限制。既可以在平面基底上进行，也可以在球形管或其它不规则形状的材料上进行，对基体材料的体型结构适应性强，并可在具有复杂体型结构的装置和材料上实现。
四、组装分子的选择范围广泛，可以为合成的聚电解质，也可以是纳米胶体、纳米粒、纳米片、纳米管、有机/无机微粒、有机小分子以及蛋白质、多糖、DNA等荷电的生物活性大分子，这为其制备功能多样的复合材料提供了可能。
五、自组装层数能够得到精确控制，且通过控制每次在溶液中的吸附时间、离子强度等来调节每层层厚，从而调节药物的载量。
六、稳定性良好，由于相邻层间靠静电引力、氢键、共价键、配位键等维系，所获得的多层膜具有良好的稳定性。
附图说明
图1 5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖的制备
图2 5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载紫杉醇纳米粒透射电镜图
图3载药纳米粒纳米粒24小时体外释放累积量
图4载药纳米粒7天体外释放累积量
图5BCP-PEI-(rFN/CDH-PTX/HGC)n-rFN/CDH层层自组装体结构示意图
图6红外图谱
图7扫描电镜图
图8接触角数据图
图9层层自组装体中载紫杉醇纳米粒对SAOS-2骨肉瘤细胞的抗肿瘤活性
图10层层自组装体中rFN/CDH蛋白对骨种子细胞和成骨细胞的增殖率和活力的影响
具体实施方式
为对本发明进行详细说明，下面结合附图和实施例作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。
实施例1
(1)5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖的制备(HGC)：将0.15g乙二醇壳聚糖(GC)和0.0037g乙基-二甲基胺-丙基碳化二亚胺(EDC)溶于18ml蒸馏水，再将0.0045g 5β-胆烷酸(5β-CA)和0.0022g N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于18ml甲醇，将5β-CA溶液缓慢地滴加到搅拌状态下的GC溶液中，溶液在室温下搅拌24h，直至溶液变透明，用透析袋(14KDa)透析3天，分别依次用80％甲醇、50％甲醇、纯水各透析一天，每3h换一次透析液，透析完的溶液用0.8μm滤膜过滤，冻干得到5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖白色絮状产物(HGC)，其制备过程见图1。
(2)5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载紫杉醇纳米粒的制备(HGC-PTX)：将紫杉醇PTX(1mg，1ml甲醇)慢慢滴加到HGC偶合物溶液中(10mg，2ml 1∶1v/v水/甲醇体系溶解)，室温下剧烈搅拌12h，用水透析(透析截留分子量为14kDa)1天，每3h换一次透析液，10000rpm离心10min，取上清液用0.8μm滤膜后冻干保存，即得5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载紫杉醇纳米粒(HGC-PTX)。
制得的HGC-PTX纳米粒疏水基取代度为0.82％，粒径为294.3nm，包封率为69.10％，载药量为6.910％。
实施例2
(1)5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖的制备(HGC)：将0.15g乙二醇壳聚糖(GC)和0.0048g乙基-二甲基胺-丙基碳化二亚胺(EDC)溶于18ml蒸馏水，再将0.0060g 5β-胆烷酸(5β-CA)和0.0029g N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于18ml甲醇，将5β-CA溶液缓慢地滴加到搅拌状态下的GC溶液中，溶液在室温下搅拌24h，直至溶液变透明，用透析袋(14KDa)透析3天，分别依次用80％甲醇、50％甲醇、纯水各透析一天，每3h换一次透析液，透析完的溶液用0.8μm滤膜过滤，冻干得到5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖白色絮状产物(HGC)。
(2)5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载紫杉醇纳米粒的制备(HGC-PTX)：将紫杉醇PTX(1mg，1ml甲醇)慢慢滴加到HGC偶合物溶液中(10mg，2ml 1∶1v/v水/甲醇体系溶解)，室温下剧烈搅拌12h，用水透析(透析截留分子量为14kDa)1天，每3h换一次透析液，10000rpm离心10min，取上清液用0.8μm滤膜后冻干保存，即得5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载紫杉醇纳米粒(HGC-PTX)。
制得的HGC-PTX纳米粒疏水基取代度为4.93％，粒径为304.9nm(透射电镜图见图2)，包封率为93.24％，载药量为9.324％。
实施例3
(1)5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖的制备(HGC)：将0.15g乙二醇壳聚糖(GC)和0.0074g乙基-二甲基胺-丙基碳化二亚胺(EDC)溶于18ml蒸馏水，再将0.0090g 5β-胆烷酸(5β-CA)和0.0045g N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于18ml甲醇，将5β-CA溶液缓慢地滴加到搅拌状态下的GC溶液中，溶液在室温下搅拌24h，直至溶液变透明，用透析袋(14KDa)透析3天，分别依次用80％甲醇、50％甲醇、纯水各透析一天，每3h换一次透析液，透析完的溶液用0.8μm滤膜过滤，冻干得到5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖白色絮状产物(HGC)。
(2)5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载紫杉醇纳米粒的制备(HGC-PTX)：将紫杉醇PTX(1mg，1ml甲醇)慢慢滴加到HGC偶合物溶液中(10mg，2ml 1∶1v/v水/甲醇体系溶解)，室温下剧烈搅拌12h，用水透析(透析截留分子量为14kDa)1天，每3h换一次透析液，10000rpm离心10min，取上清液用0.8μm滤膜后冻干保存，即得5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载紫杉醇纳米粒(HGC-PTX)。
制得的HGC-PTX纳米粒疏水基取代度为9.27％，粒径为311.2.nm，包封率为65.42％，载药量为6.542％。
实施例4
5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载多烯紫杉醇纳米粒的制备(HGC-DTX)：将多烯紫杉醇DTX(1mg，1ml甲醇)慢慢滴加到疏水基取代度为4.93％的HGC偶合物溶液中(10mg，2ml水)，室温下剧烈搅拌12h，用水透析(透析截留分子量为14kDa)1天，每3h换一次透析液，10000rpm离心10min，取上清液用0.8μm滤膜后冻干保存，即得5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载多烯紫杉醇纳米粒(HGC-DTX)。
制得的HGC-DTX纳米粒粒径为432.5nm，包封率为45.73％，载药量为4.57％。
实施例5
5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载顺铂纳米粒的制备(HGC-CDDP)：将顺铂CDDP(1mg，1ml二甲基甲酰胺)慢慢滴加到疏水基取代度为4.93％的HGC偶合物溶液中(10mg，2ml水)，室温下剧烈搅拌12h，用水透析(透析截留分子量为14kDa)1天，每3h换一次透析液，10000rpm离心10min，取上清液用0.8μm滤膜后冻干保存，即得5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载顺铂纳米粒(HGC-CDDP)。
制得的HGC-CDDP纳米粒粒径为350.0nm，包封率为80.15％，载药量为8.015％。
实施例6
5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载阿霉素纳米粒的制备(HGC-DOX)：将阿霉素DOX(1mg，1ml水)慢慢滴加到疏水基取代度为4.93％的HGC偶合物溶液中(10mg，2ml水)，室温下剧烈搅拌12h，用水透析(透析截留分子量为14kDa)1天，每3h换一次透析液，10000rpm离心10min，取上清液用0.8μm滤膜后冻干保存，即得5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载阿霉素纳米粒(HGC-DOX)。
制得的HGC-DOX纳米粒粒径为336.1nm，包封率为56.72％，载药量为5.67％。
实施例7体外释药行为的研究
将实施例2的HGC-PTX载药纳米粒分散在pH7.4PBS缓冲液中，放于14KDa透析袋中，在37℃水浴100rpm振荡条件下进行。定时取样，并加入等体积的新鲜释放介质，用HPLC测定PTX含量，计算药物的累积释放量。体外释放结果见图3和图4，结果表明24小时内PTX在12小时前释放速度较快，大概在4～5小时时释放速率开始呈减小趋势，51％的紫杉醇在1天后释放，大概在4天之后，其释放速率基本不变，近似等于零级释放，随后持续释放至第7天紫杉醇释放量达86％。
实施例8兼具边缘组织抑瘤治疗和瘤性骨缺损修复双重功效的层层自组装体的制备
层层自组装体的制备过程如下，结构示意图见图5。
1.溶液配制
(1)配制0.15mol/LNaCl水溶液500ml：将4.3875gNaCl溶于500ml蒸馏水中充分溶解。
(2)配制5mg/ml聚乙烯亚胺(PEI)的NaCl水溶液10ml：称取0.1g 50％PEI水溶液，用10ml刚刚配制好的NaCl水溶液充分溶解。对于PEI溶液，由于PEI粘度较大，作为层层自组装实验的第1层来引发，故无需调节pH值。
(3)配制5mg/ml 5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载紫杉醇纳米粒(HGC-PTX)的NaCl水溶液10ml：称取50mg HGC-PTX置于10mlNaCl水溶液中，磁力搅拌至其溶解。用12.5％冰醋酸和4％wt无水醋酸钠调节pH值至6.10。
(4)配制1mg/ml融合蛋白rFN/CDH的NaCl水溶液5ml：称取5mg rFN/CDH溶于5mlNaCl水溶液中，充分溶解。并用冰醋酸和无水醋酸钠调节pH值至6.20。
2.在6孔板中的各孔中分别加入5ml PEI溶液、5ml HGC-PTX溶液、5ml rFN/CDH溶液、5ml NaCl溶液。
3.准备圆片状双相钙磷陶瓷(BCP)支架材料(直径5mm×厚度1mm)，将BCP同时置于PEI溶液中。并用镊子夹着BCP片子来回振荡，以赶走孔隙中的气泡。BCP在PEI溶液中浸泡30min，以让PEI粘附在BCP表面，作为层层自组装实验的第1层。
4.取出BCP置于1孔NaCl溶液中1min，轻微振荡以洗涤去除BCP表面未附着牢固的PEI。
5.取出BCP置于另1孔NaCl溶液中1min，同样轻微振荡以再次洗去BCP表面未附着牢固的PEI。
6用1ml枪头吸走2孔NaCl溶液，重新换上新的NaCl溶液。以后每洗涤完成，均换上新的NaCl溶液。(BCP-PEI，N＝1)
7.取出BCP置于rFN/CDH溶液中30min。
8.取出BCP，依前法洗涤2次。(BCP-PEI-rFN/CDH，N＝2)
9.取出BCP置于HGC-PTX溶液中30min。
10.取出BCP，依前法洗涤2次。(BCP-PEI-rFN/CDH-[HGC-PTX]，N＝3)
11.多次循环步骤7-10的4个步骤，制备层数为1-50层的自组装体，在常温下干燥。
实施例9层层自组装体的红外检测(FTIR)
红外检测结果见图6，从图片可以看到：双相钙磷陶瓷(BCP)曲线中的900～1200cm-1段对应BCP中的羟基磷灰石，633cm-1处也对应羟基磷灰石，945cm-1处对应BCP中的磷酸三钙；双相钙磷陶瓷-聚乙烯亚胺(BCP-PEI)在BCP的基础上增加了PEI对应的峰，即3115cm-1处对应PEI中的-NH2基团；双相钙磷陶瓷-聚乙烯亚胺-rFN/CDH蛋白(BCP-PEI-rFN/CDH)在BCP-PEI的基础上增加了rFN/CDH蛋白质的肽键基团峰，即1638cm-1处；rFN/CDH蛋白的1650cm-1处的肽键基团峰与(c)中一致；双相钙磷陶瓷-聚乙烯亚胺-rFN/CDH蛋白-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载紫杉醇纳米粒(BCP-PEI-rFN/CDH-[HGC-PTX])曲线中也出现了5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖(HGC)中的-NH2基团的峰，即3396cm-1；5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖(HGC)的3298cm-1处的-NH2基团峰与(e)中一致。由图分析可知，双相钙磷陶瓷(BCP)基片已经成功地进行了层层自组装。
实施例10层层自组装体的扫描电镜检测(SEM)
由单纯光面双相钙磷陶瓷(BCP)的扫描电镜图(不同放大倍数：500、50、10、5μm，见图7)可以看出，虽然是光面BCP，但仍然有许多空隙存在，表面空隙呈现不规则分布。根据标尺判断，主要大孔直径约200-500um，而大孔表面散有直径20-50um的微孔，颗粒直径分布在5-10um范围内，此种结构的实际意义在于显著增加了界面的表面积。
与单纯光面BCP扫描电镜图相比，双相钙磷陶瓷-聚乙烯亚胺(BCP-PEI)片子表面厚度增加，PEI填平了BCP表面的许多空隙，是其表面变得平整光滑，说明BCP-PEI片子因PEI较大的粘度已粘附在BCP表面，作为第一层来引发层层自组装。
与BCP-PEI扫描电镜图相比，双相钙磷陶瓷-聚乙烯亚胺-rFN/CDH蛋白(BCP-PEI-rFN/CDH)片子表面更为平整光滑，厚度增加，表面几乎已无空隙，有大量颗粒聚集在片子表面形成平整光滑的rFN/CDH膜层，说明带正电的PEI通过静电作用吸引了带负电的rFN/CDH形成层层自组装的第二层膜。
与BCP-PEI-rFN/CDH扫描电镜图相比，双相钙磷陶瓷-聚乙烯亚胺-rFN/CDH蛋白-5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载紫杉醇纳米粒(BCP-PEI-rFN/CDH-[HGC-PTX])片子表面也比上一层更加平整光滑，膜厚度也增加，大量颗粒聚集程度更为密集，聚集的颗粒表面上较为均匀地分布了许多极小的颗粒，根据标尺判断，附着的极小颗粒大小为纳米级别，直径约为300-500nm，与PTX-HGC纳米粒的大小基本一致，说明BCP片子上带负电的rFN/CDH膜层已通过静电吸附了带正电荷的PTX-HGC纳米粒，形成一层PTX-HGC纳米粒薄膜层。
实施例11层层自组装体的X线光电子能谱检测(XPS)
XPS检测结果见表1，由表可知，BCP中所含的Ca、P、C、O元素均被检测出来，与理论相符；BCP-PEI、BCP-PEI-rFN/CDH、BCP-PEI-rFN/CDH-[HGC-PTX]在BCP基础上增加了N元素，为PEI、rFN/CDH、HGC中含有丰富的N元素相关；BCP-PEI-rFN/CDH在BCP-PEI基础上增加了硫元素(S)，这与蛋白质中含有微量的S元素相符(BCP、PEI、HGC中不含S元素)；BCP-PEI-rFN/CDH-[PTX-HGC]由于蛋白质rFN/CDH外还有1层HGC(不含S元素)，且rFN/CDH本身的S元素含量就很低，故也没有检测出来，由此表明双相钙磷陶瓷(BCP)基材上能够成功进行层层自组装实验。
表1X线光电子能谱检测结果
实施例12层层自组装多层体的接触角检测
单纯双相钙磷陶瓷(BCP)接触角较大(45.6°)，表现出较强的疏水性。而经过层层自组装修饰后的BCP表现出较强的亲水性。由图8可以看出，经过30层自组装修饰后，接触角表现出较规律的变化(第1层为聚乙烯亚胺PEI，第3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29层为5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载紫杉醇纳米粒HGC-PTX，第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30层为rFN/CDH蛋白)，说明经过30层自组装修饰后，BCP表面存在明显的层次。
接触角实验说明仿生界面疏水特性显著下降，具有良好的亲水倾向，是一种有光明应用前景的新型组织工程来源的骨替代材料。亲水性是影响细胞粘附的直接因素，对疏水性差的多聚物进行表面改性，使其具有一定的亲水倾向，亦是增强材料生物相容性的策略之一。
实施例13细胞实验
在N＝10，20，30层的自组装体界面上培养SAOS-2骨肉瘤细胞，培养时间1周，用MTT法检测不同自组装层数的自组装体中载紫杉醇纳米粒对SAOS-2骨肉瘤细胞的抗肿瘤活性，结果骨肉瘤细胞存活率降低，说明不同层数的自组装体对骨肉瘤细胞有较大的杀伤作用，能有效抑制肿瘤细胞生长，其中20层和30层自组装体有更好的抑瘤效果(见图9)。
提取N＝10，20，30层的自组装体的肿瘤细胞培养液，加入到人间充质干细胞hMSCs和成骨细胞共培养体系内培养1周，用MTT法测定不同自组装层数的自组装体细胞培养液中rFN/CDH对骨种子细胞和成骨细胞的促成骨效应，结果人间充质干细胞和成骨细胞在20层和30层自组装体的细胞培养液中增殖率和细胞活力明显高于空白组(p＜0.01)，表现为MTT还原产物溶液的吸光度明显高于空白组，说明该层层自组装体有良好的促成骨活性(见图10)。
由两图可知，BCP-PEI-(rFN/CDH-PTX/HGC)n-rFN/CDH该层层自组装多层膜具有HGC-PTX纳米粒的抗癌作用和rFN/CDH蛋白质良好的促成骨活性，有望成为具有光明前景的抑瘤和骨修复材料。
Claims (7)
1.一种兼具抑瘤和骨缺损修复的层层自组装体，其特征在于，制备方法包括如下步骤：(1)阳离子5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载抗癌药纳米粒的制备(2)双相钙磷陶瓷基材的预处理(3)具有促粘附和促成骨作用的阴离子蛋白质水溶液的配制(4)阳离子5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载抗癌药纳米粒水溶液的配制(5)层层自组装体的制备。
2.根据权利要求1所述的层层自组装体，其特征在于，阳离子5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖中乙二醇壳聚糖分子量为82000-85000。
3.根据权利要求1所述的层层自组装体，其特征在于，阳离子5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖中疏水取代基5β-胆烷酸的取代度为0.2-15％，优选取代度为4-6％。
4.根据权利要求2所述的5β-胆烷酸化乙二醇壳聚糖载抗癌药纳米粒，其特征在于，抗癌药为金属铂络合物类、紫杉烷类、喜树碱类、长春碱类、叶酸拮抗剂类、嘌呤拮抗剂类、嘧啶拮抗剂类、氮芥类、蒽醌类、鬼臼素类抗肿瘤药中的任一种，优选顺铂、阿霉素、紫杉醇。
5.根据权利要求1所述的层层自组装体，其特征在于，双相钙磷陶瓷基材由羟基磷灰石和β-磷酸三钙组成，且羟基磷灰石成分多于或等于β-磷酸三钙，优选由60％羟基磷灰石和40％β-磷酸三钙组成，多孔孔隙率60％-70％，大孔直径为200-500μm，在巨孔表面散有直径约50μm微孔的双相钙磷陶瓷。
6.根据权利要求1所述的层层自组装体，其特征在于，阴离子蛋白质水溶液为骨形态发生蛋白、纤维连接连蛋白和rFN/CDH融合蛋白中的任一种或多种，优选为rFN/CDH融合蛋白。
7.根据权利要求1所述的层层自组装体，其特征在于，自组装体的层数为1-50层，优选为20-30层。
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