CN116285386A - 一种软骨组织修复水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域，具体为一种软骨组织修复水凝胶及其制备方法。软骨组织修复水凝胶的制备成分每100ml水凝胶中均掺杂有：10‑15g桑蚕丝、0.1‑0.5g甲基丙烯酸缩水甘油酯、0‑1g硅酸锂镁、0‑1g单宁酸、0.1g光引发剂；软骨组织修复水凝胶的制备方法：对桑蚕丝进行脱胶、溶解处理得到丝素蛋白溶液，向丝素蛋白溶液中加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，并进行搅拌，得到甲基丙烯酸酯化丝素蛋白溶液，向甲基丙烯酸酯化丝素蛋白溶液中加入硅酸锂镁溶液和单宁酸溶液，得到丝素蛋白混合溶液，然后向丝素蛋白混合溶液中加入光引发剂，制得软骨组织修复水凝胶；本发明所述的组织修复水凝胶为亲水的三维网络结构，能为骨软骨缺损部位提供力学支撑和生物诱导活性，适宜骨损伤修复。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种软骨组织修复水凝胶及其制备方法。
背景技术
肌肉骨骼和关节疾病在过去十年引起了世界卫生组织的重视，影响着数千万人的健康，而目前在临床上针对骨软骨损伤尚缺少有效的治疗方案。骨软骨损伤涉及两种具有不同组织特性和再生能力的组织(软骨和软骨下骨)，修复过程中两种组织连接不紧密和修复速度不同步都会引发关节生物力学的改变，影响软骨组织的长期性能，因此骨软骨缺损的修复具有相当大的挑战性。
目前临床治疗骨软骨损伤的常用方法如关节腔灌洗清创、微骨折术等治疗效果较差、人工关节置换术、自体/异体骨软骨移植，旨在减轻关节疼痛和缓解症状，并不能有效地促进骨软骨组织的修复再生，且受到供体来源、免疫排斥等限制。因此，研发能够有效促进骨软骨损伤修复的方法具有极其重要的临床意义和应用价值。
近年来，组织工程和再生医学的发展为骨软骨的修复和再生提供了新的希望，而寻找合适的组织工程支架对于骨软骨缺损修复至关重要。甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)水凝胶由光交联甲基丙烯酸酐(MA)和皮肤衍生明胶组成，由于其细胞粘附性、优越的生物相容性和高度可调的力学性能，已在组织工程中广泛应用。但目前仍缺乏具有多功能特性的GelMA水凝胶，为骨软骨再生提供支持性的微环境。
近年来，美国食品和药物管理局(FDA)批准的药物单宁酸(TA)因其抗氧化、抗菌和抗炎特性而被广泛应用于生物医学领域。TA是一种多酚类化合物，起源于多种天然植物，丰富的酚羟基赋予TA氧化还原电位，通过氧化诱导的低聚反应促进TA与底物的结合，形成复合水凝胶。在水凝胶中，TA可以清除活性氧，提高骨髓间充质干细胞对氧化应激的生存能力。
为了促进OC缺损的再生，通常引入促成骨和促软骨因子来增强骨髓间充质干细胞的双谱系分化。合成硅酸锂镁(laponite)是一种二维盘状硅酸盐纳米粘土，具有各向异性的电荷分布，可作为水凝胶的交联剂和流变修饰剂，具有递送药物的功能。值得注意的是，既往研究证实了硅酸锂镁具有体外和体内的骨软骨双系生物活性，其制成的水凝胶可增强全层骨软骨缺陷患者的骨软骨一体化再生。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提出了一种软骨组织修复水凝胶及其制备方法，该软骨组织修复水凝胶由硅酸锂镁和单宁酸与丝素蛋白交联反应制得，制备出的软骨组织修复水凝胶可以促进内源性骨髓间充质干细胞成骨/成软骨双向分化，有效促进骨软骨缺损的修复与再生。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种软骨组织修复水凝胶，所述软骨组织修复水凝胶的制备成分每100ml水凝胶中均掺杂有：10-15g桑蚕丝、0.1-0.5g甲基丙烯酸缩水甘油酯、0-1g硅酸锂镁、0-1g单宁酸、0.1g光引发剂。
优选地，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯浓度为100-1000mM。
优选地，所述硅酸锂镁溶液的浓度为：0-1％(w/v)。
优选地，所述单宁酸溶液的浓度为：0-1％(w/v)。
优选地，所述光引发剂为2,4,6_三甲基苯甲酰基苯基膦酸锂盐(lithium phenyl-2，4，6-trimethylbenzoylphosphinate，LAP)，所述光引发剂的浓度为0.1％(w/v)。
优选地，所述软骨组织修复水凝胶的制备方法为：
先对桑蚕丝进行脱胶、溶解处理得到丝素蛋白溶液，向丝素蛋白溶液中加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，并进行搅拌，得到甲基丙烯酸酯化丝素蛋白溶液，然后向甲基丙烯酸酯化丝素蛋白溶液中加入硅酸锂镁溶液和单宁酸溶液，得到丝素蛋白混合溶液，然后向丝素蛋白混合溶液中加入光引发剂并进行光交联反应使丝素蛋白混合溶液固化，最终制得软骨组织修复水凝胶；
其中，光交联反应中采用的是紫外线进行照射，紫外线的波长为200-400nm。
优选地，所述脱胶处理的具体方法为：将桑蚕丝放入的碳酸钠水溶液中，100℃水浴30min，然后使用纯水振荡清洗，脱去桑蚕丝中的丝胶蛋白，留下桑蚕丝中的丝素蛋白，然后将丝素蛋白烘干备用。
优选地，所述溶解处理的具体方法为将干燥的丝素蛋白溶于的溴化锂水溶液中，60℃加热1小时至丝素蛋白溶解，得到含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液，然后对混合液进行透析处理，去除混合液中的不溶性颗粒和溴化锂离子。
优选地，所述软骨组织修复水凝胶由所述软骨组织修复水凝胶的制备方法制备而成。
优选地，所述的软骨组织修复水凝胶或所述的软骨组织修复水凝胶制备方法制备出的软骨组织修复水凝胶能够用于制备骨软骨损失修复材料。
本发明的有益效果：
1、本发明由硅酸锂镁和单宁酸与丝素蛋白交联反应制得的组织修复水凝胶，为亲水的三维网络结构凝胶，能为骨软骨缺损部位提供力学支撑和生物诱导活性，适宜于骨软骨损伤修复。
2、本发明制备工艺简单，最大程度保证了硅酸锂镁和单宁酸的生物活性；硅酸锂镁和单宁酸具有良好的生物相容性，并能有效促进骨髓间充质干细胞成骨/成软骨双向分化，丝素蛋白水凝胶可以有效搭载硅酸锂镁和单宁酸，并为缺损部位提供力学支撑，从而促进骨软骨损伤部位的修复与再生。
附图说明
为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1是本发明实施例1中具有骨软骨诱导活性的组织修复水凝胶的大体形态图；
图2是本发明实施例1中具有骨软骨诱导活性的组织修复水凝胶的电镜照片；
图3是本发明实施例1中具有骨软骨诱导活性的组织修复水凝胶的流变性能图；
图4是本发明实施例2中大鼠骨软骨损伤修复8周后的大体形态图片；
图5是本发明实施例2中大鼠骨软骨损伤修复8周后的SO染色图片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种单纯丝素蛋白的组织修复水凝胶，由丝素蛋白经光交联交联反应制得，其制备方法包括以下步骤：
(1)、甲基丙烯酸酯化丝素蛋白溶液的制备：
a)脱胶：将10g桑蚕蚕丝(6A级)放入4L的0.02M碳酸钠水溶液中，100℃水浴30min，2L纯水震荡清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在60℃烘干，获得7g干燥后的丝素蛋白，备用；
b)溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以20％(w/v)溶于9.3M的溴化锂水溶液中，60℃加热1小时至丝素蛋白溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液
c)甲基丙烯酸酯化：将上述混合液中加424mM甲基丙烯酸缩水甘油酯，在60℃、300rpm加热搅拌3小时至混合均匀；
d)透析：将混合液用5透析，用10倍混合液体积的无菌纯水在3天透析6次，去除溶液中的溴化锂离子，获得截留液；
(2)、一种单纯丝素蛋白的组织修复水凝胶的制备：将(1)方法制备的高浓度甲基丙烯酸酯化丝素蛋白溶液，用无菌纯水稀释成终浓度为10％(w/v)的溶液。取上述丝素蛋白溶液1000μl置于1.5mlEP管中，溶液中加入终浓度为0.2％(w/v)的光引发剂LAP。混合均匀，在波长为365nm紫外灯下照射10s。置于烘箱中于37℃加热60min，即得到一种单纯丝素蛋白的组织修复水凝胶。
实施例2
一种具有抗氧化应激活性的的组织修复水凝胶，由丝素蛋白与单宁酸经光交联交联反应制得，其制备方法包括以下步骤：
(1)、甲基丙烯酸酯化丝素蛋白溶液的制备：
a)脱胶：将10g桑蚕蚕丝(6A级)放入4L的0.02M碳酸钠水溶液中，100℃水浴30min，2L纯水震荡清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在60℃烘干，获得7g干燥后的丝素蛋白，备用；
b)溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以20％(w/v)溶于9.3M的溴化锂水溶液中，60℃加热1小时至丝素蛋白溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液
c)甲基丙烯酸酯化：将上述混合液中加424mM甲基丙烯酸缩水甘油酯，在60℃、300rpm加热搅拌3小时至混合均匀；
d)透析：将混合液用5透析，用10倍混合液体积的无菌纯水在3天透析6次，去除溶液中的溴化锂离子，获得截留液；
e)将截留液于-45℃、20Pa冻干48小时，-80℃保存备用；
(2)、单宁酸用无菌纯水稀释为浓度10mg/ml的储存液，置于4℃保存。
(3)、一种具有抗氧化应激活性的的组织修复水凝胶：将(1)方法制备的高浓度甲基丙烯酸酯化丝素蛋白溶液，用无菌纯水稀释成终浓度为10％(w/v)的溶液。取上述丝素蛋白溶液900μl置于1.5mlEP管中，加入100μl(2)方法制备的单宁酸溶液，获得单宁酸终浓度为1％(w/v)的丝素蛋白混合溶液。溶液中加入终浓度为0.2％(w/v)的光引发剂LAP。混合均匀，在波长为365nm紫外灯下照射10s。置于烘箱中于37℃加热60min，得到复合单宁酸的丝素蛋白水凝胶，即一种具有抗氧化应激活性的的组织修复水凝胶。
实施例3
一种具有骨软骨诱导活性的组织修复水凝胶，由丝素蛋白与硅酸锂镁和单宁酸经光交联交联反应制得，其制备方法包括以下步骤：
(1)、甲基丙烯酸酯化丝素蛋白溶液的制备：
a)脱胶：将10g桑蚕蚕丝(6A级)放入4L的0.02M碳酸钠水溶液中，100℃水浴30min，2L纯水震荡清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在60℃烘干，获得7g干燥后的丝素蛋白，备用；
b)溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以20％(w/v)溶于9.3M的溴化锂水溶液中，60℃加热1小时至丝素蛋白溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液
c)甲基丙烯酸酯化：将上述混合液中加424mM甲基丙烯酸缩水甘油酯，在60℃、300rpm加热搅拌3小时至混合均匀；
d)透析：将混合液用5透析，用10倍混合液体积的无菌纯水在3天透析6次，去除溶液中的溴化锂离子，获得截留液；
e)将截留液于-45℃、20Pa冻干48小时，-80℃保存备用；
(2)、硅酸锂镁用无菌纯水稀释为浓度40mg/ml的储存液，置于4℃保存。
(3)、单宁酸用无菌纯水稀释为浓度10mg/ml的储存液，置于4℃保存。
(4)、一种具有骨软骨诱导活性的组织修复水凝胶的制备：将(1)方法制备的高浓度甲基丙烯酸酯化丝素蛋白溶液，用无菌纯水稀释成终浓度为10％(w/v)的溶液。取上述丝素蛋白溶液875μl置于1.5mlEP管中，分别加入25μl(2)方法制备的的硅酸锂镁和100μl(3)方法制备单宁酸溶液，获得硅酸锂镁和单宁酸终浓度均为1％(w/v)的丝素蛋白混合溶液。溶液中加入终浓度为0.2％(w/v)的光引发剂LAP。混合均匀，在波长为365nm紫外灯下照射10s。置于烘箱中于37℃加热60min，得到复合硅酸锂镁和单宁酸的丝素蛋白水凝胶，即一种具有骨软骨诱导活性的组织修复水凝胶(图1)。冻干的丝素蛋白水凝胶在电镜下表现出多孔的三维网络结构(图2)。与传统的光交联丝素蛋白水凝胶相比，本发明制备的骨软骨诱导活性的组织修复水凝胶经光交联反应后，其流变性能显著提高(图3)，能更好的满足骨软骨损伤修复的力学性能要求。
实施例4
一种具有骨软骨诱导活性的组织修复水凝胶，由0维碳纳米材料硅酸锂镁和单宁酸与丝素蛋白交联反应制得，其应用方法包括以下步骤：
(1)骨软骨损伤造模：取6-8周雄性SD大鼠(体重200-220g)，在全身麻醉后，在髌骨右侧做一长约1cm的纵向切口，并从髌骨内侧切开关节囊，向外侧推使髌骨脱位，暴露股骨髁滑车，用胸骨穿刺针(直径1mm)在滑车正中造直径1mm，深1mm的骨软骨缺损。
(2)应用复合硅酸锂镁和单宁酸的丝素蛋白水凝胶：将实施例1中的一种具有骨软骨诱导活性的组织修复水凝胶填充在(1)中所造骨软骨损伤处，每伤口50μl。造模完成后将髌骨复位，逐层缝合。术后大鼠行标准动物饲料喂养，自由活动。
(3)修复效果评估：术后8周处死动物取样行大体学和组织学评估。与空白对照组(图4a)和单纯丝素蛋白水凝胶组(图4b)相比，大体观察可见复合硅酸锂镁和单宁酸的丝素蛋白水凝胶组(图4c)能够显著促进骨软骨缺损修复，缺损部位表层软骨修复良好；组织学切片结果显示复合硅酸锂镁和单宁酸的丝素蛋白水凝胶能够促进骨软骨损伤部位表层软骨和软骨下骨的修复再生，细胞形态、基质分泌、骨软骨构成接近天然骨软骨组织(图5)。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
Claims (10)
1.一种软骨组织修复水凝胶，其特征在于，所述软骨组织修复水凝胶的制备成分每100ml水凝胶中均掺杂有：10-15g桑蚕丝、0.1-0.5g甲基丙烯酸缩水甘油酯、0-1g硅酸锂镁、0-1g单宁酸、0.1g光引发剂。
2.根据权利要求1所述的一种软骨组织修复水凝胶，其特征在于，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯浓度为100-1000mM。
3.根据权利要求1所述的一种软骨组织修复水凝胶，其特征在于，所述硅酸锂镁溶液的浓度为：0-1％(w/v)。
4.根据权利要求1所述的一种软骨组织修复水凝胶，其特征在于，所述单宁酸溶液的浓度为：0-1％(w/v)。
5.根据权利要求1所述的一种软骨组织修复水凝胶，其特征在于，所述光引发剂为2,4,6_三甲基苯甲酰基苯基膦酸锂盐(lithiumphenyl-2，4，6-trimethylbenzoylphosphinate，LAP)，所述光引发剂的浓度为0.1％(w/v)。
6.根据权利要求1-5所述的软骨组织修复水凝胶，其特征在于，所述软骨组织修复水凝胶的制备方法为：
先对桑蚕丝进行脱胶、溶解处理得到丝素蛋白溶液，向丝素蛋白溶液中加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，并进行搅拌，得到甲基丙烯酸酯化丝素蛋白溶液，然后向甲基丙烯酸酯化丝素蛋白溶液中加入硅酸锂镁溶液和单宁酸溶液，得到丝素蛋白混合溶液，然后向丝素蛋白混合溶液中加入光引发剂并进行光交联反应使丝素蛋白混合溶液固化，最终制得软骨组织修复水凝胶；
其中，光交联反应中采用的是紫外线进行照射，紫外线的波长为200-400nm。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述脱胶处理的具体方法为：将桑蚕丝放入的碳酸钠水溶液中，100℃水浴30min，然后使用纯水振荡清洗，脱去桑蚕丝中的丝胶蛋白，留下桑蚕丝中的丝素蛋白，然后将丝素蛋白烘干备用。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述溶解处理的具体方法为将干燥的丝素蛋白溶于的溴化锂水溶液中，60℃加热1小时至丝素蛋白溶解，得到含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液，然后对混合液进行透析处理，去除混合液中的不溶性颗粒和溴化锂离子。
9.一种如权利要求1-5所述的软骨组织修复水凝胶由权利要求6-8所述的制备方法制备而成。
10.一种如权利要求1-5所述的软骨组织修复水凝胶或一种如权利要求6-8的方法制备出的软骨组织修复水凝胶能够用于制备骨软骨损失修复材料。
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