CN1570117A - 一种表达复合干扰素的方法和用于该方法的载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于表达复合干扰素的载体，其保藏号为：CGMCCNo.0978。本发明还提供了含有所述载体的宿主细胞和一种生产复合干扰素的方法，该方法包括使用权利要求1所述的载体的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及复合干扰素制备方法和用于该方法的载体。
背景技术
干扰素是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物活性的细胞素的总称，被广泛应用于临床治疗肝炎，炎症与癌症。哺乳动物的干扰素有α、β、γ三种型别，其中的α-干扰素又分为多种亚型。
八十年代初，科学家比较了当时已查明的13种α-干扰素的氨基酸序列及其相关功能之后，发现它们具有很多相同之处，说明它们的相似的生物活性与功能；同时它们又具有各自特异之处，这就决定了它们各自的作用专一性。综合这些相同与相异之处，美国安进(Amgen)公司设计出一种综合各种天然干扰素优点的全人工干扰素-复合干扰素(consensus interferon)。复合干扰素具有天然干扰素无法匹配的优点：A.复合干扰素集中了各种天然干扰素的优点，故而具有更强、更广谱的抗病毒作用。例如，在治疗丙型肝炎方面，干扰素α-2b的有效率略大于50％，但其中近三分之二的病人停药后病情复发，因而其净治愈率只有15-20％。与之呈鲜明对照的是，复合干扰素的总治愈率高达40％。B.对天然干扰素α-2b无法治疗的病人，复合干扰素的治愈率达17％左右；而对干扰素α-2b治疗后复发的病人，复合干扰素的治愈率高达50％。
安进公司开发的复合干扰素于1997年获美国FDA批准上市，商品名Infergen，临床上用于治疗对干扰素α-2b治疗无效的丙型肝炎。
中国四川省生物工程研究中心于2001年申请了“重组高效复合干扰素用作乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制剂”的国际专利保护(公开号WO 02/80958 A1)。
从已发表的复合干扰素的专利文件中，我们注意到，复合干扰素的表达量并不理想，每升发酵液中只有100毫克的复合干扰素蛋白，以包涵体的形式存在，经变性、复性、纯化后才能得到纯度较高的目的蛋白，其总纯化效率很低。
发明内容
本发明的目的是建立一种低成本高量表达高活性复合干扰素的表达方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于本发明的方法的表达载体。
为实现上述发明目的，本发明提供了一个表达复合干扰素的载体。含有该表达载体的大肠杆菌宿主细胞大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21-CI 1已于2003年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏中心地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100080。保藏号为：CGMCC 0978。
本发明还提供了利用上述表达载体在大肠杆菌中表达复合干扰素的方法。该方法包括用本发明的表达载体转化宿主细胞，和培养转化的宿主细胞的步骤。
利用本发明的上述技术方案，复合干扰素的表达量达到500毫克/升。
附图说明：
图1是复合干扰素的离子交换层析图。图中检测波长ODλ280，目标蛋白所在主峰用箭头指示。
图2是复合干扰素的凝胶过滤层析图。图中检测波长ODλ280，目标蛋白所在主峰用箭头指示。
图3是复合干扰素制备过程的SDS-PAGE电泳检测图。各泳道分别为：1：分子量标准；2：未诱导表达的对照；3：50μl发酵诱导表达液；4：包涵体；5：包涵体复性后；6：离子交换层析前；7，离子交换层析后；8：凝胶过滤后纯品蛋白，含还原剂；9：凝胶过滤后纯品蛋白，不含还原剂。
实施例
下面通过优选实例对本发明做更详细的描述。
实施例一、复合干扰素表达载体构建
根据本发明涉及的复合干扰素的氨基酸序列，选择大肠杆菌偏爱的密码子，并考虑克隆、鉴定的方便性，设计了编码复合干扰素的DNA序列如下：
ATG TGT GAT TTA CCT CAA ACT CAT TCT CTT GGT AAC CGT CGC GCTCTG ATT CTG CTG GCA CAG ATG CGT CGT ATT TCC CCG TTT AGC TGC CTG AAAGAC CGT CAC GAC TTC GGC TTT CCG CAA GAA GAA TTC GAT GGC AAC CAA TTCCAG AAA GCT CAG GCA ATC TCT GTA CTG CAC GAA ATG ATC CAA CAG ACC TTCAAC CTG TTT TCC ACT AAA GAC AGC TCT GCT GCT TGG GAC GA
A AGC TTG CTGGAG AAG TTC TAC ACC GAG CTG TAT CAG CAG CTG AAC GAC CTG GAA GCA TGCGTA ATC CAG GAA GTT GGT GTA GAA GAG ACT CCG CTG ATG AAC GTC GAC TCTATT CTG GCA GTT AAA AAG TAC TTC CAG CGT ATC ACT CTG TAC CTG ACC GAAAAG AAA TAT TCT CCG TGC GCT TGG GAA GTA GTT CGC GCT GAA ATT ATG CGTTCT TTC TCT CTG AGC ACT AAC CTG CAG GAG CGT CTG CGC CGT AAA GAA TAATAG(SEQ ID NO：1)。
根据上述设计的DNA序列，分别合成两组寡聚核苷酸片段，每组12个，长度在40个碱基左右。每组中的12个片段依次重叠，两组分别室温退火，利用T4 DNA连接酶使形成两条双链DNA。此两段DNA末段含有HindIII粘性末端，经电泳纯化后，等比例混合，利用连接酶使之形成一条完整的双链DNA。利用上游引物ATATAGCTTAAGCTAGAAACCATGAGGGTAATAAATAATGTGTGATTTACCTCAA和下游引物ATATAGTCTAGACTATTATTCTTTACGGC，用PCR方法扩增上述DNA片段，在5’端引入AflII酶切位点(CTTAAG)和核糖体结合位点序列(引物中斜体表示部分)；在3’端引入Xba酶切位点(TCTAGA)。PCR产物经AflII和XbaI双酶切后，克隆到自建的表达载体pTac中，命名为pTac-CI。
实施例二、在大肠杆菌中表达复合干扰素
表达载体pTac-CI转化于大肠杆菌BL-21，并把转化的大肠杆菌保藏于2003年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏中心地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100080。保藏号为：CGMCC 0978。从划线培养的菌板挑取单菌落，接种于100毫升含有100微克/毫升氨苄青霉素的液体LB培养基，37℃摇瓶培养12小时，作为一级种子液；1％接种量转接一级种子液于含6升LB液体培养基的发酵罐中，同样条件培养至O.D600为1.0，作为二级种子液；10％接种量转接二级种子液于含60升培养基的发酵罐中，37℃培养，发酵罐转速300rpm，氧饱和度20％-60％，pH7.0-7.4。培养至OD600 2.0时，加诱导物IPTG终浓度1mM，继续培养4-6小时，离心收集菌体，称菌体湿重1200克，15％SDS-PAGE电泳检测表明目标蛋白在包涵体中，占总蛋白的25％。菌体裂解后，测定蛋白含量为每克菌体含100毫克总蛋白。据此计算，60升发酵液得总蛋白120克，其中30克为复合干扰素，相当于每升发酵液得500毫克复合干扰素。
实施例三、复合干扰素的复性与纯化
菌体裂解后，离心收集包涵体。充分洗涤包涵体，至目标蛋白纯度达75％，将包涵体溶解于溶液B(25mMTris-HCl，2mM巯基乙醇，1mMEDTA-Na，PH8.3，离心弃沉淀，上清加溶液A(25mMTris-HCL，6M盐酸胍，2mM巯基乙醇，1mM EDTA-Na，PH8.3)稀释至蛋白浓度为2毫克/毫升，再以溶液B)缓慢稀释三倍，然后4℃搅拌，均匀缓慢滴加溶液B，12小时透析至盐酸胍浓度为0.2M。此后以五倍体积溶液B透析，每次4小时，共4次。离心、过滤去除不溶物。SDS-PAGE电泳判断目标蛋白纯度大于80％，复性率为80％。
蛋白纯化：DEAE Fast Flow(购自Pharmacia)离子交换层析，以10倍柱体积的溶液B平衡后，加载不大于20倍柱体积的复性样品，随后以5倍柱体积溶液B加50mMNaCl洗柱，最后以5倍柱体积溶液B加50mM-250mMNaCl连续梯度洗脱。离子交换目标蛋白得率约80％，纯度为90％。
凝胶过滤：预装Sephacryl-100(26/60，pharmacia)，以PBS平衡2个柱体积，上样1-2毫升(含蛋白10-20毫克)，以PBS洗脱。凝胶过滤后，目标蛋白得率约60-80％。15％SDS-PAGE电泳未见杂带，样品中加入还原剂与否未见纯度发生改变，表明经纯化的复合干扰素为单体分子，而非通过二硫键连接的双体或多体。
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院微生物研究所
<120>一种表达复合干扰素的方法和用于该方法的载体
<130>I030471
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>507
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(507)
<223>
<400>1
atg tgt gat tta cct caa act cat tct ctt ggt aac cgt cgc gct ctg 48
Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu
1 5 10 15
att ctg ctg gca cag atg cgt cgt att tcc ccg ttt agc tgc ctg aaa 96
Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys
20 25 30
gac cgt cac gac ttc ggc ttt ccg caa gaa gaa ttc gat ggc aac caa 144
Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln
35 40 45
ttc cag aaa gct cag gca atc tct gta ctg cac gaa atg atc caa cag 192
Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln
50 55 60
acc ttc aac ctg ttt tcc act aaa gac agc tct gct gct tgg gac gaa 240
Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu
65 70 75 80
agc ttg ctg gag aag ttc tac acc gag ctg tat cag cag ctg aac gac 288
Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp
85 90 95
ctg gaa gca tgc gta atc cag gaa gtt ggt gta gaa gag act ccg ctg 336
Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu
100 105 110
atg aac gtc gac tct att ctg gca gtt aaa aag tac ttc cag cgt atc 384
Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile
115 120 125
act ctg tac ctg acc gaa aag aaa tat tct ccg tgc gct tgg gaa gta 432
Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val
130 135 140
gtt cgc gct gaa att atg cgt tct ttc tct ctg agc act aac ctg cag 480
Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln
145 150 155 160
gag cgt ctg cgc cgt aaa gaa taa tag 507
Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu
165
<210>2
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys
20 25 30
Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln
35 40 45
Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln
50 55 60
Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu
65 70 75 80
Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp
85 90 95
Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu
100 105 110
Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile
115 120 125
Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val
130 135 140
Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln
145 150 155 160
Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu
165
<210>3
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
atatagctta agctagaaac catgagggta ataaataatg tgtgatttac ctcaa 55
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
atatagtcta gactattatt ctttacggc 29
Claims (3)
1.一种用于表达复合干扰素的载体，其保藏号为：CGMCC No.0978
2.一种含有权利要求1所述的载体的宿主细胞。
3.一种生产复合干扰素的方法，该方法包括使用权利要求1所述的载体的步骤。
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|---|---|---|---|
| CN 03150138 CN1570117A (zh) | 2003-07-18 | 2003-07-18 | 一种表达复合干扰素的方法和用于该方法的载体 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009109129A1 (en) * | 2008-03-04 | 2009-09-11 | Biotrand Inc. | A new type of consensus interferon and preparation method thereof |
| WO2020108427A1 (zh) * | 2018-11-28 | 2020-06-04 | 深圳市利云德生物技术有限公司 | 一种新型干扰素α及其制备方法、组合物和用途 |
-
2003
- 2003-07-18 CN CN 03150138 patent/CN1570117A/zh active Pending
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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