TWI513706B - The spatial conformation changes the reconstructed interferon crystal, its three - dimensional structure and its application - Google Patents

Description

空間構象改變的重組干擾素的晶體、其三維結構及應用

本發明主要涉及空間構象改變的重組干擾素的晶體、其結晶方法、其三維結構、所述晶體和三維結構的應用以及所述重組干擾素的模擬物。

干擾素(IFN)是一種由多種細胞產生的可溶性蛋白質，其具有多種重要的生物功能，包括抗病毒、抗腫瘤和免疫調節功能。根據產生細胞類型、受體、生物活性等的不同，干擾素可分為I型、II型和III型干擾素。I型干擾素主要由病毒及合成的雙鏈RNA所誘導，因此也稱為抗病毒干擾素。現有三種類型的I型干擾素：IFN α、INF β和IFN ω。II型干擾素也稱為免疫干擾素或IFN γ，由T細胞產生，並且在體內是一種重要的免疫調節因數。III型干擾素則由IFN-λ分子構成。

如大量的相關專利和公開文獻所顯示的，近年來，世界上許多公司都在參與干擾素的研究。舉例來說，美國專利第4,695,623號和第4,897,471號公開了新型人干擾素多肽，其氨基酸序列包含存在于天然α-干擾素多肽中的共同或佔優勢的氨基酸。該新型干擾素多肽被命名為IFN-con(共有干擾素α)。所公開的氨基酸序列被命名為IFN-con1、IFN-con2和IFN-con3。還公開了編碼IFN-cons的基因以及在大腸桿菌中的基因表達。研究表明與白細胞干擾素或其他I型干擾素相比，該重組IFN-con具有更高的體外抗病毒、抗增殖及天然殺傷細胞活性。

美國專利第5,372,808號公開了人IFN-con在疾病治療中的用途。與之前臨床審批通過的α-干擾素如先靈葆雅公司生產的干擾能®(IFN-α 2b,SGP)相比，重組人共有干擾素顯示具有更低的副作用。1997年底，美國食品與藥品管理局(FDA)批准了美國安進(Amgen)公司生產的人共有干擾素作為丙型肝炎臨床治療用藥，商品名為幹複津(INFERGEN®，interferon alfacon-1)。

美國專利第7,364,724號(其全文在此併入作為參考)公開了同一種功效增強、副作用更小且能夠大劑量使用的重組干擾素(在下文中也稱為“rSIFN-co”)。所述重組干擾素具有與幹複津相同的氨基酸序列，但其空間構象和生物效力發生了變化。因此，獲得品質良好的、X-射線衍射解析度高的所述具有改變的結構和功能的重組干擾素的晶體，測定其三維結構、建立模型並通過利用所述結構和模型來開展藥物設計以及改良已有干擾素的效力是非常有意義的。

本發明涉及重組干擾素包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。進一步地，本發明提供了上述重組干擾素的結晶方法、包含所述晶體的組合物。此外，本發明提供了所述重組干擾素不同于現有技術已公佈的IFN-α 2b等干擾素的三維結構、也不同于美國安進公司幹複津的計算模型結構的三維結構、所述三維結構在基於電腦的鑒定能與干擾素相互作用的候選化合物、設計干擾素模擬物、進行合理藥物設計中的應用。

以下所提供的是幫助本領域技術人員實施本發明的本發明詳細描述。

重組干擾素(rSIFN-co)

在一個實施方案中，本發明的重組干擾素的氨基酸序列以及編碼所述氨基酸的核苷酸序列分別如下所示：

E R L R R K E (SEQ ID NO：1)

481 GAACGTCTGC GTCGTAAAGA ATAA (SEQ ID NO：2)

CTTGCAGACG CAGCATTTCT TATT (SEQ ID NO：3)

此外，本發明的重組干擾素在190-250nm範圍內的圓二色譜顯著不同於在同樣條件下測得的幹複津的圓二色譜，在250-320nm範圍內的圓二色譜與幹複津的圓二色譜也顯著不同(參見中國專利公開號CN1740197A說明書第3頁第22-25行、實施例三和圖6A-D)。

並且，本發明的重組干擾素的三維結構既不同于現有技術已公佈的IFN-α 2b的三維結構(參見圖12)，也不同於幹複津的計算模型結構(參見KORN,AP等，Journal of Interferon Research 1994,14：1-9)，由兩者比較結果尤其可見二者的AB環有著明顯的區別，其BC環也無法完全重合(參見圖14)。

另外，本發明的重組干擾素在肌肉注射給體重指數(BMI)為18-23範圍內的人體後，以采血時間對受試人體血清中的2-5A寡聚核苷酸酶(也稱為“2’,5’-OAS”)濃度作圖，所得曲線一般表現為雙峰，其曲線下面積顯著大於在同一條件下注射幹複津所獲得的曲線下面積。此外，本發明的重組干擾素在注射給人體後其在人體內的半衰期比干複津在人體內的半衰期更長。

已進行的實驗的結果還證實，本發明的重組干擾素具有比目前投入臨床使用的其他任何干擾素(包括幹複津)更強的效力。例如，對於乙型肝炎病毒而言，本發明的重組干擾素不僅能抑制乙型肝炎病毒的DNA複製而且還能抑制乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，抑制乙肝病毒核心抗原(HBcAg)DNA複製的效力與幹複津相比提高約一倍。本發明的重組干擾素的體外藥效學顯示它不僅能抑制乙型肝炎病毒的DNA複製，而且能抑制表面抗原和e抗原的分泌，其細胞學毒性僅為臨床現用干擾素的1/8，但抗病毒活性卻是臨床現用干擾素的5-20倍，同時在人體內具有更高更廣譜更長時間的生物學應答反應。

此外，無論是就病毒性疾病的預防還是就腫瘤的治療而言，所述干擾素都具有與其他干擾素(包括幹複津)相比，更高的抗病毒活性和更低的副作用。例如，本發明的重組干擾素不但具有強於臨床現用干擾素20倍的抗病毒活性，以及明顯強於重組人α 型干擾素(包括幹複津)的抗腫瘤如抗乳腺癌和宮頸癌作用；還極大地降低了毒副作用並可安全的大劑量使用(每劑用量可>1000萬IU)，使需要大劑量用藥干擾素的部分病毒性疾病或腫瘤的成功治療成為可能。

由此可見，本發明所使用的重組干擾素具有與幹複津不同的空間構象、增強的生物學活性以及不同的藥代動力學特性。

當在本文中使用時，術語“空間構象”、“空間結構”、“三維結構”和“三維構象”可互相交換使用。

因此，在一個實施方案中，本發明所使用的重組干擾素包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，並由包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列編碼。進一步地，本發明所使用的重組干擾素的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，並由如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列編碼。進一步地，所述重組干擾素與具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(或與具有相同的氨基酸序列)但不為如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列編碼的干擾素例如幹複津相比，具有改變的空間構象和/或增強的生物學活性和/或不同的藥代動力學特性，舉例來說，所述重組干擾素具有改變的空間構象和增強的生物學活性、具有改變的空間構象和不同的藥代動力學特性、或具有增強的生物學活性和不同的藥代動力學特性。更進一步地，所述改變的空間構象包括：所述重組干擾素在190-250nm範圍內的原二色譜顯著不同於在同樣條件下測定的幹複津的圓二色譜和/或在250-320nm範圍內的圓二色譜與幹複津的圓二色譜也顯著不同；所述增強的生物學活性包括：增強的抗病毒活性、增強的抗腫瘤活性、更低的副作用和/或能大劑量使用，例如每劑用量可>1000萬IU，舉例來說，所述增強的生物學活性可以是增強的抗病毒活性和增強的抗腫瘤活性等等，進一步地所述腫瘤可以是乳腺癌和宮頸癌；所述不同的藥代動力學特性包括：在肌肉注射給體重指數為18-23範圍內的人體後，以采血時間對受試人體血清中的2-5A寡聚核苷酸酶濃度作圖，所得曲線的曲線下面積顯著大於在同一 條件下注射幹複津所獲得的曲線下面積和/或與幹複津相比更長的半衰期。

在另一個實施方案中，本發明中使用的重組干擾素可由如下方法所產生，所述方法包括：將編碼重組干擾素的包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列導入分離的宿主細胞中，在適合於表達所述重組干擾素的條件下培養所述宿主細胞，和收穫所述重組干擾素，其中所述重組干擾素具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，並且所述重組干擾素抑制乙型肝炎病毒的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌。進一步地，所述宿主是大腸桿菌，如。大腸桿菌LGM 194。進一步地，其中包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列處於啟動子PBAD的控制下。進一步地，其中收穫步驟包括從培養發酵液中提取干擾素，收集包涵體，所收穫干擾素的變性和複性。更進一步地，所述收穫步驟進一步包括分離純化所述重組干擾素(參見美國專利第7,364,724號權利要求)。

重組干擾素晶體及結晶方法

重組干擾素晶體

本發明提供了一種本發明重組干擾素的晶體。

在一個實施方案中，本發明提供了一種包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重組干擾素的晶體。進一步地，所述晶體具有三方晶型。在一個實施方案中，所述晶體的空間群為P3121。在某些實施方案中，所述晶體的單晶胞參數為：a=b=77.92埃，c=125.935埃，α=β=90°，γ=120°，所有晶胞參數的可變性不超過5%。在某些實施方案中，所述晶體在一個不對稱單位中包含2個分子。在某些實施方案中，所述晶體包含共價或非共價結合的金屬離子。進一步地，所述金屬離子可以是鎂離子、鋅離子等，這些金屬離子可介導晶體中干擾素二聚體的形成。在某些實施方案中，所述重組干擾素由包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列所編碼。

在更進一步的實施方案中，本發明提供了一種包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(優選其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示) 的重組干擾素的晶體，其中該晶體的空間群為P3121，在一個不對稱單位中包含2個分子，以及單晶胞參數為：a=b=77.92埃，c=125.935埃，α=β=90°，γ=120°，所有晶胞參數的可變性不超過5%。進一步地，這樣的重組干擾素由包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列所編碼，優選由如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列所編碼。

結晶方法

本發明提供了製備(培養)本發明重組干擾素晶體的方法。

在一個實施方案中，本發明提供了一種製備(培養)本發明重組干擾素晶體的方法，包括步驟：將重組干擾素濃縮至約3-3.5mg/ml，置於包含Li2SO4、CAPS(3-(環己氨基)-1-丙磺酸)和MgCl2的結晶溶液條件下合適的一段時間，獲得所述晶體。進一步地，所述晶體培養方法是在室溫如293K下進行的。在某些實施方案中，所述晶體培養採用懸滴法或坐滴法進行的，優選採用懸滴法(也稱為懸滴汽相擴散法)進行。在某些實施方案中，所述結晶溶液條件包含約1.0-約1.5M Li2SO4、約0.05-約0.15M CAPS(3-(環己氨基)-1-丙磺酸)和約0.01-約0.03M MgCl2。在某些實施方案中，所述結晶溶液條件的pH值在約10.5-約12.0範圍內，優選約11.1。在某些實施方案中，所述結晶溶液條件為1.2M Li2SO4、0.1M CAPS(3-(環己氨基)-1-丙磺酸)，pH 11.1，0.02M MgCl2。在某些實施方案中，所述晶體培養包括將上述含重組干擾素的結晶溶液靜置約1天-約2周，優選約2天-約10天，更優選約3天到約1周，例如3天-1周。

X-射線結晶學分析

在此公開的干擾素的每一個組成氨基酸都通過一組結構座標(也稱為“原子座標”)得到定義。術語“結構座標”指由數學方程式導出的笛卡兒座標，該數學方程式與X-射線單色光通過以晶體形式存在的本發明的干擾素的原子(散射中心)衍射獲得的圖樣相關。衍射資料用於計算晶體重複單元的電子密度圖。然後， 電子密度圖用於建立干擾素蛋白或蛋白/配體複合物的單個原子的位置。

通過數學方式操作所述干擾素或者干擾素/配體結構座標，還可產生輕微的結構座標改變。舉例來說，在此公開的結構座標可通過如下手段進行操作：結構座標的結晶學置換、結構座標的分段、結構座標集合的整體加減、結構座標的翻轉，或上述手段的任意組合。而由於氨基酸突變、添加、取代和/或缺失或在任何組成部分中的其他改變而導致的晶體結構的改變，也可引起結構座標的變化。在個體座標中這樣的輕微變化對總體形狀影響不大。如果與原始座標相比這樣的改變處於可接受的標準誤差之內，則所得到的三維形狀被認為是結構等價的。

應當指出本發明干擾素的個體結構座標中的輕微變化預計不會明顯改變上述實體如可與干擾素或其部分(如其AB或BC環)結合的配體的特性。當在本發明中使用時，本發明重組干擾素的“AB環”指本發明重組干擾素(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)第25-33位氨基酸殘基，即該AB環的序列為SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列SPFSCLKDR；本發明重組干擾素的“BC環”指本發明重組干擾素(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)第44-52位氨基酸殘基，即該BC環的序列為SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列DGNQFQKAQ。在上下文中，短語“與......結合”指配體或其部分與干擾素分子或其部分之間相鄰近的情況。這樣的結合可以是非共價的，其中這樣的相鄰近在能量上受益于氫鍵、范德華力或靜電相互作用；所述結合也可以是共價的。因此，作為實例，與干擾素的結合口袋或結合區結合的配體也應預期能結合結構等價的結合口袋或結合區，或與之相互作用。

對於本發明而言，對於任何分子或分子複合物或其任意部分，當疊合到在此描述的相關骨架原子上，具有小於約0.65埃的保守殘基骨架原子(如N、Cα、C、O，優選Cα)均方根偏差時，被認為是“結構等價的”。換言之，這兩個分子的這些部位的晶體結構在可接受的誤差範圍內是基本上相同的。特別優選的結構等 價的分子或者分子複合物為具有如下限定的分子或者分子複合物：在此公開的結構座標的完整集合±小於約0.65埃的來自於那些氨基酸的保守骨架原子的均方根偏差。更優選地，所述均方根偏差最多約0.5埃，還更優選最多約0.35埃。本發明的其他實施方案包括具有如下限定的分子複合物：在此公開的AB或BC環的結構座標±小於約0.65埃的均方根偏差，所述均方根偏差優選最多約0.5埃，還更優選最多約0.35埃。

術語“均方根偏差”指偏差的平方的算術平均值的方根，其用於表示與趨勢或物件的偏差或變化。在一個實施方案中，所述“均方根偏差”規定了一種蛋白質骨架相對於如在此描述的結構座標所限定的干擾素骨架或其部分的變化。

X-射線結構座標定義了空間中點的獨特構象。本領域技術人員應當理解蛋白、或蛋白/配體複合物、或它們的一部分的結構座標定義了一系列相應的點；而這些點又繼而定義了三維構象。如果座標之間的距離和角度保持基本上相同，則相似或相同的構象可為一組完全不同的座標所定義。此外，只要保持角度基本上相同，可伸縮的點構象就可通過在座標之間增加或減少距離來定義。

各種計算分析可用于確定分子或其部分與在此公開的干擾素或其部分是否是根據三維結構定義的“結構等價的”。舉例來說，可通過各種計算分析進行不同結構、相同結構的不同構象、或相同結構的不同部分之間的比較。在一個實施方案中，所述分析可包括以下四個步驟：(1)載入需要比較的結構；(2)在這些結構中定義原子等價性；(3)執行擬合操作；和(4)分析結果。

重組干擾素(rSIFN-co)的三維結構

本發明提供了本發明重組干擾素的三維結構。

這種三維結構既不同于現有技術已公佈的IFN-α2b的三維結構(參見圖12)、也不同于美國安進公司幹複津的計算模型結構(參見圖14)，尤其在AB環和BC環上與IFN-α 2b及幹複津存在著結構上的差異。

在一個實施方案中，所述重組干擾素的三維結構包含如表7所示的重組干擾素的原子座標，所述原子座標任選地在小於約0.65埃，優選約0.5埃以及更優選約0.35埃的保守殘基骨架原子優選Cα原子(也稱為“α碳原子”)的均方根偏差內變化。

在一個實施方案中，在上述重組干擾素的三維結構中，所述重組干擾素的每個單體都由6段α螺旋、1段310螺旋及其間的連接肽段構成。所述6段α螺旋對應的氨基酸殘基位置分別為13-20、50-68、70-76、79-100、114-133和138-160；所述的1段310螺旋對應的氨基酸殘基位置為40-43。單體結構的折疊方式屬於螺旋狀細胞因數型(helical cytokine)，特徵在於：在將所述重組干擾素的α碳原子骨架與IFN-α2b蛋白的α碳原子骨架以最小二乘法方式進行疊合後，該重組干擾素在第25-33位殘基(AB環)上的各α碳原子與所述IFN-α2b蛋白在對應位殘基上的各α碳原子的位置均方根偏差(location root-mean-square deviation)為3.63埃±5%。

優選的是，所述重組干擾素與所述IFN-α2b蛋白在第25位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為3.291埃±5%；在第26位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為4.779埃±5%；在第27位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為5.090埃±5%；在第28位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為3.588埃±5%；在第29位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為2.567埃±5%；在第30位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為2.437埃±5%；在第31位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為3.526埃±5%；在第32位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為4.820埃±5%；在第33位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為2.756埃±5%。

還優選的是，所述重組干擾素在第44-52位殘基(BC環)上的各α碳原子與所述IFN-α2b蛋白在對應位殘基上的各α碳原子的位置均方根偏差為2.90埃±5%。其中，所述重組干擾素與所述IFN-α2b蛋白在第44位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為1.614埃±5%，在第45位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為 1.383埃±5%，在第46位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為2.735埃±5%，在第47位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為2.709埃±5%，在第48位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為5.018埃±5%，在第49位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為4.140埃±5%，在第50位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為3.809埃±5%，在第51位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為2.970埃±5%，在第52位殘基上的α碳原子的位置均方根偏差為0.881埃±5%(上述所列的“位置均方根偏差”均為座標位置的均方根偏差)。

在另一方面，本發明提供了經選擇的本發明重組干擾素的三維結構的一部分，其中所述三維結構經選擇的部分包含表7中所包含的來自第25-33位氨基酸殘基和/或第44-52位氨基酸殘基的一個或更多個氨基酸殘基的原子座標。在某些實施方案中，本文所述的“一個或更多個氨基酸殘基”包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18個氨基酸殘基。在某些實施方案中，“所述三維結構經選擇的部分”包含表7中所包含的來自第25-33位氨基酸殘基和/或第44-52位氨基酸殘基的原子座標。在某些實施方案中，“所述三維結構經選擇的部分”包含表7中所包含的來自至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個氨基酸殘基的原子座標。在某些實施方案中，上述原子座標任選地在小於約0.65埃，優選約0.5埃以及更優選約0.35埃的保守殘基骨架原子優選Cα原子的均方根偏差內變化。

在又一方面，本發明提供了一種包含本發明的重組干擾素的三維結構的蛋白質空間結構模型。在一個實施方案中，所述蛋白 質空間結構模型可以是電子密度圖、線框模型、網狀模型、空間填充模型、棍狀模型、帶狀模型、分子表面模型等等。

在再一方面，本發明提供了一種可伸縮(scalable)的由點組成的三維構象，所述點的至少一部分來源於在此披露的結構座標，或來源於包含本發明的重組干擾素的AB環或BC環的肽。在一個實施方案中，所述可伸縮的由點組成的三維構象展示為全息圖、立體圖、模型或者電腦顯示圖片。

三維結構的應用

篩選/設計與重組干擾素相互作用的候選物質

在一方面，本發明提供了一種篩選/設計與本發明重組干擾素相互作用的候選化合物的方法。進一步地，所述方法利用到本發明重組干擾素的三維結構，更進一步地，所述方法是基於電腦的。在一個實施方案中，本發明提供了一種基於電腦的鑒定能與重組干擾素相互作用的候選化合物的方法，所述方法包括步驟：(a)提供包含表7所示的重組干擾素的原子座標的三維結構，所述原子座標任選地在小於約0.65埃，優選約0.5埃以及更優選約0.35埃的保守殘基骨架原子優選Cα原子的均方根偏差內變化；和(b)選擇具有能與上述三維結構或該三維結構經選擇的部分相互作用的結構特徵的候選化合物，從而鑒定能與所述重組干擾素相互作用的候選化合物。在某些實施方案中，所述結構特徵選自抗原性位元點、親水特性、表面可接近性和結構基序。在某些實施方案中，步驟(b)中的候選化合物的選擇和鑒定包括：(i)對多個候選化合物生成三維結構；和(ii)將步驟(i)的三維結構各自與上述步驟(a)中的三維結構或該三維結構經選擇的部分進行擬合，以發現在能量上最有利的相互作用，從而鑒定能與所述重組干擾素相互作用的候選化合物。在某些實施方案中，所述方法進一步包括步驟：(c)獲取或合成候選化合物；和(d)使所述候選化合物與所述重組干擾素接觸以確定該候選化合物與所述重組干擾素相互作用的能力。進一步地，所述確定候選化合物與重組干擾素 相互作用的能力的步驟還可包括進一步包括測定所述重組干擾素與候選化合物接觸時的活性。舉例來說，要被測試的干擾素活性包括：抗病毒活性、抗腫瘤活性、抗增殖活性、天然殺傷細胞活性和免疫調節活性。在某些實施方案中，所述候選化合物是與所述重組干擾素或其經選擇的部分結合的配體。舉例來說，所述配體選自：受體、改性劑、激動劑和拮抗劑，舉例來說，這樣的受體可以是IFNAR1、IFNAR2或它們的複合物；以及其中所述經選擇的部分包含所述重組干擾素的第25-33位氨基酸殘基(AB環的序列)和/或第44-52位氨基酸殘基(BC環的序列)的一個或更多個氨基酸殘基。進一步地，其中所述經選擇的部分包含來自所述重組干擾素的第25-33位氨基酸殘基和/或第44-52位氨基酸殘基。

在另一方面，本發明提供了一種鑒定能與本發明重組干擾素相結合的潛在配體的方法。在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟：將在此公開的晶體暴露於一種或多種包含潛在配體的樣品，並確定是否形成配體-干擾素分子複合物。

在另一方面，本發明提供了一種獲取用於設計能與干擾素形成分子複合物的潛在配體的結構資訊的方法。在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟：將在此公開的晶體暴露於潛在配體庫，並確定是否形成配體-干擾素分子複合物。

在另一方面，本發明提供了一種電腦輔助的用於鑒定、設計或製備潛在干擾素活性調節劑的方法。在一個實施方案中，所述方法包括篩選化學或者生物實體庫。

本領域技術人員可應用結晶學手段來篩選並鑒定可能成為干擾素配體的化學或生物實體(見美國專利第6,297,021號)。舉例來說，一種優選的方法可包括以下步驟：獲得非配體化的干擾素晶體；將所述非配體化的干擾素晶體暴露於一種或多種包含潛在干擾素配體的測試樣品；和確定是否形成配體-干擾素分子複合物。可通過多種方法將所述干擾素暴露於潛在配體，所述方法包括但不限於，將干擾素晶體浸泡於含有一種或多種潛在配體的溶液中，或者，在一種或多種潛在配體的存在下共結晶干擾素。

來自所述配體-干擾素複合物的結構資訊可優選地用於設計新配體，該新配體較已知配體結合得更緊密、結合得更特異，具有期望的生物活性特性，具有更高的安全性，甚至具有以上優點的結合。舉例來說，計算出的電子密度圖直接揭示了結合事件，鑒定了結合的化學或者生物實體，並且提供了配體-干擾素複合物的詳細三維結構。一旦命中(hit)，就可通過傳統的篩選方法找出該命中的一系列具有更緊密結合或期望的生物活性的類似物或衍生物。任選地，可將配體-干擾素迭代暴露於額外的潛在配體，使得兩次或更多次命中能優選地結合在一起以鑒定或設計更具效力的配體。

結構同源分子的獲得/設計干擾素的模擬物

在此公開的結構座標可用於幫助獲得關於其他結晶分子或分子複合物的結構資訊。本發明的方法可以用於確定與在此公開的干擾素具有一個或多個相似結構特徵的分子或者分子複合物的三維結構的至少一部分。所述的分子在此稱為“結構同源的”。相似的結構特徵可包括例如氨基酸同一性區域、保守的活性位元點或結合位點基序、以及相似排列的二級結構元件(例如，α螺旋和β折疊)。在另一個實施方案中，通過比對兩條氨基酸序列的殘基以優化其序列長度上相同氨基酸的個數來確定結構同源性；在進行比對過程中，允許再這兩條序列中的一條或兩條中存在空位，以優化相同氨基酸的個數，但是，這些氨基酸必須在其各自序列中保持固有順序。優選地，結構同源的分子是一種具有與SEQ ID NO：1至少65%同一性的氨基酸序列的蛋白質。更優選地，與本發明的干擾素結構同源的蛋白質包含與SEQ ID NO：1的類似部分具有至少80%氨基酸序列同一性的至少50個氨基酸殘基的連續區段。用於生成結構同源分子或分子複合物的結構資訊的方法在本領域中是公知的。

在此公開的結構坐標系還可用於解析相關干擾素、干擾素突變體或與各種配體共複合的干擾素同系物的晶體結構。該應用使確定配體和干擾素(如候選的干擾素改性劑和干擾素)之間相互 作用的最佳位點得以可能。本方法還適用于鑒定分子的多個結合位點中用於修飾的潛在位點。這一資訊的獲得為確定最有效的結合相互作用(如在干擾素及其配體之間增強的疏水相互作用)提供了額外的途徑。

此外，在一個實施方案中，本發明還提供了一種基於電腦設計重組干擾素類比物的方法，包括步驟：(a)對多個類比物生成三維結構；和(b)將步驟(a)的多個類比物的三維結構各自與包含表7所示的重組干擾素的原子座標的三維結構或該三維結構經選擇的部分進行擬合，以發現所述重組干擾素的最佳擬合模擬物，所述原子座標任選地在小於約0.65埃，優選約0.5埃以及更優選約0.35埃的保守殘基骨架原子優選Cα原子的均方根偏差內變化。

合理藥物設計

電腦技術可用於篩選、鑒定、選擇和/或設計能與干擾素或結構同源的分子結合的化學實體或配體。在此公開的干擾素的結構座標的資訊使得具有與在此公開的干擾素的構象互補形狀的合成化合物和/或其他分子的設計和/或鑒定得以可能。具體而言，電腦技術可用於鑒定或設計與干擾素或其部分(如AB或BC環)結合的化學實體或配體，例如受體、改性劑、激動劑和拮抗劑等。潛在的改性劑可結合干擾素的活性位元點或其部分，或干擾之，並可以是競爭性、非競爭性或無競爭性的抑制劑；或通過結合兩個單體之間的介面，從而干擾二聚化。一旦針對生物活性進行鑒定或篩選，這些抑制劑/激動劑/拮抗劑就可在治療上或預防上用於阻斷或增強干擾素活性。還可通過電腦技術獲得干擾素結合與干擾之的配體類似物的結構-活性資料。

當在本文中使用時，術語“化學實體”指化合物、兩種或更多種化合物的複合物、及所述化合物或複合物的片段。被確定能與本發明的干擾素相結合的化學實體就是潛在的藥物候選物。因此，如在此所鑒定的本發明的干擾素或結構同源分子或其部分的結果的三維結構圖示可有利地用於藥物研發。通過本領域可獲得 的多種電腦方法和技術中某一種，所述化學實體的結構坐標系可用于生成三維圖像，該三維圖像又可通過電腦與所述干擾素或結構同源分子的三維圖像進行擬合。

本發明的藥物設計方法的一個實施方案包括評估已知化學實體或配體與所述干擾素或其結構同源分子的潛在結合。因此，所述藥物設計方法還包括通過電腦來評估所選擇的化學實體或配體與本文所列的任何一種分子或分子複合物的潛在結合。在另一個實施方案中，所述藥物設計方法包括與本發明干擾素、其同系物或它們的部分結合的化學實體或配體的電腦輔助設計。化學實體或配體可以步進方式進行設計，一次一條片段，或可作為整體進行設計或“從頭(de novo)”設計。

因此，在一個實施方案中，本發明提供了一種基於電腦的合理藥物設計方法，包括步驟：(a)提供包含表7所示的重組干擾素的原子座標的三維結構，所述原子座標任選地在小於約0.65埃，優選約0.5埃以及更優選約0.35埃的保守殘基骨架原子優選Cα原子的均方根偏差內變化；(b)提供多個分子片段，並對其生成三維結構；(c)將所述多個分子片段的三維結構各自與步驟(a)的三維結構或該三維結構經選擇的部分進行擬合；和(d)將經選擇的所述分子片段組裝到一個分子中以產生候選藥物。在一個實施方案中，所述方法進一步包括步驟：(e)獲得或合成候選藥物；和(f)令所述候選藥物與所述重組干擾素接觸，從而確定候選藥物與所述重組干擾素相互作用的能力。

在本發明的某些實施方案中，所述三維結構經選擇的部分包含表7中來自第25-33位氨基酸殘基(SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列)和/或第44-52位氨基酸殘基(SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列)的一個或更多個氨基酸殘基的原子座標，進一步地，所述三維結構經選擇的部分包含表7中來自第25-33位氨基酸殘基(SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列)和/或第44-52位氨基酸殘基(SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列)的原子座標，上述原子座標 任選地在小於約0.65埃，優選約0.5埃以及更優選約0.35埃的保守殘基骨架原子優選Cα原子的均方根偏差內變化。

同源模建

在一方面，通過同源模建，可構建或優化未被結晶的干擾素同系物的電腦模型。首先，通過序列比對、二級結構預測、結構庫篩選或這些技術的任意組合，創建出干擾素同系物的初級模型。計算軟體可用於實施所述的序列比對和二級結構預測。諸如在插入或缺少周圍形成的結構碎片之類的結構不連貫可通過篩選具有期望長度和合適構象的肽結構庫從而模建獲得。若所述干擾素同系物已經結晶，則可通過本領域已知技術使用最終的同源模型來解析該同系物的晶體結構。其次，讓所述初級模型能量最小化以生成能量最小化模型。該能量最小化模型可包含違背立體化學約束的區域，在這種情況下，可使用本領域已知技術對這些區域重新模建以獲得最終的同源模型。

在另一方面，本發明提供了一種獲取關於未知結構分子或分子複合物的結構資訊的方法。在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟：結晶所述分子或分子複合物；由所述結晶的分子或分子複合物產生X射線衍射圖；以及將所述的X射線衍射圖應用於在此公開的干擾素的至少一部分的結構座標，從而產生所述未知結構分子或分子複合物的至少一部分的三維電子密度圖。

在另一方面，本發明提供了一種干擾素同系物的模建方法。在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟：將推定的干擾素同系物的氨基酸序列與本發明的重組干擾素的氨基酸序列進行比對並將推定的干擾素同系物的氨基酸序列摻入由在此披露的結構座標形成的干擾素模型中，從而生成干擾素同系物的初級模型；對所述初級模型進行能量最小化以生成能量最小化模型；重建所述能量最小化模型中違背立體化學約束的區域，從而生成干擾素同系物的最終模型。

干擾素模擬物

本發明提供了干擾素模擬物。

在一方面，本發明提供了包含在此公開的序列的肽，或其衍生物、活性部分、類似物、變體或模擬物，及其用途。因此，在一個實施方案中，本發明提供了一種干擾素模擬物，其包含如SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。在一個實施方案中，將所述干擾素類比物三維結構中的α碳原子骨架與IFN-α2b三維結構中的α碳原子骨架以最小二乘法方式進行疊合後，該干擾素模擬物在對應於IFNα2b蛋白質分子中第25-33位殘基上的各α碳原子與IFNα2b蛋白質分子在對應位殘基上的α碳原子均方根偏差為3.63埃±5%。在某些實施方案中，與IFNα2b對應位殘基相比，所述干擾素模擬物在第25-33位殘基上的α碳原子偏差分別是3.291埃±5%、4.779埃±5%、5.090埃±5%、3.588埃±5%、2.567埃±5%、2.437埃±5%、3.526埃±5%、4.820埃±5%和2.756埃±5%。在某些實施方案中，將所述干擾素類比物三維結構中的α碳原子骨架與IFN-α2b三維結構中的α碳原子骨架以最小二乘法方式進行疊合後，該干擾素模擬物在對應於IFNα2b蛋白質分子中第44-52位殘基上的各α碳原子與IFNα2b蛋白質分子在對應位殘基上的α碳原子均方根偏差為2.90埃±5%。在某些實施方案中，與IFNα2b對應位殘基相比，所述干擾素模擬物在第44-52位殘基上的α碳原子偏差分別是1.614埃±5%、1.383埃±5%、2.735埃±5%、2.709埃±5%、5.018埃±5%、4.140埃±5%、3.809埃±5%、2.970埃±5%和0.881埃±5%。在某些實施方案中，所述干擾素模擬物是功能性類比物或結構性類比物。在某些實施方案中，所述干擾素模擬物是本發明重組干擾素(rSIFN-co)的模擬物，進一步地，所述干擾素模擬物不包含幹複津。在某些實施方案中，所述干擾素類比物的三維結構類似于本發明重組干擾素(rSIFN-co)的三維結構，尤其在相應于本發明重組干擾素的AB環和BC環位置處，兩者的三維結構可以是基本上相同或完全相同的。進一步地，所述干擾素類比物的三維結構包含表7中來自第25-33位氨基酸殘 基(AB環)和/或第44-52位氨基酸殘基(BC環)的原子座標，所述原子座標任選地在小於約0.65埃，優選約0.5埃以及更優選約0.35埃的保守殘基骨架原子優選Cα原子的均方根偏差內變化。

本發明包含其中個體氨基酸可被在本領域中被認為密切相關的其他氨基酸所取代的變體肽。舉例來說，所述個體氨基酸可由以下方式進行取代：可用任何疏水性脂肪族氨基酸取代其他疏水性脂肪族氨基酸；可用任何疏水性芳香族氨基酸取代其他疏水性芳香族氨基酸；可用任何帶有極性側鏈的中性氨基酸取代其他帶有極性側鏈的中性氨基酸；可用任何酸性氨基酸取代其他酸性氨基酸；可用任何鹼性氨基酸取代其他鹼性氨基酸。當在本文中使用時，“模擬物”、“功能性/結構性類比物”均指具有與在此公開的多肽相同的功能/結構活性的肽變體或有機化合物。這樣的類比物或者類似物的實例包括：被模建以比擬在此公開的干擾素的三維結構(該三維結構包含表7所示的重組干擾素的原子座標)，特別是如上所述的氨基酸殘基的排列的化合物或肽。因此，當在本文中使用時，“本發明重組干擾素的模擬物”指與具有與本發明重組干擾素(rSIFN-co)相同的功能/結構活性但不同于本發明重組干擾素的肽變體或有機化合物，尤其是具有與本發明重組干擾素的AB環和/或BC環相同的空間結構但不同于本發明重組干擾素的肽變體或有機化合物。當作為肽變體時，這樣的“模擬物”的氨基酸序列一般具有與本發明重組干擾素的氨基酸序列類似的長度，例如可包含約120-200個氨基酸殘基，優選約140-180個氨基酸殘基，更優選約150-175個氨基酸殘基，還更優選約160-170個氨基酸殘基，例如約164、165、166或167個氨基酸殘基；或者，這樣的“模擬物”可以是包含本發明重組干擾素的AB環和/或BC環的具有較短氨基酸序列長度的肽變體，例如其可包含約10-100個氨基酸殘基，優選約15-80個氨基酸殘基。

可通過本領域通常所知的模建技術生成適合的模擬物或者類似物。包括設計涉及研究功能相互作用的“模擬物”以及設計包含以使之能產生上述相互作用的方式排列的官能團的化合物。

對已知藥學活性化合物設計模擬物是一種基於“前導”化合物用於開發藥物的已知方法。這一方法可用于獲得不易合成或需高價合成的活性化合物，也可用於改良不宜於常規給藥的活性化合物；所述不宜於常規給藥的活性化合物包括：會在消化道中被蛋白酶快速分解，從而不宜於口服的活性化合物多肽。模擬物設計、合成和測試可用於避免針對目標性質隨機篩選大量分子。

在根據具有給定目標特性的化合物/肽設計模擬物的過程中，通常包括以下幾步：首先，確定對於決定目標性質起關鍵和/或重要作用的化合物/肽的特定部分。就肽而言，可通過系統性地改變肽中的氨基酸殘基從而實現這樣的確定，例如將每個殘基依次取代。構成化合物活性區的這些部分或殘基被稱為其“藥效團”。

一旦發現所述藥效團，就可根據其物理性質對其結構進行模建；所述物理性質例如立體化學性、鍵合、大小和/或電荷、該模建使用了來自多種來源例如光譜技術、X-射線衍射和NMR的資料。計算分析、相似性製圖(其模擬了藥效團的電荷和/或體積，而非原子間鍵合)以及其他技術可用於該模建過程中。在該方法的變型中，模建配體及其結合伴侶的三維結構。這一方法特別適用於配體和/或結合伴侶在結合中產生構象變化的情況，從而容許在類比物設計中對該模型作進一步考慮。

然後，選擇可將類比藥效團的化學基團移植到其上的範本分子。可便利地選擇所述範本分子及移植到其上的化學基團，從而容易地合成所述模擬物；而所合成的模擬物除了保持前導化合物的生物活性外，還可能是藥理學可接受的，並且不會在體內降解。通過這一手段獲取的模擬物經篩選後，即可得知其是否具有目標性質或者在什麼程度上顯示了目標性質。然後，可進行進一步的優化和改性，以獲得用於體內或臨床測試的一種或多種最終的模擬物。

在另一方面，本發明還提供了一種非配體化的分子；所述分子具有在此公開的干擾素的至少一部分。例如，所述非配體化結合的分子可包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示序列(分別 為在此公開的干擾素的AB環和BC環的序列)，進一步地所述非配體化的分子具有如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示序列。

組合物及治療應用

本發明提供了包含本發明的重組干擾素晶體或本發明的重組干擾素類比物的組合物。在一個實施方案中，所述組合物是藥物組合物。在一個實施方案中，所述藥物組合物進一步包含有藥學上可接受的載體。

無論是就本發明而言用於人體給藥的多肽、抗體、肽、核酸分子、小分子、模擬物還是其他藥學上有用的化合物，優選的給藥劑量都是“預防有效劑量”或“治療有效劑量”(當然預防也可被認為是治療的一個方面)，這樣的劑量足以顯示對個體的有益效果。本發明的實際給藥劑量、給藥頻率以及給藥時間隨受治療疾病的性質和嚴重程度而定。治療處方，如劑量確定等問題，由醫生或其他醫務工作者按情況而定。藥物組合物可依據情況單獨給藥或聯合給藥。

根據本發明並供本發明所用的藥物組合物，除活性成分外，可包括：藥學上可接受的賦形劑、載體、緩衝劑、穩定劑或其他本領域公知的物質。這類物質應當是無毒且不會影響活性成分效力的物質。載體或其他物質的確切性質依據給藥方式而定；所述給藥方式包括口服和注射；而注射則進一步包括皮下注射、肌肉注射以及靜脈注射等。上述技術和給藥方案的實例可見Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.(編)，1980。

在某些實施方案中，所述藥物組合物可配製成如下劑型，包括：片劑、膠囊、口服液、貼劑、注射劑、噴霧劑、栓劑、溶液製劑，推薦的劑型為注射劑。可皮下或靜脈注射給藥，藥物組合物中的載體可使用任何一種適宜的可接受的藥物載體，包括粘合劑、崩解劑、潤滑劑、填充劑、增溶劑、緩衝劑、防腐劑、增稠劑、配合劑和其他佐劑。

根據本發明的不同目的，“藥學上可接受的載體”是指任何標準的藥用載體。例如公知的適當載體包括但不僅限於任何標準藥用的載體如：磷酸鹽緩衝液及各種潤濕劑。其他載體可能包括用於片劑、顆粒劑及膠囊等的添加劑。典型的載體常含有如：澱粉、乳液、糖、纖維素、某種類型的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽類、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物油脂、樹膠、乙二醇或其他已知的賦形劑。這些載體中也可能還含有調味劑及增色劑及其它成分。這些載體中的成分可用公知的傳統方法調製。

進一步地，由於本發明重組干擾素的模擬物具有本發明重組干擾素的AB環和/或BC環結構(如上述特定的AB環和/或BC環空間結構)，因此預計其能與本發明的重組干擾素一樣，用於治療病毒性疾病和/或腫瘤。

因此，在另一方面，本發明提供了本發明的重組干擾素晶體、干擾素類比物或包含上述晶體或類比物的組合物在製備用於治療病毒性疾病和/或腫瘤的藥物中的應用。

在另一方面，本發明提供了一種治療病毒性疾病和/或腫瘤的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的本發明的重組干擾素晶體、干擾素類比物或包含上述晶體或類比物的組合物。

在另一方面，本發明還提供了一種用於治療病毒性疾病和/或腫瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的本發明的重組干擾素晶體、干擾素類比物或包含上述晶體或類比物的組合物。

在某些實施方案中，所述病毒性疾病可包括：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、其他類型的肝炎、由Epstein-Barr病毒、人體免疫缺陷病毒(HIV)、埃博拉病毒、嚴重急性呼吸道綜合征病毒(SARS)、流感病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒、或其他類型的皰疹病毒、乳頭多瘤空泡病毒、痘病毒、小核糖核酸病毒、腺病毒、鼻病毒、I型人類T細胞白血病病毒、或者II型人類T細胞白血病病毒，或者III型人類T細胞白血病病毒引起的病毒感染。

在某些實施方案中，所述腫瘤是癌症、實體瘤，所述腫瘤可包括：皮膚癌、基底細胞癌及惡性黑色素瘤、腎細胞癌、肝癌、甲 狀腺癌、鼻咽癌、實體腫瘤、前列腺癌、胃/腹癌、食道癌、直腸癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、淺表膀胱癌、血管瘤、表皮樣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、神經膠質瘤、血癌、急性血癌、慢性血癌、慢性骨髓性白血病、毛細胞白血病、淋巴腺瘤、多發性骨髓瘤、紅血球過多病、卡波濟氏肉瘤。

本發明將通過下列實施例得以詳細描述，所述實施例僅作為解釋說明目的，並不意在限制本發明的範圍。可對本發明進行修改而不背離的本發明的範圍。

所有出版物、專利和專利申請在此以其整體併入作為參考，如同每篇獨立出版物、專利或專利申請被明確且單獨地指出以其整體併入作為參考一樣。

實施例1 重組干擾素rSIFN-co的製備

一、基因克隆：根據已發表的幹複津的編碼DNA序列及推斷的氨基酸序列資料(Klein ML等，Structural characterization of recombinant consensus interferon-alpha.Journal of Chromatography,1988,454：205-215)，利用大腸桿菌優先表達密碼子(The Wisconsin Package,by Genetics Computer Group,Inc.Copyright 1992,Medison,Wisconsin,USA)，在保證氨基酸序列不變的情況下，對其DNA編碼序列進行分子設計，然後人工合成rSIFN-co全長cDNA編碼基因。

合成rSIFN-co cDNA序列

rSIFN-co cDNA 5'-端和3'-端半分子的合成

用PCR方法直接合成rSIFN-co cDNA 5'-端280bp(I片段)和3'-端268bp(Ⅱ片段)兩個cDNA半分子。片段I的3'-端與片段Ⅱ的5'-端有41bp的核苷酸序列重疊互補。

化學合成如下寡聚去氧核苷酸片段

Oligomer A：

Oligomer B：

Oligomer C：

Oligomer D：

Oligomer E：

Oligomer F：

(2)PCR反應

PCR反應I合成rSIFN-co 5'-端半分子：用寡聚去氧核苷酸片段B作為範本，A和C兩個寡聚去氧核苷酸片段作為引物，進行PCR反應合成長度為280bp的rSIFN-co 5'-端半分子產物。

PCR I反應週期為：95℃ 2′→(95℃ 45"→65℃ 1′→72℃ 1′)×25週期→72℃ 10′→4℃

PCR反應Ⅱ合成rSIFN-co 3'-端半分子：用寡聚去氧核苷酸片段E作為範本，D和F兩個寡聚去氧核苷酸片段作為引物，進行PCR反應合成長度為268bp的rSIFN-co 3'-端半分子產物。

PCR Ⅱ反應條件和週期同PCR I。

rSIFN-co全長cDNA分子的組裝

採用“重疊-延伸PCR”方法將上述PCR合成的I和Ⅱ片段組裝在一起從而得到完整的rSIFN-co cDNA全長分子序列。並且在其5'-端和3'-端分別引入Nde I和Pst I限制性酶切位點，以便於將rSIFN-co cDNA序列克隆到質粒載體中去。

(1)化學合成引物

Oligomer G：5'ATCGGCCATATGTGCGACCTGCCGCAGACCC3'

Oligomer H：5'ACTGCCAGGCTGCAGTTATTCTTTACGACGCAGACGTTCC3'

(2)“重疊-延伸PCR”反應

注：用美國Stratagen公司生產的StrataPrep PCR純化試劑盒將PCR產物先進行分離純化，然後溶於消毒蒸餾水中。

PCR反應條件及週期同前述PCR I。

rSIFN-co基因的克隆及序列分析

選用pLac T7質粒作為rSIFN-co cDNA基因克隆的載體。pLac T7質粒是經pBluescript Ⅱ KS(+)質粒(美國Stratagen公司生產)改造而成。

用StrataPrep PCR純化試劑盒(美國Stratagen公司生產)將含rSIFN-co全長cDNA PCR產物進行純化，然後用NdeI和PstI進行酶切；同時將pLac T7質粒進行NdeI和PstI雙重酶切。將這二種酶切DNA片段在1%瓊脂糖膠上進行電泳分離，然後用美國Promoga公司的Winzard DNA純化試劑盒從膠中回收，純化507bp長的rSIFN-co DNA片段和2.9kb的質粒酶切DNA片段。將二者經T4 DNA連接酶催化連接成重組質粒。將連接反應混合物轉化DH5 α感受態細胞(美國Gibco公司生產)。經37℃過夜培養後，挑選陽性重組菌落，命名為pHY-1。

按DNA序列分析試劑盒(SequiThermTM Cycle Sequencing Kit，購自美國Epicentre Technologies公司)說明書進行DNA序列測定反應，其中引物為通用T7和T3引物，DNA測序結果顯示其與理論設計相符。

純化的重組rSIFN-co蛋白進行N-末端16個氨基酸及C-末端4個氨基酸序列測定。其結果為：N端：Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-

其N-末端的甲硫氨酸(Met)在成熟蛋白中被切除。

C端：Arg-Arg-Lys-Glu-COOH。

rSIFN-co全長核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

表達載體的構建、轉化、酶切鑒定及其遺傳穩定性

表達載體的構建、轉化

將大腸桿菌表達載體pBAD18質粒先經Nde I酶解，使質粒線性化(Linearized)，然後用Xba I進行充分酶解。經1%瓊脂糖凝膠電泳，再用德國QIAGEN公司生產的QIAEX Ⅱ試劑盒純化，得到pBAD18經NdeI和XbaI消化的4.8kb片段。

與此同時將pHY-1質粒進行Nde I和Xba I雙酶切，同樣經1%瓊脂糖凝膠電泳分離後，純化出715bp大小的序列片段。將上 述4.8kb的pBAD18片段與715bp的rSIFN-co和pBAD18酶切片段在T4 DNA連接酶催化下連接成重組質粒。將連接反應物轉化DH5 α感受態細胞，然後將轉化細胞塗於LB-Amp瓊脂平板，置37℃培養過夜。

陽性克隆菌株的篩選

隨機從上述LB平板中挑起單個細菌菌落，用核酸內切酶酶解，PCR分析的方法篩選含rSIFN-co全長編碼序列的重組質粒菌株。將其中一個PCR陽性重組質粒命名為pHY-5。將含有pHY-5質粒的菌株命名為PV Ⅲ，擴增後加入甘油凍存液凍存於-80℃備用。

rSIFN-co基因在E.coli LMG194中的高效表達

在pHY-5質粒中，rSIFN-co基因處於強啟動子PBAD的調控之中，而PBAD又受Ara C蛋白的調控。Ara C是由位於同一質粒中的ara C基因編碼的蛋白質。在沒有阿拉伯糖存在的情況下，Ara C二聚體與O2及I2結合形成一個210bp的環。這一結構導致轉錄的完全抑制。當加入阿拉伯糖時，Ara C二聚體與O2脫離，並轉而與I1和I2結合，解除對轉錄的抑制。阿拉伯糖結合失活、抑制、及啟動PBAD啟動子的轉錄，從而刺激PBAD介導高水準的rSIFN-co表達。rSIFN-co表達量可達菌體總蛋白的50%。

二、分離純化：(1)、製備生產菌種：將含有表達載體pHY-5的E.coli LMG194工程菌種接種在LB培養基中，37℃，搖瓶振盪(200rpm)培養過夜(約18小時)，細菌培養液中加入50%濃度為30%的甘油，混勻分裝成1ml每支，-20℃保存，作為生產菌種；(2)、製備I級種子菌：將生產菌種按1%的比例接入LB培養基(1L中含有胰蛋白腖10g，酵母膏5g，氯化鈉10g)，37℃，200rpm培養過夜，作為I級種子菌；(3)、發酵、收菌：將I級種子菌再按10%的比例加入RM培養基(1L中含有酪蛋白20g，氯化鎂1mmol/L(0.203g)，磷酸 氫二鈉4g，磷酸二氫鉀3g，氯化鈉0.5g，氯化胺1g)中，37℃，pH 7.0，發酵至OD600值2.0左右加入阿拉伯糖(20%)至終濃度0.02%誘導，4小時後收菌，離心，得到菌體沉澱；(4)、製備包涵體：將離心後的菌體沉澱用適量緩衝液A(100mmol/L Tris鹽酸pH 7.5，10mmol/L EDTA，100mmol/L氯化鈉)重混懸，置-20℃冷凍過夜，取出融化後，勻漿機破菌，離心，再用緩衝液B(50mmol/L Tris鹽酸pH 7.5，1mol/L尿素，10mmol/L EDTA，0.5% Triton X-100)、緩衝液C(50mmol/L Tris鹽酸、pH 7.5，2mol/L尿素，10mmol/L EDTA，0.5% Triton X-100)分別洗滌沉澱兩次，再用蒸餾水洗滌一次，得到包涵體；(5)、複性處理：用6mol/L鹽酸胍(或尿素)溶解包涵體得到稍渾濁的變性液，10000rpm高速離心，取上清液測定變性液的蛋白濃度；按終蛋白濃度0.3mg/ml，分三次將變性液加入已配製好的複性液(0.5mol/L精氨酸，150mmol/L Tris鹽酸pH 7.5，0.2mmol/L EDTA)中，並在4℃連續攪拌過夜(約18小時)；然後，依次用10倍體積的10mol/L磷酸鹽緩衝液(PB)、和5mol/L的磷酸鹽緩衝液及蒸餾水透析；透析完畢，用2mol/L的醋酸-醋酸鈉(pH 5.0)調pH，靜置，過濾；(6)、HS陽離子柱層析：柱體先用20mmol/L的醋酸-醋酸鈉(pH 5.0)平衡，將步驟(5)得到的複性產物以30ml/min的速度上樣，用20個柱體積的20mmol/L醋酸-醋酸鈉(pH 5.0)，洗脫雜蛋白；接著，用5個柱體積含0.15mol/L氯化鈉的20mmol/L醋酸-醋酸鈉(pH 5.0)，洗脫雜蛋白。然後，再用3個柱體積含0.18mol/L氯化鈉的20mmol/L醋酸-醋酸鈉(pH 5.0)，洗脫雜蛋白；最後，用含0.25mol/L氯化鈉的20mmol/L醋酸-醋酸鈉(pH 5.0)解離目標蛋白，得到HS解離蛋白液；(7)、銅離子親和層析(chelating sepharoseTM fast flow)：將HS解離蛋白液加入0.2mol/L、pH 6.6的PB緩衝液中，用4mol/L的氯化鈉調到含1mol/L氯化鈉，pH 6.0，備上樣；柱體用含1mol/L氯化鈉的50mmol/L磷酸氫二鈉緩衝液(pH 5.5)平衡，以1ml/min 的速度上樣；接著，用50mmol/L磷酸氫二鈉緩衝液(pH 5.0)，洗脫雜蛋白；再用50mmol/L磷酸氫二鈉緩衝液(pH 4.0)，洗脫雜蛋白；然後，再用50mmol/L磷酸氫二鈉緩衝液(pH 3.6)，解離目標蛋白，得到螯合柱解離目標蛋白液；(8)、HS柱層析：將螯合柱解離目標蛋白液稀釋30倍，並將pH調至5.0，上HS柱，以含0.5mol/L氯化鈉的PB緩衝液(pH 7.0)解離，收集，即得所述的重組干擾素(原液)。

實施例2 重組干擾素製劑

製備工藝：按配方稱料，無菌無熱原注射水溶解，0.22μm孔徑濾膜過濾除菌，於6-10℃保存，取樣作無菌和熱原檢查合格後分裝西林瓶中，每瓶0.3-0.5的單次劑量，分裝後放置至凍幹機中冷凍乾燥。

製備工藝：按配方稱料，無菌無熱原注射水溶解，0.22μm孔徑濾膜過濾除菌，於6-10℃保存，取樣作無菌和熱原檢查合格後分裝於密閉容器中，每瓶0.3-0.5的單次劑量，分裝後成品置2-10℃暗處保存。

實施例3 rSIFN-co與幹複津抗人乳腺癌細胞的體外實驗研究

本實施例為重組干擾素rSIFN-co及幹複津抗人乳腺癌細胞的體外實驗研究。

分別以本發明所述重組干擾素rSIFN-co和美國安進公司生產的幹複津為試驗藥物，考察其對人乳腺癌MCF-7細胞及耐藥株MCF-7/ADR細胞增殖、凋亡及癌基因表達的影響。

一、實驗方法

1.細胞培養

將人乳腺癌細胞株MCF-7細胞及人乳腺癌阿黴素耐藥株MCF-7/ADR細胞分別培養於25cm²或75cm²培養瓶中，細胞長滿瓶底後，以0.25%胰酶消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

2.MTT比色法檢測不同濃度的rSIFN-co對細胞增殖的影響

實驗分組：每株細胞分3大組共11小組：rSIFNco組(0.02、0.078、0.313、1.25、5.0μg/ml)、幹複津組(0.02、0.078、0.313、1.25、5.0μg/ml)、空白對照組(含10%小牛血清的RPMI1640培養液(美國Sigrma公司)，也稱為RPMI1640完全培養基)，其中用RPMI1640完全培養基將rSIFNco和幹複津稀釋成所需濃度(使乙醇濃度<1%)，4℃保存。

取對數生長期的MCF-7細胞、MCF27/ADR細胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養液，配製成1.25×10⁵/mL的細胞懸液，台盼藍法測細胞活率>95%，將細胞接種于96孔培養板上，每孔100μL。按上述分組加入藥物後24h、48h、72h，常規MTT法檢測細胞的增殖(在酶標儀上於波長490nm處檢測吸光度)。每組設2個複孔作為平行樣。以上實驗重複3次，按照以下公式計算不同藥物濃度及作用時間對細胞株的生長抑制率：增殖抑制率(%)=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

3.流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡

實驗分組：每株細胞分3組，分別為rSIFN-co(5μg/mL)組、 幹複津(5μg/mL)組、及空白對照組(含10%小牛血清的RPMI1640培養液)。

FCM檢測：分別收集加入藥物作用48h後各組細胞，製成單細胞懸液，採用碘化丙啶(PI)染料，用Elite Esp型流式細胞儀(美國Coulter公司)測定凋亡率，用隨機所附軟體對測量值進行分析。以上實驗重複3次。

4.免疫組化檢測各組細胞癌基因的蛋白表達

實驗分組：每株細胞分3組。向MCF-7細胞培養液中加入rSIFN-co(5μg/mL)、幹複津(5μg/mL)、及含10%小牛血清的RPMI1640。MCF-7/ADR細胞培養液中加入rSIFN-co(5μg/mL)、幹複津(5μg/mL)、及含10%小牛血清的RPMI1640。

免疫組化檢測P53、Bcl-2、CerbB-2蛋白的表達：將細胞爬片所用的蓋玻片先經酸處理後洗滌乾淨、高壓滅菌，放入6孔培養板中。取對數期生長的MCF27細胞、MCF27/ADR細胞，用0.25%胰酶消化成單細胞懸液，接種至6孔板中，每孔1×10⁵，37℃、CO₂孵箱培養24h，待細胞貼壁後，分別加入各組藥物，處理48h後，取出蓋玻片，採用常規免疫組化SABC法染色，一抗濃度均為1：100。

結果判定標準：染色結果判定參照Volm的方法(Volm M等，European Journal of Cancer,1997,33(3)：691-693)，以細胞胞核(P53)、胞漿(Bcl-2)或胞膜(CerbB-2)內出現黃色或棕黃色顆粒者為陽性。高倍鏡下(400×)對每張玻片隨機選取5個視野，每個視野計數200個細胞。每組細胞的表達由兩方面共同決定。陽性染色深度：按每個細胞著色深淺計分，無著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分，其平均值即為該組細胞的平均染色深度；陽性細胞百分比：未見染色為0分，染色細胞<25%為1分，25%~50%為2分，>50%為3分。兩項的總和，得分0~分判為表達陰性，2~分判為陽性，4~6分判為強陽性。使用雙盲法進行(染色者及結果觀察者均不知玻片的分組情況)。

二、統計學方法

對試驗資料進行統計學處理：所有試驗資料，經SPSS 11.5統計套裝軟體處理，採用t檢驗、方差分析和秩相關分析；P<0.05，認為差異有統計學意義。

三、實驗結果

1．對MCF-7細胞、MCF-7/ADR細胞增殖的影響

(1)MCF-7細胞：rSIFN-co能抑制MCF-7細胞的增殖。濃度分別為0.02、0.078、0.313、1.25、5.0μg/mL的rSIFN-co和幹複津作用的各細胞組的吸光度OA，與空白對照組比較均顯著降低，經方差分析，早期(24h、48h)rSIFN-co與幹複津對MCF-7細胞抑制作用的差異無統計學意義(P>0.05)，但作用72h後，除最低濃度0.02μg/mL外，rSIFN-co的抑制率均較相同濃度幹複津的抑制率更高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1-1。

(2)MCF-7/ADR細胞：rSIFN-co能抑制MCF-7/ADR細胞的增殖。濃度分別為0.02、0.078、0.313、1.25、5.0μg/mL的rSIFN-co 和幹複津作用的各細胞組的吸光度OA，與空白對照組比較均顯著降低，經方差分析，除最低濃度0.02μg/mL外，rSIFN-co的抑制率均較相同濃度幹複津的抑制率更高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1-2。

2.對MCF-7細胞、MCF-7/ADR細胞凋亡的影響

與空白對照組相比，作用48h後，5μg/mL的rSIFN-co和幹複津均能誘導MCF-7細胞凋亡，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)，5μg/mL的rSIFN-co和幹複津均能誘導MCF-7/ADR細胞凋亡，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。相同濃度的rSIFN-co較幹複津對MCF-7細胞、MCF-7/ADR細胞的誘導凋亡作用更顯著，兩者差異有統計學意義(P<0.01)。見表1-3。

3.對各組細胞P53、CerbB-2和Bcl-2蛋白表達的影響

在MCF-7細胞中，rSIFN-co處理後能下調P53表達，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，但幹複津處理後，雖然P53表達有一定程度下降，但與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；在MCF-7/ADR細胞中，rSIFN-co和幹複津均能下調P53表達，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，但相同濃度的rSIFN-co與幹複津相比，兩者間無明顯差異(P>0.05)。

在MCF-7和MCF-7/ADR細胞中，rSIFN-co處理後均能下調CerbB-2表達，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)，幹複津處理後，雖然CerbB-2表達均有一定程度下降，但與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。

在MCF-7細胞中，rSIFN-co和幹複津處理均能上調Bcl-2表達，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)，且rSIFN-co上調Bcl-2表達的作用較幹複津更顯著，兩者差異有統計學意義(P=0.001)；在MCF-7/ADR細胞中，rSIFN-co和幹複津處理均能上調Bcl-2表達，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。

結果詳見表1-4。

實施例4 rSIFN-co與幹複津抗宮頸癌細胞的體外實驗研究

本實施例為重組干擾素rSIFN-co及幹複津對宮頸癌細胞的生長抑制及促凋亡作用的體外實驗研究。

分別以本發明所述重組干擾素rSIFN-co和美國安進公司生產的幹複津為試驗藥物，觀察其對宮頸癌Caski細胞(HPV16+)細胞的生長抑制以及促凋亡作用。

一、實驗方法

1、Caski細胞生長抑制試驗

1.1 細胞培養與分組

用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液稀釋藥品，在96孔培養板中培養宮頸癌Caski細胞。以培養液調定細胞數為1×10⁵/ml製成單細胞懸液，在培養板各孔中加入100μl細胞懸液。向培養板中分別加入rSIFN-co和幹複津，每種藥物的濃度梯度為0.156μg/ml、0.625μg/ml、2.5μg/ml和10μg/ml，並設置對照組(含10%小牛血清的RPMI-1640培養液)，每個濃度設3個複孔。放置於37℃、5% CO₂孵箱培養72小時。

1.2 MTT法檢測細胞生長抑制率

配製MTT試劑(美國Sigma公司)，使其濃度為5mg/ml。培養板各孔分別加入10μl MTT液，輕微震盪使其混勻，放置於37℃，5% CO₂孵箱中反應4小時後，見培養板孔底部出現藍色結晶。棄去培養板中上清液，每孔加入100μl二甲基亞碸，室溫下待結晶溶解，在570nm波長酶標儀讀取OD值。

1.3 計算細胞生長抑制率

細胞生長抑制率=(1-樣品孔OD值/對照孔OD值)×100%。

2、Caski細胞凋亡試驗

2.1 細胞培養與分組

分7組在含10%滅活小牛血清的RPMI-1640培養液中培養宮頸癌Caski細胞，第1組直接用培養液培養72小時，作為對照組；第2-4組rSIFN-co濃度分別為0.156μg/ml、0.625μg/ml、2.5μg/ml；第5-7組幹複津濃度分別為0.156μg/ml、0.625μg/ml、2.5μg/ml。

2.2 流式細胞儀檢測Caski細胞凋亡率

收集每組細胞至離心管中以1000r/min離心5分鐘，棄去上清液，採用AnnexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡。每樣本細胞數約為1×10⁶個，用孵育緩衝液洗1次，1000r/min離心5分鐘，用100μl的標記液重懸細胞，室溫下避光孵育15分鐘，以1000r/min離心5分鐘沉澱細胞，孵育緩衝液洗1次，加入螢光溶液在4℃下孵育20分鐘，避光並不時震動，以流式細胞儀檢測。

二、統計學處理

所有定量分析資料以x±s表示，採用方差分析不同藥物、不同濃度組之間的差異，應用SPSS 14.0套裝軟體進行統計學分析。

三、實驗結果

1、對Caski細胞生長抑制的作用

rSIFN-co和幹複津對Caski細胞的生長有抑制作用，這種作用隨干擾素作用濃度的增加而升高。rSIFN-co與幹複津相比，在0.625、2.5、10μg/ml濃度時對Caski細胞生長的抑制作用高於幹複津，兩者差異有統計學意義(P<0.01)。見表2-1。

2、促進Caski細胞凋亡的作用

rSIFN-co和幹複津都有促進宮頸癌細胞凋亡的作用，這種作用隨藥物濃度的增加而明顯；rSIFN-co在低濃度(0.156μg/ml)時對宮頸癌細胞的促凋亡作用強於幹複津的作用，兩者差異有統計學意義(P<0.01)。見表2-2。

實施例5 rSIFN-co與幹複津的人體藥動學及生物等效性研究

本實施例為重組干擾素rSIFN-co及幹複津人體藥動學及生物等效性的研究。分別以本發明所述重組干擾素rSIFN-co和美國安進公司生產的幹複津為試驗藥物，對其人體藥動學和生物等效性進行比較研究。

干擾素在健康人體內的藥物代謝動力學研究是干擾素研究的難點。由於藥用干擾素注射後在血漿中的干擾素水平均系微量，用酶聯免疫吸附測定(ELISA)或病毒細胞病變抑制法都難以直接在健康成人血清中將其測出。目前，干擾素的藥物代謝動力學研究所採用的檢測指標一般是2’,5’-OAS(2-5A寡聚核苷酸酶)，它既是干擾素的誘生產物，又是其藥效活力的代表。

一、物件與方法

1.對象

納入健康男性志願者18名，年齡(22.8±1.4)歲，身高(170±5.0)cm，體重指數20.5±2.4[體重(59.4±7.2)kg]。受試者經全面體格檢查、實驗室檢查(包括血液學、尿常規、肝腎功)及心電圖檢查均正常。自受試前4周起未使用過任何藥物；試驗前3個月內未用過已知對臟器有損害的藥物；對試驗藥物無過敏史；自願受試並簽署知情同意書。

2.方法

本試驗獲得四川大學華西醫院醫學倫理委員會批准，根據中華人民共和國GCP相關指導原則進行。

2.1 材料

試驗製劑：凍幹重組高效複合干擾素粉針劑(實驗製劑，即本明所述重組干擾素rSIFN-co，9μg/支)。參比製劑：幹複津注射液(參比製劑，9μg/支)，美國安進公司生產。

2-5A試劑盒：Eiken’Radioimmunoassay試劑盒由日本榮研化學株式會社提供，試劑盒含：(1)I₁₂₅-標記2’,5’-OAS；(2)抗2’,5’-OAS血清；(3)2’,5’-OAS標準瓶(每瓶含0、10、30、90、270或810pmol/dL的2’,5’-OAS；(4)緩衝液；(5)空白血清；(6)聚(I)聚(C)瓊脂；(7)ATP；(8)巰基乙醇；(9)隨行質控血清。

2.2 試驗設計與給藥方法

採用隨機自身交叉對照試驗設計，18名受試者隨機均分為A、B兩組，每組9人，分別於兩個週期內交叉皮下注射試驗製劑rSIFN-co 9μg和幹複津9μg，清洗期1周。

每次試驗前日晚8時後禁食至次日晨用藥後2h，試驗當日晨7：00於上臂三角肌部作皮下注射。試驗當日統一用標準餐(不含高脂肪食物)，禁止吸煙、飲酒及飲茶、咖啡類飲料，試驗期間禁用一切藥物，禁止劇烈活動。

2.3 血樣採集與檢測

給藥前抽取血樣4ml，給藥後2、6、12、18、22、24、26、30、34、38、42及48h於對側肘靜脈取血約3.5ml，立即離心分離血清置於-20℃保存直至檢測。

檢測各血樣中血清2’,5’-OAS濃度。

3 統計學方法

使用DAS ver1.0統計軟體，試驗製劑和參比製劑的比較採用配對t檢驗。

二、結果

根據測得的各血樣中血清2’,5’-OAS濃度，繪製均值酶濃度-時間曲線，見圖16。

由圖16可以看出，分別皮下注射rSIFN-co 9μg、幹複津9μg後，二者的酶濃度-時間曲線變化趨勢基本一致，但皮下注射rSIFN-co血中酶濃度-時間曲線峰濃度顯著高於幹複津。

試驗製劑(rSIFN-co)對參比製劑(幹複津)的相對生物利用度(F)按下式進行計算：F=[AUC_試驗製劑/AUC_參比製劑]×[參比製劑劑量/試驗製劑劑量]×100%

計算結果顯示rSIFN-co相對生物利用度(F0~48)為125.4%。試驗製劑和參比製劑的T_max差異無統計學意義(t=1.458，P=0.163)，AUC_0-48和C_max差異有統計學意義(t=2.730，P=0.014；t=2.347，P=0.031)，試驗製劑高於參比製劑。

此外，比較兩組的不良反應：幹複津組的不良反應在發生率、發生程度和持續時間三個方面均重於rSIFN-co組。

三、結論

(1)注射rSIFN-co與幹複津後均能誘生2’,5’-OAS，二者的藥代動力學曲線變化趨勢一致，主要藥代動力學參數比較無統計學差異。

(2)注射rSIFN-co誘生的2’,5’-OAS的Cmax和AUC_0-48大於幹複津誘生的2’,5’-OAS的Cmax和AUC_0-48，提示rSIFN-co在相同劑量治療時，其療效可能優於幹複津。

(3)幹複津組的不良反應在發生率、發生程度和持續時間三個方面均重於rSIFN-co組。

(4)以不同采血時間測定的受試者血清中2’,5”寡腺苷酸合成酶(2’,5’-OAS)的含量作圖(即均值酶濃度-時間曲線)後發現：注射rSIFN-co誘生的2’,5’-OAS濃度一般出現雙峰現象，其曲線下面積顯著大於在同一條件下注射幹複津所獲得的曲線下面積，且並未由於曲線下面積的增加而增加不良反應發生率和/或加重發生程度。

實施例6 重組干擾素的結晶

製備優質rSIFN-co蛋白質單晶是測定其晶體結構的前提條件。用於晶體生長的rSIFN-co樣品得自如上所述的本發明rSIFN-co。rSIFN-co的單晶製備的方法、技術流程和結晶條件，及其晶體學參數如下：將上述本發明的rSIFN-co凍乾粉溶解于純水中並在低溫(-20℃)下保存，初始蛋白質濃度為0.42mg/ml。結晶前將rSIFN-co蛋白質樣品濃縮至3-3.5mg/ml後立即用於晶體生長實驗。晶體培養均在室溫下(293k)採用懸滴汽相擴散法進行。

在結晶研究初期，rSIFN-co的微晶可以在多個系列條件中出現，但獲得可用於X-射線衍射分析並有足夠解析度的優質單晶十分困難。經過大量結晶條件優化研究，得出所獲晶體品質最好的結晶溶液條件為1.2M(mol/L，下同)Li₂SO₄、0.1M CAPS(3-(環己氨基)-1-丙磺酸)，pH 11.1，0.02M MgCl₂。按此條件配製的結晶溶液靜置三天至一周後，獲得rSIFN-co蛋白質的優良單晶，晶體為三方晶型，晶體大小為0.42×0.08×0.08mm。用於X-射線衍射晶體結構分析的rSIFN-co蛋白質晶體見圖1。

實施例7 晶體X-射線衍射資料的分析

晶體衍射資料收集：資料收集在日本築波光子工廠同步輻射站線BL5A，低溫條件下(100K)完成。具體操作步驟如下：(1)在顯微鏡下仔細小心用安置晶體工具將晶體從母液撈到工具頂部的線圈中；(2)採用快速冷凍技術(Flash-Cooling)迅速將含有晶體的線圈在防凍試劑parrafin oil(購自hampton Research公司)浸泡幾秒後，快速將安置晶體工具放置在衍射儀器測角頭上，這時晶體也瞬間處於低溫氮氣流(100K)中，使資料收集在100K低溫下進行；(3)設定參數後開始進行資料收集，光源波長為1.0Å，探測器為ADSC Quantum 315 CCD(電荷偶合器件探測器)，晶體到探測器的距離為310mm；採用回擺法收集資料，每幅畫面所用回擺角度為1°，每幅曝光時間為12秒，總共收集了110幅畫面(見圖2)。

衍射資料處理和分析：衍射實驗首先收集得到一套直觀的衍射畫面(圖2)，這些畫面必須經過收集到的全套衍射資料用CCP4套裝程式進行處理和分析，以應用於衍射資料品質評估和結構解析。這個過程包括：1)指標化：將衍射資料轉換為晶體學指標(h,k,l)，並計算出晶胞參數和空間群；2)參數修正：對晶胞參數、晶體和探測器間距離與角度和晶體鑲嵌度等參數進行精化；3)積分：從衍射斑點得到強度資訊；4)資料合併：將所有對稱相關和重複的衍射點合併，產生一套由獨立衍射點構成的完整資料；5)將強度資料轉化為結構振幅。rSIFN-co晶體衍射資料收集和處理分析的結果詳見表3。

實施例8 晶體結構解析 晶體衍射相位的測定和rSIFN-co分子初始結構模型的建立

rSIFN-co晶體結構採用分子置換法進行相位解析，選擇綿羊IFN-τ(其與rSIFN-co序列同源性54%)的晶體結構(PDB編號1B5L)作為分子置換的同源結構模型，用軟體程式Phaser，進行旋轉函數和平移函數的計算分析，推定rSIFN-co分子在晶胞中的位置和取向。根據勞厄群和系統消光規律，測定空間群為P3121，同時將模型分子進行一些修改(即保留了1B5L結構中的13-25，37-69，79-101，114-151位殘基)，計算結果是：Z-score為15.71，IL-gain為307.79，Clash為0。晶胞中分子堆積合理，且在分子置換過程中IL-gain逐步上升，表明獲得了正確解，測定了各衍射點的初始相位。進而用Phaser生成的帶有初始相位的mtz通過FFT生成電子密度圖，獲得的rSIFN-co分子的初始結構模型與生成的電子密度圖匹配良好，表明已獲得rSIFN-co所有衍射點的正確相位解。以所述結果為基礎，構建了rSIFN-co分子的初始結構模型。

rSIFN-co結構模型的精化

運用分子模建技術和電腦優化程式，對rSIFN-co分子初始模型中的所有非氫原子的座標參數和溫度因數進行疊代式修正(refinement)，以獲得精確的rSIFN-co分子結構模型。

結構修正採用程式CNS 1.1，資料為沒有相位的母體資料，從其中隨機提取10%作為測試集(testing set)，且至始至終保持同一套隨機選取的測試集。結構模型中的所有原子均參與修正，且每個原子的修正參數均為4個，包括座標(x，y，z)和各向同性溫度因數B。整個修正過程中，結構的電腦自動修正與模型的人工調整、搭建(用軟體O)交替進行，在修正起始時使用了限制性的NCS，當在結構調整基本完成時，修正中不再使用NCS。當R_work因數(低於0.30)和R_free因數基本不再繼續下降時，開始在結構 中加入水和溶劑分子，最終完成結構的精化，其主要精化指標為，R_work為0.250，R_free為0.286。最終獲得的精化rSIFN-co分子結構的主要指標列於表4。所得到的rSIFN-co的原子座標如表7所示。

實施例9 rSIFN-co分子結構模型的品質表徵

rSIFN-co分子結構模型的品質表徵

(1)模型的電子密度圖：可以直觀、清晰、準確地顯示rSIFN-co。圖3為一代表性電子密度圖與rSIFN-co分子中氨基酸殘基結構的配合情況，可清晰辨識不同氨基酸殘基的空間位置和取向。

(2)平均溫度因數隨殘基的分佈圖(見圖4)。

(3)分子的立體化學指標──拉氏構象圖：rSIFN-co分子的立體化學合理性由拉氏構象圖(圖5)表徵，其結構位於最適允許區的氨基酸殘基數占90.6%，位於允許區的9.1%，位於一般允許區的0.4%。表明rSIFN-co分子結構模型具有合理的立體化學。

實施例10 rSIFN-co分子的晶體結構特徵 rSIFN-co分子在晶體中的堆積及總體排列

rSIFN-co分子在晶胞中的堆積方式見圖6所示。rSIFN-co晶體結構的一個不對稱單位中包含2個蛋白質分子(稱為晶體學二聚體)(見圖7所示)。二聚體間的包埋面積為1033.3Ų，即每個晶體所貢獻的面積為516.6Ų，僅占單體總面積的約6.4%。二聚 體中A鏈的A、B、F面與B鏈的C、D、E面相對應(見圖9所示)；用VADAR軟體計算單體，二聚體折疊自由能量分別為-126.9和-257.1，即二聚體折疊自由能與兩個孤立單體自由能分別(-126.9×2)很接近。這表明二聚體間相互作用裏較弱。同時兩者間僅存在兩個弱氫鍵A12(ARG)NH2...NH2 B71(Arg)，3.05埃；A145(Arg)NH1...OH B90(Tyr),3.14埃。

在純化過程中證明rSIFN-co蛋白質溶液態下為單體，現有生化功能實驗表明IFN-α類功能單位應是單體，因此這個二聚體可能是由於晶體堆積而形成的。

二聚體結構

一個不對稱單位中的兩個rSIFN-co單分子形成了一個二聚體。圖8顯示出了rSIFN-co晶體學二聚體的組織方式。A鏈由11-103和111-163位殘基構成(1-10，104-110和164-166由於在電子密度圖上沒有表現而沒有構建)；B鏈由11-103和110-163位殘基構成(1-10，104-109和164-166由於在電子密度圖上沒有表現而沒有構建)。在晶體結構中可見到每個單體的第29位和第139位的Cys形成了分子內二硫鍵，而第1位和第99位的Cys間的分子內二硫鍵由於第1位元Cys在晶體結構中未構建所以沒有體現。另外，A鏈的30-33、47-49位及B鏈的30-33、48-50位殘基由於側鏈的密度沒有表現，故這些殘基主要構建為Ala或Gly。另外，A鏈的30-33、47-49位及B鏈的30-33、48-50位殘基由於側鏈的密度沒有表現，故這些殘基主要構建為Ala或Gly。兩個單體的結構基本相同，由非晶體學對稱性所聯繫(從B到A，極角Omega、Phi、Kappa分別為170.64、94.56、118.35；平移分數tx、ty、tz分別為-1.061、-0.225、0.155)。對兩個單體進行疊合比較(見圖8)，除了少數幾段分子表面的環(loop)區域柔性比較大以外，絕大部分殘基能夠很好地疊合(所有α碳原子RMSD隨氨基酸的分佈如圖8c)，其中127個殘基(13-30、34-44、53-101、115-163)α碳原子的均方根偏差為0.64埃。局部結構的差異是可能由於蛋 白質的較大柔性以及晶體堆積環境的不同而造成的。

單分子結構

每個單體由6段α螺旋(A、C、C’、D、E、F)、一段310螺旋(B)以及它們之間的連接肽段所構成，整個單體結構的折疊方式屬於螺旋狀細胞因數型(見圖9所示)。6段α螺旋(A、C、C’、D、E、F)所對應的氨基酸殘基位置分別是：13-20、50-68、70-76、79-100、114-133、138-160。一段310螺旋(B)所對應的氨基酸殘基位置是40-43。圖9清楚地顯示了這些二級結構的分佈和組織方式。圖10示出了二級結構與氨基酸序列的對應關係。

實施例11 rSIFN-co和IFN-α2b的三維結構

干擾素根據受體的不同，首先可分為兩類：I型和II型。I型類群又可分為α、β、ω等，其中IFNα又包括近15種不同的亞型，不同α類蛋白質間的蛋白質序列同源性都在80%以上，但是它們的功能卻顯示了多樣性。rSIFN-co蛋白質屬於IFNα類中非天然的人工設計蛋白質，至今I型IFNs只有6個三維結構(表5)，它們的氨基酸序列同源性可見序列對比(如圖11所示)。

從表5和圖11對比分析可以知道，與rSIFN-co的晶體結構最相近的是IFN-α2b(如圖12所示)，在序列上，rSIFN-co主要在45位比IFN-α2b多一個天冬氨酸(D)；在三維結構上，它們主要區別在AB環(25-33位殘基)和BC環(44-52位殘基)的空間構象有顯著不同。IFN-α2b的晶體結構已在2.9埃解析度解析，但在蛋白質資料庫(Protein Data Bank，PDB)中僅有α碳原子的座標，所有其他原子的座標數缺失(PDB Code 1RH2)。故rSIFN-co與IFN-α2b的結構比較只能在α碳原子的水準上進行。這兩個分子所有α碳原子之間的均方根偏差(RMSD)為1.577埃，但它們在AB環區和BC環區的均方根偏差為3.6埃和2.9埃，分別是其 總平均值的2.5倍和2倍。此外，rSIFN-co的晶體結構中不對稱單位中含有2個分子，而IFN-α2b的晶體學不對稱單位中有6個蛋白質分子，由3個二聚體構成。顯然，rSIFN-co的二聚體組織方式與IFN-α2b明顯不同(如圖13所示)。

現有技術已知，作為細胞因數的干擾素首先與細胞膜上的特異受體結合，以啟動多種信號傳導途徑，使機體產生抗病毒、抗腫瘤等生物學效應。rSIFN-co屬於IFN-α類干擾素，其在細胞膜上的受體已知由IFNAR1和IFNAR2共同組成，並由此構建了受體與IFN-α分子結合的三維結構模型(如圖15a所示)。以此為基礎，一系列分子生物學實驗研究顯示，IFN-α類蛋白質與受體IFNAR1、IFNAR2相互作用時形成夾層式結構(如圖15a所示)，即IFN-α類的A、B、F面與IFNAR2相互作用，而其相對的C、D、E面與IFNAR1相作用。同時，深入的分子生物學定位突變試驗揭示IFN-α類功能重要區(如圖15所示)，其中AB環尤其重要，它是與IFNAR2相互作用的主要分子部位。結構比較顯示(如 圖12、表6所示)，這一重要部位在rSIFN-co和IFN-α2b中明顯不同。這一活性重要部位的結構差異，可能通過影響其與受體結合特徵的改變，產生不同的生理/藥理效應。

顯然，rSIFN-co干擾素雖然與IFN-α2b有類似的分子骨架，但卻在其功能活性重要區具有顯著不同的結構。因此，從藥理活性密切相關的分子局部結構看，rSIFN-co是不同於IFN-α2b的新類型分子，從而導致了兩者間具有顯著不同的生物學和藥物學特徵。以特殊的關鍵部位的特徵三維結構為基礎，干擾素rSIFN-co可能產生獨特的生理和藥理效應。

圖1顯示了用於晶體結構分析的本發明的重組干擾素(rSIFN-co)的單晶。

圖2顯示了rSIFN-co晶體的X-射線衍射圖(解析度為2.6Å)。

圖3顯示了rSIFN-co分子晶體結構中局部2Fo-Fc的1.0σ電子密度圖。

圖4顯示了rSIFN-co的所有原子的平均溫度因數隨殘基的分佈圖；其中圖4a為A鏈的圖；圖4b為B鏈的圖。

圖5顯示了rSIFN-co蛋白質分子結構模型中所有氨基酸殘基的(φ，ψ)值在拉氏構象圖上的分佈，此圖參考了解析度至少2.0埃、R因數低於20%的118個結構，在最佳區域內有90%以上是高品質的模型，其統計資料如下：

圖6顯示了rSIFN-co晶胞堆積圖。

圖7顯示了rSIFN-co二聚體結構的組裝結構對。

圖8顯示了rSIFN-co晶體學二聚體的組織(圖8a，圖8b)及 α碳原子的均方根偏差(RMSD，方框代表缺失殘基)(圖8c)。

圖9顯示了rSIFN-co單分子的結構(僅示出主肽鏈)；其中圖9a為側視圖；圖9b為俯視圖；圖9c為拓撲示意圖；圖9d為二級結構的拓撲組織方式。

圖10顯示了rSIFN-co二級結構與氨基酸序列匹配圖；其中灰線方框代表在結構中未搭建的氨基酸殘基，藍線方框代表在結構中構建為Ala或Gly的氨基酸殘基，連線為兩對二硫鍵，下標綠色為結構中已構建的1對二硫鍵。

圖11顯示了rSIFN-co蛋白與同源IFN多肽的序列對比圖。

圖12顯示了rSIFN-co與IFN-α2b的結構比較差異圖。

圖13顯示了rSIFN-co(紅色)與IFN-α2b(黃色)二聚體疊合圖。

圖14顯示了rSIFN-co三維結構與美國安進公司Infergen的計算模型結構的比較差異圖。

圖15顯示了(a)IFN-α類蛋白與受體的結合模型；(b)IFN-α類功能區示意圖(藍圈區為重要功能區)。

圖16顯示了18名受試者皮下注射rSIFN-co 9μg和 INFERGEN® 9μg後的均值血中酶濃度-時間曲線。

<110> 遠東超級實驗室有限公司

<120> 構象改變的重組干擾素的晶體、其三維結構及應用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 167

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重組干擾素的氨基酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼重組干擾素的核苷酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼重組干擾素的核苷酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB環的氨基酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BC環的氨基酸序列

<400> 5

Claims (12)

1. 一種包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重組干擾素的晶體，其中該晶體的空間群為P3121，單晶胞參數為：a=b=77.92埃，c=125.935埃，α=β=90°，γ=120°。
2. 如申請專利範圍第1項所述的重組干擾素晶體，所述晶體在一個不對稱單位中包含2個分子。
3. 如申請專利範圍第1-2項中任一項所述的重組干擾素晶體，進一步包含共價或非共價結合的金屬離子。
4. 如申請專利範圍第1-2項中任一項所述的重組干擾素晶體，其中所述重組干擾素由包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列所編碼。
5. 一種包含申請專利範圍第1-4項中任一項所述的重組干擾素晶體的組合物。
6. 如申請專利範圍第5項的所述組合物，該組合物是藥物組合物。
7. 如申請專利範圍第6項所述的組合物，進一步包含有藥學上可接受的載體。
8. 一種如申請專利範圍第1-4項中任一項所述的重組干擾素晶體、申請專利範圍第5-7項中任一項的組合物在製備用於治療病毒性疾病和/或腫瘤的藥物中的應用。
9. 如申請專利範圍第8項所述的應用，其中所述病毒性疾病包括：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、其他類型的肝炎、由Epstein-Barr病毒、人體免疫缺陷病毒、埃博拉病毒、嚴重急性呼吸道綜合征病毒(SARS)、流感病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒、或其他類型的皰疹病毒、乳頭多瘤空泡病毒、痘病毒、小核糖核酸病毒、腺病毒、鼻病毒、I型人類T細 胞白血病病毒、或者II型人類T細胞白血病病毒，或者III型人類T細胞白血病病毒引起的病毒感染。
10. 如申請專利範圍第8項所述的應用，其中所述腫瘤是癌症。
11. 如申請專利範圍第8項所述的應用，其中所述腫瘤是實體瘤。
12. 如申請專利範圍第8項所述的應用，其中所述腫瘤包括：皮膚癌、基底細胞癌及惡性黑色素瘤、腎細胞癌、肝癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、實體腫瘤、前列腺癌、胃/腹癌、食道癌、直腸癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、淺表膀胱癌、血管瘤、表皮樣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、神經膠質瘤、血癌、急性血癌、慢性血癌、慢性骨髓性白血病、毛細胞白血病、淋巴腺瘤、多發性骨髓瘤、紅血球過多病、卡波濟氏肉瘤。