CN102770447B

CN102770447B - 空间构象改变的重组干扰素的晶体、其三维结构及应用

Info

Publication number: CN102770447B
Application number: CN201080057897.1A
Authority: CN
Inventors: 魏光文; 王大成
Original assignee: SICHUAN HUIYANG LIFE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: Superlab Far East Ltd
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2030-12-16
Also published as: CA2784624C; SG181785A1; KR20120108985A; JP2013514279A; CN102770447A; HK1177749A1; CA2784624A1; US8415151B2; EP2514761A4; AU2010333574A1; US20140356324A1; US8846025B2; EP2514761A1; ES2631028T3; EP2514761B1; MY169650A; US20120308520A1; CN102101886A; EP2514761A9; WO2011072487A1

Abstract

本发明提供了一种重组干扰素(rSIFN-co)晶体，所述重组干扰素具有(i)与人共有干扰素相同的氨基酸序列，以及(ii)与IFN-α2b相比改变了的三维结构。本发明的重组干扰素具有增强的生物活性。本发明还提供了一种可用于药物筛选和/或药物设计的所述重组干扰素的结构模型及该重组干扰素的模拟物。

Description

空间构象改变的重组干扰素的晶体、其三维结构及应用

技术领域

本发明主要涉及空间构象改变的重组干扰素的晶体、其结晶方法、其三维结构、所述晶体和三维结构的应用以及所述重组干扰素的模拟物。

背景技术

干扰素(IFN)是一种由多种细胞产生的可溶性蛋白质，其具有多种重要的生物功能，包括抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。根据产生细胞类型、受体、生物活性等的不同，干扰素可分为I型、II型和III型干扰素。I型干扰素主要由病毒及合成的双链RNA所诱导，因此也称为抗病毒干扰素。现有三种类型的I型干扰素：IFNα、INFβ和IFNω。II型干扰素也称为免疫干扰素或IFNγ，由T细胞产生，并且在体内是一种重要的免疫调节因子。III型干扰素则由IFN-λ分子构成。

如大量的相关专利和公开文献所显示的，近年来，世界上许多公司都在参与干扰素的研究。举例来说，美国专利第4,695,623号和第4,897,471号公开了新型人干扰素多肽，其氨基酸序列包含存在于天然α-干扰素多肽中的共同或占优势的氨基酸。该新型干扰素多肽被命名为IFN-con(共有干扰素α)。所公开的氨基酸序列被命名为IFN-con1、IFN-con2和IFN-con3。还公开了编码IFN-cons的基因以及在大肠杆菌中的基因表达。研究表明与白细胞干扰素或其它I型干扰素相比，该重组IFN-con具有更高的体外抗病毒、抗增殖及天然杀伤细胞活性。

美国专利第5,372,808号公开了人IFN-con在疾病治疗中的用途。与之前临床审批通过的α-干扰素如先灵葆雅公司生产的干扰能(IFN-α2b，SGP)相比，重组人共有干扰素显示具有更低的副作用。1997年底，美国食品与药品管理局(FDA)批准了美国安进(Amgen)公司生产的人共有干扰素作为丙型肝炎临床治疗用药，商品名为干复津(，interferon alfacon-1)。

美国专利第7,364,724号和中国专利公开号CN1740197A(其全文在此并入作为参考)均公开了同一种功效增强、副作用更小且能够大剂量使用的重组干扰素(在下文中也称为“rSIFN-co”)。所述重组干扰素具有与干复津相同的氨基酸序列，但其空间构象和生物效力发生了变化。此外，虽然上述中国专利公开号CN1740197A中还公开了所述重组干扰素的晶体及其制备方法，但所得到的晶体质量不好，晶体内部结构疏松，X-射线衍射分辨率低，仅达到无法适用于进一步的蛋白质空间结构解析，以获得有用的结构信息。因此，获得质量良好的、X-射线衍射分辨率高的所述具有改变的结构和功能的重组干扰素的晶体，测定其三维结构、建立模型并通过利用所述结构和模型来开展药物设计以及改良已有干扰素的效力是非常有意义的。

发明概述

本发明涉及上述美国专利第7,364,724号和中国专利公开号CN1740197A所公开的重组干扰素的晶体，这样的重组干扰素包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。进一步地，本发明提供了上述重组干扰素的结晶方法、包含所述晶体的组合物。此外，本发明提供了所述重组干扰素不同于现有技术已公布的IFN-α2b等干扰素的三维结构、也不同于美国安进公司干复津的计算模型结构的三维结构、所述三维结构在基于计算机的鉴定能与干扰素相互作用的候选化合物、设计干扰素模拟物、进行合理药物设计中的应用。更进一步地，本发明提供了所述重组干扰素的模拟物、包含所述模拟物的组合物以及所述晶体、模拟物或组合物在制备用于治疗病毒性疾病和/或肿瘤的药物中的应用。

附图简述

图1显示了用于晶体结构分析的本发明的重组干扰素(rSIFN-co)的单晶。

图2显示了rSIFN-co晶体的X-射线衍射图(分辨率为)。

图3显示了rSIFN-co分子晶体结构中局部2Fo-Fc的1.0σ电子密度图。

图4显示了rSIFN-co的所有原子的平均温度因子随残基的分布图；其中图4a为A链的图；图4b为B链的图。

图5显示了rSIFN-co蛋白质分子结构模型中所有氨基酸残基的(φ，ψ)值在拉氏构象图上的分布，此图参考了分辨率至少2.0埃、R因子低于20％的118个结构，在最佳区域内有90％以上是高质量的模型，其统计数据如下：

统计数据

图6显示了rSIFN-co晶胞堆积图。

图7显示了rSIFN-co二聚体结构的组装结构对。

图8显示了rSIFN-co晶体学二聚体的组织(图8a，图8b)及α碳原子的均方根偏差(RMSD，方框代表缺失残基)(图8c)。

图9显示了rSIFN-co单分子的结构(仅示出主肽链)；其中图9a为侧视图；图9b为俯视图；图9c为拓扑示意图；图9d为二级结构的拓扑组织方式。

图10显示了rSIFN-co二级结构与氨基酸序列匹配图；其中灰线方框代表在结构中未搭建的氨基酸残基，蓝线方框代表在结构中构建为A1a或Gly的氨基酸残基，连线为两对二硫键，下标绿色为结构中已构建的1对二硫键。

图11显示了rSIFN-co蛋白与同源IFN多肽的序列对比图。

图12显示了rSIFN-co与IFN-α2b的结构比较差异图。

图13显示了rSIFN-co(红色)与IFN-α2b(黄色)二聚体叠合图。

图14显示了rSIFN-co三维结构与美国安进公司Infergen的计算模型结构的比较差异图。

图15显示了(a)IFN-α类蛋白与受体的结合模型；(b)IFN-α类功能区示意图(蓝图区为重要功能区)。

图16显示了18名受试者皮下注射rSIFN-co9μg和9μg后的均值血中酶浓度-时间曲线。

发明详述

以下所提供的是帮助本领域技术人员实施本发明的本发明详细描述。

重组干扰素(rSIFN-co)

本发明的重组干扰素在结晶之前的纯化产物是根据美国专利第7,364,724号说明书实施例1和2和/或中国专利公开号CN1740197A说明书中第11-17页记载的方法制得的。关于本发明的重组干扰素的限定，可具体参见美国专利第7,364,724号和/或中国专利公开号CN1740197A。在一个实施方案中，本发明的重组干扰素的氨基酸序列以及编码所述氨基酸的核苷酸序列分别如下所示：

此外，本发明的重组干扰素在190-250nm范围内的圆二色谱显著不同于在同样条件下测得的干复津的圆二色谱，在250-320nm范围内的圆二色谱与干复津的圆二色谱也显著不同(参见中国专利公开号CN1740197A说明书第3页第22-25行、实施例三和图6A-D)。

并且，本发明的重组干扰素的三维结构既不同于现有技术已公布的IFN-α2b的三维结构(参见图12)，也不同于干复津的计算模型结构(参见KORN，AP等，Journal of Interferon Research1994，14：1-9)，由两者比较结果尤其可见二者的AB环有着明显的区别，其BC环也无法完全重合(参见图14)。

另外，本发明的重组干扰素在肌肉注射给体重指数(BMI)为18-23范围内的人体后，以采血时间对受试人体血清中的2-5A寡聚核苷酸酶(也称为“2’，5’-OAS”)浓度作图，所得曲线一般表现为双峰，其曲线下面积显著大于在同一条件下注射干复津所获得的曲线下面积。此外，本发明的重组干扰素在注射给人体后其在人体内的半衰期比干复津在人体内的半衰期更长。

已进行的实验的结果还证实，本发明的重组干扰素具有比目前投入临床使用的其它任何干扰素(包括干复津)更强的效力。例如，对于乙型肝炎病毒而言，本发明的重组干扰素不仅能抑制乙型肝炎病毒的DNA复制而且还能抑制乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，抑制乙肝病毒核心抗原(HBcAg)DNA复制的效力与干复津相比提高约一倍。本发明的重组干扰素的体外药效学显示它不仅能抑制乙型肝炎病毒的DNA复制，而且能抑制表面抗原和e抗原的分泌，其细胞学毒性仅为临床现用干扰素的1/8，但抗病毒活性却是临床现用干扰素的5-20倍，同时在人体内具有更高更广谱更长时间的生物学应答反应。

此外，无论是就病毒性疾病的预防还是就肿瘤的治疗而言，所述干扰素都具有与其它干扰素(包括干复津)相比，更高的抗病毒活性和更低的副作用。例如，本发明的重组干扰素不但具有强于临床现用干扰素20倍的抗病毒活性，以及明显强于重组人α型干扰素(包括干复津)的抗肿瘤如抗乳腺癌和宫颈癌作用；还极大地降低了毒副作用并可安全的大剂量使用(每剂用量可＞1000万IU)，使需要大剂量用药干扰素的部分病毒性疾病或肿瘤的成功治疗成为可能。

由此可见，本发明所使用的重组干扰素具有与干复津不同的空间构象、增强的生物学活性以及不同的药代动力学特性。

当在本文中使用时，术语“空间构象”、“空间结构”、“三维结构”和“三维构象”可互相交换使用。

因此，在一个实施方案中，本发明所使用的重组干扰素包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，并由包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列编码。进一步地，本发明所使用的重组干扰素的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，并由如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码。进一步地，所述重组干扰素与具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(或与具有相同的氨基酸序列)但不为如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码的干扰素例如干复津相比，具有改变的空间构象和/或增强的生物学活性和/或不同的药代动力学特性，举例来说，所述重组干扰素具有改变的空间构象和增强的生物学活性、具有改变的空间构象和不同的药代动力学特性、或具有增强的生物学活性和不同的药代动力学特性。更进一步地，所述改变的空间构象包括：所述重组干扰素在190-250nm范围内的原二色谱显著不同于在同样条件下测定的干复津的圆二色谱和/或在250-320nm范围内的圆二色谱与干复津的圆二色谱也显著不同；所述增强的生物学活性包括：增强的抗病毒活性、增强的抗肿瘤活性、更低的副作用和/或能大剂量使用，例如每剂用量可＞1000万IU，举例来说，所述增强的生物学活性可以是增强的抗病毒活性和增强的抗肿瘤活性等等，进一步地所述肿瘤可以是乳腺癌和宫颈癌；所述不同的药代动力学特性包括：在肌肉注射给体重指数为18-23范围内的人体后，以采血时间对受试人体血清中的2-5A寡聚核苷酸酶浓度作图，所得曲线的曲线下面积显著大于在同一条件下注射干复津所获得的曲线下面积和/或与干复津相比更长的半衰期。

在另一个实施方案中，本发明中使用的重组干扰素可由如下方法所产生，所述方法包括：将编码重组干扰素的包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列导入分离的宿主细胞中，在适合于表达所述重组干扰素的条件下培养所述宿主细胞，和收获所述重组干扰素，其中所述重组干扰素具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，并且所述重组干扰素抑制乙型肝炎病毒的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌。进一步地，所述宿主是大肠杆菌，如。大肠杆菌LGM194。进一步地，其中包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列处于启动子P_BAD的控制下。进一步地，其中收获步骤包括从培养发酵液中提取干扰素，收集包涵体，所收获干扰素的变性和复性。更进一步地，所述收获步骤进一步包括分离纯化所述重组干扰素(参见美国专利第7,364,724号权利要求)。

重组干扰素晶体及结晶方法

重组干扰素晶体

本发明提供了一种本发明重组干扰素的晶体。

在一个实施方案中，本发明提供了一种包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重组干扰素的晶体。进一步地，所述晶体具有三方晶型。在一个实施方案中，所述晶体的空间群为P3₁21。在某些实施方案中，所述晶体的单晶胞参数为： a＝b＝77.92埃，c＝125.935埃，α＝β＝90°，γ＝120°，所有晶胞参数的可变性不超过5％。在某些实施方案中，所述晶体在一个不对称单位中包含2个分子。在某些实施方案中，所述晶体包含共价或非共价结合的金属离子。进一步地，所述金属离子可以是镁离子、锌离子等，这些金属离子可介导晶体中干扰素二聚体的形成。在某些实施方案中，所述重组干扰素由包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列所编码。

在更进一步的实施方案中，本发明提供了一种包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(优选其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)的重组干扰素的晶体，其中该晶体的空间群为P3₁21，在一个不对称单位中包含2个分子，以及单晶胞参数为：a＝b＝77.92埃，c＝125.935埃，α＝β＝90°，γ＝120°，所有晶胞参数的可变性不超过5％。进一步地，这样的重组干扰素由包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列所编码，优选由如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列所编码。

结晶方法

本发明提供了制备(培养)本发明重组干扰素晶体的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了一种制备(培养)本发明重组干扰素晶体的方法，包括步骤：将重组干扰素浓缩至约3-3.5mg/ml，置于包含Li₂SO₄、CAPS(3-(环己氨基)-1-丙磺酸)和MgCl₂的结晶溶液条件下合适的一段时间，获得所述晶体。进一步地，所述晶体培养方法是在室温如293K下进行的。在某些实施方案中，所述晶体培养采用悬滴法或坐滴法进行的，优选采用悬滴法(也称为悬滴汽相扩散法)进行。在某些实施方案中，所述结晶溶液条件包含约1.0-约1.5MLi₂SO₄、约0.05-约0.15M CAPS(3-(环己氨基)-1-丙磺酸)和约0.01-约0.03MMgCl₂。在某些实施方案中，所述结晶溶液条件的pH值在约10.5-约12.0范围内，优选约11.1。在某些实施方案中，所述结晶溶液条件为1.2M Li₂SO₄、0.1M CAPS(3-(环己氨基)-1-丙磺酸)，pH11.1，0.02M MgCl₂。在某些实施方案中，所述晶体培养包括将上述含重组干扰素的结晶溶液静置约1天-约2周，优选约2天-约10天，更优选约3天到约1周，例如3天-1周。

X-射线结晶学分析

在此公开的干扰素的每一个组成氨基酸都通过一组结构坐标(也称为“原子坐标”)得到定义。术语“结构坐标”指由数学方程式导出的笛卡儿坐标，该数学方程式与X-射线单色光通过以晶体形式存在的本发明的干扰素的原子(散射中心)衍射获得的图样相关。衍射数据用于计算晶体重复单元的电子密度图。然后，电子密度图用于建立干扰素蛋白或蛋白/配体复合物的单个原子的位置。

通过数学方式操作所述干扰素或者干扰素/配体结构坐标，还可产生轻微的结构坐标改变。举例来说，在此公开的结构坐标可通过如下手段进行操作：结构坐标的结晶学置换、结构坐标的分段、结构坐标集合的整体加减、结构坐标的翻转，或上述手段的任意组合。而由于氨基酸突变、添加、取代和/或缺失或在任何组成部分中的其他改变而导致的晶体结构的改变，也可引起结构坐标的变化。在个体坐标中这样的轻微变化对总体形状影响不大。如果与原始坐标相比这样的改变处于可接受的标准误差之内，则所得到的三维形状被认为是结构等价的。

应当指出本发明干扰素的个体结构坐标中的轻微变化预计不会明显改变上述实体如可与干扰素或其部分(如其AB或BC环)结合的配体的特性。当在本发明中使用时，本发明重组干扰素的“AB环”指本发明重组干扰素(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)第25-33位氨基酸残基，即该AB环的序列为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列SPFSCLKDR；本发明重组干扰素的“BC环”指本发明重组干扰素(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)第44-52位氨基酸残基，即该BC环的序列为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列DGNQFQKAQ。在上下文中，短语“与......结合”指配体或其部分与干扰素分子或其部分之间相邻近的情况。这样的结合可以是非共价的，其中这样的相邻近在能量上受益于氢键、范德华力或静电相互作用；所述结合也可以是共价的。因此，作为实例，与干扰素的结合口袋或结合区结合的配体也应预期能结合结构等价的结合口袋或结合区，或与之相互作用。

对于本发明而言，对于任何分子或分子复合物或其任意部分，当叠合到在此描述的相关骨架原子上，具有小于约0.65埃的保守残基骨架原子(如N、Cα、C、O，优选Cα)均方根偏差时，被认为是“结构等价的”。换言之，这两个分子的这些部位的晶体结构在可接受的误差范围内是基本上相同的。特别优选的结构等价的分子或者分子复合物为具有如下限定的分子或者分子复合物：在此公开的结构坐标的完整集合±小于约0.65埃的来自于那些氨基酸的保守骨架原子的均方根偏差。更优选地，所述均方根偏差最多约0.5埃，还更优选最多约0.35埃。本发明的其他实施方案包括具有如下限定的分子复合物：在此公开的AB或BC环的结构坐标±小于约0.65埃的均方根偏差，所述均方根偏差优选最多约0.5埃，还更优选最多约0.35埃。

术语“均方根偏差”指偏差的平方的算术平均值的方根，其用于表示与趋势或对象的偏差或变化。在一个实施方案中，所述“均方根偏差”规定了一种蛋白质骨架相对于如在此描述的结构坐标所限定的干扰素骨架或其部分的变化。

X-射线结构坐标定义了空间中点的独特构象。本领域技术人员应当理解蛋白、或蛋白/配体复合物、或它们的一部分的结构坐标定义了一系列相应的点；而这些点又继而定义了三维构象。如果坐标之间的距离和角度保持基本上相同，则相似或相同的构象可为一组完全不同的坐标所定义。此外，只要保持角度基本上相同，可伸缩的点构象就可通过在坐标之间增加或减少距离来定义。

各种计算分析可用于确定分子或其部分与在此公开的干扰素或其部分是否是根据三维结构定义的“结构等价的”。举例来说，可通过各种计算分析进行不同结构、相同结构的不同构象、或相同结构的不同部分之间的比较。在一个实施方案中，所述分析可包括以下四个步骤：(1)加载需要比较的结构；(2)在这些结构中定义原子等价性；(3)执行拟合操作；和(4)分析结果。

重组干扰素(rSIFN-co)的三维结构

本发明提供了本发明重组干扰素的三维结构。

这种三维结构既不同于现有技术已公布的IFN-α2b的三维结构(参见图12)、也不同于美国安进公司干复津的计算模型结构(参见图14)，尤其在AB环和BC环上与IFN-α2b及干复津存在着结构上的差异。

在一个实施方案中，所述重组干扰素的三维结构包含如表7所示的重组干扰素的原子坐标，所述原子坐标任选地在小于约0.65埃，优选约0.5埃以及更优选约0.35埃的保守残基骨架原子优选Cα原子(也称为“α碳原子”)的均方根偏差内变化。

在一个实施方案中，在上述重组干扰素的三维结构中，所述重组干扰素的每个单体都由6段α螺旋、1段3₁₀螺旋及其间的连接肽段构成。所述6段α螺旋对应的氨基酸残基位置分别为13-20、50-68、70-76、79-100、114-133和138-160；所述的1段3₁₀螺旋对应的氨基酸残基位置为40-43。单体结构的折叠方式属于螺旋状细胞因子型(helical cytokine)，特征在于：在将所述重组干扰素的α碳原子骨架与IFN-α2b蛋白的α碳原子骨架以最小二乘法方式进行叠合后，该重组干扰素在第25-33位残基(AB环)上的各α碳原子与所述IFN-α2b蛋白在对应位残基上的各α碳原子的位置均方根偏差(location root-mean-square deviation)为3.63埃±5％。

优选的是，所述重组干扰素与所述IFN-α2b蛋白在第25位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为3.291埃±5％；在第26位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为4.779埃±5％；在第27位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为5.090埃±5％；在第28位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为3.588埃±5％；在第29位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2.567埃±5％；在第30位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2.437埃±5％；在第31位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为3.526埃±5％；在第32位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为4.820埃±5％；在第33位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2.756埃±5％。

还优选的是，所述重组干扰素在第44-52位残基(BC环)上的各α碳原子与所述IFN-α2b蛋白在对应位残基上的各α碳原子的位置均方根偏差为2.90埃±5％。其中，所述重组干扰素与所述IFN-α2b蛋白在第44位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为1.614埃±5％，在第45位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为1.383埃±5％，在第46位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2.735埃±5％，在第47位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2.709埃±5％，在第48位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为5.018埃±5％，在第49位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为4.140埃±5％，在第50位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为3.809埃±5％，在第51位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为2.970埃±5％，在第52位残基上的α碳原子的位置均方根偏差为0.881埃±5％(上述所列的“位置均方根偏差”均为坐标位置的均方根偏差)。

在另一方面，本发明提供了经选择的本发明重组干扰素的三维结构的一部分，其中所述三维结构经选择的部分包含表7中所包含的来自第25-33位氨基酸残基和/或第44-52位氨基酸残基的一个或更多个氨基酸残基的原子坐标。在某些实施方案中，本文所述的“一个或更多个氨基酸残基”包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个氨基酸残基。在某些实施方案中，“所述三维结构经选择的部分”包含表7中所包含的来自第25-33位氨基酸残基和/或第44-52位氨基酸残基的原子坐标。在某些实施方案中，“所述三维结构经选择的部分”包含表7中所包含的来自至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个氨基酸残基的原子坐标。在某些实施方案中，上述原子坐标任选地在小于约0.65埃，优选约0.5埃以及更优选约0.35埃的保守残基骨架原子优选Cα原子的均方根偏差内变化。

在又一方面，本发明提供了一种包含本发明的重组干扰素的三维结构的蛋白质空间结构模型。在一个实施方案中，所述蛋白质空间结构模型可以是电子密度图、线框模型、网状模型、空间填充模型、棍状模型、带状模型、分子表面模型等等。

在再一方面，本发明提供了一种可伸缩(scalable)的由点组成的三维构象，所述点的至少一部分来源于在此披露的结构坐标，或来源于包含本发明的重组干扰素的AB环或BC环的肽。在一个实施方案中，所述可伸缩的由点组成的三维构象展示为全息图、立体图、模型或者计算机显示图片。

三维结构的应用

筛选/设计与重组干扰素相互作用的候选物质

在一方面，本发明提供了一种筛选/设计与本发明重组干扰素相互作用的候选化合物的方法。进一步地，所述方法利用到本发明重组干扰素的三维结构，更进一步地，所述方法是基于计算机的。在一个实施方案中，本发明提供了一种基于计算机的鉴定能与重组干扰素相互作用的候选化合物的方法，所述方法包括步骤：(a)提供包含表7所示的重组干扰素的原子坐标的三维结构，所述原子坐标任选地在小于约0.65埃，优选约0.5埃以及更优选约0.35埃的保守残基骨架原子优选Cα原子的均方根偏差内变化；和(b)选择具有能与上述三维结构或该三维结构经选择的部分相互作用的结构特征的候选化合物，从而鉴定能与所述重组干扰素相互作用的候选化合物。在某些实施方案中，所述结构特征选自抗原性位点、亲水特性、表面可接近性和结构基序。在某些实施方案中，步骤(b)中的候选化合物的选择和鉴定包括：(i)对多个候选化合物生成三维结构；和(ii)将步骤(i)的三维结构各自与上述步骤(a)中的三维结构或该三维结构经选择的部分进行拟合，以发现在能量上最有利的相互作用，从而鉴定能与所述重组干扰素相互作用的候选化合物。在某些实施方案中，所述方法进一步包括步骤：(c)获取或合成候选化合物；和(d)使所述候选化合物与所述重组干扰素接触以确定该候选化合物与所述重组干扰素相互作用的能力。进一步地，所述确定候选化合物与重组干扰素相互作用的能力的步骤还可包括进一步包括测定所述重组干扰素与候选化合物接触时的活性。举例来说，要被测试的干扰素活性包括：抗病毒活性、抗肿瘤活性、抗增殖活性、天然杀伤细胞活性和免疫调节活性。在某些实施方案中，所述候选化合物是与所述重组干扰素或其经选择的部分结合的配体。举例来说，所述配体选自：受体、改性剂、激动剂和拮抗剂，举例来说，这样的受体可以是IFNAR1、IFNAR2或它们的复合物；以及其中所述经选择的部分包含所述重组干扰素的第25-33位氨基酸残基(AB环的序列)和/或第44-52位氨基酸残基(BC环的序列)的一个或更多个氨基酸残基。进一步地，其中所述经选择的部分包含来自所述重组干扰素的第25-33位氨基酸残基和/或第44-52位氨基酸残基。

在另一方面，本发明提供了一种鉴定能与本发明重组干扰素相结合的潜在配体的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：将在此公开的晶体暴露于一种或多种包含潜在配体的样品，并确定是否形成配体-干扰素分子复合物。

在另一方面，本发明提供了一种获取用于设计能与干扰素形成分子复合物的潜在配体的结构信息的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：将在此公开的晶体暴露于潜在配体库，并确定是否形成配体-干扰素分子复合物。

在另一方面，本发明提供了一种计算机辅助的用于鉴定、设计或制备潜在干扰素活性调节剂的方法。在一个实施方案中，所述方法包括筛选化学或者生物实体库。

本领域技术人员可应用结晶学手段来筛选并鉴定可能成为干扰素配体的化学或生物实体(见美国专利第6,297,021号)。举例来说，一种优选的方法可包括以下步骤：获得非配体化的干扰素晶体；将所述非配体化的干扰素晶体暴露于一种或多种包含潜在干扰素配体的测试样品；和确定是否形成配体-干扰素分子复合物。可通过多种方法将所述干扰素暴露于潜在配体，所述方法包括但不限于，将干扰素晶体浸泡于含有一种或多种潜在配体的溶液中，或者，在一种或多种潜在配体的存在下共结晶干扰素。

来自所述配体-干扰素复合物的结构信息可优选地用于设计新配体，该新配体较已知配体结合得更紧密、结合得更特异，具有期望的生物活性特性，具有更高的安全性，甚至具有以上优点的结合。举例来说，计算出的电子密度图直接揭示了结合事件，鉴定了结合的化学或者生物实体，并且提供了配体-干扰素复合物的详细三维结构。一旦命中(hit)，就可通过传统的筛选方法找出该命中的一系列具有更紧密结合或期望的生物活性的类似物或衍生物。任选地，可将配体-干扰素迭代暴露于额外的潜在配体，使得两次或更多次命中能优选地结合在一起以鉴定或设计更具效力的配体。

结构同源分子的获得/设计干扰素的模拟物

在此公开的结构坐标可用于帮助获得关于其他结晶分子或分子复合物的结构信息。本发明的方法可以用于确定与在此公开的干扰素具有一个或多个相似结构特征的分子或者分子复合物的三维结构的至少一部分。所述的分子在此称为“结构同源的”。相似的结构特征可包括例如氨基酸同一性区域、保守的活性位点或结合位点基序、以及相似排列的二级结构元件(例如，α螺旋和β折叠)。在另一个实施方案中，通过比对两条氨基酸序列的残基以优化其序列长度上相同氨基酸的个数来确定结构同源性；在进行比对过程中，允许再这两条序列中的一条或两条中存在空位，以优化相同氨基酸的个数，但是，这些氨基酸必须在其各自序列中保持固有顺序。优选地，结构同源的分子是一种具有与SEQ ID NO：1至少65％同一性的氨基酸序列的蛋白质。更优选地，与本发明的干扰素结构同源的蛋白质包含与SEQ ID NO：1的类似部分具有至少80％氨基酸序列同一性的至少50个氨基酸残基的连续区段。用于生成结构同源分子或分子复合物的结构信息的方法在本领域中是公知的。

在此公开的结构坐标系还可用于解析相关干扰素、干扰素突变体或与各种配体共复合的干扰素同系物的晶体结构。该应用使确定配体和干扰素(如候选的干扰素改性剂和干扰素)之间相互作用的最佳位点得以可能。本方法还适用于鉴定分子的多个结合位点中用于修饰的潜在位点。这一信息的获得为确定最有效的结合相互作用(如在干扰素及其配体之间增强的疏水相互作用)提供了额外的途径。

此外，在一个实施方案中，本发明还提供了一种基于计算机设计重组干扰素模拟物的方法，包括步骤：(a)对多个模拟物生成三维结构；和(b)将步骤(a)的多个模拟物的三维结构各自与包含表7所示的重组干扰素的原子坐标的三维结构或该三维结构经选择的部分进行拟合，以发现所述重组干扰素的最佳拟合模拟物，所述原子坐标任选地在小于约0.65埃，优选约0.5埃以及更优选约0.35埃的保守残基骨架原子优选Cα原子的均方根偏差内变化。

合理药物设计

计算机技术可用于筛选、鉴定、选择和/或设计能与干扰素或结构同源的分子结合的化学实体或配体。在此公开的干扰素的结构坐标的信息使得具有与在此公开的干扰素的构象互补形状的合成化合物和/或其他分子的设计和/或鉴定得以可能。具体而言，计算机技术可用于鉴定或设计与干扰素或其部分(如AB或BC环)结合的化学实体或配体，例如受体、改性剂、激动剂和拮抗剂等。潜在的改性剂可结合干扰素的活性位点或其部分，或干扰之，并可以是竞争性、非竞争性或无竞争性的抑制剂；或通过结合两个单体之间的界面，从而干扰二聚化。一旦针对生物活性进行鉴定或筛选，这些抑制剂/激动剂/拮抗剂就可在治疗上或预防上用于阻断或增强干扰素活性。还可通过计算机技术获得干扰素结合与干扰之的配体类似物的结构-活性数据。

当在本文中使用时，术语“化学实体”指化合物、两种或更多种化合物的复合物、及所述化合物或复合物的片段。被确定能与本发明的干扰素相结合的化学实体就是潜在的药物候选物。因此，如在此所鉴定的本发明的干扰素或结构同源分子或其部分的结果的三维结构图示可有利地用于药物研发。通过本领域可获得的多种计算机方法和技术中某一种，所述化学实体的结构坐标系可用于生成三维图像，该三维图像又可通过计算机与所述干扰素或结构同源分子的三维图像进行拟合。

本发明的药物设计方法的一个实施方案包括评估已知化学实体或配体与所述干扰素或其结构同源分子的潜在结合。因此，所述药物设计方法还包括通过计算机来评估所选择的化学实体或配体与本文所列的任何一种分子或分子复合物的潜在结合。在另一个实施方案中，所述药物设计方法包括与本发明干扰素、其同系物或它们的部分结合的化学实体或配体的计算机辅助设计。化学实体或配体可以步进方式进行设计，一次一条片段，或可作为整体进行设计或“从头(de novo)”设计。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种基于计算机的合理药物设计方法，包括步骤：(a)提供包含表7所示的重组干扰素的原子坐标的三维结构，所述原子坐标任选地在小于约0.65埃，优选约0.5埃以及更优选约0.35埃的保守残基骨架原子优选Cα原子的均方根偏差内变化；(b)提供多个分子片段，并对其生成三维结构；(c)将所述多个分子片段的三维结构各自与步骤(a)的三维结构或该三维结构经选择的部分进行拟合；和(d)将经选择的所述分子片段组装到一个分子中以产生候选药物。在一个实施方案中，所述方法进一步包括步骤：(e)获得或合成候选药物；和(f)令所述候选药物与所述重组干扰素接触，从而确定候选药物与所述重组干扰素相互作用的能力。

在本发明的某些实施方案中，所述三维结构经选择的部分包含表7中来自第25-33位氨基酸残基(SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列)和/或第44-52位氨基酸残基(SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列)的一个或更多个氨基酸残基的原子坐标，进一步地，所述三维结构经选择的部分包含表7中来自第25-33位氨基酸残基(SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列)和/或第44-52位氨基酸残基(SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列)的原子坐标，上述原子坐标任选地在小于约0.65埃，优选约0.5埃以及更优选约0.35埃的保守残基骨架原子优选Cα原子的均方根偏差内变化。

同源模建

在一方面，通过同源模建，可构建或优化未被结晶的干扰素同系物的计算机模型。首先，通过序列比对、二级结构预测、结构库筛选或这些技术的任意组合，创建出干扰素同系物的初级模型。计算软件可用于实施所述的序列比对和二级结构预测。诸如在插入或缺少周围形成的结构碎片之类的结构不连贯可通过筛选具有期望长度和合适构象的肽结构库从而模建获得。若所述干扰素同系物已经结晶，则可通过本领域已知技术使用最终的同源模型来解析该同系物的晶体结构。其次，让所述初级模型能量最小化以生成能量最小化模型。该能量最小化模型可包含违背立体化学约束的区域，在这种情况下，可使用本领域已知技术对这些区域重新模建以获得最终的同源模型。

在另一方面，本发明提供了一种获取关于未知结构分子或分子复合物的结构信息的方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：结晶所述分子或分子复合物；由所述结晶的分子或分子复合物产生X射线衍射图；以及将所述的X射线衍射图应用于在此公开的干扰素的至少一部分的结构坐标，从而产生所述未知结构分子或分子复合物的至少一部分的三维电子密度图。

在另一方面，本发明提供了一种干扰素同系物的模建方法。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：将推定的干扰素同系物的氨基酸序列与本发明的重组干扰素的氨基酸序列进行比对并将推定的干扰素同系物的氨基酸序列掺入由在此披露的结构坐标形成的干扰素模型中，从而生成干扰素同系物的初级模型；对所述初级模型进行能量最小化以生成能量最小化模型；重建所述能量最小化模型中违背立体化学约束的区域，从而生成干扰素同系物的最终模型。

干扰素模拟物

本发明提供了干扰素模拟物。

在一方面，本发明提供了包含在此公开的序列的肽，或其衍生物、活性部分、类似物、变体或模拟物，及其用途。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种干扰素模拟物，其包含如SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，将所述干扰素模拟物三维结构中的α碳原子骨架与IFN-α2b三维结构中的α碳原子骨架以最小二乘法方式进行叠合后，该干扰素模拟物在对应于IFNα2b蛋白质分子中第25-33位残基上的各α碳原子与IFNα2b蛋白质分子在对应位残基上的α碳原子均方根偏差为3.63埃±5％。在某些实施方案中，与IFNα2b对应位残基相比，所述干扰素模拟物在第25-33位残基上的α碳原子偏差分别是3.291埃±5％、4.779埃±5％、5.090埃±5％、3.588埃±5％、2.567埃±5％、2.437埃±5％、3.526埃±5％、4.820埃±5％和2.756埃±5％。在某些实施方案中，将所述干扰素模拟物三维结构中的α碳原子骨架与IFN-α2b三维结构中的α碳原子骨架以最小二乘法方式进行叠合后，该干扰素模拟物在对应于IFNα2b蛋白质分子中第44-52位残基上的各α碳原子与IFNα2b蛋白质分子在对应位残基上的α碳原子均方根偏差为2.90埃±5％。在某些实施方案中，与IFNα2b对应位残基相比，所述干扰素模拟物在第44-52位残基上的α碳原子偏差分别是1.614埃±5％、1.383埃±5％、2.735埃±5％、2.709埃±5％、5.018埃±5％、4.140埃±5％、3.809埃±5％、2.970埃±5％和0.881埃±5％。在某些实施方案中，所述干扰素模拟物是功能性模拟物或结构性模拟物。在某些实施方案中，所述干扰素模拟物是本发明重组干扰素(rSIFN-co)的模拟物，进一步地，所述干扰素模拟物不包含干复津。在某些实施方案中，所述干扰素模拟物的三维结构类似于本发明重组干扰素(rSIFN-co)的三维结构，尤其在相应于本发明重组干扰素的AB环和BC环位置处，两者的三维结构可以是基本上相同或完全相同的。进一步地，所述干扰素模拟物的三维结构包含表7中来自第25-33位氨基酸残基(AB环)和/或第44-52位氨基酸残基(BC环)的原子坐标，所述原子坐标任选地在小于约0.65埃，优选约0.5埃以及更优选约0.35埃的保守残基骨架原子优选Cα原子的均方根偏差内变化。

本发明包含其中个体氨基酸可被在本领域中被认为密切相关的其他氨基酸所取代的变体肽。举例来说，所述个体氨基酸可由以下方式进行取代：可用任何疏水性脂肪族氨基酸取代其他疏水性脂肪族氨基酸；可用任何疏水性芳香族氨基酸取代其他疏水性芳香族氨基酸；可用任何带有极性侧链的中性氨基酸取代其他带有极性侧链的中性氨基酸；可用任何酸性氨基酸取代其他酸性氨基酸；可用任何碱性氨基酸取代其他碱性氨基酸。当在本文中使用时，“模拟物”、“功能性/结构性模拟物”均指具有与在此公开的多肽相同的功能/结构活性的肽变体或有机化合物。这样的模拟物或者类似物的实例包括：被模建以比拟在此公开的干扰素的三维结构(该三维结构包含表7所示的重组干扰素的原子坐标)，特别是如上所述的氨基酸残基的排列的化合物或肽。因此，当在本文中使用时，“本发明重组干扰素的模拟物”指与具有与本发明重组干扰素(rSIFN-co)相同的功能/ 结构活性但不同于本发明重组干扰素的肽变体或有机化合物，尤其是具有与本发明重组干扰素的AB环和/或BC环相同的空间结构但不同于本发明重组干扰素的肽变体或有机化合物。当作为肽变体时，这样的“模拟物”的氨基酸序列一般具有与本发明重组干扰素的氨基酸序列类似的长度，例如可包含约120-200个氨基酸残基，优选约140-180个氨基酸残基，更优选约150-175个氨基酸残基，还更优选约160-170个氨基酸残基，例如约164、165、166或167个氨基酸残基；或者，这样的“模拟物”可以是包含本发明重组干扰素的AB环和/或BC环的具有较短氨基酸序列长度的肽变体，例如其可包含约10-100个氨基酸残基，优选约15-80个氨基酸残基。

可通过本领域通常所知的模建技术生成适合的模拟物或者类似物。包括设计涉及研究功能相互作用的“模拟物”以及设计包含以使之能产生上述相互作用的方式排列的官能团的化合物。

对已知药学活性化合物设计模拟物是一种基于“前导”化合物用于开发药物的已知方法。这一方法可用于获得不易合成或需高价合成的活性化合物，也可用于改良不宜于常规给药的活性化合物；所述不宜于常规给药的活性化合物包括：会在消化道中被蛋白酶快速分解，从而不宜于口服的活性化合物多肽。模拟物设计、合成和测试可用于避免针对目标性质随机筛选大量分子。

在根据具有给定目标特性的化合物/肽设计模拟物的过程中，通常包括以下几步：首先，确定对于决定目标性质起关键和/或重要作用的化合物/肽的特定部分。就肽而言，可通过系统性地改变肽中的氨基酸残基从而实现这样的确定，例如将每个残基依次取代。构成化合物活性区的这些部分或残基被称为其“药效团”。

一旦发现所述药效团，就可根据其物理性质对其结构进行模建；所述物理性质例如立体化学性、键合、大小和/或电荷、该模建使用了来自多种来源例如光谱技术、X-射线衍射和NMR的数据。计算分析、相似性制图(其模拟了药效团的电荷和/或体积，而非原子间键合)以及其他技术可用于该模建过程中。在该方法的变型中，模建配体及其结合伴侣的三维结构。这一方法特别适用于配体和/或结合伴侣在结合中产生构象变化的情况，从而容许在模拟物设计中对该模型作进一步考虑。

然后，选择可将模拟药效团的化学基团移植到其上的模板分子。可便利地选择所述模板分子及移植到其上的化学基团，从而容易地合成所述模拟物；而所合成的模拟物除了保持前导化合物的生物活性外，还可能是药理学可接受的，并且不会在体内降解。通过这一手段获取的模拟物经筛选后，即可得知其是否具有目标性质或者在什么程度上显示了目标性质。然后，可进行进一步的优化和改性，以获得用于体内或临床测试的一种或多种最终的模拟物。

在另一方面，本发明还提供了一种非配体化的分子；所述分子具有在此公开的干扰素的至少一部分。例如，所述非配体化结合的分子可包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示序列(分别为在此公开的干扰素的AB环和BC环的序列)，进一步地所述非配体化的分子具有如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示序列。

组合物及治疗应用

本发明提供了包含本发明的重组干扰素晶体或本发明的重组干扰素模拟物的组合物。在一个实施方案中，所述组合物是药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物进一步包含有药学上可接受的载体。

无论是就本发明而言用于人体给药的多肽、抗体、肽、核酸分子、小分子、模拟物还是其他药学上有用的化合物，优选的给药剂量都是“预防有效剂量”或“治疗有效剂量”(当然预防也可被认为是治疗的一个方面)，这样的剂量足以显示对个体的有益效果。本发明的实际给药剂量、给药频率以及给药时间随受治疗疾病的性质和严重程度而定。治疗处方，如剂量确定等问题，由医生或其他医务工作者按情况而定。药物组合物可依据情况单独给药或联合给药。

根据本发明并供本发明所用的药物组合物，除活性成分外，可包括：药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其它本领域公知的物质。这类物质应当是无毒且不会影响活性成分效力的物质。载体或其他物质的确切性质依据给药方式而定；所述给药方式包括口服和注射；而注射则进一步包括皮下注射、肌肉注射以及静脉注射等。上述技术和给药方案的实例可见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编)，1980。

在某些实施方案中，所述药物组合物可配制成如下剂型，包括：片剂、胶囊、口服液、贴剂、注射剂、喷雾剂、栓剂、溶液制剂，推荐的剂型为注射剂。可皮下或静脉注射给药，药物组合物中的载体可使用任何一种适宜的可接受的药物载体，包括粘合剂、崩解剂、润滑剂、填充剂、增溶剂、缓冲剂、防腐剂、增稠剂、配合剂和其他佐剂。

根据本发明的不同目的，“药学上可接受的载体”是指任何标准的药用载体。例如公知的适当载体包括但不仅限于任何标准药用的载体如：磷酸盐缓冲液及各种润湿剂。其它载体可能包括用于片剂、颗粒剂及胶囊等的添加剂。典型的载体常含有如：淀粉、乳液、糖、纤维素、某种类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐类、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、植物油脂、树胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。这些载体中也可能还含有调味剂及增色剂及其它成分。这些载体中的成分可用公知的传统方法调制。

进一步地，由于本发明重组干扰素的模拟物具有本发明重组干扰素的AB环和/或BC环结构(如上述特定的AB环和/或BC环空间结构)，因此预计其能与本发明的重组干扰素一样，用于治疗病毒性疾病和/或肿瘤。

因此，在另一方面，本发明提供了本发明的重组干扰素晶体、干扰素模拟物或包含上述晶体或模拟物的组合物在制备用于治疗病毒性疾病和/或肿瘤的药物中的应用。

在另一方面，本发明提供了一种治疗病毒性疾病和/或肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明的重组干扰素晶体、干扰素模拟物或包含上述晶体或模拟物的组合物。

在另一方面，本发明还提供了一种用于治疗病毒性疾病和/或肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的本发明的重组干扰素晶体、干扰素模拟物或包含上述晶体或模拟物的组合物。

在某些实施方案中，所述病毒性疾病可包括：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、其它类型的肝炎、由Epstein-Barr病毒、人体免疫缺陷病毒(HIV)、埃博拉病毒、严重急性呼吸道综合征病毒(SARS)、流感病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、或其它类型的疱疹病毒、乳头多瘤空泡病毒、痘病毒、小核糖核酸病毒、腺病毒、鼻病毒、I型人类T细胞白血病病毒、或者II型人类T细胞白血病病毒，或者III型人类T细胞白血病病毒引起的病毒感染。

在某些实施方案中，所述肿瘤是癌症、实体瘤，所述肿瘤可包括：皮肤癌、基底细胞癌及恶性黑色素瘤、肾细胞癌、肝癌、甲状腺癌、鼻咽癌、实体肿瘤、前列腺癌、胃/腹癌、食道癌、直肠癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、浅表膀胱癌、血管瘤、表皮样癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤、血癌、急性血癌、慢性血癌、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、淋巴腺瘤、多发性骨髓瘤、红血球过多病、卡波济氏肉瘤。

本发明将通过下列实施例得以详细描述，所述实施例仅作为解释说明目的，并不意在限制本发明的范围。可对本发明进行修改而不背离的本发明的范围。

所有出版物、专利和专利申请在此以其整体并入作为参考，如同每篇独立出版物、专利或专利申请被明确且单独地指出以其整体并入作为参考一样。

具体实施方式

实施例1

重组干扰素rSIFN-co的制备

本实施例为重组干扰素rSIFN-co(原液)的制备方法(具体参见美国专利第7,364,724号说明书实施例1和2以及中国专利公开号CN1740197A说明书中第11-17页记载的方法)。

一、基因克隆：

根据已发表的干复津的编码DNA序列及推断的氨基酸序列资料(Klein ML等，Structural characterization of recombinant consensus interferon-alpha.Journal of Chromatography，1988，454：205-215)，利用大肠杆菌优先表达密码子(The Wisconsin Package，by Genetics Computer Group，Inc.Copyright1992，Medison，Wisconsin，USA)，在保证氨基酸序列不变的情况下，对其DNA编码序列进行分子设计，然后人工合成rSIFN-co全长cDNA编码基因。

合成rSIFN-co cDNA序列

rSIFN-co cDNA5′-端和3′-端半分子的合成

用PCR方法直接合成rSIFN-co cDNA5′-端280bp(I片段)和3′-端268bp(II片段)两个cDNA半分子。片段I的3′-端与片段II的5′-端有41bp的核苷酸序列重叠互补。

化学合成如下寡聚脱氧核苷酸片段

Oligomer A：

5’ATGTGCGACCTGCCGCAGACCCACTCCCTGGGTAACCGTCGTGCTCTGATCCTGCTGGCTCAGATGCGTCGTATCTCCCCGTTCTCCTGCCTGAAAGACCGTCACGAC3’

Oligomer B：

5’CTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAAGAATTCGACGGTAACCAGTTCCAGAAAGCTCAGGCTATCTCCGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGACCTTC3’

Oligomer C：

5’GCTGCTGGTACAGTTCGGTGTAGAATTTTTCCAGCAGGGATTCGTCCCAAGCAGCGGAGGAGTCTTTGGTGGAGAACAGGTTGAAGGTCTGCTGGATCATTTC3’

Oligomer D：

5’ATCCCTGCTGGAAAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCTTGCGTTATCCAGGAAGTTGGTGTTGAAGAAACCCCGCTGATGAAC3’

Oligomer E：

5’GAAGAAACCCCGCTGATGAACGTTGACTCCATCCTGGCTGTTAAAAAATACTTCCAGCGTATCACCCTGTACCTGACCGAAAAAAAATACTCCCCGTGCGCTTGGG3’

Oligomer F：

5’TTATTCTTTACGACGCAGACGTTCCTGCAGGTTGGTGGACAGGGAGAAGGAACGCATGATTTCAGCACGAACAACTTCCCAAGCGCACGGGGAGTATTTTTTTTCGGTCAGG3’

(2)PCR反应

PCR反应I合成rSIFN-co5’-端半分子：用寡聚脱氧核苷酸片段B作为模板，A和C两个寡聚脱氧核苷酸片段作为引物，进行PCR反应合成长度为280bp的rSIFN-co5’-端半分子产物。

PCR I反应混合物如下： (单位：μl)(总体积：50μl)

PCR I反应周期为：

95℃2′→(95℃45″→65℃1′→72℃1′)×25周期→72℃10′→4℃

PCR反应II合成rSIFN-co3′-端半分子：用寡聚脱氧核苷酸片段E作为模板，D和F两个寡聚脱氧核苷酸片段作为引物，进行PCR反应合成长度为268bp的rSIFN-co3′-端半分子产物。

PCR II反应混合物如下： (单位：μl)(总体积：50μl)

PCRII反应条件和周期同PCR I。

rSIFN-co全长cDNA分子的组装

采用“重叠-延伸PCR”方法将上述PCR合成的I和II片段组装在一起从而得到完整的rSIFN-co cDNA全长分子序列。并且在其5′-端和3′-端分别引入Nde I和Pst I限制性酶切位点，以便于将rSIFN-co cDNA序列克隆到质粒载体中去。

(1)化学合成引物

Oligomer G：5′ArCGGCCATATGTGCGACCTGCCGCAGACCC3′

Oligomer H：5′ACTGCCAGGCTGCAGTTATTCTTTACGACGCAGACGTTCC3′

(2)“重叠-延伸PCR”反应

PCR反应混合物： (单位：μl)(总体积：50μl)

注：用美国Stratagen公司生产的StrataPrep PCR纯化试剂盒将PCR产物先进行分离纯化，然后溶于消毒蒸馏水中。

PCR反应条件及周期同前述PCR I。

rSIFN-co基因的克隆及序列分析

选用pLac T7质粒作为rSIFN-co cDNA基因克隆的载体。pLac T7质粒是经pBluescript II KS(+)质粒(美国Stratagen公司生产)改造而成。

用StrataPrep PCR纯化试剂盒(美国Stratagen公司生产)将含rSIFN-co全长cDNA PCR产物进行纯化，然后用NdeI和PstI进行酶切；同时将pLacT7质粒进行NdeI和PstI双重酶切。将这二种酶切DNA片段在1％琼脂糖胶上进行电泳分离，然后用美国Promoga公司的Winzard DNA纯化试剂盒从胶中回收，纯化507bp长的rSIFN-co DNA片段和2.9kb的质粒酶切DNA片段。将二者经T4DNA连接酶催化连接成重组质粒。将连接反应混合物转化DH5α感受态细胞(美国Gibco公司生产)。经37℃过夜培养后，挑选阳性重组菌落，命名为pHY-1。

按DNA序列分析试剂盒(SequiThermTM Cycle Sequencing Kit，购自美国Epicentre Technologies公司)说明书进行DNA序列测定反应，其中引物为通用T7和T3引物，DNA测序结果显示其与理论设计相符。

纯化的重组rSIFN-co蛋白进行N-末端16个氨基酸及C-末端4个氨基酸序列测定。其结果为：

N端：

Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-

其N-末端的甲硫氨酸(Met)在成熟蛋白中被切除。

C端：

Arg-Arg-Lys-Glu-COOH。

rSIFN-co全长核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

表达载体的构建、转化、酶切鉴定及其遗传稳定性

表达载体的构建、转化

将大肠杆菌表达载体pBAD18质粒先经Nde I酶解，使质粒线性化(Linearized)，然后用Xba I进行充分酶解。经1％琼脂糖凝胶电泳，再用德国QIAGEN公司生产的QIAEX II试剂盒纯化，得到pBAD18经NdeI和XbaI消化的4.8kb片段。

与此同时将pHY-1质粒进行Nde I和Xba I双酶切，同样经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，纯化出715bp大小的序列片段。将上述4.8kb的pBAD18片段与715bp的rSIFN-co和pBAD18酶切片段在T4DNA连接酶催化下连接成重组质粒。将连接反应物转化DH5α感受态细胞，然后将转化细胞涂于LB-Amp琼脂平板，置37℃培养过夜。

阳性克隆菌株的筛选

随机从上述LB平板中挑起单个细菌菌落，用核酸内切酶酶解，PCR分析的方法筛选含rSIFN-co全长编码序列的重组质粒菌株。将其中一个PCR阳性重组质粒命名为pHY-5。将含有pHY-5质粒的菌株命名为PVIII，扩增后加入甘油冻存液冻存于-80℃备用。

rSIFN-co基因在E.coli LMG194中的高效表达

在pHY-5质粒中，rSIFN-co基因处于强启动子P_BAD的调控之中，而P_BAD又受Ara C蛋白的调控。Ara C是由位于同一质粒中的ara C基因编码的蛋白质。在没有阿拉伯糖存在的情况下，Ara C二聚体与O₂及I₂结合形成一个210bp的环。这一结构导致转录的完全抑制。当加入阿拉伯糖时，Ara C二聚体与O₂脱离，并转而与I₁和I₂结合，解除对转录的抑制。阿拉伯糖结合失活、抑制、及激活P_BAD启动子的转录，从而刺激P_BAD介导高水平的rSIFN-co表达。rSIFN-co表达量可达菌体总蛋白的50％。

二、分离纯化：

(1)、制备生产菌种：将含有表达载体pHY-5的E.coli LMG194工程菌种接种在LB培养基中，37℃，摇瓶振荡(200rpm)培养过夜(约18小时)，细菌培养液中加入50％浓度为30％的甘油，混匀分装成1ml每支，-20℃保存，作为生产菌种；

(2)、制备I级种子菌：将生产菌种按1％的比例接入LB培养基(1L中含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g)，37℃，200rpm培养过夜，作为I级种子菌；

(3)、发酵、收菌：将I级种子菌再按10％的比例加入RM培养基(1L中含有酪蛋白20g，氯化镁1mmol/L(0.203g)，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾3g，氯化钠0.5g，氯化胺1g)中，37℃，pH7.0，发酵至OD600值2.0左右加入阿拉伯糖(20％)至终浓度0.02％诱导，4小时后收菌，离心，得到菌体沉淀；

(4)、制备包涵体：将离心后的菌体沉淀用适量缓冲液A(100mmol/L Tris盐酸pH7.5，10mmol/L EDTA，100mmol/L氯化钠)重混悬，置-20℃冷冻过夜，取出融化后，匀浆机破菌，离心，再用缓冲液B(50mmol/L Tris盐酸pH7.5，1mol/L尿素，10mmol/L EDTA，0.5％Triton X-100)、缓冲液C(50mmol/L Tris盐酸、pH7.5，2mol/L尿素，10mmol/L EDTA，0.5％Triton X-100)分别洗涤沉淀两次，再用蒸馏水洗涤一次，得到包涵体；

(5)、复性处理：用6mol/L盐酸胍(或尿素)溶解包涵体得到稍浑浊的变性液，10000rpm高速离心，取上清液测定变性液的蛋白浓度；按终蛋白浓度0.3mg/ml，分三次将变性液加入已配制好的复性液(0.5mol/L精氨酸，150mmol/LTris盐酸pH7.5，0.2mmol/L EDTA)中，并在4℃连续搅拌过夜(约18小时)；然后，依次用10倍体积的10mol/L磷酸盐缓冲液(PB)、和5mol/L的磷酸盐缓冲液及蒸馏水透析；透析完毕，用2mol/L的醋酸-醋酸钠(pH5.0)调pH，静置，过滤：

(6)、HS阳离子柱层析：柱体先用20mmol/L的醋酸-醋酸钠(pH5.0)平衡，将步骤(5)得到的复性产物以30ml/min的速度上样，用20个柱体积的20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.0)，洗脱杂蛋白；接着，用5个柱体积含0.15mol/L氯化钠的20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.0)，洗脱杂蛋白。然后，再用3个柱体积含0.18mol/L氯化钠的20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.0)，洗脱杂蛋白；最后，用含0.25mol/L氯化钠的20mmol/L醋酸-醋酸钠(pH5.0)解离目标蛋白，得到HS解离蛋白液；

(7)、铜离子亲和层析(chelating sepharose^TM fast flow)：将HS解离蛋白液加入0.2mol/L、pH6.6的PB缓冲液中，用4mol/L的氯化钠调到含1mol/L氯化钠，pH6.0，备上样；柱体用含1mol/L氯化钠的50mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH5.5)平衡，以1ml/min的速度上样；接着，用50mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)，洗脱杂蛋白；再用50mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)，洗脱杂蛋白；然后，再用50mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(pH3.6)，解离目标蛋白，得到螯合柱解离目标蛋白液；

(8)、HS柱层析：将螯合柱解离目标蛋白液稀释30倍，并将pH调至5.0，上HS柱，以含0.5mol/L氯化钠的PB缓冲液(pH7.0)解离，收集，即得所述的重组干扰素(原液)。

实施例2

重组干扰素制剂

冻干注射剂(冻干粉)的配方

本发明rSIFN-co原液 34.5μg/ml

pH7.0的磷酸盐缓冲液 10mmol/L

甘氨酸 0.4mol/L

制备工艺：按配方称料，无菌无热原注射水溶解，0.22μm孔径滤膜过滤除菌，于6-10。℃保存，取样作无菌和热原检查合格后分装西林瓶中，每瓶0.3-0.5的单次剂量，分装后放置至冻干机中冷冻干燥。

水溶液注射剂的配方

本发明rSIFN-co原液 34.5μg/ml

pH7.0的磷酸盐缓冲液 25mmol/L

氯化钠 0.4mol/L

制备工艺：按配方称料，无菌无热原注射水溶解，0.22μm孔径滤膜过滤除菌，于6-10℃保存，取样作无菌和热原检查合格后分装于密闭容器中，每瓶0.3-0.5的单次剂量，分装后成品置2-10℃暗处保存。

实施例3

rSIFN-co与干复津抗人乳腺癌细胞的体外实验研究

本实施例为重组干扰素rSIFN-co及干复津抗人乳腺癌细胞的体外实验研究。

分别以本发明所述重组干扰素rSIFN-co和美国安进公司生产的干复津为试验药物，考察其对人乳腺癌MCF-7细胞及耐药株MCF-7/ADR细胞增殖、凋亡及癌基因表达的影响。

一、实验方法

1.细胞培养

将人乳腺癌细胞株MCF-7细胞及人乳腺癌阿霉素耐药株MCF-7/ADR细胞分别培养于25cm²或75cm²培养瓶中，细胞长满瓶底后，以0.25％胰酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

2.MTT比色法检测不同浓度的rSIFN-co对细胞增殖的影响

实验分组：每株细胞分3大组共11小组：rSIFNco组(0.02、0.078、0.313、1.25、5.0μg/ml)、干复津组(0.02、0.078、0.313、1.25、5.0μg/ml)、空白对照组(含10％小牛血清的RPMI1640培养液(美国Sigma公司)，也称为RPMI1640完全培养基)，其中用RPMI1640完全培养基将rSIFNco和干复津稀释成所需浓度(使乙醇浓度＜1％)，4℃保存。

取对数生长期的MCF-7细胞、MCF27/ADR细胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液，配制成1.25×10⁵/mL的细胞悬液，台盼蓝法测细胞活率＞95％，将细胞接种于96孔培养板上，每孔100μL。按上述分组加入药物后24h、48h、72h，常规MTT法检测细胞的增殖(在酶标仪上于波长490nm处检测吸光度)。每组设2个复孔作为平行样。以上实验重复3次，按照以下公式计算不同药物浓度及作用时间对细胞株的生长抑制率：

增殖抑制率(％)＝(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100％。

3.流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡

实验分组：每株细胞分3组，分别为rSIFN-co(5μg/mL)组、干复津(5μg/mL)组、及空白对照组(含10％小牛血清的RPMI1640培养液)。

FCM检测：分别收集加入药物作用48h后各组细胞，制成单细胞悬液，采用碘化丙啶(PI)染料，用Elite Esp型流式细胞仪(美国Coulter公司)测定凋亡率，用随机所附软件对测量值进行分析。以上实验重复3次。

4.免疫组化检测各组细胞癌基因的蛋白表达

实验分组：每株细胞分3组。向MCF-7细胞培养液中加入rSIFN-co(5μg/mL)、干复津(5μg/mL)、及含10％小牛血清的RPMI1640。MCF-7/ADR细胞培养液中加入rSIFN-co(5μg/mL)、干复津(5μg/mL)、及含10％小牛血清的RPMI1640。

免疫组化检测P53、Bcl-2、CerbB-2蛋白的表达：将细胞爬片所用的盖玻片先经酸处理后洗涤干净、高压灭菌，放入6孔培养板中。取对数期生长的MCF27细胞、MCF27/ADR细胞，用0.25％胰酶消化成单细胞悬液，接种至6孔板中，每孔1×10⁵，37℃、CO₂孵箱培养24h，待细胞贴壁后，分别加入各组药物，处理48h后，取出盖玻片，采用常规免疫组化SABC法染色，一抗浓度均为1：100。

结果判定标准：染色结果判定参照Volm的方法(Volm M等，European Journal of Cancer，1997，33(3)：691-693)，以细胞胞核(P53)、胞浆(Bcl-2)或胞膜(CerbB-2)内出现黄色或棕黄色颗粒者为阳性。高倍镜下(400×)对每张玻片随机选取5个视野，每个视野计数200个细胞。每组细胞的表达由两方面共同决定。阳性染色深度：按每个细胞着色深浅计分，无着色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分，其平均值即为该组细胞的平均染色深度；阳性细胞百分比：未见染色为0分，染色细胞＜25％为1分，25％～50％为2分，＞50％为3分。两项的总和，得分0～分判为表达阴性，2～分判为阳性，4～6分判为强阳性。使用双盲法进行(染色者及结果观察者均不知玻片的分组情况)。

二、统计学方法

对试验数据进行统计学处理：所有试验数据，经SPSS11.5统计软件包处理，采用t检验、方差分析和秩相关分析；P＜0.05，认为差异有统计学意义。

三、实验结果

1.对MCF-7细胞、MCF-7/ADR细胞增殖的影响

(1)MCF-7细胞：rSIFN-co能抑制MCF-7细胞的增殖。浓度分别为0.02、0.078、0.313、1.25、5.0μg/mL的rSIFN-co和干复津作用的各细胞组的吸光度OA，与空白对照组比较均显著降低，经方差分析，早期(24h、48h)rSIFN-co与干复津对MCF-7细胞抑制作用的差异无统计学意义(P＞0.05)，但作用72h后，除最低浓度0.02μg/mL外，rSIFN-co的抑制率均较相同浓度干复津的抑制率更高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1-1。

表1-1对MCF-7细胞体外生长的抑制率(％，n＝6)

*P＜0.05，vs干复津

(2)MCF-7/ADR细胞：rSIFN-co能抑制MCF-7/ADR细胞的增殖。浓度分别为0.02、0.078、0.313、1.25、5.0μg/mL的rSIFN-co和干复津作用的各细胞组的吸光度OA，与空白对照组比较均显著降低，经方差分析，除最低浓度0.02μg/mL外，rSIFN-co的抑制率均较相同浓度干复津的抑制率更高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1-2。

表1-2对MCF-7/ADR细胞体外生长的抑制率(％，n＝6)

*P<0.05，vs干复津

2.对MCF-7细胞、MCF-7/ADR细胞凋亡的影响

与空白对照组相比，作用48h后，5μg/mL的rSIFN-co和干复津均能诱导MCF-7细胞凋亡，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，5μg/mL的rSIFN-co和干复津均能诱导MCF-7/ADR细胞凋亡，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。相同浓度的rSIFN-co较干复津对MCF-7细胞、MCF-7/ADR细胞的诱导凋亡作用更显著，两者差异有统计学意义(P<0.01)。见表1-3。

表1-3作用48h时乳腺癌细胞凋亡率的变化(％，n＝6)

*P<0.01， vs对照；▲P<0.01，vs干复津

3.对各组细胞P53、CerbB-2和Bcl-2蛋白表达的影响

在MCF-7细胞中，rSIFN-co处理后能下调P53表达，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，但干复津处理后，虽然P53表达有一定程度下降，但与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；在MCF-7/ADR细胞中，rSIFN-co和干复津均能下调P53表达，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，但相同浓度的rSIFN-co与干复津相比，两者间无明显差异(P>0.05)。

在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中，rSIFN-co处理后均能下调CerbB-2表达，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，干复津处理后，虽然CerbB-2表达均有一定程度下降，但与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

在MCF-7细胞中，rSIFN-co和干复津处理均能上调Bcl-2表达，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，且rSIFN-co上调Bcl-2表达的作用较干复津更显著，两者差异有统计学意义(P＝0.001)；在MCF-7/ADR细胞中，rSIFN-co和干复津处理均能上调Bcl-2表达，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。

结果详见表1-4。

表1-4作用48h后对乳腺癌细胞P53、CerbB-2、Bcl-2表达的影响(n＝5)

★P＜0.05，*P＜0.01，vs对照

实施例4

rSIFN-co与干复津抗宫颈癌细胞的体外实验研究

本实施例为重组干扰素rSIFN-co及干复津对宫颈癌细胞的生长抑制及促凋亡作用的体外实验研究。

分别以本发明所述重组干扰素rSIFN-co和美国安进公司生产的干复津为试验药物，观察其对宫颈癌Caski细胞(HPV16+)细胞的生长抑制以及促凋亡作用。

一、实验方法

1、Caski细胞生长抑制试验

1.1细胞培养与分组

用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液稀释药品，在96孔培养板中培养宫颈癌Caski细胞。以培养液调定细胞数为1×10⁵/ml制成单细胞悬液，在培养板各孔中加入100μl细胞悬液。向培养板中分别加入rSIFN-co和干复津，每种药物的浓度梯度为0.156μg/ml、0.625μg/ml、2.5μg/ml和10μg/ml，并设置对照组(含10％小牛血清的RPMI-1640培养液)，每个浓度设3个复孔。放置于37℃、5％CO₂孵箱培养72小时。

1.2MTT法检测细胞生长抑制率

配制MTT试剂(美国Sigma公司)，使其浓度为5mg/ml。培养板各孔分别加入10μl MTT液，轻微震荡使其混匀，放置于37℃，5％CO₂孵箱中反应4小时后，见培养板孔底部出现蓝色结晶。弃去培养板中上清液，每孔加入100μl二甲基亚砜，室温下待结晶溶解，在570nm波长酶标仪读取OD值。

1.3计算细胞生长抑制率

细胞生长抑制率＝(1-样品孔OD值/对照孔OD值)×100％。

2、Caski细胞凋亡试验

2.1细胞培养与分组

分7组在含10％灭活小牛血清的RPMI-1640培养液中培养宫颈癌Caski细胞，第1组直接用培养液培养72小时，作为对照组；第2-4组rSIFN-co浓度分别为0.156μg/ml、0.625μg/ml、2.5μg/ml；第5-7组干复津浓度分别为0.156μg/ml、0.625μg/ml、2.5μg/ml。

2.2流式细胞仪检测Caski细胞凋亡率

收集每组细胞至离心管中以1000r/min离心5分钟，弃去上清液，采用AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡。每样本细胞数约为1×106个，用孵育缓冲液洗1次，1000r/min离心5分钟，用100μl的标记液重悬细胞，室温下避光孵育15分钟，以1000r/min离心5分钟沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次，加入荧光溶液在4℃下孵育20分钟，避光并不时震动，以流式细胞仪检测。

二、统计学处理

所有定量分析数据以表示，采用方差分析不同药物、不同浓度组之间的差异，应用SPSS14.0软件包进行统计学分析。

三、实验结果

1、对Caski细胞生长抑制的作用

rSIFN-co和干复津对Caski细胞的生长有抑制作用，这种作用随干扰素作用浓度的增加而升高。rSIFN-co与干复津相比，在0.625、2.5、10μg/ml浓度时对Caski细胞生长的抑制作用高于干复津，两者差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2-1。

表2-1对宫颈癌细胞的抑制作用()

①与同浓度干复津组比较，P＜0.01。

2、促进Caski细胞凋亡的作用

rSIFN-co和干复津都有促进宫颈癌细胞凋亡的作用，这种作用随药物浓度的增加而明显；rSIFN-co在低浓度(0.156μg/ml)时对宫颈癌细胞的促凋亡作用强于干复津的作用，两者差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2-2。

表2-2促进宫颈癌细胞凋亡的作用()

①与对照比较，P＜0.01；

②与同浓度干复津组比较，P＜0.01。

实施例5

rSIFN-co与干复津的人体药动学及生物等效性研究

本实施例为重组干扰素rSIFN-co及干复津人体药动学及生物等效性的研究。分别以本发明所述重组干扰素rSIFN-co和美国安进公司生产的干复津为试验药物，对其人体药动学和生物等效性进行比较研究。

干扰素在健康人体内的药物代谢动力学研究是干扰素研究的难点。由于药用干扰素注射后在血浆中的干扰素水平均系微量，用酶联免疫吸附测定(ELISA)或病毒细胞病变抑制法都难以直接在健康成人血清中将其测出。目前，干扰素的药物代谢动力学研究所采用的检测指标一般是2’，5’-OAS(2-5A寡聚核苷酸酶)，它既是干扰素的诱生产物，又是其药效活力的代表。

一、对象与方法

1.对象

纳入健康男性志愿者18名，年龄(22.8±1.4)岁，身高(170±5.0)cm，体重指数20.5±2.4[体重(59.4±7.2)kg]。受试者经全面体格检查、实验室检查(包括血液学、尿常规、肝肾功)及心电图检查均正常。自受试前4周起未使用过任何药物；试验前3个月内未用过已知对脏器有损害的药物；对试验药物无过敏史；自愿受试并签署知情同意书。

2.方法

本试验获得四川大学华西医院医学伦理委员会批准，根据中华人民共和国GCP相关指导原则进行。

2.1材料

试验制剂：

冻干重组高效复合干扰素粉针剂(实验制剂，即本明所述重组干扰素rSIFN-co，9μg/支)。参比制剂：干复津注射液(参比制剂，9μg/支)，美国安进公司生产。

2-5A试剂盒：

Eiken，Radioimmunoassay试剂盒由日本荣研化学株式会社提供，试剂盒含：(1)I₁₂₅-标记2’，5’-OAS；(2)抗2’，5’-OAS血清；(3)2’，5’-OAS标准瓶(每瓶含0、10、30、90、270或810pmol/dL的2’，5’-OAS；(4)缓冲液；(5)空白血清；(6)聚(I)聚(C)琼脂；(7)ATP；(8)巯基乙醇；(9)随行质控血清。

2.2试验设计与给药方法

采用随机自身交叉对照试验设计，18名受试者随机均分为A、B两组，每组9人，分别于两个周期内交叉皮下注射试验制剂rSIFN-co9μg和干复津9μg，清洗期1周。

每次试验前日晚8时后禁食至次日晨用药后2h，试验当日晨7：00于上臂三角肌部作皮下注射。试验当日统一用标准餐(不含高脂肪食物)，禁止吸烟、饮酒及饮茶、咖啡类饮料，试验期间禁用一切药物，禁止剧烈活动。

2.3血样采集与检测

给药前抽取血样4ml，给药后2、6、12、18、22、24、26、30、34、38、42及48h于对侧肘静脉取血约3.5ml，立即离心分离血清置于-20℃保存直至检测。

检测各血样中血清2’，5’-OAS浓度。

3统计学方法

使用DAS ver1.0统计软件，试验制剂和参比制剂的比较采用配对t检验。

二、结果

根据测得的各血样中血清2’，5’-OAS浓度，绘制均值酶浓度-时间曲线，见图16。

由图16可以看出，分别皮下注射rSIFN-co9μg、干复津9μg后，二者的酶浓度-时间曲线变化趋势基本一致，但皮下注射rSIFN-co血中酶浓度-时间曲线峰浓度显著高于干复津。

试验制剂(rSIFN-co)对参比制剂(干复津)的相对生物利用度(F)按下式进行计算：

F＝[AUC_试验制剂/AUC_参比制剂]×[参比制剂剂量/试验制剂剂量]×100％

计算结果显示rSIFN-co相对生物利用度(F0～48)为125.4％。试验制剂和参比制剂的T_max差异无统计学意义(t＝1.458，P＝0.163)，AUG_0-48和C_max差异有统计学意义(t＝2.730，P＝0.014；t＝2.347，P＝0.031)，试验制剂高于参比制剂。

此外，比较两组的不良反应：干复津组的不良反应在发生率、发生程度和持续时间三个方面均重于rSIFN-co组。

三、结论

(1)注射rSIFN-co与干复津后均能诱生2’，5’-OAS，二者的药代动力学曲线变化趋势一致，主要药代动力学参数比较无统计学差异。

(2)注射rSIFN-co诱生的2’，5’-OAS的Cmax和AUC_0-48大于干复津诱生的2’，5’-OAS的Cmax和AUC_0-48，提示rSIFN-co在相同剂量治疗时，其疗效可能优于干复津。

(3)干复津组的不良反应在发生率、发生程度和持续时间三个方面均重于rSIFN-co组。

(4)以不同采血时间测定的受试者血清中2’，5”寡腺苷酸合成酶(2’，5’-OAS)的含量作图(即均值酶浓度一时间曲线)后发现：注射rSIFN-co诱生的2’，5’-OAS浓度一般出现双峰现象，其曲线下面积显著大于在同一条件下注射干复津所获得的曲线下面积，且并未由于曲线下面积的增加而增加不良反应发生率和/或加重发生程度。

实施例6

重组干扰素的结晶

制备优质rSIFN-co蛋白质单晶是测定其晶体结构的前提条件。用于晶体生长的rSIFN-co样品得自如上所述的本发明rSIFN-co。rSIFN-co的单晶制备的方法、技术流程和结晶条件，及其晶体学参数如下：

将上述本发明的rSIFN-co冻干粉溶解于纯水中并在低温(-20℃)下保存，初始蛋白质浓度为0.42mg/ml。结晶前将rSIFN-co蛋白质样品浓缩至3-3.5mg/ml后立即用于晶体生长实验。晶体培养均在室温下(293k)采用悬滴汽相扩散法进行。

在结晶研究初期，rSIFN-co的微晶可以在多个系列条件中出现，但获得可用于X-射线衍射分析并有足够分辨率的优质单晶十分困难。经过大量结晶条件优化研究，得出所获晶体质量最好的结晶溶液条件为1.2M(mol/L，下同)Li₂SO₄、0.1M CAPS(3-(环己氨基)-1-丙磺酸)，pH11.1，0.02M MgCl₂。按此条件配制的结晶溶液静置三天至一周后，获得rSIFN-co蛋白质的优良单晶，晶体为三方晶型，晶体大小为0.42×0.08×0.08mm。用于X-射线衍射晶体结构分析的rSIFN-co蛋白质晶体见图1。

实施例7

晶体X-射线衍射数据的分析

晶体衍射数据收集：

数据收集在日本筑波光子工厂同步辐射站线BL5A，低温条件下(100K)完成。具体操作步骤如下：

(1)在显微镜下仔细小心用安置晶体工具将晶体从母液捞到工具顶部的线圈中；

(2)采用快速冷冻技术(Flash-Cooling)迅速将含有晶体的线圈在防冻试剂parrafin oil(购自hampton Research公司)浸泡几秒后，快速将安置晶体工具放置在衍射仪器测角头上，这时晶体也瞬间处于低温氮气流(100K)中，使数据收集在100K低温下进行；

(3)设定参数后开始进行数据收集，光源波长为探测器为ADSC Quantum315CCD(电荷偶合器件探测器)，晶体到探测器的距离为310mm；采用回摆法收集数据，每幅画面所用回摆角度为1°，每幅曝光时间为12秒，总共收集了110幅画面(见图2)。

衍射数据处理和分析：

衍射实验首先收集得到一套直观的衍射画面(图2)，这些画面必须经过收集到的全套衍射数据用CCP4程序包进行处理和分析，以应用于衍射数据质量评估和结构解析。这个过程包括：1)指标化：将衍射数据转换为晶体学指标(h，k，l)，并计算出晶胞参数和空间群；2)参数修正：对晶胞参数、晶体和探测器间距离与角度和晶体镶嵌度等参数进行精化；3)

积分：从衍射斑点得到强度信息；4)数据合并：将所有对称相关和重复的衍射点合并，产生一套由独立衍射点构成的完整数据；5)将强度数据转化为结构振幅。rSIFN-co晶体衍射数据收集和处理分析的结果详见表3。

表3

rSIFN-co晶体衍射数据收集和处理分析结果

实施例8

晶体结构解析

晶体衍射相位的测定和rSIFN-co分子初始结构模型的建立

rSIFN-co晶体结构采用分子置换法进行相位解析，选择绵羊IFN-τ(其与rSIFN-co序列同源性54％)的晶体结构(PDB编号1B5L)作为分子置换的同源结构模型，用软件程序Phaser，进行旋转函数和平移函数的计算分析，推定rSIFN-co分子在晶胞中的位置和取向。根据劳厄群和系统消光规律，测定空间群为P3121，同时将模型分子进行一些修改(即保留了1B5L结构中的13-25，37-69，79-101，114-151位残基)，计算结果是：Z-score为15.71，IL-gain为307.79，Clash为0。晶胞中分子堆积合理，且在分子置换过程中IL-gain逐步上升，表明获得了正确解，测定了各衍射点的初始相位。进而用Phaser生成的带有初始相位的mtz通过FFT生成电子密度图，获得的rSIFN-co分子的初始结构模型与生成的电子密度图匹配良好，表明已获得rSIFN-co所有衍射点的正确相位解。以所述结果为基础，构建了rSIFN-co分子的初始结构模型。

rSIFN-co结构模型的精化

运用分子模建技术和计算机优化程序，对rSIFN-co分子初始模型中的所有非氢原子的坐标参数和温度因子进行叠代式修正(refinemem)，以获得精确的rSIFN-co分子结构模型。

结构修正采用程序CNS1.1，数据为没有相位的母体数据，从其中随机提取10％作为测试集(testing set)，且至始至终保持同一套随机选取的测试集。结构模型中的所有原子均参与修正，且每个原子的修正参数均为4个，包括坐标(x，y，z)和各向同性温度因子B。整个修正过程中，结构的计算机自动修正与模型的人工调整、搭建(用软件O)交替进行，在修正起始时使用了限制性的NCS，当在结构调整基本完成时，修正中不再使用NCS。当R_work因子(低于0.30)和R_free因子基本不再继续下降时，开始在结构中加入水和溶剂分子，最终完成结构的精化，其主要精化指标为，R_work为0.250，R_free为0.286。最终获得的精化rSIFN-co分子结构的主要指标列于表4。所得到的rSIFN-co的原子坐标如表7所示。

表4

rSIFN-co分子精化结构模型的主要参数指标和质量统计结果

1自由不符合指数R_free取不参与修正的10％总衍射点数计算；

2相对标准键长/键角计算的均方根偏差

3拉氏构象图(Ramachandran plot)统计所用软件为PROCHECK.

实施例9

rSIFN-co分子结构模型的质量表征

(1)模型的电子密度图：可以直观、清晰、准确地显示rSIFN-co。图3为一代表性电子密度图与rSIFN-co分子中氨基酸残基结构的配合情况，可清晰辨识不同氨基酸残基的空间位置和取向。

(2)平均温度因子随残基的分布图(见图4)。

(3)分子的立体化学指标——拉氏构象图：rSIFN-co分子的立体化学合理性由拉氏构象图(图5)表征，其结构位于最适允许区的氨基酸残基数占90.6％，位于允许区的9.1％，位于一般允许区的0.4％。表明rSIFN-co分子结构模型具有合理的立体化学。

实施例10

rSIFN-co分子的晶体结构特征

rSIFN-co分子在晶体中的堆积及总体排列

rSIFN-co分子在晶胞中的堆积方式见图6所示。rSIFN-co晶体结构的一个不对称单位中包含2个蛋白质分子(称为晶体学二聚体)(见图7所示)。二聚体间的包埋面积为即每个晶体所贡献的面积为仅占单体总面积的约6.4％。二聚体中A链的A、B、F面与B链的C、D、E面相对应(见图 9所示)；用VADAR软件计算单体，二聚体折叠自由能量分别为-126.9和-257.1，即二聚体折叠自由能与两个孤立单体自由能分别(-126.9×2)很接近。这表明二聚体间相互作用里较弱。同时两者间仅存在两个弱氢键A12(ARG)NH2...NH2B71(Arg)，3.05埃；A145(Arg)NH1...OH B90(Tyr)，3.14埃。

在纯化过程中证明rSIFN-co蛋白质溶液态下为单体，现有生化功能实验表明IFN-α类功能单位应是单体，因此这个二聚体可能是由于晶体堆积而形成的。

二聚体结构

一个不对称单位中的两个rSIFN-co单分子形成了一个二聚体。图8显示出了rSIFN-co晶体学二聚体的组织方式。A链由11-103和111-163位残基构成(1-10，104-110和164-166由于在电子密度图上没有表现而没有构建)；B链由11-103和110-163位残基构成(1-10，104-109和164-166由于在电子密度图上没有表现而没有构建)。在晶体结构中可见到每个单体的第29位和第139位的Cys形成了分子内二硫键，而第1位和第99位的Cys间的分子内二硫键由于第1位Cys在晶体结构中未构建所以没有体现。另外，A链的30-33、47-49位及B链的30-33、48-50位残基由于侧链的密度没有表现，故这些残基主要构建为Ala或Gly。另外，A链的30-33、47-49位及B链的30-33、48-50位残基由于侧链的密度没有表现，故这些残基主要构建为Ala或Gly。两个单体的结构基本相同，由非晶体学对称性所联系(从B到A，极角Omega、Phi、Kappa分别为170.64、94.56、118.35；平移分数tx、ty、tz分别为-1.061、-0.225、0.155)。对两个单体进行叠合比较(见图8)，除了少数几段分子表面的环(loop)区域柔性比较大以外，绝大部分残基能够很好地叠合(所有α碳原子RMSD随氨基酸的分布如图8c)，其中127个残基(13-30、34-44、53-101、115-163)α碳原子的均方根偏差为0.64埃。局部结构的差异是可能由于蛋白质的较大柔性以及晶体堆积环境的不同而造成的。

单分子结构

每个单体由6段α螺旋(A、C、C’、D、E、F)、一段310螺旋(B)以及它们之间的连接肽段所构成，整个单体结构的折叠方式属于螺旋状细胞因子型 (见图9所示)。6段α螺旋(A、C、C’、D、E、F)所对应的氨基酸残基位置分别是：13-20、50-68、70-76、79-100、114-133、138-160。一段310螺旋(B)所对应的氨基酸残基位置是40-43。图9清楚地显示了这些二级结构的分布和组织方式。图10示出了二级结构与氨基酸序列的对应关系。

实施例11

rSIFN-co和IFN-α2b的三维结构

干扰素根据受体的不同，首先可分为两类：I型和II型。I型类群又可分为α、β、ω等，其中IFNα又包括近15种不同的亚型，不同α类蛋白质间的蛋白质序列同源性者在80％以上，但是它们的功能却显示了多样性。rSIFN-co蛋白质属于IFNα类中非天然的人工设计蛋白质，至今I型IFNs只有6个三维结构(表5)，它们的氨基酸序列同源性可见序列对比(如图11所示)。

从表5和图11对比分析可以知道，与rSIFN-co的晶体结构最相近的是IFN-α2b(如图12所示)，在序列上，rSIFN-co主要在45位比IFN-α2b多一个天冬氨酸(D)；在三维结构上，它们主要区别在AB环(25-33位残基)和BC环(44-52位残基)的空间构象有显著不同。IFN-α2b的晶体结构已在2.9埃分辨率解析，但在蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB)中仅有α碳原子的坐标，所有其它原子的坐标数缺失(PDB Code1RH2)。故rSIFN-co与IFN-α2b的结构比较只能在α碳原子的水平上进行。这两个分子所有α碳原子之间的均方根偏差(RMSD)为1.577埃，但它们在AB环区和BC环区的均方根偏差为3.6埃和2.9埃，分别是其总平均值的2.5倍和2倍。此外，rSIFN-co的晶体结构中不对称单位中含有2个分子，而IFN-α2b的晶体学不对称单位中有6个蛋白质分子，由3个二聚体构成。显然，rSIFN-co的二聚体组织方式与IFN-α2b明显不同(如图13所示)。

表5

已测定结构的干扰素分子

现有技术已知，作为细胞因子的干扰素首先与细胞膜上的特异受体结合，以激活多种信号传导途径，使机体产生抗病毒、抗肿瘤等生物学效应。rSIFN-co属于IFN-α类干扰素，其在细胞膜上的受体已知由IFNAR1和IFNAR2共同组成，并由此构建了受体与IFN-α分子结合的三维结构模型(如图15a所示)。以此为基础，一系列分子生物学实验研究显示，IFN-α类蛋白质与受体IFNAR1、IFNAR2相互作用时形成夹层式结构(如图15a所示)，即IFN-α类的A、B、F面与IFNAR2相互作用，而其相对的C、D、E面与IFNAR1相作用。同时，深入的分子生物学定位突变试验揭示IFN-α类功能重要区(如图15所示)，其中AB环尤其重要，它是与IFNAR2相互作用的主要分子部位。结构比较显示(如图12、表6所示)，这一重要部位在rSIFN-co和IFN-α2b中明显不同。这一活性重要部位的结构差异，可能通过影响其与受体结合特征的改变，产生不同的生理/药理效应。

显然，rSIFN-co干扰素虽然与IFN-α2b有类似的分子骨架，但却在其功能活性重要区具有显著不同的结构。因此，从药理活性密切相关的分子局部结构看，rSIFN-co是不同于IFN-α2b的新类型分子，从而导致了两者间具有显著不同的生物学和药物学特征。以特殊的关键部位的特征三维结构为基础，干扰素rSIFN-co可能产生独特的生理和药理效应。

表6

rSIFN-co与IFN-α2b的AB环和BC环中碳原子的位置均方根偏差(单位：埃)

表7

rSIFN-co的原子坐标

Claims

1.一种氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的重组干扰素的晶体，其中该晶体的空间群为P3₁21，单晶胞参数为：a＝b＝77.92埃，c＝125.935埃，α＝β＝90°，γ＝120°，所有晶胞参数的可变性不超过5％。

2.权利要求1的重组干扰素晶体，其中单晶胞参数为：a＝b＝77.92埃，c＝125.935埃，α＝β＝90°，γ＝120°。

3.权利要求1-2任一项的重组干扰素晶体，所述晶体在一个不对称单位中包含2个分子。

4.权利要求1-3任一项的重组干扰素晶体，进一步包含共价或非共价结合的金属离子。

5.权利要求1-4任一项的重组干扰素晶体，其中所述重组干扰素由包含SEQID NO：2的核苷酸序列所编码。

6.一种包含权利要求1-5任一项的重组干扰素晶体的组合物。

7.权利要求6的组合物，所述组合物是药物组合物。

8.权利要求7的组合物，进一步包含有药学上可接受的载体。

9.一种基于计算机的鉴定能与重组干扰素相互作用的候选化合物的方法，所述方法包括步骤：

(a)提供包含表7所示的重组干扰素的原子坐标的三维结构，所述原子坐标任选地在小于约0.65埃的保守残基骨架原子的均方根偏差内变化；和

(b)选择具有能与上述三维结构或该三维结构经选择的部分相互作用的结构特征的候选化合物，从而鉴定能与所述重组干扰素相互作用的候选化合物。

10.权利要求9的方法，其中在步骤(a)中，所述原子坐标任选地在小于约0.5埃的保守残基骨架原子的均方根偏差内变化。

11.权利要求10的方法，其中在步骤(a)中，所述原子坐标任选地在小于约0.35埃的保守残基骨架原子的均方根偏差内变化。

12.权利要求9-11任一项的方法，其中在步骤(a)中，所述保守残基骨架原子为Cα原子。

13.权利要求9-12任一项的方法，其中所述结构特征选自抗原性位点、亲水特性、表面可接近性和结构基序。

14.权利要求9-13任一项的方法，其中步骤(b)中的候选化合物的选择和鉴定包括：

(i)对多个候选化合物生成三维结构；和

(ii)将步骤(i)的三维结构各自与上述步骤(a)中的三维结构或该三维结构经选择的部分进行拟合，以发现在能量上最有利的相互作用，从而鉴定能与所述重组干扰素相互作用的候选化合物。

15.权利要求9-14任一项的方法，进一步包括步骤：

(c)获取或合成候选化合物；和

(d)使所述候选化合物与所述重组干扰素接触以确定该候选化合物与所述重组干扰素相互作用的能力。

16.权利要求15的方法，其中所述确定候选化合物与重组干扰素相互作用的能力的步骤进一步包括测定所述重组干扰素与候选化合物接触时的活性。

17.权利要求16的方法，其中所述活性选自抗病毒活性、抗肿瘤活性、抗增殖活性、天然杀伤细胞活性和免疫调节活性。

18.权利要求9-17任一项的方法，其中所述候选化合物是与所述重组干扰素或其经选择的部分结合的配体。

19.权利要求18的方法，其中所述配体选自：受体、改性剂、激动剂和拮抗剂，以及其中所述经选择的部分包含来自所述重组干扰素的第25-33位氨基酸残基和/或第44-52位氨基酸残基的一个或更多个氨基酸残基。

20.权利要求19的方法，其中所述经选择的部分包含来自所述重组干扰素的第25-33位氨基酸残基和/或第44-52位氨基酸残基。

21.一种基于计算机设计重组干扰素模拟物的方法，包括步骤：

(a)对多个模拟物生成三维结构；和

(b)将步骤(a)的多个模拟物的三维结构各自与包含表7所示的重组干扰素的原子坐标的三维结构或该三维结构经选择的部分进行拟合，以发现所述重组干扰素的最佳拟合模拟物，所述原子坐标任选地在小于约0.65埃的保守残基骨架原子的均方根偏差内变化。

22.权利要求21的方法，其中在步骤(b)中，所述原子坐标任选地在小于约0.5埃的保守残基骨架原子的均方根偏差内变化。

23.权利要求22的方法，其中在步骤(b)中，所述原子坐标任选地在小于约0.35埃的保守残基骨架原子的均方根偏差内变化。

24.权利要求21-23任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述保守残基骨架原子为Cα原子。

25.一种基于计算机的合理药物设计方法，包括步骤：

(a)提供包含表7所示的重组干扰素的原子坐标的三维结构，所述原子坐标任选地在小于约0.65埃的保守残基骨架原子的均方根偏差内变化；

(b)提供多个分子片段，并对其生成三维结构；

(c)将所述多个分子片段的三维结构各自与步骤(a)的三维结构或该三维结构经选择的部分进行拟合；和

(d)将经选择的所述分子片段组装到一个分子中以产生候选药物。

26.权利要求25的方法，其中在步骤(a)中，所述原子坐标任选地在小于约0.5埃的保守残基骨架原子的均方根偏差内变化。

27.权利要求26的方法，其中在步骤(a)中，所述原子坐标任选地在小于约0.35埃的保守残基骨架原子的均方根偏差内变化。

28.权利要求25-28任一项的方法，其中在步骤(a)中，所述保守残基骨架原子为Cα原子。

29.权利要求25-28任一项的方法，进一步包括步骤：

(e)获得或合成候选药物；和

(f)令所述候选药物与所述重组干扰素接触，从而确定候选药物与所述重组干扰素相互作用的能力。

30.权利要求9-29任一项的方法，其中所述三维结构经选择的部分包含表7中所包含的来自第25-33位氨基酸残基和/或第44-52位氨基酸残基的一个或更多个氨基酸残基的原子坐标，所述原子坐标任选地在小于约0.65埃的保守残基骨架原子的均方根偏差内变化。

31.权利要求30的方法，其中所述三维结构经选择的部分包含表7中所包含的来自第25-33位氨基酸残基和/或第44-52位氨基酸残基的原子坐标，所述原子坐标任选地在小于约0.65埃的保守残基骨架原子的均方根偏差内变化。

32.权利要求30或31的方法，其中所述三维结构经选择的部分所包含的原子坐标任选地在小于约0.5埃的保守残基骨架原子的均方根偏差内变化。

33.权利要求32的方法，其中所述三维结构经选择的部分所包含的原子坐标任选地在小于约0.35埃的保守残基骨架原子的均方根偏差内变化。

34.权利要求30-33任一项的方法，其中所述保守残基骨架原子为Cα原子。

35.权利要求1-5任一项的重组干扰素晶体、或权利要求6-8任一项的组合物在制备用于治疗病毒性疾病和/或肿瘤的药物中的应用。

36.权利要求35的应用，其中所述病毒性疾病选自：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、其它类型的肝炎、由Epstein-Barr病毒、人体免疫缺陷病毒、埃博拉病毒、严重急性呼吸道综合征病毒(SARS)、流感病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、或其它类型的疱疹病毒、乳头多瘤空泡病毒、痘病毒、腺病毒、鼻病毒、I型人类T细胞白血病病毒、或者II型人类T细胞白血病病毒，或者III型人类T细胞白血病病毒引起的病毒感染。

37.权利要求35的应用，其中所述病毒性疾病是由小核糖核酸病毒引起的病毒感染。

38.权利要求35的应用，其中所述肿瘤是癌症。

39.权利要求35的应用，其中所述肿瘤是实体瘤或血癌。

40.权利要求35的应用，其中所述肿瘤选自：皮肤癌、基底细胞癌及恶性黑色素瘤、肾细胞癌、肝癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、胃/腹癌、食道癌、直肠癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、浅表膀胱癌、血管瘤、表皮样癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤、急性血癌、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、淋巴腺瘤、多发性骨髓瘤、红血球过多病、卡波济氏肉瘤。

41.权利要求35的应用，其中所述肿瘤是慢性血癌。