CN106407737A - 以p2y12为靶点的计算药物设计方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明以P2Y12为靶点的计算药物设计方法及其应用属于靶计算机辅助药物设计、小分子药物虚拟筛选、分子对接及全原子分子动力学技术领域，具体以P2Y12为靶点，以Chembridge小分子数据库为搜索数据库的药物虚拟筛选设计方法。本发明还包括靶点蛋白的空间结构分析、结合口袋定义方法以及构效关系分析方法。本发明已在相关蛋白靶点的药物设计方法中进行了多次验证，成功率极高。本发明方法已用于虚拟筛选GPCRs受体家族的抑制剂。

Description

以P2Y12为靶点的计算药物设计方法及其应用

技术领域

本发明属于计算机辅助药物设计领域，计算生物学范畴，特别涉及一种计算机药物筛选方法及分子对接、分子动力学的应用。

技术背景

随着组合化学及高通量筛选的发展，可以在短时间内获得大量的化合物及生物活性数据。是否可以通过随机方式合成及筛选获得大批的先导化合物，而不需要合理方式开展计算机辅助药物分子设计？1999年在美国华盛顿特区的一个关于高通量技术的学术会议上，与会者讨论的一个议题是“How many leads from HTS？”令人惊讶的是，来自各大制药公司的代表一致回答是：none。其只要原因是类药化合物的可能数目可达6210，即使组合化学在短时间内能提供百万个化合物，高通量筛选能每天筛选数万个化合物，但它们仅占类药化合物空间的极小部分，+随机筛选犹如大海捞针，效率是很低的。因此组合化学及高通量筛选技术必须与计算机辅助药物设计相结合才能发挥其应有的作用。盲目扩大库的容量，提高筛选速度不是一条有效地途径。首先通过计算组合化学设计虚拟库虚拟筛选，然后进行小数目化合物的合成，即开展“基于知识的组合化学”是一条可取的有效途径。计算机辅助药物设计已有数十年的历史，近十多年来已取得实则性的进展，已有许多药物的研究取得成功，比如HIV蛋白酶抑制Indinavir的设计(已上市)、HIV蛋白酶环脲类抑制剂的设计(Lam1994)(曾进入一期临床)等。目前，CADD方法已经成为药物设计中的常规方法之一。而且随着CADD方法的不断发展和应用的不断深化，这种成功的实例也不断增加。CADDF方法在药物设计中的应用，大大家快了药物设计和开发的速度。当前药物设计的关键问题是如何命中率和速度。这需要药物设计方法的发展及靶标结构及药物作用机理方面的发展。随着人类基因组计划的完成和相关研究的不断深入，大量与疾病相关的基因被发现，这会促使药物作用的靶标分子急速增加，同时随着对药物作用机理的认识，对化合物源的数目及多样性的要求会逐步降低，命中率会逐步提高。此外，计算机技术的发展日新月异，这将大大加快药物设计的速度。同时在超级计算机的支持下，发展新的适应复杂生物体系理论计算以及药物设计需求的新方法和新技术。

血栓性疾病包括中风、冠心病、肺栓塞等各种疾病，是严重威胁人类的生命健康、致死致残的重要疾病之一。数据统计，血栓性疾病占人类疾病死亡率的51％以上。目前，我国血栓性疾病患者超过1千万，发病率远高于其他疾病，且有逐年递增的趋势。在血栓性疾病的发病过程中，嘌呤能受体P2Y12是刺激血栓形成的重要因子，阻断P2Y12受体能防止血液凝固，因此其阻断剂也是当代医学研究的重点和热点之一。当前，市场上靶向该受体的药物年销售额可达数十亿美元。但是，这些药物都存在一定的副作用或者不足，例如第二代药物对1/3病人无效，而第四代P2Y12受体阻断剂可能导致病人呼吸困难等。

P2Y12是一种位于血小板表面的G蛋白偶联受体(GPCR)，其天然配体二磷酸腺苷(ADP)是人们发现最早也是体内最重要的诱导血小板聚集的物质，该受体在止血块和病理性动脉血栓形成中起到关键的作用。然而，受制于ADP在生物体内的广泛存在等各种客观因素，多年来研究人员对于这一受体的各项研究进展缓慢。而P2Y12受体的三维结构以及受体配体识别方式等信息缺乏了解更进一步严重制约了新的抗血栓药物研发。

目前药品专利的保护期限为20年，如果药物上市前研究与开发(R&D)花费的时间为10年，那么药品的有效市场销售时间就仅有10年。如果R&D时间能缩短2～3年，那么不但能节约R&D的经费，而且能为市场赢得宝贵的时间，这将产生巨大的经济效益和社会效益。因此，CADD方法已被国外许多制药公司用于新药的研究与开发，并且近年来已取得了极大的成功。所以，CADD方法与应用的研究不但具有深远的科学意义，而且具有巨大的应用价值。研究者发现通过CADD可有效减少新药研发过程中33％的费用和30％的时间成本，其中虚拟筛选的介入，使新药研发的平均周期缩短了0.9年，直接研发费用平均降低了1.3亿美元。

发明内容

本发明目的在于自主开发一种以分子对接、虚拟筛选及全原子分子动力学技术为基础的计算机药物设计方法，能够适用于GPCRs家族合理的药物设计。

本发明的首要目的是通过计算机Autodock虚拟筛选方式得到P2Y12的先导药物。该先导化合物有对P2Y12有抑制活性的潜力。

本发明的第二个目的是通过Discovery Studio程序精确地选中靶点P2Y12的绑定口袋。以供分子对接和虚拟筛选使用。

本发明第三个目的是通过分子动力学对筛选出的苗头化合物进行评估。

本发明的第四个目的是通过细胞生物学实验验证虚拟筛选得到的先导化合物的活性。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种以P2Y12为靶点的计算药物设计方法，以分子对接、虚拟筛选及分子动力学技术为基础进行计算机药物设计，其特征包含以下五个步骤：P2Y12晶体结构的获取及能量最小化优化；P2Y12受体与小分子结合口袋的定义；基于P2Y12结构分子对接及小分子数据库的高通量筛选；苗头化合物与受体结构分子对接及分子动力学模拟；先导化合物的生物活性测试。

为实现上述发明目的，本发明还采用如下方案：以P2Y12为靶点的计算药物设计方法在以P2Y12为靶点的先导化合物计算机筛选的应用。

为实现上述发明目的，本发明还采用如下方案：以P2Y12为靶点的计算药物设计方法在无晶体结构GPCR蛋白但与其他GPCR晶体结构同源相似率达75％以上的受体抑制剂筛选的应用。

为实现上述发明目的，本发明还采用如下方案：以P2Y12为靶点的计算药物设计方法在分子对接软件Autodock平台的应用。

为实现上述发明目的，本发明还采用如下方案：以P2Y12为靶点的计算药物设计方法在CDDOCK分子对接程序的应用。

为实现上述发明目的，本发明还采用如下方案：以P2Y12为靶点的计算药物设计方法在NAMD全原子分子动力学模拟平台的应用。

为实现上述发明目的，本发明还采用如下方案：以P2Y12为靶点的计算药物设计方法在Chembridge数据库的应用。

为实现上述发明目的，本发明还采用如下方案：以P2Y12为靶点的计算药物设计方法在Zinc数据库的应用。

为实现上述发明目的，本发明还采用如下方案：以P2Y12为靶点的计算药物设计方法筛选出的小分子化合物在抑制P2Y12活性的应用。

附图说明

图1是P2Y12晶体评估得倒的受体与小分子抑制剂相互作用的重要残基。主要涉及Gln283、Gln282、Glu380。

图2是对分子对接以及进行虚拟筛选时小分子与受体的结合口袋，直接为5埃。

图3是三个有较高细胞抑制活性的小分子与受体P2Y12分子动力学过程中受体重要残基的RMSD值。

图4是三个有较高细胞抑制活性的小分子化学结构式。

图5是个有最高细胞抑制活性的小分子活性曲线。

图6是该计算机药物设计方法的流程图。

具体实施方式

请参阅图1～图6所示，采用Discovery Studio程序，为P2Y12确定绑定口袋。

载入受体PDB结构，使PDB结构以卡通图模式展示。小分子与受体作用的主要残基是N191，N159，Arg93，Cys97残基。

(2)采用Autodock软件对P2Y12抑制剂小分子数据库进行虚拟筛选。将同源建模后的晶体结构用Autodock Tools进行处理，去掉冗余分子，按Autodock Vina运行规则进行分子优化处理，加电荷，并将受体结构转化为pdbqt格式。所有的化合物结构从Chembridge数据库下载，用PyRx处理和转换成pdbqt格式.建立一个处理后的化合物数据库.定义绑定口袋区域，定义口袋半径为5埃。

(3)根据已经确定的活性位点.其它条件设为默认.选择Lamarckian genetical gorithm(LGA)计算方法，用PyRx运行AutodockVina，首轮筛选从大约10万个化合物库(Chembridge数据库)中进行高通量筛选，得到1200个类药小分子化合物的库.再从这1200个小分子化合物中筛选针对P2Y12的抑制剂.通过对建立的化合物数据库进行6轮筛选，筛选出活性最高的3个化合物，分别为3-[7-(2-苯-环丙氨)-5-丙烷磺酰基-[1，2，3]三唑[4，5-d]嘧啶-3-yl]-环戊烷-1，2-二醇、3-(7-环丙氨-[1，2，3]三唑[4，5-嘧啶-3-yl)-环戊烷-1，2-二醇、3-(7-氨基-5-丙基磺酰-[1，2，3]、三唑[4，5]嘧啶-3-yl)-环戊醇分别用化合物1、化合物2、化合物3表示。对这三个化合物做进一步分析。

(4)从网站http://www.ks.uiuc.edu/Research/namd/上获得NAMD软件、从网站http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/上获得VMD软件和从网站http://www.ks.uiuc.edu/Training/CaseStudies/上获得大多数蛋白质分子通用的top_all27_prot_lipid.inp拓扑文件、par_all27_prot_lipid.inp力场文件和运行NAMD的配置文件。而蛋白质分子相对应的psf和pdb文件，我们将用VMD软件中的psfgen来获得。以分子对接获得的配体-受体复合物为起点，在VMD软件中，载入复合物pdb文件，在菜单Extensions下的TK console平台上依次输入一下命令：

package require psfgen

topology top_all27_prot_lipid.inp

pdbalias residue HIS HSE

pdbalias residue HIE HSE

pdbalias atom ILE CD1 CD

segment EMLA{

pdb 4pxz_ptn.pdb

}patch DISU EMLA：187EMLA：195

patch DISU EMLA：281EMLA：285

coordpdb 4pxz_ptn.pdb EMLA

guesscoord

writepsf 4pxz.psf

writepdb 4pxz.pdb

这样就将复合物分离成独立的分子片段结构，并生产相应的psf和pdb文件。接着，在菜单Extensions下的Modeling中的Membrane Builder平台上设置POPC在X和Y方向上都为紧接着我们在Add Solvation Box平台上添加一个90*90*90的水盒子，最后就可以对整个体系用AddIons来添加抗衡负离子Cl，直到体系的静电荷为零。这样就完成了运行NAMD所要求的整个无配体蛋白质体系的4pxz_popc_water_ion.psf和4pxz_popc_water_ion.pdb文件的生成。在VMD软件中，先载入4pxz_popc_water_ion.psf文件，再载入4pxz_popc_water_ion.pdb文件。选定要固定的原子，在菜单Extensions下的TK console平台上用set beta 1命令来生成含有固定位置信息的pdb文件，来作为优化双层质膜的参考文件。在配置文件中，设置每步步长为1fs，温度为300K，最小化3000步并运行1ns。采用与优化双层质膜相同的设置，在约束蛋白的情况下，对质膜、水和离子进行优化。完成之后，在对蛋白放开约束的情况下，进行整个体系的能量最小化和全优化。这样获得的分子的初始态就可以进行分子动力学模拟运行。

(5)小分子抑制剂的细胞实验活性分析。

细胞接种在96孔板上，使用0.25％DMSO或DAPT(浓度为2.9μM-145μM)处理72小时。使用MTT染料减少检测实验，稍微修正，测定细胞毒性。与DAPT温育后，25μLMTT溶液(5mg/mL，溶于PBS)加到含200μL培养基的每孔中，实验板在37℃下温育8小时，随后每孔加入200μLDMSO，在室温下震荡30分钟混合。通过酶联免疫吸附法在490nm处测定吸光值。使用α-MEM及等量的MTT溶液和溶剂，作为空白对照。使用PROBIT程序在SPSS中计算IC50值。化合物1、化合物2、化合物3IC50分别为1.8Nm、9.1nM、17.2nM。

Claims (9)

1.一种以P2Y12为靶点的计算药物设计方法，其特征在于以分子对接、虚拟筛选及分子动力学技术为基础进行计算机药物设计，其特征包含以下五个步骤：

P2Y12晶体结构的获取及能量最小化优化；

P2Y12受体与小分子结合口袋的定义；

基于P2Y12结构分子对接及小分子数据库的高通量筛选；

苗头化合物与受体结构分子对接及分子动力学模拟；

先导化合物的生物活性测试。

2.权利要求1中所述以P2Y12为靶点的计算药物设计方法在以P2Y12为靶点的先导化合物计算机筛选的应用。

3.权利要求1中所述以P2Y12为靶点的计算药物设计方法在无晶体结构GPCR蛋白但与其他GPCR晶体结构同源相似率达75％以上的受体抑制剂筛选的应用。

4.权利要求1所述以P2Y12为靶点的计算药物设计方法在分子对接软件Autodock平台的应用。

5.权利要求1所述以P2Y12为靶点的计算药物设计方法在CDDOCK分子对接程序的应用。

6.权利要求1所述以P2Y12为靶点的计算药物设计方法在NAMD全原子分子动力学模拟平台的应用。

7.权利要求1所述以P2Y12为靶点的计算药物设计方法在Chembridge数据库的应用。

8.权利要求1所述以P2Y12为靶点的计算药物设计方法在Zinc数据库的应用。

9.权利要求1所述以P2Y12为靶点的计算药物设计方法筛选出的小分子化合物在抑制P2Y12活性的应用。