CN107683286A - 与抑制剂复合的plasmepsin V的结构及其用途 - Google Patents

与抑制剂复合的plasmepsin V的结构及其用途 Download PDF

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Abstract

一方面，本发明涉及与抑制剂复合的间日疟原虫(Plasmodium vivax)plasmepsin V的晶体结构，以及使用晶体结构和相关结构信息鉴定、设计和/或筛选抑制剂或重新设计与plasmepsin V相互作用和/或调节plasmepsin V活性的已知抑制剂的方法。另一方面，本发明涉及基于可用于治疗疟疾的抑制剂的一类化合物。

Description

与抑制剂复合的plasmepsin V的结构及其用途
技术领域
本发明一般性涉及与抑制剂复合的plasmepsin V的结构研究。一方面，本发明涉及与抑制剂复合的间日疟原虫(Plasmodium vivax)plasmepsin V的晶体结构，以及使用晶体结构和相关结构信息鉴定、设计和/或筛选抑制剂或重新设计与plasmepsin V相互作用和/或调节plasmepsin V活性的已知抑制剂的方法。另一方面，本发明涉及基于可用于治疗疟疾的抑制剂的一类化合物。
背景
恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和间日疟原虫(P.vivax)是人类中最严重形式的疟疾的原因。这些寄生虫通过被感染的疟蚊(Anopheles mosquito)的叮咬感染人类。然后，寄生虫迁移到肝脏并发育成裂殖子，然后裂殖子被释放并侵入红细胞，在红细胞中，它们通过连续轮的感染发育和扩增。
通过寄生虫输出到宿主细胞的效应蛋白(Marti M.et al.,2004；Hiller N.L.etal.,2004)负责在寄生虫感染的红细胞中诱导的显著的细胞再生过程(综述于BoddeyJ.A.&Cowman A.F.,2013中)。宿主细胞的重塑提供了寄生虫获得营养物质并且保持对宿主保护应答的隐藏而处于相对受保护的生态位中的手段。
Plasmepsin V是由疟原虫属的某些种(Plasmodium spp.)的原生动物寄生虫表达的天冬氨酰蛋白酶，并且已知其在识别和加工效应蛋白以输出到宿主细胞中起关键作用(Boddey J.A.,et al.2010；Russo I.,et al.2010)。该蛋白酶是I型整合膜结合蛋白酶，其活性结构域位于内质网(“ER”)的腔侧(Boddey J.A.,et al.2010；Russo I.,et al.2010；Sleebs B.E.,et al.2014a)。
Plasmepsin V识别并切割在亮氨酸残基的羧基侧上的称为疟原虫输出元件(Plasmodium EXport Element，“PEXEL”)(Marti M.et al.,2004)或液泡运输信号(Vacuolar Transport Signal，“VTS”)(Hiller N.L.et al.,2004)的五聚体序列RxLxE/Q/D(Chang H.H.et al.,2008；Boddey J.A.,et al.2009)。该基序位于超过400种注定用于输出的蛋白质的疏水性ER型信号序列的C末端15-30个氨基酸处(Marti M.et al.,2004；Hiller N.L.et al.,2004；Sargeant T.J.et al.2006)。通过plasmepsin V的加工步骤揭示了乙酰化的输出信号(xE/Q/D)，并将这些蛋白质导向质膜和寄生泡膜(Boddey J.A.,etal.2010；Russo I.,et al.2010；Sleebs B.E.,et al.2014a；Boddey J.A.,et al.2009)，其围绕寄生虫。然后这些蛋白质被疟原虫输出的易位子(Plasmodium Translocon ofEXported proteins，“PTEX”)(将它们转移到寄生虫感染的红血球中的蛋白质机器)识别(Elsworth B.，et al.2014；Beck J.R.et al。2014)。
由于编码该酶的基因不能被破坏，因此通过plasmepsin V切割PEXEL基序对于恶性疟原虫(P.falciparum)感染的红细胞中的蛋白输出是必不可少的(Boddey J.A.,etal.2010；Klemba M&Goldberg D.E.2005)。事实上，在恶性疟原虫中plasmepsin V的显性失活形式的表达已被证明阻断蛋白质向宿主红细胞的输出，这表明其是该运输途径所需的(Russo I.,et al.2010；Sleebs B.E.,et al.2014a)。
另外，含有抑胃酶氨酸(statine)的PEXEL模拟化合物(具有模拟酰胺键蛋白酶解的过渡态的羟基官能团的分子)已显示抑制恶性疟原虫和间日疟原虫plasmepsin V的体外活性，阻断蛋白质输出并被对恶性疟原虫的生长是致命的(Sleebs B.E.,et al.2014a)。这表明，plasmepsin V在蛋白质输出中起着至关重要的作用，并且该过程对于寄生虫存活是必需的，因此验证了plasmepsin V是无性血液阶段中的重要抗疟靶。
目前，没有以apo形式或与底物或抑制剂复合的plasmepsin V的结构信息。因此，没有详细说明底物或抑制剂如何与plasmepsin V的底物结合位点相互作用的结构信息，也没有详细说明plasmepsin V在蛋白酶解后如何输出的功能的结构信息。
因此，需要测定与抑制剂复合的plasmepsin V的结构，以便更好地理解plasmepsin V与底物或抑制剂相互作用的性质，并有助于合理设计或重新设计抑制剂以开发新的抗疟药。
发明概述
本发明部分基于与抑制剂WEHI-842复合的plasmepsin V的晶体结构的测定，其允许首次可视化plasmepsin V的结构以及详细描述plasmepsin V的底物结合位点及其与WEHI-842的相互作用的结构信息。该结构还首次鉴定了在标准的天冬氨酰蛋白酶中不存在的两个特征，即由包括4个半胱氨酸残基的17个氨基酸组成的二硫键结合的表面环，和螺旋-转角-螺旋基序。附录I介绍了该结构的原子坐标。
如上所述，晶体结构通过WEHI-842的结合揭示了关于plasmepsin V的底物结合位点的非常需要的结构信息。晶体结构揭示了标准的天冬氨酰蛋白酶折叠，包括在底物结合位点周围包含月牙形和主要为β-片层核心的酶结构域。酶结构域包括沿着含有活性位点天冬氨酸(Asp80和Asp313)的底物结合位点的底部相互接触的N末端和C末端亚结构域。将plasmepsin V多肽的氨基和羧基末端组装成特征性的六链结构域间β-片层，其用于将N末端和C末端亚结构域锚定在一起。N末端亚结构域进一步包括独特的β-发夹环结构，称为“瓣(flap)”，其垂直于底物结合位点并与结合的WEHI-842相互作用。
本发明还基于抑制剂WEHI-842的开发。WEHI-842由其前体WEHI-916开发，其使用抑胃酶氨酸模拟PEXEL底物的酰胺键蛋白酶解的过渡态(Sleebs B.E.,et al.2014a)。尽管WEHI-916在体外是plasmepsin V蛋白酶活性的良好抑制剂，但其在阻断恶性疟原虫生长方面并不是特别有效(EC50 5μM)，并且本发明人假设这是由于过渡态模拟物的P3Arg上高度极化的胍基团损害穿过膜的渗透性。
相比之下，WEHI-842具有替换了WEHI-916中的P3Arg的非蛋白氨基酸刀豆氨酸和还替换了WEHI-916中所见的磺酰胺的N末端氨基甲酸酯。已观察到WEHI-842是比WEHI-916更有效的plasmepsin V和恶性疟原虫生长的抑制剂。根据以前的研究，已知磺酰胺与氨基甲酸酯的交换对于plasmepsin V或寄生虫活性的结合亲和力没有影响(Gazdik M.etal.2015)，因此WEH-842看到的活性的改善归因于用刀豆氨酸替换P3Arg。
鉴于上述情况，本发明的一个方面提供了具有附录I所述原子坐标的plasmepsinV/WEHI-842结晶复合物。通常，包含plasmepsin V和WEHI-842的结晶复合物或其衍生物或其组分基本上是纯天然形式。
本发明的另一方面涉及定义plasmepsin V和WEHI-842之间相互作用的原子坐标数据集。在一个实施方案中，原子坐标数据集定义plasmepsin V的底物结合位点与WEHI-842之间的相互作用。在另一个实施方案中，原子坐标数据集定义了plasmepsin V的瓣和WEHI-842之间的相互作用。
本发明的另一个方面涉及WEHI-842的底物结合位点表面的构象模拟物。模拟物可能直接干扰或与plasmepsin V的底物结合位点和/或plasmepsin V的瓣直接相互作用，或者可能在其他地方相互作用引起对底物结合位点和/或瓣的构象改变。
在一个实施方案中，提出底物结合位点和/或瓣抑制剂，以例如阻断或至少减少plasmepsin V对效应蛋白的PEXEL基序的切割来抑制或至少降低恶性疟原虫和间日疟原虫plasmepsin V的活性，以阻断或至少减少蛋白质输出，并任选对恶性疟原虫和/或间日疟原虫生长是致死的。
在另一个实施方案中，提出了例如治疗疟疾的底物结合位点和/或瓣抑制剂。
因此，在一种形式中，本发明在于结晶形式的plasmepsin V/WEHI-842复合物或其衍生物、同源物、组分和/或可溶形式。
在一个实施方案中，复合物包含与WEHI-842复合的plasmepsin V多肽链的至少一部分。
在优选的实施方案中，复合物包括与WEHI-842复合的plasmepsin V多肽链的酶结构域。
在另一个优选的实施方案中，复合物包括plasmepsin V多肽链的酶结构域的N末端亚结构域的至少一部分和plasmepsin V多肽链的酶结构域的C末端亚结构域的至少一部分，其中N末端亚结构域的至少一部分和C末端亚结构域的至少一部分一起限定了与WEHI-842复合的plasmepsin V多肽链的底物结合位点。
在更优选的实施方案中，N末端亚结构域包含二硫键结合的表面环的至少一部分。
在另一个更优选的实施方案中，N末端亚结构域包含β-发夹结构(称为“瓣”)的至少一部分。
在又一个更优选的实施方案中，C末端亚结构域包含螺旋-转角-螺旋基序的至少一部分。
在进一步优选的实施方案中，复合物包含与WEHI-842的至少一部分复合的plasmepsin V的底物结合位点的至少一部分，优选地复合物还包含瓣的至少一部分。
在又一个优选的实施方案中，复合物包含包括S1，S2和S3结合口袋的plasmepsinV的底物结合位点的至少一部分，其中：S1结合口袋包括氨基酸Ile78，Tyr139，Phe180和Val188；S2结合口袋包括氨基酸Gly315；S3结合口袋包括氨基酸Glu141和Gln183。
在最优选的实施方案中，复合物包括由附录I中所示的原子坐标或其子集所定义的结构的组分。
在另一种形式中，本发明提供了鉴定、设计和/或筛选能够潜在地与plasmepsinV，优选plasmepsin V的底物结合位点和/或瓣相互作用的化合物的方法，包括基于化合物与由附录I的原子坐标或其子集定义的plasmepsin V结构的相互作用来进行基于化合物的鉴定、设计和/或筛选。
在另一种形式中，本发明提供了鉴定、设计和/或筛选能够潜在地模拟与plasmepsin V相互作用的WEHI-842的化合物的方法，包括：基于(i)化合物与plasmepsin V结构的相互作用和/或(ii)化合物与由附录I的原子坐标或其子集定义的plasmepsin V结构复合的WEHI-842结构的相似性，进行化合物的基于结构的鉴定、设计和/或筛选。
在一个实施方案中，方法包括鉴定、设计和/或筛选与plasmepsin V的底物结合位点和/或瓣的三维结构相互作用的化合物，所述结构由附录I的原子坐标定义，其中化合物与结构的相互作用在能量上是有利的。
在另一个实施方案中，方法包括基于与plasmepsin V的底物结合位点和/或瓣的组分复合的WEHI-842的三维结构来鉴定、设计和/或筛选化合物，所述结构由附录I中所示的原子坐标或其子集所定义，其中所述化合物与所述结构的相互作用在能量上是有利的。
在另一种形式中，本发明提供了鉴定抑制剂化合物的方法，抑制剂化合物包含选自抗体、抗原结合片段、肽、非肽分子和化学化合物的实体，其中所述抑制剂化合物能够阻断由于与plasmepsin V的相互作用而产生的生物活性，其中所述方法包括：
基于对应于附录I的原子坐标或其子集的与WEHI-842复合的plasmepsin V的构象，引入限定相互作用表面的合适的计算机程序参数，其中所述程序显示相互作用表面的三维模型；
在所述计算机程序中创建测试化合物的三维结构；
在相互作用表面的三维模型上显示所述测试化合物的叠加模型；
评估所述测试化合物的所述叠加模型是否在空间上和任选地能量上适合结合位点；
任选地，合成所述测试化合物；
任选地，将所述测试化合物并入在生物活性测定中；和
任选地，确定所述测试化合物是否抑制plasmepsin V的生物活性。
在一个实施方案中，方法包括鉴定能够与如附录I中所示的原子坐标所定义的plasmepsin V的底物结合位点和/或瓣的至少一部分、优选整个底物结合位点和瓣相互作用的抑制剂化合物。
在进一步的实施方案中，如附录I中所示的原子坐标或其子集定义了与plasmepsin V复合的WEHI-842的一个或多个区域。
在优选的实施方案中，如附录I中所示的原子坐标或其子集定义了与plasmepsinV多肽链的底物结合位点的至少一部分和plasmepsin V多肽链的N末端亚结构域的瓣的至少一部分复合的WEHI-842。
在另一个优选的实施方案中，如附录I中所示的原子坐标或其子集定义了plasmepsin V的底物结合位点和plasmepsin V的N末端亚结构域的瓣的分子表面的部分，其与WEHI-842的分子表面的至少一部分相互作用。
在另一个实施方案中，原子坐标或其子集定义选自与WEHI-842复合的间日疟原虫plasmepsin V的44至240和273至470的一个或多个氨基酸。
在另一个优选的实施方案中，选自plasmepsin V的44至240和273至470的一个或多个氨基酸包括选自Tyr59，Ala60，Ile78，Asp80，Gly82，Tyr139，Cys140，Glu141，Phe180，Gln183，Val188，Asp313，Gly315和Thr317的一个或多个氨基酸。
在另一个优选的实施方案中，如附录I中所示的原子坐标或其子集定义了包含S1，S2和S3结合口袋的plasmepsin V的底物结合位点的至少一部分，其中：S1结合口袋包括氨基酸Ile78，Tyr139，Phe180和Val188；S2结合口袋包含残基Gly315；S3结合口袋包括氨基酸Glu141和Gln183。
在另一种形式中，本发明包括如附录I所示的原子坐标或其子集在鉴定、设计和/或筛选化合物中的用途，该原子坐标或其子集至少代表：
(i)WEHI-842；和/或
(ii)与plasmepsin V的一个或多个区域复合的WEHI-842的一个或多个区域，
该化合物能够潜在地模拟与plasmepsin V相互作用的WEHI-842，该用途包括：基于(a)化合物与plasmepsin V结构的相互作用和/或(b)化合物与由该原子坐标或其子集定义的plasmepsin V结构复合的WEHI-842结构的相似性，进行化合物的基于结构的鉴定、设计和/或筛选。
在另一种形式中，本发明包括如附录I所示的原子坐标或其子集在鉴定、设计和/或筛选化合物中的用途，该原子坐标或其子集至少代表：
(i)plasmepsin V的酶结构域；
(ii)plasmepsin V的N末端亚结构域；
(iii)plasmepsin V的C末端亚结构域；
(iv)plasmepsin V的底物结合位点；
(v)plasmepsin V的N末端亚结构域的瓣；
(vi)与WEHI-842复合的瓣的一个或多个区域；和/或
(vii)与WEHI-842复合的底物结合位点的一个或多个区域，
该化合物能够潜在地与plasmepsin V相互作用，该用途包括基于化合物与由原子坐标或其子集定义的plasmepsin V结构的相互作用进行化合物的基于结构的鉴定、设计和/或筛选。
在另一种形式中，本发明包括如附录I中所示的原子坐标集合或其子集，其至少代表：
(i)plasmepsin V的酶结构域；
(ii)plasmepsin V的N末端亚结构域；
(iii)plasmepsin V的C末端亚结构域；
(iv)plasmepsin V的底物结合位点；
(v)plasmepsin V的N端亚结构域的瓣；
(vi)与WEHI-842复合的瓣的一个或多个区域；
(vii)与WEHI-842复合的底物结合位点的一个或多个区域；和/或
(viii)与plasmepsin V复合的WEHI-842的一个或多个区域。
在另一种形式中，本发明包括含有选自plasmepsin V的44至240和273至470的一个或多个氨基酸的位点的抑制剂，包括选自Tyr59，Ala60，Ile78，Asp80，Gly82，Tyr139，Cys140，Glu141，Phe180，Gln183，Val188，Asp313，Gly315和Thr317的一个或多个氨基酸。在一个实施方案中，所述位点包含形成包括S1，S2和S3结合口袋的plasmepsin V的底物结合位点的至少一部分的一个或多个氨基酸，其中：S1结合口袋包括氨基酸Ile78，Tyr139，Phe180和Val188；S2结合口袋包括氨基酸Gly315；S3结合口袋包括氨基酸Glu141和Gln183。在一个实施方案中，位点的抑制剂可以是分离的，合成的，纯化的，重组的和/或非天然存在的抑制剂。
本发明已经使得能够鉴定WEHI-842与plasmepsin V的底物结合位点和/或瓣之间的分子表面相互作用。具体而言，本发明已经使得能够确定参与WEHI-842与底物结合位点和/或瓣的结合的关键氨基酸。对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些发现能够被转换到相关的天冬氨酰蛋白酶上，包括疟原虫属的某些种(包括恶性疟原虫)的同源plasmepsin V。
因此，本发明还可用于鉴定和/或设计候选化合物，其与相关天冬氨酰蛋白酶的底物结合位点结合和/或与相关天冬氨酰蛋白酶的瓣相互作用，所述相关天冬氨酰蛋白酶包括疟原虫属的某些种(包括恶性疟原虫)的同源plasmepsin V。
在一个实施方案中，用于与plasmepsin V或相关天冬氨酰蛋白酶相互作用的候选化合物可以作为使用附录I中定义的原子坐标或其子集的基于结构的评估的结果而被化学修饰。
使用本发明的方法或过程鉴定或设计的候选化合物和化合物可以是任何合适的化合物，包括天然存在的化合物，从头(de novo)设计的化合物，文库产生的化合物(化学或重组产生的)，模拟物等，并且可以包括有机化合物，新化学实体，抗体，不同于基于抗体的分子(非免疫球蛋白的蛋白)的结合蛋白，包括例如蛋白支架，设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin,Stumpp et al.,2007)和蛋白A结构域(在Binz et al,2005中综述)，avimer(Silverman et al.,2005)和其他新生物实体如核酸适体(在Ulrich，2006中综述)。
本发明还可用于改善针对plasmepsin V和/或相关天冬氨酰蛋白酶的底物结合位点的配体的性质。例如，可以根据附录I的原子坐标或其子集所定义的plasmepsin V的底物结合位点和/或瓣或其区域的3D结构对现有配体进行筛选，并评估与plasmepsin V的底物结合位点和/或瓣进行能量上相互作用的潜力。
类似地，能够针对如由附录I的原子坐标或其子集定义的结合plasmepsin V的WEHI-842的底物结合表面和/或与瓣相互作用的表面的3D结构来筛选现有的底物结合配体，并评估与plasmepsin V的底物结合位点和/或瓣进行能量上相互作用的潜力。
因此，本发明还提供重新设计化合物的方法，已知化合物与plasmepsin V结合，该方法包括基于化合物与由附录I的原子坐标或其子集定义的plasmepsin V结构的相互作用进行化合物的基于结构的评估，和作为评估的结果，重新设计或化学修饰化合物。
在另一种形式中，本发明提供了重新设计化合物的方法，已知化合物与plasmepsin V结合，该方法包括基于结构评估化合物与由附录I的原子坐标或其子集定义的与plasmepsin V复合的WEHI-842结构的相似性，和作为评估的结果，重新设计或化学修饰化合物。
在一个实施方案中，已知与plasmepsin V结合的化合物被重新设计或化学修饰以(i)改善与plasmepsin V结合的亲和力，和/或(ii)任选地降低与其他天冬氨酰蛋白酶，例如，plasmepsin I-IV结合的亲和力。
在另一个实施方案中，方法可以进一步包括一旦重新设计或化学修饰则合成化合物，并且任选地一旦重新设计或化学修饰，则将所述化合物并入在生物活性测定中，优选以确定所述化合物是否抑制plasmepsinV的生物活性。
本发明还提供了用于鉴定能够潜在地与plasmepsin V相互作用的一种或多种化合物的计算机系统，该系统含有代表以下结构的数据：(i)plasmepsin V的底物结合位点，结构由附录I中所示的原子坐标子集定义；(ii)plasmepsin V的瓣，结构由附录I中所示的原子坐标子集定义；(iii)WEHI-842上的底物结合位点表面，结构由附录I中所示的原子坐标子集定义；(iv)WEHI-842上的瓣相互作用表面，结构由附录I中所示的原子坐标子集定义；和/或(v)其组合，结构由附录I中所示的原子坐标或其子集定义。
另一方面，本发明提供了计算机可读介质，其上记录有附录I中所示的代表模型和/或原子坐标或其原子坐标的子集的数据，该模型和/或原子坐标至少代表：
(i)plasmepsin V的酶结构域；
(ii)plasmepsin V的N末端亚结构域；
(iii)plasmepsin V的C末端亚结构域；
(iv)plasmepsin V的底物结合位点；
(v)plasmepsin V的N端亚结构域的瓣；
(vi)与WEHI-842复合的瓣的一个或多个区域；
(vii)与WEHI-842复合的底物结合位点的一个或多个区域；
(viii)与plasmepsin V复合的WEHI-842的一个或多个区域；
(ix)与底物结合位点复合的WEHI-842的一个或多个区域；和/或
(x)与瓣复合的WEHI-842的一个或多个区域。
还提供了附录I中所示的原子坐标集合或其子集，其至少表示：
(i)plasmepsin V的酶结构域；
(ii)plasmepsin V的N末端亚结构域；
(iii)plasmepsin V的C末端亚结构域；
(iv)plasmepsin V的底物结合位点；
(v)plasmepsin V的N端亚结构域的瓣；
(vi)与WEHI-842复合的瓣的一个或多个区域；
(vii)与WEHI-842复合的底物结合位点的一个或多个区域；
(viii)与plasmepsin V复合的WEHI-842的一个或多个区域；
(ix)与底物结合位点复合的WEHI-842的一个或多个区域；和/或
(x)与瓣复合的WEHI-842的一个或多个区域。
可以使用plasmepsin V和/或plasmepsin V的底物结合位点和/或plasmepsin V的瓣和/或与plasmepsin V复合的WEHI-842的一个或多个区域和/或与plasmepsin V的底物结合位点复合的WEHI-842的一个或多个区域和/或与plasmepsin V的瓣复合的WEHI-842的一个或多个区域的三维结构来开发可用于药物设计和/或计算机模拟(in silico)筛选与plasmepsin V相互作用和/或调节plasmepsin V的候选化合物的模型。其他物理化学特征如键合、静电等也可用于开发该模型。
通常，术语“计算机模拟(in silico)”是指在计算机存储器中即在硅或其他类似芯片上的创建。否则表示“计算机模拟(in silico)”意味着“虚拟”。当在本文中使用时，术语“计算机模拟(in silico)”是指基于使用计算机模型而不是体外或体内实验的筛选方法。
因此，本发明还提供了鉴定潜在地与plasmepsin V相互作用的化合物的计算机辅助方法，所述方法包括将候选化合物的结构与以下结构进行拟合：(i)plasmepsin V的底物结合位点，其结构由附录I中所示的原子坐标子集定义；和/或(ii)plasmepsin V的部分，优选包括瓣，其结构由附录I中所示的原子坐标子集定义。
本发明还提供了使用包含处理器的编程计算机来鉴定能够与plasmepsin V相互作用的分子的计算机辅助方法，所述方法包括以下步骤：(a)使用计算机方法产生结构的原子坐标集合，该结构具有与以下结构的原子坐标的能量上有利的相互作用：(i)plasmepsinV的底物结合位点，该结构由附录I中所示的原子坐标子集定义；和/或(ii)plasmepsin V的至少部分，优选包括瓣，该结构由附录I中所示的原子坐标的子集定义，所述坐标被输入到计算机中，由此生成标准数据集；(b)使用处理器将标准数据集与化学结构的计算机数据库进行比较；(c)使用计算机方法从数据库中选择与标准数据集的区域互补或类似的化学结构；和(d)任选地，将与标准数据集的区域互补或类似的所选化学结构输出至输出设备。
本发明还提供了使用包括处理器的编程计算机来鉴定WEHI-842的潜在模拟物的计算机辅助方法，所述方法包括以下步骤：(a)从以下的原子坐标集合生成标准数据集：(i)plasmepsin V的底物结合位点，结构由附录I中所示的原子坐标子集定义；(ii)plasmepsinV的至少一部分，优选包括瓣，结构由附录I所示的原子坐标子集定义；和/或WEHI-842，该结构由附录I中所示的原子坐标的子集定义，所述坐标被输入到计算机中；(b)(i)使用处理器将标准数据集与存储在计算机数据存储系统中的化学结构的计算机数据库进行比较，并且使用计算机方法从数据库中选择具有与标准数据集结构相似的区域的化学结构；或者(ii)使用计算机方法构建具有与标准数据集结构相似的区域的化学结构的模型；和(c)任选地，将以下内容输出至输出设备：(i)来自步骤(b)(i)的具有与标准数据集相似的区域的所选化学结构；或者(ii)步骤(b)(ii)中构建的模型。
本发明进一步提供评估化合物与plasmepsin V相互作用的能力的方法，该方法包括以下步骤：(a)采用计算手段来执行：(i)化合物与plasmepsin V上的WEHI-842的底物结合位点的计算机模型的结合表面之间的拟合操作；和/或(ii)化合物与WEHI-842、plasmepsin V上的WEHI-842的底物结合位点或其部分之间的重叠操作，其使用原子坐标，其中该原子坐标与至少代表plasmepsin V的底物结合位点或其部分，瓣或其部分，plasmepsin V或WEHI-842的附录I的原子坐标的子集或其一个或多个的原子坐标的子集之间的均方根偏差不超过；和(b)分析拟合操作和/或叠加操作的结果以定量化合物与结合表面模型之间的缔合。
本发明还提供了使用分子置换来获得关于未知结构的分子或分子复合物的结构信息的方法，所述方法包括以下步骤：(i)生结晶的分子或分子复合物的X射线衍射图案；和(ii)将至少代表plasmepsin V、plasmepsin V的底物结合位点、plasmepsin V的瓣、WEHI-842、其模拟物、其衍生物或其部分的附录I的原子坐标或其原子坐标的子集应用于X射线衍射图案，生成结构未知的分子或分子复合物的至少一个区域的三维电子密度图谱。
本发明还包括结合使用本发明的方法或过程设计、重新设计和/或修饰的结合plasmepsin V的化合物。优选地，此类化合物对plasmepsin V具有小于10-7M的亲和力(KD)。优选地，化合物结合plasmepsin V的底物结合位点。更优选地，化合物结合至plasmepsin V的底物结合位点和瓣。
另一方面，本发明涉及式I的化合物或其药学上可接受的盐：
式I
其中：
E是O或S；
R1是-Z-C(R9)-R10,-Z-C(R9)-C(O)-R10；-Z-C(R9)-C(O)-N(R11)-R10；
Z是键，O,S或N(R12)；
R2是-C(R7)2-C(R7)2-,-CR7＝CR7-或
R3选自氢，-C1-7烷基,-C1-7卤代烷基,-C2-7烯基,-C2-7炔基,-C0-7烷基OH,-C0-7烷基CO2H,-C0-7烷基CONH2,-C0-7烷基NH2,-C0-7烷基SH,-C0-4烷基SC1-4烷基,-C0-6烷基NHC(＝NH)NH2,-C0-6烷基芳基,-C0-6烷基环烷基,-C0-6烷基杂环基,和–C0-6烷基杂芳基；其中烷基,烯基或炔基任选地被卤基,羟基,羧基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2和–NH烷基中的一种或多种取代；并且其中芳基,环烷基,杂环基或杂芳基任选地被卤基,羟基,羧基,烷基,烯基,炔基,卤代烷基,羟基烷基,烷氧基,卤代烷氧基,-CO-烷基,-烷基-CO-烷基,-CO-O-烷基,-烷基-CO-O-烷基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2,–NH烷基,-烷基-CONH2,-烷基-CON(烷基)2,-烷基-CONH烷基,-烷基-NH2,-烷基-N(烷基)2和–烷基-NH烷基中的一种或多种取代；
R4是任选地被卤基,羟基或取代的支化的烷基；
n是0-7的整数；
R5是氢，烷基或卤代烷基；
R6是-C(R14)-R15,-C(R14)-C(O)-R15；-C(R14)-C(O)-N(R16)-R15；
R7各自独立地为氢，卤素或羟基；
R8各自独立地为氢，卤素或羟基；
R9选自氢，-C1-7烷基,-C1-7卤代烷基,-C2-7烯基,-C2-7炔基,-C0-7烷基OH,-C0-7烷基CO2H,-C0-7烷基CONH2,-C0-7烷基NH2,-C0-7烷基SH,-C0-4烷基SC1-4烷基,-C0-6烷基NHC(＝NH)NH2,-C0-6烷基芳基,-C0-6烷基环烷基,-C0-6烷基杂环基,和–C0-6烷基杂芳基；其中烷基,烯基或炔基任选地被卤基,羟基,羧基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2和–NH烷基中的一种或多种取代；并且其中芳基,环烷基,杂环基或杂芳基任选地被卤基,羟基,羧基,烷基,烯基,炔基,卤代烷基,羟基烷基,烷氧基,卤代烷氧基,-CO-烷基,-烷基-CO-烷基,-CO-O-烷基,-烷基-CO-O-烷基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2,–NH烷基,-烷基-CONH2,-烷基-CON(烷基)2,-烷基-CONH烷基,-烷基-NH2,-烷基-N(烷基)2和–烷基-NH烷基中的一种或多种取代；
R10选自氢，-R13,-烷基-R13,-烯基-R13和炔基-R13；其中烷基，烯基或炔基任选地被卤基,羟基,羧基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2和–NH烷基中的一种或多种取代；
R11是氢，烷基或卤代烷基；
R12是氢，烷基或卤代烷基；
R13是氢，芳基，环烷基，杂环基或杂芳基；其中芳基，环烷基，杂环基或杂芳基任选地被一个或多个R18取代；
R14选自氢，-C1-7烷基,-C1-7卤代烷基,-C2-7烯基,-C2-7炔基,-C0-7烷基OH,-C0-7烷基CO2H,-C0-7烷基CONH2,-C0-7烷基NH2,-C0-7烷基SH,-C0-4烷基SC1-4烷基,-C0-6烷基NHC(＝NH)NH2,-C0-6烷基芳基,-C0-6烷基环烷基,-C0-6烷基杂环基,和–C0-6烷基杂芳基；其中烷基,烯基或炔基任选地被卤基,羟基,羧基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2和–NH烷基中的一种或多种取代；并且其中芳基,环烷基,杂环基或杂芳基任选地被卤基,羟基,羧基,烷基,烯基,炔基,卤代烷基,羟基烷基,烷氧基,卤代烷氧基,-CO-烷基,-烷基-CO-烷基,-CO-O-烷基,-烷基-CO-O-烷基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2,–NH烷基,-烷基-CONH2,-烷基-CON(烷基)2,-烷基-CONH烷基,-烷基-NH2,-烷基-N(烷基)2和–烷基-NH烷基中的一种或多种取代；
R15选自氢，-R17,-烷基-R17,-烯基-R17和炔基-R17；其中烷基,烯基或炔基任选地被卤基,羟基,羧基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2和–NH烷基中的一种或多种取代；
R16是氢，烷基或卤代烷基；
R17是氢，芳基，环烷基，杂环基或杂芳基；其中芳基，环烷基，杂环基或杂芳基任选地被一个或多个R19取代；
R18选自卤基,羟基,羧基,烷基,烯基,炔基,卤代烷基,羟基烷基,烷氧基,卤代烷氧基,-CO-烷基,-烷基-CO-烷基,-CO-O-烷基,-烷基-CO-O-烷基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2,–NH烷基,-烷基-CONH2,-烷基-CON(烷基)2,-烷基-CONH烷基,-烷基-NH2,-烷基-N(烷基)2和–烷基-NH烷基；和
R19选自卤基,羟基,羧基,烷基,烯基,炔基,卤代烷基,羟基烷基,烷氧基,卤代烷氧基,-CO-烷基,-烷基-CO-烷基,-CO-O-烷基,-烷基-CO-O-烷基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2,–NH烷基,-烷基-CONH2,-烷基-CON(烷基)2,-烷基-CONH烷基,-烷基-NH2,-烷基-N(烷基)2和–烷基-NH烷基。
在式(I)的化合物的一些实施方案中，应用以下的一种或多种：
E是O；
R1是-Z-C(R9)-R10；
Z是O；
R2是-C(R7)2-C(R7)2-；特别是-CH2-CH2-；
R3是-C1-7烷基或-C1-7卤代烷基；特别是-CH-(C1-3烷基)2或-CH-(C1-3卤代烷基)2；最特别是–CH(CH3)2；
R4是任选地被卤基或羟基取代的支化的烷基；特别是–CR8-[(C(R8)2)m-C(R8)3]2，其中m各自独立地是0-6的整数(特别是0、1、2、3或4；最特别是0)；更特别是CH-(CH3)2；
n是0、1、2、3或4；特别是0、1或2；最特别是0；
R5是氢或烷基；特别是氢；
R6是-C(R14)-R15；
R7是氢或卤素；特别是卤素，氟或氯；更特别是氢或氟；最特别是氢；
R8是氢或卤素；特别是卤素，氟或氯；更特别是氢或氟；最特别是氢；
R9选自氢，-C1-7烷基,-C1-7卤代烷基,-C2-7烯基,-C2-7炔基,-C0-7烷基OH,-C0-7烷基芳基,-C0-6烷基环烷基,-C0-6烷基杂环基,和–C0-6烷基杂芳基；特别是选自氢，-C1-7烷基和-C1-7卤代烷基；更特别是氢；其中烷基,烯基或炔基任选地被卤基,羟基,羧基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2和–NH烷基中的一种或多种取代；并且其中芳基,环烷基,杂环基或杂芳基任选地被卤基,羟基,羧基,烷基,烯基,炔基,卤代烷基,羟基烷基,烷氧基,卤代烷氧基,-CO-烷基,-烷基-CO-烷基,-CO-O-烷基,-烷基-CO-O-烷基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2,–NH烷基,-烷基-CONH2,-烷基-CON(烷基)2,-烷基-CONH烷基,-烷基-NH2,-烷基-N(烷基)2和–烷基-NH烷基中的一种或多种取代；
R10选自-R13,-烷基-R13,-烯基-R13和炔基-R13；特别是R13；其中烷基，烯基或炔基任选地被卤基,羟基,羧基,-CONH2,-CON(烷基)2(特别是–CON(C1-6烷基)2),-CONH烷基(特别是–CONHC1-6烷基),-NH2,-N(烷基)2(特别是–N(C1-6烷基)2)和–NH烷基(特别是–NHC1-6烷基)中的一种或多种取代；
R11是氢；
R12是氢；
R13是芳基(特别是C6-10芳基)，环烷基(特别是C3-10环烷基)，杂环基(特别是C3-10杂环基)或杂芳基(特别是C6-10杂芳基)，更特别是芳基(特别是C6-10芳基)；最特别是苯基；其中芳基，环烷基，杂环基或杂芳基任选地被一个或多个R18取代；
R14选自氢，-C1-7烷基,-C1-7卤代烷基,-C2-7烯基,-C2-7炔基,-C0-7烷基OH,-C0-6烷基芳基,-C0-6烷基环烷基,-C0-6烷基杂环基,和–C0-6烷基杂芳基；特别是选自氢，-C1-7烷基和-C1-7卤代烷基；更特别是氢；其中烷基,烯基或炔基任选地被卤基,羟基,羧基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2和–NH烷基中的一种或多种取代；并且其中芳基,环烷基,杂环基或杂芳基任选地被卤基,羟基,羧基,烷基,烯基,炔基,卤代烷基,羟基烷基,烷氧基,卤代烷氧基,-CO-烷基,-烷基-CO-烷基,-CO-O-烷基,-烷基-CO-O-烷基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2,–NH烷基,-烷基-CONH2,-烷基-CON(烷基)2,-烷基-CONH烷基,-烷基-NH2,-烷基-N(烷基)2和–烷基-NH烷基中的一种或多种取代；
R15选自-R17,-烷基-R17,-烯基-R17和炔基-R17；其中烷基,烯基或炔基任选地被卤基,羟基,羧基,-CONH2,-CON(烷基)2(特别是–CON(C1-6烷基)2),-CONH烷基(特别是–CONHC1-6烷基),-NH2,-N(烷基)2(特别是–N(C1-6烷基)2)和–NH烷基(特别是–NHC1-6烷基)中的一种或多种取代；R15特别是-烷基-R17，其中烷基被任选地取代；更特别是–C1-6烷基-R17，其中烷基被任选地取代；最特别是–C1-6烷基-R17或–C1烷基-R17；
R16是氢；和
R17是芳基(特别是C6-10芳基)，环烷基(特别是C3-10环烷基)，杂环基(特别是C3-10杂环基)或杂芳基(特别是C6-10杂芳基)；更特别是芳基(特别是C6-10芳基)；最特别是苯基。
在一个实施方案中，式I的化合物是式II的化合物或其药学上可接受的盐：
式II
其中R13,R9,Z,R3,R14和R15如上所定义。
在另一个实施方案中，式(I)的化合物是以下化合物或其药学上可接受的盐：
如本文所用，术语“烷基”是指直链或支链饱和烃基。烷基可以具有特定数目的碳原子，例如，C1-7烷基是指具有直链或支链排列的具有1、2、3、4、5、6或7个碳原子的烷基。除非另外定义，否则术语“烷基”可以是C1-12烷基或C1-6烷基。合适的烷基的实例可以包括但不限于甲基，乙基，丙基(正丙基和异丙基)，丁基(正丁基，异丁基和叔丁基)，正戊基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，4-甲基丁基，2-乙基丙基，正己基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，4-甲基戊基，2-乙基丁基，3-乙基丁基，庚基，辛基，壬基，癸基，十一烷基和十二烷基。
如本文所用，诸如“卤代烷基”，“烷基OH”，“烷基CO2H”，“烷基NH2”等基团是指卤基，OH，CO2H和NH2基团可位于烷基链的任何合适碳上。在一个实施方案中，对于“烷基OH”，OH基团位于烷基的末端或非末端碳上。
如本文所用，术语“烯基”是指在两个碳原子之间具有一个或多个双键的直链或支链烃基。烯基可以具有特定数目的碳原子，例如C2-7烯基是指具有2、3、4、5、6或7个碳原子的直链或支链排列的烯基。除非另外定义，否则术语“烯基”可以是C2-12烯基或C2-6烯基。示例性烯基可以包括但不限于乙烯基，丙烯基，异丙烯基，丁烯基，丁二烯基，戊烯基，戊二烯基，己烯基，己二烯基，庚烯基，辛烯基，壬烯基，癸烯基，十一烯基和十二烯基，但不限于此。
如本文所用，术语“炔基”是指在两个碳原子之间具有一个或多个三键的直链或支链烃基。炔基可以具有特定数目的碳原子，例如C2-7炔基是指具有2、3、4、5、6或7个碳原子的直链或支链排列的炔基。除非另外定义，否则术语“炔基”可以是C2-12炔基或C2-6炔基。示例性炔基可以包括但不限于乙炔基，丙炔基，丁炔基，戊炔基，己炔基，庚炔基，辛炔基，壬炔基，癸炔基，十一炔基和十二炔基。
如本文所用，术语“烷氧基”是指基团-O-烷基。类似地，“卤代烷氧基”是指基团-O-烷基，其中烷基中的一个或多个氢原子被卤素原子取代。“卤代烷基”包括其中全部氢原子被卤素原子取代的全卤代烷基。
如本文所用，术语“卤基”是指卤素原子。示例性的卤基包括氟(氟)，氯(氯)，溴(溴)和碘(碘)。特别是氟或氯；最特别是氟。
如本文所用，术语“芳基”是指在每个环中具有至多7个原子的任何稳定的单环，双环或三环(或环体系)，其中至少一个环是芳族的。当存在多于一个的环时，环可以彼此稠合。芳基在环系中可以具有特定数目的碳原子。为了避免疑义，术语“芳基”不包括具有杂芳基环的基团。例如，C6-10芳基是指在环体系中具有6、7、8、9或10个碳原子的芳基(并且包括苯基和萘基)。示例性的芳基包括但不限于苯基，萘基，四氢萘基，茚满基，联苯基和联萘基。
如本文所用，术语“杂芳基”表示每个环中具有至多7个原子的稳定的单环，双环或三环，其中至少一个环是芳族的并且至少一个环含有1至4个选自O，N和S的杂原子。如果存在多于一个的环，则环可以是稠合的。杂芳基还可以包括至少一个附接到环体系中的不饱和碳上的羰基。杂芳基可以在环系统中包括特定数目的碳原子。例如，C6-10杂芳基是指环体系中具有6、7、8、9或10个碳原子的杂芳基，其中环体系可以包含其它杂原子如O，S或N。示例性的杂芳基可以包括吡咯基，呋喃基，噻吩基，吡唑基，咪唑基，三唑基，异唑基，唑基，噻唑基，异噻唑基，二唑基，三唑基，吡啶基，哒嗪基，嘧啶基，吡嗪基，三嗪基，氮基，oxepinyl，thiepinyl，二氮基，苯并呋喃基，异苯并呋喃基，苯并噻吩基，吲哚基，二氢吲哚基，苯并咪唑基，苯并异唑基，苯并唑基，苯并噻唑基，苄基吡喃基(benzyopyranyl)，苯并吡喃基，喹啉基，四氢喹啉基，异喹啉基，喹唑啉基，喹喔啉基，四氢喹喔啉基和萘啶基。
如本文所用，术语“环烷基”是指饱和的环状烃。环烷基环可以包括特定数目的碳原子。例如，C3-10环烷基包括3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。环烷基可以包括两个或三个环。当有两个或三个环时，每个环通过共享一个或多个环原子连接到一个或多个其他环上，从而形成螺烷烃或稠环体系。环烷基还可以包括附接到环碳原子上的羰基。为了避免疑义，术语“环烷基”不包括具有芳基，杂芳基或杂环环的基团。环烷基的实例包括但不限于环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和环辛基。
如本文所用，术语“杂环基”是指其中一个或多个碳原子已经被独立地选自N、S和O的杂原子替换的环烷基或环烯基。每个环中1至4个碳原子可以被独立地选自N、S和O的杂原子替换。杂环基团可以是单环，双环或三环。如果存在两个或三个环，则一个环可以通过共享一个或多个环原子而彼此连接，从而形成螺环烃或稠环体系。杂环基可以包括附接到不饱和环碳上的羰基。杂环基可具有特定数目的环碳原子，例如C3-10杂环基是指环体系中具有3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的杂环基。示例性的杂环基包括四氢呋喃基，四氢噻吩基，吡咯烷基，2-吡咯烷酮基，吡咯啉基，二硫醇基，1,3-二氧戊环基，吡唑啉基，咪唑啉基，咪唑烷酮基，哌啶基，哌嗪基，吗啉基和四氢吡喃基。
式I或II的化合物可以为药学上可接受的盐的形式。合适的药学上可接受的盐可以包括但不限于药学上可接受的无机酸如盐酸，硫酸，磷酸，硝酸，碳酸，硼酸，氨基磺酸和氢溴酸的盐或药学上可接受的有机酸如乙酸，丙酸，丁酸，酒石酸，马来酸，乳酸，柠檬酸，苯甲酸和谷氨酸的盐。非药学上可接受的盐也可以落入本发明的范围内，因为它们可以用作制备药学上可接受的盐的中间体或用于储存或运输期间。
式I和II的化合物具有不对称中心。本发明还涉及在所述中心的一个或多个处具有基本上纯的异构体形式的化合物，例如大于约90％ee，如大于95％ee或大于97％ee或大于99％ee。这样的异构体可以通过不对称合成来制备，例如使用手性中间体或通过手性拆分。
式I和II的化合物可以使用溶液或固相肽化学方法合成，如经适当修饰以包括非肽基团。溶液和固相合成方法对于本领域技术人员可以是已知的。例如，固相合成程序可以在树脂上进行。肽化学方法可以使用BOC或Fmoc化学。例如，合成方法可以包括以下的连续处理：(i)通过将胺与N-保护的氨基酸，偶联剂(例如HBTU(N,N,N',N'-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐)和碱(如二异丙基乙胺)在极性非质子传递溶剂(如二甲基甲酰胺)混合形成酰胺键；和(ii)将N-保护的氨基酸去保护以提供胺用于进一步反应。
本发明还可涉及组合疗法，例如将包括式I或II的化合物的本发明化合物，本发明的肽或模拟物或其药学上可接受的盐以及其他治疗或预防疟疾的药物或程序一起向受试者施用。
本发明的化合物可以用作药物。因此，本发明另一方面提供了药物组合物，其包含本发明化合物，包括式I或II化合物，本发明的肽或模拟物或其药学上可接受的盐。药物组合物可以包含药学上可接受的载体或赋形剂。
从与组合物的其他成分相容的意义上讲，载体必须是可接受的，并且不会对受试者有害。
药物组合物包括适用于口服，直肠，鼻腔，局部(包括口腔和舌下)，阴道或肠胃外(包括肌内，皮下，鞘内和静脉内)施用的那些或适合于通过吸入或吹药施用的形式。该药物组合物可能特别适用于肠胃外施用。包含式I或II化合物，本发明的肽或模拟物或其药学上可接受的盐的本发明化合物可以与药学上可接受的载体或赋形剂一起置于药物组合物中。所述组合物可以是固体(包括片剂，填充胶囊，散剂，胶囊，栓剂，可分散颗粒剂和阴道栓剂)或液体(包括溶液剂，悬浮剂，乳剂，胶体，酏剂，乳膏剂，凝胶剂和泡沫剂)形式。在一个实施方案中，药物组合物可以是用于肠胃外使用的无菌注射溶液的形式。据信使用各种载体和赋形剂用于药学上可接受的化合物是本领域众所周知的。除了任何常规赋形剂或载体与活性化合物不相容之外，考虑将其用于药物组合物中。
药物组合物和载体或赋形剂的性质将取决于施用途径以及病症的性质和所治疗的受试者。据信，本领域技术人员可以容易地确定特定载体或递送系统的选择和施用途径。在一些情况下，可能需要通过本领域已知的手段(例如通过微囊化)保护化合物(鉴于酰胺键)。还应选择施用途径，使化合物到达其作用部位。
药学上可接受的载体或赋形剂可以是固体或液体。固体载体或赋形剂可用作稀释剂，调味剂，增溶剂，润滑剂，悬浮剂，粘合剂，防腐剂，片剂崩解剂或包封材料。合适的固体载体和赋形剂是本领域技术人员已知的。
如果药物组合物是散剂，则活性组分和载体或赋形剂都可以是混合在一起的细碎散剂。
如果药物组合物是片剂，则可以在将活性组分与合适量的具有必要的结合能力的载体或赋形剂混合，然后压制成具有所需形状和尺寸的片剂。
用于散剂和片剂的示例性载体或赋形剂可以包括例如碳酸镁，滑石，糖，乳糖，果胶，糊精，淀粉，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，低熔点蜡，可可脂等。
液体形式制剂可以包括例如水或水-丙二醇溶液。例如，肠胃外注射液体制剂可以配制成在聚乙二醇水溶液中的溶液。
液体药物组合物可以以单位剂量形式配制。例如，组合物可以以安瓿，预填充注射器，小容量输液器或多剂量容器的形式提供。这样的组合物可以包含防腐剂。组合物还可以包含配制剂如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。组合物还可以是散剂形式，用于在使用之前与合适的载体(例如无菌水)一起构成。液体载体和赋形剂可以包括着色剂，调味剂，稳定剂，缓冲剂，人造甜味剂和天然甜味剂，分散剂，增稠剂，增溶剂，悬浮剂等。
口服使用的水溶液可以通过将活性化合物溶解在水中并根据需要添加着色剂，增稠剂，调味剂和稳定剂来制备。
口服使用的水悬浮液可以通过将活性组分分散在具有粘性材料例如天然或合成树胶，树脂，甲基纤维素或其它悬浮剂的水中来制备。
药物组合物还可以包括旨在转换为液体形式用于口服施用的固体形式的制剂。为了局部施用于表皮，化合物可以配制成软膏，乳膏或洗液，或者作为透皮贴剂。
对于口服施用，活性化合物可以与载体或赋形剂混合，并以可摄取片剂，含服或舌下片剂，锭剂，胶囊，酏剂，悬浮剂，糖浆剂，糯米纸囊剂等的形式使用。这些口服途径中的一些可能有可能避免肝脏代谢。
组合物也可以通过气雾剂形式从加压分配器或容器吸入施用，所述分配器或容器包含推进剂，例如二氧化碳气体，二氯二氟甲烷，氮气，丙烷或其他合适的气体或气体组合。
另一方面，本发明提供了预防或治疗疟疾的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的药物组合物，包含式I或II化合物的本发明化合物，本发明的肽或模拟物或其药学上可接受的盐。
另一方面，本发明提供了包含式I或II化合物，本发明的肽或模拟物或其药学上可接受的盐的本发明化合物在制备用于治疗或预防疟疾的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了包含式I或II化合物，本发明的肽或模拟物或其药学上可接受的盐的本发明化合物在制备用于治疗或预防与疟原虫属的某些种相关的疾病或病症。
另一方面，本发明提供治疗或预防与疟原虫属的某些种有关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本发明的药物组合物，式I或II化合物，本发明的肽或模拟物或其药学上可接受的盐。由疟原虫属的某些种引起或感染的疾病或病症引起的“与疟原虫属的某些种有关的疾病或病症”。在一个实施方案中，疟原虫属的某些种恶性疟原虫或间日疟原虫。在另一个实施方案中，所述与疟原虫属的某些种有关的疾病或病症是疟疾。
在又一方面，本发明提供抑制plasmepsin V的方法，所述方法包括使plasmepsinV与本发明的化合物接触的步骤，所述化合物包括式I或II的化合物，本发明的肽或模拟物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，plasmepsin V衍生自疟原虫属的某些种，尤其是衍生自恶性疟原虫或间日疟原虫。plasmepsin V可以位于体外或体内。方法可包括筛选化合物文库以鉴定与plasmepsin V结合的化合物，并进行实验以研究plasmepsin V的生理学或药理学。
如本文所使用的，术语“治疗”和“预防”将在其最宽泛的背景下考虑。例如，术语“治疗”并不一定意味着受试者被治疗直到完全康复。术语“治疗”包括改善疾病或病症的症状，或降低疾病或病症的严重程度。同样，“预防”并不一定意味着受试者将永远不会感染疾病或病症。“预防”可被认为是降低疾病或病症发作的可能性，或预防或以其他方式降低发展成疾病或病症的风险。
包括式I或II化合物，本发明的肽或模拟物或其药学上可接受的盐的本发明化合物的“有效量”是指至少部分获得所需反应，或延迟所治疗的疾病或病症的发作或进展所需的量。该量可以根据以下因素而变化，例如：向其施用化合物的个体的健康和身体状况，向其施用化合物的个体的分类群，期望的治疗/预防的程度，化合物的配制，以及对医疗情况的评估。预计“有效量”将落在可以通过常规试验确定的广泛范围内。
如本文所用，术语“受试者”可以包括哺乳动物，特别是人类，灵长类动物，家畜动物，实验室试验动物，伴侣动物和野生动物(不管是捕获的还是自由的)。家畜可能包括羊，牛，猪，马和驴。实验室试验动物可以包括小鼠，兔，大鼠，猪和豚鼠。伴侣动物可能包括狗和猫。在一个实施例中，受试者是人。
在整个说明书中，优选的方面和实施方案适当地单独地或与其他方面和实施方案组合地应用，加以必要的修改，无论是否明确地如此陈述。
现在将参考下面的实施例进一步描述本发明，这些实施例仅是说明性的而非限制性的。
附图简要说明
将参照以下附图描述本发明的各种实施方案。一些图包含颜色表示或实体。可以从申请人在要求后或合适的专利局获得彩色版本的图。
图1：显示了其为RxL PEXEL基序的过渡态模拟物的WEHI-842和WEHI-916的结构。
图2：显示：(A)WEHI-842和WEHI-916对plasmepsin V活性和寄生虫生长的影响，左图显示WEHI-842(红色)和WEHI-916(蓝色)对恶性疟原虫plasmepsin V的抑制作用，右侧图显示WEHI-842(红色)和WEHI-916(蓝色)对间日疟原虫plasmepsin V的抑制作用。对于两个图，IC50数据代表使用KAHRP荧光底物的三个独立实验的平均值±SD；(B)用WEHI-842和WEHI-916抑制恶性疟原虫生长，左图显示用WEHI-842和WEHI-916抑制3D7寄生虫(氯喹敏感)，右图显示用CS2，W2mef(氯喹耐药)和NF54(氯喹敏感)获得的结果。EC50数据代表三个独立实验的平均值±SEM，所述实验在暴露于化合物九点稀释系列72小时后通过流式细胞术测量恶性疟原虫3D7寄生虫血症。相对于载体处理的对照测量寄生虫存活；(C)在恶性疟原虫中表达的PfEMP2-GFP嵌合蛋白的结构。如先前所示，PfEMP3-GFP在通过plasmepsin V切割PEXEL后输出(Boddey J.A.，et al.2010)；(D)不同浓度的WEHI-842和WEHI-916在3小时后裂解PfEMP3-GFP中的PEXEL的作用。黑箭头表示由于plasmepsin V的抑制而积累在ER中的未切割蛋白质，而蓝色箭头表示plasmepsin V切割带。下图显示抗HSP70作为上样对照；和(E)WEHI-842和WEHI-916(10μM)对孵育过程中PfEMP3-GFP中PEXEL的裂解的影响。下图再次显示抗HSP70作为上样对照。
图3：显示：(A)通过放射性标记测量的plasmepsin V对PfEMP3-GFP加工的抑制。将寄生虫用WEHI-842和WEHI-916(10μM)孵育3小时，然后用35S-Met标记蛋白质10分钟。PfEMP3-GFP被免疫沉淀并通过SDS-PAGE和放射自显影进行可视化。黑色箭头指向未切割的PfEMP3-GFP，红色箭头指向信号肽酶切割的PfEMP3-GFP，蓝色箭头指向PEXEL切割的PfEMP3-GFP，如先前所述Sleebs B.E.,et al.(2014a)。直方图显示每条带的密度测定定量值与每条泳道中检测到的总蛋白库的比例；(B)WEHI-842抑制plasmepsin V对PfEMP3-GFP的加工是可逆的。将寄生虫用WEHI-842(10μM)孵育3小时，用35S-Met标记蛋白质10分钟，然后将寄生虫在缺乏35S-Met的正常培养基中孵育30和60分钟作为冷追踪。PfEMP3-GFP被免疫沉淀并通过SDS-PAGE和放射自显影进行可视化。黑色箭头指向未切割的PfEMP3-GFP，红色箭头指示信号肽酶切割的PfEMP3-GFP，蓝色箭头指向PEXEL切割的PfEMP3-GFP。直方图显示每条带的密度测定定量值与每条泳道中检测到的总蛋白库的比例；(C)显示输出至恶性疟原虫感染的红细胞的胞质溶胶的可溶性蛋白的测定的示意图。破伤风溶血素(tetanolysin)介导红细胞膜中的孔隙，从而释放可溶性蛋白质；以及(D)PfEMP3-GFP输出到恶性疟原虫感染的红细胞被WEHI-842阻断。随着时间的推移，顶图测定输出到恶性疟原虫感染的红细胞的胞质溶胶中的PfEMP3-GFP。直方图显示在每个时间点从破伤风溶血素上清液免疫沉淀得到的PfEMP3-GFP的定量。中图显示在破伤风溶血素处理期间没有醛缩酶从寄生虫中泄漏。底部的两个图显示，就在免疫沉淀之前，细胞中存在大致等量的PfEMP3-GFP和醛缩酶。
图4：显示与抑制剂WEHI-842复合的plasmepsin V的晶体结构的模型，其中(A)和(B)分别显示表面图的前视图和侧视图；和(C)和(D)分别表示带状的等同取向图。WEHI-842(绿色)与间日疟原虫plasmepsin V的底物结合位点结合，plasmepsin V在结合位点(褐色)上具有处于闭合位置的瓣。游离的Cys140和二硫键结合的Cys氨基酸以球形(黄色)表示。
图5：显示在所选天冬氨酸蛋白酶的酶结构域中发现的二硫键结构的比较。显示了间日疟原虫(Pv)plasmepsin V的Cys残基编号，但是序列的分隔没有按比例显示。编号1-14代表间日疟原虫plasmepsin V中的Cys氨基酸相比于其他天冬氨酸蛋白酶的相对位置。数字或字母的加或减代表其他天冬氨酸蛋白酶中发现的其他半胱氨酸氨基酸相对于间日疟原虫plasmepsin V的酶结构域中的位置的偏移。每种结构的PDB标识符代码示于括号中。基于结构比对模型预测恶性疟原虫(Pf)PMV，刚地弓形虫(T.gondii)(Tg)Aspv，致病疫霉(Phytophthora infestans)(Pi)AP和卵菌亚纲(oomycete)NEP1(坏死和乙烯诱导肽1)的二硫键连接性。
图6：显示了间日疟原虫plasmepsin V与恶性疟原虫plasmepsin II的结构比对。具体地：(A)显示与恶性疟原虫plasmepsin II晶体结构模型(PDB：1LF4)比对的间日疟原虫plasmepsin V晶体结构的模型。顶视图直接观察底物结合位点，而底视图是显示底物结合位点侧视图的图像顺时针旋转90°。间日疟原虫plasmepsin V中的NAP1插入序列(绿色)位于朝向间日疟原虫结构的顶部，螺旋-转角-螺旋基序(黄色)见于分子的底部边缘上。两个结构元素中的二硫键都显示为红色；(B)显示通过均方根偏差(“RMSD”)比对和着色的间日疟原虫plasmepsin V晶体结构和恶性疟原虫plasmepsin II晶体结构的模型。RMSD测量两个比对残基的C-α原子之间的距离，以表示。深蓝色着色表示比对良好，而更高的偏差则逐渐通过绿色到红色显示。不用于比对的残留物是白色的；以及(C)是(B)中所示的间日疟原虫plasmepsin V晶体结构和恶性疟原虫plasmepsin II晶体结构的模型的底物结合位点的放大图，显示了结构相似性的水平。
图7：显示来自与WEHI-842复合的间日疟原虫plasmepsin V的晶体结构的间日疟原虫plasmepsin V的底物结合位点和WEHI-842之间的蛋白质-配体相互作用模型。具体地：(A)显示了与WEHI-842复合的间日疟原虫plasmepsin V的底物结合位点的放大图。涉及与WEHI-842相互作用的残基的主链原子被表示为球形(粉红色)，而显示涉及相互作用的侧链。也参与稳定复合物的H2O分子1和2都显示为球形(红色)。(C)中显示的Ile78和Val188侧链的位置来帮助显示在下方的残基的取向；(B)示出了(A)的简化2D示意图，示出了复合物中的S1-S3口袋的位置；和(C)显示S1口袋的放大图(后视图)，显示了WEHI-842中紧密包封P1亮氨酸(绿)基团的疏水性残基Ile78，Val188，Phe180和Tyr139(蓝色和红色网格)。
图8：显示用于活性测定和结构研究的重组间日疟原虫和恶性疟原虫plasmepsinV的制备。使用相同的操作方案制备每种蛋白质。将Plasmepsin V融合蛋白分泌到昆虫细胞培养基中并从中收获，使用抗flag树脂亲和纯化并使用TEV蛋白酶去除融合标签。使用SEC从消化物中获得高纯度的每个plasmepsin V的酶结构域。具体地：(A)显示了从重组间日疟原虫plasmepsin V蛋白酶结构域去除融合物的SDS-PAGE分析。泳道1＝TEV切割前的间日疟原虫plasmepsin V融合蛋白，泳道2＝TEV蛋白酶，泳道3＝间日疟原虫plasmepsin V/TEV消化混合物，泳道4＝对照消化物(不添加间日疟原虫plasmepsin V融合蛋白)。泳道1-4在还原(RD)样品缓冲液存在下进行电泳。泳道5-8是泳道1-4的复制品，除了样品在非还原(NR)样品缓冲液存在下电泳。在完成时去除融合标签，并且在约20kDa处看到与融合标签等同的条带；(B)显示对来自TEV消化物的间日疟原虫plasmepsin V酶结构域的SEC纯化的SDS-PAGE分析。标记1、2和3代表来自洗脱曲线的关键级分，并且PAGE分析已经显示已经使用SEC从间日疟原虫plasmepsin V酶结构域(2)中去除了高分子量多聚体(1)和低分子量融合标签(3)。发现所有重组形式的恶性疟原虫/间日疟原虫plasmepsin V的洗脱的保留时间等价于这些蛋白的预期单体大小；以及(C)显示用于大多数酶测定和结晶试验的重组plasmepsin V酶结构域(去除融合标签)的最终纯化形式的SDS-PAGE分析。在RD或NR样品缓冲液存在下，将大约3-5μg蛋白质/泳道进行电泳。
图9：显示间日疟原虫和恶性疟原虫plasmepsin V的序列比对和酶的活性。具体地：(A)显示了部分序列比对，用于比较间日疟原虫和恶性疟原虫plasmepsin V的N末端区域；(B)显示使用KAHRP PEXEL五聚体作为野生型和具有RL>2A，R>K和L>I的突变的恶性疟原虫plasmepsin V的蛋白酶活性；(C)显示使用KAHRP PEXEL五聚体作为野生型和具有RL>2A，R>K和L>I的突变的间日疟原虫plasmepsin V的蛋白酶活性；和(D)显示在活性位点具有D>N突变的间日疟原虫plasmepsin V的酶活性的消除。
图10：显示恶性疟原虫和间日疟原虫plasmepsin V的Michaelis-Menten酶动力学。具体地，(A)和(B)分别表示Michaelis-Menten曲线，其示出在用恶性疟原虫plasmepsinV和间日疟原虫plasmepsin V分别在17和33分钟后，由plasmepsin V得到递增浓度的荧光KAHRP PEXEL肽的切割速率(相对荧光单位/min)；(C)和(D)分别表示用恶性疟原虫plasmepsin V和间日疟原虫plasmepsin V的作为荧光KAHRP PEXEL底物浓度函数的plasmepsin V的速度的Burk-Lineweaver曲线。数据被用来推导Km值；(E)和(F)分别显示用恶性疟原虫plasmepsin V和间日疟原虫plasmepsin V随着时间的推移在不同浓度切割KAHRP荧光底物的动力学；以及(G)显示衍生自Michaelis-Menten图(MM)和Burk-Lineweaver图(BL)的恶性疟原虫plasmepsin V和间日疟原虫plasmepsin V的动力学值。
图11：显示：(A)显示WEHI-916对间日疟原虫plasmepsin V的直接结合动力学的代表性传感图；和(B)显示WEHI-842对间日疟原虫plasmepsin V的直接结合动力学的代表性传感图。在每个浓度对间日疟原虫plasmepsin V的结合通过与拟合曲线黑色重叠的彩色曲线示出。
图12：显示WEHI-842对恶性疟原虫中全局蛋白质合成的影响。具体地：(A)显示在用35S-甲硫氨酸/半胱氨酸标记寄生虫蛋白15分钟之前用DMSO或WEHI-842(2.5，5或10μM)处理3小时，显示在蛋白质合成中没有缺陷。HSP70水平作为上样和活力对照通过免疫印迹进行检测(中图)。还通过免疫印迹检查对PfEMP3-GFP加工的作用(下图)。使用相同的膜获得图像；以及(B)显示了显示加工位置的PfEMP3-GFP的示意图。
图13：显示了间日疟原虫plasmepsin V(“Pv pmv”)和恶性疟原虫plasmepsin II(Pf pmII)序列和二级结构元件的比对。使用位于http://espript.ibcp.fr(Robert，X.&Gouet，P.，2014)的在线ESPript程序来准备该比对。已经比较了与具有晶体结构的酶结构域的区域对应的序列。尽管间日疟原虫plasmepsin V和恶性疟原虫plasmepsin II具有较差的序列同源性，但是大多数二级结构元件都保持在它们各自的三维结构中。用于恶性疟原虫plasmepsin II序列信息的PDB文件参考是1LF4。
图14：显示了与WEHI-842复合的间日疟原虫plasmepsin V的结构特征。具体地：(A)显示了间日疟原虫plasmepsin V的晶体结构的putty模型，说明该结构内B因子的差异。增加的B因子显示为增加的厚度和颜色转变(蓝色到橙色)；和(B)显示了各种示意图，详细描述了间日疟原虫plasmepsin V的表面静电势。顶部LHS图像显示了分子结构的一个面，使得能够显示底物结合位点完整主视图。顶部RHS图像顺时针旋转90°，显示具有底物结合位点侧视图的分子的一个面。预测有大面积的负静电势与底物结合位点的边缘相邻，并位于分子的底部。底部的RHS图像显示了分子的背面，其中底物结合位点面向页面内。底部的LHS显示间日疟原虫plasmepsin V的另一侧表面，预测具有正面静电表面电势的广泛区域。
图15：显示：(A)通过确定X射线晶体学结构的区域，恶性疟原虫与间日疟原虫plasmepsin V的序列比对。行下面的星号表示间日疟原虫plasmepsin V中涉及与WEHI 842抑制剂相互作用的残基。行上面的彩色线条表示间日疟原虫plasmepsin V中发现的特定结构特征(绿色＝NEP1插入物，红色＝没有观察到电子密度的环区域，黄色＝螺旋-环-螺旋区域)；(B)提出位于恶性疟原虫plasmepsin V的底物结合位点和WEHI-842的保守残基之间的潜在相互作用。
序列表的说明
SEQ ID NO：1-恶性疟原虫的plasmepsin V的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2-间日疟原虫的plasmepsin V的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3-编码具有包含FLAG标签，SUMO结构域和TEV蛋白酶切割位点的N末端融合标签的重组间日疟原虫plasmepsin V的核苷酸序列。
SEQ ID NO：4-编码包含用于插入pTriex2表达载体的KpnI和XhoI限制性位点的重组间日疟原虫plasmepsin V的核苷酸序列。
SEQ ID NO：5-表达的具有未切割的包含FLAG标签，SUMO结构域和TEV蛋白酶切割位点的N末端融合标签的重组间日疟原虫plasmepsin V的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6-在TEV切割位点切割包含FLAG标签和SUMO结构域的N末端融合标签之后的重组间日疟原虫plasmepsin V的氨基酸序列(“plasmepsin V多肽链”)。
SEQ ID NO：7-来自包含PEXEL序列(RTLAQ)的knob相关富含组氨酸的蛋白质(“KAHRP”)的肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8-含有突变的PEXEL序列(KTLAQ)的变体KAHRP肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9-含有突变的PEXEL序列(RTIAQ)的另一种变体KAHRP肽的氨基酸序列。
详述
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义(例如分子生物学，生物化学，结构生物学和/或计算生物学中)。标准技术用于分子和生物化学方法(一般参见Sambrook et al.,2001,Ausubel et al.1999和Green and Sambrook,2012，其通过引用并入本文)和化学方法。
在本说明书和权利要求书中，词语“包含(comprising)”及其衍生词包括“包含(comprises)”和“包含(comprise)”包括所述整体中的每一个，但不排除包含一个或多个其他整体。
在整个说明书中对“一个实施方案”或“实施方案”的引用意味着结合该实施方案描述的特定特征，结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个本说明书中各处出现的短语“在一个实施例中”或“在实施方案中”并不一定都指同一实施方案。此外，特定的特征，结构或特性可以以任何合适的方式以一种或多种组合进行组合。
如本文所用，术语“同源物”是指与plasmepsin V和/或其部分具有至少30％氨基酸序列同一性的蛋白质。优选同一性百分比为40％或50％，更优选60％或70％，最优选80％或90％。95％或以上的同一性是最特别优选的，例如95％，96％，97％，98％，99％或100％。
如本文所用，术语“衍生物”是指显示野生型plasmepsin V的生物活性的plasmepsin V，其特征在于从野生型序列中替换至少一个氨基酸或修饰一个或多个天然存在的氨基酸。
与plasmepsin V复合WEHI-842的晶体和晶体结构
本发明提供了包含与WEHI-842复合的间日疟原虫plasmepsin V构建体(SEQ IDNO：6)的晶体(见图1B)。构建体包括间日疟原虫plasmepsin V(SEQ ID NO：2)的残基35至476，并且不包括C末端膜锚。
在图4和6中显示了与WEHI-842复合的间日疟原虫plasmepsin V的晶体结构。晶体结构揭示了标准的天冬氨酰蛋白酶折叠，包括在底物结合位点周围包含月牙形和主要为β-片层核心的酶结构域。酶结构域包括沿着含有活性位点天冬氨酸(Asp80和Asp313，根据SEQID NO：2)的底物结合位点的底部相互接触的N末端和C末端亚结构域。将plasmepsin V多肽的氨基和羧基末端装配成特征性的六链结构域间β-片层，其用于将N末端和C末端亚结构域锚定在一起。N末端亚结构域进一步包括独特的β-发夹环结构，称为“瓣”，其垂直于底物结合位点并与结合的WEHI-842相互作用。
看到WEHI-842与plasmepsin V的底物结合位点和瓣相互作用。这些相互作用的细节在图7中给出。
该结构还揭示了在天冬氨酰蛋白酶中不存在的两个特征，即由包括4个半胱氨酸残基的17个氨基酸组成的NAP1插入物，和螺旋-转角-螺旋基序。后者的基序被认为可能在plasmepsin V切割效应底物后的输出功能中是重要的。
由包含4个半胱氨酸残基的17个氨基酸组成的NAP1插入物位于N末端亚结构域中，并且已经发现与在植物天冬氨酸蛋白酶例如nepenthesin 1中发现的相似。nepenthesin 1中的插入物被称为neafhesin1型天冬氨酰蛋白酶(NAP1)折叠(Athauda S.B.,etal.2004)，并被认为在napenthesin 1的功能调节中起作用(Athauda S.B.,et al.2004)。
螺旋-转角-螺旋基序由43个氨基酸组成，并似乎对plasmepsin V(包括疟原虫属的某些种的直系同源蛋白酶)是独特的。
如图14所示的b因子putty示意图显示结构中的大多数环区域通常具有较高的B因子，表明如预期的更大的灵活性。然而，位于底物结合位点上的瓣相对有序，与其与WEHI-842的相互作用一致。间日疟原虫plasmepsin V预计在中性pH下具有主要的正表面电荷，在底物结合位点的一个角上和在结构底部的螺旋-转角-螺旋附近的另一个角上有显著的负表面电荷斑块。
间日疟原虫plasmepsin V中R241至E272(根据SEQ ID NO：2)
之间的环区域具有较差的电子密度，其结构不能确定。尽管如此，间日疟原虫plasmepsin V的结构表明这些残基将位于分子的与底物结合位点相对的一侧，并且可能不会与效应蛋白相互作用。来自其他疟原虫属的某些种的Plasmepsin V在这个位置也包含相似大小的区域，并且观察到这个环在物种之间具有较差的序列保守性(参见图15)。在比对中，间日疟原虫plasmepsin V的疟原虫直系同源物在其比较序列中具有55-85％的同一性，76-91％的相似性和<3％的缺口(http://ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi)。其他的顶复门寄生虫(Apicomplexa)，植物病原体和植物具有与plasmepsin V相关的酶(例如刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)，东方泰勒虫(Theileria orientalis)，马巴贝斯虫(Babesiaequi)，致病疫霉和猪笼草(Nepenthes gracilis))，其中序列同一性、相似性和序列差异分别为<35％，<50％和至多20％。疟原虫属的某些种中天冬氨酰蛋白酶的plasmepsin家族的其他成员(如plasmepsin II，VI，IX和X)与plasmepsin V表现出非常低的序列相似性，与其不同的功能差异一致。
间日疟原虫plasmepsin V的酶结构域含有形成7个二硫键的15个半胱氨酸残基，其中4个位于N末端亚结构域中，3个位于C末端亚结构域中(见图5)。尽管间日疟原虫plasmepsin V具有胃蛋白酶样家族折叠，但二硫键结构比该酶组中大多数成员更复杂(KayJ.，et al.2011)。例如，胃蛋白酶和组织蛋白酶E的结构具有三个二硫键，并且恶性疟原虫的食物液泡蛋白酶I，II和IV已经失去了这三个二硫键中的一个。最近，具有高的半胱氨酸含量的植物天冬氨酸蛋白酶的亚家族已经被系统发生聚类，但是没有可用的结构信息(KayJ.，et al.2011)。还发现Plasmepsin V位于包含植物和真菌天冬氨酸蛋白酶的相同进化枝内，其中大部分是I型整合膜蛋白。间日疟原虫plasmepsin V的晶体结构与先前报道的比对结合使用，表明这组酶具有类似的二硫键结构，并且代表了这一不寻常的亚家族A1B天冬氨酸蛋白酶组的第一种结构。
C1-C8二硫键跨越N末端亚结构域；位于该区域内是保守的胃蛋白酶样C2-C3二硫键和由17个氨基酸组成的NAP1插入物(Athauda，S.B.，et al.2004)，包括4个在C4-C6和C5-C7之间具有二硫键的半胱氨酸残基。间日疟原虫plasmepsin V蛋白NAP1插入键模式不同于之前使用序列比对预测的C4-C7和C5-C6结构和胃蛋白酶样天冬氨酸蛋白酶的已知结构(Kay J.，et al.2011；Athauda S.B.,et al.2004)。在结构中底物结合位点之上的瓣中位于原型酪氨酸附近的未配对的半胱氨酸残基(C7a)在其他顶复门寄生虫(Apicomplexan)或密切相关的植物/真菌天冬氨酸蛋白酶中未观察到，并且对于疟原虫属的某些种似乎是独特的(见图5和6)。
在C末端亚结构域中，C9-C14键通过将六链结构域间β-片层(位于结合位点后面)紧固到多肽链的通往朝向蛋白质的膜锚定点的区域而稳定了底物结合位点的取向。间日疟原虫plasmepsin V中的C10-C11键将螺旋-转角-螺旋基序的每个末端系链到结构上。该结构元件存在于疟原虫直系同源物中，但不存在于plasmepsin V的其他顶复门寄生虫，植物或真菌同系物或其他plasmepsin家族蛋白酶中，其中它通常被可以被C10-C11键系链的小的非结构化环替换。间日疟原虫plasmepsin V中发现的C12-C13键也在胃蛋白酶样酶中观察到，并似乎在plasmepsin V的其他顶复门寄生虫同系物中保守。先前对疫霉属的某些种(Phytophthora spp.)的研究已经表明类似地定位的半胱氨酸残基可能参与分子间二硫键(Kay J.，et al.2011)。然而，在相同的研究中的序列比对揭示了这些残基的定位，使得它们可能参与在间日疟原虫plasmepsin V中发现的C12-C13键。
间日疟原虫plasmepsin V和恶性疟原虫plasmepsin II(参与血红蛋白消化的plasmepsin家族的另一成员)之间的序列和二级结构比对显示出低的序列同源性，但在整个酶结构域二级结构元件保守的高水平(见图13)。两个结构的比对(参见图6A)显示，当根据均方根偏差(RMSD)对比对的结构进行着色时，核心和底物结合位点区域内的折叠保持良好的保守(参见图6B和6C)。结构相似性朝着这些分子的末端降低，其中存在更多移动区或结构差异，例如NAP1插入物和plasmepsin V的螺旋-转角-螺旋基序(见图6B)。
在间日疟原虫plasmepsin V中，NAP1插入物形成在恶性疟原虫plasmepsin II的结构中未观察到的表面环(Tyr116-Gly121)(图6A中绿色)(Athauda，S.B.，et al.2004)。插入环附近的其他结构元件的比对也有细微的变化(参见图6B)。在更广泛的plasmepsin家族的其他成员中，例如plasmepsin VI，IX和X中，也没有看到NAP1插入物。在疟原虫属的某些种中plasmepsin V的直系同源物的NAP1插入序列的比对显示这个区域是高度保守的，但是序列的保守性从其他顶复门寄生虫直系同源物和相关的植物酶中消失。有趣的是，位于间日疟原虫plasmepsin V结构中底物结合位点之上的瓣似乎与NAP1插入物错综复杂地相关。包含未配对的Cys140的瓣序列在疟原虫属的某些种中的plasmepsin V的直系同源物中高度保守。瓣中的序列同源性在其他顶复门寄生虫直系同源物中高度保持，除了它们的瓣区域不包含未配对的半胱氨酸残基。NAP1插入物内的二硫键之一(即C5-C7)将该环系链到瓣内的N末端β-链上。先前已经建议(Athauda S.B.,et al.2004)，NAP1插入物在nepenthesin1的功能调节中发挥作用。间日疟原虫plasmepsin V结构揭示了瓣位置可能受到通过NAP1插入物与另一种蛋白质相互作用的影响(参见图14)。这一点的主要候选对象将是PEXEL效应器，因为它们进入对接用于加工，并且需要瓣充分打开以将大的多肽的PEXEL基序插入底物结合位点。plasmepsin V的序列比对表明，该提出的用于PEXEL进入的“分子门”可以在整个顶复门寄生虫和相关的植物/真菌酶中保守。尽管没有包括间日疟原虫plasmepsin V的短原序列(pro-sequence)用于结构测定，但是预测其位置定向远离底物结合位点，使该酶可能处于连续活性状态(Boddey，JA等，2010；Russo I.，等2010；Klemba，M.&Goldberg，D.E.2005)。
螺旋-转角-螺旋基序是间日疟原虫plasmepsin V的另一个关键特征，并且仅在疟原虫属的某些种的直系同源物中保守(见图14)。其他结晶的plasmepsin(包括恶性疟原虫plasmepsin II)也不存在螺旋-转角-螺旋基序(Ile338-Met381，图6A中的黄色)。重叠图显示它们的结构在N末端(螺旋5)和C末端(掺入β15a链的β-片层)至间日疟原虫plasmepsin V中的Cys337-Cys382(C10-C11)系链点的区域中比对不佳(见图6A和6B)。这可以通过螺旋-转角-螺旋基序在plasmepsin V分子的内部和在邻接区域内稳定的方式来解释。这些两亲性螺旋通过沿着该基序的内部面朝向彼此的疏水性残基以反平行取向强烈地保持在一起，而β15a链参与基序的二硫键系链(参见图13)。衬于螺旋-转角-螺旋基序外侧边缘的亲水性残基在跨疟原虫属的某些种的plasmepsin V直系同源物中高度保守(见图15)。这个结构元件的保守和周围特征表明它扮演着一个重要的功能角色。
如图7A所示，WEHI-842的N末端氨基甲酸酯部分突出到底物结合位点之外，并且不直接影响抑制剂的结合亲和力(Gazdik,M.,et al.2015；Sleebs,B.E.,et al.2014b)。蛋白质-配体相互作用主要包括密切靠近两个催化性Asp残基(Asp80和Asp313，根据SEQ ID NO：2)的残基和位于底物结合位点正上方的瓣中的残基。可以看到plasmepsin V的两个催化性Asp残基与模拟在肽键切割过程中形成的过渡态中间体的抑胃酶氨酸羟基官能团相互作用，这些相互作用解释了plasmepsin V被WEHI-842抑制的机制。
WEHI-842的氧代-胍盐离子(oxx-guanidinium)位于plasmepsin V的S3口袋内深处，并且参与将其锚定至底物结合位点的多重相互作用。瓣的Glu141的羧酸部分与胍盐离子形成“侧接”盐桥，而Gln183侧链上的羰基与位于相同离子的远端的两个氢原子相互作用(见图7B和7C)。胍盐离子通过与也与Tyr59的主链羰基相互作用的水分子(图7A中的H2O#2)的氢键结合而进一步稳定化。胍侧链的这些相互作用解释了为什么PEXEL Arg残基对于plasmepsin V活性是重要的。
已显示PEXEL中的P1Leu对于plasmepsin V底物和抑制剂的结合亲和力是重要的(Sleebs,B.E.,et al.2014a；Sleebs,B.E.,et al.2014b；Boddey,J.A.,et al.2013)。该结构揭示了该残基占据了S1口袋并紧密地包封在由残基Ile78，Tyr139和Val188的并列所形成的疏水环境中(见图7B)。因此，即使通过结构异构体Ile的置换在该口袋中具有有限的容忍度(Sleebs,B.E.,et al.2014a；Sleebs,B.E.,et al.2014b；Boddey,J.A.,et al.2013)。沿WEHI-842主链长度上的大部分羰基和酰胺基团参与与周围的氨基酸和溶剂分子形成氢键(参见例如图7A中的H2O#1)，从而形成广泛的相互作用网络，锚定穿过底物结合位点的抑制剂(参见图7B和7C)。在底物结合位点上方的瓣中发现的未配对的Cys140残基经由其主链酰胺基团与WEHI-842上的抑胃酶氨酸羰基相互作用。尽管Cys140侧链朝向抑制剂定向，但是在该结构中硫醇没有明显的相互作用/功能。
对于比对的疟原虫属的某些种的直系同源物，衬于底物结合位点表面的残基基本上是相同的，除了在恶性疟原虫、文氏疟原虫(P.vinckei)和伯氏疟原虫(P.berghei)plasmepsin V的S5位置中观察到的两个备选残基(未显示)。如此高水平的保守表明鉴定为plasmepsin V的高亲和力抑制剂应该对大多数(如果不是全部的)疟原虫属的某些种有效，并表明动物模型可用于体内动力学研究。来自其他顶复门寄生虫和nepenthesin 1的直系同源物的腔表面显示在整个底物结合位点的一些关键相互作用残基和各种底物结合口袋周围的序列变化，表明优化用于针对疟原虫属的某些种的抑制剂可能对其他相关的天冬氨酰蛋白酶不具有活性。
晶体结构的分析表明，在该复合物中并不是所有的腔空间都被利用。天然存在的肽有效填充这个空间的能力可能是有限的，而基于非肽的抑制剂可以提供更大的几何形状和物理化学性质的范围，这可能导致对plasmepsin V的亲和力改善。例如，已经发现WEHI-842上的P2位置对于Val是最佳的，但Ile和Leu可以在这个位置被容忍，其亲和力改变最小。显然，S2口袋仅部分地被WEHI-842的Val残基填充。此外，P3袋的主腔大部分由刀豆氨酸侧链填充，然而，在该口袋的底上也存在较小但同样深的腔，其没有被该抑制剂利用。最后，底物结合腔边缘上的口袋如S1'，S2'，S4和S5可以提供额外的机会来改善未来抑制剂对plasmepsin V的亲和力。
如本文所用，术语“晶体”是指组成化学物质的这样的结构(例如三维(3D)固体聚集体)，其中平面以一定角度相交且其中存在规则结构(例如内部结构)。术语“晶体”特别是指固体物理晶体形式，例如实验制备的晶体。
根据本发明的晶体可以使用任何含有酶结构域的plasmepsin V多肽来制备，所述酶结构域包括N末端和C末端亚结构域，并且缺少C末端膜锚定点(SEQ ID NO：2、5和6)。典型地，plasmepsin V多肽(SEQ ID NO：6)包含根据SEQ ID NO：2的残基35-476或其等同物以及这些残基的任何翻译后修饰，例如N-或O-连接的糖基化。
在优选的实施方案中，plasmepsin V多肽来自间日疟原虫(SEQ ID NO：2、5和6)。然而，plasmepsin V多肽可以从其他物种例如恶性疟原虫(SEQ ID NO：1)获得。
可用野生型plasmepsin V多肽序列或其变体(包括等位基因变体和天然存在的突变以及基因工程改造变体)构建晶体。通常，变体与相应的野生型plasmepsin V多肽具有至少95％或98％的序列同一性。
根据本发明的晶体可以优选使用抑制剂WEHI-842来制备(参见图1B)。在一些实施方案中，晶体可以用WEHI-842的变体，衍生物或药学上可接受的盐构建。
任选地，与WEHI-842复合的plasmepsin V的晶体可以包含一种或多种与plasmepsin V和/或WEHI-842结合或者以其他方式浸在plasmepsin V和/或WEHI-842晶体中或与其共结晶的化合物。这样的化合物包括配体或小分子，其可以是旨在调节plasmepsin V与生物底物之间的相互作用的候选药剂。
下面描述与WEHI-842复合的plasmepsin V晶体的生产。
在优选的实施方案中，本发明的与WEHI-842复合的plasmepsin V的晶体具有附录I所述的原子坐标。
如本文所使用的，术语“原子坐标”或“坐标集合”是指参考轴系统定义一个或多个原子的位置的值的集合。本领域技术人员将会理解，可以改变原子坐标而不显著影响由其导出的模型的准确性。因此，尽管本发明提供了优选的原子结构的非常精确的定义，但应该理解的是，设想了较小的变化，并且权利要求旨在包含这样的变化。
应该理解的是，除非另外指明，否则本文中对附录I中所示的原子坐标或原子坐标子集的任何引用应包括当叠加在由附录I所示原子坐标描述的相应主链原子上时具有不超过、优选不超过的主链原子的均方根偏差的原子坐标。
以下定义两个数据集之间的术语“均方根偏差('RMSD')”的意图。对于第一个数据集中的每个元素，计算它与第二个数据集中相应项目的偏差。平方偏差是该偏差的平方，均方偏差是所有这些平方偏差的平均值。均方根偏差是均方偏差的平方根。
优选的变体是这样的变体，其中与在附录I中给出的坐标相比，除了氢之外的所有主链原子的x，y和z坐标的RMSD小于(优选小于，小于或小于)。本领域技术人员将容易理解，原子坐标的3D刚体旋转和/或平移不改变所涉及的分子的结构。
在非常优选的实施方案中，晶体具有如附录I所示的原子坐标。
本发明还提供了包含plasmepsin V的N末端和C末端亚结构域或其区域或部分的plasmepsin V的底物结合位点的晶体结构。
附录I中显示了间日疟原虫plasmepsin V和WEHI-842的氨基酸44至240和273至470的实验获得的原子坐标。然而，本领域技术人员将认识到，由X射线晶体学确定的原子坐标集合不是没有标准误差的。因此，任选与WEHI-842复合的plasmepsin V的任何结构坐标集合当(使用主链原子时)在附录I中列出的原子坐标上叠加时具有小于的蛋白质主链原子的均方根偏差时应被视为相同。
与给定的原子坐标集合“基本上符合”的结构是这样的结构，其中对于每个结构域中的二级结构元件中的主链原子，这种结构的至少约50％具有小于约的RMSD，并且更优选地，对于每个结构域中的二级结构元件中的主链原子，小于约，并且在递增优选的情况下，对于每个域中的二级结构元素中的主链原子而言，小于约，小于约，小于约，最优选小于约。
在更优选的实施方案中，基本符合给定的原子坐标集合的结构是这样的结构，其中至少约75％的这种结构具有所述RMSD值，并且更优选至少约90％的这种结构具有所述RMSD值，并且最优选地，约100％的这种结构具有所述RMSD值。
在甚至更优选的实施方案中，“基本符合”的上述定义可以扩展到包括氨基酸侧链的原子。如本文所用，短语“普通氨基酸侧链”是指与实质上符合给定的原子坐标集合的结构和实际由这种原子坐标表示的结构的两个结构共同的氨基酸侧链。
如本文所用，术语“酶结构域”是指缺乏C末端膜锚的plasmepsin V的核心酶天冬氨酰蛋白酶折叠，并且通常包含如SEQ ID No：2中给出的间日疟原虫plasmepsin V的残基35至470。
如本文所使用的，术语“N末端亚结构域”是指形成酶结构域的一部分的plasmepsin V的N末端区域，并且其与C末端亚结构域和六链结构域间β-片层一起定义plasmepsin V的底物结合位点
如本文所用，术语“C末端亚结构域”是指形成酶结构域的一部分的plasmepsin V的C末端区域，并且其与N末端亚结构域和六链结构域间β-片层一起定义了plasmepsin V的底物结合位点
如本文所用，术语“六链结构域间β-片层”是指位于缺损膜锚之前的plasmepsin V多肽的N端区域和plasmepsin V多肽的C端区域，其被组装成为六链结构域间β-片层结构基序，其用于将N末端和C末端亚结构域锚定在一起。
如本文所用，用于plasmepsin V的术语“底物结合位点”是指参与结合底物或抑制剂的plasmepsin V的区域(也称为“结合裂缝”)。底物结合位点形成于N末端和C末端亚结构域之间，它们一起锚定至六链结构域间β-片层以形成月牙形酶结构域。底物结合位点包含如SEQ ID NO：2中给出的催化对，Asp80和Asp313。
如本文所用，术语“瓣”是指在先前关于天冬氨酰蛋白酶的文献中描述的plasmepsin V的N末端亚结构域中的β-发夹结构，其在底物结合位点中与底物或抑制剂发生相互作用(Baldwin,E.T.,et al.1993)，并且包含如SEQ ID No：2中给出的氨基酸139至142。
如本文所用，用于plasmepsin V的术语“NAP1插入物”是指包含SEQ ID NO：2中给出的残基116至132的序列插入物，其在N末端亚结构域中形成表面环。
如本文所用，术语“螺旋-转角-螺旋基序”在plasmepsin V中是指包含通过短环连接并且位于C末端亚结构域中的两个α-螺旋的结构基序。螺旋-转角-螺旋基序包含如SEQID No：2中给出的氨基酸338至381。
处理原子坐标
应该理解的是，一个或多个多肽的原子坐标集合是定义三维形状的相对点集合。因此，完全不同的坐标集合可以定义相似或相同的形状。此外，个别坐标的细微变化对整体形状几乎没有影响。
坐标的变化可以由于原子坐标的数学处理而产生。例如，可以通过原子坐标的结晶排列，原子坐标的分数化，结构坐标集合的整数加法或减法，原子坐标的反演或其任何组合来处理附录I中列出的原子坐标。
或者，由于构成晶体的任何组分中的氨基酸的突变，添加，置换和/或缺失或其他变化而引起的晶体结构的改变也可以解释原子坐标的变化。
使用各种计算分析来确定分子复合物或其部分是否与上述与WEHI-842复合的plasmepsin V的全部或部分结构足够相似。这样的分析可以在当前的软件应用中进行，例如Sequoia程序(Bruns et al.，1999)。
分子相似性程序(Melecular Similarity program)允许不同结构，相同结构的不同构象以及相同结构的不同部分之间的比较。
比较通常涉及计算所需的最佳平移和旋转，使得在指定的等价原子对上拟合的均方根偏差是绝对最小值。这个数字以埃(“”)给出。
因此，本发明的与WEHI-842复合的包含底物结合位点的plasmepsin V的原子坐标包括通过全体平移和/或旋转而与附录I中列出的原子坐标有关的原子坐标。因此，上面列出的RMSD值假设至少结构的主链原子被最佳地叠加，这可能需要平移和/或旋转以实现所需的最佳拟合，从而由其计算RMSD值。
可以通过合适的建模计算机程序如MODELLER(Sali&Blundell，1993)对基本符合特定原子坐标集合的plasmepsin V多肽或其区域的三维结构和/或WEHI-842或其区域或部分的三维结构进行建模，使用例如来源于以下数据的信息：(1)plasmepsin V的氨基酸序列和/或WEHI-842的序列；(2)由具有三维构型的指定的原子坐标集合表示的蛋白质的相关部分的氨基酸序列；和(3)指定的三维构型的原子坐标。还可以通过诸如分子置换的方法来计算plasmepsin V的三维结构和/或WEHI-842的三维结构，其基本上符合指定的原子坐标集合，这将在下面详细描述。
通常将原子坐标加载到机器可读介质上用于随后的计算操作。因此，模型和/或原子坐标有利地存储在诸如磁性或光学介质和随机存取或只读存储器(包括磁带，磁盘，硬盘，CD-ROM和DVD，闪存或芯片，服务器和互联网)上。这台机器通常是一台计算机。
原子坐标可以被用在计算机中以生成以下表示，例如，与WEHI-842复合的plasmepsin V的三维结构的图像，其可以由计算机显示和/或以电子文件表示。
从其衍生的原子坐标和模型也可用于各种目的，例如药物发现，生物试剂(结合蛋白)选择和其他蛋白质晶体的X射线晶体学分析。
分子替换
与WEHI-842复合的plasmepsin V的结构坐标(例如附录I中列出的那些)或其子集也可以用于确定分子复合物的三维结构，所述分子复合物包含plasmepsin V的至少N末端和/或C末端区域。具体地，可以获得关于另一个结晶分子复合物的结构信息。这可以通过包括分子替换的许多众所周知的技术中的任何一种来实现。
分子置换的方法通常由本领域技术人员所知(一般在Brunger,1997；Navaza&Saludjian,1997；Tong&Rossmann,1997；Bentley,1997；Lattman,1985；Rossmann,1972；McCoy,2007中描述)。
通常，分子置换包括以下步骤。从结晶的靶结构的晶体收集X射线衍射数据。X射线衍射数据被转换以计算帕特森(Patterson)函数。将结晶的靶结构的帕特森函数与从已知结构(在此称为搜索结构)计算的帕特森函数进行比较。搜索结构的帕特森函数在靶结构帕特森函数上旋转，以确定搜索结构在晶体中的正确方向。然后计算平移函数以确定搜索结构相对于晶轴的位置。一旦搜索结构被正确定位在单位单元中，可以计算实验数据的初始相位(phase)。这些相位对于计算可以观察到结构差异的电子密度图以及精化结构是必要的。优选地，搜索分子的结构特征(例如，氨基酸序列，保守的二硫键和β-链或β-片层)与结晶的靶结构相关。
电子密度图进而可以经受任何众所周知的模型构建和结构精修技术，以提供未知(即靶)结晶分子复合物的最终准确结构(例如，参见Jones et al.,1991；Brünger et al.,1998)。
通过不同于分子置换的方法获得相位的准确值是耗费时间的过程，其涉及迭代循环的近似和精化，并且极大地阻碍了晶体结构的解析(solution)。然而，当至少含有同源部分的蛋白质的晶体结构已经解析时，来自已知结构的相位提供了令人满意的对于未知结构的相位的起始估计。
通过使用分子置换，本文提供的与WEHI-842复合的plasmepsin V的全部或部分结构坐标(和附录I中所述)可用于确定其结构未知的结晶分子复合物的结构，比从头开始试图确定这样的信息更迅速和更有效。这种方法在确定plasmepsin V的结构方面特别有用。
与间日疟原虫plasmepsin V的任何部分充分同源的任何结晶分子复合物的任何部分的结构，可以通过这种方法来解析，例如恶性疟原虫plasmepsin V。
这样的结构坐标对于解析与各种分子(例如化学实体)共复合的plasmepsin V晶体的结构也是特别有用的。例如，这种方法使得能够确定化学实体之间相互作用以及候选plasmepsin V抑制剂的相互作用的最佳位点。
可以使用众所周知的X射线衍射技术研究上面提及的所有复合物，并且可以使用计算机软件例如X-PLOR(耶鲁大学由分子模拟公司(Molecular Simulations)分销；参见Brünger,1996)或Phenix(Adams,P.D.,et al.2010)将分辨率的X射线数据精炼至R值为约0.25或更小。该信息因此可用于优化已知的抑制剂，更重要的是设计新的或改进的plasmepsin V抑制剂。
用于化合物鉴定、设计或筛选的靶位点
本发明所提供的与WEHI-842复合的plasmepsin V的底物结合位点和瓣的三维结构(附录I)可用于鉴定间日疟原虫plasmepsin V和/或恶性疟原虫plasmepsin V的底物结合位点和/或瓣中潜在的靶结合位点(即，鉴定参与WEHI-842的结合或对该结合重要的间日疟原虫plasmepsin V和/或恶性疟原虫plasmepsin V的底物结合位点和/或瓣的那些区域)，以及用于鉴定和/或设计能够与间日疟原虫plasmepsin V和/或恶性疟原虫plasmepsin V的底物结合位点和/或瓣相互作用的其他化合物例如间日疟原虫plasmepsinV和/或恶性疟原虫plasmepsin V的潜在抑制剂的方法。
在一个实施方案中，靶结合位点可以包含底物结合位点和瓣的分子表面的部分。在优选的实施方案中，所述靶结合位点可以包含如SEQ ID NO：2中给出的间日疟原虫plasmepsin V的残基44至240和/或氨基酸273至470的一个或多个残基。在更优选的实施方案中，靶结合位点包括选自如下的一种或多种残基：SEQ ID NO：2中所示的间日疟原虫plasmepsin V的Tyr59,Ala60,Ile78,Asp80,Gly82,Tyr139,Cys140,Glu141,Phe180,Gln183,Val188,Asp313,Gly315和Thr317。
与plasmepsin V结合的化学实体的设计，选择，拟合和评估
使用各种已知的建模技术，可以使用本发明的晶体结构来产生显示为与WEHI-842相互作用的一个或多个结构区域的模型。
如本文所使用的，术语“建模”包括基于原子结构信息和相互作用模型的分子结构和/或功能的定量和定性分析。术语“建模”包括传统的基于数字的分子动力学和能量最小化模型，交互式计算机图形模型，修改的分子力学模型，距离几何和其他基于结构的约束模型。
可以将分子建模技术应用于与WEHI-842或其至少部分或其区域复合的plasmepsin V的原子坐标，以得到一系列3D模型并研究底物结合位点瓣和任何其他结合位点的结构，例如单克隆抗体，非免疫球蛋白结合蛋白和抑制肽的结合位点。
这些技术还可以用于筛选或设计小的和大的化学实体，其能够结合plasmepsinV，优选在底物结合位点内，以例如抑制或至少减少PEXEL的切割效应蛋白基序抑制或至少降低恶性疟原虫和/或间日疟原虫plasmepsin V的活性，抑制或至少减少蛋白质输出，并任选对恶性疟原虫和/或间日疟原虫生长是致死的。
这种建模方法是设计或选择具有与恶性疟原虫和/或间日疟原虫plasmepsin V的底物结合位点和/或与恶性疟原虫和/或间日疟原虫plasmepsin V的瓣的至少一部分的立体化学互补的化学实体，其与WEHI-842相互作用。“立体化学互补性”是指化合物或其部分与底物结合位点和/或瓣形成足够数量的能量上有利的接触，从而在与底物结合位点和/或瓣结合时具有净自由能的降低。
这样的建模方法还可以用于设计或选择与WEHI-842的底物结合位点表面和/或与WEHI-842的至少一部分具有立体化学相似性的化学实体，其与恶性疟原虫和/或间日疟原虫plasmepsin V的瓣的至少一部分相互作用。“立体化学相似性”是指该化合物或其部分与WEHI-842与plasmepsin V的能量上有利的接触次数相同，如与plasmepsin V复合的WEHI-842的晶体结构所确定的，其由附录I所示坐标表示。
立体化学互补性是与通过附录I中列出的坐标或其子集列举的与衬于底物结合位点内和瓣中位点内表面残基匹配的分子的特征。所谓“匹配”是指所鉴定的部分与表面残基相互作用，例如通过氢键或通过促进位点内分子去溶剂化的非共价范德华力和库仑相互作用(具有表面或残基)，以这样的方式，分子在结合位点的保留是能量上有利的。
优选立体化学互补性使得化合物对于底物结合位点和/或瓣的KD小于10-5M，更优选小于10-6M，还更优选10-7M。在最优选的实施方案中，KD值小于10-8M或最好仍小于10-9M。
由位于附录I中列出的原子坐标的氨基酸特征化的底物结合位点和/或瓣的形状和静电或化学性质互补的化学实体将能够结合底物结合位点和/或瓣，并且当结合足够强时，基本上抑制或至少减少恶性疟原虫和/或间日疟原虫plasmepsin V与生物靶分子例如具有PEXEL基序的效应蛋白的相互作用。
应该理解的是，化学实体和底物结合位点和/或瓣之间的互补性或者化学实体与生物学靶分子(诸如具有PEXEL基序的效应蛋白)之间的相似性不需要延伸超过底物结合位点和/或瓣或靶分子的所有残基，以抑制或模拟与plasmepsin V天然相互作用的分子或复合物的结合。
可以使用许多方法来鉴定具有与恶性疟原虫和/或间日疟原虫plasmepsin V的底物结合位点和/或与恶性疟原虫和/或间日疟原虫plasmepsin V的瓣的至少一部分的立体化学互补性的化学实体，其与WEHI-842相互作用。例如，该过程可以根据附录I从机器可读存储介质生成的计算机的坐标通过计算机屏幕上目视检查整个间日疟原虫底物结合位点或恶性疟原虫plasmepsin V中的等价区域开始。或者，选择的片段或化学实体然后可以以各种取向位于或对接在恶性疟原虫和/或间日疟原虫plasmepsin V的底物结合位点内或相对于恶性疟原虫和/或间日疟原虫plasmepsin V的瓣的至少一部分，其以上面定义的与WEHI-842和plasmepsin V类似的方式与WEHI-842相互作用。
可以使用本领域众所周知和可用的建模软件(Guida，1994)。这些软件包括Discovery Studio(Accelrys Software Inc.，San Diego)，SYBYL(Tripos Associates，Inc.，St.Louis，Mo.，1992)，Maestro(Portland)，MOE(ChemicalComputing Group Inc.,Montreal,Canada)。这个建模步骤之后可以用标准分子力学力场如AMBER(Weiner et al.,1984)，OPLS(Jorgensen and Tirado-Rives,1988)和CHARMM(Brooks et al.,1983)进行能量最小化。此外，还有许多更专门的计算机程序来帮助选择本发明的结合部分的过程。
专门的计算机程序还可以帮助选择片段或化学实体的过程。这些计算机程序其中包括：
1.GRID(Goodford，1985)。GRID可从Molecular Discovery Ltd.,Italy获得；
2.AUTODOCK(Goodsell&Olsen,1990)。AUTODOCK可从Scripps ResearchInstitute,La Jolla,CA获得；
3.DOCK(Kuntz et al.,1982)。DOCK可从University of California,SanFrancisco,CA获得；
4.GLIDE(Friesner et al.,2004)。GLIDE可从 LLC,Portland获得；和
5.GOLD(Cole et al.,2005)。GOLD可从The Cambridge Crystallographic DataCentre,Cambridge,UK获得。
一旦已经选择了合适的化学实体或片段，就可以将它们组装成单个化合物。在一个实施方案中，组装可以通过视觉检查显示在计算机屏幕上的三维图像上的片段彼此之间的关系，相对于间日疟原虫plasmepsin V的底物结合位点和/或间日疟原虫plasmepsin V的瓣的至少一部分的结构坐标，其与WEHI-842结合。接下来是使用Discovery Studio，Maestro，MOE或Sybyl等软件进行手动建模。或者，可以使用标准化学几何结构将片段连接到另外的原子。
上述用于化学实体的评估过程可以对于化学化合物以类似的方式进行。
帮助本领域技术人员连接各个化学实体或片段的有用程序包括：
1.CAVEAT(Bartlett et al.,1989)。CAVEAT可以从University of California,Berkeley,CA获得；和
2.GANDI(Day and Caflisch,2008)。GANDI可从University of Zurich获得。
其他分子建模技术也可以根据本发明使用，参见例如Cohen et al.(1990)和Navia&Murcko(1992)。
有两种优选的方法来设计根据本发明的分子，其补足plasmepsin V的底物结合位点和/或plasmepsin V的瓣的至少一部分的立体化学，其与WEHI-842结合。第一种方法是计算机模拟将三维结构数据库中的分子直接对接到靶结合位点，主要但不是排他地使用几何标准来评估特定分子对位点的适合度(goodness-of-fit)。在这种方法中，通过仅考虑两个刚体的几何(硬球)相互作用来减少内部自由度(以及分子构象空间中相应的局部最小值)的数量，其中一个刚体(活性位点)包含形成用于第二个刚体(互补分子)的结合位点的“口袋”或“凹槽”。
可以通过应用plasmepsin V的多种构象将plasmepsin V的灵活性引入到计算机模拟筛选中。可以从附录I中列出的坐标或其子集计算地通过使用分子动力学模拟或类似的方法来生成plasmepsin V的多种构象。
Kuntz et al.(1982)和Ewing et al.(2001)说明了这种方法，其内容在此引入作为参考，其配体设计的算法在由加利福尼亚大学董事会分发的商业软件包DOCK 4.0版中实施，并在分销商提供的名称为“DOCK程序套件概述”文献中进一步描述，其内容通过引用并入本文。根据Kuntz算法，WEHI-842适合的腔的形状可以定义为一系列不同半径的重叠球。然后搜索一个或多个结晶学数据的现有数据库，例如剑桥结构数据库系统(The CambridgeCrystallographic Data Centre,Cambridge,U.K.)，由结构生物信息学研究合作实验室(Rutgers University,N.J.,U.S.A.)维护的蛋白质数据库，LeadQuest(TriposAssociates,Inc.,St.Louis,MO)，可用化学品目录(Symyx Technologies Inc.)和NCI数据库(National Cancer Institute,U.S.A)以获得接近如此定义的形状的分子。
然后可以修改基于几何参数鉴定的分子以满足与化学互补性相关的标准，例如氢键，离子相互作用和范德华相互作用。可以使用不同的评分函数来从数据库中排序和选择最佳分子(参见例如Bohm&Stahl,1999)。由Tripos Associates，Inc.(St.Louis,MO)销售的软件包FlexX是另一个可用于这种直接对接方法的程序(参见Rarey et al.,1996)。
第二优选方法需要评估各个化学基团(“探针”)与活性位点在位点内部和位点周围的样品位置处的相互作用，得到能量值的阵列，从中可以在选定的能级生成三维轮廓表面。配体设计的化学探针方法例如由Goodford(1985)描述，其内容通过引用并入本文，并且在若干商业软件包中实施，例如GRID(Molecular Discovery Ltd.,Italy的产品)。
按照这种方法，通过用不同的化学探针，例如水，甲基，胺氮，羧基氧，或羟基探测活性位点，从而在初期阶段(outset)确定位点互补分子的化学先决条件。由此确定了活性位点与每个探针之间的相互作用的有利位点，并且由此产生的这种位点的三维模式可以产生推定的互补分子。这可以通过可以搜索三维数据库以鉴定结合所需药效团模式的分子的程序来完成，或者通过使用有利位点和探针作为输入来执行从头设计的程序来完成。用于确定和设计药效团的合适程序包括CATALYST(Accelrys Software,Inc)和CERIUS2，DISCO(Abbott Laboratories,Abbott Park,IL；由Tripos Associates Inc.分销)。
药效团可用于使用诸如CATALYST(Accelrys Software,Inc)和Sybyl/3DB Unity(Tripos Associates,Inc.,St.Louis,MO)的程序在计算机模拟化合物文库/三维数据库中筛选。
化学结构数据库可从许多来源获得，包括Cambridge Crystallographic DataCenter(Cambridge,U.K.)，Molecular Design，Ltd.(San Leandro,CA)，TriposAssociates，Inc.(St.Louis,MO)，化学文摘服务(Columbus,OH)，可用化学目录(SymyxTechnologies,Inc.)，德温特世界药物索引(WDI)，BioByteMasterFile，美国国家癌症研究所数据库(NCI)，Medchem数据库(BioByte Corp.)和Maybridge目录。
从头(De novo)设计程序包括LUDI(Accelrys Software Inc.,San Diego,CA)，Leapfrog(Tripos Associates,Inc.)和LigBuilder(北京大学，中国)。
一旦已经通过上述方法设计或选择了实体或化合物，则可以通过计算评估来测试和优化该实体或化合物可以结合plasmepsin V的效率。例如，设计或选择用作plasmepsinV结合化合物的化合物还必须优选地横越与天然plasmepsin V结合时与结合位点所占据的位置不重叠的体积。有效的plasmepsin V结合化合物必须优选地其结合态和自由态之间的能量差异相对较小(即结合变形能较小)。因此，最有效的plasmepsin V结合化合物应优选设计成具有不大于约10kcal/mole，优选不大于7kcal/mole的结合变形能。
设计或选择为与plasmepsin V结合的化合物可以进一步计算优化，使得在其结合状态下，其优选不会与靶蛋白发生排斥静电相互作用。
这种非互补(例如静电)相互作用包括排斥性电荷-电荷，偶极-偶极和电荷-偶极相互作用。具体地，当化合物与plasmepsin V结合时，化合物与蛋白质之间的所有静电相互作用的总和优选对结合的焓产生中性或有利的贡献。
如上所述，一旦最终选择或设计了plasmepsin V结合化合物，则可以在其一些原子或侧基中进行置换以改善或修改其结合性质。通常，初始替换是保守的，即替换基团将具有与原始基团大致相同的尺寸，形状，疏水性和电荷。当然应当理解，应当避免本领域已知的改变构象的组分。然后可以通过以上详细描述的相同计算机方法分析这些置换的化学化合物与plasmepsin V的拟合效率。
本领域中可用具体的计算机软件来评估化合物变形能和静电相互作用。设计用于这种用途的程序的例子包括：Gaussian 03，(Frisch,Gaussian,Inc.,Pittsburgh,PA)；GAMESS(Gordon et al.,Iowa State University)；Jaguar( LLC,Portland)；AMBER，9.0版(Case et al,University of California at San Francisco)；CHARMM(Accelrys Software,Inc.,San Diego,CA)；和GROMACS 4.0版(van der Spoel etal.)。
筛选/设计方法可以用硬件或软件，或两者的组合来实现。然而，优选地，这些方法在可编程计算机上执行的计算机程序中实现，每个可编程计算机包括处理器，数据存储系统(包括易失性和非易失性存储器和/或存储元件)，至少一个输入设备和至少一个输出设备。程序代码被用于输入数据以执行上述功能并生成输出信息。输出信息以已知的方式被应用于一个或多个输出设备。计算机可以是例如个人计算机，微型计算机或常规设计的工作站。
每个程序优选地以高级过程或面向对象的编程语言来实现，以与计算机系统进行通信。但是，如果需要，程序可以用汇编语言或机器语言来实现。无论如何，该语言可以是编译或解释的语言。
每个这样的计算机程序优选地被存储在可由通用或专用可编程计算机读取的存储介质或设备(例如，ROM或磁盘)上，用于当由计算机读取存储介质或设备时配置和操作计算机以执行这里描述的过程。该系统也可以被认为是作为计算机可读存储介质来实现的，该计算机可读存储介质被配置有计算机程序，其中如此配置的存储介质使得计算机以特定的和预定义的方式操作来执行这里描述的功能。
化合物
本发明的化合物包括使用本发明的筛选方法设计和/或鉴定的那些，由上述式I和II化合物涵盖的那些以及能够识别和结合plasmepsin V的底物结合位点和/或与如上定义的plasmepsin V的瓣相互作用的那些。
可以使用(i)基于使用对应于与WEHI-842复合的底物结合位点和/或瓣的3D结构的原子坐标的筛选方法；或(ii)基于使用对应于与plasmepsin V复合的WEHI-842的3D结构的原子坐标的筛选方法来产生能够识别和结合plasmepsin V的底物结合位点和/或与plasmepsin V的瓣相互作用的化合物。或者，可以通过针对代表结合到plasmepsin V的底物结合位点和/或瓣的能力的特定靶分子筛选来鉴定化合物。
使用本发明的方法鉴定或设计的候选化合物和/或化合物可以是合成的或天然存在的、优选合成的任何合适的化合物。在一个实施方案中，通过本发明的方法选择或设计的合成化合物优选具有等于或小于约5000、4000、3000、2000、1000或500道尔顿的分子量。本发明的化合物优选在生理条件下是可溶的。
化合物可涵盖多种化学类别，尽管通常它们是有机分子，优选分子量大于50且小于约2,500，优选小于1,500，更优选小于1,000，还更优选小于500道尔顿的小有机化合物。这样的化合物可以包含与蛋白质结构相互作用所必需的官能团，特别是氢键结合，并且通常包括至少一个胺基，羰基，羟基或羧基，优选这些化学官能团中的至少两个。化合物可以包含被一个或多个上述官能团置换的环碳或杂环结构和/或芳族或聚芳族结构。化合物还可以包含生物分子，包括肽，糖，脂肪酸，类固醇，嘌呤，嘧啶，其衍生物，结构类似物或组合。
化合物可以包括例如：(1)肽，例如可溶性肽，包括加Ig尾的融合肽和随机肽文库(参见例如Lam et al.,1991；Houghten et al.,1991)和由D-和/或L-构型氨基酸制成的组合化学衍生的分子文库的成员；(2)磷酸肽(例如，随机和部分简并的定向磷酸肽文库的成员，参见例如Songyang et al.,1993)；(3)抗体(例如多克隆，单克隆，人源化，抗独特型，嵌合和单链抗体以及Fab、(Fab)2'、Fab表达文库和抗体的表位结合片段)；(4)非免疫球蛋白结合蛋白，例如但不限于avimer，DARPin和脂质运载蛋白；(5)基于核酸的适体；和(6)小的有机和无机分子。
配体可以从各种来源获得，包括合成或天然化合物的文库。合成化合物文库可从例如Maybridge Chemical Co.(Tintagel,Cornwall,UK)，AMRI(Budapest,Hungary)和ChemDiv(San Diego,CA)，Specs(Delft,The Netherlands)商购获得。
包含细菌，真菌，植物或动物提取物的天然化合物文库可获得自例如PanLaboratories(Bothell,WA)，TimTec(Newark,DE)。另外，有多种手段可用于各种有机化合物和生物分子的随机和定向合成，包括随机寡核苷酸的表达。
或者，可以容易地生产细菌，真菌，植物和动物提取物形式的天然化合物文库。合成分子文库的方法容易获得(参见例如DeWitt et al.,1993；Erb et al.,1994；Zuckermann et al.,1994；Cho et al.,1993；Carell et al.,1994a；Carell et al.,1994b；和Gallop et al.,1994)。另外，天然或合成化合物文库和化合物可以通过常规的化学，物理和生物化学手段容易地修饰(参见例如Blondelle and Houghton,1996)，并且可以用于产生组合文库。在另一种方法中，先前鉴定的药剂可以进行定向或随机化学修饰，例如酰化，烷基化，酯化，酰胺化，并且可以筛选类似物的plasmepsin V-调节活性。
用于产生组合文库的许多方法是本领域已知的，包括涉及生物文库；空间可寻址的平行固相或液相文库的那些方法；需要解卷积的合成文库方法；“一珠一化合物”文库方法；和使用亲和色谱选择的合成文库方法。生物文库方法限于多肽或肽文库，而其他四种方法适用于多肽，肽，非肽寡聚物或化合物的小分子文库(Lam，1997)。
化合物还包括可由基于片段的药物设计产生的引物(leads)合成的化合物，其中通过将此类筛选片段浸至或共结晶至本发明提供的晶体中，然后将它们X射线束并获得衍射数据来评估这些化学片段的结合。本领域技术人员容易应用差异傅立叶(DifferenceFourier)技术来确定这些片段结合的plasmepsin V内的位置，然后可以通过合成化学将这些片段组装成对plasmepsin V具有增加的亲和力的较大的化合物。
分离的肽或其模拟物
使用本发明的方法鉴定或设计的化合物可以是肽或其模拟物。
本发明的分离的肽或模拟物可以是构象约束的分子或者可选地不是构象约束的分子，例如非约束肽序列。术语“构象约束的分子”是指构象约束的肽和构象约束的肽类似物和衍生物。
术语“类似物”是指具有与天然存在的α-氨基酸类似的化学结构的分子。实例包括含有偕二氨基烷基或烷基丙二酰基的分子。
术语“衍生物”包括其中在天然存在的α-氨基酸中发现的一个或多个侧基已被修饰的α-氨基酸。因此，例如氨基酸可以被多种未编码或修饰的氨基酸替换，例如相应的D-氨基酸或N-甲基氨基酸。其他修饰包括用化学上类似的基团置换羟基，巯基，氨基和羧基官能团。
关于肽及其模拟物，可以作为置换或添加引入的其它非天然氨基酸或化学氨基酸类似物/衍生物的其它实例一般包括但不限于2,4-二氨基丁酸，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，2-氨基丁酸，6-氨基己酸，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，磺基丙氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，氟代氨基酸，设计者氨基酸例如β-甲基氨基酸，Cα-甲基氨基酸，Nα-甲基氨基酸和氨基酸类似物。
模拟物可以是肽模拟物。“肽模拟物”是模拟肽的生物活性但在化学性质上不再是肽的分子。通过严格的定义，肽模拟物是不再含有任何肽键(即氨基酸之间的酰胺键)的分子。然而，术语肽模拟物有时用于描述自然界中不再完全肽的分子，例如假肽，半肽和类肽。无论是完全还是部分非肽，用于本发明方法和/或本发明的肽模拟物提供了反应性化学部分的空间排列，所述化学部分非常类似于肽模拟物基于的肽上的活性基团的三维排列。由于这种相似的活性位点几何结构，肽模拟物对与肽的生物活性相似的生物系统具有影响。
有时使用给定肽的模拟物而不是肽自身是有利的，因为肽通常表现出两种不希望的性质：(1)较差的生物利用度；和(2)持续时间短。肽模拟物围绕这两个主要障碍提供了明显的途径，因为所涉及的分子足够小以致于既有口服活性又具有长的作用持续时间。与肽模拟物相关的还有相当大的成本节省和改善的患者依从性，因为与非肠道施用肽相比，它们可以口服施用。此外，肽模拟物通常比肽生产起来更便宜。
基于WEHI-842或其片段的合适肽模拟物可以使用容易获得的技术来开发。因此，例如，肽键，或者在WEHI-842的情况下，其他肽键可以被非肽键替换，所述非肽键允许肽模拟物采用类似于原始肽的结构，因此具有生物学活性。还可以通过将氨基酸的化学基团替换为具有相似结构的其他化学基团来进行进一步的修饰。通过参考附录I中提供的抑制剂的三维结构可以帮助开发源自WEHI-842或其片段的肽模拟物。该结构信息可以用于搜索三维数据库以鉴定具有相似性的分子结构，使用诸如Sybyl/3DB Unity(Tripos Associates，St.Louis，MO)等程序。
本领域技术人员将认识到肽模拟物的设计可能需要使用本发明的方法设计或鉴定的化学结构的略微结构改变或调整。一般而言，使用本发明的方法鉴定或设计的化学化合物可以化学合成，然后使用本文所述的任何方法测试调节和/或抑制plasmepsin V活性的能力。本发明的方法是特别有用的，因为它们可以用于极大地减少必须筛选其调节和/或抑制plasmepsin V活性的能力的潜在模拟物。
本发明的肽或肽模拟物可用于筛选候选化合物的测定中，所述候选化合物结合plasmepsin V的区域并可能干扰底物结合位点内的底物结合，以例如抑制或至少减少切割效应蛋白的PEXEL基序以抑制或至少降低恶性疟原虫和/或间日疟原虫plasmepsin V的活性，抑制或至少减少蛋白质输出并任选对恶性疟原虫和/或间日疟原虫生长是致死的。模拟靶结合位点的肽或肽模拟物特别可用作鉴定可能有用的plasmepsin V配体的特异性靶分子。
如本文所用，“片段”是本发明的肽的一部分，其保持“全长”肽的定义的活性，即与plasmepsin V的底物结合位点结合和/或与plasmepsin V的瓣相互作用的能力。片段可以是任何大小，只要它们保持定义的活性即可。优选地，该片段维持全长多肽的至少50％，更优选至少75％的活性。
通过GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)确定肽的同一性％，其中空位产生罚分＝5，空位延伸罚分＝0.3。查询序列的长度至少为10个氨基酸，并且GAP分析在至少10个氨基酸的区域上比对两个序列。更优选地，GAP分析在两个序列的整个长度上比对。
关于定义的肽，将理解的是，高于上面提供数字的同一性％将包括优选的实施方案。因此，在适用的情况下，鉴于最小数字的同一性％，优选肽包含与相关指定的SEQ ID NO至少50％，更优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％，更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，甚至更优选至少99.9％相同的氨基酸序列。
使用本发明的方法和/或本发明鉴定或设计的肽的氨基酸序列突变体可通过将适当的核苷酸变化引入本发明的核酸中或通过体外合成的所需肽。这样的突变体包括例如氨基酸序列内的残基的缺失，插入或置换。只要最终的肽产物具有所需的特征，可以进行缺失，插入和置换的组合以达到最终的构建体。
在设计氨基酸序列突变体时，突变位点的位置和突变的性质将取决于待修饰的特征。用于突变的位点可以单独修饰或成串修饰，例如通过(1)首先用保守的氨基酸选择进行置换，然后根据所获得的结果用更激进的选择，(2)缺失靶残基，或(3)插入与所在位点相邻的其他残基。
置换突变体在去除的肽中具有至少一个氨基酸残基，并在其位置插入不同的残基。感兴趣的位点是从各种菌株或物种获得的特定残基是相同的。这些位点，尤其是落在至少三个其他相同保守位点的序列内的位点，优选以相对保守的方式进行置换。在“示例性置换”标题下的表1中显示了这样的保守置换。
表1—示例性置换。
在优选的实施方案中，当与本文所定义的肽比较时，突变体/变体肽具有一个或两个或三个或四个保守氨基酸改变。表1中提供了保守氨基酸改变的细节。
还包括在本发明的范围内的是在合成期间或之后通过例如生物素化，苄基化，糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/封闭基团衍生化，蛋白酶解切割，连接至抗体分子或其他细胞配体等进行差异化修饰的肽。这些修饰可用于增加肽的稳定性和/或生物活性。
关于使用本发明的方法重新设计化合物，在实施方案中，所述化合物被重新设计成与含有靶向PEXEL基序的天然效应蛋白结构更相似。
化合物与plasmepsin V的相互作用
化合物可通过直接或间接结合于以下区域而与plasmepsin V的底物结合位点和/或plasmepsin V的瓣相互作用。直接结合的化合物与特定区域结合。间接结合的化合物与plasmepsin V的底物结合位点和/或plasmepsin V的瓣紧密接近或邻近的区域结合，结果干扰了plasmepsin V结合天然含有靶向PEXEL基序的效应蛋白，无论是拮抗还是激动。这种干扰可能是立体的，静电的或变构的。优选地，化合物通过直接与两个区域中的一个或两个结合而与plasmepsin V的底物结合位点和/或plasmepsin V的瓣相互作用。在结合特定靶分子的化合物的情况下，这样的化合物直接结合到特定靶分子。
可以通过共价或非共价相互作用或两者兼有结合。非共价相互作用的实例包括静电相互作用，范德华相互作用，疏水相互作用和亲水相互作用。
当本发明化合物与plasmepsin V相互作用时，优选“调节”plasmepsin V.“调节”是指化合物将plasmepsin V的活性改变至少10％。合适地，化合物通过降低或抑制plasmepsin V活性来调节plasmepsin V。候选化合物降低或抑制plasmepsin V活性的能力可以通过本文所述的任何一种plasmepsin V测定来评估。
本发明化合物优选具有足以为预期目的提供足够结合的对plasmepsin V的亲和力。合适地，这样的化合物和与plasmepsin V的特定靶分子结合的化合物具有10-5至10-15M的亲和力(KD)。对于用作治疗剂，该化合物合适地具有10-7至10-15M，优选10-8至10-12M，更优选10-10至10-12M的亲和力(KD)。当在竞争性测定中将化合物用作试剂以鉴定其它配体时，该化合物合适地具有10-5至10-12M的亲和力(KD)。
对本领域技术人员显而易见的是，本文中呈现的晶体结构首次使得能够直接观察在plasmepsin V中结合WEHI-842的区域。
在一个实施方案中，化合物可对plasmepsin V和/或plasmepsin V的特定靶分子具有高度特异性，但对其他天冬氨酰蛋白酶不具有特异性，即化合物选择性结合plasmepsin V。在这方面，化合物适当地对plasmepsin V和/或plasmepsin V的特异性靶分子具有不超过10-5M，优选不超过10-7M的亲和力(KD)，并且对其他天冬氨酰蛋白酶的亲和力至少为10-5M，优选至少10-3M。这样的化合物是期望作为例如plasmepsin V抑制剂，其中与其他非疟原虫属的某些种的天冬氨酰蛋白酶具有相互作用的倾向，并因此例如促进不良结果减少。
在优选的实施方案中，plasmepsin V或plasmepsin V的特异性靶分子/其他天冬氨酰蛋白酶对化合物的结合亲和比是至少10，优选至少100，更优选至少1000。
筛选测定和结合的确认
通过化合物与plasmepsin V的共结晶和如本文所述的结构测定，本发明的化合物可以进一步确认与plasmepsin V的结合。
根据本发明的方法设计或选择的化合物优选通过多种plasmepsin V功能的体外和体内测定来评估，以确认它们与plasmepsin V相互作用和调节plasmepsin V活性的能力。例如，可以测试化合物结合plasmepsin V的能力和/或其调节例如破坏plasmepsin V活性的能力。
可以通过本领域通常已知的方法在溶液中筛选文库，以确定配体是否竞争性地结合在共同的结合位点。这样的方法可以包括在溶液中(例如Houghten，1992)或在珠上(Lam，1991)，芯片(Fodor，1993)，细菌或孢子(U.S.5,223,409)，质粒(Cull et al.,1992)，或在噬菌体上(Scott&Smith,1990；Devlin,1990；Cwirla et al.,1990；Felici,1991；U.S.5,223,409)筛选文库。
在筛选测定是结合测定的情况下，可以使用PEXEL切割测定。在这样的测定中，将plasmepsin V，潜在结合分子和标记的含有PEXEL的肽底物一起孵育，其中结合效率由可检测信号确定，所产生的信号与蛋白酶活性成正比。可以使用各种标记，包括放射性同位素，荧光分子，化学发光分子，酶，特异性结合分子，颗粒，例如磁性颗粒等。
筛选测定中还可以包括多种其他试剂。这些包括用于促进最佳结合和/或减少非特异性或背景相互作用的试剂如盐，中性蛋白质，例如白蛋白，去污剂等。可以使用提高测定效率的试剂，例如核酸酶抑制剂，抗微生物剂等。组分以任何顺序添加，以产生必要的结合。孵育是在促进最佳的活性的任何温度下进行的，通常在4至40℃。
化合物与plasmepsin V的直接结合也可以通过表面等离子体共振(BIAcore)完成(综述于Morton&Myszka,1998)。在此，可以通过使用胺或硫醇-二硫化物交换偶联的直接化学偶联(Nice&Catimel,1999)或通过将作为Fc融合蛋白的plasmepsin V捕获到适当衍生的传感器表面(Morten&Myszka,1998)来将plasmepsin V固定在CM5或其他传感器芯片上。潜在的结合分子(称为分析物)以适当的流速和浓度范围通过传感器表面。传统的分析方法是收集广泛分析物浓度的响应。一系列的浓度提供了有关反应的足够信息，并且通过使用拟合算法如CLAMP(参见Morton&Myszka,1998)，可以测定速率常数(Morton&Myszka,1998；Nice&Catimel,1999)。通常，在每个分析物结合循环结束时再生配体表面。表面再生确保每个循环开始时分析物可以接近相同数量的配体结合位点。
选择孵育时间段以获得最佳活性，但也可优化以促进快速高通量筛选。通常在0.05到1小时之间就足够了。一般而言，多个测定混合物以不同的测试剂浓度平行运行以获得对这些浓度的不同响应。典型地，这些浓度中的一个用作阴性对照，即在零浓度或低于检测水平。
为了测量化合物体内抑制plasmepsin V活性的效率，可以使用脉冲追踪分析。在这样的分析中，脉冲可以包括在含有潜在结合分子，标记的底物和放射性标记的培养基中培养的恶性疟原虫和/或间日疟原虫感染的红细胞。追踪可以包括通过在无标记和无抑制剂的培养基中培养受感染的红细胞不同的孵育时间段，然后通过密度测定分析来定量标记的输出蛋白质的量，追踪标记的蛋白质向红细胞的输出。
化合物的用途
通过上述本发明的方法设计或选择的化合物/化学实体可用于调节细胞中的plasmepsin V活性，即抑制或至少降低plasmepsin V活性。这样的化合物可以与本文定义的plasmepsin V的底物结合位点和/或瓣相互作用。
鉴于恶性疟原虫和间日疟原虫感染引起疟疾，上述化合物可用于通过调节plasmepsin V活性，优选抑制plasmepsin V活性来治疗，改善或预防疟疾。
本发明提供的化合物还可以用作鉴定其它有用配体的测定试剂，通过例如竞争测定，作为用于进一步分析plasmepsin V的研究工具和作为药物组合物中潜在的治疗剂。
本发明提供的化合物也可用作鉴定其他更有效或选择性化合物的先导化合物。
在一个实施方案中，一种或多种化合物可作为试剂盒中的组分提供，用于鉴定与plasmepsin V结合的其他配体(例如小的有机分子)。此类试剂盒还可包括plasmepsin V或其功能片段。试剂盒的化合物和plasmepsin V或其组分可以被标记(例如，通过放射性同位素，荧光分子，化学发光分子，酶或其他标记)，或者可以不标记并且可以提供标记试剂。试剂盒也可以含有外围试剂，如缓冲剂，稳定剂等。也可以提供使用说明书。
施用
本发明的化合物可以优选与各种组分组合以产生本发明的组合物。优选地，组合物与药学上可接受的载体或稀释剂组合以产生药物组合物(其可以用于人类或动物用途)。
制剂将取决于化合物的性质和施用途径，但是通常可以将它们配制成用于局部，肠胃外，肌内，口服，静脉内，腹膜内，鼻内吸入，肺吸入，皮内或关节内施用。该化合物可以可注射形式使用。因此可以将其与任何用于可注射制剂的可接受的载体混合，优选用于在待治疗部位直接注射，尽管其可以全身施用。
药学上可接受的载体或稀释剂可以是例如无菌等渗盐水溶液，或其它等渗溶液如磷酸盐缓冲盐水。本发明的化合物可以与任何合适的粘合剂，润滑剂，悬浮剂，包衣剂，增溶剂混合。配制口服活性形式的化合物也是优选的。可用于本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体，稀释剂和赋形剂将为本领域技术人员所知。英国药典(BP)和美国药典和国家处方集(USP-NF)包含合适的载体，稀释剂和赋形剂的细节，如同Sweetman S(Ed.),‘Martindale:The complete drug reference.’London:Pharmaceutical Press,37th Ed.,(2011),and Rowe RC,Sheskey PJ,Quinn ME(Ed.),‘Handbookof PharmaceuticalExcipients’,6th Ed.,London:Pharmaceutical Press(2009)也包含相应细节，其内容通过交叉引用并入本文。
一般而言，本发明化合物(包括本发明化合物及其盐)的治疗有效的每日口服或静脉内剂量可能为0.01至50mg/kg，优选0.1至20mg/kg待治疗受试者体重。本发明化合物及其盐也可通过静脉内输注以可能范围为0.001-10mg/kg/hr的剂量施用。
如果合适，化合物的片剂或胶囊可以一次单独施用或两次或更多次施用。也可以缓释制剂施用化合物。
通常，医生将确定最适合于个体患者的实际剂量，并且其将随特定患者的年龄，体重和反应而变化。上述剂量是一般情况的例子。当然，可以有值得更高或更低的剂量范围的个别情况，这也在本发明的范围内。
对于一些应用，优选组合物以含有赋形剂如淀粉或乳糖的片剂的形式口服施用，或者以单独或与赋形剂混合的胶囊或珠剂(ovule)形式，或以含有调味剂或着色剂的酏剂，溶液或悬浮剂的形式。
组合物(以及单独的化合物)也可以肠胃外注射，例如静脉内，肌内或皮下注射。在这种情况下，组合物将包含合适的载体或稀释剂。
对于肠胃外施用，组合物最好以无菌水溶液的形式使用，所述无菌水溶液可以含有其它物质，例如足够的盐或单糖以使溶液与血液等渗。
对于口腔或舌下施用，组合物可以能够常规方式配制的片剂或锭剂形式施用。
对于受试者(例如患者)的口服，肠胃外，口腔和舌下施用，本发明化合物及其药学上可接受的盐和溶剂合物的日剂量水平通常为10-500mg(单次或分剂量)。因此，举例来说，片剂或胶囊可含有5至100mg的活性化合物，以适当的方式一次单剂量或两个剂量或更多个剂量施用。如上所述，医生将确定最适合于个体患者的实际剂量，并且其将随特定患者的年龄，体重和反应而变化。
所描述的施用途径和剂量仅作为指导，因为技术人员将能够容易地确定任何特定患者的最佳施用途径和剂量，这取决于例如患者的年龄，体重和病况。
实施例
实验步骤
蛋白质表达和纯化
将携带N末端gp67信号肽和包含FLAG标签，SUMO结构域和烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶切割位点的融合标签的间日疟原虫plasmepsin V(根据SEQ ID NO：2的残基R35-R476)在High Five昆虫细胞中表达(SEQ ID NO：5)。
使用抗FLAG M2-琼脂糖(Sigma)从细胞上清液初始亲和纯化重组蛋白质。浓缩合并的级分并使用TEV蛋白酶(1:25v/v，5小时，室温；参见图8；SEQ ID NO：6)去除N末端融合标签。然后使用尺寸排阻色谱法(SEC)获得高纯度的plasmepsin V。在20mM HEPES pH7.2/100mM NaCl/0.2mM DTT中进行SEC(Superdex 75，GE lifesciences)，得到为了结晶而浓缩的纯且稳定的蛋白质(再次参见图8)。
除了使用sf21昆虫细胞进行蛋白质表达外，使用类似的方法产生恶性疟原虫plasmepsin V(根据SEQ ID NO：1的残基N80-R528)，因为在该细胞系统中产生较少的共价聚集体。
重组plasmepsin V的动力学表征
评估重组恶性疟原虫和间日疟原虫plasmepsin V的体外活性，其针对包含来自knob相关富含组氨酸的蛋白质(“KAHRP”)的PEXEL序列的九个氨基酸的荧光肽(DABCYL-RNKRTLAQKQ-E-EDANS；SEQ ID NO：7)。
如所预期的，两种plasmepsin V均表现出针对PEXEL底物的特异性活性并在P1亮氨酸残基之后切割肽(参见图9)。
Km的值来自反Michaelis-Menten和Lineweaver-Burk图。这些值对于每种酶来说具有相同的量级，并且也与在不同PEXEL底物上的恶性疟原虫plasmepsin V的另一种重组形式来源的Km相似(Xiao，H.et al.2014)。
使用来自KAHRP(SEQ ID NO：7)的荧光PEXEL底物的重组plasmepsin V的Km对于恶性疟原虫和间日疟原虫的酶分别为20.2μM和6.0μM(参见图9和10)。
PEXEL切割测定(20μl总体积)由缓冲液(25mM Tris.HCl，25mM MES，pH 6.4)中的1ng/孔的间日疟原虫plasmepsin V或1.5ng/孔的恶性疟原虫plasmepsin V与5μM FRET肽底物(DABCYL-RNKRTLAQKQ-E-EDANS(SEQ ID NO：7))或具有序列DABCYL-RNKKTLAQKQ-E-EDANS(SEQ ID NO：8)或DABCYL-RNKRTIAQKQ-E-EDANS(SEQ ID NO：9)的肽组成(Sleebs,B.E.et al.2014a；参见图9)。将样品在37℃孵育120分钟，并使用Envision酶标仪(Perkin-Elmer)测量(Ex 340nm/Em 490nm)。
化合物评估
使用上述荧光PEXEL切割测定(Sleebs，B.E.et al.2014a)评估化合物WEHI-916(参见图1A)和WEHI-842。
反应包含含有来自KAHRP的PEXEL序列(RTLAQ)的9个氨基酸的荧光肽。商业获得KAHRP PEXEL肽底物DABCYL-RNKRTLAQKQ-E-EDANS(SEQ ID NO：7)，并以7.5μM的最终测定浓度使用。
所有测定的终点设定在活性的线性范围内(约1小时)。
吐温-20以0.005％的最终测定浓度使用。最终测定缓冲液浓度如下：25mM TrisHCl，25mM MES(pH 6.4)。最终测定体积为20μL。
使用DMSO作为稀释剂产生化合物的11点1/3系列稀释液(最终测定浓度为1％)。
测定反应在37℃孵育60分钟，并使用荧光酶标仪读取(Ex 340nm，Em 495nm)。使用非线性回归四参数拟合分析来确定IC50值，其中参数中的两个被限制为0和100％。
显示与WEHI-916(IC50为12.9nM)(参见图2A)相比，WEHI-842对重组恶性疟原虫plasmepsin V(IC50为0.79nM)具有15倍增加的效价。WEHI-842和WEHI-916之间在抑制间日疟原虫plasmepsin V的能力上有相似的效价差异，IC50分别为1.6nM和8.2nM(见图2A)。
寄生虫和生长测定
在含有25mM HEPES，pH 7.4，0.2％碳酸氢钠，0.5％Albumax II(LifeTechnologies)和5nM WR99210需要时的选择(Jacobus Pharmaceuticals赠予的礼物)的RPMI 1640培养基中，在5％CO2，5％O2，90％N，37℃，在以4％血细胞比容的人O+红细胞中培养恶性疟原虫株3D7，NF54，CS2和W2mef。
先前生成了表达与绿色荧光蛋白(GFP)融合的PEXEL蛋白红细胞膜蛋白3(PfEMP3)(PfEMP3-GFP)的恶性疟原虫3D7(Boddey，J.A.et al.，2010)(参见图2C)。
通过将环形体阶段的恶性疟原虫寄生虫与溶解于DMSO中的WEHI-916或WEHI-842或溶解于水中的氯喹以指定浓度孵育，在72小时如前所述通过流式细胞术测定寄生虫血症(Sleebs，B.E.et al.2014a)。
表达PfEMP3-GFP的恶性疟原虫滋养体经磁性纯化(Miltenyi Biotech)，与抑制剂孵育1-4小时，在37℃下用含0.09％皂苷的抑制剂处理，洗涤后的沉淀物在莱氏缓冲液中溶解，煮沸3分钟，通过SDS-PAGE分离蛋白质，转移到硝酸纤维素膜上，用1％脱脂奶粉封闭。用小鼠α-GFP(Roche；1：1000)，兔α-醛缩酶(1:1000)或兔α-HSP70(1:4000)抗体探测膜，随后用辣根过氧化物酶缀合的二抗(Silenius；1:2000)并使用增强化学发光(Amersham)进行可视化。为了放射性标记恶性疟原虫蛋白质，在37℃用10μM抑制剂处理表达PfEMP3-GFP的磁性纯化滋养体3小时，(最后30min在无Met/Cys培养基中)，然后向培养基中加入800μCi/ml35S-Met/Cys(Perkin/Elmer)10分钟。然后使用抗GFP琼脂糖(MBL)在4℃下从溶解于含有1x完全蛋白酶抑制剂(Roche)的1％Triton X-100/PBS中的寄生虫裂解物对PfEMP3-GFP蛋白质物质进行免疫沉淀2小时，并通过SDS-PAGE解析蛋白质，通过放射自显影进行可视化并使用GS-800校准密度计(Bio-Rad)定量(Sleebs,B.E.et al.2014a)。
发现WEHI-842抑制恶性疟原虫(3D7)寄生虫(一种氯喹敏感性株)生长的能力比用WEHI-916以相同方式处理的寄生虫好10倍(分别为EC50 0.40μM和EC50 5.0μM)(见图2B)。WEHI-842对其他恶性疟原虫寄生虫(包括替代氯喹抗性株)的影响类似于3D7(对于NF54，W2mef和CS2，EC50分别为0.47μM，0.64μM和0.83μM)。因此，WEHI-842是一种有效的plasmepsin V蛋白酶活性体外抑制剂，能够阻断恶性疟原虫血液阶段的生长。
生长测定还显示WEHI-842有效抑制PEXEL切割，如通过对应于全长PfEMP3-GFP的35kDa条带的积累所示(Boddey J.A.,et al.2010；Sleebs B.E.,et al.2014a)(见图2C和D)。WEHI-842与WEHI-916相比PEXEL处理抑制程度高10倍，WEHI-842抑制plasmepsin V所需时间明显低于WEHI-916，需要3小时达到最佳抑制效果(见图2D)，相比于WEHI-916的5小时(Sleebs B.E.,et al.2014)。另外，当以相同浓度对表达PfEMP3-GFP的寄生虫进行测试时，发现WEHI-842比WEHI-916更有效抑制plasmepsin V(见图2D)。
为了提供WEHI-842特异性抑制plasmepsin V并且没有其他正常的细胞功能的证据，用DMSO或WEHI-842(2.5、5、10μM)处理磁性纯化的滋养体3小时，然后用35S-甲硫氨酸/半胱氨酸标记寄生虫蛋白15分钟(参见图12)。还通过免疫印迹检查对PfEMP3-GFP加工的影响。
用10μM WEHI-842处理3小时显示对翻译没有抑制作用，但有效地抑制了PfEMP3-GFP的plasmepsin V切割。这些结果表明WEHI-842是恶性疟原虫寄生虫中PEXEL的plasmepsin V切割的有效和特异性抑制剂。
脉冲追踪以测量蛋白质输出和抑制
通过如上所述的放射性标记蛋白质进行脉冲追踪，然后在不含放射标记的无抑制剂的完全培养基中在37℃下进一步培养30和60分钟，然后纯化，解析，显影和通过密度测量定量PfEMP3-GFP蛋白质物质，如上所述。
脉冲：表达PfEMP3-GFP的恶性疟原虫滋养体经磁性纯化(Miltenyi Biotech)并用10μM WEHI-842或DMSO处理3小时。寄生虫蛋白在抑制剂存在下通过在培养基中加入800μCi/ml 35S-Met/Cys(Perkin/Elmer)标记3小时抑制剂处理时间的最后50分钟(这包括在标记之前的不含Met/Cys的含有抑制剂的培养基中30分钟)。追踪：通过在无放射性标记的无抑制剂的完全培养基中培养寄生虫20分钟，40分钟，60分钟或120分钟，在37℃下追踪输出标记的蛋白质至红细胞，然后通过于37℃孵育5分钟的破伤风溶血素处理(100U/mL破伤风溶血素(Sigma)，0.2％牛血清白蛋白(Sigma)，1×完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche))从感染的红细胞中释放输出蛋白质并以1500g离心1分钟。如上所述，将PfEMP3-GFP蛋白质从破伤风溶血素上清液级分纯化并解析，可视化并通过密度测定定量(参见图3A和3B)。
发现WEHI-842在抑制plasmepsin V切割PfEMP3-GFP中PEXEL基序方面比WEHI-916更有效10倍。随着寄生虫重新开始切割全长PfEMP3-GFP，WEHI-842的去除和在无抑制剂培养基中的继续生长显示PEXEL切割的抑制是可逆的(参见图3B)。PfEMP3-GFP加工的抑制作用也阻止了这种蛋白向寄生虫感染的红细胞的输出，如使用破伤风溶血素所确定的(参见图3C)。在20分钟后可以检测到DMSO存在下的输出，在40、60和120分钟后稳定增加，WEHI-842预处理在20、40和60分钟时显著降低输出(参见图3D)。PfEMP3-GFP的有效输出在120分钟后返回，表明PEXEL切割抑制是可逆的(参见图3B)，并且这引起了类似的输出抑制反转(参见图3D)。因此，WEHI-842通过抑制plasmepsin V切割PEXEL，有效地阻断蛋白质向恶性疟原虫感染的红细胞的输出。
表面等离子体共振
使用Biacore 4000(GE Healthcare)进行表面等离子体共振。使用胺偶联化学将Plasmepsin V固定在S系列CM5传感器芯片上。用0.1M NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和0.1M EDC(3-(N,N-二甲基氨基)丙基-N-乙基碳化二亚胺)的1:1混合物以流速5μl/min激活流动细胞的表面10min。将Plasmepsin V(10mM乙酸钠中的20μg/ml，pH4.5)以约10,000的密度固定。如上所述点3被激活和失活并用作参比表面。所有表面都用7分钟注射1M乙醇胺，pH 8.0来封闭。通过从1000nM稀释1:2制备WEHI-916和WEHI-842的11-点滴定，并以30μl/min的流速注射。使用的缓冲液是10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％Tween和2％DMSO。在25℃进行分析。化合物注射后，芯片表面用10mM甘氨酸-HCl，pH 2再生30s。使化合物分别缔合和解离250s和600s。数据以10Hz的速率收集，并使用Biacore4000评估软件1.0版拟合为1:1相互作用模型。
表面等离子体共振实验显示，WEHI-842和WEHI-916对间日疟原虫plasmepsin V的亲和力(KD)分别为13.4和42.0nM(见图11)。如图所示，WEHI-842比WEHI-916高两倍以上的对间日疟原虫plasmepsin V的亲和力。
此外，发现WEHI-842的kd低于WEHI-916的kd(分别为1.11E-03(1/s)和2.47E-03(1/s)的kd)，这较慢的解离速率与WEHI-842的亲和力更高一致。总之，这些结果显示WEHI-842是比WEHI-916更有效的恶性疟原虫和间日疟原虫plasmepsin V的抑制剂。
与WEHI-842复合的Plasmepsin V的结晶，结构解析及精修
结晶
间日疟原虫plasmepsin V(8mg/ml)的样品通过与6x摩尔比的WEHI-842混合而制备用于结晶。
检测结晶条件(0.11M硫酸铵/5％(v/v)jeffamine M-600/15.5％(w/v)聚乙二醇4000/0.1M乙酸钠-乙酸pH4.16)并针对间日疟原虫plasmepsin V/WEHI-842进行改善。
衍射数据收集
间日疟原虫plasmepsin V/WEHI-842的单晶在补充有20％乙二醇的良好溶液中冷冻。
使用XDS套件(Kabsch,W.,2010；Evans,P.R.,2011)，Pointless(Evans,P.R.,2011)和Aimless(Evans,P.R.&Murshudov,G.N.,2013)处理所有衍射数据。数据集的统计提供于下面的表2中。
结构解析及精修
通过使用Sculptor(Bunkoczi,G.&Read,R.J.,2011)修改形式的组织蛋白酶E(PDB1TZS；Ostermann,N.et al.,2004)作为搜索模型，用Phaser进行分子替换(McCoy,A.J.etal.,2007)解析结构。
用Coot(Emsley,P.&Cowtan,K.,2004)和Phenix(Adams,P.D.,et al.2010)的进一步多轮的构建和改进得到最终模型。根据SEQ ID NO：2，定义密度不好的斑块连接残基R241-E272，但对于有信心的模型构建而言质量不足。在Asn355附近观察到的密度可能是由于在蛋白质表达过程中该残基的糖基化。下面的表2中还提供了精修统计。
表2—X射线数据收集和精修统计
1括号中的数字是指最高分辨率shell中的统计数据。
3Rwork和Rfree是使用R＝<|Fh xpct–Fh obs|>/<|Fh obs|>(其中Fh xpct是模型结构振幅的期望值；Blanc et al.,2004)计算的。
一般化学方法
在Merck硅胶60F254铝背板上进行分析薄层色谱，并通过在UV光下的荧光淬灭或通过KMnO4染色使其可视化。用硅胶60(粒度0.040-0.063mm)进行快速色谱。NMR光谱在Bruker Avance DRX 300(300MHz，1H NMR)或Varian 600(600MHz，1H NMR)下用所示溶剂记录。化学位移以在δscale上的ppm报道并参考适当的溶剂峰。MeOD含有H2O。HRESMS由MonashInstitute of Pharmaceutical Sciences Spectrometry Facility的Jason Dang使用Agilent 1290infinity 6224TOF LCMS获得。使用的柱是RRHT 2.1×50mm 1.8μm C18。在5分钟内以0.5mL/min的流速施加梯度。对于MS：气体温度为325℃；干燥气体11L/min；雾化器45psig和裂解电压(fragmentor)125V。使用2996二极管阵列检测器在Waters ZQ 3100上记录LCMS。用于评估化合物纯度的LCMS条件如下，柱：XBridge TM C18 5μm 4.6×100mm，进样体积10μL，梯度：10-100％B，10分钟(溶剂A：水0.1％甲酸；溶剂B：AcCN 0.1％甲酸)，流速：1.5mL/分钟，检测：100-600nm。所有最终化合物均使用与质谱联用的超高效液相色谱/紫外/蒸发光散射检测进行分析。除非另有说明，否则通过该方法发现所有化合物>95％纯。如先前所述制备WEHI-916(Sleebs,B.E.et al,2014a；Sleebs,B.E.et al.,2014b)。
WEHI-842的合成
试剂和条件
a)SOCl2,MeOH,18h；b)Cbz-OSu,Et3N,THF,H2O,1h；c)(Boc)2O,Et3N,THF,H2O,18h；d)LiOH,THF,H2O,4h；e)苯乙胺,HBTU,DIPEA,DMF,18h；f)4N HCl的二烷溶液,1h；g)Boc-Val-OH,HBTU,DIPEA,DMF,18h；h)4N HCl的二烷溶液,1h；i)HCl.NH2-Val-Sta-NH(CH2)2Ph8,HBTU,DIPEA,DMF,18h；j)TFA,DCM,18h。
化合物2–2HCl.NH2-Cav-OMe(2)
在0℃和氮气氛下，将亚硫酰氯(529μL，7.29mmol)逐滴添加到MeOH(8mL)中。加入H2SO4.H-Cav-OH 1(1g，3.65mmol)，并将所得悬浮液在20℃下搅拌18h。将反应混合物真空浓缩至干，得到2，为无色吸湿性残余物(920mg，99％)。1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.63(br s,2H),7.76(s,4H),4.17(t,J＝6.7Hz,1H),4.02–3.92(m,2H),3.76(s,3H),2.24–2.06(m,2H)。
化合物3–Cbz-Cav-OMe(3)
在水(4mL)和THF(5.3mL)的混合物中的2HCl.NH2-Cav-OMe 2(330mg,1.25mmol)，Et3N(262μL,1.88mmol)和Cbz-OSu(281mg,1.13mmol)的混合物在20℃下搅拌1h。反应用饱和的NaHCO3猝灭，并用EtOAc(3×20mL)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤并用MgSO4干燥。将溶剂真空浓缩以获得粗制残余物。将粗制残余物进行二氧化硅色谱法梯度洗脱，用100％DCM至20％MeOH/DCM洗脱，得到3，为无色吸湿性残余物(270mg，57％)。1H NMR(600MHz,MeOD,)δ7.39–7.24(m,5H),5.17–5.03(m,2H),4.43–4.10(m,1H),3.95–3.78(m,2H),3.77–3.59(m,3H),2.28–1.86(m,2H)。13C NMR(75MHz,MeOD)δ174.69,159.16,158.67,138.08,129.47,129.02,128.76,70.27,67.72,67.49,52.76,31.65.MS,m/z＝325.1[M+H]+。
化合物4–Cbz-Cav(N,N-Boc)-OMe(4)
在水(3mL)和THF(12mL)的混合物中的Cbz-Cav-OMe 3(270mg,0.832mmol)，Et3N(147μL,1.25mmol)和Boc-anhydride(218mg,0.999mmol)的混合物在20℃下搅拌18h。向反应混合物加入水并用EtOAc(3×10mL)萃取。将合并的有机层用MgSO4干燥并且将溶剂真空浓缩以获得粗制残余物。将粗制残余物进行二氧化硅色谱法梯度洗脱，用100％环己烷至80％EtOAc/环己烷洗脱，得到4，为无色吸湿性残余物(122mg,35％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.38–7.24(m,5H),6.10(br s,1H),5.77(d,J＝8.2Hz,1H),5.08(s,2H),4.55–4.44(m,1H),3.93–3.83(m,2H),3.76–3.60(m,3H),2.24–1.97(m,2H),1.45(d,J＝12.5Hz,9H)。13CNMR(151MHz,CDCl3)δ173.29,156.06,153.27,151.25,136.31,128.54,128.17,128.07,82.04,68.81,67.01,52.51,51.58,31.38,28.17.MS,m/z＝425.3[M+H]+。
化合物5–Cbz-Cav(N,N-Boc)-OH(5)
在水(1mL)和THF(3mL)的混合物中的Cbz-Cav(N,N-Boc)-OMe4(100mg,0.236mmol)和LiOH水合物(35mg,0.825mmol)的混合物在20℃下搅拌4h。向反应混合物中加入10％柠檬酸溶液。将溶液用EtOAc(3×10mL)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤并用MgSO4干燥。将溶剂真空浓缩以获得5，为油(96mg,99％)。1H NMR(600MHz,MeOD)δ7.39–7.23(m,5H),5.14–5.09(m,2H),4.40–4.29(m,1H),4.00(br s,2H),2.35–2.23(m,1H),2.03–1.94(m,1H),1.51(s,9H).MS,m/z＝411.3[M+H]+。
化合物6–HCl.NH2-Sta-NH(CH2)2Ph(6)
根据之前描述的程序合成化合物6(Sleebs,B.E.et al,2014a；Sleebs,B.E.etal.,2014b)。
化合物7–Boc-Val-Sta-NH(CH2)2Ph(7)
向搅拌的Boc-Val-OH(90mg，0.414mmol)的DMF(1.8mL)溶液中加入HBTU(204mg，0.538mmol)和DIPEA(361μL，2.07mmol)。将反应混合物在20℃下搅拌10min。加入过量的HCl.NH2-Sta-NH(CH2)2Ph 6(196mg，0.621mmol)，并将得到的悬浮液在20℃下搅拌18小时。反应混合物用10％柠檬酸溶液淬灭。滤出得到的沉淀，得到7，为灰白色固体(196mg，99％)。1H NMR(600MHz,MeOD)δ7.30–7.15(m,5H),4.00–3.90(m,2H),3.81(d,J＝6.8Hz,1H),3.40(t,J＝7.4Hz,2H),2.80(t,J＝7.4Hz,2H),2.31–2.20(m,2H),2.10–2.01(m,1H),1.68–1.51(m,2H),1.45(s,9H),1.37–1.27(m,1H),0.96(dd,J＝23.0,6.8Hz,6H),0.91(dd,J＝12.6,6.6Hz,6H)。13C NMR(75MHz,MeOD)δ174.56,173.86,158.20,140.52,129.78,129.48,127.32,80.79,71.14,62.44,52.28,42.04,41.76,41.68,36.49,31.30,28.75,25.81,23.69,22.32,19.99,18.52.MS,m/z＝478.6[M+H]+。
化合物8–HCl.NH2-Val-Sta-NH(CH2)2Ph(8)
将在4N HCl的二烷(0.8mL)溶液中Boc-Val-Sta-NH(CH2)2Ph 7(170mg，0.356mmol)的混合物在20℃下搅拌1h。将反应混合物真空浓缩至干燥。将油用Et2O研磨，倾析出上清液，得到8，为暗黄色固体(145mg，99％收率)。1H NMR(600MHz,MeOD)δ7.31–7.16(m,5H),4.03–3.95(m,2H),3.80(d,J＝4.8Hz,1H),3.51–3.42(m,2H),2.83(t,J＝7.4Hz,2H),2.42–2.23(m,3H),1.72–1.63(m,1H),1.58–1.51(m,1H),1.43–1.36(m,1H),1.08(dd,J＝38.2,6.9Hz,6H),0.94(dd,J＝14.4,6.6Hz,6H)。13C NMR(75MHz,MeOD)δ174.76,169.66,140.13,129.78,129.52,127.44,71.03,59.69,53.45,42.64,41.11,40.97,36.17,31.56,25.73,23.66,22.40,19.28,17.51.MS,m/z＝378.4[M+H]+。
化合物9–Cbz-Cav(N,N-Boc)-Val-Sta-NH(CH2)2Ph(9)
向搅拌的Cbz-Cav(N,N-Boc)-OH 5(50mg，0.122mmol)的DMF(1mL)溶液中加入HBTU(60mg，0.158mmol)和DIPEA(127μL，0.731mmol)。将反应混合物在20℃下搅拌10min。加入过量的HCl.NH2-Val-Sta-NH(CH2)2Ph 8(61mg，0.146mmol)，并将得到的悬浮液在20℃下搅拌18小时。将反应混合物用10％柠檬酸溶液淬灭并用EtOAc(2×10mL)萃取。然后将合并的有机层用饱和NaHCO3溶液(1×20mL)洗涤。将有机层用盐水(20mL)洗涤，用MgSO4干燥，并将溶剂真空浓缩以获得粗制残余物。将粗残余物进行二氧化硅色谱法梯度洗脱，用100％DCM至10％MeOH/DCM洗脱，得到9，为无色的油(52mg，55％)。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.42(br s,1H),7.35–7.26(m,7H),7.24–7.14(m,3H),6.86(br s,1H),6.62(br s,1H),6.25(br s,1H),6.09(br s,1H),5.14–5.03(m,2H),4.42–4.31(m,1H),4.23(t,J＝6.9Hz,1H),4.03–3.78(m,4H),3.56–3.37(m,2H),2.80(t,J＝7.3Hz,2H),2.39–1.85(m,5H),1.62–1.51(m,2H),1.51–1.41(m,9H),1.39–1.30(m,1H),0.99–0.79(m,12H)。13C NMR(75MHz,CDCl3)δ172.46,172.38,171.58,157.83,156.64,152.76,139.12,136.45,128.87,128.71,128.36,128.12,127.95,126.59,83.45,71.24,70.72,67.30,60.38,53.00,51.69,41.09,40.83,35.77,32.36,30.50,28.39,28.23,25.06,23.23,22.29,19.57,18.32.MS,m/z＝770.5[M+H]+。
WEHI-842–Cbz-Cav(NH2)-Val-Sta-NH(CH2)2Ph.TFA(WEHI-842)
在TFA(0.8mL)和DCM(0.8mL)中的Cbz-Cav(N,N-Boc)-Val-Sta-NH(CH2)2Ph 9(52mg，0.068mmol)在20℃下搅拌18h。将反应混合物真空浓缩至干燥。将油用Et2O研磨，倾析出上清液，得到WEHI-842，为无色吸湿性残余物(52mg，98％)。1H NMR(600MHz,MeOD)δ7.40–7.14(m,10H),5.11(s,2H),4.43–4.26(m,1H),4.26–4.12(m,1H),4.01–3.89(m,3H),3.46–3.33(m,2H),2.86–2.70(m,2H),2.65–2.48(m,1H),2.32–1.90(m,4H),1.68–1.43(m,2H),1.40–1.23(m,1H),1.02–0.77(m,12H)。13C NMR(75MHz,MeOD)δ174.14,173.96,173.55,160.45,158.51,140.48,137.98,129.77,129.70,129.50,129.47,129.10,128.86,127.33,74.53,71.28,67.92,60.80,53.34,52.87,42.06,41.56,41.21,36.50,31.73,31.49,25.86,23.71,22.30,19.97,18.66.MS,m/z＝670.5[M+H]+。HRMS发现为:(M+H)670.3925；C34H51N7O7需要(M+H),670.3928。
本申请中引用的所有出版物的公开内容通过引用并入本文。
在本说明书和权利要求书(如果有的话)中，词语“包含(comprising)”及其衍生词包括“包含(comprises)”和“包含(comprise)”包括所述整体中的每一个，但不排除包含一个或多个其他整体。
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依照法规，已经用或多或少特定于结构或方法特征的语言描述了本发明。应该理解的是，本发明不限于所示出或描述的具体特征，因为这里描述的手段包括使本发明生效的优选形式。因此，本发明以其由本领域技术人员适当解释的所附权利要求书(如果有的话)的适当范围内的任何形式或修改来保护。
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附录I：PLASMEPSIN V(链A和B)与WEHI-842(链C)的原子坐标
注意：本附录中的坐标描述晶体晶胞的不对称单位。
序列表
<110> 沃尔特及伊莱萨霍尔医学研究院
<120> 与抑制剂复合的plasmepsin V的结构及其用途
<130> A/16/293
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 590
<212> PRT
<213> 恶性疟原虫(分离株3D7)
<400> 1
Met Asn Asn Tyr Phe Leu Arg Lys Glu Asn Phe Phe Ile Leu Phe Cys
1 5 10 15
Phe Val Phe Val Ser Ile Phe Phe Val Ser Asn Val Thr Ile Ile Lys
20 25 30
Cys Asn Asn Val Glu Asn Lys Ile Asp Asn Val Gly Lys Lys Ile Glu
35 40 45
Asn Val Gly Lys Lys Ile Gly Asp Met Glu Asn Lys Asn Asp Asn Val
50 55 60
Glu Asn Lys Asn Asp Asn Val Gly Asn Lys Asn Asp Asn Val Lys Asn
65 70 75 80
Ala Ser Ser Asp Leu Tyr Lys Tyr Lys Leu Tyr Gly Asp Ile Asp Glu
85 90 95
Tyr Ala Tyr Tyr Phe Leu Asp Ile Asp Ile Gly Lys Pro Ser Gln Arg
100 105 110
Ile Ser Leu Ile Leu Asp Thr Gly Ser Ser Ser Leu Ser Phe Pro Cys
115 120 125
Asn Gly Cys Lys Asp Cys Gly Ile His Met Glu Lys Pro Tyr Asn Leu
130 135 140
Asn Tyr Ser Lys Thr Ser Ser Ile Leu Tyr Cys Asn Lys Ser Asn Cys
145 150 155 160
Pro Tyr Gly Leu Lys Cys Val Gly Asn Lys Cys Glu Tyr Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Cys Glu Gly Ser Gln Ile Tyr Gly Phe Tyr Phe Ser Asp Ile Val
180 185 190
Thr Leu Pro Ser Tyr Asn Asn Lys Asn Lys Ile Ser Phe Glu Lys Leu
195 200 205
Met Gly Cys His Met His Glu Glu Ser Leu Phe Leu His Gln Gln Ala
210 215 220
Thr Gly Val Leu Gly Phe Ser Leu Thr Lys Pro Asn Gly Val Pro Thr
225 230 235 240
Phe Val Asp Leu Leu Phe Lys His Thr Pro Ser Leu Lys Pro Ile Tyr
245 250 255
Ser Ile Cys Val Ser Glu His Gly Gly Glu Leu Ile Ile Gly Gly Tyr
260 265 270
Glu Pro Asp Tyr Phe Leu Ser Asn Gln Lys Glu Lys Gln Lys Met Asp
275 280 285
Lys Ser Asp Asn Asn Ser Ser Asn Lys Gly Asn Val Ser Ile Lys Leu
290 295 300
Lys Asn Asn Asp Lys Asn Asp Asp Glu Glu Asn Asn Ser Lys Asp Val
305 310 315 320
Ile Val Ser Asn Asn Val Glu Asp Ile Val Trp Gln Ala Ile Thr Arg
325 330 335
Lys Tyr Tyr Tyr Tyr Ile Lys Ile Tyr Gly Leu Asp Leu Tyr Gly Thr
340 345 350
Asn Ile Met Asp Lys Lys Glu Leu Asp Met Leu Val Asp Ser Gly Ser
355 360 365
Thr Phe Thr His Ile Pro Glu Asn Ile Tyr Asn Gln Ile Asn Tyr Tyr
370 375 380
Leu Asp Ile Leu Cys Ile His Asp Met Thr Asn Ile Tyr Glu Ile Asn
385 390 395 400
Lys Arg Leu Lys Leu Thr Asn Glu Ser Leu Asn Lys Pro Leu Val Tyr
405 410 415
Phe Glu Asp Phe Lys Thr Ala Leu Lys Asn Ile Ile Gln Asn Glu Asn
420 425 430
Leu Cys Ile Lys Ile Val Asp Gly Val Gln Cys Trp Lys Ser Leu Glu
435 440 445
Asn Leu Pro Asn Leu Tyr Ile Thr Leu Ser Asn Asn Tyr Lys Met Ile
450 455 460
Trp Lys Pro Ser Ser Tyr Leu Tyr Lys Lys Glu Ser Phe Trp Cys Lys
465 470 475 480
Gly Leu Glu Lys Gln Val Asn Asn Lys Pro Ile Leu Gly Leu Thr Phe
485 490 495
Phe Lys Asn Lys Gln Val Ile Phe Asp Leu Gln Gln Asn Gln Ile Ala
500 505 510
Phe Ile Glu Ser Lys Cys Pro Ser Asn Leu Thr Ser Ser Arg Pro Arg
515 520 525
Thr Phe Asn Glu Tyr Arg Glu Lys Glu Asn Ile Phe Leu Lys Val Ser
530 535 540
Tyr Ile Asn Leu Tyr Cys Leu Trp Leu Leu Leu Ala Leu Thr Ile Leu
545 550 555 560
Leu Ser Leu Ile Leu Tyr Val Arg Lys Met Phe Tyr Met Asp Tyr Phe
565 570 575
Pro Leu Ser Asp Gln Asn Lys Ser Pro Ile Gln Glu Ser Thr
580 585 590
<210> 2
<211> 536
<212> PRT
<213> 间日疟原虫(株Salvador I)
<400> 2
Met Val Gly Ala Ser Leu Gly Pro Pro Gly Arg Gly Ser Leu Ser Arg
1 5 10 15
Leu Ile Arg Leu Val Ile Cys Val Leu Thr Leu Cys Ala Leu Ser Val
20 25 30
Gln Gly Arg Ser Glu Ser Thr Glu Gly His Ser Lys Asp Leu Leu Tyr
35 40 45
Lys Tyr Lys Leu Tyr Gly Asp Ile Asp Glu Tyr Ala Tyr Tyr Phe Leu
50 55 60
Asp Ile Asp Ile Gly Thr Pro Glu Gln Arg Ile Ser Leu Ile Leu Asp
65 70 75 80
Thr Gly Ser Ser Ser Leu Ser Phe Pro Cys Ala Gly Cys Lys Asn Cys
85 90 95
Gly Val His Met Glu Asn Pro Phe Asn Leu Asn Asn Ser Lys Thr Ser
100 105 110
Ser Ile Leu Tyr Cys Glu Asn Glu Glu Cys Pro Phe Lys Leu Asn Cys
115 120 125
Val Lys Gly Lys Cys Glu Tyr Met Gln Ser Tyr Cys Glu Gly Ser Gln
130 135 140
Ile Ser Gly Phe Tyr Phe Ser Asp Val Val Ser Val Val Ser Tyr Asn
145 150 155 160
Asn Glu Arg Val Thr Phe Arg Lys Leu Met Gly Cys His Met His Glu
165 170 175
Glu Ser Leu Phe Leu Tyr Gln Gln Ala Thr Gly Val Leu Gly Met Ser
180 185 190
Leu Ser Lys Pro Gln Gly Ile Pro Thr Phe Val Asn Leu Leu Phe Asp
195 200 205
Asn Ala Pro Gln Leu Lys Gln Val Phe Thr Ile Cys Ile Ser Glu Asn
210 215 220
Gly Gly Glu Leu Ile Ala Gly Gly Tyr Asp Pro Ala Tyr Ile Val Arg
225 230 235 240
Arg Gly Gly Ser Lys Ser Val Ser Gly Gln Gly Ser Gly Pro Val Ser
245 250 255
Glu Ser Leu Ser Glu Ser Gly Glu Asp Pro Gln Val Ala Leu Arg Glu
260 265 270
Ala Glu Lys Val Val Trp Glu Asn Val Thr Arg Lys Tyr Tyr Tyr Tyr
275 280 285
Ile Lys Val Arg Gly Leu Asp Met Phe Gly Thr Asn Met Met Ser Ser
290 295 300
Ser Lys Gly Leu Glu Met Leu Val Asp Ser Gly Ser Thr Phe Thr His
305 310 315 320
Ile Pro Glu Asp Leu Tyr Asn Lys Leu Asn Tyr Phe Phe Asp Ile Leu
325 330 335
Cys Ile Gln Asp Met Asn Asn Ala Tyr Asp Val Asn Lys Arg Leu Lys
340 345 350
Met Thr Asn Glu Ser Phe Asn Asn Pro Leu Val Gln Phe Asp Asp Phe
355 360 365
Arg Lys Ser Leu Lys Ser Ile Ile Ala Lys Glu Asn Met Cys Val Lys
370 375 380
Ile Val Asp Gly Val Gln Cys Trp Lys Tyr Leu Glu Gly Leu Pro Asp
385 390 395 400
Leu Phe Val Thr Leu Ser Asn Asn Tyr Lys Met Lys Trp Gln Pro His
405 410 415
Ser Tyr Leu Tyr Lys Lys Glu Ser Phe Trp Cys Lys Gly Ile Glu Lys
420 425 430
Gln Val Asn Asn Lys Pro Ile Leu Gly Leu Thr Phe Phe Lys Asn Arg
435 440 445
Gln Val Ile Phe Asp Ile Gln Lys Asn Arg Ile Gly Phe Val Asp Ala
450 455 460
Asn Cys Pro Ser His Pro Thr His Thr Arg Pro Arg Thr Tyr Asn Glu
465 470 475 480
Tyr Lys Arg Lys Asp Asn Ile Phe Leu Lys Ile Pro Phe Phe Tyr Leu
485 490 495
Tyr Ser Leu Phe Val Val Phe Ala Leu Ser Val Leu Leu Ser Leu Val
500 505 510
Phe Tyr Val Arg Arg Leu Tyr His Met Glu Tyr Ser Pro Leu Pro Ser
515 520 525
Glu Gly Lys Ala Pro Ala Asp Ala
530 535
<210> 3
<211> 1686
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组间日疟原虫plasmepsin V的核苷酸序列（包括包含FLAG标签、SUMO结构域和TEV蛋白酶切割位点的融合标签）
<400> 3
gactacaaag acgatgacga caaggggtcc ctgcaggact cagaagtcaa tcaagaagct 60
aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat 120
ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa 180
gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg gactccttaa cgttcttgta cgacggtatt 240
gaaattcaag ctgatcagac ccctgaagat ttggacatgg aggataacga tattattgag 300
gctcacagag aacagattgg aggtgagaac ttgtacttcc aaggtacccg ttccgagtct 360
accgagggcc actccaagga cctgctgtac aagtacaagc tgtacggcga catcgacgag 420
tacgcttact acttcctgga catcgacatc ggcacccccg agcagcgcat ctccctgatc 480
ctggataccg gttcctccag cctgtccttc ccttgcgctg gttgcaagaa ctgcggtgtc 540
cacatggaaa accccttcaa cctgaacaac tccaagacct cctccatcct gtactgcgag 600
aacgaggaat gccctttcaa gctgaactgc gtgaagggca agtgcgagta catgcagtcc 660
tactgcgagg gttcccagat ctccggtttc tacttctccg acgtggtgtc cgtcgtgtcc 720
tacaacaacg agcgtgtgac cttccgcaag ctgatgggtt gccacatgca cgaagagtcc 780
ctgttcctct accagcaagc taccggcgtg ctgggcatgt ccctgtccaa gcctcagggt 840
atccccacct tcgtgaacct gctgttcgac aacgctcccc agctgaagca agtgttcacc 900
atctgcatct ccgagaacgg tggcgagctg atcgctggtg gttacgaccc cgcttacatc 960
gtgcgtcgtg gtggttccaa gtccgtgtcc ggccagggtt ctggtcctgt gtccgagtct 1020
ctgtctgagt ccggcgagga cccccaagtg gctctgaggg aagctgagaa ggtcgtgtgg 1080
gagaacgtga cccgcaagta ctactactac atcaaagtgc gcggcctgga catgttcggc 1140
accaacatga tgtcctccag caagggcctg gaaatgctgg tggattccgg ctccaccttc 1200
acccacatcc ccgaggacct gtacaacaag ctcaactact tcttcgacat cctgtgcatc 1260
caagacatga acaacgccta cgacgtgaac aagcgtctga agatgaccaa cgagtccttc 1320
aacaaccccc tggtgcagtt cgacgatttc cgcaagtccc tgaagtccat catcgccaag 1380
gaaaatatgt gcgtgaagat cgtggacggc gtgcagtgct ggaagtacct ggaaggcctg 1440
cccgacctgt tcgtgaccct gtctaacaac tacaagatga agtggcagcc ccactcctac 1500
ctctacaaga aggaatcttt ctggtgcaag ggcatcgaga agcaagtcaa caacaagcct 1560
atcctgggcc tgaccttctt caagaaccgt caagtgatct tcgatatcca gaagaaccgc 1620
atcggtttcg tggacgctaa ctgcccctcc caccctaccc acactcgtcc tagataataa 1680
ctcgag 1686
<210> 4
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有用于插入pTriex2载体的KPNI和XhoI限制位点的Geneart合成基因
<400> 4
ggtacccgtt ccgagtctac cgagggccac tccaaggacc tgctgtacaa gtacaagctg 60
tacggcgaca tcgacgagta cgcttactac ttcctggaca tcgacatcgg cacccccgag 120
cagcgcatct ccctgatcct ggataccggt tcctccagcc tgtccttccc ttgcgctggt 180
tgcaagaact gcggtgtcca catggaaaac cccttcaacc tgaacaactc caagacctcc 240
tccatcctgt actgcgagaa cgaggaatgc cctttcaagc tgaactgcgt gaagggcaag 300
tgcgagtaca tgcagtccta ctgcgagggt tcccagatct ccggtttcta cttctccgac 360
gtggtgtccg tcgtgtccta caacaacgag cgtgtgacct tccgcaagct gatgggttgc 420
cacatgcacg aagagtccct gttcctctac cagcaagcta ccggcgtgct gggcatgtcc 480
ctgtccaagc ctcagggtat ccccaccttc gtgaacctgc tgttcgacaa cgctccccag 540
ctgaagcaag tgttcaccat ctgcatctcc gagaacggtg gcgagctgat cgctggtggt 600
tacgaccccg cttacatcgt gcgtcgtggt ggttccaagt ccgtgtccgg ccagggttct 660
ggtcctgtgt ccgagtctct gtctgagtcc ggcgaggacc cccaagtggc tctgagggaa 720
gctgagaagg tcgtgtggga gaacgtgacc cgcaagtact actactacat caaagtgcgc 780
ggcctggaca tgttcggcac caacatgatg tcctccagca agggcctgga aatgctggtg 840
gattccggct ccaccttcac ccacatcccc gaggacctgt acaacaagct caactacttc 900
ttcgacatcc tgtgcatcca agacatgaac aacgcctacg acgtgaacaa gcgtctgaag 960
atgaccaacg agtccttcaa caaccccctg gtgcagttcg acgatttccg caagtccctg 1020
aagtccatca tcgccaagga aaatatgtgc gtgaagatcg tggacggcgt gcagtgctgg 1080
aagtacctgg aaggcctgcc cgacctgttc gtgaccctgt ctaacaacta caagatgaag 1140
tggcagcccc actcctacct ctacaagaag gaatctttct ggtgcaaggg catcgagaag 1200
caagtcaaca acaagcctat cctgggcctg accttcttca agaaccgtca agtgatcttc 1260
gatatccaga agaaccgcat cggtttcgtg gacgctaact gcccctccca ccctacccac 1320
actcgtccta gataataact cgag 1344
<210> 5
<211> 558
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含N-末端gp67信号肽和由FLAG标签、SUMO结构域和烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点组成的融合标签的重组间日疟蛋白质plasmepsin V
<400> 5
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val
1 5 10 15
Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr
20 25 30
His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys
35 40 45
Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys
50 55 60
Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Asp Gly Ile
65 70 75 80
Glu Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn
85 90 95
Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly Glu Asn Leu Tyr
100 105 110
Phe Gln Gly Thr Arg Ser Glu Ser Thr Glu Gly His Ser Lys Asp Leu
115 120 125
Leu Tyr Lys Tyr Lys Leu Tyr Gly Asp Ile Asp Glu Tyr Ala Tyr Tyr
130 135 140
Phe Leu Asp Ile Asp Ile Gly Thr Pro Glu Gln Arg Ile Ser Leu Ile
145 150 155 160
Leu Asp Thr Gly Ser Ser Ser Leu Ser Phe Pro Cys Ala Gly Cys Lys
165 170 175
Asn Cys Gly Val His Met Glu Asn Pro Phe Asn Leu Asn Asn Ser Lys
180 185 190
Thr Ser Ser Ile Leu Tyr Cys Glu Asn Glu Glu Cys Pro Phe Lys Leu
195 200 205
Asn Cys Val Lys Gly Lys Cys Glu Tyr Met Gln Ser Tyr Cys Glu Gly
210 215 220
Ser Gln Ile Ser Gly Phe Tyr Phe Ser Asp Val Val Ser Val Val Ser
225 230 235 240
Tyr Asn Asn Glu Arg Val Thr Phe Arg Lys Leu Met Gly Cys His Met
245 250 255
His Glu Glu Ser Leu Phe Leu Tyr Gln Gln Ala Thr Gly Val Leu Gly
260 265 270
Met Ser Leu Ser Lys Pro Gln Gly Ile Pro Thr Phe Val Asn Leu Leu
275 280 285
Phe Asp Asn Ala Pro Gln Leu Lys Gln Val Phe Thr Ile Cys Ile Ser
290 295 300
Glu Asn Gly Gly Glu Leu Ile Ala Gly Gly Tyr Asp Pro Ala Tyr Ile
305 310 315 320
Val Arg Arg Gly Gly Ser Lys Ser Val Ser Gly Gln Gly Ser Gly Pro
325 330 335
Val Ser Glu Ser Leu Ser Glu Ser Gly Glu Asp Pro Gln Val Ala Leu
340 345 350
Arg Glu Ala Glu Lys Val Val Trp Glu Asn Val Thr Arg Lys Tyr Tyr
355 360 365
Tyr Tyr Ile Lys Val Arg Gly Leu Asp Met Phe Gly Thr Asn Met Met
370 375 380
Ser Ser Ser Lys Gly Leu Glu Met Leu Val Asp Ser Gly Ser Thr Phe
385 390 395 400
Thr His Ile Pro Glu Asp Leu Tyr Asn Lys Leu Asn Tyr Phe Phe Asp
405 410 415
Ile Leu Cys Ile Gln Asp Met Asn Asn Ala Tyr Asp Val Asn Lys Arg
420 425 430
Leu Lys Met Thr Asn Glu Ser Phe Asn Asn Pro Leu Val Gln Phe Asp
435 440 445
Asp Phe Arg Lys Ser Leu Lys Ser Ile Ile Ala Lys Glu Asn Met Cys
450 455 460
Val Lys Ile Val Asp Gly Val Gln Cys Trp Lys Tyr Leu Glu Gly Leu
465 470 475 480
Pro Asp Leu Phe Val Thr Leu Ser Asn Asn Tyr Lys Met Lys Trp Gln
485 490 495
Pro His Ser Tyr Leu Tyr Lys Lys Glu Ser Phe Trp Cys Lys Gly Ile
500 505 510
Glu Lys Gln Val Asn Asn Lys Pro Ile Leu Gly Leu Thr Phe Phe Lys
515 520 525
Asn Arg Gln Val Ile Phe Asp Ile Gln Lys Asn Arg Ile Gly Phe Val
530 535 540
Asp Ala Asn Cys Pro Ser His Pro Thr His Thr Arg Pro Arg
545 550 555
<210> 6
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TEV切割后的重组间日疟原虫plasmepsin V(残基35至476)
<400> 6
Gly Thr Arg Ser Glu Ser Thr Glu Gly His Ser Lys Asp Leu Leu Tyr
1 5 10 15
Lys Tyr Lys Leu Tyr Gly Asp Ile Asp Glu Tyr Ala Tyr Tyr Phe Leu
20 25 30
Asp Ile Asp Ile Gly Thr Pro Glu Gln Arg Ile Ser Leu Ile Leu Asp
35 40 45
Thr Gly Ser Ser Ser Leu Ser Phe Pro Cys Ala Gly Cys Lys Asn Cys
50 55 60
Gly Val His Met Glu Asn Pro Phe Asn Leu Asn Asn Ser Lys Thr Ser
65 70 75 80
Ser Ile Leu Tyr Cys Glu Asn Glu Glu Cys Pro Phe Lys Leu Asn Cys
85 90 95
Val Lys Gly Lys Cys Glu Tyr Met Gln Ser Tyr Cys Glu Gly Ser Gln
100 105 110
Ile Ser Gly Phe Tyr Phe Ser Asp Val Val Ser Val Val Ser Tyr Asn
115 120 125
Asn Glu Arg Val Thr Phe Arg Lys Leu Met Gly Cys His Met His Glu
130 135 140
Glu Ser Leu Phe Leu Tyr Gln Gln Ala Thr Gly Val Leu Gly Met Ser
145 150 155 160
Leu Ser Lys Pro Gln Gly Ile Pro Thr Phe Val Asn Leu Leu Phe Asp
165 170 175
Asn Ala Pro Gln Leu Lys Gln Val Phe Thr Ile Cys Ile Ser Glu Asn
180 185 190
Gly Gly Glu Leu Ile Ala Gly Gly Tyr Asp Pro Ala Tyr Ile Val Arg
195 200 205
Arg Gly Gly Ser Lys Ser Val Ser Gly Gln Gly Ser Gly Pro Val Ser
210 215 220
Glu Ser Leu Ser Glu Ser Gly Glu Asp Pro Gln Val Ala Leu Arg Glu
225 230 235 240
Ala Glu Lys Val Val Trp Glu Asn Val Thr Arg Lys Tyr Tyr Tyr Tyr
245 250 255
Ile Lys Val Arg Gly Leu Asp Met Phe Gly Thr Asn Met Met Ser Ser
260 265 270
Ser Lys Gly Leu Glu Met Leu Val Asp Ser Gly Ser Thr Phe Thr His
275 280 285
Ile Pro Glu Asp Leu Tyr Asn Lys Leu Asn Tyr Phe Phe Asp Ile Leu
290 295 300
Cys Ile Gln Asp Met Asn Asn Ala Tyr Asp Val Asn Lys Arg Leu Lys
305 310 315 320
Met Thr Asn Glu Ser Phe Asn Asn Pro Leu Val Gln Phe Asp Asp Phe
325 330 335
Arg Lys Ser Leu Lys Ser Ile Ile Ala Lys Glu Asn Met Cys Val Lys
340 345 350
Ile Val Asp Gly Val Gln Cys Trp Lys Tyr Leu Glu Gly Leu Pro Asp
355 360 365
Leu Phe Val Thr Leu Ser Asn Asn Tyr Lys Met Lys Trp Gln Pro His
370 375 380
Ser Tyr Leu Tyr Lys Lys Glu Ser Phe Trp Cys Lys Gly Ile Glu Lys
385 390 395 400
Gln Val Asn Asn Lys Pro Ile Leu Gly Leu Thr Phe Phe Lys Asn Arg
405 410 415
Gln Val Ile Phe Asp Ile Gln Lys Asn Arg Ile Gly Phe Val Asp Ala
420 425 430
Asn Cys Pro Ser His Pro Thr His Thr Arg Pro Arg
435 440
<210> 7
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自包含PEXEL序列RTLAQ的knob相关富含组氨酸的蛋白质（KAHRP）的肽
<400> 7
Asp Ala Asx Cys Tyr Leu Arg Asn Lys Arg Thr Leu Ala Gln Lys Gln
1 5 10 15
Glu Glu Asp Ala Asn Ser
20
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自包含PEXEL变体序列KTLAQ的knob相关富含组氨酸的蛋白质（KAHRP）的肽
<400> 8
Asp Ala Asx Cys Tyr Leu Arg Asn Lys Lys Thr Leu Ala Gln Lys Gln
1 5 10 15
Glu Glu Asp Ala Asn Ser
20
<210> 9
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自包含变体PEXEL序列RTIAQ的knob相关富含组氨酸的蛋白质（KAHRP）的肽
<400> 9
Asp Ala Asx Cys Tyr Leu Arg Asn Lys Arg Thr Ile Ala Gln Lys Gln
1 5 10 15
Glu Glu Asp Ala Asn Ser
20

Claims (29)

1.结晶形式的plasmepsin V/WEHI-842复合物或其衍生物、同源物、组分和/或可溶形式。
2.鉴定、设计和/或筛选能够潜在地与plasmepsin V相互作用的化合物的方法，包括基于化合物与由附录I的原子坐标或其子集定义的plasmepsin V结构的相互作用进行化合物的基于结构的鉴定、设计和/或筛选。
3.鉴定、设计和/或筛选能够潜在地模拟与plasmepsin V相互作用的WEHI-842的化合物的方法，该方法包括：基于(i)化合物与plasmepsin V结构的相互作用和/或(ii)化合物与由附录I的原子坐标或其子集定义的plasmepsin V结构复合的WEHI-842结构的相似性，进行化合物的基于结构的鉴定、设计和/或筛选。
4.鉴定抑制剂化合物的方法，抑制剂化合物包含选自抗体、抗原结合片段、肽、非肽分子和化学化合物的实体，其中所述抑制剂化合物能够阻断由于与plasmepsin V的相互作用而产生的生物活性，其中所述方法包括：
基于对应于附录I的原子坐标或其子集的与WEHI-842复合的plasmepsin V的构象，引入限定相互作用表面的合适的计算机程序参数，其中所述程序显示相互作用表面的三维模型；
在所述计算机程序中创建测试化合物的三维结构；
在相互作用表面的三维模型上显示所述测试化合物的叠加模型；
评估所述测试化合物的所述叠加模型是否在空间上和任选地能量上适合结合位点；
任选地，合成所述测试化合物；
任选地，将所述测试化合物并入在生物活性测定中；和
任选地，确定所述测试化合物是否抑制plasmepsin V的生物活性。
5.根据权利要求2的方法鉴定、设计或筛选的化合物。
6.根据权利要求3的方法鉴定、设计或筛选的化合物。
7.根据权利要求4的方法鉴定、设计或筛选的化合物。
8.附录I所示的原子坐标集合或其子集，至少代表：
(i)plasmepsin V的酶结构域；
(ii)plasmepsin V的N末端亚结构域；
(iii)plasmepsin V的C末端亚结构域；
(iv)plasmepsin V的底物结合位点；
(v)plasmepsin V的N末端亚结构域的瓣；
(vi)与WEHI-842复合的瓣的一个或多个区域；和/或
(vii)与WEHI-842复合的底物结合位点的一个或多个区域。
9.附录I所示的原子坐标或其子集在鉴定、设计和/或筛选化合物中的用途，该原子坐标或其子集至少代表：
(i)WEHI-842；和/或
(ii)与plasmepsin V的一个或多个区域复合的WEHI-842的一个或多个区域，
该化合物能够潜在地模拟与plasmepsin V相互作用的WEHI-842，该用途包括：基于(a)化合物与plasmepsin V结构的相互作用和/或(b)化合物与由该原子坐标或其子集定义的plasmepsin V结构复合的WEHI-842结构的相似性，进行化合物的基于结构的鉴定、设计和/或筛选。
10.附录I所示的原子坐标或其子集在鉴定、设计和/或筛选化合物中的用途，该原子坐标或其子集至少代表：
(i)plasmepsin V的酶结构域；
(ii)plasmepsin V的N末端亚结构域；
(iii)plasmepsin V的C末端亚结构域；
(iv)plasmepsin V的底物结合位点；
(v)plasmepsin V的N末端亚结构域的瓣；
(vi)与WEHI-842复合的瓣的一个或多个区域；和/或
(vii)与WEHI-842复合的底物结合位点的一个或多个区域，
该化合物能够潜在地与plasmepsin V相互作用，该用途包括基于化合物与由原子坐标或其子集定义的plasmepsin V结构的相互作用进行化合物的基于结构的鉴定、设计和/或筛选。
11.根据权利要求9的用途鉴定、设计或筛选的化合物。
12.根据权利要求10的用途鉴定、设计或筛选的化合物。
13.位点抑制剂，其包括选自plasmepsin V的44至240和273至470的一个或多个氨基酸，包括选自以下的一个或多个氨基酸：Tyr59,Ala60,Ile78,Asp80,Gly82,Tyr139,Cys140,Glu141,Phe180,Gln183,Val188,Asp313,Gly315和Thr317。
14.重新设计化合物的方法，已知化合物与plasmepsin V结合，该方法包括基于结构评估化合物与由附录I的原子坐标或其子集定义的与plasmepsin V复合的WEHI-842结构的相似性，和作为评估的结果，重新设计或化学修饰化合物。
15.重新设计化合物的方法，已知化合物与plasmepsin V结合，该方法包括基于化合物与由附录I的原子坐标或其子集定义的plasmepsin V结构的相互作用进行化合物的基于结构的评估，和作为评估的结果，重新设计或化学修饰化合物。
16.用于鉴定能够潜在地与plasmepsin V相互作用的一种或多种化合物的计算机系统，该系统含有代表以下结构的数据：
(a)plasmepsin V的底物结合位点，结构由附录I中所示的原子坐标子集定义；
(b)plasmepsin V的瓣，结构由附录I中所示的原子坐标子集定义；
(c)WEHI-842上的底物结合位点表面，结构由附录I中所示的原子坐标子集定义；
(d)WEHI-842上的瓣相互作用表面，结构由附录I中所示的原子坐标子集定义；和/或
(e)其组合，结构由附录I中所示的原子坐标或其子集定义。
17.计算机可读介质，其上记录有附录I中所示的代表模型和/或原子坐标或其原子坐标的子集的数据，该模型和/或原子坐标至少代表：
(i)plasmepsin V的酶结构域；
(ii)plasmepsin V的N末端亚结构域；
(iii)plasmepsin V的C末端亚结构域；
(iv)plasmepsin V的底物结合位点；
(v)plasmepsin V的N末端亚结构域的瓣；
(vi)与WEHI-842复合的瓣的一个或多个区域；
(vii)与WEHI-842复合的底物结合位点的一个或多个区域；
(viii)与plasmepsin V复合的WEHI-842的一个或多个区域；
(ix)与底物结合位点复合的WEHI-842的一个或多个区域；和/或
(x)与瓣复合的WEHI-842的一个或多个区域。
18.鉴定潜在地与plasmepsin V相互作用的化合物的计算机辅助方法，所述方法包括将候选化合物的结构与以下结构进行拟合：
(a)plasmepsin V的底物结合位点，结构由附录I中所示的原子坐标子集定义；和/或
(b)plasmepsin V的部分，优选包括瓣，结构由附录I中所示的原子坐标子集定义。
19.使用包含处理器的编程计算机来鉴定能够与plasmepsin V相互作用的分子的计算机辅助方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使用计算机方法产生结构的原子坐标集合，该结构具有与以下结构的原子坐标的能量上有利的相互作用：
(i)plasmepsin V的底物结合位点，结构由附录I中所示的原子坐标子集定义；和/或
(ii)plasmepsin V的至少部分，优选包括瓣，结构由附录I中所示的原子坐标的子集定义，所述坐标被输入到计算机中，由此生成标准数据集；
(b)使用处理器将标准数据集与化学结构的计算机数据库进行比较；
(c)使用计算机方法从数据库中选择与标准数据集的区域互补或类似的化学结构；和
(d)任选地，将与标准数据集的区域互补或类似的所选化学结构输出至输出设备。
20.使用包括处理器的编程计算机来鉴定WEHI-842的潜在模拟物的计算机辅助方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从以下的原子坐标集合生成标准数据集：
(i)plasmepsin V的底物结合位点，结构由附录I中所示的原子坐标子集定义；
(ii)plasmepsin V的至少一部分，优选包括瓣，结构由附录I所示的原子坐标子集定义；和/或WEHI-842，该结构由附录I中所示的原子坐标的子集定义，所述坐标被输入到计算机中；
(b)：(i)使用处理器将标准数据集与存储在计算机数据存储系统中的化学结构的计算机数据库进行比较，并且使用计算机方法从数据库中选择具有与标准数据集结构相似的区域的化学结构；或者
(ii)使用计算机方法构建具有与标准数据集结构相似的区域的化学结构的模型；和
(c)任选地，将以下内容输出至输出设备：
(i)来自步骤(b)(i)的具有与标准数据集相似的区域的所选化学结构；或者
(ii)步骤(b)(ii)中构建的模型。
21.评估化合物与plasmepsin V相互作用的能力的方法，该方法包括以下步骤：
(a)采用计算手段来执行：
(i)化合物与plasmepsin V上的WEHI-842的底物结合位点的计算机模型的结合表面之间的拟合操作；和/或
(ii)化合物与WEHI-842、plasmepsin V上的WEHI-842的底物结合位点或其部分之间的重叠操作，其使用原子坐标，其中该原子坐标与至少代表plasmepsin V的底物结合位点或其部分，瓣或其部分，plasmepsin V或WEHI-842的附录I的原子坐标的子集或其一个或多个的原子坐标的子集之间的均方根偏差不超过和
(b)分析拟合操作和/或叠加操作的结果以定量化合物与结合表面模型之间的缔合。
22.使用分子置换来获得关于未知结构的分子或分子复合物的结构信息的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)产生结晶的分子或分子复合物的X射线衍射图案；和
(ii)将至少代表plasmepsin V、plasmepsin V的底物结合位点、plasmepsin V的瓣、WEHI-842、其模拟物、其衍生物或其部分的附录I的原子坐标或其原子坐标的子集应用于X射线衍射图案，生成结构未知的分子或分子复合物的至少一个区域的三维电子密度图谱。
23.式I的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
E是O或S；
R1是-Z-C(R9)-R10,-Z-C(R9)-C(O)-R10；-Z-C(R9)-C(O)-N(R11)-R10；
Z是键，O,S或N(R12)；
R2是-C(R7)2-C(R7)2-,-CR7＝CR7-或
R3选自氢，-C1-7烷基,-C1-7卤代烷基,-C2-7烯基,-C2-7炔基,-C0-7烷基OH,-C0-7烷基CO2H,-C0-7烷基CONH2,-C0-7烷基NH2,-C0-7烷基SH,-C0-4烷基SC1-4烷基,-C0-6烷基NHC(＝NH)NH2,-C0-6烷基芳基,-C0-6烷基环烷基,-C0-6烷基杂环基,和–C0-6烷基杂芳基；其中烷基,烯基或炔基任选地被卤基,羟基,羧基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2和–NH烷基中的一种或多种取代；并且其中芳基,环烷基,杂环基或杂芳基任选地被卤基,羟基,羧基,烷基,烯基,炔基,卤代烷基,羟基烷基,烷氧基,卤代烷氧基,-CO-烷基,-烷基-CO-烷基,-CO-O-烷基,-烷基-CO-O-烷基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2,–NH烷基,-烷基-CONH2,-烷基-CON(烷基)2,-烷基-CONH烷基,-烷基-NH2,-烷基-N(烷基)2和–烷基-NH烷基中的一种或多种取代；
R4是任选地被卤基,羟基或取代的支化的烷基；
n是0-7的整数；
R5是氢，烷基或卤代烷基；
R6是-C(R14)-R15,-C(R14)-C(O)-R15；-C(R14)-C(O)-N(R16)-R15；
R7各自独立地为氢，卤素或羟基；
R8各自独立地为氢，卤素或羟基；
R9选自氢，-C1-7烷基,-C1-7卤代烷基,-C2-7烯基,-C2-7炔基,-C0-7烷基OH,-C0-7烷基CO2H,-C0-7烷基CONH2,-C0-7烷基NH2,-C0-7烷基SH,-C0-4烷基SC1-4烷基,-C0-6烷基NHC(＝NH)NH2,-C0-6烷基芳基,-C0-6烷基环烷基,-C0-6烷基杂环基,和–C0-6烷基杂芳基；其中烷基,烯基或炔基任选地被卤基,羟基,羧基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2和–NH烷基中的一种或多种取代；并且其中芳基,环烷基,杂环基或杂芳基任选地被卤基,羟基,羧基,烷基,烯基,炔基,卤代烷基,羟基烷基,烷氧基,卤代烷氧基,-CO-烷基,-烷基-CO-烷基,-CO-O-烷基,-烷基-CO-O-烷基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2,–NH烷基,-烷基-CONH2,-烷基-CON(烷基)2,-烷基-CONH烷基,-烷基-NH2,-烷基-N(烷基)2和–烷基-NH烷基中的一种或多种取代；
R10选自氢，-R13,-烷基-R13,-烯基-R13和炔基-R13；其中烷基，烯基或炔基任选地被卤基,羟基,羧基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2和–NH烷基中的一种或多种取代；
R11是氢，烷基或卤代烷基；
R12是氢，烷基或卤代烷基；
R13是氢，芳基，环烷基，杂环基或杂芳基；其中芳基，环烷基，杂环基或杂芳基任选地被一个或多个R18取代；
R14选自氢，-C1-7烷基,-C1-7卤代烷基,-C2-7烯基,-C2-7炔基,-C0-7烷基OH,-C0-7烷基CO2H,-C0-7烷基CONH2,-C0-7烷基NH2,-C0-7烷基SH,-C0-4烷基SC1-4烷基,-C0-6烷基NHC(＝NH)NH2,-C0-6烷基芳基,-C0-6烷基环烷基,-C0-6烷基杂环基,和–C0-6烷基杂芳基；其中烷基,烯基或炔基任选地被卤基,羟基,羧基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2和–NH烷基中的一种或多种取代；并且其中芳基,环烷基,杂环基或杂芳基任选地被卤基,羟基,羧基,烷基,烯基,炔基,卤代烷基,羟基烷基,烷氧基,卤代烷氧基,-CO-烷基,-烷基-CO-烷基,-CO-O-烷基,-烷基-CO-O-烷基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2,–NH烷基,-烷基-CONH2,-烷基-CON(烷基)2,-烷基-CONH烷基,-烷基-NH2,-烷基-N(烷基)2和–烷基-NH烷基中的一种或多种取代；
R15选自氢，-R17,-烷基-R17,-烯基-R17和炔基-R17；其中烷基,烯基或炔基任选地被卤基,羟基,羧基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2和–NH烷基中的一种或多种取代；
R16是氢，烷基或卤代烷基；
R17是氢，芳基，环烷基，杂环基或杂芳基；其中芳基，环烷基，杂环基或杂芳基任选地被一个或多个R19取代；
R18选自卤基,羟基,羧基,烷基,烯基,炔基,卤代烷基,羟基烷基,烷氧基,卤代烷氧基,-CO-烷基,-烷基-CO-烷基,-CO-O-烷基,-烷基-CO-O-烷基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2,–NH烷基,-烷基-CONH2,-烷基-CON(烷基)2,-烷基-CONH烷基,-烷基-NH2,-烷基-N(烷基)2和–烷基-NH烷基；和
R19选自卤基,羟基,羧基,烷基,烯基,炔基,卤代烷基,羟基烷基,烷氧基,卤代烷氧基,-CO-烷基,-烷基-CO-烷基,-CO-O-烷基,-烷基-CO-O-烷基,-CONH2,-CON(烷基)2,-CONH烷基,-NH2,-N(烷基)2,–NH烷基,-烷基-CONH2,-烷基-CON(烷基)2,-烷基-CONH烷基,-烷基-NH2,-烷基-N(烷基)2和–烷基-NH烷基。
24.药物组合物，其包含权利要求5至7、11、12和23任一项的化合物或其药学上可接受的盐。
25.预防或治疗疟疾的方法，该方法包括向受试者施用权利要求5至7、11、12和23中任一项的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求24的药物组合物。
26.权利要求5至7、11、12和23中任一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防疟疾的药物中的用途。
27.权利要求5至7、11、12和23中任一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防与疟原虫属的某些种相关的疾病或病症的药物中的用途。
28.治疗或预防与疟原虫的某些种有关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用权利要求5至7、11、12和23中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求24的药物组合物。
29.抑制plasmepsin V的方法，该方法包括使plasmepsin V与权利要求5至7、11、12和23中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐接触的步骤。
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