JP2013224293A - 癌細胞増殖抑制に用いられるリン脂質輸送タンパク質(plscr)抑制方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明に係るPLSCR−抑制剤は、癌細胞中PLSCRの含有量及び/或いはPLSCRの生物活性を低減できる化合物であり、例えば、PLSCR−特異性モノクローナル抗体や拮抗薬或いは核酸である。
【選択図】図1
Description
化学治療は、一般として、細胞(例えば、増殖細胞)に対して毒性を有する非選択性薬剤であり、このような薬剤は、有効に、癌細胞を殺すことができるが、健康細胞も殺し、そのため、有害の副作用が発生する。
スクランブラーゼ(Scramblases)は、一群の、知られた、フリッパーゼ(flippases)と称された膜透過脂質トランスポーター家族の一つである。リン脂質輸送タンパク質において、よく研究された一つは、リン脂質輸送タンパク質1(PLSCR1;UniProt accession No.O15162)(タンパク質分子量が、37 kDaである)は、細胞膜リン脂質を、快速的にCa2+トランス二分子層再分配(transbilayer redistribution)させるものである。
最近、PLSCR1の機能について、上記のリン脂質転置タンパクの機能の他に、PLSCR1を信号分子とすることが、検証された。上記のように、PLSCR1が、タンパク質リン酸化反応に関し、また、インターフェロンが他のサイトカイン(cytokines)と作用する時、遺伝子の表現が活性化される(SantoshやKS等、Archives of Biochemistry and Biophysics 462:103−114、2007)。
ウイルス感染によるインターフェロン反応により、PLSCR1が刺激されて表現量が高くなり、細胞免疫反応に関することを証明する。また、刺激されたPLSCR1の表現が、細胞核に分布し、そして、それが、IP3R1遺伝子の促進因子と結合して、その表現が誘発され、それにより、PLSCR1タンパクが、細胞分化作用において、必要とする機能を持つことを証明できる。
本発明の具体的な実施形態によれば、上記方法に適用されるPLSCR−抑制剤により、PLSCRの生物活性が低減される。上記のような抑制剤には、PLSCR−特異性配位子が含まれ、例えば、モノクローナル抗体や拮抗薬が含まれる。
他の具体的な実施形態によれば、上記モノクローナル抗体には、一部の人類PLSCR1のアミノ酸1−160と、唯一性結合できる結合部位が含まれる。また、他の具体的な実施形態によれば、抗−PLSCR1モノクローナル抗体には、一部の人類PLSCR1のC−端と、唯一性結合できる結合部位が含まれる。
また、PLSCR−抑制剤は、脱リン酸化反応により、腫瘍抑制因子のpRbタンパク(retinoblastoma protein)を活性化させて、癌細胞を抑制する。
例えば、上記細胞において、PLSCRのsiRNA(一種類のモルホリノ)やリボザイム(ribozyme)をターゲットするか、それを、上記細胞に染め付ける。また、機能領域に活性を有しないPLSCR突変型を使用してもよく、例えば、リン酸化反応を行わない突変型である。
或いは、転写作用を抑制できる試薬を使用しても良い。PLSCRタンパク質濃度を調節する方法には、エンコードPLSCRの遺伝子転写作用を調節する方法や対応するmRNAを非安定化させる方法及び他の既知の方法が含まれる。
抗体断片の実例は、FabやFab’、F(ab)2、F(ab’)2、F(ab)3、Fv(代表として、抗体単腕のVLとVH機能領域)、単鎖Fv(scFv)、dsFv、Fd断片(代表として、VHとCH1機能領域)及びdAb(代表として、VH機能領域)断片や、VH、VLとVhH機能領域、ミニボディ(minibodies)、ダイアボディ(diabodies)、トリボディ(triabodies)、テトラボディ(tetrabodies)及びkappa抗体断片(例えば、Illら、Protein Eng 1997;10:949−57)、駱駝IgG(camel IgG)、IgNAR及び、抗体断片と、一つや多種類の経単離CDRsや機能性抗原と互いに補完することにより形成された多重特異性抗体断片で、経単離CDRsや抗原結合残基やポリペプチドを、一緒になるように吸着や連鎖させて、機能性抗体断片が形成される。
他の具体的な実施形態によれば、PLSCR−抑制方法は、SEQ ID NO:3のペプチド類と唯一性結合できるモノクローナル抗体や修正された後、依然として、唯一性結合特性を有する抗体或いはその抗体断片である。更に他の具体的な実施形態によれば、PLSCR−抑制方法は、SEQ ID NO:4のペプチド類と唯一性結合できるモノクローナル抗体や修正された後、唯一性結合特性を有する抗体或いはその抗体断片である。
注射する場合、化合物を液態溶液に調製し、好ましいのは、生理学に使用可能の緩衝液に調製し、例えば、ハンク(Hank’s)溶液やリンゲル(Ringer’s)溶液に調製する。また、化合物を固体に調製してもよいが、使用する前に、再溶解や懸濁させればよい。また、冷凍乾燥形式も含まれる。
使用された付形剤は、(特に)充填剤は、例えば、乳糖や蔗糖、マンニトール或いはソルビトールである糖質や、セルロース製剤、コーンスターチや小麦澱粉、米澱粉及び馬鈴薯澱粉である粘着剤及び、ゲラチンやトラガント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び/或いはポリビニルピロリドン(polyvinyl−pyrrolidone;PVP)である他の材料である。
必要とすれば、拡散剤を添加でき、例えば、架橋結合ポリビニルピロリドン(cross−linked polyvinyl pyrrolidone)や寒天或いはアルギン酸(alginic acid)である。また、例えば、アルギン酸ナトリウム等の塩類を添加できる。
<実施例一:抗−PLSCR1モノクローナル抗体の準備>
<人類PLSCR1−特異性モノクローナル抗体を生成>
人類PLSCR1(UniProt accession No.O15162)の残基2−17に相当するペプチドDKQNSQMNASHPETNL(SEQ ID NO.2)を使用して、小鼠において、抗PLSCR1抗体を作製する。上記ペプチドは、Yao−Hong生物科技有限会社(新北市、台湾、R.O.C.)によって合成される。前記のプロセス(Yu、J.S.ら、Biochem.J.334:121-131、1998)に従って、抗−PLSCR1モノクローナル抗体を作製して親和性純化を行う。
即ち、400μgペプチドを、完全なフロインドアジュバント(Wako化学会社)において、乳化させ、得られた乳液を、小鼠(BALB/cJ)に対して、皮下注射を行う。そして、二週間置きに、200μgを、不完全なフロインドアジュバントにあるペプチドに乳化させ、三回注射を追加する。上記のペプチド免疫された小鼠の赤血球を有しない脾臓細胞と骨髄腫細胞(Fo細胞系、Sp2/o−Ag14)とを融合させる。
融合させた後、細胞を、HAT(ヒポキサンチン(Hypoxanthine)やアミノプテリン(Aminopterin)及びチミジン(Thymidine))の培地に懸濁させる。懸濁細胞を96−穴組織培養浅皿に移入させる。約10日の後、抗体が存在する槽穴を選別する。限界希釈(limiting dilution)により、希望する抗体を分泌できるハイブリドーマ純株を用意して、24−穴培養浅皿において、増殖させる。7−9日後、純株のある槽穴を選別する。その後、選別した純株を、再び、選別増殖させる。二回選別増殖の段階の後において、高力価の抗体を分泌可能の細胞株を、液体窒素で冷凍させ、大量に、抗体を含有する細胞培養物上清液を作製する。
<細胞培養と生長分析>
大腸直腸癌細胞(HT29やHCT116及びColo205)や甲状腺癌細胞(CG1)、口腔癌細胞(OEC−M1)、胃癌細胞(AGS)、膀胱癌細胞(MGH−U1)、肺癌細胞(A549)及び子宮頚部癌細胞(HeLa)等の細胞系を、37℃、5% CO2培養箱に保持し、10%牛胎児血清(FBS)と抗生物質が補充された培地において、培養させる。
癌細胞生長抑制の実験では、細胞に対して、抗PLSCR1モノクローナル抗体で処理する前の日に、皿分配を行い、各皿にあるそれぞれの槽穴に、固定の細胞数がある。生長曲線を観察するために、異なる細胞系について、各穴に1x103個細胞の密度で、96−穴組織培養浅皿にセットし、また、CellTiter 96 AQueous One Solution試薬(Promega、Madison、WI)を添加して、現れた色変化により、細胞数が評価される。
小鼠抗−人類PLSCR1モノクローナル抗体(N−端)(IE9)は、LifeSpan BioSciences(LS−C39025、シアトル、WA)から手にした。小鼠IgGは、Jackson免疫研究実験室有限会社(台北、台湾、R.O.C.)から購入した。第一類HLA抗体(Human leukocyte antigen Class I)(W6/32)は、NOVUS BIOLOGICALS(CO、USA)から購入した。Alexa Fluor(登録商標)488山羊抗−小鼠IgGは、台湾Invitrogen有限会社(台湾)から購入した。
細胞増殖は、CellTiter 96 AQueous One Solution試薬(Promega、Madison、WI)を利用して評価する。上記テストは、活細胞の糸粒体の脱水素酵素が、MTT試薬を、可溶性青色ホルマザン(formazan)染料に変換可能であることに基づく。
細胞を、各穴に、1x103個細胞の密度で、96−穴組織培養浅皿にセットし、また、指定された時間間隔で、抗体を処理する。使用された抗−人類PLSCR1モノクローナル抗体の最終濃度は、0や0.65、1、2.5、5、7.5及び10μg/mLである。各培養が終了された時、各穴の培地を、20μl CellTiter 96 AQueous One Solution試薬を含有する新規の培地に取替え、また、培養浅皿を、1時間に放置する。その後、ELISA READER(Fusion、Packard BioScience会社、CT)で、490nm下の吸光度を測定して、相対的な細胞数が評価される。
6−穴培養浅皿で、細胞培養を行い、その方法は、細胞(6000個細胞/穴)を、1mLに10% FBSが含有された0.5%寒天(agar)に懸濁させ、また、抗−PLSCR1モノクローナル抗体(20μg/mL、LS−C39025、LifeSpan BioSciences)を添加して、1mLに10%FBSが含有された0.35%寒天(agarose)を被覆する。
その培養浅皿を、37℃、5% CO2培養箱に14日に保持する。その期間において、培養浅皿の細胞を、週に二回、細胞培地に対して供給する。観察する時点で、6−穴培養浅皿に対して、0.5mLの0.005%クリスタルバイオレットで、1時間以上に、色染めさせる。解剖顕微鏡で、細胞群体を検査する。
メーカーの操作プロセス(ibidi、Martinsried、ドイツ)に基づいて、傷口癒合分析を行う。簡略に、培養挿入中隔(ibidi)を、6−穴培養浅皿の穴に設置する。3.5x104個HT29やHCT116大腸直腸癌細胞を、培養挿入中隔の各穴にセットし、37℃、5% CO2下において、24時間、培養する。細胞が付着した後、ピンセットで、気をつけて培養挿入中隔を取り出し、約500μmの無細胞隙間が形成される。
上記の細胞を、牛胎児血清を含有する培地で培養させ、また、抗−PLSCR1モノクローナル抗体(20μg/mL)で処理する。倒立顕微鏡(Nikon ECLIPSE(登録商標) TS100、Nikon計器有限会社、 Melville、NY)で、細胞培養浅皿において、同じ位置にある細胞隙間のイメージを撮影する。
[https://mywim.wimasis.com/index.php?page=Launch&select=Wound_Healing&gr=ibidi]であるWebアドレスのWimasisイメージ分析平台(ミュンヘン、ドイツ)にて、各時点の細胞被覆面積を定量化させる。
細胞侵入作用分析は、QCM ECMatrix細胞侵入分析(Milipore)により、穴径8μMのポリカーボネート膜と一層の人工的なベース膜基質を有して、分析する。300μLの血清無しの培地に懸濁した細胞(3x105)を、慎重に前記装置の上層空間に移転し、下層空間に、500μLの10%牛胎児血清が含有されて誘引剤とする培地が充填され、装置を、37℃、湿潤の5% CO2空気に48時間放置する。
48時間培養された後、綿棒で、侵入していない細胞を、上層空間から除去する。ポリカーボネート膜を経由して下表面まで侵入した細胞を固定し、クリスタルバイオレットで色染め、その後、顕微鏡で観察し、ランダムに、5箇所を選択して顕微鏡視野で、細胞数を計上する。
<異種間移植腫瘍細胞>
胸腺が除去されたBalb/cヌードマウス(NU/NU小鼠、雌性、5−週齢)は、台湾のBioLASCO会社(宜蘭、台湾)から購入したものである。HT29細胞(2x106を200μLリン酸塩緩衝食塩水に懸濁させる)を、胸腺が除去されたBalb/cヌードマウスの背部左側に、皮下注射して、その腫瘍生長を監視する。腫瘍の長さ(l)や幅(w)及び高さ(h)を利用して、下記の式で、腫瘍体積(V):V=0.52(l x w x h)を推算する(Tomayko MM、Reynolds CP.、Cancer Chemother Pharmacol 24:148-154、1989)。
実験の小鼠に対して、腫瘍小結の近くに注射治療を行う。小鼠を、接種した後の30日目までに監視し、この時、小鼠を犠牲する。腫瘍を切り出して重量を測る。すべての動物実験は、ともに、長庚大学実験動物照護と使用委員会(IACUC)の認可プロセス下で行い、また、上記委員会により認可された動物実験は、中華民国行政院農業委員会によって公開された実験動物設備と養護規範の条例に基づくものである。
<組織アレイの免疫組織化学分析>
正常と腫瘍器官組織の組織アレイサンプルは、Biomax(Rockville、MD)から購入したものである。メーカーの操作ステップによれば、DAB検知セット(DAKO、AR155、Glostrup、デンマーク)で、組織アレイサンプル上において、免疫組織化学分析を行う。上記の免疫組織化学分析においては、PLSCR1抗体(1:100)を使用する。
簡略化のH評価システム(Ravn Vら、Pathol Res Pract 189:1015−22、1993)で、PLSCR1の表現が、陽性か陰性であることを評価し、上記評価は、色染められた細胞百分率値(3、≧90%、2、50−89%、1、10−49%、或いは0、0−9%)と細胞色染め強度(3、強、2、中、1、弱、或いは0、細胞色染め無し)に基づく。上記二つの数値を相乗して3で割って、最後の評価点が得られる。陽性色染めについて、最後評価点≧1に定義する。
<ウエスタンプロット分析>
分離されたばかりの手術切除部分から臨床組織サンプルを採集し、液体窒素で急速冷却させてから、−80℃下に、使用するまでに保管する。PLSCR1タンパクが、大直腸癌(CRC)組織においての表現を分析することは、冷凍組織を、研磨してから、溶解溶液(0.25mol/L蔗糖や10mmol/L Tris−HCl pH 7.6、1mmol/L MgCl2、1%ドデシルスルホン酸ナトリウム[SDS])、そして、タンパク質分解酵素抑制剤(20μg/μL aprotinin、20μg/μL leupeptinと1mmol/Lフェニル基メタンスルホニルフッ化物)が含有され、タンパク質:タンパク質分解酵素抑制剤が、100:1、v/v)に懸濁する。サンプルを、超音波で振盪させ、14、000rpmの下で、10分、遠心させる。DCタンパク質分析方法(BIO−RAD(登録商標)、Bio−Rad Laboratories、Inc.、CA)で、タンパク質の量を測定する。
ブロット膜に対して、化学発光(ECL)が増強されたウエスタンプロット試薬で現像し、Kodak Biomaxフィルムに露光させる。また、Imagemaster(Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)分析で、ブロットイメージが得られる。
光学密度測定法で、Multi Gauge 2.0版ソフト(Fuji PhotoFilm、東京、日本)により分析し、各バーのタンパク質含有量を定量化する。SPSS/Windows(登録商標) 12.0統計パッケージソフト(SPSS、Inc.、Chicago、IL)を使用して、得られたデータを、対応t検定(paired t−test)で分析する。P<0.05は、統計上、明白的なことと認められる。
特に、Rbのリン酸化反応が低減されても、その表現が抗−PLSCR1による処理によって抑制されない。既知のように、Rbの未リン酸化形式は、多種類の細胞週期を変調するE2F転写因子家族のメンバーと結合する。RbとE2Fによって形成された複合物は、抑制物として作用でき、細胞週期がG1段階に通過することを抑制できる(Resnitzky DとReed SI、1995)。
<PBMCとRBC細胞の免疫蛍光色染め>
PBMC細胞を採集してPBSで、三回清浄する。細胞を、2%牛血清白タンパク(BSA)を有するPBSで、4℃下にで、1時間、封鎖する。封鎖試薬を除去して、10μg/mLの抗−PLSCR1や第一類HLA抗体(W6/32、NOVUS BIOLOGICALS、USA)(陽性反応制御組とする)を、5% BSAを含有するPBSに溶け、採集した細胞に、注入して、1時間、反応させる。結合されていない抗体を除去して、細胞を、PBSにおいて、三回清浄する。
また、下位抗体であるAlexa Fluor 488山羊抗−小鼠IgG(1:50;Invitrogen Taiwan Ltd.、Taiwan)を注入して、1時間、反応させる。細胞を、PBSにおいて、三回清浄し、また、フローサイトメトリー計(EPICS XL−MCL、Beckman Coulter、USA)で、各分析サンプルに対して、10、000個細胞を計量する。
また、容量依存性分析(dose−dependent assays)は、5や10及び20μg/mLの抗−PLSCR1抗体によって処理されたPBMCについて、上記の実験条件とフローサイトメトリー計で、評価する。
下位抗体であるAlexa Fluor 488山羊抗−小鼠IgG(1:50;Invitrogen Taiwan Ltd.、Taiwan)を注入して、30分、反応させる。細胞を、PBSにおいて、三回清浄し、また、フローサイトメトリー計(EPICS XL−MCL、Beckman Coulter、USA)で、細胞数を計量する。
上記の結果によれば、抗−PLSCR1抗体を、10μg/mLの濃度で、静脈内投薬する時、PBMCとRBCとに結合しなく、或いは、上記らの細胞に対して、副作用を起こさない。一方、5や10及び20μg/mLの抗−PLSCR1抗体によって処理されたPBMCやRBCは、類似的な信号変位が表し、容量依存性反応が表さない(図11)。
本明細書に披露された全ての特徴は、任意に組立てられることができる。そのため、本明細書に掲示された各特徴は、同じや等価或いは類似した目的の代替特徴によって取り替えられることができる。そのため、明白に言明されない限りに、掲示された各特徴は、ただ、シリーズの等価や類似する特徴を有する実例である。
HT29細胞系の抗−PLSCR1は、Rbタンパクの再活性化を抑制することにより、細胞増殖を抑制する。(A)は、抗−PLSCR1が細胞周期表D1を抑制する表現である。(B)は、抗−PLSCR1処理により、HT29細胞のSrcやShc、ErkとRbのリン酸化反応が低減される。
Claims (26)
- 野生型PLSCR家族タンパク及PLSCR変異型の活性を抑制する、ことを特徴とする癌細胞生長抑制の方法。
- 上記野生型PLSCR家族タンパクは、PLSCR1やPLSCR2、PLSCR3或いはPLSCR4であることを特徴とする請求項1に記載の癌細胞生長抑制の方法。
- PLSCR−抑制剤や医薬使用可能の担体、希釈剤或いは付形剤が含まれる、ことを特徴とする医薬組成物。
- 上記PLSCR−抑制剤は、PLSCRの生物活性が低減される化合物であることを特徴とする請求項3に記載の医薬組成物。
- 上記PLSCR−抑制剤は、為一種と人類PLSCR1 (SEQ ID NO. 1)及PLSCR1の經修正タンパクシークエンス唯一性結合的モノクローナル抗体或其具結合能力の抗体断片。ことを特徴とする請求項3に記載の医薬組成物。
- 上記モノクローナル抗体やその結合能力を有する抗体断片は、SEQ ID NO. 2のペプチドやSEQ ID NO. 2の修正されたペプチドシークエンスと唯一性結合することを特徴とする請求項5に記載の医薬組成物。
- 上記モノクローナル抗体やその結合能力を有する抗体断片は、SEQ ID NO. 3のペプチドやSEQ ID NO. 3の修正されたペプチドシークエンスと唯一性結合することを特徴とする請求項5に記載の医薬組成物。
- 上記モノクローナル抗体やその結合能力を有する抗体断片は、SEQ ID NO. 4のペプチドやSEQ ID NO. 4の修正されたペプチドシークエンスと唯一性結合することを特徴とする請求項5に記載の医薬組成物。
- 上記モノクローナル抗体やその結合能力を有する抗体断片は、ヒト化モノクローナル抗体や修正された抗体であることを特徴とする請求項5に記載の医薬組成物。
- 上記PLSCR−抑制剤は、PLSCRタンパクの表現が低減されることを特徴とする請求項3に記載の医薬組成物。
- 上記PLSCRの表現は、siRNAによる変調により、低減されることを特徴とする請求項10に記載の医薬組成物。
- 更に、少なくとも一つの余計な抗癌剤が含まれることを特徴とする請求項3に記載の医薬組成物。
- 上記PLSCR−抑制剤は、PLSCRの生物活性を低減することにより、癌細胞の増殖や移動及び侵入が抑制されることを特徴とする請求項4に記載の医薬組成物。
- 上記PLSCR−抑制剤は、脱リン酸化反応で、Srcの活性を低減することにより、癌細胞を抑制することを特徴とする請求項13に記載の医薬組成物。
- 上記PLSCR−抑制剤は、脱リン酸化反応で、Shcの活性を低減することにより、癌細胞を抑制することを特徴とする請求項13に記載の医薬組成物。
- 上記PLSCR−抑制剤は、脱リン酸化反応で、Erkの活性を低減することにより、癌細胞を抑制することを特徴とする請求項13に記載の医薬組成物。
- 上記PLSCR−抑制剤は、細胞周期表D1の表現を低減することにより、癌細胞を抑制することを特徴とする請求項13に記載の医薬組成物。
- 上記PLSCR−抑制剤は、脱リン酸化反応で、抑制因子であるRbタンパク(retinoblastoma)の活性化させて、癌細胞を抑制することを特徴とする請求項13に記載の医薬組成物。
- 上記PLSCR−抑制剤の有効量範囲は、1 mg/kg乃至10 mg/kgにあることを特徴とする請求項3に記載の医薬組成物。
- 上記個体に対して、有効量の請求項3に記載のPLSCR−抑制剤が含まれる医薬組成物を投薬する、ことを特徴とする個体内の癌細胞生長抑制や予防癌の方法。
- 上記癌のPLSCRは、過量表現になることを特徴とする請求項20に記載の個体内の癌細胞生長抑制や予防癌の方法。
- 上記癌は、乳癌や肝癌、大腸直腸癌、膵臓癌、食道癌、膀胱癌、卵巣癌、皮膚癌、胃癌、前立腺癌、肺癌、腎細胞癌、甲状腺癌、腦癌、黒色腫、肉腫、白血病、骨癌及び子宮内膜癌からなる群から選ばれる何れかの一つである、ことを特徴とする請求項20に記載の個体内の癌細胞生長抑制や予防癌の方法。
- 上記請求項3項に記載の医薬組成物は、毒性を、選択的に、高表現量のPLSCRの癌細胞にターゲットすることを特徴とする請求項20に記載の個体内の癌細胞生長抑制や予防癌の方法。
- 上記癌細胞を、有効量の請求項3や5に記載のPLSCR−抑制剤が含まれる医薬組成物に露出させることを特徴とする請求項23に記載の個体内の癌細胞生長抑制や予防癌の方法。
- 上記投薬された請求項3項に記載のPLSCR−抑制剤が含まれる医薬組成物は、他の放射線療法や化学療法或いは免疫調節の療法と組み合わせて適用されることを特徴とする請求項20に記載の個体内の癌細胞生長抑制や予防癌の方法。
- 上記有効量は、1 mg/kg乃至10 mg/kgの範囲にあることを特徴とする請求項20に記載の個体内の癌細胞生長抑制や予防癌の方法。
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