ES2349117T3 - Anticuerpos anti-vegf-2. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que de manera inmunoespecífica se enlaza con un polipéptido VEGF-2, consistiendo dicho anticuerpo en una secuencia de aminoácido que es al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo consistente en: (a) la secuencia de aminoácido del dominio VH de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:79; y (b) la secuencia de aminoácido del dominio VH del anticuerpo expresado por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Depósito ATCCC PTA-4095.

Description

Contexto de la Invención

La presente descripción hace referencia a polinucleótidos recién identificados, polipéptidos codificados por dichos polinucleótidos, anticuerpos específicos para tales polipéptidos, el uso de estos anticuerpos, así como la producción de estos anticuerpos. Los polipéptidos de la presente descripción han sido identificados como miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular. Más en particular, los polipéptidos de la presente descripción son del factor 2 de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF-2). Los anticuerpos de la invención son específicos para dichos polipéptidos VEGF -2. La invención también hace referencia a la inhibición de la acción de dichos polipéptidos.

La formación de nuevos vasos sanguíneos, o angiogénesis, es esencial para el desarrollo embriónico, el posterior crecimiento y la reparación de tejidos. La angiogénesis es también una parte esencial de ciertas condiciones patológicas, como neoplasia (por ejemplo, tumores y gliomas). La angiogénesis anormal se asocia con otras enfermedades como inflamación, artritis reumatoide, psoriasis, y retinopatía diabética (Folkman, J. y Klagsbrun, M., Science 235:442447 (1987)).

Las moléculas de factor de crecimiento de fibroblasto ácidas y básicas son mitógenos para células endoteliales y otros tipos de células. La angiotropina y angiogenina pueden inducir angiogénesis, a pesar de que sus funciones no están muy claras (Folkman, J., Cancer Medicine, Lea y Febiger Press, pp. 153-170 (1993)). El factor de crecimiento endotelial vascular o VEGF es un mitógeno muy selectivo para células endoteliales vasculares (Ferrara, N. et al., Endocr. Rev. 13:19-32 (1992)), que también se conoce como factor de permeabilidad vascular (FPV).

El factor de crecimiento endotelial vascular es un mitógeno angiogénico segregado cuya especificidad de célula objetivo parece estar restringida a células endoteliales vasculares. El gen VEGF de ratones se ha caracterizado y su patrón de expresión en embriogénesis se ha analizado. Se observó una expresión persistente de VEGF en células epiteliales adyacentes al endotelio fenestrado, es decir, en los plexos coroideos y en los glomérulos renales. Los datos fueron consistentes con el papel de VEGF como regulador multifuncional de crecimiento y diferenciación celular endotelial (Breier, G. et al., Development 114:521-532 (1992)).

VEGF comparte la homología secuencial con los factores de crecimiento derivados de plaquetas humanas, PDGFa y PDGFb (Leung D. W., et al., Science 246:1306-1309, (1989)). La extensión de homología es de aproximadamente 21% y 23%, respectivamente. Ocho residuos de cisteína que contribuyen a la formación del enlace de disulfuro se conservan de manera estricta en estas proteínas. Aunque son similares, hay diferencias específicas entre VEGF y PDGF. Mientras que PDGF es un factor de crecimiento principal para tejido conector, VEGF es muy específico para célula endoteliales. De manera alternativa, se han identificado ARNs ensamblados para VEGF, PLGF y PDGF y estos productos ensambladores difieren en actividad biológica y en especificidad de enlace con el receptor. VEGF y PDGF funcionan como homo-dímeros y hetero-dímero y se enlazan con receptores que provocan actividad intrínseca de tirosina quinasa seguida de dimerización del receptor.

VEGF tiene cuatro formas diferentes de 121, 165, 189 y 206 aminoácidos debido al ensamblaje alternativo. VEGF121 y VEGF165 son solubles y son capaces de producir angiogénesis, mientras que VEGF189 y VEGF-206 están unidos a heparina que contiene proteoglicanos en la superficie celular. La expresión temporal y espacial de VEGF se ha relacionado con la proliferación fisiológica de los vasos sanguíneos (Gajdusek, C.M., y Carbon, S.J., Cell Physiol. 139:570-579 (1989); McNeil, P.L., et al., J. Cell. Biol. 109:811-822 (1989)). Sus puntos de enlace de elevada afinidad se localizan solamente en células endoteliales en secciones del tejido (Jakeman, L.B., et al., Clin. Invest. 89:244-253 (1989)). El factor puede aislarse de células pituitarias y varias líneas celulares tumorales, y ha estado implicado en algunos gliomas humanos (Plate

K.H. Nature 359:845-848, (1992)). De manera interesante, la expresión de VEGF121 y VEGF165 confiere en células de ovarios en hámsteres chinos la habilidad para formar tumores en ratones desnudos (ratón inmunológicamente deficiente utilizado para permitir el crecimiento de células tumorales de otro ratón o de otras especies, como la humana) (Ferrara, N. et al., J. Clin. Invest. 91:160-170 (1993)). La inhibición de la función VEGF por la acción de anticuerpos monoclonales anti-VEGF se mostró para inhibir crecimiento tumoral en ratones inmunodeficientes (Kim, K.J., Nature 362:841-844) (1993)). Además, un mutante dominante negativo del receptor VEGF ha demostrado inhibir el crecimiento de glioblastomas en ratones.

El factor de permeabilidad vascular (VPF) también ha demostrado ser responsable de la hiperpermeabilidad microvascular persistente para proteínas de plasma incluso tras el cese de la lesión, que es una característica de la curación normal de una herida. Esto sugiere que VPF es un factor importante en la curación de heridas. Brown, L. F., et al., J. Exp. Med. 176:1375-1379 (1992).

La expresión de VEGF es alta en tejidos vascularizado, (por ejemplo, pulmón, corazón, placenta y tumores sólidos) y se relaciona con angiogénesis tanto temporalmente como espacialmente. VEGF también ha demostrado provocar angiogénesis in vivo. Debido a que la angiogénesis es esencial para la reparación de tejidos normales, especialmente tejidos vasculares, VEGF ha sido propuesto para uso en la estimulación de reparación de tejidos vasculares (por ejemplo, en ateroesclerosis).

La patente U.S Nº 5,073492, concedida el 17 de diciembre de 1991 de Chen et al., describe un método para mejorar sinergísticamente el crecimiento celular endotelial en un ambiente apropiado que consiste en la adición al ambiente de VEGF, efectores y factor derivado de suero. Así mismo, ADN con sub-unidad de factor C de crecimiento de célula endotelial vascular se ha preparado mediante técnicas de reacción en cadena de polimerasa. El ADN codifica una proteína que existe como heterodímero o homodímero. La proteína es un nitrógeno celular endotelial vascular de mamífero y, como tal, es útil para la estimulación de desarrollo y reparación vascular, tal y como se describe en la Solicitud de Patente Europea Nº 92302750.2, publicada el 30 de septiembre de 1992.

Resumen de la Invención

Los polipéptidos de la presente descripción se han identificado supuestamente como un factor nuevo de crecimiento endotelial vascular basado en la homología de secuencia de aminoácido para VEGF humano.

También se describen polipéptidos maduros nuevos, así como fragmentos biológicamente activos y diagnósticamente o terapéuticamente útiles, análogos y derivados de los mismos. Los polipéptidos de la presente descripción son de origen humano.

También se describen moléculas aisladas de ácido nucleico que están formadas por polinucleótidos que codifican polipéptidos VEGF-2 de longitud completa o truncados que tienen secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID Nos: 2 o 4, respectivamente, o secuencias de aminoácido codificadas por los clones cADN depositados en huéspedes bacterianos como ATCC Número de Depósito 97149 el 12 de mayo de 19995 o ATCC Número de Depósito 75698 el 4 de marzo de 1994.

La presente descripción también se relaciona con fragmentos biológicamente activos y diagnósticamente o terapéuticamente útiles, análogos y derivados de VEGF-2.

También se describen proceso para producir tales polipéptidos y técnicas recombinantes que consisten en cultivar células huéspedes recombinantes procarióticas y/o eucarióticas, que contienen la secuencia de ácido nucleico codificadora de la presente descripción, bajo condiciones que impulsan la expresión de dichas proteínas y la posterior recuperación de dichas proteínas.

También se describen procesos para utilizar dichos polipéptidos, o polinucleótidos que codifican estos polipéptidos para fines terapéuticos, por ejemplo, para estimular angiogénesis, curación de heridas, crecimiento de hueso o tejido dañado, y para estimular la reparación de tejido vascular. En concreto, se proporcionan procesos para utilizar estos polipéptidos, o polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, para el tratamiento de enfermedad arterial periférica, como isquemia crítica de las

extremidades y enfermedad coronaria.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan anticuerpos contra tales polipéptidos, procesos para producir tales polipéptidos, y se proporcionan procesos para utilizar tales anticuerpos.

Usando la tecnología de expresión fágica, los inventores presentes han identificado moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (“scFvs”) que inmunoespecíficamente se enlazan con VEGF2, por ejemplo, scFvs que inmunoespecíficamente se enlazan con VEGF-2 de longitud completa, scFvs que inmunoespecíficamente se enlazan con la forma madura de polipéptido VEGF-2, scFvs que inmunoespecíficamente se enlazan con la forma pro-proteína de VEGF-2, scFvs que inmunoespecíficamente se enlazan con la forma segregada de VEGF-2 y/o scFvs que inmunoespecíficamente se enlazan con la forma de longitud completa y la forma segregada de VEGF-2. Las moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de variantes de estos scFvs (por ejempo, incluyendo dominios VH, CDRs VH, dominios VL, o VL CDRs que tienen una secuencia de aminoácido de cualquiera de los referidos en la Tabla 2), que inmunoespecíficamente se enlazan con VEGF-2 de longitud completa, la forma madura de polipéptido VEGF-2, la forma pro-proteína de VEGF-2, la forma segregada de VEGF-2 y/o la forma de longitud completa y la forma segregada de VEGF-2 están comprendidos en esta invención como moléculas de ácido nucleico que codifican estos scFvs y/o moléculas.

En particular, la invención hace referencia a scFvs que comprenden, o alternativamente consisten en, una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo consistente en SEQ ID Nos: 7283 referida en la Tabla 2 a continuación. Las moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos o variantes de estos scFvs (por ejemplo, incluyendo dominios VH, CDRs VH, dominios VL, o VL CDRs que tienen una secuencia de aminoácido de cualquiera de los referidos en la Tabla 2) que inmunoespecíficamente se enlazan con VEGF-2 de longitud completa, la forma pro-proteína de VEGF-2, la forma segregada de VEGF-2 y/o la forma de longitud completa y la forma segregada de VEGF-2 también están comprendidos en esta invención como moléculas de ácido nucleico que codifican estos scFvs y/o moléculas.

La presente invención engloba anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que inmunoespecíficamente se ligan con un polipéptido VEGF-2 o fragmento de polipéptido o variante de un VEGF-2. En particular, la invención incluye anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que inmunoespecíficamente se ligan con un polipéptido o fragmento de polipéptido o variante de VEGF-2 humano como los de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:18, el polipéptido VEGF-2 de longitud completa, la forma preproteína del polipéptido VEGF-2, el polipéptido maduro de VEGF-2, o la forma segregada del polipéptido VEGF-2.

En realizaciones preferentes, la invención comprende anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que inmunoespecíficamente se ligan con VEGF-2 de longitud completa. En otras realizaciones, la invención incluye anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que inmunoespecíficamente se ligan con la forma segregada de VEGF-2.

La presente invención hace referencia a los métodos y composiciones para tratar y mejorar una enfermedad o desorden que consiste en la administración a un animal, preferiblemente un humano, de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, o moléculas relacionadas, que inmunoespecíficamente se enlazan con un polipéptido VEGF-2 o un fragmento o una variante del mismo. En realizaciones específicas, la presente invención hace referencia a métodos y composiciones para prevenir, tratar o mejorar una enfermedad o desorden asociado con la función VEGF-2 o la función del receptor VEGF-2 (por ejemplo, flt-4 o flk-1) o VEGF-2 aberrante o la expresión del receptor VEFG-2 (por ejemplo, flt-4 o flk-1), que consiste en la administración a un animal, preferiblemente un humano, de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, o moléculas relacionadas, que inmunoespecíficamente se enlazan con VEGF-2 o un fragmento o una variante del mismo. En realizaciones más preferentes, la presente invención hace referencia a métodos y composiciones basados en anticuerpos para prevenir, tratar o mejorar tumores y metástasis tumorales, en particular los asociados con cáncer de pecho, de cerebro, colon y próstata o linfangiomas. Otras enfermedades y desórdenes que pueden tratarse, prevenirse y/o mejorar con los anticuerpos de la presente invención incluyen, aunque no se limitan a, desórdenes inflamatorios, artritis reumatoide, psoriasis, retinopatía diabética y desórdenes proliferativos.

La presente invención también engloba métodos y composiciones para detectar, diagnosticar, o pronosticar enfermedades y trastornos que consiste en la administración a un animal, preferiblemente un humano, de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos, o moléculas relacionadas, que inmunoespecíficamente se enlazan con VEGF-2 o un fragmento o una variante del mismo. En realizaciones específicas, la presente invención también engloba métodos y composiciones para detectar, diagnosticar, o pronosticar enfermedades y trastornos asociados con la función VEGF-2 o función del receptor VEGF-2 o VEGF-2 aberrante o expresión del receptor VEGF-2, que consiste en la administración a un animal, preferiblemente un humano, de una cantidad efectiva de uno o más anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos o moléculas relacionadas, que inmunoespecíficamente se enlazan con VEGF-2 o un fragmento o una variante del mismo.

En realizaciones muy preferentes, la presente invención hace referencia a métodos y composiciones basados en anticuerpos para detectar, diagnosticar o pronosticar tumores y metástasis tumorales, en particular los asociados con cáncer de pecho, de cerebro, colon y próstata o linfangiomas. Otras enfermedades y desórdenes que pueden tratarse, prevenirse y/o mejorar con los anticuerpos de la presente invención incluyen, aunque no se limitan a, desórdenes inflamatorios, artritis reumatoide, psoriasis, retinopatía diabética y desórdenes proliferativos.

Otra realización de la presente invención incluye el uso de los anticuerpos de la invención como herramienta de diagnóstico para controlar la expresión de VEGF-2 en muestras biológicas.

La presente invención también proporciona anticuerpos que se enlazan con uno o más polipéptidos VEGF-2 que están unidos a una etiqueta detectable, como una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, o una etiqueta bioluminiscente. La presente invención también proporciona anticuerpos que se enlazan con uno o más polipéptidos VEGF-2 que están unidos a un agente terapéutico o citotóxico. La presente invención también proporciona anticuerpos que se enlazan con uno o más polipéptidos VEGF-2 que están unidos a un material radioactivo.

La presente invención también proporciona anticuerpos que se enlazan con uno o más polipéptidos VEGF-2 que actúan como agonistas de VEGF-2 o antagonistas de VEGF-2.

La presente invención proporciona además anticuerpos que inhiben o abolen el enlace de VEGF-2 con sus receptor (por ejemplo, flk-1 y/o flt-4) (ver, por ejemplo, Ejemplo 33). En otras realizaciones, los anticuerpos de la invención inhiben la fosforilación inducida por VEGF-2 de Elk-1 (por ejemplo, ver Ejemplo 35). En otras realizaciones, los anticuerpos de la invención inhiben la proliferación inducida por VEGF-2 de proliferación celular vascular o endotelial (por ejemplo, ver Ejemplo 35). En otra realizaciones preferentes, los anticuerpos de la presente invención inhiben angiogénesis (por ejemplo, ver Ejemplos 16 o 23).

En realizaciones muy preferentes de la presente invención, los anticuerpos de VEGF-2 se usan para tratar, prevenir o mejorar tumores y metástasis tumoral. En otras realizaciones muy preferentes, los anticuerpos VEGF-2 de la presente invención se administran a un individuo, solos o en combinación con otros compuestos terapéuticos, especialmente agentes anti-cáncer, para tratar, prevenir o mejorar tumores y metástasis tumorales. En otras realizaciones muy preferentes, los anticuerpos VEGF-2 de la presente invención se administran a un individuo, solos o en combinación con otros tratamientos anti-cáncer (por ejemplo, terapia de radiación o cirugía) para tratar, prevenir o mejorar tumores y metástasis tumorales.

La presente invención también proporcionar una molécula de ácido nucleico, generalmente aislada, que codifica un anticuerpo (incluyendo moléculas, como scFvs, dominios VH o dominios VL, que comprende, o alternativamente consisten en, un fragmento de anticuerpo o una variante del mismo) de la invención. La presente invención también proporciona una célula huésped transformada con una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo (incluyendo moléculas, como scFvs, dominios VH o dominios VL, que comprende, o alternativamente consisten en, un fragmento de anticuerpo o una variante del mismo) de la invención y progenie del mismo. La presente invención también proporciona un método para la producción de un anticuerpo (incluyendo una molécula que comprende, o alternativamente consiste en, un fragmento de anticuerpo o una variante del mismo) de la invención. Además, la presente invención proporciona un método para expresar un anticuerpo (incluyendo una molécula que comprende, o alternativamente consiste en, un fragmento de anticuerpo o una variante del mismo) de la invención a partir de una molécula de ácido nucleico. Estos y otros aspectos de la invención se describen con más detalle más adelante.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan antagonistas para tales polipéptidos, que pueden usarse para inhibir la acción de tales polipéptidos, por ejemplo, para evitar angiogénesis de tumor y por lo tanto inhibir el crecimiento de tumores, para tratar retinopatía diabética, inflamación, artritis reumatoide y psoriasis.

También se describen sondas de ácido nucleico que consisten en moléculas de ácido nucleico con la suficiente longitud como para hibridizar específicamente las secuencias de ácido nucleico de la presente descripción

También se describen métodos de diagnóstico de enfermedades o una susceptibilidad de enfermedades relacionadas con mutaciones de secuencias de ácido nucleico de la presente descripción y proteínas codificadas por estas secuencias de ácido nucleico.

También se describe un proceso para utilizar estos polipéptidos, o polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, para fines in vitro relacionados con investigación científica, síntesis de ADN y fabricación de vectores de ADN.

Estos y otros aspectos de la presente invención deberían resultar claros para aquellos expertos en la técnica a partir de los contenidos aquí expuestos. Breve Descripción de las Figuras

Los siguientes dibujos son ilustrativos de la descripción y de las realizaciones de la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención tal y como las reivindicaciones la engloban.

Las Figuras 1A-F muestran el nucleótido de longitud completa (SEQ ID NO:1) y la secuencia del aminoácido deducido (SEQ ID NO:2) de VEGF-2. El polipéptido comprende aproximadamente 419 residuos de aminoácido de los cuales aproximadamente 23 representan la secuencia líder. Se usan las abreviaturas estándares de letras para los aminoácidos. La secuenciación se realizó usando el Secuenciador de ADN Automatizado Modelo 373 (Applied Biosystems, Inc.). Se predice que la exactitud de la secuenciación es superior al 97%.

Las Figuras 2A-D muestran el nucleótido (SEQ ID NO:3) y la secuencia del aminoácido deducido (SEQ ID NO:4) de una forma truncada y biológicamente activa de VEGF-2. El polipéptido comprende aproximadamente 350 residuos de aminoácido de los cuales aproximadamente los primeros 24 representan la secuencia líder.

Las Figuras 3A-B son una ilustración de las homología secuencial del aminoácido entre PDGFa (SEQ ID NO:5), PDGFb (SEQ ID NO:6), VEGF (SEQ ID NO:7), Y VEGF-2 (SEQ ID NO:4). Las zonas recuadradas indican las secuencias conservadas y la localización de los ochos residuos conservados de cisteína.

La Figura 4 muestra, en forma de tabla, la homología porcentual entre PDGFa, PDGFb, VEGF y VEGF-2.

La Figura 5 muestra la presencia de mARN VEGF-2 en líneas celulares de tumor de pecho humano.

La Figura 6 muestra los resultados del análisis de inmunotransferencia del tipo Northern de VEGF-2 en tejidos de humano adulto.

La Figura 7 muestra una fotografía de un gel SDS-PAGE tras una transcripción in vitro y electroforesis del polipéptido de la presente descripción. Ruta 1: 14C y marcador arcoíris M.W; Ruta 2: control FGF; Ruta 3: VEGF-2 producido por cebadores inverso y delantero M14; Ruta 4: VEGF-2 producido por cebadores de M13 inverso y VEGF-F4; Ruta 5: VEGF-2 producido por cebadores de M13 inverso y VEGF-F5.

Las Figura 14A-B muestra la expresión de mARN VEGF-2 en tejidos humanos fetales y de adultos.

La Figura 15 muestra la expresión de mARN VEGF-2 en células de cultivo primario humano.

Las Figura 16A-B muestra la expresión pasajera de proteína VEGF-2 en células COS-7.

La Figura 17 muestra proliferación estimulada por VEGF-2 de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC).

La Figura 18 muestra proliferación estimulada por VEGF-2 de células endoteliales microvasculares dérmicas.

La Figura 19 muestra el efecto estimulador de VEGF-2 en la proliferación de células endoteliales microvasculares, del cordón umbilical, endometriales y de las aortas bovinas.

La Figura 20 muestra la inhibición de proliferación de células musculares lisas vasculares (aórtica humana) inducida por VEGF-2.

Las Figuras 21A-B muestra la estimulación o migración de HUVEC y células endoteliales microvasculares bovinas (BMEC) por la acción de VEGF-2.

La Figura 22 muestra la estimulación de liberación de óxido nítrico de HUVEC por VEGF-2 y VEGF-1.

La Figura 23 muestra la inhibición de formación del cordón de células endoteliales vasculares (CADMEC) por VEGF-2.

La Figura 24 muestra la estimulación de angiogénesis por VEGF, VEGF-2 y bFGF en el ensayo CAM.

Las Figuras 25A-25O muestran la restauración de ciertos parámetros en la extremidad isquémica por la proteína VEGF-2 (Figura 25 A) y el plásmido de expresión desnuda (Figura 25B); el ratio BP (Figuras 25A-25C); Flujo de Sangre y Reserva de Flujo (Figuras 25D-25I); Resultado Angiográfico (Figuras 25J-25L); Densidad capilar (Figura 25M-25O).

Las Figuras 26A-G muestran la habilidad de VEGF-2 para afectar a la presión sanguínea diastólica en ratas espontáneamente hipersensibles (SHR). Las Figuras 26a y b muestran el descenso en base a la dosis en presión sanguínea diastólica conseguido con VEGF-2. (Figuras 26c y d muestran la presión arterial media descendida (MAP) observada con VEGF-2. El panel E muestra el efecto de dosis crecientes de VEGF-2 en la presión arterial media (MAP) en ratas SHR. El panel E muestra el efecto de VEGF-2 en presión diastólica de ratas SHR. El panel G muestra el efecto de VEGF-2 en la presión sanguínea diastólica de ratas SHR.

La Figura 27 muestra la inhibición de VEGF-2N= y proliferación inducida por VEGF-2.

La Figura 28 muestra una representación esquemática del vector de expresión pHE4a (SEQ ID NO:16). Se indican las localizaciones del gen marcador de resistencia a kanamicina, la región de unión de clonación múltiple, la secuencia oriC, y la secuencia codificadora lacIq.

La Figura 29 muestra la secuencia nucleótida de los elementos reguladores del promotor pHE4 a (SEQ ID NO.17). Se indican las dos secuencias operadoras lac, la secuencia Shine-Delgarno (S/D), y los puntos de restricción de terminal Hind/III y Ndel (en cursiva).

Las Figuras 30A-G muestran el efecto de anticuerpos VEGF-2 en el tamaño, peso y metástasis del tumor. La Figura 30A muestra el efecto de anticuerpos αVEGF-2 en el crecimiento de carcinoma de pecho humano MDA-MB-231 en ratones desnudo. La Figura 30B muestra el efecto de anticuerpos VEGF-2 en el volumen del tumor PC-3 después de 42 días de exposición al anticuerpo VEGF-2. La Figura 30C muestra el efecto de anticuerpos VEGF-2 en la frecuencia metastática del nodo linfático. La Figura 30D muestra el efecto de anticuerpos VEGF-2 en los pesos del tumor PC-3 después de 43 días de exposición al anticuerpo VEGF-2. La Figura 30E muestra el efecto de anticuerpos VEGF-2 en el índice de crecimiento de tumor PC-3 durante un periodo superior a 40 días. La Figura 30F muestra el efecto de anticuerpos VEGF-2 en el volumen de tumor PC-3 después de 42 días de exposición al anticuerpo VEGF-2.

Descripción Detallada de las Realizaciones Preferentes

El polipéptido VEGF-2 de la presente descripción tiene como fin incluir el polipéptido de longitud completa y la secuencia de polinucleótido que codifica cualquier secuencia líder y fragmentos activos del polipéptido de longitud completa. Los fragmentos activos incluyen cualquier porción de la secuencia de aminoácido de longitud completa que tenga menos de 419 aminoácidos completos de la secuencia de aminoácido de longitud completa tal y como se muestra en la SEQ ID NO:2, pero que aún así contenga los ocho residuos de cisteína mostrados y conservados en la Figura 3 y que aún tenga actividad VEGF-2.

Tal y como se describe con detalle a continuación, los polipéptidos de la presente descripción pueden usarse para crear anticuerpos policlonales y monoclonales, que son útiles en ensayos de diagnóstico para detectar expresión de proteína VEGF-2 tal y como se describe a continuación o como agonistas y antagonistas capaces de aumentar o inhibir la función de la proteína VEGF-2. Además, estos polipéptidos pueden usarse en el sistema dos híbridos de levadura para “capturar” las proteínas VEGF-2 que son también candidatas agonistas y antagonistas de acuerdo con la presente invención. El sistema dos híbridos de levadura se describe en Fields y Song, Nature 340:245-246 (1989).

La descripción también proporciona un péptido o polipéptido que contiene una porción que transporta un epítope de un polipéptido de la descripción. En lo relativo a la selección de péptidos o polipéptidos que transportan un epítope anigénico (es decir, que contienen una región de una molécula proteica a la cual un anticuerpo puede enlazarse), es bien conocido en la técnica que los péptidos sintéticos relativamente cortos que imitan parte de una secuencia proteica son de manera rutinaria capaces de provocar un antisuero que reacciona con la proteína parcialmente imitada. Ver, por ejemplo, Sutcliffe, J. G., Shinnick, T. M., Green, N. y Learner, R.

A. (1983). Anticuerpos que reaccionan con lugares predeterminados en proteínas. Science 219:660-666. Péptidos capaces de provocar suero reactivo con proteína se representan con frecuencia en la secuencia primaria de una proteína y pueden caracterizarse por un conjunto de reglas químicas sencillas, y no se restringen ni a regiones inmunodominantes de proteínas intactas (es decir, epítopes inmunogénicos) ni a los terminales de amino y carboxil. Los péptidos que son extremadamente hidrofóbicos y aquellos de seis o menos residuos generalmente son inefectivos para inducir anticuerpos que se enlacen con la proteína imitada; los péptidos más largos y solubles, especialmente aquellos que contienen residuos de prolina, normalmente son efectivos. Sutcliffe et al., supra, en 661. Por ejemplo, 18 de los 20 péptidos diseñados de acuerdo con estas pautas, que contienen 8-39 residuos que cubren el 75% de la secuencia de la cadena de polipéptidos de hemaglutinina HA1 del virus de la influenza, provocaron anticuerpos que reaccionaron con la proteína HA1 o con el virus intacto; y 12/12 péptidos de la polimerasa MuLV y 18/18 de glicoproteína de la rabia provocaron anticuerpos que precipitaron las respectivas proteínas.

Por lo tanto, los péptidos y polipéptidos que transportan epítope antigénico de la descripción son útiles para crear anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se enlazan específicamente con un polipéptido de la descripción. Por consiguiente, una alta proporción de hibridomas obtenidos mediante fusión de células del bazo inmunizados con un péptido que transporta un epítope generalmente segregaron anticuerpo ractivo con la proteína nativa. Sutcliffe et al., supra, en 663. Los anticuerpos creados por péptidos o polipéptidos que transportan epítope antigénico son útiles para detectar la proteína imitada, y los anticuerpos para diferentes péptidos pueden usarse para seguir el rastro de varias regiones de un precursor de proteína que sufre procesos traslacionales. Los anticuerpos de péptido y anti-péptido pueden usarse en una variedad de ensayos cualitativos y cuantitativos para la proteína imitada, por ejemplo, en ensayos de competición ya que se ha demostrado que incluso péptidos cortos (por ejemplo, aproximadamente 9 aminoácidos) pueden enlazar y desplazar los péptidos más largos en ensayos de inmunoprecipitación. Ver por ejemplo, Wilson et al, Cell 37:767-778 (1984) en 777. Los anticuerpos anti-péptido de la invención también son útiles en la purificación de la proteína imitada, por ejemplo, mediante cromatografía de adsorción usando métodos bien conocidos en la técnica.

Los péptidos y polipéptidos que transportan epítope antigénico de la descripción diseñado de acuerdo con las pautas anteriormente señaladas contienen una secuencia de al menos siete, al menos nueve y entre 15 y aproximadamente 30 aminoácidos contenidos en la secuencia de aminoácido de un polipéptido de la descripción. Sin embargo, los péptidos o polipéptidos que comprenden una porción más larga de una secuencia de aminoácido de un polipéptido de la descripción, que contenga aproximadamente 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o 150 aminoácidos, o de mayor longitud y que incluya la secuencia completa de aminoácido de un polipéptido de la invención, también se consideran péptidos o polipéptidos que transportan epítope de la descripción y también son útiles para inducir anticuerpos que reaccionan con la proteína imitada. La secuencia de aminoácido del péptido que transporta epítope puede seleccionarse para que proporcione una sustancial solubilidad en disolventes acuosos (es decir, la secuencia incluye residuos relativamente hidrofílicos y secuencias muy hidrofóbicas pueden evitarse); y se consideran de manera particular las secuencias que contienen residuos de prolina.

Ejemplos no limitativos de polipéptidos o péptidos antigénicos que pueden usarse para generar anticuerpos específicos de VEGF-2 incluyen los siguientes: un polipéptido que comprende residuos e aminoácidos desde aproximadamente leu-37 hasta aproximadamente glu-45 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Tyr-58 hasta aproximadamente Gly-66 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Gln-73 hasta aproximadamente Glu-81 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Asp-100 hasta aproximadamente Cys-108 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Gly-140 hasta aproximadamente Leu-148 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Pro-168 hasta aproximadamente Val-176 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente His-183 hasta aproximadamente Lys-191 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Ile-201 hasta aproximadamente Thr-209 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Ala-216 hasta aproximadamente Tyr-224 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Asp-244 hasta aproximadamente His-254 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Gly-258 hasta aproximadamente Glu-266 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Cys-272 hasta aproximadamente Ser-280 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Pro-283 hasta aproximadamente Ser-291 en SEQ ID NO:2. desde aproximadamente Cys-296 hasta aproximadamente Gln-304 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Ala-307 hasta aproximadamente Cys-316 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Val-319 hasta aproximadamente Cys-335 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Cys-339 hasta aproximadamente Leu-347 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Cys-360 hasta aproximadamente Glu-373 en SEQ ID NO:2, desde aproximadamente Tyr-378 hasta aproximadamente Val-386 en SEQ ID NO:2, and desde aproximadamente Ser-388 hasta aproximadamente Ser-396 en SEQ ID NO:2. Estos fragmentos de polipéptido han sido determinados para transportar epítopes antigénicos de la proteína VEGF-2 mediante análisis del índice antigénico de Jameson-Wolf.

Los péptidos y polipéptidos que transportan epítope de la descripción pueden producirse a través de medios convencionales para hacer péptidos o polipéptidos entre los que se incluyen medios recombinantes que usan moléculas de ácido nucleico de la descripción. Por ejemplo, una secuencia corta de aminoácido que transporta epítope puede fusionarse con un polipéptido más largo que actúa como portador durante la producción y purificación recombinante así como durante la inmunización para producir anticuerpos anti-péptido. Los péptidos que transportan epítope también pueden sintetizarse usando métodos conocidos de síntesis química. Por ejemplo, Houghten ha descrito un método sencillo para sintetizar grandes números de péptidos, como 10-20 mg de 248 péptidos diferentes de residuo 13 que representan variantes sencillas de aminoácido de un segmento del polipéptido HA1 que se prepararon y caracterizaron (mediante estudios de enlace del tipo ELISA) en menos de cuatro semanas. Houghten, R. A. (1985) Método general para la síntesis rápida en fase sólida de grandes números de péptidos: especificidad de interacción antígenoanticuerpo en el nivel de aminoácidos individuales. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135. Este proceso “Síntesis Múltiple Simultánea del Péptido (SMPS)” se describe además en la Patente de Estados Unidos Nº 4,631,211 de Houghten et al. (1986). En este procedimiento, las resinas individuales para la síntesis en fase sólida de varios péptidos están contenidas en paquetes separados permeables al disolvente, permitiendo un uso óptimo de los muchos pasos repetitivos e idénticos que implican los métodos en fase sólida. Un procedimiento completamente manual permite que 5001000 o más síntesis se puedan producir simultáneamente. Houghten et al., supra, en 5134.

Los péptidos y polipéptidos que transportan epítope de la descripción se usan para provocar anticuerpos de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sutcliffe et al., supra; Wilson et al., supra; Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914; y Bittle, F. J. et al., J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985). Generalmente, los animales pueden inmunizarse con tres péptidos; sin embargo, el título de anticuerpo anti-péptido puede aumentarse uniendo el péptido a un portador macromolecular, como hemocianina de lapa californiana (KLH) o toxoide del tétanos. Por ejemplo, péptidos que contienen cisteína pueden unirse a un portador usando un enlace como éster m-maleimidobenzoilo-Nhidroxisuccinimida (MBS), mientras que otros péptidos pueden unirse a un portador usando un agente de enlace más general como glutaraldehído. Los animales como los conejos, ratas y ratones se inmunizan con péptidos libres o unidos a portadores, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal y/o intradérmica de emulsiones que contienen aproximadamente 100 mg de péptido o proteína portadora y adyuvante de Freud. Pueden necesitarse varias inyecciones de estimulación, por ejemplo, en intervalos de aproximadamente dos semanas, para proporcionar un título adecuado de anticuerpo anti-péptido que pueda detectarse, por ejemplo, mediante ensayo ELISA usando péptido libre adsorbido a una superficie sólida. El título de anticuerpos anti-péptido en suero de un animal inmunizado puede aumentar mediante una selección de anticuerpos anti-péptido, por ejemplo, mediante adsorción al péptido sobre un soporte sólido y elución de los anticuerpos seleccionados de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica.

Los péptidos que transportan epítope inmunogénico de la descripción, es decir, aquellas partes de una proteína que provocan una respuesta del anticuerpo cuando toda la proteína es un inmunogen, se identifican de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Geysen et al., supra, describe un procedimiento para síntesis concurrente rápida sobre soportes sólido de cientos de péptidos de suficiente pureza como para reaccionar en un ensayo inmunosorbente con unión de enzimas. La interacción de los péptidos sintetizados con los anticuerpos se detecta fácilmente sin retirarlos del soporte. De esta manera, un experto en la técnica puede identificar de manera rutinaria un péptido que contiene un epítope inmunogénico de una proteína deseada. Por ejemplo, el epítope inmunológicamente importante en la proteína de capa del virus de la fiebre aftosa fue localizado por Geysen et al. con una resolución de siete aminoácidos mediante síntesis de un conjunto solapado de todos los 208 hexapéptidos posibles que cubren la secuencia entera de 213 aminoácidos de la proteína. A continuación, se sintetizó el conjunto completo de reemplazo de péptidos en los 20 aminoácidos se sustituyeron a su vez en todas las posiciones dentro del epítope, y se determinaron los aminoácidos particulares que conferían especificidad a la reacción con el anticuerpo. Por lo tanto, los análogos del péptido de los péptidos que transportan epítope de la invención pueden hacerse de manera rutinaria mediante este método. La Patente de Estados Unidos Nº 4,708,781 de Geysen (1987) describe además este método para identificar un péptido que transporta un epítope inmunogénico de la proteína deseada.

Eliminaciones en la Terminal Amino y Terminal Carboxi

Además, VEGF-2 parece estar proteolíticamente clavado en la expresión resultante de los fragmentos de polipéptido de los siguientes tamaños cuando circulan en un gel SDS-PAGE (los tamaños son aproximados) (Ver Figuras 6-8, por ejemplo): 80, 59, 45, 43, 41, 40, 39, 37, 36, 31, 29, 21 y 15 kDa. Estos fragmentos de polipéptido son el resultado de la división proteolítica en las porciones terminal N terminal C de la proteína. Estos fragmentos proteolíticamente generados parecen tener actividad, particularmente el fragmento 21 kDa.

Además, la creación de proteínas puede emplearse con el fin de mejorar o alterar una o más características de VEGF-2 nativo. La eliminación de aminoácidos en la terminal de carboxi puede mejorar la actividad de las proteínas. Un ejemplo es gamma interferón que muestra una actividad hasta diez veces mayor eliminando los diez residuos de aminoácido de la terminal carboxi de la proteína (Döbeli et al., J. of Biotechnology 7:199-216 (1988)). Por lo tanto, la descripción proporciona análogos de polipéptido de VEGF-2 y secuencias nucleótidas que codifican tales análogos que muestran una mayor estabilidad (por ejemplo, cuando se exponen a pH habitual, condiciones térmicas u otras condiciones de almacenamiento) en relación con el polipéptido nativo VEGF-2.

La descripción incluye los siguientes mutantes de eliminación: Thr(103)-Arg(227); Glu(104) -- Arg(227); Ala(112) --Arg (227); Thr(103) -- Scr(213); Glu(104) -- Ser(213); Thr(103) -Leu(215); Glu(47) -- Ser(419); Met(1), Glu (23), o Ala (24)Met(263); Met(1), Glu (23), o Ala (24) -- Asp(311); Met(1), Glu (23), o Ala (24)Pro (367); Met(1) -- Ser(419); y Met(1) -- Ser(228) de (Figura 1 (SEQ ID NO:18)).

También se describen mutantes de eliminación que tienen aminoácidos eliminados de la terminal N y terminal C. Tales mutantes incluyen todas las combinaciones de los mutantes de eliminación de terminal N y los mutantes de eliminación de terminal C descritos anteriormente. Estas combinaciones pueden hacerse usando técnicas recombinantes conocidas por aquellos expertos en la técnica.

En particular, las eliminaciones en terminal N del polipéptido VEGF-2 pueden describirse mediante la fórmula general m-396, donde m es un número entero desde -23 a 388, donde m corresponde a la posición del residuo de aminoácido identificado en SEQ ID NO:2. Las eliminaciones en la terminal N conservan el área recuadrada de la Figura 3 (PXCVXXXRCXGCCN) (SEQ ID NO:8).

Además, las eliminaciones en la terminal C del polipéptido VEGF-2 también pueden describirse mediante la fórmula general 23-n, donde n es un número entero desde -15 a 395 donde n corresponde a la posición de residuo de aminoácido identificado en SEQ ID NO:2. Las eliminaciones en la terminal C conservan el área recuadrada de la Figura 3 (PXCVXXXRCXGCCN) (SEQ ID NO:8).

Además, la descripción también proporciona polipéptidos que tiene uno o más aminoácidos eliminados de la terminal amino y caboxi, que pueden describirse de manera general por tener residuos m-n de SEQ ID NO:2, donde n y m son números enteros tal y como se ha descrito anteriormente.

Muchas secuencias de polinucleótido, como secuencias EST, se encuentras disponibles al público y son accesibles a través de bases de datos secuenciales. Algunas de estas secuencias están relacionadas con SEQ ID NO:1 pueden encontrarse públicamente disponibles antes de la concepción de la presente descripción. Preferiblemente, tales polinucleótidos relacionados se excluyen específicamente del alcance de la presente descripción. Listar todas las secuencias relacionadas sería pesado. Por consiguiente, se excluyen de la presente descripción uno o más polinucleótidos que consisten en una secuencia nucleótida descrita por la fórmula general de a-b, donde a es un número entero entre 1 y 1660 de SEQ ID NO:1, b es un número entero de 15 a 1674, donde tanto a como b corresponden a las posiciones de residuos de nucleótido mostradas en la SEQ ID NO:1, y donde b es mayor o igual a + 14.

Por lo tanto, la presente descripción proporciona mutantes de eliminación en la terminal N. Estos mutantes incluyen aquellos que comprenden la secuencia de aminoácido mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:18) excepto por una eliminación de al menos los 24 primeros residuos de aminoácido en la terminal N (es decir, la eliminación de al menos Met (1) – Glu (24)) pero no más de los primeros 115 residuos de aminoácido en la terminal N de la Figura 1 (SEQ ID NO:18). De manera alternativa, los 24 primeros residuos de aminoácido en la terminal N (es decir, la eliminación de al menos Met

(1) – Glu (24)) pero no más de los primeros 103 residuos de aminoácido en la terminal N de la Figura 1 (SEQ ID NO:18).

La presente descripción proporciona mutantes de eliminación en la terminal C. Estos mutantes incluyen aquellos que comprenden la secuencia de aminoácido mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:18) excepto por una eliminación de al menos el último residuo de aminoácido en la terminal C (Ser (419)) pero no más de los últimos 220 residuos de aminoácido en la terminal C (es decir, la eliminación de los residuos de aminoácido Val (199) – Ser (419)) de la Figura 1 (SEQ ID NO:18). De manera alternativa, la eliminación incluirá al menos el último residuo de aminoácido en la terminal C pero no más de los últimos 216 residuos de aminoácido en la terminal C de la Figura 1 (SEQ ID NO:18). De manera alternativa, la eliminación incluirá al menos el último residuo de aminoácido en la terminal C pero no más de los últimos 204 residuos de aminoácido en la terminal C de la Figura 1 (SEQ ID NO:18). De manera alternativa, la eliminación incluirá al menos el último residuo de aminoácido en la terminal C pero no más de los últimos 192 residuos de aminoácido en la terminal C de la Figura 1 (SEQ ID NO:18). De manera alternativa, la eliminación incluirá al menos el último residuo de aminoácido en la terminal C pero no más de los últimos 156 residuos de aminoácido en la terminal C de la Figura 1 (SEQ ID NO:18). De manera alternativa, la eliminación incluirá al menos el último residuo de aminoácido en la terminal C pero no más de los últimos 108 residuos de aminoácido en la terminal C de la Figura 1 (SEQ ID NO:18). De manera alternativa, la eliminación incluirá al menos el último residuo de aminoácido en la terminal C pero no más de los últimos 52 residuos de aminoácido en la terminal C de la Figura 1 (SEQ ID NO:18).

En la presente descripción también se incluyen mutantes de eliminación que tienen aminoácidos eliminados por residuos de la terminal N y terminal C. Dichos mutantes incluyen todas las combinaciones de los mutantes de eliminación en terminal N y mutantes de eliminación en terminal C descritas anteriormente. Actividades Biológicas de VEGF-2

Los polinucleótidos y polipéptidos VEGF-2 pueden usarse en ensayos para testar una o más actividades biológicas. Si los Los polinucleótidos y polipéptidos VEGF-2 muestran actividad en un ensayo particular, es posible que VEGF-2 pueda participar en las enfermedades asociadas con la actividad biológica. Por lo tanto, VEGF-2 o los anticuerpos VEGF-2 podría usarse para tratar la enfermedad asociada. Actividad Anti-Angiogénesis

El balance que ocurre de manera natural entre estimuladores endógenos e inhibidores de angiogénesis es uno en los que las influencias inhibidoras predominan. Rastinejad et al., Cell 56:345-355 81989). En aquellos casos raros en los que ocurre neovascularización bajo condiciones fisiológicas normales, como curación de heridas, regeneración de órganos, desarrollo embriónico, y proceso de reproducción femenina, la angiogénesis se regula con rigor y se delimita espacialmente y temporalmente. Bajo condiciones de angiogénesis patológica como las que caracterizan el crecimiento de tumor sólido, estos controles reguladores fallan. La angiogénesis no regulada se convierte en patológica y mantiene la progresión de muchas enfermedades neoplásticas y no-neoplásticas. La neovascularización anormal domina varias enfermedades serias como crecimiento de tumor sólido y metástasis, artritis, algunos tipos de trastornos oculares, y psoriasis. Ver, por ejemplo, publicaciones de Moses et al., Biotech. 9:630-634 (1991); Folkman et al., N. Engl.

J. Med. 333:1757-1763 (1995); Auerbach et al., J. Microvasc. Res. 29:401-411 (1985); Folkman, Advances in Cancer Research, eds. Klein and Weinhouse, Academic Press, New York, pp.175-203 (1985); Patz, Am. J. Opthalmol. 94:715-743 (1982); and Folkman et al., Science 221:719-725 (1983). En un número de condiciones patológicas, el proceso de angiogénesis contribuye al estado de enfermedad. Por ejemplo, se han acumulado bastantes datos que sugieren que el crecimiento de tumores sólidos depende de angiogénesis. Folkman y Klagsbrun, Science 235:442-447 (1987).

Aquí se describen métodos para el tratamiento de enfermedades o trastornos asociados con la neovascularización mediante la administración de los anticuerpos de la invención. Condiciones malignas y de metástasis que pueden tratarse con los anticuerpos de la invención incluyen, aunque no se limitan a, tumores malignos, tumores sólidos, cánceres aquí descritos o sino conocidos en la técnica (para publicaciones de tales trastornos, ver Fishman et al., Medicine, 2ª ed. J. B. Lippincott Co. Philadelphia (1985)). Por lo tanto, aquí se describe un método para tratar una enfermedad y/o trastorno relacionado con angiogénesis, que consiste en la administración a un individuo que lo necesite una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse en varios métodos adicionales con el fin de tratar terapéuticamente un cáncer o un tumor. Los cánceres que pueden tratarse con anticuerpo incluyen, aunque no se limitan a, tumores sólidos, incluyendo cáncer de próstata, pulmón, pecho, cerebro, ovario, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, glándula parótida, tracto biliar, color, recto, cuello del útero, útero, endometrio, riñón, vejiga, glándula tiroide; tumores primarios y metástasis; melanomas; gliobastoma; sarcoma de Kaposi; leiomisarcoma; cáncer de pulmón de células no pequeñas; cáncer colorectal; tumores malignos avanzados; y tumores con origen en la sangre como leucemias. Por ejemplo, los anticuerpos pueden administrarse tópicamente, con el fin de tratar cánceres como cáncer de piel, tumores en la cabeza y en el cuello, tumores de pecho y sarcoma de Kaposi.

Como además se describe, los anticuerpos pueden tratarse para tratar formas superficiales de cáncer de vejiga mediante, por ejemplo, administración intravesical. Los anticuerpos pueden enviarse directamente al tumor, o cerca del punto del tumor, a través de inyección o catéter. Por supuesto, los expertos en la técnica apreciarán que el modo apropiado de administración variará dependiendo del cáncer a ser tratado. Aquí se incluyen otros modos de envío.

Los anticuerpos pueden ser útiles para tratar otros trastornos además de cáncer que impliquen angiogénesis. Estos trastornos incluyen, aunque no se limitan a: tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, y granulomas piogénicos; placas ateroscleróticas; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de la prematuridad, degeneración macular, rechazo de injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, uveítis y Pterigión (crecimiento anormal del vaso sanguíneo) del ojo; artritis reumatoide; psoriasis; curación tardía de heridas; endometriosis; vasculogénesis; granulaciones; cicatrices hipertróficas (queloides); fracturas sin unión; escleroderma; tracoma; adhesiones vasculares; angiogénesis del miocardio; vasos colaterales coronarios; vasos colaterales cerebrales; malformaciones arteriovenosas; angiogénesis de extremidades isquémicas; Síndrome de Osler-Weber; neovascularización de placas; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; displasia fibromuscular; granulación de heridas; enfermedad de Crohn; y arterosclerosis.

Por ejemplo, se describen métodos para tratar cicatrices hipertróficas y queloides, que consisten en el paso de administración de anticuerpos de la invención a una cicatriz hipertrófica o queloide.

Los anticuerpos pueden inyectarse directamente en la cicatriz hipertrófica o queloide, con el fin de prevenir la progresión de estas lesiones. Esta terapia posee un valor especial en el tratamiento profiláctico de condiciones que se conoce que son el resultado en el desarrollo de cicatrices hipertróficas y queloides (por ejemplo, en el trasero), y preferiblemente se inicia después de que la fase proliferativa haya tenido tiempo para progresar (aproximadamente 14 días después de la lesión inicial), pero antes del desarrollo de la cicatriz hipertrófica o queloide. Tal y como se ha anotado previamente, la presente invención también proporciona métodos para tratar enfermedades neovasculares del ojo, incluyendo por ejemplo, neovascularización de la córnea, glaucoma neovascular, retinopatía diabética proliferativa, fibroplasia retrolental y degeneración macular.

Además, los trastornos oculares asociados con la neovascularización que pueden tratarse con los anticuerpos de la presente invención incluyen, aunque no se limitan a: glaucoma neovascular, retinopatía diabética retinoblastoma, fibroplasia retrolental, uveítis, degeneración de retinopatía de la prematuridad, neovascularización en injerto de córnea, así como otras enfermedades oculares inflamatorias, tumores oculares y enfermedades asociadas con neovascularización coroidal o del iris. Ver, por ejemplo, publicaciones de Waltman et al., Am. J. Ophthal. 85:704-710 (1978) y Gartner et al., Surv. Ophthal. 22:291-312 (1978).

Por lo tanto, se describen métodos para tratar enfermedades neovasculares del ojo como neovascularización de la córnea (incluyendo neovascularización en el injerto de córnea), que consisten en el paso de administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto (como el descrito anteriormente, que incluye anticuerpos) a la córnea, de tal modo que se inhiba la formación de vasos sanguíneos. En resumen, la córnea en un tejido en el que normalmente carece de vasos sanguíneos. Sin embargo, en ciertas condiciones patológicas, los capilares pueden extenderse hasta la córnea desde el plexo vascular pericorneal del limbo. Cuando la córnea se vasculariza, también se nubla, dando como resultado una disminución en la agudeza visual del paciente. La pérdida visual puede ser completa cuando si la córnea se vuelve completamente opaca. Varios trastornos pueden resultar en la neovascularización de la córnea, incluyendo por ejemplo, infecciones en la córnea (por ejemplo, tracoma, queratitis por herpes simple, leishmaniasis y oncocercosis), procesos inmunológicos (por ejemplo, rechazo de injerto y síndrome de Steven-Johnson), quemaduras por álcali, trauma, inflamación (por cualquier causa), estados de deficiencia tóxica y nutricional, y como complicación de llevar lentes de contacto.

Los anticuerpos pueden prepararse para administración en salina (en combinación con agentes conservantes y microbiales comúnmente usados en preparaciones oculares), y se administran en forma de gotas para los ojos. La solución o suspensión puede prepararse en su forma pura y administrarse varias veces al día. De manera alternativa, las composiciones anti-angiogénicas, preparadas tal y como se ha descrito previamente, pueden también administrarse directamente a la córnea. En las realizaciones preferentes, la composición antiangiogénica se prepara con un polímero muco-adhesivo que se liga a la córnea. En otras realizaciones, el factor antiangiogénico o las composiciones antiangiogénicas pueden utilizarse como un complemento a la terapia convencional con esteroides. La terapia tópica también puede ser profilácticamente en lesiones de la córnea que son conocidas por tener una elevada probabilidad de provocar una respuesta angiogénica (como quemaduras químicas). En estos casos, el tratamiento, probablemente en combinación con esteroides, puede iniciarse inmediatamente para ayudar a prevenir posteriores complicaciones.

Tal y como aquí se describe, los anticuerpos anteriormente descritos pueden inyectarse directamente en el estroma corneal por parte de un oftalmólogo bajo guía microscópica. El punto preferente de inyección puede variar por la morfología de la lesión individual, pero el objetivo de la administración sería colocar la composición en la parte frontal delantera de la vasculatura (es decir, intercalada entre los vasos sanguíneos y la córnea normal). En la mayoría de los casos, esto podría implicar la inyección corneal prelímbica para “proteger” la córnea del avance de los vasos sanguíneos. Este método también puede utilizarse poco después de un daño en la córnea con el fin de evitar profilácticamente la neovascularización de la córnea. En esta situación, el material podría inyectare en la córnea prelímbica intercalada entre la lesión de la córnea y su potencial suministro no deseado de sangre límbica. Estos métodos también pueden utilizarse de manera similar para evitar la invasión capilar de córneas trasplantadas. En forma de inyecciones con liberación mantenida solamente puede ser necesario 2-3 veces al año. También puede añadirse un esteroide a la solución de la inyección para reducir la inflamación resultante de la propia inyección.

Se describen métodos adicionales para tratar glaucoma neovascular, que consisten en el paso de administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo al ojo, de modo que se inhiba la formación de vasos sanguíneos. En una realización, el compuesto puede administrase por vía tópica al ojo con el fin de tratar formas tempranas de glaucoma neovascular. En otras realizaciones, el compuesto puede implantarse mediante inyección en la región del ángulo anterior de la cámara. En otras realizaciones, el compuesto también puede colocarse en una localización de tal modo que el compuesto se libere de manera continua en el humor acuoso. En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan métodos para tratar retinopatía diabética proliferativa, que consisten en el paso de administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo a los ojos, de modo que se inhiba la formación de vasos sanguíneos.

La retinopatía diabética proliferativa puede tratarse mediante inyección en el humor acuoso del vítreo, con el fin de aumentar la concentración local de anticuerpos en la retina. Preferiblemente, este tratamiento debería iniciarse antes de la adquisición de enfermedad severa que requiera fotocoagulación.

Se describen métodos para tratar fibroplasia retrolental, que consisten en el paso de administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo al ojo, de modo que se inhiba la formación de vasos sanguíneos. El compuesto puede administrase por vía tópica, por medio de inyección intravítrea y/o por medio de implantes intraoculares.

Además, trastornos que pueden tratarse con anticuerpos que incluyen, aunque no se limitan a, hemangioma, artritis, psoriasis, angiofibroma, placas ateroscleróticas, curación tardía de heridas, granulaciones, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, fracturas sin unión, Síndrome de Osler-Weber, granuloma piogénico, escleroderma, tracoma y adhesiones vasculares.

Además, los trastornos y/o estados, que pueden tratarse, prevenirse, diagnosticarse y/o pronosticarse con los anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a, tumores sólidos, tumores nacidos en sangre como leucemias, metástasis de tumor, sarcoma de Kaposi, tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, y granulomas piogénicos, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de la prematuridad, degeneración macular, rechazo a injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, y uveítis, curación tardía de heridas, endometriosis, vasculogénesis, granulaciones, cicatrices hipertróficas (queloides), fracturas sin unión, escleroderma, tracoma,

adhesiones vasculares, angiogénesis del miocardio, vasos colaterales coronarios, vasos colaterales cerebrales, malformaciones arteriovenosas, angiogénesis de extremidades isquémicas, Síndrome de Osler-Weber; neovascularización de placas, telangiectasia, articulaciones hemofílicas, displasia fibromuscular de angiofibroma, granulación de heridas, enfermedad de Crohn, arterosclerosis, agente de control de nacimiento evitando la vascularización necesaria para la menstruación controlando la implantación de embrión, enfermedades que tienen angiogénesis como una consecuencia patológica como enfermedad del arañazo de gato (Rochele minalia quintosa), úlceras (Helicobacter pylori), Bartonelosis y angiomatosis bacilar.

En un aspecto del método de control de nacimiento, se administra una cantidad del compuesto suficiente como para bloquear la implantación del embrión antes o después de que haya ocurrido el acto sexual y la fertilización, proporcionando de este modo un método efectivo de control de nacimiento, posiblemente un método “del día después”. Los anticuerpos también pueden usarse para controlar la menstruación o pueden administrarse como fluido para lavado peritoneal o para la implantación peritoneal en el tratamiento de endometriosis.

Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse en suturas quirúrgicas con el fin de evitar granulomas en puntos de cirugía.

Los anticuerpos pueden utilizarse en varios procedimientos quirúrgicos. Por ejemplo, en un aspecto de la presente invención una composición (en forma de, por ejemplo, un espray o una capa) puede utilizarse para cubrir o pulverizar una zona antes de retirar el tumor, con el fin de aislar los tejidos normales circundantes del tejido maligno, y/o para evitar la extensión de enfermedad a los tejidos circundantes. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones (por ejemplo, en forma de un espray) pueden enviarse por medio de procedimientos endoscópicos con el fin de cubrir tumores, o inhibir angiogénesis en una localización deseada. En otros aspectos de la presente invención, pueden utilizarse mallas quirúrgicas que han sido cubiertas con las composiciones antiangiogénicas de la presente invención en un procedimiento en el que puede utilizarse una malla quirúrgica. Por ejemplo, en una realización de la presente invención una malla quirúrgica cargada con una composición antiangiogénica puede utilizarse durante una cirugía de resección en cáncer abdominal (por ejemplo, tras una resección de colon) con el fin de proporcionar un soporte a la estructura y para liberar una cantidad del factor antiangiogénico.

Además se describen métodos para tratar puntos de escisión de tumores, que consiste en administrar un anticuerpo a los márgenes de la resección de un tumor tras la escisión, de tal modo que se inhiba la recurrencia local de cáncer y la formación de nuevos vasos sanguíneos en la zona. En una realización de la invención, el compuesto antiangiogénico, por ejemplo anticuerpo VEGF-2, se administra directamente al punto de escisión del tumor (por ejemplo, se aplica mediante hisopos húmedos, cepillando o sino cubriendo los márgenes de resección del tumor con el anticuerpo VEGF-2). De manera alternativa, los anticuerpos VEGF-2 pueden incorporarse a las pastas quirúrgicas conocidas antes de la administración. En realizaciones particularmente preferentes de la invención, los anticuerpos VEGF-2 se aplican tras resección hepática para tumores malignos, y tras operaciones neuroquirúrgicas.

Los anticuerpos VEGF-2 también pueden administrarse al margen de restricción de una gran variedad de tumores, incluyendo por ejemplo, tumores de pecho, colon, cerebro y hepáticos. Por ejemplo, en una realización de la invención, los anticuerpos VEGF-2 pueden administrarse al punto de un tumor neurológico tras la escisión, de tal modo que se inhiba la formación de nuevos vasos sanguíneos.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden administrarse junto con otros factores antiangiogénicos. Ejemplos representativos de otros factores antiangiogénicos incluyen: Factor Anti-Invasivo, ácido retinoico y derivados del mismo, paclitaxel, Suramina, Inhibidor de Tejido de Metaloproteinasa-1, Inhibidor de Tejido de Metaloproteinasa-2, Inhibidor del Activador del Plasminógeno-1, Inhibidor del Activador del Plasminógeno-2, y varias formas de los metales de transición del “grupo d” más ligeros.

Los metales de transición del “grupo d” más ligeros incluyen, por ejemplo, vanadio, molibdeno, tungsteno, titanio, niobio, y especies de tantalio. Estas especies de metales de transición pueden formar complejos de metales de transición. Complejos adecuados de los metales de transición que se acaban de mencionar incluyen complejos oxo de metales de transición.

Ejemplos representativos de complejos de vanadio incluyen complejos de vanadio oxo como complejos de vanadato y vanadil.

Complejos adecuados de vanadato incluyen complejos de metavanadato y ortovanadato como, por ejemplo, metavanadato de amonio, metavadanato de sodio, y ortovanadato de sodio. Complejos adecuados de vanadil incluyen, por ejemplo, acetilacetonato de vanadil y sulfato de vanadil que incluye hidratos de sulfato de vanadil como mono- y trihidratos de sulfato de vanadil.

Ejemplos representativos de complejos de tungsteno y molibdeno también incluyen complejos oxo. Complejos oxo adecuados de tungsteno incluyen complejos óxidos de tungstato y tungsteno. Complejos adecuados de tungstato incluyen tungstato de amonio, tungstato de calcio, dihidrato de tungstato sódico y ácido túngstico. Óxidos de tungsteno adecuados incluyen óxido de tungsteno (IV) y óxido de tungsteno (VI). Complejos oxo adecuados de molibdeno incluyen molibdato, óxido de molibdeno, y complejos de molibdenilo. Complejos adecuados de molibdato incluyen molibdato de amonio y sus hidratos, molibdato de sodio y sus hidratos, y molibdato de potasio y sus hidratos. Óxidos adecuados de molibdeno incluyen óxido de molibdeno (IV) y óxido de molibdeno

(VI) y ácido molíbdico. Complejos adecuados de molibdenilo incluyen, por ejemplo, acetilacetonato de molibdenilo. Otros complejos adecuados de tungsteno y molibdeno incluyen derivados hidroxo derivados de, por ejemplo, glicerol, ácido tartárico, y azúcares.

También puede utilizarse una amplia variedad de factores antiangiogénicos en el contexto de la presente invención. Ejemplos representativos incluyen factor plaquetario 4; sulfato de protamina; derivados de quitina sulfatada (preparados a partir de conchas de cangrejo reina), (Murata et al., Cancer Res. 51:22-26, 1991); Complejo Peptidoglicano Polisacárido Sulfatado (SP-PG) (la función de este compuesto puede aumentar en presencia de esteroides como estrógeno, y citrato de tamoxifeno); Estaurosporina; moduladores de metabolismo de matriz, incluyen por ejemplo, análogos de prolina, cishidroxiprolina, d,L-3,4-dehidroprolina, thiaprolina, alfa,alfa-dipiridilo, aminopropionitrilo fumarato; 4-propil-5(4-piridinilo)-2(3H)-oxazolona; Metotrexato; Mitoxantrona; Heparina; Interferonas; 2 Macroglobulina-suero; ChIMP-3 (Pavloff et al., J. Bio. Chem. 267:17321-17326, 1992); Quimostatina (Tomkinson et al., Biochem J. 286:475-480, 1992); Tetradecasulfato de ciclodextrina; Eponemicina; Camptotecina; Fumagilina (Ingber et al., Nature 348:555-557, 1990); Tiomalato sódico de oro (“GST”; Matsubara y Ziff, J. Clin. Invest. 79:1440-1446, 1987); anticolagenasa-suero; alfa2-antiplasmina (Holmes et al., J. Biol. Chem. 262(4):1659-1664, 1987); Bisantreno (Instituto Nacional de Cáncer); Lobenzarit disódico (N-(2)-carboxifenil-4-ácido disódico cloroantronílico o “CCA”; Takeuchi et al., Acciones de Agente 36:312-316, 1992); Talidomida; esteroide angoestático; AGM-1470; carboxinaminolmidazola; e inhibidores de metaloproteinasas como BB94.

Actividad Inmune

Los anticuerpos VEGF-2 pueden ser útiles en el tratamiento de deficiencias y trastornos del sistema inmune, activando o inhibiendo la proliferación, diferenciación, o movilización (quimiotaxis) de células inmunes. Las células inmunes se desarrollan por medio de un proceso llamado hematopoyesis, produciendo células mieloides (plaquetas, glóbulos rojos, neutrófilos y macrófagos) y células linfoides (linfocitos B y T) de células madres pluripotentes. La etiología de estas deficiencias y trastornos inmunes puede ser genético, somático, como cáncer o algunos trastornos autoinmunes, adquiridos (por ejemplo, mediante quimioterapia o toxinas), o infeccioso. Además, los anticuerpos VEGF-2 pueden usarse como marcadores o detectores de una particular enfermedad o un trastorno del sistema inmune.

Los anticuerpos VEGF-2 pueden ser útiles para tratar o detectar deficiencias o trastornos de células hematopoyéticas. Los anticuerpos VEGF-2 podrían usarte para aumentar la diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas, incluyendo las células madre pluripotentes, en un esfuerzo de tratar tales trastornos asociados con un descenso en ciertas (o muchas) tipos de células hematopoyéticas. Ejemplos de síndromes de deficiencia inmunológica incluyen, aunque no se limitan a: desorden de proteína en sangre (por ejemplo, agammaglobulinemia, disgammaglobulinemia), ataxia telangiectasia, inmunodeficiencia común variable, Síndrome de Digeorge, infección de VIH, infección HTLV-BLV, síndrome de adhesión leucocitaria deficiente, linfopenia, disfunción de fagocito bactericida, inmunodeficiencia combinada severa (SCDIs), Síndrome de Wiskott-Aldrich, anemia, trombocitopenia o hemoglobinuria.

Además, los anticuerpos VEGF-2 pueden también usarse para modular actividad hemostática (la frenada de sangre) o actividad trombolítica (la formación de coágulos). Por ejemplo, aumentando la actividad hemostática o trombolítica, los anticuerpos VEGF-2 podrían usarse para tratar trastornos de coagulación de sangre (por ejemplo, afibrinogenemia, deficiencias de factor), trastornos de plaquetas en sangre (por ejemplo, trombocitopenia), o heridas resultantes de trauma, cirugía u otras causas. De manera alternativa, los anticuerpos VEGF-2 que pueden hacer descender la actividad hemostática o trombolítica podrían usarse para inhibir o disolver coágulos, lo que resulta importante en el tratamiento de ataques al corazón (infartos), golpes y cicatrices.

Los anticuerpos VEGF-2 también pueden ser útiles para tratar

o detectar trastornos autoinmunes. Muchos trastornos autoinmunes son el resultado del reconocimiento inapropiado de los mismos como materia externa por parte de células inmunes. Este reconocimiento inapropiado da como resultado una respuesta inmune que conduce a la destrucción del tejido huésped. Por lo tanto, la administración de anticuerpos VEGF-2 que pueden inhibir la respuesta inmune, en particular la proliferación, diferenciación o quimiotaxis de células T, puede ser una terapia efectiva para prevenir trastornos autoinmunes.

Ejemplos de trastornos autoinmunes que pueden tratarse o detectarse con anticuerpos VEGF-2 incluyen, aunque no se limitan

a: Enfermedad de Addison, anemia hemolítica, síndrome antifosfolípido, artritis reumatoide, Síndrome de Goodpasture, Enfermedad de Graves, Esclerosis Múltiple, Miastenia Gravis, Neuritis, Oftalmía, Penfigoide Ampollar, Pénfigo, Poliendocrinopatías, Púrpura, Enfermedad de Reiter, Síndrome de Stiff-Man, Tiroiditis Autoinmune, Lupus Eritematoso Sistémico, Inflamación Pulmonar Autoinmune, Síndrome de Guillain-Barre, diabetes mellitus dependiente de insulina, y enfermedad inflamatoria autoinmune del ojo.

De manera similar, las reacciones y condiciones alérgica, como asma (en particular asma alérgico) y otros problemas respiratorios, pueden tratarse con anticuerpos VEFG-2. Además, los anticuerpos VEGF-2 pueden usarse para tratar anafilaxia, hipersensibilidad a una molécula antigénica, o incompatibilidad con el grupo sanguíneo.

Los anticuerpos VEGF-2 pueden también usarse para tratar y/o prevenir rechazo de órganos o enfermedad injerto-contrahuésped (EICH). El rechazo de órganos ocurre por parte de la destrución de la célula huésped inmune del tejido trasplantado a través de una respuesta inmune.

De manera similar, una respuesta inmune también se implica en EICH, pero en este caso las células inmunes externas trasplantadas destruyen los tejidos huéspedes. La administración de anticuerpos VEGF-2 que inhibe una respuesta inmune, en particular la proliferación, diferenciación, o quimiotaxis de células T, puede ser una terapia efectiva para prevenir rechazo de órganos

o EICH.

De manera similar, los anticuerpos VEGF-2 también pueden usarse para modular una inflamación. Por ejemplo, los anticuerpos VEGF-2 pueden inhibir la proliferación y diferenciación de células involucradas en una respuesta inflamatoria. Estas moléculas pueden usarse para tratar condiciones inflamatorias, tanto condiciones crónicas como agudas, incluyendo inflamación asociada con infección (por ejemplo, shock séptico, sepsis, o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), lesión de isquemiareperfusión, letalidad de endotoxina, artritis, rechazo hiperagudo mediado por complemento, nefritis, lesión de pulmón inducida por citoquina o quimioquina, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, o el resultado de la sobreproducción de citoquinas (por ejemplo, TNF o IL_1). Trastornos Hiperproliferativos

Los anticuerpos VEGF-2 de la invención, pueden usarse para tratar o detectar trastornos hiperproliferativos, incluyendo neoplasmas. Los anticuerpos VEGF-2 pueden inhibir la proliferación del trastorno a través de interacciones directas o indirectas. De manera alternativa, los anticuerpos VEGF-2 pueden proliferar otras células que pueden inhibir el trastorno hiperproliferativo.

Por ejemplo, los desordenes o trastornos hiperproliferativos pueden tratarse aumentando una respuesta inmune, en particular aumentando las calidades antigénicas del desorden hiperproliferativo

o proliferando, diferenciando o movilizando las células T. Esta respuesta inmune puede aumentar mejorando una respuesta ya existente, o iniciando una nueva respuesta inmune. De manera alternativa, haciendo disminuir una respuesta inmune puede ser también un método para tratar desordenes hiperproliferativos, como un agente quimioterapéutico. Ejemplos de trastornos hiperproliferativos que pueden tratarse o detectarse mediante anticuerpos VEGF-2 incluyen, aunque no se limitan a neoplasmas localizados en: abdomen, hueso, pecho, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (adrenal, paratiroide, pituitaria, testículos, ovario, timo, tiroide), ojo, cabeza y cuello, cerebro, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejido suave, bazo, próstata, sistema torácico y urogenital. En realizaciones preferentes, los anticuerpos VEGF-2 pueden usarte para tratar, prevenir o mejorar cáncer de pecho. En otras realizaciones preferentes, los anticuerpos VEGF-2 pueden usarte para tratar, prevenir o mejorar cáncer de cerebro. En otras realizaciones preferentes, los anticuerpos VEGF-2 pueden usarte para tratar, prevenir o mejorar cáncer de próstata. En otras realizaciones preferentes, los anticuerpos VEGF-2 pueden usarte para tratar, prevenir o mejorar cáncer de colon. En otras realizaciones preferentes, los anticuerpos VEGF-2 pueden usarte para tratar, prevenir o mejorar sarcoma de Kaposi.

De manera similar, otros trastornos hiperproliferativos pueden también tratarse o detectarse mediante anticuerpos VEGF-2. Ejemplos de estos trastornos hiperproliferativos incluyen, aunque no se limitan a: hipergammaglobulinemia, trastornos linfoproliferativos, paraproteinemias, púrpura, sarcoidosis, Síndrome de Sézary, Macroglobulinemia de Waldenstrom, Enfermedad de Gaucher, histiocitosis, y otras enfermedades hiperproliferativas además de neoplasia, localizadas en los sistemas de órganos anteriormente listados.

Composiciones farmacéuticas

Los anticuerpos VEGF-2 pueden emplearse en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Esas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido o agonista o antagonista, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Este portador incluye, aunque no se limita a, salina, salina de búfer, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. La formulación debería adecuarse al modo de administración.

La invención también proporciona un pack o kit farmacéutico que consiste en uno o más envases llenos con uno o más de los ingredientes de la composición farmacéutica de la invención. Acompañando a dicho envase, puede haber una nota prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuyo aviso refleja la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, uso o venta para administración humana. Además, las composiciones farmacéuticas pueden emplearse junto con otros compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de manera práctica por vía tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, subcutánea, intranasal o intradérmica. Las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad que sea efectiva para el tratamiento y/o profilaxis de la indicación específica.

En general, las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad de al menos aproximadamente 10 mg/kg peso corporal y en la mayoría de los casos se administrarán en una cantidad que no exceda aproximadamente los 8 mg/kg peso corporal por día. En la mayoría de los casos, la dosis es desde aproximadamente 10 mg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg peso corporal por día, teniendo en cuenta las rutas de administración, los síntomas, etc.

Los anticuerpos VEGF-2 que son polipéptidos también pueden emplearse de acuerdo con la presente invención mediante la expresión de estos polipéptidos in vivo, que a menudo se refiere como “terapia de gen”, anteriormente descrita.

Por lo tanto, por ejemplo, las células como las células de la médula pueden construirse con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica un anticuerpos VEGF-2 ex vivo, y las células construidas se facilitan posteriormente a un paciente pata tratarse con el polipéptido. Estos métodos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células pueden construirse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica usando una partícula retroviral que contenga ARN codificador del polipéptido de la presente invención.

De manera similar, las células pueden construirse in vivo para expresión de un anticuerpo VEGF-2, in vivo, por ejemplo, a través de procedimientos conocidos en la técnica. Tal y como se conoce en la técnica, una célula productora para producir una partícula retroviral que contenga ARN codificador de anticuerpos VEGF-2 de la presente invención puede administrarse a un paciente para producir células in vivo y expresión de anticuerpos VEGF-2 in vivo. Estos y otros métodos para administrar anticuerpos VEGF-2 de la presente invención por medio de tales métodos resultarán claros para aquellos expertos en la técnica a partir de los contenidos de la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de expresión para producir células puede ser otro diferente a la partícula retroviral, por ejemplo, un adenovirus, que puede usarse para producir células in vivo tras la combinación con un vehículo adecuado de envío.

Los retrovirus de los cuales los vectores de plásmido retrovirales anteriormente mencionados pueden derivarse incluyen, aunque no se limitan a, Virus de la Leucemia Murina de Moloney, virus de la necrosis esplénica, retrovirus como Virus del Sarcoma de Rous, Virus del Sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, virus de la leucemia del gibón, virus de inmunodeficiencia humana, adenovirus, Virus del Sarcoma Mieloproliferativo, y virus de tumor mamario. En una realización, el vector de plásmido retroviral se deriva del Virus de la Leucemia Murina de Moloney.

El vector incluye uno o más promotores. Promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, aunque no se limitan a, el LTR retroviral; el promotor SV40; y el promotor del citomegalovirus humano (CMV) descrito en Miller et al., Biotechniques 7:980-990 (1989), o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores como los promotores de células eucarióticas que incluyen, pero no se limitan a, los promotores de histona, pol III, y b-actina). Otros promotores virales que pueden incluirse incluyen, pero no se limitan a, promotores de adenovirus, promotores de timidina quinasa (TK), y promotores de parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado resultará clara para aquellos expertos en la técnica a partir de los contenidos aquí presentados.

La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a, promotores adenovirales, como el promotor tardío principal de adenovirus; o promotores heterólogos, como promotor de citomegalovirus (CMV); el promotor del virus respiratorio sincitial (VRS); promotores inducibles, como el promotor MMT, el promotor de metalotioneina; promotores del choque por calor; el promotor de albumina; el promotor de ApoAI; promotores de globina humana; promotores de timidina quinasa viral, como el promotor de timidina quinasa del Herpes Simplex; LTRs retrovirales (incluyendo los LTRs retrovirales modificados anteriormente descritos); el promotor bactina y promotores de la hormona de crecimiento humano. El promotor también puede ser el promotor nativo que controla el gen codificador del polipéptido.

El vector plásmido retroviral se emplea para convertir líneas celulares de embalaje para formar líneas celulares productoras. Ejemplos de células de embalaje que pueden ser transfectadas incluyen, pero no se limitan a, PE501, PA317, y-2, y-AM, PA12, T1914X,VT-19-17-H2, yCRE, yCRIP, GP+E-86, GP+envAm12, y líneas celulares como las descritas en Miller, Human Gene Therapy 1:5-14 (1990). El vector puede convertir las células de embalaje a través de cualquier medio conocido en la técnica. Estos medios incluyen, aunque no se limitan a, electroporación, el uso de liposomas y la precipitación con CaPO4. En una alternativa, el vector plásmido retroviral puede encapsularse en un liposoma, o enlazarse con un lípido, y a continuación administrarse a un huésped.

La línea celular productora genera partículas infecciosas del vector retroviral que incluyen la secuencia de ácido nucleico codificadora de polipéptidos. Estas partículas del vector retroviral pueden a continuación emplearse, para convertir células eucarióticas, in vitro o in vivo. Las células eucarióticas convertidas expresarán la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido. Células eucariótica que pueden ser convertidas incluyen, pero no se limitan a, células madre del embrión, células de carcinoma embriónico, así como células madres hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales, y células epiteliales bronquiales. Anticuerpos

La presente invención hace referencia además a anticuerpos y a receptores de antígeno de células T (TCR) que específicamente se enlazan con los polipéptidos de la presente descripción: polipéptido, fragamento de polipéptido, o variante de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:18, o el polipéptido de longitud completa (o fragmentos o variante del mismo), la secuencia de polipéptido pro-proteína, o el polipéptido segregado codificado por una secuencia de polinucleótido contenida en el depósito ATCCC con Números 97149

o 75698, y/o un epítope de la presente descripción (tal y como lo determinan los inmunoensayos bien conocidos en la técnica para analizar enlace específico anticuerpo-antígeno).

Los polipéptidos VEGF-2 unidos por los antecuerpos de la invención pueden ser monómeros o multímeros (es decir, dímeros, trímeros, tetrámeros o multímeros más altos). Por consiguiente, la presente invención hace referencia a anticuerpos que se enlazan con monómeros y multímeros de los polipéptidos VEGF-2 de la descripción, su preparación y composiciones (preferiblemente, composiciones farmacéuticas) que los contienen. En realizaciones específicas, los polipéptidos VEGF-2 enlazados por los anticuerpos de la invención son monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. En realizaciones adicionales, los polipéptidos enlazados por los anticuerpos de la invención son al menos dímeros, al menos trímeros

o al menos tetrámeros.

VEGF-2 multiméricos enlazados por los anticuerpos de la invención pueden ser homómeros o heterómeros. Un homómero VEGF-2 hace referencia a un multímero que contiene solamente polipéptidos VEGF-2 (incluyendo fragmentos de VEGF-2, variantes y proteínas de fusión, tal y como aquí se describe). Esto homómeros pueden contener poipéptidos VEGF-2 que tienen secuencias de aminoácido idénticas o diferentes. En realizaciones específicas, el multímero VEGF-2 enlazado por los anticuerpos de la invención es un homodímero (es decir, contiene dos polipéptidos VEGF-2 que tienen secuencias de aminoácido idénticas o diferentes) o un homotrímero (es decir, contiene tres polipéptidos VEGF-2 que tienen secuencias de aminoácido idénticas o diferentes). En una realización preferente, los anticuerpos de la invención se enlazan con homotrímeros de VEGF-2. En realizaciones adicionales, el multímero VEGF-2 homomérico enlazado por los anticuerpos de la invención es al menos un homodímero, al menos homotrímero o al menos homotetrámero.

Los multímeros VEGF-2 enlazados por los anticuerpos de la invención pueden ser el resultado de asociaciones hidrofóbicas, hidrofílicas, iónicas y/o covalentes y/o pueden unirse directamente, por ejemplo, a través de formación de liposomas. Por lo tanto, en una realización, los multímeros VEGF-2, como tales, por ejemplo, homodímeros u homotrímeros, se forman cuando los polipéptidos de la descripción entran en contacto en solución. En otra realización, los heteromultímeros VEGF-2, como, por ejemplo, heterotrímeros VEGF-2 o heterotetrámeros VEGF-2, se forman cuando los polipéptidos de la descripción entran en contacto con los anticuerpos de la descripción (incluyendo los anticuerpos con la secuencia de polipéptido heterólogo en una proteína de fusión de la descripción) en solución. En otras realizaciones, los multímeros VEGF-2 se forman a través de asociaciones covalentes con y/o entre los polipéptidos VEGF-2 de la descripción. Estas asociaciones covalentes pueden implicar uno o más residuos de aminoácido contenidos en la secuencia de polipéptido (por ejemplo, aquellos mencionados en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:18). En un caso, las asociaciones covalentes son ligamentos cruzados entre residuos de cisteína localizados en el interior de las secuencias de polipéptido que interaccionan en el polipéptido nativo (es decir, que ocurren de manera natural). En otro caso, las asociaciones covalentes son la consecuencia de manipulación química o recombinante. De manera alternativa, estas asociaciones covalentes pueden implicar uno o más residuos de aminoácido contenidos en la secuencia de polipéptido heterólogo en una proteína de fusión VEGF-2. En un ejemplo, las asociaciones covalentes están entre la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Número 5,478,925). En un ejemplo específico, las asociaciones covalentes están entre la secuencia heteróloga contenida en una proteína de fusión VEGF-2Fc. En otro ejemplo específico, las asociaciones covalentes de proteínas de fusión de la descripción están entre la secuencia de polipéptido heterólogo de otro miembro del ligando/receptor de la familia PDGF/VEGF que es capaz de formar multímeros covalentemente asociados. Ejemplos de estos péptidos incluyen aquellos enlaces de péptido descritos en la Patente de Estados Unidos Número 5,073,627. Las proteínas que contienen múltiples polipéptidos VEGF-2 separados por enlaces de péptido pueden producirse usando tecnología convencional de ADN recombinante.

La unidad estructural básica del anticuerpo es conocida por tener un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo cada para una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. La porción carboxi-terminal de cda cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alpha, o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente, Ver a modo general, Fundamental Immunology Capítulo 7 (Paul W. 2ª ed. Raven Press,

N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forma el punto del enlace del anticuerpo.

Por lo tanto, un anticuerpo intacto IgG tiene dos puntos de enlace. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos puntos de enlace son los mismos.

Todas las cadenas muestran la misma estructura general de regiones con marco relativamente conservado (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de complementariedad o CDRs. Las CDRs de cada cadena pesada y ligera de cada par se alinean por las regiones de marco, permitiendo en enlace con un epítope específico. Desde la terminal N hasta la terminal C, tanto las cadenas ligeras como pesadas están constituidas por los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio se realiza de acuerdo con las definiciones de Kabat en Sequences de Proteins of Immunological Interest (Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al Nature 342:878-883 (1989).

Una anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares diferentes de cadenas pesada/ligera y dos puntos diferentes de enlace. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse por medio de una variedad de métodos que incluyen fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab. Ver, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol.

79: 315-321 (1990), Kostelny et al., J Immunol. 148:1547 1553 (1992). Además, los anticuerpos biespecíficos pueden formarse como “diacuerpos” (Holliger et al. “Diacuerpos: pequeños fragmentos bivalentes y biespecíficos de anticuerpos” PNAS USA 90:6444-6448 (1993)) o “Janusins” (Traunecker et al. “Moléculas biespecíficas de cadena sencilla (Janusins) dirigidas a linfocitos citotóxicos en células infectadas por VIH” EMBO J 10:3655-3659 (1991) y Traunecker et al. “Janusin: Nuevo diseño molecular para reagentes biespecíficos” Int J Cancer Suppl 7:51-52 81992)).

Los anticuerpos de la invención incluyen, auqneu no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), fragmentos producidos por una biblioteca con expresión Fab, anticuerpos anti-idiotópicos incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id para anticuerpos de la invención), anticuerpos hechos intracelularmente (es decir, intracuerpos), y fragmentos de cualquiera de los citados que se enlazan a epítopes. El término “anticuerpo”, tal y como aquí se emplea, hace referencia a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un punto de enlace de antígeno que inmunoespecíficamente se enlaza con un antígeno. Los anticuerpos de la presente invención incluyen IgG (incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4), IgA (incluyendo IgA1 e IgA2), IgD, IgE o IgM e IgY. En una realización preferente, la inmunoglobulina es un isotipo IgG1. En otra realización preferente, la inmunoglobulina es un isotipo IgG2. En otra realización preferente, la inmunoglobulina es un isotipo IgG4. La inmunoglobulina puede tener una cadena pesada o cadena ligera. Una variedad de cadenas pesadas de IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY puede emparejarse con una cadena ligera de las formas kappa o lambda.

Más preferiblemente, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpo que se enlazan con antígeno humano de la presente invención que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos Fab, Fab’ y F(ab’)2, Fd, Fvs (scFv) de cadena sencilla, anticuerpos de cadena sencilla, Fvs (scFv) unidos con disulfuro y fragmentos que contienen un dominio VL o VH. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal que incluye pájaros y mamíferos. Preferiblemente, los anticuerpos son de humano, ratones, conejo, cabra, cerdo de guinea, camello, caballo o pollo. Los fragmentos de anticuerpo que se enlazan con antígeno, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla, pueden estar formados por la región variable sola o pueden estar en combinación de todos o una parte de lo siguientes elementos: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. La invención también incluye fragmentos que se enlazan con antígeno que están formados por una combinación de regiones variables con una región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3.

Los fragmentos que se enlaza con antígeno, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla, pueden estar formados por la región variable sola o pueden estar en combinación de todos o una parte de lo siguientes elementos: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. La invención también incluye combinaciones de regiones variables con una región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. La presente invención incluye además anticuerpos quiméricos, humanizados, y anticuerpos monoclonales o policlonales que específicamente se enlazan con los polipéptidos de la presente invención. La presente invención incluye además anticuerpos que son anti-idiotípicos a los anticuerpos de la presente invención.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de una multiespecificidad superior. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopes de un polipéptido de la presente descripción o pueden ser específicos para una polipéptido de la presente descripción y par una composición heteróloga, como un polipéptido heterólogo o un material sólido de soporte. Ver, por ejemplo, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, A. et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69; US Patents 5,573,920, 4,474,893, 5,601,819, 4,714,681, 4,925,648; Kostelny, S.A.et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553.

Los anticuerpos de la presente invención pueden describirse o especificarse en términos de los epítopes o porciones de un polipéptido de la presente descripción que son reconocidos o específicamente se enlazan por la acción del anticuerpo. Los epítopes o porciones de un polipéptido pueden especificarse tal y como aquí se describen, por ejemplo, mediante posiciones de terminal N o terminal C, por el tamaño en residuos de aminoácido contiguos, o con listas en Tablas y Figuras. En realizaciones preferentes, los anticuerpos de la invención se enlazan con la proteína VEGF-2 de longitud completa codificada por una secuencia de polinucleótido contenida en el depósito ATCC con Números 97149 o 75698. En realizaciones preferentes, los anticuerpos de la invención se enlazan con la forma pre-proteína de la proteína VEGF2 codificada por una secuencia de polinucleótido contenida en el depósito ATCC con Números 97149 o 75698. En realizaciones preferentes, los anticuerpos de la invención se enlazan con la proteína segregada VEGF-2 codificada por una secuencia de polinucleótido contenida en el depósito ATCC con Números 97149 o 75698. En otras realizaciones preferentes, los anticuerpos de la invención se enlazan con la proteína segregada VEGF-2 pero no la proteína VEGF-2 de longitud completa codificada por una secuencia de polinucleótido contenida en el depósito ATCC con Números 97149 o 75698. En otras realizaciones preferentes, los anticuerpos de la invención se enlazan con la forma segregada de la proteína VEGF-2 y con la proteína VEGF-2 de longitud completa codificada por una secuencia de polinucleótido contenida en el depósito ATCC con Números 97149 o 75698.

En otras realizaciones preferentes, los anticuerpos de la invención se enlazan con aminoácidos 103 a 227 de SEQ ID NO:18. En otras realizaciones, los anticuerpos de la invención se enlazan con polipéptidos diméricos VEGF-2 que consisten en dos polipéptidos consistiendo cada uno de ellos en aminoácidos 103 a 227 de SEQ ID NO:18. En otras realizaciones preferentes, los anticuerpos de la invención se enlazan con aminoácidos 112 a 227 de SEQ ID NO:18. En otras realizaciones los anticuerpos de la invención se enlazan con polipéptidos diméricos VEGF-2 que consisten en dos polipéptidos consistiendo cada uno de ellos en aminoácidos 112 a 227 de SEQ ID NO:18.

Los anticuerpos que específicamente se enlazan con un epítope o polipéptido de la presente descripción también pueden excluirse. Por lo tanto, la presente invención incluye anticuerpos que específicamente se enlazan con los polipéptidos de la presente descripción y permite la exclusión de los mismos.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Los anticuerpos que no se enlazan con otro análogo, ortólogo o homologo de los polipéptidos de la presente invención están incluidos. Los anticuerpos que no se enlazan con polipéptidos con menos de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55% y menos de 50% de identidad (calculado usando métodos conocidos en la técnica y aquí descritos) en comparación con un polipéptido de la presente descripción también se incluyen en la presente invención. En realizaciones específicas, los anticuerpos de la presente invención reaccionan de manera cruzada con homólogos de ratones, monos, ratas y/o conejos de proteínas humanas y los correspondientes epítopes de los mismos. Los anticuerpos que no se enlazan con polipéptidos con menos de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55% y menos de 50% de identidad (calculado usando métodos conocidos en la técnica y aquí descritos) en comparación con un polipéptido de la presente descripción también se incluyen en la presente invención. En realizaciones específicas, la reactividad cruzada anteriormente descrita es con respecto a un único polipéptido específico antigénico o inmunogénico, o combinaciones de 2, 3, 4, 5 o más de los polipéptidos específicos antigénicos y/o inmunogénicos aquí descritos. Además, la invención incluye anticuerpos que solamente se enlazan con polipéptidos codificados por polinucleótidos que hibridizan a un polinucleótido de la presente descripción bajo rigurosas condiciones de hibridización (tal y como aquí se describe).

Los anticuerpos de la invención (incluyendo moléculas formadas, o alternativamente compuestas por, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) inmunoespecíficamente se enlazan con un polipéptido o fragmento de polipéptido o variante de VEGF-2 humano (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 O SEQ ID NO:18) y/o VEGF-2 de mono. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención se enlazan inmunoespecíficamente con VEGF-2 humano. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención se enlazan inmunoespecíficamente con VEGF-2 humano o de mono. También preferiblemente, los anticuerpos de la invención se enlazan inmunoespecíficamente con VEGF-2 humano y VEGF-2 murino. Más preferiblemente, los anticuerpos de la invención se enlazan inmunoespecíficamente y con mayor afinidad con VEGF-2 humano que con VEGF-2 murino.

En realizaciones preferentes, los anticuerpos de la presente invención (incluyendo moléculas formadas, o alternativamente compuestas por, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) inmunoespecíficamente se enlazan con VEGF-2 y no reaccionan de manera cruzada con ningún otro antígeno. En realizaciones preferentes, los anticuerpos de la invención inmunoespecíficamente se enlazan con VEGF-2 y no reaccionan de manera cruzada con otros miembros de la familia VEGF/PDGF como, por ejemplo, VEGF, VEGF-1, VEGF-3 (VEGF-B), VEGF-4 (VEGF-D), PDGFa o PDGFb.

En otras realizaciones preferentes, los anticuerpos de la invención inmunoespecíficamente se enlazan con VEGF-2 y reaccionan de manera cruzada con otros miembros de la familia VEGF/PDGF como, por ejemplo, VEGF, VEGF-1, VEGF-3 (VEGFB), VEGF-4 (VEGF-D), PDGFa o PDGFb.

En una realización preferente, los anticuerpos de la invención preferentemente se enlazan con VEGF-2 (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 O SEQ ID NO:18), o fragmentos o variantes de los mismos en relación a su habilidad para enlazarse con otros antígenos (como, por ejemplo, otros receptores de quimioquina).

A modo de ejemplo no limitativo, puede considerarse que un anticuerpo se enlace con un primer antígeno preferiblemente si se enlaza con dicho primer antígeno con una constante de disociación (KD) que sea inferior que la KD del anticuerpo del segundo antígeno. En otra realización no limitativa, puede considerarse que un anticuerpo se enlace con un primer antígeno preferentemente si se enlaza con dicho primer antígeno con una afinidad que sea al menos un orden de magnitud inferior al KD del anticuerpo para el segundo antígeno. En otra realización no limitativa, puede considerarse que un anticuerpo se enlace con un primer antígeno preferentemente si se enlaza con dicho primer antígeno con una afinidad que sea al menos dos órdenes de magnitud inferior al KD del anticuerpo para el segundo antígeno.

En otra realización no limitativa, puede considerarse que un anticuerpo se enlace con un primer antígeno preferentemente si se enlaza con dicho primer antígeno con una constante de disociación (Koff) que es inferior que la Koff del anticuerpo para el segundo antígeno. En otra realización no limitativa, puede considerarse que un anticuerpo se enlace con un primer antígeno preferentemente si se enlaza con dicho primer antígeno con una afinidad que sea al menos un orden de magnitud inferior al Koff del anticuerpo para el segundo antígeno. En otra realización no limitativa, puede considerarse que un anticuerpo se enlace con un primer antígeno preferentemente si se enlaza con dicho primer antígeno con una afinidad que sea al menos dos órdenes de magnitud inferior al Koff del anticuerpo para el segundo antígeno.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de enlace con un polipéptido de la descripción. Las afinidades preferentes de enlace incluyen aquellas con una constante de disociación o una Kd inferior a 10-9 M, 5 X 10-10 M, 10-10 M, 5 X 10-11 M, 10-11 M, 5 X 10-12 M, 10-12 M, 5 X 10-13 M, 10-13 M, 5 X 10-14 M, 10-14 M, 5 X 1015 M o 10-15 M.

La invención también facilita anticuerpos que competentemente inhiben en enlace de un anticuerpo con un epítope de la descripción tal y como lo determina cualquier método en la técnica para determinar enlace competitivo, por ejemplo, los inmunoensayos aquí descritos. En realizaciones preferentes, el anticuerpo competitivamente inhibe el enlace con el epítope por al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60% o al menos 50%.

La invención hace referencia además a anticuerpos que actúan como agonistas o antagonistas de los polipéptidos de la presente descripción. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos que afecta a las interacciones receptor/ligando con los polipéptidos de la descripción ya sea parcialmente o completamente. Se incluyen los anticuerpos específicos de receptor y los anticuerpos específicos de ligando. Se incluyen los anticuerpos específicos de receptor que no previenen el enlace de ligando pero que previenen la activación del receptor. La activación del receptor (es decir, la señalización) pueden determinarse a través de técnicas aquí descritas o sino conocidas en la técnica. Por ejemplo, la activación del receptor puede determinarse detectando la fosforilización (por ejemplo, tirosina o serina/treonina) del receptor o su sustrato por medio de inmunoprecipitación seguida de análisis de inmunotransferencia (por ejemplo, como se ha descrito anteriormente). En realizaciones específicas, se proporcionan anticuerpos que inhiben la actividad del ligando o la actividad del receptor en al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60% o al menos 50% de la actividad en ausencia del anticuerpo.

La invención también ofrece anticuerpos específicos del receptor que previenen el enlace del ligando y la activación del receptor y anticuerpos que reconocen el complejo ligando-receptor, y, preferiblemente, no reconocen de manera específica el receptor no ligado o el ligando lo ligado. Del mismo modo, se incluyen los anticuerpos neutralizadores que se enlazan con el ligando y evitan el enlace del ligando con el receptor, así como anticuerpos que se enlazan con el ligando, evitando de este modo la activación del receptor, pero no evitan que el ligando se enlace con el receptor. Estos anticuerpos pueden actuar como agonistas para todas o no todas las actividades biológicas afectadas por la activación del receptor mediada por el ligando. Los anticuerpos pueden especificarse como agonistas o antagonistas para actividades biológicas que comprenden actividades específicas aquí descritas. Los agonistas de anticuerpos mencionados pueden hacerse usando métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, WO 96/40281; Patente de Estados Unidos 5.811.097; Deng, B. et al. (1998) Blood 92(6):1981-1988; Chen, Z. et al. (1998) Cancer Res. 58(16):36683678; Harrop, J.A. et al. (1998) J. Immunol. 161(4):1786-1794; Zhu,

Z. et al. (1998) Cancer Res. 58(15):3209-3214; Yoon, D.Y. et al. (1998) J. Immunol. 160(7):3170-3179; Prat, M. et al. (1998) J. Cell. Sci. 111(Pt2):237-247; Pitard, V. et al. (1997) J. Immunot. Methods 205 (2):177-190; Liautard, J. et al. (1997) Cytokinde 9(4):233-241; Carlson, N.G. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(17): 11295-11301; Taryman, R.E. et al. (1995) Neuron 14(4):755-762; Muller, Y.A. et al. (1998) Structure 6(9):1153-1167; Bartunek, P. et al. (1996) Cytokine 8(1):14-20).

La invención también engloba anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismo) que tienen una

o más características iguales que las de los anticuerpos aquí descritos. Por “características biológicas” se entiende que las actividades o propiedades in vitro o in vivo de los anticuerpos, como por ejemplo, la habilidad para inhibir en enlace de VEGF-2 con su receptor (por ejemplo, flk-1 y/o flt4) (por ejemplo, ver Ejemplo 33), la habilidad para inhibir la fosforilación inducida por VEGF-2 de Elk-1 (por ejemplo, ver Ejemplo 35), la habilidad para inhibir proliferación de células endoteliales vasculares y/o linfáticas inducida por VEGF-2 (por ejemplo, ver Ejemplo 34), la habilidad para inhibir angiogénesis (por ejemplo, ver Ejemplos 16 y 23), y/o la habilidad para inhibir el crecimiento de tumor y/o metástasis de tumor (por ejemplo, ver Ejemplos 37 y 38). Opcionalmente, los anticuerpos de la invención se ligarán al mismo epítope que al menos uno de los anticuerpos aquí referidos. Dicho enlace de epítope puede determinarse de manera rutinaria usando ensayos conocidos en la técnica.

La presente invención también proporciona anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que neutralizan VEGF-2, comprendiendo dichos anticuerpos, o alternativamente consistiendo en, una porción (por ejemplo, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y/o VL CDR3) de un dominio VH o VL de un scFv referido en la Tabla 2. Un anticuerpo que “neutraliza VEGF-2 o un fragmento o una variante del mismo es, por ejemplo, un anticuerpo que inhibe en enlace de VEGF-2 con su receptor (por ejemplo, flk-1 y/o flt-4) (por ejemplo, ver Ejemplo 33), la habilidad para inhibir la fosforilación inducida por VEGF-2 de Elk-1 (por ejemplo, ver Ejemplo 35), la habilidad para inhibir proliferación de células endoteliales vasculares y/o linfáticas inducida por VEGF-2 (por ejemplo, ver Ejemplo 34), la habilidad para inhibir angiogénesis (por ejemplo, ver Ejemplos 16 y 23), y/o la habilidad para inhibir el crecimiento de tumor y/o metástasis de tumor (por ejemplo, ver Ejemplos 37 y 38). En una realización, un anticuerpo que neutraliza VEGF-2 comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo y un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que neutraliza VEGF-2 comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VH o un dominio VL de un anticuerpo sencillo (o fragmento de scFv o Fab) de la invención, o fragmentos o variantes del mismo. En una realización, un anticuerpo que neutraliza VEGF-2 comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento

o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que neutraliza VEGF-2 comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que neutraliza VEGF-2 comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene

una secuencia de aminoácido de un dominio VH CDR de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En una realización preferente, un anticuerpo que neutraliza VEGF-2 comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VH CDR3 de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que neutraliza VEGF-2 comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VL CDR de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que neutraliza VEGF-2 comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VL CDR3 de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos también están incluidas en esta invención.

La presente invención también proporciona anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que inhiben el enlace de VEGF-2 con su receptor (por ejemplo, flk-1 y/o flt-4) (por ejemplo, ver Ejemplo 33). Dichos anticuerpos comprenden, o alternativamente consisten en, una porción (por ejemplo, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y/o VL CDR3) de un dominio VH o VL de un scFv referido en la Tabla 2. En una realización, un anticuerpo que inhibe el enlace de VEGF-2 con su receptor (por ejemplo, flk-1 y/o flt-4) comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo y un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2 o un fragmento o una variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que inhibe el enlace de VEGF-2 con su receptor (por ejemplo, flk-1 y/o flt-4) comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo sencillo (o un fragmento scFv o Fab) de la invención, o fragmentos o variantes del mismo. En una realización, un anticuerpo que inhibe el enlace de VEGF-2 con su receptor (por ejemplo, flk-1 y/o flt-4) comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que inhibe el enlace de VEGF-2 con su receptor (por ejemplo, flk-1 y/o flt-4) comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En una realización preferente, un anticuerpo que inhibe el enlace de VEGF-2 con su receptor (por ejemplo, flk-1 y/o flt4) comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un VH CDR3 de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización preferente, un anticuerpo que inhibe el enlace de VEGF-2 con su receptor (por ejemplo, flk-1 y/o flt-4) comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un VL CDR3 de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos también están incluidas en esta invención.

La presente invención también proporciona anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que inhiben la fosforilación de Elk-1 inducida por VEGF-2 tal y como se determina en los métodos conocidos en la técnica como, por ejemplo, los ensayos descritos en el Ejemplo 35. Estos anticuerpos pueden comprender, o alternativamente consistir en, una porción (por ejemplo, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y/o VL CDR3) de un dominio VH o VL que tiene una secuencia de aminoácido de un scFv referido en la Tabla 2 o un fragmento o variante del mismo. En una realización, un anticuerpo que inhibe la fosforilación de Elk-1 inducida por VEGF-2 comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo y un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que inhibe la fosforilación de Elk-1 inducida por VEGF-2 comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo sencillo (o scFv o fragmento Fab) de la invención, o fragmentos o variantes de los mismos. En una realización, un anticuerpo que inhibe la fosforilación de Elk-1 inducida por VEGF-2 comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que inhibe la fosforilación de Elk-1 inducida por VEGF2 comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En una realización preferente, un anticuerpo que inhibe la fosforilación de Elk-1 inducida por VEGF-2 comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un VH CDR3 de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización preferente, un anticuerpo que inhibe la fosforilación de Elk-1 inducida por VEGF-2 comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un VL CDR3 de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos también están incluidas en esta invención.

La presente invención también proporciona anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que inhiben la proliferación inducida por VEGF-2 de células endoteliales vasculares y/o linfáticas (por ejemplo, ver Ejemplo 34). Estos anticuerpos pueden comprender, o alternativamente consistir en, una porción (por ejemplo, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y/o VL CDR3) de un dominio VH o VL que tiene una secuencia de aminoácido de un scFv referido en la Tabla 2 o un fragmento o variante del mismo. En una realización, un anticuerpo que inhibe la proliferación inducida por VEGF-2 de células endoteliales vasculares y/o linfáticas comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento

o variante del mismo, y un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que inhibe la proliferación inducida por VEGF-2 de células endoteliales vasculares y/o linfáticas comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo sencillo (o scFv o fragmento Fab) de la invención, o fragmentos o variantes de los mismos. En una realización, un anticuerpo que inhibe la proliferación inducida por VEGF-2 de células endoteliales vasculares y/o linfáticas comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que inhibe la proliferación inducida por VEGF-2 de células endoteliales vasculares y/o linfáticas comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En una realización preferente, un anticuerpo que inhibe la proliferación inducida por VEGF-2 de células endoteliales vasculares y/o linfáticas comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VH CDR3 de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización preferente, un anticuerpo que inhibe la proliferación inducida por VEGF-2 de células endoteliales vasculares y/o linfáticas comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VL CDR3 de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos también están incluidas en esta invención.

En realizaciones muy preferentes, la presente invención también proporciona anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que inhiben angiogénesis (por ejemplo, ver Ejemplos 16 y 24). Estos anticuerpos pueden comprender, o alternativamente consistir en, una porción (por ejemplo, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y/o VL CDR3) de un dominio VH o VL que tiene una secuencia de aminoácido de un scFv referido en la Tabla 2 o un fragmento o variante del mismo. En una realización, un anticuerpo que inhibe angiogénesis comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo, y un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que inhibe la angiogénesis comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo sencillo (o scFv o fragmento Fab) de la invención, o fragmentos o variantes de los mismos. En una realización, un anticuerpo que inhibe la angiogénesis comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que inhibe la angiogénesis comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En una realización preferente, un anticuerpo que inhibe la angiogénesis comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VH CDR3 de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización preferente, un anticuerpo que inhibe la angiogénesis comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VL CDR3 de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos también están incluidas en esta invención.

En otras realizaciones muy preferentes, la presente invención también proporciona anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que inhiben el crecimiento de tumor y/o metástasis de tumor (por ejemplo, ver Ejemplos 37 y 38). Estos anticuerpos pueden comprender, o alternativamente consistir en, una porción (por ejemplo, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y/o VL CDR3) de un dominio VH o VL que tiene una secuencia de aminoácido de un scFv referido en la Tabla 2 o un fragmento o variante del mismo. En una realización, un anticuerpo que inhibe el crecimiento de tumor y/o metástasis de tumor comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo, y un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que inhibe el crecimiento de tumor y/o metástasis de tumor comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo sencillo (o scFv o fragmento Fab) de la invención, o fragmentos o variantes de los mismos. En una realización, un anticuerpo que inhibe el crecimiento de tumor y/o metástasis de tumor comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que inhibe el crecimiento de tumor y/o metástasis de tumor comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En una realización preferente, un anticuerpo que inhibe el crecimiento de tumor y/o metástasis de tumor comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VH CDR3 de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización preferente, un anticuerpo que inhibe el crecimiento de tumor y/o metástasis de tumor comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VL CDR3 de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos también están incluidas en esta invención.

La presente invención también proporciona anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que aumentan la actividad de VEGF-2, comprendiendo estos anticuerpos, o alternativamente consistiendo en, una porción (por ejemplo, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 y/o VL CDR3) de un dominio VH o VL que tiene una secuencia de aminoácido de un scFv referido en la Tabla 2 o un fragmento o variante del mismo. A modo de ejemplo no limitativo, un anticuerpo que “aumenta la actividad de VEGF-2 o un fragmento o variante del mismo” es un anticuerpo que incrementa la habilidad de VEGF-2 para enlazarse con su receptor (por ejemplo, flk-1 o flt-4), para estimular la cascada señalizadora de VEGF-2 (por ejemplo, aumentar la fosforilación inducida por VEGF-2 de Elk-1, ver Ejemplo 35), para provocar proliferación de células endoteliales vasculares y/o linfáticas (por ejemplo, ver Ejemplo 34), y para estimular angiogénesis. En una realización, un anticuerpo que aumenta la actividad de VEGF-2, comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo, y un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que aumenta la actividad de VEGF-2 comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo sencillo (o scFv o fragmento Fab) de la invención, o fragmentos o variantes de los mismos. En una realización, un anticuerpo que aumenta la actividad de VEGF-2 o un fragmento o variante del mismo, comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que aumenta la actividad de VEGF-2 o un fragmento o variante del mismo comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización, un anticuerpo que aumenta la actividad de VEGF-2 o un fragmento o variante del mismo comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VH CDR de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En una realización preferente, un anticuerpo que aumenta la actividad de VEGF-2 o un fragmento o variante del mismo comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VH CDR3 de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización preferente, un anticuerpo que aumenta la actividad de VEGF-2 o un fragmento o variante del mismo comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VL CDR de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. En otra realización preferente, un anticuerpo que aumenta la actividad de VEGF-2 o un fragmento o variante del mismo comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VL CDR3 de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo. Las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos también están incluidas en esta invención.

La presente invención también proporciona proteínas de fusión que comprenden, o alternativamente consisten en, un anticuerpo (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que inmunoespecíficamente se enlaza con VEGF-2 y un polipéptido heterólogo. Preferiblemente, el polipéptido heterólogo con los que el anticuerpo se fusiona es útil para hacer funcionar o es útil para dirigir los anticuerpos VEGF-2 hacia células específicas (células tumorales, especialmente células de cáncer de próstata, pecho, cerebro o colon). En una realización, una proteína de fusión de la invención comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo, y un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2, o un fragmento o variante del mismo, y una secuencia de polipéptido heterólogo. En otra realización, una proteína de fusión de la presente invención comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de uno, dos, tres o más de los VH CDRs de un scFv referido en la Tabla 2, o la secuencia de aminoácido de uno, dos, tres o más de los VH CDRs del VL CDRs de un scFv referido en la Tabla 2, o fragmentos o variantes del mismo, y una secuencia de polipéptido heterólogo. En una realización preferente, la proteína de fusión comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VH CDR3 de un scFv referido en la Tabla 2, o fragmentos o variantes del mismo, y una secuencia de polipéptido heterólogo, cuya proteína de fusión se enlaza inmunoespecíficamente con VEGF-2. En otra realización, una proteína de fusión comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de a lmenos un dominio VH de un scFv referido en la Tabla 2 y la secuencia de aminoácido de al menos un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2 o fragmentos o variantes del mismo, y una secuencia de polipéptido heterólogo. Preferiblemente, los dominios VH y VL de la proteína de fusión corresponden a una anticuerpo sencillo (o scFv o fragmento Fab) de la invención. Incluso en otra realización, una proteína de fusión de la invención comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de uno, dos, tres o más de los VH CDRs de un scFv referido en la Tabla 2 y la secuencia de aminoácido de uno, dos, tres o más de los VH CDRs del VL CDRs de un scFv referido en la Tabla 2, o fragmentos

o variantes del mismo, y una secuencia de polipéptido heterólogo. Preferiblemente, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de los VHCDR(s) o VLCDR(s) corresponden a anticuerpos sencillos (o scFv

o fragmento Fab) de la invención. Las moléculas de ácido nucleico

que codifican estos anticuerpos también están incluidas en esta invención.

Los anticuerpos de la presente invención tienen usos que incluyen, pero no se limitan a, métodos conocidos en la técnica para purificar, detectar, y dirigir los polipéptidos de la presente descripción que incluyen métodos de diagnóstico y terapéuticos in vitro e in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos tienen usos en inmunoensayos para medir cualitativamente y cuantitativamente niveles de los polipéptidos de la presente descripción en muestras biológicas. Ver, por ejemplo, Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1988).

A modo de otro ejemplo no limitativo, los anticuerpos de la invención pueden administrarse a individuos como forma de inmunización pasiva. De manera alternativa, los anticuerpos de la presente invención pueden usarse para trazar epítopes con el fin de identificar los epítopes unidos por el anticuerpo. Los epítopes identificados de esta manera, a su vez pueden usarse por ejemplo como candidatos para vacunas, es decir, para inmunizar un individuo y para obtener anticuerpos contra las formas de VEGF-2 que ocurren de manera natural.

Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse solos

o en combinación con otras composiciones. Los anticuerpos pueden además fusionarse de manera recombinante con un polipéptido heterólogo en el término N o C o conjugarse químicamente (incluyendo conjugaciones covalentemente y no covalentemente) con polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden fusionarse o conjugarse de manera recombinante con moléculas útiles como etiquetas en ensayos de detección y moléculas efectoras como polipéptidos heterólogos, fármacos o toxinas. Ver, por ejemplo, WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; Patente de Estados Unidos 5,314,995; y EP 0 396

387.

Los anticuerpos de la invención incluyen derivados que están modificados, es decir, mediante unión covalente de cualquier tipo de molécula con el anticuerpo. Por ejemplo, pero sin limitar, los derivados de anticuerpo incluyen anticuerpos que se han modificado, por ejemplo, mediante glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación por acción de grupos de protección/bloqueo, división proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las múltiples modificaciones químicas puede llevarse a cabo por medio de técnicas conocidas que incluyen, pero no se limitan a, división química, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse a través de cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, un polipéptido de la presente descripción o un fragmento antigénico del mismo pueden administrarse a un animal con el fin de inducir la producción de suero que contiene anticuerpos policlonales específicos para el antígeno. Pueden usarse varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie del huésped, e incluyen aunque no se limitan a, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales como hidróxido de aluminio, sustancias activas superficiales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones con aceite, hemocianinas de lapa, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles como BCG (Bacillus Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Estos adyuvantes también son bien conocidos en la técnica.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando una amplia variedad de técnicas conocidas en el campo que incluyen el uso de tecnología de hibridoma y tecnología recombinante. Ver, por ejemplo, Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1988); Hammerling, et al., en: MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). El término “anticuerpo monoclonal” tal y como aquí se emplea no se limita a anticuerpos producidos a través de tecnología de hibridoma. El término “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que se deriva de un clon sencillo, que incluye cualquier clon eucariótico, procariótico o de fago, y no el método por el cual se produce.

Los métodos para producir y analizar anticuerpos específicos que usan tecnología de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en la técnica. En un ejemplo no limitativo, los ratones pueden inmunizarse con un polipéptido de la descripción o una célula que exprese tal péptido. Una vez que se detecta la respuesta inmune, por ejemplo, los anticuerpos específicos para el antígeno y se detecta en el suero del ratón, el bazo del ratón se extrae y los esplenocitos se aíslan. A continuación, los esplenocitos se fusionan mediante técnicas bien conocidas con células adecuadas de mieloma, por ejemplo, células de la línea celular SP2/0 disponibles en ATCC. Los hibridomas se seleccionan y clonan por medio de dilución limitada. Los clones del hibridoma se someten posteriormente a un ensayo con métodos bien conocidos en la técnica en busca de células que secreten anticuerpos capaces de enlazarse con el polipéptido de la descripción. Los fluidos ascíticos, que generalmente contienen elevados niveles de anticuerpos, pueden generarse inmunizando ratones con clones positivos de hibridoma.

Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para generar anticuerpos monoclonales así como anticuerpos producidos por el método que consiste en cultivar una célula de hibridoma que segrega un anticuerpo de la invención donde, preferiblemente, el hibridoma se genera fusionando esplenocitos aislados de un ratón inmunizado con un antígeno de la descripción con células de mieloma y posteriormente analizando los hibridomas resultantes de la fusión para que los clones de hibridoma que segregan un anticuerpo sean capaces de enlazarse con un polipéptido de la descripción.

Otro método bien conocido para producir líneas celulares b humanas policlonales y monoclonales es la transformación usando el Virus de Epstein Barr (VEB). Los protocolos para generar líneas celulares B transformadas con VEB son muy comunes en la técnica, como por ejemplo, el protocolo señalado en el Capítulo 7.22 de Current Protocols in Immunology, Coligan et al., 1994, John Wiley & Sons, NY. La fuente de células B para la transformación es normalmente sangre periférica humana, pero las células B para transformación también pueden derivarse de otras fuentes que incluyen, aunque no se limitan a, nódulos linfáticos, amígdalas, bazo, tejido de tumor y tejidos infectados. Los tejidos generalmente se hacen para suspensiones de células sencillas antes de la transformación VEB. Además, se tienen que dar pasos para retirar físicamente o inactivar las células T (por ejemplo, mediante tratamiento con ciclosporina A) en muestran que contengan células B, por que las células T de individuos seropositivos para anticuerpos anti-VEB pueden suprimir la inmortalización celular B por parte de VEB. En general, la muestra que contiene las células humanas B se inoculan con VEB, y se cultivan durante 3-4 semanas. Una fuente habitual de VEB es el sobrenadante del cultivo de la línea celular B95-8 (ATCC #VR-1492). Los signos físicos de la transformación VEB pueden generalmente verse hacia el final del periodo de cultivo de 3-4 semanas. Con un microscopio fase-contraste, las células transformadas pueden parecer grandes, claras y peludas y tienden a agregarse en grupos herméticos de células. Inicialmente, las líneas de VEB son generalmente policlonales. Sin embargo, una vez que se prolongan los periodos de cultivos celulares, las líneas de VEB pueden convertirse en policlonales o monoclonales como resultado de sobrecrecimiento selectivo de clones particulares de células B. De manera alternativa, las líneas transformadas con VEB policlonal pueden subclonares (por ejemplo, limitando el cultivo de dilución) o fusionarse con una pareja adecuada de fusión y emplatarse en dilución limitada para obtener líneas celulares B monoclonales. Parejas de fusión adecuadas para líneas celulares transformadas de VEB incluyen líneas celulares de mieloma de ratón (por ejemplo, SP2/0, 63-Ag8.653), líneas celulares de heteromieloma (ratón x humano; por ejemplo, SPAM-8, SBC-H20 y CB-F7), y líneas celulares humanas (por ejemplo, GM 1500, SKO-007, RPMI 8226 y KR-4). Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método para generar anticuerpos humanos policlonales y monoclonales contra polipéptidos de la descripción o fragmentos de los mismos, qe comprenden la transformación VEB de células B humanas.

Los fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopes específicos pueden generarse con técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab’)2 de la invención pueden producirse por medio de una división proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab’)2). Los fragmentos F(ab’)2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada. Como alternativa, los anticuerpos de la presente invención pueden producirse mediante la aplicación de tecnología recombinante de ADN o con química sintética usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse usando varios métodos de exposición de fagos conocidos en la técnica. En los métodos de exposición de fagos, los dominios funcionales de anticuerpo se exponen sobre la superficie de una partícula de fabo que transporta las secuencias de polinucleótido que les codifica. Los fagos con una propiedad deseada de enlace se seleccionan de un repertorio o una biblioteca de anticuerpos combinatorios (por ejemplo, humanos o murinos) seleccionando directamente con un antígeno, normalmente un antígeno unido o capturado a una superficie o gota sólida. Los fagos usados en estos métodos son normalmente fagos filamentosos que incluyen df y M13 con Fab, Fv o dominios de anticuerpo Fv con disulfuro estabilizado recombinantemente fusionados con el gen III de fago o proteína de gen VIII. Ejemplos de métodos con exposición de fagos que pueden usarse para hacer

los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos descritos en Brinkman U. et al. (1995) J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames,

R.S. et al. (1995) J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough,

C.A. et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic, L. et al. (1997) Gene 187 9-18; Burton, D.R. et al. (1994) Advances in Immunology 57:191-280; PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20441; y Patentes de los Estados Unidos 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727 and 5,733,743.

Tal y como se describe en las referencias citadas, tras la selección de fago, las regiones que codifica el anticuerpo del fago pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento que se enlace con el antígeno deseado, y se exprese en el huésped deseado, donde se incluyen las células de mamíferos, células de insectos, células de plantas, levadura y bacterias. Por ejemplo, técnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab’ y F(ab’)2 también pueden emplearse usando métodos conocidos en la técnica, como los descritos en WO 92/22324; Mullinax, R.L. et al. (1992) BioTechniques 12(6):864-869; y Sawai, H. et al. (1995) AJRI 34:26-34; and Better, M. et al. (1988) Science 240:1041-1043.

Ejemplos de técnicas que pueden usarse para producer Fvs de cadena sencilla y anticuerpos incluyen aquellos descritos en las Patentes de Estados Unidos 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al. (1991) Methods in Enzymology 203:46-88; Shu, L. et al. (1993) PNAS 90:7995-7999; and Skerra, A. et al. (1988) Science 240:1038-1040. Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en humanos y los ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies, S.D. et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; y Patente de Estados Unidos 5,807,715; 4,816,567; y 4,816,397. Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que se enlazan con el antígeno deseado que tiene una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de la especie no humana y una región de marco de una molécula humana de inmunoglobulina. A menudo, los residuos de marco en las regiones humanas de marco serán sustituidas por el residuo correspondiente del anticuerpo donante CDR para alterar, preferiblemente mejorar, el enlace de antígeno. Estas sustituciones de marco se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, modelando las interacciones de los residuos CDR y del marco para identificar residuos de marco importantes para el enlace de antígeno y la comparación secuencial para identificar residuos de marco inusuales en posiciones particulares. (Ver, por ejemplo, Queen et al., Patente de Estados Unidos Nº. 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988).

Los anticuerpos pueden humanizarse usando una variedad de técnicas que incluyen injertos CDR (EP 0 239 400; WO 91/09967; US Patent 5,530,101; y 5,585,089), fundas o regeneración (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E.A., (1991) Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka G.M. et al. (1994) Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska M.A. et al. (1994) PNAS 91:969-973), and chain shuffling (US Patent 5,565,332). Los anticuerpos humanos pueden hacerse por medio de una variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de exposición de fagos descritos anteriormente. Ver también, Patentes de Estados Unidos 4,444,887, 4,716.111, 5,545,806, and 5,814,318; y WO 98/46645.

Los anticuerpos completamente humanos son especialmente deseables para tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos pueden hacerse por medio de una variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de exposición de fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Ver también, Patentes de Estados Unidos Números 4,444,887 y 4,716,111; y publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO96/33735, y WO 91/10741.

Los anticuerpos humanos también pueden producirse usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes humanos de inmunoglobulina. Por ejemplo, los complejos de gen e inmunoglobulina de cadenas pesada y ligera pueden inducirse de manera arbitraria o mediante recombinación homóloga en células madre en el embrión de un ratón. Como alternativa, la región variable humana, la región constante, y la región de diversidad pueden introducirse en las células madre embrionarias del ratón además de los genes humanos de cadena pesada y ligera. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera de ratón pueden ser no funcionales de manera separada o simultáneamente con la introducción de locus de inmunoglobulina humana por medio de recombinación homóloga. En particular, la eliminación homocigota de la región JH evita la producción de anticuerpo endógeno. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y se microinyectan en blastocitos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos se reproducen posteriormente para producir crías homocigotas que expresan anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de manera habitual con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o una porción de un polipéptido de la descripción. Los anticuerpos monoclonales seleccionados dirigidos contra el antígeno pueden obtenerse a partir de ratones inmunizados, transgénicos usando tecnología convencional de hibridoma. Los transgenes de inmunoglobulina humanos que los ratones transgénicos albergan se organizan durante la diferenciación de células B y a continuación sufren un cambio de clase y una mutación somática. Por lo tanto, usando esta

técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una perspectiva general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, ver Lonberg y Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Para una visión más detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, ver, por ejemplo, publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patente Europea No. 0 598.877; Patentes de Estados Unidos Nos. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; 5,939,598; 6,075,181; and 6,114,598.

Además, empresas como Abgenix, Inc. (Fremont, CA) y Genpharm (San Jose, CA) pueden comprometerse a la hora de proporcionar anticuerpos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología similar a la aquí descrita.

Anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítope seleccionado pueden generarse usando una técnica referida como “selección guiada”. En esta técnica, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de un ratón, se usa para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítope (Jespers et al., Bio/technology 12:899-903 (1988)).

Además, los anticuerpos para los polipéptidos de la descripción pueden, a su vez, utilizarse para generar anticuerpos anti-idiotipos que “imitan” los polipéptidos de la descripción usando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica (Ver, por ejemplo, Greenspan & Bona. FASEB J. 7(5):437-444; (1989) y Nissinoff, J. Immunol. 147(8):2429-2438 (1991)). Por ejemplo, los anticuerpos que se enlazan y competitivamente inhiben la multimerización de un polipéptido y/o el enlace de un polipéptido de la descripción con un ligando pueden usarse para generar anti-idiotipos que “imitan” la multimerización de un polipéptido y/o el dominio de enlace y, como consecuencia, se enlazan y neutralizan un polipéptido y/o su ligando. Estos anti-idiotipos neutralizadores o fragmentos Fab de estos antiidiotipos pueden usarse en regímenes terapéuticos para neutralizar el ligando del polipéptido. Por ejemplo, estos anticuerpos antiidiotípicos pueden usarse para enlazar un polipéptido de la descripción y/o enlazarse con sus ligandos/receptores, y de este modo activar o bloquear su actividad biológica.

Los intracuerpos son anticuerpos, a menudo scFvs, que se expresan a partir de una molécula de ácido nucleico recombinante y se produce para estar intracelularmente retenida (por ejemplo, retenida en el citoplasma, retículo endoplásmico, o periplasmo). Los intracuerpos pueden usarse, por ejemplo, para destruir la función de una proteína a la cual se enlaza el intracuerpo. La expresión de los intracuerpos puede regularse a través del uso de promotores inducibles en el vector de expresión de ácido nucleico que forma el intracuerpo. Los intracuerpos de la invención pueden producirse usando métodos conocidos en la técnica, como aquellos descritos y expuestos en Chen et al., Hum. Gene Ther. 5:595-601 (1994); Marasco, W.A., Gene Ther. 4:11-15 (1997); Rondon y Marasco, Annu. Rev. Microbiol. 51:257-283 (1997); Proba et al., J. Mol. Biol. 275:245-253 (1998); Cohen et al., Oncogene 17:2445-2456 (1998); Ohage y Steipe, J. Mol. Biol. 291:1119-1128 (1999); Ohage et al., J. Mol. Biol. 291:1129-1134 (1999); Wirtz y Steipe, Protein Sci. 8:22452250 (1999); Zhu et al., J. Immunol. Methods 231:207-222 (1999); y referencias aquí citadas. En particular, un intracuerpo CCR5 ha sido producido por Steinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:805810 (2000).

Tecnología XenoMouse

Anticuerpos de acuerdo con la invención pueden prepararse utilizando un ratón transgénico que tiene una sustancial parte del anticuerpo humano produciendo el genoma insertado pero que es deficiente en la producción de anticuerpos murinos endógenos (por ejemplo, cepas XenoMouse disponibles en Abgenix Inc., Fremont, CA). A continuación, estos ratones son capaces de producir moléculas y anticuerpos de inmunoglobulina humana y son deficientes en la producción de moléculas y anticuerpos de inmunoglobulina murina. Tecnologías utilizadas para conseguir lo mismo se describen en patentes, solicitudes y referencias aquí mencionadas.

La habilidad para clonar y reconstruir loci humanos del tamaño megabase YACs y para introducirlos en la línea germinal del ratón proporciona una poderosa técnica para dilucidar los componentes funcionales de loci muy granes y trazados de manera rudimentaria así como para generar modelos útiles de enfermedades humanas. Además, la utilización de esta tecnología para la sustitución de loci de ratones por sus equivalentes humanos proporcionaría visiones únicas en la expresión y regulación de productos de gen humano durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas y su implicación en inducción y progresión de enfermedades.

Una importante aplicación práctica de esta estrategia es la “humanización” del sistema inmune humoral del ratón. La introducción de loci de inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los que los genes Ig endógenos se han inactivado ofrece la oportunidad de estudiar los mecanismos que se encuentran bajo la expresión programada y el ensamblaje de anticuerpos así como su papel en el desarrollo de células B. Además, esta estrategia podría proporcionar una fuente ideal para la producción de anticuerpos monoclonales completamente humanos (Mabs), una importante hito hacia el cumplimiento de la promesa de terapia con anticuerpos en enfermedades humanas.

Se espera que los anticuerpos completamente humanos minimicen las repuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a los anticuerpos monoclonales de ratón o derivados de ratón y por lo tanto, aumentarán la eficacia y seguridad de los anticuerpos administrados. El uso de anticuerpos completamente humanos proporcionará una sustancial ventaja en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, como cáncer, que requieren administraciones repetidas de anticuerpos.

Una técnica con este objetivo consistió en la producción de variedades de ratones deficientes en la producción de anticuerpo de ratón con grandes fragmentos de loci Ig humano en anticipación de tal modo que estos ratones producirían un gran repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de anticuerpos de ratón. Los grandes fragmentos de Ig humano preservaría la gran diversidad variable de genes así como la propia regulación de producción y expresión de anticuerpos. Debido a la explotación de la maquinaria de ratones para la diversificación y selección de anticuerpos y a la falta de tolerancia inmunológica hacia proteínas humanas, el repertorio reproducido de anticuerpos humanos en estas variedades de ratones debería producir anticuerpos de elevada afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluyendo antígenos humanos. Usando la tecnología de hibridoma, los anticuerpos monoclonales humanos específicos de antígeno con la especificidad deseada podrán producirse y seleccionarse de manera sencilla.

Esta estrategia general se demostró en relación con la generación de las primeras variedades XenoMouse™ tal y como se publica en 1994. Ver Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994). Las variedades XenoMouse™ se produjeron con cromosomas artificiales de levadura (YACS) que contenían fragmentos con una configuración de línea germinal del tamaño 245 kb y 10 190 kb de los locus de cadena pesada humana y locus de cadena ligera kappa, respectivamente, que contenían secuencias con un núcleo variable y regiones constantes. Id. El Ig humano que contenía YACs demostró ser compatible con el sistema murino tanto para la reorganización como para la expresión de anticuerpos y fue capaz de sustituirse por los genes inactivados de Ig murino. Esto se demostró por su capacidad para provocar el desarrollo de células B, para producir un repertorio humano del tipo adulto de anticuerpos completamente humanos, y para generar anticuerpos monoclonales humanos específicos de antígeno. Estos resultados también sugirieron que la introducción de porciones más grandes del loci humanos Ig que contenía más genes V, elementos regulatorios adicionales y las regiones constantes humanas Ig podrían sustancialmente recapitular el repertorio completo que es característico de la respuesta humoral humana ante la infección e inmunización. El trabajo de Green et al. se extendió recientemente hasta la introducción de más de aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos por medio de la introducción de fragmentos YAC con una configuración de línea germinal de tamaño megabase de loci de cadena pesada humana y loci de cadena ligera kappa, respectivamente, para producir ratones XenoMouse™. Ver Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits J Exp. Med. 188:483-495 (1998), Green, Journal of Immunological Methods 231:11-23 (1999) y Solicitud de Patente Estadounidense con Nº de Serie 08/759,620, presentada el 3 de diciembre de 1996.

Esta técnica se desarrolla y define en la Solicitud de Patente Estadounidense con Nº de Serie 07/466,008, presentada el 12 de enero de 1990, 07/710,515, presentada el 8 de noviembre, 1990, 07/919,297, presentada July 24, 1992, 07/922,649, presentada July 30, 1992, presentada 08/031,801, presentada el 15 de marzo,1993, 08/112,848, presentada el 27 de agosto, 1993, 08/234,145, presentada el 28 de abril, 1994, 08/376,279, presentada el 20 de enero, 1995, 08/430, 938. 27 de abril, 1995, 0-8/464,584, presentada el 5 de junio, 1995, 08/464,582, presentada el 5 de junio, 1995, 08/471,191, presentada el 5 de junio, 1995, 08/462,837, presentada el 5 de junio, 1995, 08/486,853, presentada el 5 de junio, 1995, 08/486,857, presentada el 5 de junio, 1995, 08/486,859, presentada el 5 de junio, 1995, 08/462,513, presentada el 5 de junio, 1995, 08/724,752, presentada el 2 de octubre, 1996, y 08/759,620, presentada el 3 de diciembre, 1996. Ver también Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) y Green yJakobovits J Exp. Med.

188:483 495 (1998). Ver también Patente Europea Nº EP 0 471 151 B1, concesión publicada el 12 de junio, 1996, Solicitud de Patente Internacional Nº WO 94/02602, publicada el 3 de febrero, 1994, Solicitud de Patente Internacional Nº WO 96/34096, publicada el 31 de octubre, 1996, y WO 98/24893, publicada el 11 de junio, 1998.

Las respuestas del anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) han llevado a la industria a preparar anticuerpos quiméricos o sino humanizados. Mientras que los anticuerpos quiméricos tienen una región humana constante y una región murina variable, se espera observar ciertas respuestas de anticuerpo anti-quimérico humano (HACA), en particular en utilizaciones crónica y multi-dosis del anticuerpo. Por lo tanto, será deseable proporcionar anticuerpos completamente humanos contra polipéptidos VEGF-2 con el fin de eliminar las preocupaciones y/o efectos de las respuestas HAMA o HACA.

Usando la tecnología de exposición de fagos, la presente invención ha identificado moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (“scFvs”) que de manera inmunoespecífica se enlazan con VEGF-2. Las moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos o variantes de estos scFvs (por ejemplo, incluyendo los dominios VH, VH CDRs, dominios VL, o VL CDRs que tienen una secuencia de aminoácido de cualquiera de las referidas en la Tabla 2), que se enlazan de manera inmunoespecífica con VEGF-2 (o fragmentos o variantes del mismo, incluyendo la forma proproteína de VEGF-2 y la forma segregada de VEGF-2) también se incluyen en

la invención, al igual que moléculas de ácido nucleico que codifican estos scFvs, y/o moléculas. En particular, la invención hace referencia a scFvs que comprenden, o alternativamente consisten en, una secuencia de

5 aminoácido seleccionada del grupo consistente en SEQ ID NOs: 7278 preferiblemente SEQ ID NOs: 72 y 73 tal y como se indica en la Tabla 2 a continuación. Las moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos o variantes de estos scFvs (por ejemplo, incluyendo los dominios VH, VH CDRs, dominios

10 VL, o VL CDRs que tienen una secuencia de aminoácido de cualquiera de las referidas en la Tabla 2), que se enlazan de manera inmunoespecífica con VEGF-2 también están incluidas en esta invención, al igual que moléculas de ácido nucleico que codifican estos scFvs, y/o moléculas.

15 La presente invención proporciona anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se enlazan de manera inmunoespecífica con un polipéptido o fragmento de polipéptido de VEGF-2. En particular, la invención proporciona

20 anticuerpos correspondientes a los scFVs referidos en la Tabla 2, de modo que los scFvs se puedan “convertir” de manera rutinaria en moléculas de inmunoglobulina insertando, por ejemplo, las secuencias nucleótidas que codifican los dominios VH y/o VL de los scFv en un vector de expresión que contiene las secuencias de

25 dominio constante y se producen para dirigir la expresión de la molécula de inmunoglobulina, tal y como se describe con más detalle en el Ejemplo 32, a continuación.

30

imagen1

En una realización, la presente invención proporciona el scFv de SEQ ID NO:72 (o fragmentos o variantes del mismo). En otra realización, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifica el scFv de SEQ ID NO:72 (o fragmentos o variantes del mismo).

En una realización, la presente invención proporciona el scFv de SEQ ID NO:73 (o fragmentos o variantes del mismo). En otra realización, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifica el scFv de SEQ ID NO:73 (o fragmentos o variantes del mismo).

En una realización, la presente invención proporciona el scFv de SEQ ID NO:74 (o fragmentos o variantes del mismo). En otra realización, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifica el scFv de SEQ ID NO:74 (o fragmentos o variantes del mismo).

En una realización, la presente invención proporciona el scFv de SEQ ID NO:75 (o fragmentos o variantes del mismo). En otra realización, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifica el scFv de SEQ ID NO:75 (o fragmentos o variantes del mismo).

En una realización, la presente invención proporciona el scFv de SEQ ID NO:76 (o fragmentos o variantes del mismo). En otra realización, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifica el scFv de SEQ ID NO:76 (o fragmentos o variantes del mismo).

En una realización, la presente invención proporciona el scFv de SEQ ID NO:77 (o fragmentos o variantes del mismo). En otra realización, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifica el scFv de SEQ ID NO:77 (o fragmentos o variantes del mismo).

En una realización, la presente invención proporciona el scFv de SEQ ID NO:78 (o fragmentos o variantes del mismo). En otra realización, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifica el scFv de SEQ ID NO:78 (o fragmentos o variantes del mismo).

En una realización, la presente invención proporciona el scFv de SEQ ID NO:79 (o fragmentos o variantes del mismo). En otra realización, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifica el scFv de SEQ ID NO:79 (o fragmentos o variantes del mismo), por ejemplo, como se encuentra en SEQ ID NO:84.

En una realización, la presente invención proporciona el scFv de SEQ ID NO:80 (o fragmentos o variantes del mismo). En otra realización, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifica el scFv de SEQ ID NO:80 (o fragmentos o variantes del mismo), por ejemplo, como se encuentra en SEQ ID NO:85.

En una realización, la presente invención proporciona el scFv de SEQ ID NO:81 (o fragmentos o variantes del mismo). En otra realización, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifica el scFv de SEQ ID NO:81 (o fragmentos o variantes del mismo).

En una realización, la presente invención proporciona el scFv de SEQ ID NO:82 (o fragmentos o variantes del mismo). En otra realización, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifica el scFv de SEQ ID NO:82 (o fragmentos o variantes del mismo).

En una realización, la presente invención proporciona el scFv de SEQ ID NO:83 (o fragmentos o variantes del mismo). En otra realización, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifica el scFv de SEQ ID NO:83 (o fragmentos o variantes del mismo).

La presente invención engloba anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que se enlazan de manera inmunoespecífica con un polipéptido VEGF-2 o un fragmento, variante o proteína de fusión del mismo. Un polipéptido VEGF-2 incluye, pero no se limita a, el polipéptido VEGF-2 de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 O SEQ ID NO:18 o el polipéptido codificado por el cADN contenido en los Números de Depósito 97149 o 75698 depositados el 12 de mayo de 1995 y el 4 de mayo de 1995, respectivamente. El polipéptido VEGF-2 ligado por los anticuerpos de la invención puede ser la proteína de longitud completa, la proproteína, o la forma segregada de VEGF-2. VEGF-2 puede producirse por medio de expresión recombinante de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 O SEQ ID NO:18 (por ejemplo, el cADN en los Números de Depósito 97149

o 75698).

En una realización de la presente invención, los anticuerpos que se enlazan de manera inmunoespecífica con un polipéptido VEGF-2 o un fragmento o variante del mismo, comprenden una polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de cualquiera de los dominios VH de los scFvs referidos en la Tabla 2 y/o cualquiera de los dominios VL de los scFvs referidos en la Tabla 2. En realizaciones preferentes, los anticuerpos de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácido de un dominio VH o un dominio VL del mismo scFv seleccionado del grupo consistente en los scFvs referidos en la Tabla 2. En realizaciones alternativas, los anticuerpos de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácido de un dominio VH o un dominio VL de diferentes scFvs referidos en la Tabla 2. Las moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpos o variantes de los dominios VH y/o VL de los scFvs referidos en la Tabla 2 que se enlazan de manera inmunoespecífica con un VGF-2 también se incluyen en la invención, como moléculas de ácido nucleico que codifican estos dominios VH y VL, moléculas, fragmentos y/o variantes.

La presente invención también proporciona anticuerpos que de manera inmunoespecífica se enlazan con unpolipéptido, un fragmento de polipéptido o variante de un VEGF-2, donde dichos anticuerpos comprenden, o alterntativamente consisten en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de uno, dos, tres

o más de los VH CDRs contenidos en un dominio VH de uno o más scFvs referidos en la Tabla 2. En particular, la invención proporciona anticuerpos que de manera inmunoespecífica se enlazan con un

VEGF-2, que comprenden, o alternativamente consisten en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VH CDR1 contenido en un dominio VH de uno o más scFvs referidos en la Tabla 2. En otra realización, los anticuerpos que de manera inmunoespecífica se enlazan con un VEGF-2, comprenden, o alternativamente consisten en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VH CDR2 contenido en un dominio VH de uno

o más scFvs referidos en la Tabla 2. En una realización preferente, anticuerpos que de manera inmunoespecífica se enlazan con un VEGF-2, comprenden, o alternativamente consisten en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VH CDR3 contenido en un dominio VH de uno o más scFvs referidos en la Tabla 2. Moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, estos anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos, que de manera inmunoespecífica se enlazan con VEGF-2 o un fragmento de VEGF-2 o una variante del mismo también se incluyen en esta invención, como moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos, moléculas, fragmentos y/o variantes.

La presente invención también proporciona anticuerpos que de manera inmunoespecífica se enlazan con unpolipéptido, un fragmento de polipéptido o variante de un VEGF-2, donde dichos anticuerpos comprenden, o alterntativamente consisten en, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido de uno, dos, tres

o más de los VL CDRs contenidos en un dominio VL de uno o más scFvs referidos en la Tabla 2. En particular, la invención proporciona anticuerpos que de manera inmunoespecífica se enlazan con un VEGF-2, que comprenden, o alternativamente consisten en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VL CDR1 contenido en un dominio VL de uno o más scFvs referidos en la Tabla 2. En otra realización, los anticuerpos que de manera inmunoespecífica se enlazan con un VEGF-2, comprenden, o alternativamente consisten en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VL CDR2 contenido en un dominio VL de uno

o más scFvs referidos en la Tabla 2. En una realización preferente, anticuerpos que de manera inmunoespecífica se enlazan con un

VEGF-2, comprenden, o alternativamente consisten en, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de un VL CDR3 contenido en un dominio VL de uno o más scFvs referidos en la Tabla 2. Moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, estos anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos, que de manera inmunoespecífica se enlazan con VEGF-2 o un fragmento de VEGF-2 o una variante del mismo también se incluyen en esta invención, como moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos, moléculas, fragmentos y/o variantes.

La presente invención también proporciona anticuerpos (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes) que de manera inmunoespecífica se enlazan con un polipéptido VEGF-2 o fragmento de polipéptido o variante de un VEGF-2, donde dichos anticuerpos comprenden, o alternativamente consisten en, uno, dos, tres o más VH CDRs y uno, dos, tres o más VL CDRs, como los contenidos en un dominio VH o un domino VL de uno o más scFvs referidos en la Tabla 2. En particular, la invención proporciona anticuerpos que de manera inmunoespecífica se enlazan con un polipéptido o fragmento de polipéptido o variante de un VEGF-2, donde dichos anticuerpos comprenden, o alternativamente consisten en, un VH CDR1 y un VL CDR1, un VH CDR1 y un VL CDR2, VH CDR1 y un VL CDR3, VH CDR2 y un VL CDR1, VH CDR2 y un VL CDR2, VH CDR2 y un VH CDR3, VH CDR3 y un VL CDR1, un VH CDR3 y un VL CDR2, VH CDR3 y un VL CDR3 o cualquier combinación de los mismos, de los VHCDRs y VL CDRs contenidos en un domino VH o un domino VL de uno o más scFvs referidos en la Tabla 2. En una realización preferente, una o más de estas combinaciones son del mismo scFv tal y como se muestra en la Tabla 2. Las moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos o variantes de estos anticuerpos, que de manera inmunoespecífica se enlazan con un VEGF-2 también se engloban en esta invención, como moléculas de ácido nucleico codificadoras de estos anticuerpos, moléculas, fragmentos o variantes. Moléculas de Ácido Nucleico que codifican Anticuerpos VEGF-2

Correspondientes a scFvs
La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico, generalmente aisladas, que codifican un anticuerpo de la invención (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos). En una realización específica, una molécula de ácido nucleico de la invención que codifica un anticuerpo (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) comprende, o alternativamente consiste en, un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácido de cualquiera de los dominios VH de los scFvs referidos en la Tabla 2 y un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácido de cualquiera de los dominios VL de los scFvs referidos en la Tabla 2. En otra realización, una molécula de ácido nucleico de la invención que codifica un anticuerpo (incluyendo moléculas que comprenden, o alternativamente consisten en, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) comprende, o alternativamente consiste en, un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácido de cualquiera de los dominios VH de los scFvs referidos en la Tabla 2 o un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácido de cualquiera de los dominios VL de los scFvs referidos en la Tabla 2.
La presente invención también proporciona anticuerpos que comprenden, o alternativamente consisten en, variantes (incluyendo derivados) de las moléculas de anticuerpo (por ejemplo, los dominios VH y/o dominios VL) aquí descritos, cuyos anticuerpos se enlazan de manera inmunoespecífica con un VEGF-2 o fragmentos o variantes del mismo. Pueden utilizarse técnicas estándar conocidas por aquellos expertos para introducir mutaciones en la secuencia nucleótida codificadora de una molécula de la invención, incluyendo, por ejemplo, mutagénesis dirigida a la zona y mutagénesis mediada por PCR que dan como resultado sustituciones de aminoácido. Preferiblemente, las variantes (incluyendo derivados) codifican menos de 50 sustituciones de aminoácido, menos de 40 sustituciones de aminoácido, menos de 30 sustituciones de aminoácido, menos de 25 sustituciones de aminoácido, menos de 20 sustituciones de aminoácido, menos de 15 sustituciones de aminoácido, menos de 10 sustituciones de aminoácido, menos de 5 sustituciones de aminoácido, menos de 4 sustituciones de aminoácido, menos de 3 sustituciones de aminoácido o menos de 2 sustituciones de aminoácido en relación con el dominio referencial VH, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, domino VL, VLCDR1, VLCDR2 o VLCDR3. Una “sustitución de aminoácido conservadora” es aquella en la que el residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. Las familias de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares se han descrito en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas básicas laterales (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Como alternativa, las mutaciones pueden introducirse de manera arbitraria en toda o parte de la secuencia codificadora, como mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden analizarse en busca de actividad biológica para identificar los mutantes que retienen actividad (p. ej., la habilidad para ligarse con VEGF-2).
Por ejemplo, es posible introducir mutaciones solamente en las regiones del marco o solamente en las regiones CDR de una molécula de anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser silenciosas o mutaciones neutrales sin sentido, es decir, tienen muy poco efecto o ninguno sobre la habilidad del anticuerpo para enlazarse con un antígeno. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso del codón o para mejorar la producción de anticuerpos por parte del hibridoma. De manera alternativa, las mutaciones neutrales sin sentido pueden alterar la habilidad de un anticuerpo para enlazarse con el antígeno. La localización de la mayoría de las mutaciones silenciosas y las neutrales sin sentido suele estar en las regiones del marco, mientras que la localización de la mayoría de las mutaciones no neutrales sin sentido suele estar en CDR, a pesar de que éste no es un requisito absoluto. Un experto en la técnica será capaz de diseñar y testar moléculas mutantes con las propiedades deseadas como la falta de alteración en la actividad de enlace con antígeno o la alteración en la actividad de enlace (p. ej., mejoras en la actividad de enlace con antígeno o cambio en la especificidad de anticuerpo). Tras la mutagénesis, la proteína codificad puede expresarse de modo rutinario y la actividad funcinoal y/o biológica puede determinarse usando técnicas aquí descritas o técnicas de modificación rutinaria conocidas en la técnica.
En una realización específica, un anticuerpo de la invención (incluyendo una molécula que comprende, o alternativamente consiste en, un fragmento de anticuerpo o variante del mismo), que se enlaza de manera inmunoespecífica con polipéptidos VEGF-2 o fragmentos o variantes del mismo, comprende, o alternativamente consiste en, una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia nucleótida que hibridica una secuencia nucleótida que es complementaria a la codificadora de los dominios VH o VL de uno o más scFvs referidos en la Tabla 2, bajo condiciones rigurosas, p. ej.,
hibridización con ADN unido al filtro en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC seguido de dos o más lavados en 0.2 x SSC/0.1% SDS a aproximadamente 50-65ºC, bajo condiciones muy rigurosas, por ejemplo, hibridización con ácido nucleico unido al filtro en 6xSSC a aproximadamente 45ºC seguido de dos o más lavados en 0.1 x SSC/0.2% SDS a aproximadamente 68ºC, o bajo otras condiciones rigurosas de hibridización que son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds. , 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., New York en páginas 6.3.1-6.3.6 y 2.10.3).
Es bien conocido en la técnica que los polipéptidos, o fragmentos o variantes de los mismos, con similares secuencias de aminoácido tienen una estructura similar y comparten muchas de las actividades biológicas. Por lo tanto, en una realización, un anticuerpo (incluyendo una moléculas que comprende, o alternativamente consiste en, un fragmento de anticuerpo o variante del mismo) que de manera inmunoespecífica se enlaza con un polipéptido VEGF-2 o fragmentos o variantes de un polipéptido VEGF-2, comprende, o alternativamente consiste en, un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácido que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácido de un dominio VH de un scFv referido como SEQ ID NO:79.
En otra realización, un anticuerpo (incluyendo una moléculas que comprende, o alternativamente consiste en, un fragmento de anticuerpo o variante del mismo) que de manera inmunoespecífica se enlaza con un polipéptido VEGF-2 o fragmentos o variantes de un polipéptido VEGF-2, comprende, o alternativamente consiste en, un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácido que es al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácido de un dominio VL de un scFv referido en la Tabla 2. Polinucleótidos que Codifican Anticuerpos
Los anticuerpos de la invención (incluyendo fragmentos o variantes de anticuerpo) pueden producirse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se apreciará que los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden expresarse en líneas celulares diferentes a las líneas celulares del hibridoma. Las secuencias que codifican los cADNs o clones genómicos para los anticuerpos particulares pueden usarse para la transformación de células de un huésped mamífero o no mamífero o para generar bibliotecas de exposición de fagos, por ejemplo. Además, los anticuerpos de polipéptido de la invención pueden sintetizarse químicamente o producirse usando sistemas de expresión recombinante.
Un modo para producir los anticuerpos de la invención sería clonar los dominios VH y/o VL de los scFvs referidos en la Tabla 2. Con el fin de aislar los dominios VH y VL de las líneas celulares de hibridoma, los cebadores de PCR incluyendo las secuencias nucleótidas VH y VL (Ver Ejemplo 32) pueden usarse para amplificar las secuencias expresadas de VH y VL expresadas por el fago. Los productos PCR pueden a continuación clonarse usando vectores que tienen, por ejemplo, un producto PCR clonador del lugar que consiste en un nucleótido saliente T sencillo en 5’ o 3’, que es complementario al nucleótido de adenina sencillo y saliente añadido en el extremo 5’ y 3’ de productos PCR por muchas polimerasas de ADN usadas para las reacciones de PCR. Posteriormente, los dominios VH y VL pueden secuenciarse usando métodos convencionales en la técnica.
Los genes clonados de VH y VL pueden colocarse en uno o más vectores adecuados de expresión. A modo de ejemplo no limitativo, los cebadores PCR incluyendo las secuencias nucleótidas de VH y VL, como lugar de restricción, y una secuencia de flanqueo para proteger el lugar de restricción, pueden usarse para amplificar las secuencias VH o VL. Utilizando técnicas de clonación conocidas por aquellos expertos, los dominios VH amplificados por PCR pueden clonarse a vectores que expresan la región constante apropiada de inmunoglobulina, por ejemplo, la región constante humana IgG1 o IgG4 para los dominios VH, y las regiones constantes humanas kappa o lambda para los dominios VL kappa y lambda, respectivamente. Preferiblemente, los vectores para expresar los dominios VH o VL contienen un promotor adecuado para dirigir la expresión de las cadenas pesada y ligera en el sistema de expresión elegido, una señal de secreción, un lugar de clonación para el dominio variable de inmunoglobulina, dominios constantes de inmunoglobulina, y un marcador de selección como neomicina. Los dominios VH y VL también pueden clonarse a un único vector que expresa las regiones constantes necesarias. Los vectores de conversión de cadena pesada y los vectores de conversión de cadena ligera se co-trasfectan a continuación a líneas celulares para generar líneas celulares estables o pasajeras que expresen anticuerpos de longitud completa, p. ej., IgG, usando técnicas conocidas por los expertos en el campo (Ver, por ejemplo, Guo et al.,
J. Clin. Endocrinol. Metab. 82:925-31 (1997), y Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-86 (1995).
La invención también proporciona polinucleótidos que consisten en una secuencia nucleótida codificadora de un anticuerpo de la invención y fragmentos del mismo. La invención también engloba polinucleótidos que hibridizan bajo condiciones rigurosas o de menor rigor, p. ej., como se ha definido anteriormente, a polinucleótidos que codifican un anticuerpo, preferiblemente, que se enlaza de manera inmunoespecífica con un polipéptido de la invención, preferiblemente, un anticuerpo que se enlaza con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 O SEQ ID NO:18.
Los polinucleótidos pueden obtenerse, y la secuencia nucleótida de los polinucleótidos determinarse, usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, si la secuencia nucleótida del anticuerpo es conocida, un polinucleótido codificador del anticuerpo pueden formarse a partir de oligonucleótidos químicamente sintetizados (p. ej., como se describe en Kutmeir et al., BioTechniques 17:242 (1994)), que, en resumen, implica la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen porciones de la secuencia codificadora del anticuerpo, templando y ligando estos oligonucleótidos, y a continuación amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.
De manera alternativa, un polinucleótido que codifica un anticuerpo puede generarse a partir de ácido nucleico procedente de una fuente adecuada. Si un clon que contiene un ácido nucleico codificador de un anticuerpo particular no se encuentra disponible, pero la secuencia de la molécula de anticuerpo es conocida, un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina puede sintetizarse químicamente u obtenerse a partir de una fuente adecuada (p. ej., una biblioteca ADN de anticuerpo o una biblioteca cADN generada a partir de ácido nucleico, preferiblemente poly A+ ARN, aislado de cualquier tejido o células que exprese el anticuerpo, como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo de la invención) mediante amplificación con PCR usando cebadores sintéticos que pueden hibridizarse con los extremos 5’ y 3’ de la secuencia (Ver Ejemplo 32) o mediante clonación usando una sonda de oligonucleótido específica para la secuencia genética particular para identificar, p. ej., un clon cADN de una biblioteca cADN que codifica el anticuerpo. Los ácidos nucleicos amplificados generados por PCR pueden clonarse a continuación hasta ser vectores replicables de clonación usando métodos bien conocidos en la técnica.
Una vez que se determinan la secuencia nucleótida y la secuencia correspondiente de aminoácido, la secuencia nucleótida pueden manipularse usando métodos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias nucleótidas, p. ej., técnicas recombinantes de ADN, mutagénesis dirigida a la zona, PCR, etc. (ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY and Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY,) para generar anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácido diferente, por ejemplo, para crear sustituciones, eliminación y/o inserciones de aminoácidos.
En una realización específica, la secuencia de aminoácido de los dominios variables de la cadena pesada y/o ligera puede examinarse para identificar las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) con métodos que cson bien conocidos en la técnica, p. ej., mediante comparación con secuencias conocidas de aminoácido de otras regiones variables de cadena pesada y ligera para determinar las regiones de hipervariabilidad secuencial. Usando técnicas recombinantes rutinarias con ADN, uno o más de los CDRs pueden insertarse en las regiones del marco, p. ej., en regiones de marco humano para humanizar un anticuerpo no humano, tal y como se ha descrito anteriormente. Las regiones de marco pueden ocurrir de manera natural o regiones de marco de consenso, y preferiblemente regiones de marco humano (ver, p. ej., Chothia et al., J. Mol. Biol. 278: 457479 (1998) para un listado de regiones de marco humano).
Preferiblemente, el polinucleótido generado por la combinación de regiones de marco y CDRs codifica un anticuerpo que se enlaza de manera específica con un polipéptido de la descripción. Preferiblemente, como se ha mencionado anteriormente, una o más sustituciones de aminoácido pueden hacerse en el interior de las regiones de marco, y preferiblemente, las sustituciones de aminoácido mejoran el enlace del anticuerpo con su antígeno. Además, estos métodos pueden usarse para hacer sustituciones o eliminaciones de aminoácidos de uno o más residuos de cisteína en la región variable que participan en un enlace disulfuro intracadena para generar molécula de anticuerpo que carece de uno o más enlaces de disulfuro intracadena. Otras alteraciones en los polinucleótidos también están incluidas en la presente invención y en la capacidad de la técnica.
Para algunos usos, como para la mutación por afinidad in vitro de un anticuerpo de la invención, puede ser útil para expresar los dominios VH o VL de uno o más anticuerpos de la invención como anticuerpos de cadena sencilla o fragmentos Fab en una biblioteca de exposición de fagos. Por ejemplo, los cADNs que codifican los dominios VH o VL de uno o más anticuerpos de la invención pueden expresarse en todas las combinaciones posibles usando una biblioteca de exposición de fagos, permitiendo la selección de combinaciones VH/VL que se enlazan con un polipéptido VEGF-2 con características preferentes de enlace como una mayor afinidad o mayores constantes de disociación. Además, los segmentos VH y VL
– las regiones CDR de los dominios VH y VL de uno o más anticuerpos de la invención, en particular, pueden mutarse in vitro. La expresión de los dominios VH y VL con CDRs “mutantes” en una biblioteca de exposición de fagos permite la selección de combinaciones VH/VL que se enlazan con un polipéptido receptor VEGF-2 con preferentes de enlace como una mayor afinidad o mayores constantes de disociación.
En métodos de exposición de fagos, los dominios funcionales de anticuerpo se exponen sobre la superficie de las partículas de fagos que transportan las secuencias de polinucleótidos que los codifica. En particular, las secuencias de ADN que codifican los dominios VH y VL se amplifican a partir de bibliotecas animales de cADN (p. ej., bibliotecas de cADN murino o humano de tejidos linfoides) o bibliotecas sintéticas de cADN. El ADN que codifica los dominios VH y VL se unen mediante un conector scFv por PCR y se clona a un vector fagémido (p. ej., CANTAB 6 o pComb 3 HSS). El vector se somete a electroforesis en E. coli y E. coli se infecta con el fago ayudante. El fago usado en estos métodos es normalmente fago filamentoso que incluye fd y M13 y los dominios vH y VL y normalmente se fusionan recombinantemente con el gen III o gen VIII del fago. El fago que expresa un antígeno que se enlaza con un dominio que se enlaza con un antígeno de interés (es decir, un polipéptido VEGF-2 o fragmento del mismo) puede seleccionarse o identificarse con antígeno, p. ej., usando antígeno etiquetado o antígeno enlazado o capturado a una superficie o gota sólida. Ejemplos de métodos con exposición de fagos que pueden usarse para hacer los anticuerpos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic el al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280(1994); solicitud PCT Nº PCT/GB91/O1134; publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737. WO 92101047; WO 92/18719; WO 93/1 1236; WO 95/15982; WO 95/20401; WO97/13844; y Patente de Estados Unidos Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484, 5,580,717; 5,427,908; 5,750;753; 5,821,047; 5,571,698, 5,42,7,908; 5,516,717; 5,780,225; 5,658,727; 5,735,743 and 5,969,108.
Además, pueden usarse las técnicas desarrolladas para la producción de “anticuerpos quiméricos (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)) ensamblando genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad apropiada de antígeno con genes de molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Tal y como se ha descrito anteriormente, un anticuerpo quimérico es una molécula en la que se derivan diferentes versiones de diferentes especies animales, como aquellas que tienen una región variable derivada de un mAb murino y una región constante de inmunoglobulina humana, p. ej., anticuerpos humanizados.
De manera alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de Estados Unidos Nº 4,946,778; Bird, Science 242.423- 42 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); and Ward et al., Nature 334:544-54 (1989)) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla. Los anticuerpos de cadena sencilla se forman uniendo los fragmentos de cadena pesada y cadena ligera de la región Fv por medio de un puente de aminoácido, dando como resultado un polipéptido de cadena sencilla. También se pueden usar técnicas para montar fragmentos funcionales de Fv en E. coli (Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988)). Métodos para Producir Anticuerpos
Los anticuerpos de la invención pueden producirse con métodos conocidos en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, mediante síntesis química, mediante inmunización intracelular (es decir, tecnología de intracuerpo), o preferiblemente, mediante técnicas de expresión recombinante. Los métodos para producir anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, tecnología de hibridoma, transformación EBV, y otros métodos aquí descritos así como el uso de tecnología recombinante de ADN, tal y como se expone a continuación.
La expresión recombinante de un anticuerpo de la invención, o un fragmento, derivado, variante o análogo del mismo (por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo de la invención o un anticuerpo de cadena sencilla de la invención) requiere la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez que se ha obtenido el polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo o una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o porción del mismo (preferiblemente conteniendo el dominio variable de la cadena pesada o ligera), el vector para la producción de la molécula de anticuerpo pueden producirse mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en el campo. Por lo tanto, los métodos para producir una proteína expresando un polinucleótido que contiene un anticuerpo codificador de la secuencia nucleótida se describen aquí. Métodos que son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen el anticuerpo codificador de la secuencia y de señales apropiadas de control trascripcionales y traslacionales. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas recombinantes de ADN in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Por consiguiente, la invención proporciona vectores replicables que comprenden una secuencia nucleótida codificadora de una molécula de anticuerpo de la invención, o una cadena pesada
o ligera del mismo, o un dominio variable de cadena pesada o ligera, unidos al promotor de manera operativa. Estos vectores pueden incluir la secuencia nucleótida codificadora de la región constante de la molécula de anticuerpo (ver, p. ej., Publicación PCT WO 86/05807; Publicación PCT WO 89/01036; y Patente de Estados Unidos Nº 5,122,464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en dicho vector para expresar la cadena completa pesada o ligera.
El vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan a continuación usando técnicas convencionales para producir un anticuerpo de la invención. Por lo tanto, la invención incluye células huéspedes que contienen un polinucleótido codificador de un anticuerpo de la invención, o una cadena pesada o ligera, o un anticuerpo de cadena sencilla de la invención, unidas de manera operativa con un promotor heterólogo. En realizaciones preferentes para la expresión de anticuerpos de doble cadena, los vectores que codifican tanto las cadenas pesadas como ligeras pueden co-expresarse en la célula huésped para la expresión de la molécula completa de inmunoglobulina, tal y como se detalla a continuación.
Pueden utilizarse una gran variedad de sistemas de vector de expresión en huésped para expresar las moléculas de anticuerpo de la invención. Estos sistemas de expresión en huésped representan vehículos por los cuales las secuencias codificadoras de interés pueden producirse y posteriormente purificarse, pero también representan célula que pueden, cuando se transforma o transfecta con el nucleótido adecuado que codifica secuencias, expresan una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Estos incluyen, aunque no se limitan a, microorganismos como bacterias (p. ej., E. coli, B. subtilis) transformadas con ADN bacteriófago recombinante, ADN plásmido o vectores de expresión ADN cósmido que contiene anticuerpo codificador de secuencias; levadura (p. ej., Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores recombinantes de expresión de levadura que contienen secuencias codificadoras de anticuerpo; sistemas celulares de insectos infectados con vectores recombinantes de expresión de virus (p. ej., baculovirus) que contienen secuencias codificadoras de anticuerpo; sistemas celulares de plantas infectados con vectores recombinantes de expresión de virus (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores recombinantes de expresión de plásmido (p. ej., plásmido Ti) que que contienen secuencias codificadoras de anticuerpo; o sistemas celulares de mamíferos (p. ej., células COS, CHO, BHK, 293, 3T3, NSO) que albergan construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de las células de mamíferos (p. ej., promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (p. ej., promotor tardío de adenovirus, el promotor 7.5K del virus vaccinia). Preferiblemente, las células bacterianas como Escherichia coli, y más preferiblemente células eucarióticas, especialmente para la expresión de toda la molécula de anticuerpo recombinante, se usan para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, las células de mamíferos como células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector como el principal elemento promotor intermedio de gen temprano de citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).
En sistemas bacterianos, puede seleccionarse un número de vectores de expresión de manera ventajosa dependiendo del uso que se le dé a la molécula de expresión que está siendo expresada. Por ejemplo, cuando se está produciendo una gran cantidad de esta proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de una molécula de anticuerpo, vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifican de manera sencilla pueden ser deseables. Estos vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)), en el que el anticuerpo que codifica la secuencia puede ligarse individualmente al vector en el marco con la región codificadora lacZ de modo que se produzca la proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:31013109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); y similares. Los vectores pGEX también pueden usarse para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, estas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente de células lisadas mediante adsorción y enlace con gotas de matriz glutatión-agarosa a lo que sigue elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir puntos de división de trombina o factor proteasa Xa de modo que el producto de gen objetivo clonado pueda liberarse del radical GST.
En un sistema de insectos, el virus de poliedrosis nuclear de Autographa califórnica (AcNPV) se usa como un vector para expresar genes extraños. El virus crece en células Spodoptera frugiperda. El anticuerpo que codifica la secuencia puede clonarse de manera individual en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen poliedrina) del virus y colocarse bajo control de un promotor acNPV (por ejemplo, el promotor de poliedrina)
En células huéspedes de mamíferos, puede utilizarse un número de sistemas de expresión con base viral. En casos en los que se usa adenovirus como vector de expresión, el anticuerpo que codifica la secuencia de interés puede ligarse a un complejo de control de adenovirus transcripción/traslación, p. ej., el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico pueden a continuación insertarse en el genoma de adenovirus a través de recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (p. ej., la región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de anticuerpo en huéspedes infectados (p. ej., ver Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)). Las señales específicas de iniciación también pueden ser necesarias para la traslación eficiente del anticuerpo insertado codificador de secuencias. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y las secuencias adyacentes. Además, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificadora deseada y los codones de iniciación pueden tener varios orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de expresión puede aumentarse mediante la inclusión de apropiados elementos potenciadores de transcripción, terminadores de trascripción, etc. (ver Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)).
Además, puede elegirse una variedad de célula huésped que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el gen de la manera específica que se desee. Estas modificaciones (p. ej., glicosilación) y procesos (p. ej., división) de proteínas pueden ser importantes para la función de la proteína. Las diferentes células huéspedes tienen mecanismos característicos y específicos para el proceso post-traslacional y la modificación de proteínas y genes. Pueden elegirse apropiadas líneas celulares o sistemas de huéspedes para asegurar la correcta modificación y proceso de la proteína extraña expresada. Con este fin, pueden usarse células huéspedes eucarióticas que poseen la maquinaría celular para el procesamiento adecuada de la transcripción, glicosilación, y fosforilación del gen. Estas células huéspedes de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3,WI38, y en particular, líneas celulares de cáncer de pecho como, por ejemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, y línea celular de glándula mamaria normal como, por ejemplo, CRL7030 y Hs578Bst.
Para producción a largo plazo o a gran escala de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, pueden fabricarse líneas celulares que expresen de manera estable la molécula de anticuerpo. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes virales de réplica, las células huéspedes pueden transformase con ADN controlado por terminadores de trascripción, puntos de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN externo, se deja que las células fabricadas crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y a continuación se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células establemente integren el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse hasta forma líneas celulares. Este método puede usarse de manera ventajosa para construir líneas celulares que expresen la molécula de anticuerpo. Estas líneas celulares construidas pueden ser particularmente útiles en el análisis y evaluación de compuestos que interactúan directamente o indirectamente con la molécula de anticuerpo.
Pueden usarse un número de sistemas de selección, incluyendo pero sin limitarse a los genes del virus de herpes simplex timidina quinasa (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hipoxantinaguanina fosforibosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)), y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) pueden emplearse en las células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. También pueden usarse la resistencia a antimetabolito como base para la selección de los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia a aminoglicósidos G418 Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:97-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215); e higro, que confiere Resistencia a higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología recombinante de AND pueden aplicarse de manera rutinaria para seleccionar el clon recombinante deseado y tales métodos se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press. NY (1990); and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol.
150:1 (1981).
Los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo pueden crecer mediante la amplificación de vector (para ver publicaciones, ver Bebbington y Hentschel, el uso de vectores basados en amplificación de genes para la expresión de genes clonados en células de mamíferos en clonación de ADN, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa el anticuerpo es capaz de amplificarse, el incremento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Debido a que la región amplificada se asocia con el gen del anticuerpo, la producción del anticuerpo también aumentará (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)).
Los vectores que usan glutamina sintasa (GS) o DHFR como marcadores seleccionables pueden amplificarse en presencia de los fármacos metionina sulfoximina o metotrexato, respectivamente. Una ventaja de los vectores basados en glutamina sintasa es la disponibilidad de líneas celulares (p. ej., la línea celular de mieloma murina, NS0) que son glutamina sintasa negativas. Los sistemas de expresión de glutamina sintasa también pueden funcionar en células que expresan glutamina sintasa (p. ej., células de Ovario de Hámster Chino (CHO)) proporcionando un inhibidor adicional para evitar el funcionamiento del gen endógeno. Los vectores que usan glutamina sintasa como marcador seleccionable incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión pEE6 descrito en Stephens y Cockett, Nucl. Acids. Res 17:7110 (1989). Un sistema de glutamina sintasa y componentes del mismo se detallan en las publicaciones PCT: WO87/04462 WO86/05807: WO89/01036; WO89/10404; and WO91/06657. Además, los vectores de expresión de glutamina sintasa que pueden usarse de acuerdo con la presente invención se encuentran disponibles en el mercado por parte de proveedores entre los que se incluye, por ejemplo, Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH). La expresión y producción de anticuerpos monoclonales usando un sistema de expresión GS en células de mieloma murino se describen en Bebbington et al., Bio/technology 10:169(1992) y en Biblia y Robinson Biotechnol. Prog. 11:1 (1995).
La célula huésped puede co-trasfectarse con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector codificando un polipéptido derivado de una cadena pesada y el segundo codificando un polipéptido derivado de una cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la misma expresión de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. De manera alternativa, puede usarse un único vector que codifique, y sea capaz de expresar, los polipéptidos de cadena pesada y ligera. En estas situaciones, la cadena ligera debería colocarse antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada sin elementos tóxicos ((Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)).
Las secuencias codificadoras de las cadenas pesada y ligera pueden estar formadas por cADN o ADN genómico.
Una vez que se ha producido una molécula de anticuerpo de la invención por medio de un animal químicamente sintetizado o recombinantemente expresado, puede purificarse utilizando cualquier método conocido en la técnica para purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (p. ej., intercambio de ión, afinidad, en particular mediante afinidad para el antígeno específico después de Proteína A, y midiendo la cromatografía de columna), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante otras técnicas estándares para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos pueden fusionarse con secuencias de polipéptidos heterólogos aquí descritas o conocidas en la técnica para facilitar la purificación.
Conjugados de Anticuerpos
Además se incluyen en la presente invención anticuerpos recombinantemente fusionados o químicamente conjugados (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) con un polipéptido de la presente descripción. Los anticuerpos pueden ser específicos para antígenos diferentes a los polipéptidos de la presente descripción. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos para dirigir polipéptidos de la presente descripción hacia tipos particulares de células, ya sea in vitro o in vivo, fusionando o conjugando los polipéptidos de la presente descripción con anticuerpos específicos de receptores particulares superficiales de células. Los anticuerpos fusionados o conjugados con los polipéptidos de la presente descripción también pueden usarse en inmunoensayos in vitro y en métodos de purificación que usan los métodos conocidos en la técnica. Ver, p. ej., Harbor et al. supra and WO 93/21232; EP 0 439 095; Naramura, M. et al. (1994) Immunol. Lett. 39:91-99; US Patent 5,474,981; Gillies, S.O. et al. (1992) PNAS 89:1428-1432; Fell, H.P. et al. (1991) J. Immunol, 146:2446-2452.
La presente descripción incluye además composiciones compuestas por los polipéptidos de la presente descripción fusionados o conjugados con dominios de anticuerpo diferentes a los de las regiones variables. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente descripción pueden fusionarse o conjugarse con una región del anticuerpo Fc o una porción del mismo. La porción de anticuerpo fusionada con un polipéptido de la presente descripción puede estar formada por la región bisagra, dominio CH1, dominio CH2, y dominio CH3 en cualquiera combinación de los dominios completos o de porciones de ellos. Los polipéptidos de la presente descripción pueden fusionarse o conjugarse con las porciones mencionadas de anticuerpo para aumentar la vida media in vivo de los polipéptidos o para usar en inmunoensayos usando métodos conocidos en la técnica. Los polipéptidos también pueden fusionarse o conjugarse con las porciones mencionadas de anticuerpo para formar multímeros. Por ejemplo, las porciones Fc fusionadas con los polipéptidos de la presente descripción pueden formar dímeros mediante enlace de disulfuro entre las porciones Fc. Métodos para fusionar o conjugar los polipéptidos de la presente descripción con porciones de anticuerpo son conocidas en la técnica. Ver, p ej., Patentes de Estados Unidos 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046. 5,349,053, 5,447,851, 5,112,946; EP 0 307 434, EP 0 367 166; WO 96/04388, WO 91/06570; Ashkenazi, A. et al. (1991) PNAS 88:10535-10539; Zheng, X.X. et al. (1995) J. Immunol. 154:5590-5600; and Vil, H. et al. (1992) PNAS 89:1133711341.
La presente invención engloba anticuerpos recombinantemente fusionados o químicamente conjugados ((incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) con un polipéptido (o porción del mismo, preferiblemente al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 aminoácidos del polipéptido) de la presente descripción para generar proteínas de fusión. La fusión no tiene que ser necesariamente directa, pero puede darse a través de secuencias conectoras. Los anticuerpos pueden ser específicos para los antígenos diferentes a los polipéptidos (o porciones de los mismos) de la presente descripcíon. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos para dirigir los polipéptidos de la presente descripción hacia tipos particulares de células, ya sea in vitro o in vivo, fusionando o conjugando los polipéptidos de la presente descripción con anticuerpos específicos de receptores particulares superficiales de células. Los anticuerpos de la presente descripción (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) pueden fusionarse con el extremo de la terminal N o C de la proteína heteróloga (p. ej., polipéptido Fc de inmunoglobulina o polipéptido de albúmina en suero humano). Los anticuerpos de la invención también pueden fusionarse con albúmina (incluyendo pero sin limitarse a albúmina recombinante en suero humano (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 5,876,969, publicada el 12 de marzo, 1999, Patente EP 0 413 622, y Patente de Estados Unidos Nº 5,766,883, publicada el 16 de junio, 1998,)) dando como resultado
polipéptidos quiméricos. En una realización preferente, anticuerpos de la presente invención (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan con la forma madura de albúmina en suero humano (es decir, aminoácidos 1 – 585 de albúmina en suero humano mostrados en las Figuras 1 y 2 de la Patente EP 0 322 094). En otra realización preferente, anticuerpos de la presente invención (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan con fragmentos de polipéptido que comprenden, o alternativamente consisten en, residuos de aminoácido 1-x de albúmina en suero humano, donde x es un número entero entre 1 y 585 y el fragmento de albúmina tiene actividad humano de albúmina en suero.
En otra realización preferente, anticuerpos de la presente invención (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan con fragmentos de polipéptido que comprenden, o alternativamente consisten en, residuos de aminoácido 1-z de albúmina en suero humano, donde z es un número entero entre 369 y 419, tal y como se describe en la Patente de Estados Unidos 5,766,883. Los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión también se incluyen en la invención. Estas proteínas pueden, por ejemplo, facilitar la purificación y pueden incrementar la vida media in vivo. Anticuerpos fusionados o conjugados con los polipéptidos de la presente descripción también pueden usarse en inmunoensayos in vitro y métodos de purificación usando métodos conocidos en la técnica. Ver, p. ej., Harbor et al., supra, and PCT publication WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol. Lett. 39:91-99 (1994); U.S. Patent 5,474,981; Gillies et al., PNAS 89:1428-1432 (1992); Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452(1991).
La presente invención incluye además composiciones que comprenden los polipéptidos de la presente descripción fusionados o conjugados con dominios de anticuerpo diferentes a las regiones variables. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente descripción pueden fusionarse o conjugarse con una región del anticuerpo Fc o una porción del mismo. La porción de anticuerpo fusionada con un polipéptido de la presente descripción puede estar formada por la región constante, la región bisagra, dominio CH1, dominio CH2, y dominio CH3 en cualquiera combinación de los dominios completos
o de porciones de ellos. Los polipéptidos de la presente descripción pueden fusionarse o conjugarse con las porciones mencionadas de anticuerpo para formar multímeros. Por ejemplo, las porciones Fc fusionadas con los polipéptidos de la presente descripción pueden formar dímeros mediante enlace de disulfuro entre las porciones Fc. Pueden formarse mayores formas multiméricas fusionando o conjugando los polipéptidos con porciones de IgA e IgM. Métodos para fusionar o conjugar los polipéptidos de la presente descripción con porciones de anticuerpo son conocidos en la técnica. Ver, p ej., Patentes de Estados Unidos Nos. 5,336,603; 5.622,929; 5,359,046; 5,349,053: 5,447,851; 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; PCT publications WO 96/04388; WO 91/06570; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Zheng ct al., J. Immunol. 154:5590-5600 (1995); y Vil et al., Pro. Natl, Acad. Sci. USA 89:11337-11341(1992).
Tal y como se ha mencionado anteriormente, solamente por preferencia, los polipéptidos que corresponden a un polipéptido, fragmento de polipéptido, o una variante de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:18 pueden fusionarse o conjugarse con las porciones mencionadas de anticuerpo para incrementar la vida media in vivo o para uso en inmunoensayos usando métodos conocidos en la técnica. Además, los polipéptidos correspondientes a SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:18 pueden fusionarse o conjugarse con las porciones mencionadas de anticuerpo para facilitar la purificación. Un ejemplo presentado describe proteínas quiméricas consistentes en los dos primeros dominios del polipéptido humano CD4 y varios dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas de mamíferos (EP 394 827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988). Los polipéptidos de la presente descripción fusionados o conjugado con un anticuerpo que tienen estructuras diméricas unidas a disulfuros (debido a su IgG) también pueden ser más eficientes en el enlace y neutralización de otras moléculas que la proteína segregada por los monoméricos o solamente el fragmento de proteína. (Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)). En muchos casos, la parte FC en una proteína de fusión es beneficiosa en terapia y diagnóstico, y por lo tanto puede resultar en, por ejemplo, tener mejores propiedades farmacocinéticas. (EP A 232,262). De manera alternativa, puede desearse eliminar la parte Fc después de que la proteína de fusión se haya expresado, detectado y purificado. Por ejemplo, la porción Fc puede dificultar la terapia y el diagnóstico si la proteína de fusión se usa como antígeno para inmunización. En el campo de descubrimiento de fármacos, por ejemplo, las proteínas humanas, como hIL-5, se han fusionado con porciones Fc en ensayos de análisis de elevada producción con el fin de identificar antagonistas de hIL-5. (Ver, Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995): Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995).
Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invención pueden fusionarse con secuencias marcadoras, como un péptido para facilitar la purificación. En realizaciones preferentes, la secuencia marcadora de aminoácido es un péptido hexa-histidina, como la etiqueta provista en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA. 91311), entre otros, muchos de los cuales se encuentran disponibles en el mercado. Tal y como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, hexa-histidina proporciona una conveniente purificación de la proteína de fusión.
Otras etiquetas de péptido útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta “HA”, que corresponde a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina de influenza (Wilson et al., Cell

37:767

(1984)) y la etiqueta “flag”.

La presente invención incluye además anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados con un agente diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos pueden usarse diagnósticamente para, por ejemplo, controlar el desarrollo o progresión de un tumor como parte de un procedimiento de pruebas clínicas para, por ejemplo, determinar la eficacia de un determinado régimen de tratamiento. La detección puede facilitarse enlazando el anticuerpo con una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos protéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, positrones que emiten metales que usan varias tomografías de emisión de positrón, e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. La sustancia detectable puede unirse o conjugarse bien directamente al anticuerpo (o fragmento del mismo) o indirectamente mediante un intermediario (como, por ejemplo, un enlace conocido en la técnica) usando técnicas conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4,741,900 donde los iones de metal pueden conjugarse con anticuerpos para uso como diagnóstico de acuerdo con la presente invención. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; ejemplos de adecuados complejos del grupo protético incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de adecuados materiales fluorescentes incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina; y ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen iodina (121I, 123I, 125I, 131I), carbono (14C), sulfuro (35S), tritio (3H), indio (111In, 112IN, 113mIN, 115mIn), tecnetio (99Tc, 99mTc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), fluorina (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh y 97Ru. Se describen polipéptidos VEGF-2 de la invención unidos a queladores macrocíclicos útiles para conjugar iones de radiometales, incluyendo pero sin limitar, 111In, 177Lu, 90Y, 166Ho y 153Sm con polipéptidos. Por ejemplo, el quelado macrocíclico puede ser un ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N’,N’’,N’’’-tetraacético (DOTA). También, el DOTA puede unirse a un polipéptido VEGF-2 de la descripción por medio de una molécula enlazadora. Ejemplos de moléculas enlazadoras útiles para conjugar DOTA con un polipéptido son conocidos en la técnica, ver, por ejemplo, DeNardo et al, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90, 1998; Peterson et al., Bioconjug. Chem. 10(4):553-7, 1999; y Zimmerman et al, Nucl. Med. Biol. 26 (8):943-50, 1999. Además las Patentes de Estados Unidos 5,652,361 y 5,756,065, describen agentes quelantes que pueden conjugarse con anticuerpos, y métodos para hacerlos y usarlos. Con las Patentes de Estados Unidos 5,652,361 y 5,756,065 centradas en la conjugación de agentes quelantes con anticuerpos, un experto en la técnica fácilmente podrá adaptar los métodos aquí descritos con el fin de conjugar agentes quelantes con otros polipéptidos. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las células. Entre los ejemplos se incluyen paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, diona antracina dihidroxi, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Entre los agentes terapéuticos se incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (p. ej. mecloretamina, clorambucil thioepa, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cisdiclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatina, antraciclinas (p. ej., daunorubicina (antes daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (p. ej., dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (p. ej., vincristina y vinblastina). Los conjugados de anticuerpo de la invención pueden usarse para modificar una determinada respuesta biológica, y el agente terapéutico o la porción de fármaco no se construyen de manera limitada a los clásicos agentes químicos terapéuticos. Por ejemplo, la porción un fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que posee una determinada actividad biológica. Estas proteínas incluyen, por ejemplo, una toxina como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudonomas, o toxina de difteria; una proteína como el factor tumoral de necrosis, a-interferón, β-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador plasminógeno de tejidos, un agente apoptótico, p. ej., TNF-alpha, TNF-beta (Ver, Publicación Internacional Nº WO 97/33899), AIM II (Ver, Publicación Internacional Nº WO 97/34911), Ligando Fas (Takahashi et al.. Int. Immunol., 6:1567-1574 (1994)), VEGI (Ver, Publicación Internacional Nº WO 99/23105), un agente trombótico o un agente anti-angiogénico, p. ej., angiostatina o endostatina; o modificadores de respuestas biológicas como, por ejemplo, linfoquinas, interleuquina-1 (“IL-1”), interleuquina-2 (“IL-2”), interleuquina-6 (“IL-6”), factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (“GM-CSF”), factor de estimulación de colonias de granulocitos (“G-CSF”) u otros factores de crecimiento. Los anticuerpos también pueden unirse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos de purificación del antígeno objetivo. Estos soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, cristal, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. Técnicas para conjugar este radical terapéutico con anticuerpos son bien conocidas en la técnica, ver, p. ej., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Anticuerpos Monoclonales y Terapia de Cáncer, Reisfeld et al (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Liberación Controlada de Fármacos (2ª Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Anticuerpos Monoclonales ’84: Aplicaciones Biológicas y Clínicas, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Anticuerpos Monoclonales para Detección de Cáncer y Terapia, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982). Como alternativa, un anticuerpo puede conjugase con un Segundo anticuerpo para formar un anticuerpo heteroconjugado tal y como describe Segal en la Patente de Estados Unidos Nº 4,676,980. Un anticuerpo, con o sin un radical terapéutico conjugado, administrado solo o en combinación de factores citotóxicos y/o citoquinas pueden usarse como elemento terapéutico. Inmunofenotipaje Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para inmunofenotipaje de líneas celulares y muestras biológicas. El producto de traslación del gen de la presente descripción puede ser útil como marcador específico de célula, o más específicamente, como marcador celular que se expresa diferencialmente en varias fases de diferenciación y/o mutación de particulares tipos de células. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra un epítope específicos, o combinación de epítopes, permitirán el análisis de poblaciones celulares que expresan el marcador. Pueden utilizarse varias técnicas que emplean anticuerpos monoclonales para analizar las poblaciones celulares que expresan los marcadores, e incluyen separación magnética que usa gotas magnéticas cubiertas de anticuerpo, “panning” con un anticuerpo unido a una matriz sólida (es decir, una placa), y citometría de flujo (Ver, p. ej., Patente de Estados Unidos Nº 5,985,660; y Morrison et al., Cel, 96:737-49 (1999)). Estas técnicas permiten el análisis de poblaciones particulares de células como las encontradas en tumores malignos hematológicos (es decir, en pacientes con enfermedad mínima residual (MRD) y con leucemia aguda) y células “no propias” en trasplantes para prevenir la Enfermedad Injerto-contra-Huésped (EICH). Como alternativa, estas técnicas permiten el análisis de la raíz hematopoyética y de células progenitoras capaces de sufrir proliferación y/o diferenciación, como las encontradas en sangre en el cordón umbilical humano. Ensayos para Enlaces de Anticuerpo Los anticuerpos de la invención pueden someterse a ensayos para enlace inmunoespecífico mediante métodos conocidos en la técnica. Los inmunoensayos que pueden usarse incluyen, aunque no se limitan a, sistemas competitivos y no competitivos de ensayos que usan técnicas como análisis BIAcore (ver, p. ej., Ejemplo 33), análisis FACS (clasificador de células activadas por fluorescencia), inmunofluorescencia, inmunocitoquímica, Western Blot, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina con difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de complemento-fijación, ensayos inmunoradiométricos, ensayos fluorescentes, inmunoensayos con proteína A, por nombrar algunos. Estos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (ver, p. ej., Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York,). A continuación se describen brevemente inmunoensayos ejemplares (pero no pretenden ser limitativos). Los protocolos de inmunoprecipitación generalmente consisten en lisar una población de células en un búfer lisis como búfer RIPA (1% NP-40 o Tritón X-100, 1% deoxicolato de sodio, 0.1% SDS, 0.15 M NaCl, 0.01 M fosfato sódico en pH 7.2, 1% Trasilol) complementado con fosfatasa de proteína y/o inhibidores de proteasa (p.ej., EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato sódico), añadir el anticuerpo de interés al lisado celular, incubar durante un periodo de tiempo (p. ej., 1-4 horas) a 4ºC, añadir gotas de sefarosa de proteína A y/o proteína G al lisado celular, incubar durante aproximadamente una hora o más a 4ºC, lavar las gotas en búfer de lisis y resuspender las bolas en búfer SDS/muestra. La habilidad del anticuerpo de interés para inmunoprecipitar un antígeno particular puede evaluarse,

p.

ej., mediante análisis western blot. Un experto en la técnica sabrá que los parámetros pueden modificarse para incrementar el enlace con un antígeno y descender el fondo (p.ej., pre-aclarar el lisado celular con gotas de sefarosa). Para más datos en relación con los

protocolos de inmunoprecipitación ver, p. ej., Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.16.1.
Los análisis Western Blot generalmente consisten en preparar muestras de proteína, electroforesis de las muestran de proteína en un gel de poliacrilamida (p. ej., 8% . 20% SDS-PAGE dependiendo del peso molecular del antígeno), transferir la muestra de proteína desde el gel de poliacrilamida a una membrana como nitrocelulosa, PVDF, nylon, bloquear la membrana en la solución de bloqueo (p. ej., PBS con 3% BSA o leche sin grasa), lavar la membrana en búfer de lavado (p. ej., PBS-Tween 20), bloquear la membrana con un anticuerpo secundario (que reconozca el anticuerpo primario, p. ej., un anticuerpo anti-humano) conjugado con un sustrato enzimático (p. ej., peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) o molécula radioactiva
(p. ej., 32P o 125I) diluida en búfer de bloqueo, lavar la membrana en búfer de lavado y detectar la presencia de un antígeno. Un experto en la técnica sabrá que los parámetros pueden modificarse para incrementar la señal detectada y reducir el ruido de fondo. Para más datos en relación con los protocolos de western blot ver, p. ej., Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.8.1.
ELISAs consisten en preparar el antígeno, cubrir el pozo de una placa del microtítulo con 96 pozos con el antígeno, añadir el anticuerpo de interés conjugado con un compuesto detectable como un sustrato enzimático (p. ej., peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) al pozo e incubar durante un periodo de tiempo, y detectar la presencia del antígeno. En ELISA el anticuerpo de interés no tiene por qué conjugarse con un compuesto detectable; en lugar de ello, un segundo anticuerpo (que reconozca el anticuerpo de interés) conjugado con un compuesto detectable puede añadirse al pozo. Además, en lugar de cubrir el pozo con el antígeno, el anticuerpo pude cubrirse al pozo. En este caso, pude añadirse un segundo anticuerpo conjugado con un compuesto detectable tras la adición del antígeno de interés al pozo cubierto. Un experto en la técnica sabrá que los parámetros pueden modificarse para incrementar la señal detectada y también conocerá otras variaciones de ELISA conocidas en la técnica. Para más datos en relación con ELISA ver,
p. ej., Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1.
La afinidad de enlace de un anticuerpo con un antígeno y la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno puede determinarse mediante ensayos de enlace competitivo. Un ejemplo de un ensayo de enlace competitivo es un radioinmunoensayo que consiste en la incubación de antígeno (p. ej., 3H o 125I), o fragmento o variante del mismo, con el anticuerpo de interés en presencia de cantidades crecientes de antígeno no etiquetado, y la detección del anticuerpo unido al antígeno etiquetado. La afinidad del anticuerpo de interés para un antígeno particular y la constante de disociación pueden determinarse a partir de los datos mediante análisis plot de Scatchard. La competición con un segundo anticuerpo también puede determinarse usando radioinmunoensayos. En este caso, el antígeno se incuba con el anticuerpo de interés conjugado con un compuesto etiquetado (p. ej., compuesto etiquetado con 3H o 125I) en presencia de cantidades crecientes de un segundo anticuerpo no etiquetado. Este tipo de ensayo competitivo entre dos anticuerpos también puede usarse para determinar si dos anticuerpos se enlazan con los mismos epítopes o con diferente.
En una realización preferente, se emplea el análisis cinético BIAcore para determinar las constantes de asociación y disociación de anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) con un VEGF-2 o fragmentos de VEGF-2. El análisis cinético BIAcore consiste en analizar en enlace y la disociación de anticuerpos de chips con VEGF-2 inmovilizado sobre su superficie, tal y como se describe con detalle en el Ejemplo 33. Usos Terapéuticos
La presente invención se dirige además a terapias basadas en anticuerpos que incluyen la administración de la invención a un paciente animal, preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente un humano, para tratar una o más de las enfermedades, trastornos o condiciones descritas. Los compuestos terapéuticos de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de la invención (incluyendo fragmentos, análogos y derivados de los mismos tal y como aquí se describen) y ácidos nucleicos que codifican anticuerpos de la invención (incluyendo fragmentos, análogos y derivados de los mismos y anticuerpos anti-idiotípicos tal y como aquí se describe). Los anticuerpos de la invención pueden usarse para tratar, inhibir
o prevenir enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de la invención, incluyendo, pero no limitando a, una o más de las enfermedades, trastornos o condiciones aquí descritas. El tratamiento y/o prevención de enfermedades, trastornos o condiciones asociadas con expresión aberrante y/o actividad de un polipéptido de la descripción incluye, pero no se limita a, aliviar los síntomas asociados con estas enfermedades, trastornos o condiciones. Los anticuerpos de la invención también pueden proporcionarse en composiciones farmacéuticamente aceptables tal y como se conoce en la técnica o como aquí se describe.
Un resumen de los modos en los que los anticuerpos de la presente invención pueden usarse de manera terapéutica incluye el enlace de polinucleótidos o polipéptidos de la presente descripción, localmente o sistemáticamente en el cuerpo o mediante citotoxicidad directa del anticuerpo, por ejemplo, mediado por complementeo (CDC) o por células efectoras (ADCC). Algunas de estas técnicas se describen con detalle a continuación. Con la información aquí provista, un experto en la técnica sabrá cómo usar los anticuerpos de la presente invención para fines de diagnóstico, control o terapia sin demasiada experimentación.
Los anticuerpos de esta invención pueden utilizarse de manera ventajosa en combinación con otros anticuerpos monoclonales
o quiméricos, o con linfoquinas o factores del crecimiento hematopoyéticos (como, por ejemplo, IL-2, IL-3 e IL-7), por ejemplo, que sirven para aumentar el número o la actividad de células efectoras que interactúan con los anticuerpos.
Los anticuerpos de la invención pueden administrarse solos o en combinación con otros tipos de tratamientos (por ejemplo, terapia de radiación, quimioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia, agentes anti-tumor y agentes anti-retrovirales). En una realización muy preferente, los anticuerpos de la invención pueden administrarse solos o en combinación con agentes antiangiogénicos. Generalmente, es preferible la administración de productos de un origen de especie o reactividad de especie (en el caso de anticuerpos) que sea de la misma especie que la del paciente. Por lo tanto, en una realización preferente, los anticuerpos humanos, los derivados de fragmentos, análogos, o ácidos nucleicos, se administran a un paciente humano para terapia o profilaxis.
Es preferible usar una elevada afinidad y/o inhibición y/o neutralización potente in vivo de anticuerpos contra los polipéptidos o polinucleótidos de la presente descripción, fragmentos o regiones de los mismos, para inmunoensayos dirigidos y para terapia de trastornos relacionados con polinucleótidos o polipéptidos, incluyendo fragmentos de los mismos, de la presente descripción. Estos anticuerpos, fragmentos o regiones tendrán preferiblmente afinidad para polinucleótidos o polipéptidos de la descripción, incluyendo fragmentos de los mismos. Las afinidades preferentes de enlace incluyen aquellas con una constante de disociación o Kd inferior a 10-9 M, 5 X 10-10 M, 10-10 M, 5 X 10-11 M, 10-11 M, 5 X 10-12 M, 10-12 M, 5 X 10-13 M, 10-13 M, 5 X 10-14 M, 10-14 M, 5 X 10-15 M o 1015 M. Terapia Genética
En una realización específica, los ácidos nucleicos que comprenden secuencias codificadoras de anticuerpos o derivados funcionales de los mismos, se administran para tratar, inhibir o prevenir una enfermedad o desorden asociado con expresión aberrante y/o actividad de un polipéptido de la invención, por medio de terapia genética. La terapia genética se refiere a la terapia llevada a cabo mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta realización de la invención, los ácidos nucleicos producen su proteína codificada que logra un efecto terapéutico.
Cualquiera de los métodos para terapia genética disponible en la técnica puede usarse de acuerdo con la presente invención. A continuación se describen métodos a modo de ejemplo.
Para publicaciones generales de los métodos de terapia genética, ver Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191217 (1993); May, TJBTECH 11(5): 155-215 (1993). Métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología recombinante con AND que pueden usarse se describen en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).
En un aspecto preferente, el compuesto comprende las secuencias de ácido nucleico codificadoras de un anticuerpo, siendo estas secuencias de ácido nucleico parte de vectores de expresión que expresan el anticuerpo o fragmentos o proteínas quiméricas o cadenas pesadas y ligeras de los mismos en un huésped adecuado. En particular, estas secuencias de ácido nucleico tienen promotores que se unen de manera operativa con el anticuerpo que codifica la región, estando dicho promotor inducible o constitutivo, y, opcionalmente, específico de tejido. En otra realización particular, las moléculas de ácido nucleico se usan y las secuencias que codifican el anticuerpo y otras secuencias deseadas están flanqueadas por regiones que promueven la recombinación homóloga en un lugar deseado en el genoma, proporcionando de este modo una expresión intracromosomal del anticuerpo que codifica los ácidos nucleicos ((Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989). En realizaciones específicas, la molécula de anticuerpo expresada es un anticuerpo de cadena sencilla; como alternativa, las secuencias de ácido nucleico incluyen secuencias que codifican tanto cadenas pesadas como ligeras, o fragmentos de las mismas, del anticuerpo.
El envío de los ácidos nucleicos a un paciente pude ser directo, en cuyo caso el paciente es directamente expuesto al ácido nucleico
o vectores que transportan el ácido nucleico, o indirecto, en cuyo caso primero las células se transforman con los ácidos nucleicos in vitro, y a continuación se trasplantan al paciente. Estas dos técnicas son conocidas, respectivamente, como terapia genética in vivo y ex vivo.
En una realización específica, las secuencias de ácido nucleico se administran directamente in vivo, donde se expresan para producir el producto codificado. Esto puede realizarse mediante una serie de métodos conocidos en la técnica, p. ej., construyéndolas como parte de un vector apropiado de expresión de ácido nucleico y administrándola como se vuelvan intracelulares, p. ej., mediante infección usando retrovirales defectuosos o atenuados u otros vectores virales (ver Patente de Estados Unidos Nº 4,980,286), o mediante inyección directa de ADN desnudo, o usando el bombardeo de micropartículas (p. ej., una pistola de gen; Biolistic, Dupont) o cubriendo con lípidos o receptores superficiales de células o agentes transfectantes, encapsulación en liposomas, micropartículas, o microcápsulas, mediante administración en unión con un péptido que es conocido por entrar al núcleo, mediante administración en unión con un ligando sujeto a la endocitosis mediada por el receptor (ver, p. ej., Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)) (que pueden usarse como tipos de célula objetivo que específicamente expresan los receptores), etc. En otra realización, los complejos ácido nucleico-ligando pueden formarse de tal manera que el ligando esté formado por un péptido viral fusogénico para afectar a los endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosomal. En otra realización, el ácido nucleico puede ser el objetivo in vivo para la respuesta y expresión específica de célula, dirigiéndose a un receptor específico (ver, p. ej., Publicaciones PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO92/20316; WO93/14188, WO 93/20221). Como alternativa, el ácido nucleico pueden introducirse intracelularmente e incorporarse al ADN de la célula huésped para expresión, por medio de recombinación homóloga (Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).
En una realización específica, se usan los vectores virales que contienen secuencias de ácido nucleico codificadoras de un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, pude usarse un vector retroviral (ver Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el correcto empaquetamiento del genoma viral y para la integración en el ADN de la célula huésped. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo que se usan en terapia genética se clonan en uno o más vectores, lo que facilita el envío de gen al paciente. Se pueden encontrar más detalles sobre vectores retrovirales en Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), que describe el uso de un vector retroviral para enviar el gen mdr1 a células madre hematopoyéticas con el fin de hacer que las células madre sean más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia genética son: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); and Grossman y Wilson, Curr. Opin. en Genetics and Devel. 3:110-114 (1993).
Los adenovirus son otros vectores virales que pueden usarse en terapia genética. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para enviar genes al epitelio respiratorio. Los adenovirus infectan de manera natural el epitelio respiratorio donde provocan una enfermedad leve. Otros objetivos para los sistemas de envío basados en adenovirus son el hígado, el sistema central nervioso, células endoteliales y los músculos. Los adenovirus tienen la ventaja que son capaces de infectar células no divisorias. Kozarsky y Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) presentan una publicación sobre terapia genetic basada en adenovirus. Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) demostró el uso de vectores de adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de monos Rhesus. Otros casos del uso de adenovirus en terapia genética pueden encontrarse en Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143- 155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); Publicación PCT WO94/12649; and Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). En una realización preferente, se usan vectores de adenovirus.
También se han propuesto virus asociados con adeno (AAV) para terapia genética (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); Patente de Estados Unidos Nº 5,436,146).
Otra técnica en terapia genetic incluye la transferencia de un gen a células en cultivo de tejidos mediante métodos como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato cálcico
o infección viral. Normalmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Las células se colocan a continuación bajo selección baja aislar aquellas células que han respondido y que expresen el gen transferido. Estas células se envían posteriormente a un paciente.
En esta realización, el ácido nucleico se introduce a una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Esta introducción puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo pero sin limitar a, transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o bacteriófago que contenga las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia de gen mediada por cromosomas, transferencia de gen mediada por microcélulas, fusión de esferoplasto, etc. Se conocen numerosas técnicas para la introducción de genes extranjeros en las células (ver, p. ej., Loeffler and Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29: 69-92m (1985) y pueden usarse de acuerdo con la presente invención, siempre y cuando las funciones necesarias biológicas y de desarrollo de las células recipientes no estén afectadas. La técnica debería proporcionar una transferencia estable de ácido nucleico a la célula, de modo que la célula pueda expresar el ácido nucleico y preferiblemente que sea heredable y expresable por parte de la progenie celular.
Las células resultantes recombinantes pueden enviarse a un paciente por medio de varios métodos conocidos en la técnica. Las células sanguíneas recombinantes (p. ej., células madre hematopoyéticas o células progenitoras) se administran de manera preferente por vía intravenosa. La cantidad de células previstas para uso depende del efecto deseado, estado del paciente, etc., y un experto en la técnica lo puede determinar.
Las células en la que un ácido nucleico puede introducirse para fines de terapia de gen incluyen cualquier tipo de célula deseado y disponible, e incluyen aunque no se limitan a, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas como T-linfocitos, B-linfocitos, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; varias células madres y progenitoras, en particular, células madre o progenitoras hematopoyéticas, p. ej., las obtenidas de la médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc.
En una realización preferente, la célula empleada para terapia genética es autóloga en el paciente.
En una realización en la que se usan células recombinantes en terapia genética, las secuencias de ácido nucleico codificadoras de un anticuerpo se introducen en las células de tal modo que las células o su progenie las puedan expresar, y a continuación, las células recombinantes se administran in vivo para conseguir efecto terapéutico. En una realización específica, se usan células madre o progenitoras. Cualquier célula madre o progenitoras que puede aislarse y mantenerse in vitro puede potencialmente usarse de acuerdo con esta realización de la presente invención (ver, p. ej., Publicación PCT WO 94/08598; Stemple and Anderson, Cell 71: 973-985 (1992); Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A:229 (1980); y Pittelkow y Scott, Mayo Clinic Proc. 61:771 (1986)).
En una realización específica, el ácido nucleico que se introduce con fines de terapia genética comprende un promotor inducible unido operativamente a la región codificadora, de tal modo que la expresión del ácido nucleico es controlable a través del control de la presencia o ausencia del inductor apropiado de trascripción. Demostración de Actividad Terapéutica o Profiláctica.
Los compuestos de composiciones farmacéuticas de la invención se testan preferiblemente in vitro, y posteriormente in vivo para conseguir la deseada actividad terapéutica o profiláctica, antes de su uso en humanos. Por ejemplo, los ensayos in vitro que demuestran la utilidad terapéutica o profiláctica de un compuesto o la composición farmacéutica incluyen el efecto de un compuesto sobre una línea celular o una muestra de tejido del paciente. El efecto del compuesto o composición sobre la línea celular y/o muestra de tejido puede determinarse usando técnicas conocidas por aquellos expertos en el campo incluyendo, pero sin limitar a, ensayos con formación de rosetones y ensayos con lisis celular. De acuerdo con la invención, los ensayos in vitro que pueden usarse para determinar si la administración de un compuesto específica es indicada, incluyen ensayos de cultivo celular in vitro en el que una muestra de tejido de un paciente crece en cultivo, y se expone o se administra un compuesto, y se observa el efecto de tal compuesto sobre la muestra del tejido. Administración y Composición Terapéutica/Profiláctica
La invención proporciona métodos de tratamiento, inhibición y profilaxis mediante la administración a un sujeto de una cantidad efectiva de un compuesto o composición farmacéutica de la invención, preferiblemente un anticuerpo de la invención. En un aspecto preferente, el compuesto se purifica sustancialmente (p. ej., sustancialmente se libera de las sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios no deseados). El sujeto es preferiblemente un animal, incluyendo pero sin limitar a, vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, etc., y preferiblemente es un mamífero, y más preferiblemente humano.
Las formulaciones y los métodos de administración que pueden emplearse cuando el compuesto consiste en un ácido nucleico o inmunoglobulina se han descrito con anterioridad; pueden seleccionarse otras formulaciones y rutas de administración apropiadas de las descritas a continuación.
Se conocen varios sistemas de envío y pueden usarse para administrar un compuesto de la invención, p. ej., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por el receptor (ver, p. ej., Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro vector, etc. Métodos de introducción incluyen pero no se limitan a, vía intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, y otras vías. Los compuestos o composiciones pueden administrarse a través de cualquier ruta conveniente, por ejemplo mediante infusión o inyección de bolos, mediante absorción por parte de las paredes epiteliales o mucocutáneas (p. ej., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal,etc) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser conveniente introducir los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema central nervioso por medio de cualquier ruta o vía adecuada, incluyendo inyección intraventricular e intratecal; la inyección intravenosa puede facilitarse con un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a una reserva, como un depósito de Ommaya. También puede emplearse la administración pulmonar, p. ej., mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y una formulación con un agente aerosol.
En una realización específica, puede desearse administrar los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención localmente al área que necesita el tratamiento; esto puede conseguirse, por ejemplo, sin pretensión de limitar, mediante infusión local durante la operación, aplicación tópica, p. ej., junto con un apósito tras la operación, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de un implante, siendo dicho implante un material poroso, no poroso o gelatinoso, entre los que se incluyen membranas, como membranas e material silástico, o fibras. Preferiblemente, cuando se administra una proteína, incluyendo un anticuerpo de la invención, hay que tener cuidado de usar materiales que no absorban la proteína.
En otra realización, el compuesto o composiciones pueden enviarse en una vesícula, en particular un liposoma (ver Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; ver generalmente ibíd.)
En otra realización, el compuesto o composición puede enviarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (ver Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos (ver Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger y Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); ver también Levy et al., Science 228: 190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J.Neurosurg. 71:105 (1989)). En otra realización, un sistema de liberación controlada puede colocarse en proximidad al objetivo terapéutico, es decir, el cerebro, requiriendo de este modo una fracción de la dosis sistémica (ver, p. ej., Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
Otros sistemas de liberación controlada se describen en la publicación por Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).
En una realización específica en la que el compuesto de la invención es un ácido nucleico codificador de una proteína, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para estimular la expresión de su proteína codificada, construyéndola como parte de un apropiado vector de expresión de ácido nucleico y administrándola de modo que se convierta en intracelular, p. ej., mediante el uso de un vector retroviral (ver Patente de Estados Unidos Nº 4,980,286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (p. ej., una pistola de gen; Biolistic, Dupont), o cubriendo con lípidos receptores de superficie celular o agentes transfectantes, o administrando en un enlace con un péptido del tipo homeobox que es conocido por entra al núcleo (ver, p. ej., Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868 (1991)), etc. Como alternativa, un ácido nucleico puede introducirse intracelularmente o incorporarse al ADN de la célula huésped para expresión, mediante recombinación homóloga.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas. Estas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto, y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, el término “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por la Agencia Reguladora del Gobierno Federal o Estatal o presente en la lista de Farmacopea de Estados Unidos u otras farmacopeas reconocidas a nivel general para uso en animales, y más en particular humanos. El término “portador” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el elemento terapéutico. Estos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, entre los que se incluyen aquellos de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferente cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones de salina y soluciones de dextrosa acuosa y glicerol también pueden emplearse como portadores líquidos, en particular para soluciones inyectables. Excipientes farmacéuticamente adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, caliza, gel de sílice, estearato sódico, monoestarato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectanes o emulsionantes, o agentes de búfer con pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, pastillas, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores estándares como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en “Remington’s Pharmaceutical Sciences” por E. W. Martin. Estas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectica del compuesto, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para que dé la forma de la adecuada administración al paciente. La formulación debería adecuarse al modo de administración.
En una realización preferente, la composición se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios como composición farmacéutica adaptada a la administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en búfer acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición puede incluir un agentes solubilizante y un anestésico local como lignocaína para disminuir el dolor en la zona de la inyección. Generalmente, los ingredientes se administran por separado o junto en forma de unidad de dosis, por ejemplo, como polvo seco liofilizado o concentrado libre de agua en un envase herméticamente sellado como una ampolla o un sobre que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, puede prepararse con una botella de infusión que contenga agua o salina de grado farmacéutico estéril. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o salina de modo que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración.
Los compuestos de la invención pueden formularse como formas neutrales o saladas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones como aquellas derivadas de ácidos hidroclóricos, fosfóricos, acéticos, oxálicos, tartáricos, etc., y aquellas derivadas con cationes como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
La cantidad del compuesto de la invención que será efectiva en el tratamiento, inhibición y prevención de una enfermedad o trastorno asociado con expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de la invención puede determinarse usando técnicas clínicas estándares. Además, los ensayos in vitro pueden opcionalmente emplearse para ayudar a identificar rangos óptimos de posología. La dosis precisa que se empleará en la formulación también dependerá de la vía de administración, y la gravedad de la enfermedad o trastorno, y debería decidirse de acuerdo con el juicio del doctor y las circunstancias del paciente. Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de pruebas in vitro y con modelos de animales.
Para los anticuerpos, la dosis administrada al paciente es normamente 0.1 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosis administrada al paciente es entre 0.1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, más preferiblemente de 1 mg/kg a 10 mg/kg del peso corporal del paciente. Generalmente, los anticuerpos humanos tienen una vida media más larga en el interior del cuerpo humano que otros anticuerpos de otras especies debido a la respuesta inmune hacia los polipéptidos extranjeros. Por lo tanto, a menudo es posible administrar dosis más bajas de anticuerpos humanos y reducir la frecuencia de administración. Además, la dosis y frecuencia de administración de anticuerpos de la invención puede reducirse al aumentar la respuesta y la penetración en el tejido (p. ej., en el cerebro) de los anticuerpos a través de modificaciones como, por ejemplo, lipidación).
La invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico que contiene uno o más envases llenos con uno o más ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente asociada con dichos envases puede haber una nota en forma de prescripción realizada por la agencia gubernamental reguladora de la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos
o biológicos que refleje la aprobación por parte de la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana.
Diagnóstico y Representación Óptica
Los anticuerpos etiquetados, y derivados y análogos de los mismos, que específicamente se enlazan con un polipéptido de interés pueden usarse para fines de diagnóstico con el fin de detectar, diagnosticar o controlar enfermedades, desórdenes, y/o condiciones asociadas con la expresión y/o actividad aberrante de un polipéptido de la descripción. La invención ofrece la detección de expresión aberrante de un polipéptido de interés, que consiste en
(a) someter a ensayos la expresión del polipéptido de interés en células o fluidos corporales del individuo usando uno o más anticuerpos específicos del polipéptido de interés y (b) comparar el nivel de expresión genética con un nivel estándar de expresión genética, y de este modo un aumento o descenso en el nivel de expresión genética del polipéptido sometido a ensayo en comparación con el nivel estándar de expresión es indicativo de expresión aberrante.
La invención proporciona un ensayo de diagnóstico para diagnosticar un trastorno, que consiste en (a) someter a ensayos la expresión del polipéptido de interés en células o fluidos corporales del individuo usando uno o más anticuerpos específicos del polipéptido de interés y (b) comparar el nivel de expresión genética con un nivel estándar de expresión genética y de este modo un aumento o descenso en el nivel de expresión genética del polipéptido sometido a ensayo en comparación con el nivel estándar de expresión es indicativo de un particular desorden. Con respecto al cáncer, la presencia de una cantidad relativamente elevada de transcripción en tejido biopsiado de un individuo puede indicar una predisposición hacia el desarrollo de la enfermedad, o puede facilitar
medios para detectar la enfermedad antes de que aparezcan los síntomas clínicos reales. Un diagnóstico más definitivo de este tipo puede permitir a los profesionales de la sanidad emplear medidas preventivas o tratamiento agresivo antes evitando de este modo el desarrollo o la posterior progresión del cáncer.
Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse para ensayar niveles de proteína en una muestra biológica usando métodos clásico inmunohistológicos conocidos por aquellos expertos en la técnica (p. ej., ver Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión genética proteica incluyen imunoensayos, como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). En la técnica se conocen etiquetas adecuadas para ensayos con anticuerpos, como, oxidasa de glucosa; radioisótopos, como iodina (125I, 121I), carbono (14C), sulfuro (35S), tritio (3H), indio (112In), y tecnecio (99Tc); etiquetas luminiscentes, como luminol; y etiquetas fluorescentes, como fluoresceína y rodamina, y bioteina.
Un aspecto de la invención es la detección y diagnóstico de una enfermedad o trastorno asociado a una expresión aberrante de un polipéptido de interés en un animal, preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente un humano. En una realización, el diagnóstico comprende: a) administrar (por ejemplo, parenteralmente, subcutáneamente o intraperitonealmente) a un sujeto una cantidad efectiva de una molécula etiquetada que específicamente se enlaza con el polipéptido de interés; b) esperar durante un intervalo de tiempo tras la administración para permitir que la molécula etiquetada se concentre preferentemente en punto en el sujeto donde se expresa el polipéptido (y para que las molécula etiquetada no ligada se despeje del nivel del fondo); c) determinar el nivel de fondo; y d) detectar la molécula etiquetada en el sujeto, de modo que la detección de la molécula etiquetada por encima del nivel de fondo indica que el sujeto tiene una enfermedad o desorden particular asociado con la expresión aberrante del polipéptido de interés. El nivel de fondo puede determinarse a través de varios métodos que incluyen la comparación de cantidad de molécula etiquetada detectada con un valor estándar previamente determinado parao un sistema particular.
En la técnica se entenderá que el tamaño del sujeto y el sistema de representación óptica determinarán la cantidad de partículas de representación óptica necesarias para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de partículas de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada normalmente oscilará en el rango desde aproximadamente 5 a 20 milicuries de 99mTc. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo etiquetado se acumulará preferentemente en la localización de células que contienen la proteína específica. La representación óptica de tumores in vivo se describe en S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).
Dependiendo de varias variables, incluyendo el tipo de etiqueta usada y el modo de administración, el intervalo de tiempo tras la administración para permitir que la molécula etiquetada se concentre preferentemente en punto en el sujeto donde se expresa el polipéptido y para que las molécula etiquetada no ligada se despeje del nivel del fondo es de 6 a 48 horas o 6 a 24 horas o 6 a 12 horas. En otra realización, el intervalo de tiempo tras la administración es de 5 a 20 días o de 5 a 10 días.
En una realización, el control de la enfermedad o trastorno se lleva a cabo repitiendo el método para diagnosticar la enfermedad, por ejemplo, un mes después del diagnóstico inicial, seis meses después del diagnóstico inicial, un año después del diagnóstico inicial, etc.
La presencia de la molécula etiquetada puede detectarse en el paciente usando métodos conocidos en la técnica de escaneo in vivo. Estos métodos dependen del tipo de etiqueta utilizada. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar el método apropiado para detectar una etiqueta particular. Métodos y dispositivos que pueden usarse en los métodos de diagnóstico de la invención incluyen, aunque no se limitan a, tomografía computarizada (CT), escaneo del cuerpo completo como la tomografía por emisión de positrones (PET), imagen por resonancia magnética (MRI) y sonografía.
En una realización específica, la molécula es etiquetada con un radioisótopo y se detecta en el paciente usando un instrumento quirúrgico sensible a la radiación. (Thurston et al., Patente de Estados Unidos Nº 5,441,050). En otra realización, la molécula se etiqueta con un compuesto fluorescente y se detecta en el paciente usando un instrumento de escaneo sensible a la fluorescencia. En otra realización, la molécula se etiqueta con un positrón que emite metal y se detecta en el paciente usando tomografía con emisión de positrón. En otra realización, la molécula se etiqueta con una etiqueta paramagnética y se detecta en un paciente usando imagen de resonancia magnética (MRI). Kits
La presente invención proporciona kits que pueden usarse en los métodos mencionados. En una realización, un kit consiste en un anticuerpo de la invención, preferiblemente un anticuerpo purificado, en uno o más envases. En una realización específica, los kits de la presente invención contienen un polipéptido sustancialmente aislado que consiste en un epítope que es específicamente inmunoreactivo con un anticuerpo incluido en el kit. Preferiblemente, los kits de la presente invención incluyen además un anticuerpo de control que no reacciona con el polipéptido de interés. En otra realización específica, los kits de la presente invención contienen un medio para detectar el enlace de un anticuerpo con un polipéptido de interés (p. ej., el anticuerpo puede conjugarse con un sustrato detectable como un compuesto fluorescente, o un segundo anticuerpo que reconozca el primer anticuerpo puede conjugarse con un sustrato detectable).
En otra realización específica de la presente invención, el kit es un kit de diagnóstico para uso en el análisis de suero que contiene anticuerpos específicos contra polinucleótidos y polipéptidos proliferativos y/o cancerosos. Este kit puede incluir un anticuerpo de control que no reacciona con el polipéptido de interés. Este kit puede incluir un antígeno de polipéptido sustancialmente aislado que comprende un epítope que específicamente es inmunoreactivo con al menos un anticuerpo de antígeno anti-polipéptido. Además, este kit incluye medios para detectar el enlace de dicho anticuerpo con el antígeno (p. ej., el anticuerpo puede conjugarse con un compuesto fluorescente como fluoresceína o rodamina que pueden detectarse mediante citometría de flujo). En realizaciones específicas, el kit puede incluir un antígeno de polipéptido recombinantemente producido o químicamente sintetizado. El antígeno de polipéptido del kit puede estar unido a un soporte sólido.
En una realización más específica, los medios de detección del kit anteriormente mencionado incluyen un soporte sólido al que se une dicho antígeno de polipéptido. Este kit puede también incluir un anticuerpo no unido con la etiqueta de reportero y anti-humano. En esta realización, el enlace del anticuerpo con el antígeno del polipéptido puede detectarse a través del enlace de dicho anticuerpo con etiqueta de reportero.
En una realización adicional, la invención incluye un kit de diagnóstico para uso en el análisis de suero que contiene antígenos del polipéptido de la descripción. El kit de diagnóstico incluye un anticuerpo sustancialmente aislado y específicamente radioactivo con los antígenos de polipéptido o polinucleótido, y medios para detectar el enlace del antígeno de polipéptido o polinucleótido con el anticuerpo. En una realización, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. Los medios detectores del kit pueden incluir un segundo anticuerpo monoclonal etiquetado. Como alternativa, o además, los medios detectores pueden incluir un antígeno competente etiquetado.
En una configuración de diagnóstico, el suero del test reacciona con un reagente en fase sólida que tiene un antígeno unido a la superficie y que se obtiene con métodos de la presente invención. Tras el enlace con el específico anticuerpo de antígeno con el reagente y tras retirar lavando los componentes de suero lo ligados, el reagente reactúa con el anticuerpo anti-humano con etiqueta de reportero para enlazar el reportero con el reagente en proporción a la cantidad de anticuerpo anti-antígeno unido al soporte sólido. El reagente se vuelve a lavar para retirar el anticuerpo etiquetado no unido, y se determina la cantidad de reportero asociado al reagente. Normalmente, el reportero es una enzima que se detecta incubando la fase sólida en presencia de un adecuado sustrato fluorométrico, luminiscente o colorimétrico (Sigma, St. Louis, MO).
El reagente con superficie sólida del ensayo anterior se prepara utilizando técnicas para unir material proteico a material de soporte sólido, como gotas poliméricas, tiras reactivas, placa con 96 pozos o material con filtro. Estos métodos de unión generalmente incluyen adsorción no específica de la proteína al soporte o unión covalente de la proteína, normalmente a través de un grupo libre de amina, a un grupo químicamente reactivo sobre el soporte sólido, como un grupo activado de carboxil, hidroxil o aldehído. Como alternativa, pueden usarse placas cubiertas con estreptavidina junto con antígenos biotinilados.
Por lo tanto, la invención ofrece un sistema de ensayo o kit para realizar este método de diagnóstico. El kit generalmente incluye un soporte con antígenos recombinantes unidos a la superficie y un anticuerpo anti-humano con la etiqueta de reportero para detectar anticuerpo anti-antígeno unido a la superficie.
Además, los anticuerpos pueden usarse en un inmunoensayos para detectar la presencia de tumores en ciertos individuos. El inmunoensayo enzimático puede realizarse a partir de la muestra sanguínea de un individuo. Niveles elevados de VEGF-2 se consideran diagnóstico de cáncer.
Además, únicamente como referencia, también pueden producirse versiones truncadas de VEGF-2 que sean capaces de interactuar con el VEGF-2 de tipo salvaje para formar dímeros que fallen al activar el crecimiento de célula endotelial, inactivando de este modo el VEGF-2 endógeno. O, formas mutantes de VEGF-2 forman dímeros y ocupan el dominio que se enlaza con el ligando de los receptores apropiados de tirosina quinasa sobre la superficie celular objetivo, pero fallan al activar el crecimiento celular.
Como alternativa, pueden emplearse antagonistas a los polipéptidos de la presente descripción que se enlazan con los receptores con los que normalmente se enlaza un polipéptido de la presente descripción. Los antagonistas pueden ser proteínas muy relacionadas de modo que reconozcan y se enlacen con los puntos receptores de la proteína natural. Sin embargo, son formas inactivas de la proteína natural y por ello evitan la acción de VEGF-2 debido a que los puntos del receptor están ocupados. En estos casos, la acción de VEGF-2 se evita y los antagonistas/inhibidores pueden usarse terapéuticamente como fármaco anti-tumor ocupando los puntos del receptor de los tumores que VEGF-2 reconoce o inactivando el propio VEGF-2. Los antagonistas/inhibidores también pueden usarse para evitar inflamación debido a la elevada acción de permeabilidad vascular de VEGF-2. Los antagonistas/inhibidores también pueden usarse para tratar crecimiento de tumores sólidos, retinopatía diabética, psoriasis y artritis reumatoide.
Los antagonistas/inhibidores también pueden emplearse en una composición con un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, los descritos con anterioridad.
La presente invención y descripción, solamente a modo de referencia, se describirá con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, se entenderá que la presente invención no está limitada a estos ejemplos. Todas las partes o cantidades, a menos que se especifique lo contrario, son por peso.
Con el fin de facilitar la comprensión de los siguientes ejemplos, se describirán ciertos métodos y/o términos que se dan de manera frecuente.
“Plásmidos” se designan con minúsculas y va precedido y/o seguido de mayúsculas y/o números. Los plásmidos de inicio aquí se encuentran disponibles en el mercado, públicamente disponibles
o sobre una base no restringida, o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con los procedimientos publicados. Además, plásmidos equivalentes a los descritos son conocidos en la técnica y resultarán evidentes para un experto en la técnica.
“Digestión” de ADN se refiere a una división catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa solamente en ciertas secuencias en el ADN. Las diferentes enzimas de restricción aquí usadas están disponibles en el mercado y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos se usaron de acuerdo con los conocimientos de los expertos en la técnica. Para fines analíticos, normalmente se usa 1 mg de plásmido o fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 Fl de solución de búfer. Con el fin de aislar los fragmentos de ADN para la construcción del plásmido, normalmente de 5 a 50 mg de ADN se digieren con 20 a 250 unidades de enzima en un mayor volumen.
El fabricante especifica búferes y cantidades apropiadas de sustrato para las particulares enzimas de restricción. Generalmente, se usan tiempos de incubación de incubación de aproximadamente 1 hora a 37EC, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Tras la digestión, la reacción directamente se somete a electroforesis sobre un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.
La preparación del tamaño de los fragmentos divididos se lleva acabo usando un gel de poliacrilamida 8% descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980).
“Oligonucleótidos” hacen referencia a un único polideoxinucleótido de cadena sencilla o dos cadenas complementarias de polideoxinucleótido, que pueden estar químicamente sintetizadas. Estos oligonucleótidos sintéticos no tienen 5’ fosfato y por lo tanto no se ligarán con otro oligonucleótido sin añadir un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no se ha defosforilarse.
“Ligación” se refiere al proceso de formar enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico de doble cadena (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), p. 146). A menos que se indique lo contrario, la ligación se lleva a cabo usando búferes y condiciones conocidas con 10 unidades de ligasa T4 ADN (“ligasa”) por 0.5 mg de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN a los que se liga.
A menos que se establezca lo contrario, la transformación se llevó a cabo tal y como se describe en el método de Graham, F. y Van der Eb, A. Virology 52:456-457 (1973). Ejemplos Ejemplo 1 Patrón de Expresión de VEGF-2 en Tejidos Humanos y Líneas Celulares de Cáncer de Pecho
Se llevó a cabo un análisis Northern blot para examinar los niveles de expresión de VEGF-2 en tejidos humanos y en líneas celulares de cáncer de pecho en tejidos humanos. El total de muestras de ARN celular se aisló con el sistema RNAzol™B (Biotecs Laboratories, Inc.). Aproximadamente 10 mg del total de ARN aislado de cada tejido de pecho y línea celular especificados se separaron en gel 1% agarosa y se secó sobre un filtro de nylon, (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). La reacción de etiquetaje se hico de acuerdo con el kit Stratagene Prime-It con 50 ng de fragmento de ADN. El ADN etiquetado se purificó con una columna Select-G-50 de 5 Prime ÷ 3 Prime, Inc (Boulder, CO). A continuación, el filtro se hibridizó con un gen VEGF2 de longitud completa y con etiqueta radioactiva a 1.000.000 cpm/ml en 0.5 M NaPO4 y 7% SDS durante la noche a 65ºC. Tras un doble lavado a temperatura ambiente y un doble lavado a 60ºC con 0,5 X SSC, 0.1% SDS, los filtros se expusieron a continuación a -70ºC durante la noche con una pantalla intensificadora. Se observó un mensaje de 1.6 Kd en 2 líneas celulares del cáncer de pecho. La Figura 15, ruta #4 representa una línea celular muy tumorigénica que es independiente de estrógeno para crecimiento.
También, se separaron 10 mg del ARN total de 10 tejidos de adulto humano sobre un gel de agarosa y se secaron sobre un filtro de nylon. A continuación, el filtro se hibridizó con una sonda VEGF-2
con etiqueta radioactiva en 7% SDS, 0.5 M NaPO4, pH 7.2; 1% BSA durante la noche a 65ºC. Tras el lavado en 0.2 X SSC a 65ºC, el filtro se expuso a una capa durante 24 días a -70ºC con pantalla intensificadora. Ver Figura 6.
Ejemplo 2 Expresión de la Forma Truncada de VEGF-2 (SEQ ID NO:4) mediante Trascripción y Traslación in vitro
El cADN VEGF-2 se trascribió y trasladó in vitro para determinar el tamaño del polipéptido trasladable codificado por la forma truncada de VEGF-2 y el cADN VEGF-2 parcial. Las dos inserciones de VEGF-2 en el vector pBluescript SK se amplificaron con PCR con tres pares de cebadores, 1) cebadores inversos y delanteros M13; 2) cebador inverso M13 y cebador F4 VEGF; y 3) cebador inverso M13 y cebador F5 VEGF. La secuencia de estos cebadores es la siguiente.
Cebador inverso M13-2: 5’-ATGCTTCCGGCTCGTATG-3’ (SEQ ID NO:9). Esta secuencia se localiza en dirección ascendente en el extremo 5’ del inserto VEGF-2 cADN en el vector pBluescript y tiene una orientación anti-sentido como el cADN. Una secuencia promotora T3 se encuentra entre este cebador y el cADN VEGF-2.
Cebador delantero M13-2: 5’GGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’ (SEQ ID NO:10). Esta secuencia se localiza en dirección descendente en el extremo 3’ del inserto VEGF-2 cADN en el vector pBluescript y tiene una orientación anti-sentido como el inserto cADN.
Cebador F4 VEGF: 5’-CCACATGGTTCAGGAAAGACA-3’ (SEQ ID NO:11). Esta secuencia está localizada dentro de cADN VEGF-2 en una orientación anti-sentido desde bp 1259-1239, que es aproximadamente 169 bp desde el extremo 3’ del codón de parada y aproximadamente 266 antes del último nulceótido del cADN.
La reacción PCR con los tres pares de cebadores produce productos amplificados con la secuencia promotora T3 en frente del inserto cADN. Los primeros y segundos pares de cebadores producen productos PCR que codifican el polipéptido de VEGF-2 mostrado en la SEQ ID NO:4. El segundo par de cebadores produce un producto PCR que pierde 36 aminoácidos que codifican la secuencia en la terminal C del polipéptido VEGF-2.
Aproximadamente se usaron 5 mg de producto PCR del primer par de cebadores, 1 mg del segundo par de cebadores, 1 mg del tercer par de cebadores para trascripción/traslación in vitro. La reacción de trascripción/traslación in vitro se realizó en un 25 Fl de volumen, usando los sistemas “TNTJ Coupled Reticulocyte Lysate” (Promega CAT# L4950). De manera específica, la reacción contiene
12.5 de lisado de reticulocito de conejo TNT 2Fl de búfer de reacción TNT, 1 Fl de polimerasa T3, 1Fl de 1 mM mezcla de aminoácido (menos metionina), 4 Fl de 35S-metionina (>1000 Ci/mmol, 10 mCi/ml), 1 Fl de 40 U/μl; inhibidor Rnasina ribonucleasa, 0.5 o 1 mg de productos PCR. Se añadió H2O libre de nucleasa para llegar al volumen de 25 Fl. La reacción se incubó a 30ºC durante 2 horas. Cinco microlitros del producto de la reaccíon se analizaron sobre un gel SDS-PAGE con gradiente 4-20%. Tras la fijación en 25% isopropanol y 10% ácido acético, el gel se secó y se expuso a una capa de rayos X a 70ºC.
Tal y como se muestra en la Figura 7, los productos PCR que contienen cADN de VEGF-2 truncado (es decir, tal y como se muestra en SEQ ID NO:3) y el cADN que pierde 266 bp en la región 3’ no trasladada (3’-UTR) produjeron la misma longitud e productos trasladados, cuyos pesos moleculares se estimaron entre 39 y 40 dk (rutas 1 y 3). El ADN que perdió todos los 3’UTR y la secuencia codificadora de los 36 aminoácidos en la terminal C se trasladó al poipéptido con un peso molecular estimado de 36-38 kd (ruta 2). Ejemplo 8 Expresión de mARN VEGF-2 en Tejidos Humanos Fetales y Adultos Diseño Experimental
Se llevó a cabo un análisis Northern blot para examinar los niveles de expresión de mARN VEGF-2 en tejidos humanos fetales y adultos. Una sonda cADn que contenía la secuencia completa nucleótida de la proteína VEGF-2 se etiquetó con 32P usando el sistema de etiquetaje “rediprimeo DNA” (Amersham Life Science), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras el etiquetaje, la sonda se purificó usando una columna CHROMA SPIN-100* (Clontech Laboratories, Inc.), de acuerdo con el número PT1200-1 del protocolo del fabricante. La sonda etiquetada purificad se usó a continuación para examinar varios tejidos humanos para mARN VEGF-2.
Se obtuvo un Northern Blot con Tejidos Múltiples (MTN) que contenía vario tejidos humanos (Riñón Fetal, Pulmón Fetal, Hígado Fetal, Cerebro, Pulmón, Hígado, Bazo, Timo, Médula Ósea, Testítculos, Placenta, y Músculo Óseo) de Clontech. El blot MTN se examinó con la sonda etiquetada usando solución de hibridización ExpressHyb* (Clontech) de acuerdo con el número PT1190-1 del protocolo del fabricante. Tras la hibridización y el lavado, el blot se expuso a una capa a -70ºC durante la noche con una pantalla intensificadora y se desarrolló de acuerdo con los procedimientos estándares. Resultados
La expresión de mARN VEGF-2 es abundante en músculos lisos vasculares y varios tejidos muy vascularizados. VEGF-2 se expresa en niveles significativamente altos en tejidos asociados con actividades hematopoyéticas o angiogénicas, es decir, tejido del riñón fetal, pulmón fetal, médula ósea, placenta y pulmón. El nivel de expresión de VEGF-2 es bajo en riñón adulto, hígado fetal, hígado de adulto y testículos; y casi no se detecta en cerebro fetal, y en cerebro de adulto (Ver Figuras 14A-B).
En células primarias cultivadas, la expresión de mARN VEGF-2 es abundante en células de la musculatura lisa vascular y céulas de fibroblasto dérmico, pero es mucho más inferior en células endoteliales de vena umbilical humana (ver Figura 15). Este patrón de distribución de mARN es muy similar al de VEGF. Ejemplo 9 Construcción de mutantes de eliminación de terminal amino y terminal carboxi
Con el fin de identificar y analizar biológicamente polipéptidos activos de VEGF-2, se construyó un panel de mutantes de eliminación de VEGF-2 usando el vector de expresión pHE4a.
1. Construcción de VEGF-2 T103-L215 en pHE4
Para permitir la Reacción en Cadena de la Polimerasa dirigida a la amplificación y la sub-clonación de VEGF-2 T103-L215 (aminoácidos 103 a 215 en la Figura 1 o SEQ ID NO:18) en el vector de expresión de la proteína E. coli, pHE4, los cebadores oligonucleótidos complementarios a la región deseada de VEGF-2 se sintetizaron con la siguiente secuencia base:
Cebador 5’ (Nde I/START y 18 nt de secuencia codificadora): 5’-GCA GCA CAT ATG ACA GAA GAG ACT ATA AAA-3’ (SEQ ID NO:19); 3’ Primer (Asp718, STOP, y 15 nt de secuencia codificadora): 5’GCA GCA GGT ACC TCA CAG TTT AGA CAT GCA-3’ (SEQ ID NO: 20).
El cebador 5’ arriba descrito (SEQ ID NO:19) incorpora un punto de restricción Ndel y el cebador 3’ arriba descrito (SEQ ID NO:20) incorpora un punto de restricción Asp718. El cebador 5’ (SEQ ID NO:19) también contiene una secuencia ATG adyacente y en marco con la región codificadora de VEGF-2 que permite la traslación del fragmento clonado a E. coli, mientras que el cebador 3’ (SEQ ID NO:20) contiene un codón de parada (preferentemente utilizado en E. coli) adyacente y en marco con la región codificadora de VEGF-2 que asegura la correcta terminación traslacional de E. coli.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa se llevó a cabo usando condiciones estándares bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y la secuencia nucleótida para el VEGF-2 maduro (aa 24-419 en SEQ ID NO.18), por ejemplo, se construyó en el Ejemplo 3 como plantilla.
El amplicón resultante se digirió con restricción con NdeI y Asp718 y se sublconó en el vector de expresión pHE4a digerido con NdeI/Asp718.
2. Construcción de VEGF-2 T103-R227 en pHE4
Para permitir la Reacción en Cadena de la Polimerasa dirigida a la amplificación y la sub-clonación de VEGF-2 T103-R227 (aminoácidos 103 a 227 en la Figura 1 o SEQ ID NO:18) en el vector de expresión de la proteína E. coli, pHE4, los cebadores oligonucleótidos complementarios a la región deseada de VEGF-2 se sintetizaron con la siguiente secuencia base:
Cebador 5’ (Nde I/START y 18 nt de secuencia codificadora): 5’-GCA GCA CAT ATG ACA GAA GAG ACT ATA AAA-3’ (SEQ ID NO:19);
Cebador 3’ (Asp 718, STOP, y 15 nt de secuencia codificadora): 5’-GCA GCA GGT ACC TCA ACG TCT AAT AAT GGA-3’ (SEQ ID NO:21).
En el caso de los cebadores arriba descritos, se incorporó un punto de restricción Ndel o Asp718 en el cebador 5’ y 3’, respectivamente. El cebador 5’ (SEQ ID NO:19) también contiene una secuencia ATG adyacente y en marco con la región codificadora de VEGF-2 que permite la traslación del fragmento clonado a E. coli, mientras que el cebador 3’ (SEQ ID NO:21) contiene un codón de parada (preferentemente utilizado en E. coli) adyacente y en marco con la región codificadora de VEGF-2 que asegura la correcta terminación traslacional de E. coli.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa se llevó a cabo usando condiciones estándares bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y la secuencia nucleótida para el VEGF-2 maduro (aa 24-419 en SEQ ID NO.18), por ejemplo, se construyó en el Ejemplo 3 como plantilla. El amplicón resultante se digirió con restricción con NdeI y Asp718 y se sublconó en el vector de expresión de proteína pHE4a digerido con NdeI/Asp718.
3. Construcción de VEGF-2 T103-L215 en pA2GP
En este ejemplo ilustrativo, el vector lanzadera de plásmido pA2 GP se usa para insertar el ADN clonado codificador de la proteína VEGF-2 eliminada en la terminal N y terminal C (amionoácidos 0.3-215 en la Figura 1 o SEQ ID NO:18) en un baculovirus para expresar la proteína VEGF-2 eliminada en la terminal N y terminal C, usando un líder baculovirus y métodos estándares como los descritos en Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures. Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987). Este vector de expresión contiene el fuerte promotor de poliedrina del virus de poliedrosis nuclear Autographa californica (AcMNPV) seguido por el péptido de señal secretora (líder) de la proteína gp67 del baculovirus y convenientes puntos de restricción como BamHI, Xba I y Asp718. El punto de poliadenilación del virus simiesco 40 (“SV40) se usa para una poliadenilación eficiente. Para una sencilla selección de virus recombinantes, el plásmido contiene el gen beta-galactosidasa de E. coli bajo control de un débil promotor Drosophila en la misma orientación, al que le sigue la señal de poliadenilación del gen de poliedrina. Los genes insertados están flanqueados en ambos costados por secuencias virales para la recombinación homóloga mediada por células con ADN viral de tipo salvaje para generar un virus viable que exprese el polinucleótido clonado.
Pueden usarse muchos otros vectores de baculovirus en lugar del vector mencionado, como pAc373, pVL941 y pAcIM1, como apreciarán los expertos en la técnica, siempre y cuando la construcción proporcione señales adecuadamente localizadas para la transcripción, traslación, secreción y procesos similares, incluyendo el péptido señalizador y AUG estructural si se requiere. Estos vectores se describen, por ejemplo, en Luckow et al., Virology 170:31-39 (1989).
La secuencia cADN codificadora de la proteína VEGF-2 sin 102 aminoácidos en la terminal N y sin 204 aminoácidos en la terminal C en la Figura 1, se amplificó usando cebadores oligonucleótidos de PCR correspondientes a las secuencias 5’ y 3’ del gen.
El cebador 5’ tiene la secuencia 5’ -GCA GCA GGA TCC CAC AGA AGA GAC TAT AAA-3’ (SEQ ID NO:22) que contiene el punto de restricción de enzima BamHI (en negrita) seguido de un espaciador nt para permanecer dentro del marco con el péptido señalizador suministrado por el vector, y 17 nt de bases secuenciales codificadoras de la proteína VEGF-2. El cebador 3’ tiene la secuencia 5N-GCA GCA TCT AGA TCA CAG TIT AGA CAT GCA-3’ (SEQ ID NO:23) que contiene el punto de restricción XbaI (en negrita) seguido de un codón de parada y 17 nucleótidos complementarios con la secuencia codificadora 3’ de VEGF-2.
Las secuencias amplificadas se aislaron de un gel 1% agarosa usado un kit comercialmente disponible (“Geneclean”, BIO 101, Inc., La Jolla, CA). A continuación, el fragmento fue digerido con la endonucleasa BamH1 y XbaI y después se purificó de nuevo sobre un gel 1% agarosa. Este fragmento se ligó al vector de transferencia baculovirus pA2 GP (Supplier) en los puntos BamH1 y XbaI. Por medio de esta ligación, cADN de VEGF-2 que representaba la proteína VEGF-2 eliminada en la terminal N y terminal C (aminoácidos 103-215 en la Figura 1 o SEQ ID NO:18) se clonó en el marco con la secuencia señalizadora del gen baculovirus GP y se localizó en el extremo 30 de la secuencia señalizadora en el vector. Esto se designó pA2GPVEGF-2.T103-L215.
4. Construcción de VEGF-2 T103-L227 en pA2GP
La secuencia cADN codificadora de la proteína VEGF-2 sin 102 aminoácidos en la terminal N y sin 192 aminoácidos en la terminal C en la Figura 1 (es decir, aminoácidos 103-227 de SEQ ID NO:18) se amplificó usando cebadores oligonucleótidos de PCR correspondientes a las secuencias 5’ y 3’ del gen.
El cebador 5’ tiene la secuencia 5’ – GCA GCA GGA TCC CAC AGA AGA GAC TAT AAA ATT TGC TGC-3’ (SEQ ID NO:24) que contiene el punto de restricción de enzima BamHI (en negrita) seguido de un espaciador nt para permanecer dentro del marco con el péptido señalizador suministrado por el vector, y 26 nt de bases secuenciales codificadoras de la proteína VEGF-2. El cebador 3’ tiene la secuencia 5NGCA GCA TCT AGA TCA ACG TCT AAT AAT GGA ATG AAC-3’ (SEQ ID NO:25) que contiene el punto de restricción XbaI (en negrita) seguido de un codón de parada y 21 nucleótidos complementarios con la secuencia codificadora 3’ de VEGF-2.
Las secuencias amplificadas se aislaron de un gel 1% agarosa usado un kit comercialmente disponible (“Geneclean”, BIO 101, Inc., La Jolla, CA). A continuación, el fragmento fue digerido con la endonucleasa BamH1 y XbaI y después se purificó de nuevo sobre un gel 1% agarosa. Este fragmento se ligó al vector de transferencia baculovirus pA2 GP (Supplier) en los puntos BamH1 y XbaI. Por medio de esta ligación, cADN de VEGF-2 que representaba la proteína VEGF-2 eliminada en la terminal N y terminal C (aminoácidos 103-227 en la Figura 1 o SEQ ID NO:18) se clonó en el marco con la secuencia señalizadora del gen baculovirus GP y se localizó en el extremo 30 de la secuencia señalizadora en el vector. Esto se designó pA2GPVEGF-2.T103-L227.
5. Construcción de VEGF-2 en pC1
Los vectores de expresión pC1 y pC4 contienen el promotor fuerte (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (Marzo, 1985)) más un fragmento del impulsador CMV (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)). Los múltiples puntos de clonación, p. ej., con los puntos de división de enzima de restricción BamHI, XbaI y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores contienen además el intrón 3N, la señal de poliadenilación y la señal de terminación del gen preproinsulina de rata.
El vector pC1 se usa para la expresión de la proteína VEGF-2. El plásmido pC1 es un derivado del plásmido pSV2-dhfr [ATCC con Número de Acceso 37146]. Ambos plásmidos contienen el gen del ratón DHFR bajo control del promotor temprano SV40. Las células del ovario de hámster chino u otras células que carecen de actividad de hidrofalato que son transfectadas con estos plásmidos pueden seleccionarse haciendo crecer células en un medio selectivo (alpha minus MEM, Life Technologies) complementado con el agente quimioterapéutico metotrexato. La amplificación de los genes DHR en células resistentes a metotrexato (MTX) se ha documentado muy bien (ver, p. ej., Alt, F.W., Kellems, R.M., Bertino, J.R., and Schimke, R.T., 1978, J. Biol. Chem. 253:1357-1370, Hamlin, J.L. and Ma, C. 1990, Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107-143, Page, M.J. and Sydenham, M.A. 1991, Biotechnology 9:64-68). Las células que crecen en mayors concentraciones de MTX desarrollan resistencia al fármaco sobreproduciendo la enzima objetivo, DHFR, como resultado de la amplificación del gen DHFR. Si un segundo gen se une al gen DHFR, normalmente se coamplifica y se sobreexpresa. Es un estado de la técnica desarrollar líneas celulares que transporten más de 1.000 copias de los genes. Como consecuencia, cuando se retira el metotrexato, las líneas celulares contienen el gen amplificado integrado en el cromosoma.
El plásmido pC1 contiene para la expresión del gen de interés un fuerte promotor de la larga repetición terminal (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438447 (Marzo, 1985)) más un fragmento aislado del impulsador del gen temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV) (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)). La dirección descendente del promotor equivale a los siguientes puntos de división de la única enzima de restricción que permite la integración de los genes: BamHI, Pvull y NrUl. Detrás de estos puntos de clonación, el plásmido contiene codones traslacionales de parada en los tres marcos de lectura seguidos por el intrón 3N y el punto de poliadenilación del gen preproinsulina de rata. Otros promotores muy eficientes también pueden usarse para la expresión, p. ej., el promotor humano bactina, los promotores SV40 tempranos o tardíos o las largas repeticiones de terminal de otros retrovirus, p. ej., VIH y HTLV-1. Para la poliadenilación del mARN, también pueden usarse otras señales, p. ej., de la hormona de crecimiento humano o genes de globina.
Las líneas celulares estables que transportan un gen de interés integrado en los cromosomas también pueden seleccionarse tras la cotrasfección con un marcador seleccionable como gpt, G418 o higromicina. Resulta ventajoso usar más de un marcador seleccionable al principio, p. ej., G418 más metotrexato.
El plásmido pC1 se digiere con la enzima BamHI de restricción y a continuación se defosforila usando fosfatos intestinales de ternero mediante procedimientos conocidos en la técnica. Posteriormente, el vector se aísla de un gel 1% agarosa.
La secuencia de ADN codificadora de VEGF-2, con Número de Acceso 97149 en ATCC, se construyó mediante PCR usando dos cebadores correspondientes al extremo 5’ y 3’ del gen VEGF-2:
el cebador 5’ (5’-GAT CGA TCC ATC ATG CAC TCG CTG GGC TTC TTC TCT GTG GCG TGT TCT CTG CTC G-3’ (SEQ ID NO:26)) contiene un punto BamHI lleno de Klenow y 40 nt de secuencia codificadora de VEGF-2 que comienza en el codón de iniciación;
el cebador 3’ (5’-GCA GGG TAC GGA TCC TAG ATT AGC TCA TTT GTG GTC TTT-3’ (SEQ ID NO:27)) contiene un punto BamHI y 16 nt de secuencia codificadora de VEGF-2 que no incluye el codón de parada.
El fragmento de ADN amplificado por PCR se aisló de un gel 1% agarosa tal y como se ha descrito anteriormente y a continuación se digirió con BamHI de endonucleasa y después se volvió a purificar sobre un gel 1% agarosa. El fragmento aislado y el vector desfosforilado se ligan a continuación con ligasa 4T ADN. Las células HB101 de E. coli se transforman posteriormente y se identifican las bacterias que contenía el plásmido pC1. La secuenciación de ADN confirma la secuencia y orientación del gen insertado. Esta construcción se desgina pC1VEGF-2.
6. Construcción de pC4SigVEGF-2 T103-L215
Plásmido pC4Sig es plásmido pC4 (Número de Acceso 209646) que contiene una porción humana de IgG Fc así como una secuencia señalizadora de proteína.
Para permitir la Reacción en Cadena de la Polimerasa dirigida a la amplificación y la sub-clonación de VEGF-2 T103-L215 (aminoácidos 103 a 215 en la Figura 1 o SEQ ID NO:18) en pC4Sig, dos cebadores oligonucleótidos complementarios a la región deseada de VEGF-2 se sintetizaron con la siguiente secuencia base:
Cebador 5’ (Bam HI y 26 nt de secuencia codificadora): 5’GCA GCA GGA TCC ACA GAA GAG ACT ATA AAA TTT GCT GC3’ (SEQ ID NO:34);
Cebador 3’ (Xba I, STOP, y 15 nt de secuencia codificadora): 5’-CGT CGT TCT AGA TCA CAG TTT AGA CAT GCA TCG GCA G3’ (SEQ ID NO:35).
La Reacción en Cadena de la Polimerasa se llevó a cabo usando condiciones estándares bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y la secuencia nucleótida para el VEGF-2 maduro (aa 24-419), por ejemplo, se construyó en el Ejemplo 3 como plantilla. El amplicón resultante se digirió con restricción con BamHI y XbaI y se subclonó en el vector pC4Sig digerido por BamHI/XbaI.
7. Construcción de pC4SigVEGF-2 T103-L227
Para permitir la Reacción en Cadena de la Polimerasa dirigida a la amplificación y la sub-clonación de VEGF-2 T103-L215 (aminoácidos 103 a 227 en la Figura 1 o SEQ ID NO:18) en pC4Sig, dos cebadores oligonucleótidos complementarios a la región deseada de VEGF-2 se sintetizaron con la siguiente secuencia base:
Cebador 5’ (Bam HI y 26 nt de secuencia codificadora): 5’GCA GCA GGA TCC ACA GAA GAG ACT ATA AAA TTT GCT GC3’ (SEQ ID NO: 34);
Cebador 3’ (Xba I, STOP, y 21 nt de secuencia codificadora): 5’-GCA GCA TCT AGA TCA ACG TCT AAT AAT GGA ATG AAC-3’ (SEQ ID NO:25).
La Reacción en Cadena de la Polimerasa se llevó a cabo usando condiciones estándares bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y la secuencia nucleótida para el VEGF-2 maduro (aa 24-419), por ejemplo, se construyó en el Ejemplo 3 como plantilla. El amplicón resultante se digirió con restricción con BamHI y XbaI y se subclonó en el vector pC4Sig digerido por BamHI/XbaI.
8. Construcción de pC4VEGF-2 M1-M263
El vector de expresión pC4 contiene el promotor fuerte (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (Marzo de 1985)) más un fragmento del impulsador CMV (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)). Los múltiples puntos de clonación, por ejemplo, con los puntos de división de enzima de restricción BamHI, XbaI y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. El vector contiene además el intrón 3N, la señal de poliadenilación y la señal de terminación del gen preproinsulina de rata.
En este ejemplo ilustrativo, el ADN clonado codificador de la proteína VEGF-2 M1-M263 eliminada por la terminal C (aminoácidos 1-263 en la Figura 1 o SEQ ID NO:18) se inserta en el vector pC4 del plásmido para expresar la proteína VEGF-2 eliminada en la terminal C.
Para permitir la Reacción en Cadena de la Polimerasa dirigida a la amplificación y la sub-clonación de VEGF-2 M1-M263 en el vector de expresión, pC4, dos cebadores oligonucleótidos complementarios a la región deseada de VEGF-2 se sintetizaron con la siguiente secuencia base:
Cebador 5’ 5’-GAC TGG ATC CGC CAC CAT GCA CTC GCT GGG CTT CTT CTC-3’ (SEQ ID NO:28);
Cebador 3’ 5’-GAC TGG TAC CTT ATC ACA TAA AAT CTT CCT GAG CC-3’ (SEQ ID NO:29).
En el caso del cebador 5’ arriba descrito, se incorporó un punto de restricción BamH1, mientras que en el caso del cebador 3’ se incorporó un punto de restricción Asp718. El cebador 5’ también contiene 6 nt, 20 nt de la secuencia codificadora de VEGF-2, y una secuencia ATG adyacente y en marco con la región codificadora de VEGF-2 que permite la traslación del fragmento clonado a E. coli, mientras que el cebador 3’ contiene 2 nt, 20 nt de la secuencia codificadora de VEGF-2, y un codón de parada (preferentemente utilizado en E. coli) adyacente y en marco con la región codificadora de VEGF-2 que asegura la correcta terminación traslacional de
E. coli.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa se llevó a cabo usando condiciones estándares bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y la secuencia nucleótida para el VEGF-2 maduro (aa 24-419) se construyó, por ejemplo, como en el Ejemplo 3 como plantilla. El amplicón resultante se digirió con restricción con BamH1 y Asp718 y se sublconó en el vector de expresión pC4 digerido con BamH1/Asp718. Esta construcción se designa pC4VEGF-2 M1-M263.
9. Construcción de pC4VEGF-2 M1-D311
En este ejemplo ilustrativo, el ADN clonado codificador de la proteína VEGF-2 M1-D311 eliminada por la terminal C (aminoácidos 1-311 en la Figura 1 o SEQ ID NO:18) se inserta en el vector pC4 del plásmido para expresar la proteína VEGF-2 eliminada en la terminal C.
Para permitir la Reacción en Cadena de la Polimerasa dirigida a la amplificación y la sub-clonación de VEGF-2 M1-D311 en el vector de expresión, pC4, dos cebadores oligonucleótidos complementarios a la región deseada de VEGF-2 se sintetizaron con la siguiente secuencia base:
Cebador 5’ 5’-GAC TGG ATC CGC CAC CAT GCA CTC GCT GGG CTT CTT CTC-3’ (SEQ ID NO:30);
Cebador 3’ 5’- GAC TGG TAC CTT ATC AGT CTA GTT CTT TGT GGG G-3’ (SEQ ID NO:31).
En el caso del cebador 5’ arriba descrito, se incorporó un punto de restricción BamH1, mientras que en el caso del cebador 3’ se incorporó un punto de restricción Asp718. El cebador 5’ también contiene 6 nt, 20 nt de la secuencia codificadora de VEGF-2, y una secuencia ATG adyacente y en marco con la región codificadora de VEGF-2 que permite la traslación del fragmento clonado a E. coli, mientras que el cebador 3’ contiene 2 nt, 20 nt de la secuencia codificadora de VEGF-2, y un codón de parada (preferentemente utilizado en E. coli) adyacente y en marco con la región codificadora de VEGF-2 que asegura la correcta terminación traslacional de
E. coli.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa se llevó a cabo usando condiciones estándares bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y la secuencia nucleótida para el VEGF-2 maduro (aa 24-419) se construyó, por ejemplo, como en el Ejemplo 3 como plantilla. El amplicón resultante se digirió con restricción con BamH1 y Asp718 y se sublconó en el vector de expresión pC4 digerido con BamH1/Asp718.
10. Construcción de pC4VEGF-2 M1-Q367
En este ejemplo ilustrativo, el ADN clonado codificador de la proteína VEGF-2 M1-Q367 eliminada por la terminal C (aminoácidos 1-367 en la Figura 1 o SEQ ID NO:18) se inserta en el vector pC4 del plásmido para expresar la proteína VEGF-2 eliminada en la terminal C.
Para permitir la Reacción en Cadena de la Polimerasa dirigida a la amplificación y la sub-clonación de VEGF-2 M1-Q367 en el vector de expresión, pC4, dos cebadores oligonucleótidos complementarios a la región deseada de VEGF-2 se sintetizaron con la siguiente secuencia base:
Cebador 5’ 5’-GAC TGG ATC CGC CAC CAT GCA CTC GCT GGG CTT CTT CTC-3’ (SEQ ID NO:32);
Cebador 3’ 5’-GAC TGG TAC CTC ATT ACT GTG GAC TTT CTG TAC ATT C-3’ (SEQ ID NO:33).
En el caso del cebador 5’ arriba descrito, se incorporó un punto de restricción BamH1, mientras que en el caso del cebador 3’ se incorporó un punto de restricción Asp718. El cebador 5’ también contiene 6 nt, 20 nt de la secuencia codificadora de VEGF-2, y una secuencia ATG adyacente y en marco con la región codificadora de VEGF-2 que permite la traslación del fragmento clonado a E. coli, mientras que el cebador 3’ contiene 2 nt, 20 nt de la secuencia codificadora de VEGF-2, y un codón de parada (preferentemente utilizado en E. coli) adyacente y en marco con la región codificadora de VEGF-2 que asegura la correcta terminación traslacional de E. coli.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa se llevó a cabo usando condiciones estándares bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y la secuencia nucleótida para el VEGF-2 maduro (aa 24-419) se construyó, por ejemplo, como en el Ejemplo 3 como plantilla. El amplicón resultante se digirió con restricción con BamH1 y Asp718 y se sublconó en el vector de expresión pC4 digerido con BamH1/Asp718. Esta construcción se designa pC4VEGF-2 M1Q367. Ejemplo 10 Expresión Pasajera de Proteína VEGF-2 en Células COS-7 Diseño Experimental
La expresión de la proteína de fusión de la construcción hecha en el Ejemplo 4, por ejemplo, se detectó mediante radioetiquetaje e inmunoprecipitación, usando métodos descritos por Harlow y colegas (Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio, 2ª ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1988)). Con este fin, tras dos días de transfección, las células se etiquetaron mediante incubación en un medio que contenía 35S-cisteína durante 8 horas. Se recogieron las células y el medio, y las células se lavaron y posteriormente se lisaron con búfer RIPA que contenía detergente: 150 nM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM TRIS, pH 7.5, tal y como lo describen Wilson y colegas (anteriormente citado). Las proteínas se precipitaron del lisado celular y del medio de cultivo usando un anticuerpo monoclonal específico de HA. Después, las proteínas precipitadas se analizaron mediante SDS-PAGE y autoradiografía.
Resultados
Tal y como se muestra en las Figuras 16A-B, las células transfectadas con pcADN1 VEGF-2HA segregaron una proteína 56 kd y 30 kd. La proteína 56 kd, pero no la proteína 30 kd, pudo también detectarse en el lisado celular pero no se detecta en controles. Esto sugiere que la proteína 30 kd tiene posibilidades de ser el resultado de la división de la proteína 56 kd. Debido a que la etiqueta HA se encuentra en la terminal C de VEGF-2, la proteína 30 kd debe representar la porción terminal C de la proteína dividida, mientras que la porción terminal N de la proteína dividida no se podría detectar mediante inmunoprecipitación. Estos datos indican que la proteína VEGF-2 expresada en células de mamíferos es segregada y procesada. Ejemplo 11 Efecto Estimulador de VEGF-2 en Proliferación de Células Vasculares Endoteliales Diseño Experimental
La expresión de VEGF-2 es abundante en tejidos muy vascularizados. Por lo tanto, se examinó el papel de VEGF-2 en la regulación de la proliferación de varios tipos de células endoteliales. Ensayo de proliferación celular endotelial
Para la evaluación de actividad mitogénica de factores de crecimiento, se realizó el ensayo MTS clorimétrico (3-(4,5dimetilthiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-ulfofenil)2H-tetrazolio) con el reagente PMS (fenazina metosulfato) de enlace de electrón (Cell Titer 96 AQ, Promega). Las células se plantaron en una placa con 96 pozos (5.000 células/pozo) en un medio complementado con
0.1 mL suero y se dejó que se unieran durante la noche. Tras inanición de suero durante 12 horas en 0.5% FBS, se añadieron condiciones (bFGF, VEGF165 o VEGF-2 en 0.5% FBS) con o sin Heparina (8 U/ml) a los pozos durante 48 horas. Se añadieron 20 mg de mezcla MTS/PMS (1:0.05) por pozo y se dejó incubar durante 1 hora a 37ºC antes de medir la absorbencia a 490 nm en un lector de placa ELISA. Se restó la absorbencia del fondo de los pozos de control (algunos medios, no células) y sietes pozos actuaron en paralelo para cada condición. Ver, Leak et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 30A:512-518 (1994).
Resultados
VEGF-2 estimuló la proliferación de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y ligeramente de células endoteliales microvasculares dérmicas (Figuras 17 y 18). El efecto estimulador de VEGF-2 es más pronunciado en la proliferación de células endoteliales endometriales y microvasculaes (Fig. 19). Las células endoteliales endometriales (HEEC) demostraron la respuesta más alta a VEGF-2 (96% del efecto de VEGF-2 sobre células microvasculares endoteliales). La respuesta de células microvasculares endoteliales (HMEC) a VEGF-2 fue 73% en comparación a VEGF. La respuesta de HUVEC y BAEC (células endoteliales aórticas bovinas) a VEGF-2 fue sustancialmente más baja en un 10% y 7%, respectivamente. La actividad de la proteína VEGF-2 ha variado entre diferentes corrientes de purificación con el efecto estimulador de ciertos lotes sobre proliferación HUVEC siendo significativamente más alto que el de otros lotes.
Además, un experto en la técnica podrá fácilmente modificar el protocolo mencionado para comprobar el efecto de agonistas y/o antagonistas de VEGF-2 (p. ej., anticuerpos de VEGF-2) en la proliferación inducida por VEGF-2 sobre células endoteliales. Ejemplo 12 Inhibición de Proliferación de Célula de Músculo Liso Vascular Inducida por PDGF
La expresión de VEGF-2 es alta en células de musculatura lisa vascular. La musculatura lisa es un importante objetivo terapéutico para enfermedades vasculares, como restenosis. Para evaluar los potenciales efectos de VEGF-2 sobre células de musculatura lisa, se examinó el efecto de VEGF-2 sobre proliferación de célula de musculo liso aórtico humano (HAoSMC). Diseño Experimental
La proliferación de HAoSMC puede medirse, por ejemplo, mediante la incorporación de BrdUrd. En resumen, células subclonfluentes y quiescentes que crecieron en portaobjetos con 4 cámaras se transfectaron con CRP o AT2-3LP con etiqueta FITC. A continuación, las células se pulsaron con 10% suero de ternero y 6 mg/ml BrdUrd. Después de 24 horas, se realizó imunocitoquímica usando un Kit de Tinción BrdUrd (Laboratorios Zyme).
En resumen, las células se incubaron con el anticuerpo anti-BrdUrd de ratón biotinilado a 4ºC durante 2 horas después de una exposición para desnaturalizar la solución y a continuación con estreptavidina-peroxidasa y diaminobenzidina. Tras tintarlo secundariamente con hematoxilina, las células se montaron para examen microscópico, y las células positivas BrdUrd se contabilizaron. El índice BrdUrd se calcula como un porcentaje de células positivas BrdUrd con el número total de células. Además, la detección simultánea de la tinción de BrdUrd (núcleo) y la respuesta de FITC (citoplasma) se lleva a cabo para células individuales mediante el concomitante uso de iluminación de campo brillante e iluminación fluorescente UV de campo oscuro. Ver, Hayashida et al., Biol. Chem. 6;271(36):21985-21992 (1996). Resultados
VEGF-2 tiene un efecto sobre proliferación de células de musculatura lisa muscular por PDGF, pero no por Suero Bovino Fetal (FBS) (Figura 20).
Además, un experto en la técnica podrá fácilmente modificar el protocolo mencionado para comprobar el efecto de agonistas y/o antagonistas de VEGF-2 (p. ej., anticuerpos de VEGF-2) en la inhibición de VEGF-2 de proliferación de células de musculatura lisa vascular.
Ejemplo 13 Estimulación de Migración Celular Endotelial
La migración celular endotelial es un importante paso incluido en angiogénesis
Diseño Experimental
Este ejemplo se usará para explorar la posibilidad de que VEGF-2 puede estimular la migración de células endoteliales linfáticas. En la actualidad, no existen informes publicados de dicho modelo. Sin embargo, adaptaremos un modelo de migración de célula endotelial vascular para uso con células endoteliales linfáticas esencialmente del siguiente modo:
Los ensayos de migración de células endoteliales se realizan usando una cámara de microquimiotaxis con 48 pozos (Neuroprobe Inc., Cabin John, MD; Falk, W., Goodwin, R. H. J., y Leonard, E. J. " Un montaje de microquimiotaxis con 48 pozos para medir de manera rápida y precisa la migración de leucocitos." J. Immunological Methods 1980;33:239-247). Filtros de policarbonato libres de polivinilpirrolidona con un tamaño de poro de 8 um (Nucleopore Corp. Cambridge, MA) se cubren con 0.1% gelatina durante al menos 6 horas a temperatura ambiente y se secan bajo aire estéril. Las sustancias del test se diluyen en concentraciones apropiadas en M199 complementado con 0.25% de albúmina de suero bovino (BSA) y 25 ul de la dilución final se colca en la cámara baja del aparato Boyden modificado. Los cultivos HUVEC o BMEC de paso temprano (2-6) subconfluentes se lavan y tripsinizan durante el mínimo tiempo requerido para conseguir el desprendimiento celular. Después de colocar el filtro entre la cámara inferior y superior, 2.5 x 105 células suspendidas en 50 ul M199 que contenía 1% FBS se cultivan en el compartimiento superior. A continuación, el aparato se incuba durante 5 horas a 37ºC en una cámara humidificada con 5% CO2 para permitir la migración celular. Tras el periodo de incubación, el filtro se retira y el lado superior del filtro con las células no migradas se descarta con una goma policía. Los filtros se fijan con metanol y se tintan con una solución Giemsa (Diff-Quick, Baxter, McGraw Park, IL). La migración se cuantifica contando las células de tres campos arbitrarios con gran poder (40x) en cada pozo, y todos los grupos actúan en cuadriplicado.
Resultado
En un ensayo que examina la migración de HUVEC que usa una cámara de microquimiotaxis con 43 pozos, VEGF-2 fue capaz de estimular la migración de HUVEC (Figuras 21A-B)
Además, un experto en la técnica podrá fácilmente modificar el protocolo mencionado para comprobar el efecto de agonistas y/o antagonistas de VEGF-2 (p. ej., anticuerpos de VEGF-2) sobre la migración inducida por VEGF-2 de células endoteliales. Ejemplo 14Estimulación de Producción de Óxido Nítrico por Células Endoteliales
Se cree que el óxido nítrico liberado por el endotelio vascular es un mediador de la relajación del endotelio vascular. VEGF-1 ha demostrado inducir producción de óxido nítrico por parte de células endoteliales en respuesta a VEGF-1. Como resultado, la actividad de VEGF-2 puede someterse a ensayo determinando la producción de óxido nítrico por parte de células endoteliales en respuesta a VEGF
2.
Diseño Experimental
El óxido nítrico se mide en placas de 96 pozos de células endoteliales microvasculares confluentes tras 24 horas de inanición y una posterior exposición de 4 horas a varios niveles de VEGF-1 y VEGF-2. El óxido nítrico en el medio se determina usando el reagente Griess para medir el nitrito total tras la reducción de nitrato derivado de óxido nítrico mediante nitrato reductasa. Se examinó el efecto de VEGF-2 sobre la liberación de óxido nítrico en HUVEC.
En resumen, se midió una liberación NO de monocapa HUVEC cultivada con un electrodo polarográfico específico conectado NO a un metro NO (Iso-No, World Precision Instruments Inc.) (1049). La calibración de los NO elementos se llevó a cabo de acuerdo con la siguiente ecuación: 2KNO2 + 2 KI + 2 H2SO4 6 2 NO + I2 + 2 H2O + 2 K2SO4
La curva de calibración estándar se obtuvo añadiendo concentraciones clasificadas de KNO2 (0, 5, 10, 25, 50, 100, 250 y 500 nmol/L) en la solución de calibración que contenía KI y H2SO4. La especificidad del electrodo Iso-NO con NO se determinó previamente midiendo el NO de auténtico gas NO (1050). El medio de cultivo se retiró y HUVECs se lavaron dos veces con salina con búfer de fosfato de Dulbecco. A continuación, las células se bañaron en 5 ml de solución filtrada Krebs-Henseleit en placas de 6 pozos, y después las placas con las células se dejaron sobre un portaobjetos más caliente (Lab Line Instruments Inc) para mantener la temperatura a 37ºC. La sonda del sensor NO se insertó verticalmente en los pozos, manteniendo la punta del electrodo 2 mm por debajo de la superficie de la solución, antes de añadir las diferentes condiciones. S-nitroso acetil penicilamina (SNAP) se usó como control positivo. La cantidad de NO liberado se expresó como picomoles por 1x106 células endoteliales. Todos los valores presentados fueron medias de cuatro a seis medidas en cada grupo (número de pozos de cultivos celulares). Ver, Leak et al. Biochem.and Biophys. Res. Comm. 217:96-105 (1995). Resultados
VEGF-2 fue capaz de estimular liberación de óxido nítrico sobre HUVEC (figura 22) hasta un nivel más alto que VEGF. Esto sugirió que VEGF-2 podría modificar la permeabilidad vascular y la dilatación de los vasos.
Además, un experto en la técnica podrá fácilmente modificar el protocolo mencionado para comprobar el efecto de agonistas y/o antagonistas de VEGF-2 (p. ej., anticuerpos de VEGF-2) sobre la liberación de óxido nítrico inducido por VEGF de células endoteliales. Ejemplo 15 Efecto de VEGF-2 sobre Formación de Cordón en Angiogénesis
Otro paso en angiogénesis es la formación de cordón, marcada por la diferenciación de células endoteliales. Este bioensayo mide la habilidad de las células endoteliales microvasculares para formar estructuras del tipo capilar (estructuras huecas) cuando se cultivan in vitro.
Diseño Experimental
Se compran CADMEC (células endoteliales microvasculares) en Cell Applications, Inc., como células proliferativas (paso 2) y se cultivan en el Medio de Crecimiento CADMEC de Cell Application y se usan en el paso 5. Para el ensayo de angiogénesis in vitro, los pozos de la placa de cultivo con 48 pozos se cubren con el Medio de Factor de Unión de Cell Application (200 ml/pozo) durante 30 minutos a 37ºC. CADMEC se siembran en los pozos cubiertos a
7.500 células/pozo y se cultivan durante la noche en el Medio de Crecimiento. Posteriormente, el Medio de Crecimiento es sustituido por 300 mg de Medio de Formación de Cordón de Cell Application que contiene búfer de control o proteína de la descripción (0.1 a 100 ng/ml) y las células se cultivan durante un periodo adicional de 48 horas. Los números y longitudes de los cordones del tipo capilar se cuantifican usando el analizador con imagen de video Boeckeler VIA
170. Todos los ensayos se hacen por triplicado.
Se usa VEGF (50 ng/ml) comercial (R&D) como control positivo. B-esteradiol (1 ng/ml) se usa como control negativo. El búfer apropiado (sin proteína) también se usa como un control. Resultados
Se ha observado que VEGF-2 inhibe la formación de cordón al igual que IFNa que también estimula la proliferación de células endoteliales (Figura 23). Este efecto inhibidor puede ser un efecto secundario de la proliferación endotelial que es mutuamente exclusiva con el proceso de formación de cordón.
Además, un experto en la técnica podrá fácilmente modificar el protocolo mencionado para comprobar el efecto de agonistas y/o antagonistas de VEGF-2 (p. ej., anticuerpos de VEGF-2) sobre la inhibición de VEGF-2 de formación de cordón Ejemplo 16 Efecto Angiogénico sobre Membrana Corioalantoidea de Pollos
La membrana corioalantoidea de pollos (CAM) es un sistema bien establecido para examinar angiogénesis. La formación de vasos sanguíneos en CAM es fácilmente visible y cuantificable. Se examinó la habilidad de VEGF-2 para estimular angiogénesis en CAM.
Diseño Experimental
Embriones
Huevos Fertilizados del pollo White Leghorn (Gallus gallus) y codorniz japonesa (Coturnix coturnix) se incubaron a 37.8ºC y 80% de humedad. La CAM diferencial de los embriones del pollo de 16 días de edad y de la codorniz de 13 días de edad se estudió con los siguientes métodos. Ensayo CAM
El día 4 del desarrollo, se hizo una ventana en la cáscara del huevo de los huevos del pollo. Se comprobó que los embriones se desarrollaban de manera normal y los huevos se sellaron con cinta de cello. A continuación, se incubaron hasta el Día 13. Los cubreobjetos Thermanox (Nunc, Naperville, IL) se cortaron en discos de aproximadamente 5 mm de diámetro. Factores de crecimiento estériles y libres de sal se disolvieron en agua destilada y aproximadamente 3.3 mg/5ml se pasó por una pipeta sobre los discos. Tras un secado al aire, se aplicaron los discos invertidos sobre CAM. Después de 3 días, los especímenes se fijaron en 3% glutaraldehído y 2% formaldehido y se enjugaron en 0.12 M búfer de cacodilato sódico. Fueron fotografiados con un microscopio estéreo [Wild M8] y se insertaron para semi-seccionamiento ultrafino tal y como se ha descrito anteriormente. Los controles se realizaron solamente con los discos portadores. Resultados
Estos datos demuestran que VEGF-2 puede estimular angiogénesis en el ensayo CAM nueve veces más en comparación con el control no tratado. Sin embargo, esta estimulación es solamente el 45% del nivel de estimulación de VEGF (Figura 24).
Además, un experto en la técnica podrá fácilmente modificar el protocolo mencionado para comprobar el efecto de agonistas y/o antagonistas de VEGF-2 (p. ej., anticuerpos de VEGF-2)
sobre la estimulación de VEGF-2 de angiogénesis en el ensayo CAM.
Ejemplo 17 Ensayo de Angiogénesis Usando un Implante de Matrigel en Ratón Diseño Experimental
Con el fin de establecer un modelo in vivo para angiogénesis para testar las actividades de la proteína, a ratones y ratas se les implantaron discos de metilcelulosa que contenían 20 mg de BSA (control negativo) y 1 mg de bFGF y 0.5 mg de VEGF-1 (control positivo).
Resultó que aunque los discos BSA contenían poco vascularización, los discos de los controles positivos mostraron signos de formación de vasos. El día 9, un ratón mostró una clara respuesta a bFGF. Resultados
Ambas proteínas VEGF parecieron aumentar la celularidad de Matrigel en un factor de aproximadamente 2 a través de una estimación visual.
30 ratones adicionales fueron implantados discos que contenían BSA, bFGF y varias cantidades de VEGF-1, VEGF-2-B8 y VEGF-2-C4. Cada ratón recibió dos discos idénticos, en lugar de un disco de control y uno experimental.
Las muestras de todos los discos recuperados se sometieron a inmunotinción con el factor de Von Willebrand para detectar presencia de células endoteliales en los discos, y flk-1 y flt-4 para distinguir entre células endoteliales vasculares y linfáticas. Sin embargo, no se pudieron determinarse los análisis histoquímicos definitivos de neovascularización y linfangiogénesis.
Además, un experto en la técnica podrá fácilmente modificar el protocolo mencionado para comprobar el efecto de agonistas y/o antagonistas de VEGF-2 (p. ej., anticuerpos de VEGF-2) sobre angiogénesis modulada por VEGF-2. Ejemplo 18 Rescate de Isquemia en Modelo de Extremidad Inferior de
Conejo Diseño Experimental
Para estudiar los efectos in vivo de VEGF-2 en isquemia, se creó un modelo de isquemia en extremidad trasera de un conejo mediante eliminación quirúrgica de una arteria femoral tal y como se ha descrito anteriormente (Takeshita, S. et al., Am J. Pathol 147:1649-1661 (1995)). La escisión de la arteria femoral da como resultado una propagación retrógrada del trombo y oclusión de la arteria ilíaca externa. Como consecuencia, el flujo sanguíneo de la extremidad isquémica depende de los vasos colaterales que se originan en la arteria ilíaca interna (Takeshita, S. et al., Am J. Pathol 147:1649-1661 (1995)). Se dejó un intervalo de 10 días para la recuperación post-operatoria de los conejos y el desarrollo de vasos colaterales endógenos. El día 10 del post-operatorio (día 0), tras realizar un angiograma de línea base, la arteria ilíaca interna de la extremidad isquémica se transfectó con 500 mg de plásmido de expresión VEGF-2 desnudo mediante tecnología de transferencia genética arterial usando un catéter con globo cubierto con hidrogel tal como el descrito (Riessen, R. et al. Hum Gene Ther. 4:749-758 (1993); Leclerc, G. et al. J. Clin. Invest. 90: 936-944 (1992)). Cuando se usó VEGF-2 en el tratamiento, se envió un único bolo de 500 mg de proteína VEGF-2 o control a la arteria ilíaca interna de la extremidad isquémica durante un periodo de 1 min. por medio de un catéter de infusión. El día 30, se midieron varios parámetros en estos conejos. Resultados
Tanto la proteína VEGF-2 (Figura 25A) como el plásmido desnudo de expresión (Figura 25B) fueron capaces de restablecer los siguientes parámetros en la extremidad isquémica. El restablecimiento de flujo sanguíneo y el resultado angiográfico parecen deberse ligeramente en mayor medida por la administración de 500 mg de plásmido en comparación con los 500 mg de proteína (Figura 25C). La extensión del restablecimiento es comparable a la del VEGF en experimentos separados (datos no mostrados). Un dilatador de vasos no fue capaz de conseguir el mismo efecto, lo que sugirió que el restablecimiento de flujo sanguíneo no se debe simplemente al efecto de dilatación vascular.
1. Radio BP (Figuras 25A-C)
El radio de presión sanguínea de presión sistólica de la extremidad isquémica con la extremidad normal.
2. Flujo Sanguíneo y Reserva de Flujo (Figuras 25D-I)
FL de descanso: el flujo sanguíneo durante una condición no dilatada.
FL máximo: el flujo sanguíneo durante una condición completamente dilatada (también una medida indirecta de la cantidad de vaso sanguíneo).
La Reserva de Flujo se refleja por el radio de FL max : FL de descanso.
3. Resultado Angiográfico (Figuras 25J-L)
Esto se mide con el angiograma de vasos colaterales. Se determinó un resultado con el porcentaje de círculos en una rejilla suprayacente con arterias ensombrecidas y cruzadas dividido entre el número m total del muslo del conejo.
4. Densidad Capilar (Figuras 25M-O) El número de capilares colaterales determinados en secciones claras microscópicas tomadas de las extremidades traseras.
Tal y como se ha comentado, VEGF-2 se procesa a un fragmento de terminal N y terminal C que se co-purifican. El fragmento de terminal N contiene el dominio funcional putativo intacto y puede ser responsable de la actividad biológica. Ejemplo 19 Efecto de VEGF-2 en Vasodilatación
Tal y como se ha descrito anteriormente, VEGF-2 puede estimular liberación NO, un mediador de dilatación del endotelio vascular. Debido a que la dilatación del endotelio vascular es importante para reducir la presión sanguínea, se examinó la habilidad de VEGF-2 para afectar a la presión sanguínea en ratas espontáneamente hipertensas (SHR). VEGF-2 provocó un descenso dependiente de dosis en presión sanguínea diastólica (Fig. 26 a y b). Hubo un descenso estable en presión sanguínea diastólica con dosis crecientes de VEGF-2 que consiguieron significancia estadística cuando se administró una dosis de 300 mg/kg.
Los cambios observados en esta dosis no fueron diferentes a los observados con acetilcolina (0.5 mg/kg). También se observó un descenso de la presión arterial media (MAP) (Ver figuras 26c y 26d). VEGF-2 (300 mg/kg) y acetilcolina redujeron el MAP de estos animales SHR hasta niveles normales.
Además, dosis mayores (0, 10, 30, 100, 300 y 900 mg/kg) de las preparaciones B8, C5 y C4 de VEGF-2 se administraron a las ratas espontáneamente hipertensas (SHR) de 13-14 semanas de edad. Los datos de expresan como la media +/- SEM. El análisis estadístico se llevó a cabo con un test t emparejado y la importancia estadística se definió como p<0.05 vs. la respuesta al búfer solamente.
Estudios con VEGF-2 (preparación C5) revelaron que aunque la presión sanguínea disminuyó de manera significativa, la magnitud de la respuesta no fue tan grande como la observada con VEGF-2 (preparación B8) incluso cuando se usó en una dosis de 900 mg/kg.
Estudios con VEGF-2 (preparación C4) revelaron que esta preparación con proteína de expresión CHO dio resultados similares a los observados con C5 (es decir, estadísticamente significativos pero de menor magnitud que los observados con la preparación B8) (ver Figuras 26A-D).
Como el control y los lotes C4 y C5 de VEGF-2 produjeron cambios menores, pero estadísticamente significativos, en presión sanguínea, se realizaron experimentos con otra proteína expresada por CHO, M-CIF. La administración de M-CIF en dosis en el rango de 10-900 mg/kg no produjo cambios significativos en presión sanguínea diastólica. Se observó una menor reducción estadísticamente significativa en la presión sanguínea arterial media en dosis de 100 y 900 mg/kg pero no se observó una respuesta a la dosis. Estos resultados sugieren que las reducciones en la presión sanguínea observada con los lotes C4 y C5 de VEGF-2 fueron específicas, es decir, relacionadas con VEGF-2.
Ejemplo 25 Fragmentos de Péptido Específicos para Generar Anticuerpos Monoclonales de VEGF-2
Se han generado cuatro péptidos específicos (designados SP40, SP-41, SP-42 y SP-43). Estos se usarán para generar anticuerpos monoclonales para analizar los procesos de VEGF-2. Los péptidos se muestran a continuación:

1.

"SP-40": MTVLYPEYWKMY (aminoácidos 70-81 en SEQ ID NO:18)

2.

"SP-41": KSIDNEWRKTQSMPREV (aminoácidos 120-136 (observer mutación C->S en posición 131) en SEQ ID NO: 18)

3.

"SP-42": MSKLDVYRQVHSIIRR (aminoácidos 212-227 en SEQ ID NO: 18)

4.

"SP-43": MFSSDAGDDSTDGFHDI (aminoácidos 263-279 en SEQ ID NO: 18)

Ejemplo 32 Identificación y Clonación de dominios VH y VL
Un método para identificar y clonar dominios VH y VL de líneas celulares que expresan un anticuerpo particular consiste en realizar PCR con cebadores específicos de VH y VL sobre cADN hecho de las líneas celulares que expresan el anticuerpo. En resumen, se aísla ARN de las líneas celulares y se usa como plantilla para RT-PCR diseñado para amplificar los dominios VH y VL de los anticuerpos expresados por las líneas celulares EBV. Las células pueden lisarse en el reagente TRIzol® (Life Technologies, Rockville, MD) y extraerse con una quinta parte de volumen de cloroformo. Tras la adición de cloroformo, la solución se deja incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos, y a continuación se centrifuga a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC en un centrifugador de mesa. Se recoge el sobrenadante y el ARN se precipita usando un volumen igual de isopropanol. El ARN precipitado se transforma en partículas mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC en un centrifugador de mesa. Después de la centrifugación, el sobrenadante se descarta y se lava con 75% etanol. Tras el lavado, el ARN se vuelve a centrifugar a 800 rpm durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se descarta y el precipitado se deja en aire seco. El ARN se disuelve en agua DEPC y se calienta a 60ºC durante 10
5 minutos. Las cantidades de ARN pueden determinarse usando medidas de densidad ópticas.
El cADN puede sintetizarse, de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica, desde 1.5-2.5 microgramos de ARN usando transcriptasa inversa y cebadores arbitrarios de hexámero. A
10 continuación, el cADN se usa como plantilla para amplificación PCR de los dominios VH y VL. Los cebadores empleados para amplificar genes VH y VL se muestran en la Tabla 5. Normalmente, una reacción PCR hace uso de un único cebador 5’ y un único cebador 3’. Algunas veces, cuando la cantidad de plantilla ARN disponible es
15 limitada, o para mayor eficacia, pueden usarte grupos de cebadores 5’ y/o 3’. Por ejemplo, algunas veces los cinco cebadores VH-5’ y todos los cebadores JH3’ pueden se usan en un única reacción PCR. La reacción PCR se lleva a cabo en un volumen de 50 microlitros que contiene búfer IX PCR, 2 mM de cada dNTP, 0.7 unidades de
20 Taq polimerasa de Alta Fidelidad, mezcla de cebador 5’, mezcla de cebador 3’ y 7.5 microlitros de cADN. La mezcla de cebador 5’ y 3’ y VH y VL pueden hacerse uniendo 22 y 28pmoles, respectivamente, de cada cebador individual. Las condiciones PCR son: 96ºC durante 5 min.; seguido de 25 ciclos de 94ºC durante 1 min., 50ºC durante 1
25 min., y 72ºC durante 1 min.; seguido de un ciclo de extensión de 72ºC durante 10 minutos. Después de que la reacción se haya completado, los tubos de muestra se almacenan a 4ºC. Tabla 3: Secuencias de Cebadores Usadas para Amplificar dominios VH y VL
30 imagen1
Posteriormente, las muestras de PCR se sometieron a electroforesis sobre un gel 1.3% agarosa. Las bandas de ADN de los tamaños esperados (~506 pares base para dominios VH, y 344 pares base para dominios VL) pueden cortarse del gel y purificarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Los productos PCR purificados pueden ligarse en un vector de clonación PCR (vector TA de Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). Los productos PCR individuales clonados pueden aislarse tras la transfección de E. coli y la selección de color azul/blanco. A continuación, los productos PCR clonados pueden secuenciarse usando métodos comúnmente conocidos en la técnica.
Las bandas de PCR que contienen el dominio VH y los dominios VL también pueden usarse para crear vectores de expresión Ig de longitud completa. Los dominios VH y VL pueden clonarse en vectores que contienen las secuencias nucleótidas de regiones constantes de una cadena pesada (p. ej., IgG1 humano o IgG4 humano) o cadena ligera (kappa humano o lambda humano) de modo que una molécula completa de cadena pesada o ligera pueda expresarse a partir de estos vectores cuando se transfectan a una apropiada célula huésped. Además, cuando las dos cadenas ligera y pesada clonadas se expresan en una línea celular (de uno o dos vectores), pueden formar una molécula completa de anticuerpo funcional que es segregada al medio de cultivo celular. Los métodos que usan polinucleótidos que codifican los dominios de anticuerpo VH y VL para generar vectores de expresión que codifican moléculas de anticuerpo son bien conocidos en la técnica. Ejemplo 33 Análisis BIAcore de Afinidad de Polipéptidos que se enlazan con VEGF-2
El enlace de anticuerpos VEGF-2 con VEGF-2, por ejemplo, puede analizarse con el análisis BIAcore. Bien VEGF-2 (u otro antígeno con el que se quiera saber la afinidad de un anticuerpo VEGF-2) o un anticuerpo de VEGF-2 pueden inmovilizarse covalentemente con un chip sensor BIAcore (chip CM5) por medio de grupos de amina usando química de N-etil-N’(dimetilaminopropilo)carboiimida/N-hidroxisuccinimida. Varias diluciones de anticuerpos de VEGF-2 o VEGF-2 (u otro antígeno con el que se quiera saber la afinidad de un anticuerpo VEGF-2), respectivamente, fluyen sobre el chip CM5 derivado en células de flujo a 25 microlitros/min en un volumen total de 50 microlitros. La cantidad de proteína ligada se determina usando lavado de la célula de flujo con búfer HBS (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 4.3 mM EDTA, 0.005% surfactante p20). La especificidad de enlace para la proteína de interés se determina por medio de competición con competidor soluble en presencia de la proteína de interés.
La superficie celular de flujo puede regenerarse desplazando la proteína ligada mediante lavado con 20 microlitros de 10 mM glicina-HCl, pH 2.3. Para análisis cinético, las células de flujo se testan en diferentes velocidades de flujo y en diferentes densidades de polipéptido sobre el chip CM5. Las constantes de asociación y las constantes de disociación pueden determinarse usando el programa de evaluación cinética en un software BIAevaluation 3.
La tecnología BIAcore también puede utilizarse, por ejemplo, para determinar de manera cuantitativa la habilidad de un anticuerpo anti-VEGF-2 para inhibir la habilidad de VEGF-2 para enlazarse con su receptor. Ejemplo 34 Ensayo de Proliferación Celular Endotelial
El tratamiento de VEGF-2 provoca que células endoteliales vasculares así como células endoteliales linfáticas sufran proliferación. Se puede usar el siguiente ensayo para seguir esta actividad en células tratadas con VEGF-2. Además, se puede usar este ensayo para determinar si los anticuerpos VEGF-2 son capaces de inhibir la habilidad de proteínas VEGF-2 para provocar proliferación de células endoteliales. El siguiente protocolo demuestra que el ensayo puede testa la actividad inhibidora de anticuerpos VEGF-2, aunque un experto en la técnica podrá fácilmente modificar este ensayo para omitir los anticuerpos VEGF-2 con el fin comprobar la habilidad de las proteínas VEGF-2 para inducir proliferación celular endotelial.
Subcultivo Continuo de células endoteliales linfáticas bovinas (bLEC)
Células endoteliales linfáticas bovinas (bLEC) (ATCC Nº PTA1149) crecen en medio completo (DMEM, 10% de FBS inactivado por calor (Biowhittaker, Cat.#14-502f), 100 U/ml penicilina, 100 g/ml estreptomicina, 2 mM glutamina, 5 ml/500 ml medio de Solución de Aminoácidos No Esenciales (NEAA), 150 ug/ml extracto de cerebro bovino (el extracto de cerebro bovino se prepara tal y como se describe en Maciag et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5674-5678 (1979)), 100 ug/ml heparina) en un matraz de 75 cm2. Cuando se alcanza la confluencia, el medio de cultivo se retira del matraz de 75 cm2, y las células se enjuagan una vez con 20 ml de PBS sin calcio y sin magnesio, y a continuación se cubren con 4 ml de tripsina-EDTA y se devuelven a la incubadora durante 3-5 minutos. A continuación, las células se separan de la superficie de plástico por medio de una suave agitación, añadiendo 4 ml de medio completo para inactivar la tripsina. La suspensión celular se transfiere posteriormente al tubo de centrifugación de 15 ml y se centrifuga a 1000 rpm durante 5 minutos hasta conseguir células granuladas. El sobrenadante se retira y los gránulos celulares se vuelven a suspender en el medio completo. Las células se parten 1:3 y se mantienen en la incubadora con CO2 a 37ºC. El medio se cambia dos veces por semana con independencia de la necesidad de partición de las células. Protocolo de Ensayo de Proliferación de VEGF-2
Día 1: Poner en placas bLECs en 3500 células por pozo en una placa con 96 pozos excluyendo filas externas y cultivo durante la noche en medio completo. El siguiente día,
Día 2: Retirar el medio completo y añadir 100 microlitros de medio de inanición: EBM (Clonetics Cat. #CC-3121), 0.5% FBS.
Día 3: Diluir la proteína VEGF-2 en medio de inanición produciendo una concentración 3X. En placas con 12 pozos, hacer diluciones en serie de cada anticuerpo (usando la concentración 3X de VEGF-2 en medio de inanición como diluyente) para un total de 14 diluciones. Las concentraciones finales después de añadir el anticuerpo a las placas experimentales deberían estar en el rango de 4000 ng/ml a 0.0006 ng/ml (diluciones por 3 veces) por triplicado.
Transferir 50 microlitros de cada dilución comenzando por la menor cantidad de anticuerpo a la placa con 96 pozos. Incubar las placas durante 3 días a 37ºC, 5% CO2.
Día 6: Complementar cada pozo con 50 microlitros de medio de inanición que contiene 3H-timidina 0.5mCi por pozo (6.7 Ci/mM) e incubar las células durante un periodo adicional de 18-30 horas.
Día 7: Congelar las placas a -80ºC. Después de 2-3 horas, derretir las placas. Cosechar las células y medir la incorporación de 3H-timidina. Ejemplo 35 Ensayo de Fosforilación de Elk-1
VEGF-2 provoca una cascada señalizadora en células sensibles a VEGF-2 que activa una quinasa que fosforila la proteína Elk-1. Se puede usar el siguiente ensayo para seguir la actividad en células tratadas con VEGF-2. Además, se puede usar este ensayo para determinar si los anticuerpos de VEGF-2 son capaces de inhibir la habilidad de proteínas VEGF-2 para inducir fosforilación Elk-1. El siguiente protocolo demuestra que el ensayo es capaz de testar la actividad inhibidora de anticuerpos VEGF-2, aunque un experto en la técnica podrá fácilmente modificar este ensayo para omitir los anticuerpos VEGF-2 con el fin comprobar la habilidad de las proteínas VEGF-2 para inducir fosforilación de Elk-1.
En resumen, placas de cultivo de tejido con fondo plano con 96 pozos se siembran con células endoteliales linfáticas bovinas (bLEC) con 25.000 células por pozo en un volumen de 100 microlitros de medio de crecimiento completo (EGM-MV de Clonetics Corporation, Cat. Nº CC-4143) y se incuban durante la noche a 37ºC en 5% CO2. Se preparan soluciones patrón de trabajo de VEGF-2 (p. eje., proteína de longitud completa o la forma segregada de VEGF-2) en
0.2 microgramo/mililitro en PBS + 0.05% BSA (baja endotoxina).
En una placa de ensayo separada, se mezclan 6 ng de longitud completa o 2 ng de la forma segregada de proteína VEGF-2 con
1.500 ng (que representa 100X exceso molar de anticuerpo) de anticuerpo VEGF-2, y se ajusta el volumen total a 100 microlitros con Medio Libre de Suero Endotelial Humano (Life Technologies, Cat. Nº 11111-04) (SFM). La concentración final de VEGF-2 de longitud completa, VEGF-2 segregado y anticuerpo es 60 ng/mL, 20 ng/mL y 15 ug/mL, respectivamente. Si las muestras de anticuerpo están en un medio acondicionado, se usan las concentraciones del total IgG para calcular la cantidad de anticuerpo necesario en el ensayo. Se deja que los complejos del anticuerpo de VEGF-2 se formen durante 1 hora a temperatura ambiente.
Mientras que los complejos anticuerpo-antígeno se están formando, retirar el medio de crecimiento completo y sustituirlo por un medio de inanición SFM, e incubar las células durante una hora a 37ºC en 5% CO2. Después de que haya finalizado la incubación de una hora de las células, trasvasar el medio de inanición de las células y transferir 50 microlitros de cada muestra VEGF-2/anticuerpo VEGF-2 de la placa de ensayo a la placa celular. A continuación, incubar la placa celular durante 15 minutos a 37ºC. Tras la incubación, trasvasar el líquido que contiene los complejos VEGF-2 anti-VEGF-2 de las células y 50 microlitros por pozo de búfer de lisis con hielo (20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 0.5% NP-40, 10% glicerol, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA, 0.1 mM ortovanadato sódico, 1 mM NaF, 0.5 mM DDT [añadir fresco], 1X inhibidor de proteasa completo de Roche [añadir fresco] y se deja reposar durante 1-3 minutos. El lisado debería usarse inmediatamente en ensayo de quinasa o almacenarse a -70ºC. Ensayo de Quinasa:
Diluir proteína de fusión GST-Elk1 (Cell Signaling Technologies #9184, o Boston Biologicals #1010) en PBS hasta 10 ug/mL, y añadir una placa Dynex Microlite 2 de 96 pozos (Catálogo #7417) con 50 microlitros por pozo. Golpoear la placa suavemente hasta conseguir que el líquido cubra el fondo completamente. Incubar durante la noche a temperatura ambiente o durante una hora a 37ºC. Lavar la placa una vez con 250 microlitros por pozo de búfer de lavado (0.05% Tween 20, PBS + PBST). A continuación, bloquear los puntos de enlace no ocupados en los pozos con búfer bloqueador (1.0% Leche Seca No Grasa, PBST) en 150 microlitrso por pozo e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, la placa se lava tres veces con 250 microlitros por pozo de búfer de lavado. A cada pozo en la placa de ensayo, añadir 15 microlitros de muestras (por duplicado) y 10 microlitros de agua. Iniciar la reacción de quinasa añadiendo 25 microlitros por pozo de 2X búfer de quinasa (1X Búfer de Reacción de Quinasa (100 mM Hepes (pH 7.5), 20 mM MgCl2, 5 mM NaF, 0.2 mM ortovanadato sódico, 1 mM DTT [añadir fresco], 1 mM ATP [añadir fresco] a cada pozo. Incluir quinasa ERK1/2 purificada, activada y desactivada (Stratagene, #206110 y #206120, respectivamente) como controles). Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora (la reacción es lineal entre 1 y 3 horas).
Tras la incubación del lisado o los controles de quinasa con la proteína de fusión GST-Elk-1, lavar la placa tres veces con 250 microlitros por pozo de búfer de lavado. A continuación, diluir antifosfo-anticuerpo Elk 1 1:1000 (Cell Signaling Technologies, #9181) con diluyente de anticuerpo (0.1% BSA, PBST), y añadir 50 microlitros a cada pozo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
Posteriormente, lavar la placa tres veces con 250 microlitros por pozo de búfer de lavado. Diluir Ig anti-conejo de cabra Zymaxfosfatasa alcalina (Zymed Laboratories Inc., #81-6122) 1:4000 con diluyente de anticuerpo. Transferir 50 microlitros por pozo de anticuerpo diluido a cada pozo, e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Lavar tres veces con 250 microlitros por pozo de búfer de lavado. A continuación, añadir 50 microlitros por pozo BM quimioluminiscente sustrato AP ELISA (Roche Molecular Biochemicals, #1759779) preparado de acuerdo con las “direcciones ELISA” del envase. Incubar a temperatura ambiente durante 12 minutos antes de leerlo en un luminómetro. Ejemplo 36 Modelo de Cámara Dorsal para Estudiar el Efecto de Anticuerpos VEGF-2 de Vascularización Tumoral
La caracterización de los múltiples aspectos de la fisiología microvascular en sistemas con ventana transparente ha facilitado valiosos datos sobre angiogénesis, inflamación, transporte microvascular, rechazo de tejidos, y fisiología tumoral (Melder, R. J et al., Biophys.J. 69: 2131-2138, (1995); Fukumura, D. et al Cáncer Res. 55: 4824-4829, (1995); Yamada, S. et al., Blood, 86: 3487-3492, (1995); Yamada, S., et al., Blood, 86: 4707-4708, (1995); Melder, R.J., et al., Microvas.Res. 50, 35-44, (1995); Melder, R.J. et al., Nature Medicine 2:992-997, (1996); Dellian, M., et al., Am. J. Path. 149: 59-71, (1996); and Leunig M., et al., Cancer Res 52: 6553-60 (1992)). Este ensayo puede ser usado para comprobar la hipótesis de que los polipéptidos VEGF-2 administrados directamente al compartimiento intersticial de la piel o superficie de la piamadre provocará un cambio en la estructura y función de la microvasculatura. Estos estudios caracterizarán de manera específica actividades sobre la vasculatura existente en el interior de la ventana de observación y vasculatura neurogénica que se desarrolla en respuesta a estas proteínas en geles implantados. Se harán las siguientes observaciones:
a) longitud, diámetro y densidad de la red vascular existente en la piel o superficie de la piamadre en respuesta al tratamiento con polipéptidos VEGF-2;
b) velocidad de flujo sanguíneo y flujo de leucocitos en la base vascular tratada;
c) la frecuencia de leucocitos rodantes y adherentes en la base vascular tratada;
d) la permeabilidad de la red vascular existente en la piel o superficie de piamadre en respuesta al tratamiento con polipéptidos VEGF-2;
e) la respuesta angiogénica a polipéptidos VEGF-2 en discos implantados de colágeno en el interior de las preparaciones con ventana;
f) velocidad de flujo sanguíneo, flujo de leucocitos y frecuencia de leucocitos rodantes y adherentes en los discos implantados de colágeno en el interior de las preparaciones con ventana;
g) la permeabilidad de redes vasculares angiogénicas en respuesta a polipéptidos VEGF-2 en discos implantados de colágeno preparaciones con ventana craneal o cutánea.
Para este ensayo, se usaron ratones suizos nu/nu. La ventaja de usar ratones suizos nu/nu son varias, entre las que se incluyen a) reducir la posibilidad de respuesta inmune durante el periodo de estudio, b) mejorar la óptica del sistema debido a la falta de pigmentación y pelo en la piel, c) mantener consistencia histórica con estudios previos similares.
Cada experimento y control de grupo tendrá siete ratones de control. Se prefiere a los ratones macho porque son más grandes y tendrán más piel para implantes quirúrgicos de ventanas. Las muestras para las pruebas incluirán polipéptidos VEGF-2 y controles de proteína recombinante. Cada estudio que examina las actividades de las proteínas sobre camas vasculares existentes consistirá en cinco grupos experimentales: Grupo 1: Muestra del test (dosis 1) en búfer Grupo 2: Muestra del test (dosis 2) en búfer Grupo 3: Muestra del test (dosis 3) en búfer Grupo 4: Búfer y control BSA Grupo 5: Control Positivo (bFGF, 10 ng)
Las soluciones estériles de proteína se administrarán en un volumen de 10 μl directamente a la preparación de la ventana de los ratones con ventanas en la piel dorsal. Como alternativa, los discos estériles de colágeno/sucralfato que contienen las concentraciones de proteínas listadas anteriormente se colocaran en las preparaciones de las ventanas para evaluar el potencial angiogénico. Las soluciones estériles de anticuerpo se administrarán por vía intravenosa.
Estos experimentos están diseñados para testar la hipótesis de que los polipéptidos VEGF-2 administrados al compartimiento extravascular de la piel provocarán un cambio en la estructura y función de los capilares y vénulas postcapilares existentes. La administración de polipéptidos en discos de colágeno examinará el potencial para modular angiogénesis.
Métodos
Preparación Animal
Los procedimientos quirúrgicos se llevan a cabo en ratones suizos desnudos. Para los procedimientos quirúrgicos, los animales (20-30 g) se anestesian con una inyección sub-cutánea de un cocktail de 90 mg Ketamina y 9 mg Xilacina por kg de peso corporal. Todos los procedimientos quirúrgicos se llevan a cabo bajo condiciones asépticas en una cámara de flujo laminar horizontal, con todo el equipo estando el vapor o gas químicamente esterilizados. La esterilidad de la mesa se mantiene mediante luces U.V cuando no se usa. Durante la operación, la temperatura corporal de los animales se mantiene constante por medio de una superficie calentada de trabajo. Todos los ratones se colocan de manera individual en jaulas micro-aislantes y todas las manipulaciones se realizan en cámaras de flujo laminar. Tras la operación, se observa los animales en busca de cualquier molestia/problema. El criterio para molestia incluye, aunque no se limita a: pérdida de peso corporal (20%), inhabilidad para caminar, pruebas de auto-mutilación, o inhabilidad para comer o beber. Se usa buprenorfina
(0.1 mg/kg cada 12 horas) como analgésico durante 3 días tras la implantación. Los animales que musetren cualquier síntoma de malestar durante 3 días tras la operación son sometidos a eutanasia con inhalación de CO2.
Implantación de Cámara Dorsal Cutánea:
Las cámaras se implantan como se describe en Leunig et al., Cancer Res 52:65536560 (1992). En resumen, la cámara se posiciona de modo que la cámara se encuentre sobre una capa doble de piel (es decir, un “pellizco de piel”) que se extiende por encima de la superficie dorsal. El grosor completo de un lado del colgajo de piel dorsal se retira en un área circular de ~15 mm de diámetro. El segundo lado del colgajo (consistente en epidermis, fascia y músculo estriado) se posiciona sobre el marco de la cámara y la abertura (“ventana”) se cubre con un cubreobjetos estéril de cristal. La cámara se mantiene en su lugar con sutura (seda, 4-0) que pasa a través de la piel extendida y de agujeros a lo largo de la parte superior de la cámara. Se deja que los ratones se recuperen durante 72 horas.
Tras la recuperación, cada ratón es colocado en un tubo transparente de policarbonato (25 mm de diámetro) para el tratamiento. Los cubreobjetos se retiran cuidadosamente y se añaden los factores de tratamiento. Tras la adición de los factores de tratamiento, un nuevo cubreobjeto se colocará sobre la superficie de visión. Se realizan mediadas mediante un análisis morfométrico usando un CCD y cámara SIT, un grabador de vídeo S-VHS y adquisición directa de imagen digital. Los ratones con cámaras implantadas se observan durante 28 días, tal y como se indica en los gráficos de flujo. Medidas
Se anestesia a los ratones con inyección s.c de un cocktail de 90 mg Ketamina y 9 mg Xilacina por kg de peso corporal, y a continuación se les coloca sobre un montaje con tabla de plástico estéril. A continuación, se realizarán mapas vasculares de la ventana usando transiluminación (ventana cutánea dorsal) o siguiendo una inyección de 100 μl de BSA-FITC (1 mg/ml, i.v) y epi-iluminación (ventana craneal). Las grabaciones con vídeo de camas vasculares se hacen en un rango de magnificaciones (de 1X a 4X) así como marcos digitales para un análisis fuera de línea. Las imágenes se cuantifican para densidad vascular, velocidad de flujo sanguíneo y dimensiones vasculares (para análisis de rango de deformación). Además, las infecciones de leucocitos circulantes se evalúan con una inyección de 10 μl de Rodamina 6-G seguida de microscopia con vídeo de los capilares y vénulas post-capilares. Las medidas de permeabilidad se hacen desde un análisis autónomo de imágenes de transporte BSA a los 5, 10, 15 y 20 minutos tras la inyección de BSA-FITC. Las determinaciones de densidad capilar de camas vasculares normales y angiogénicas se hacen desde análisis autónomos de cintas de vídeo. Hay cinco conjuntos de observaciones de ratones experimentales y de controles en intervalos de siete días (un total de 28 días). Ejemplo 37 Modelo de Cámara Dorsal de en Carcinoma de Colon LS174 T
El carcinoma de colon, LS174T, produce/segrega el polipéptido VEGF-2. Por lo tanto, es particularmente interesante testar si el tratamiento con anticuerpos VEGF-2 ralentiza o detiene el crecimiento de tumor LS174T o si incluso afecta a la regresión del tumor LS174T. Para comprobar esta hipótesis el modelo de cámara dorsal descrito anteriormente pude adaptarse para estudiar el crecimiento tumoral y vascularización en el interior de la cámara dorsal.
Tres días después de implantar una cámara dorsal, se inoculan 2 microlitros de suspensión de célula tumoral LS174T en gránulos (que contiene aproximadamente 2 x 105 células) en la capa de músculo estriado del tejido subcutáneo en la cámara. El tumor inoculado se deja reposar durante un periodo de tiempo y se deja que crezca hasta un tamaño específico (p. ej., 4-6 mm de diámetro) antes de empezar con el tratamiento VEGF-2.
Inicialmente, a los ratones se les inyecta 0.4 miligramos de anticuerpo VEGF-2, y a continuación inyecciones de 0.2 miligramos de anticuerpo VEGF-2 administradas en intervalos de cinco días durante 30 días. Las inyecciones pueden administrarse intraperitonealmente (i.p.) o intravenosamente (i.v.).
Los parámetros que pueden medirse para evaluar el efecto del tratamiento con VEGF-2 sobre el crecimiento de tumores incluyen tamaño de tumor y densidad vascular (endotelial y linfática).
Además, este ensayo puede modificarse de manera sencilla para comprobar el efecto del tratamiento con VEGF-2 sobre otros tumores, con independencia de su producción de polipéptido VEGF2 endógeno. Ejemplo 38 Efecto de Tratamiento con Anticuerpo VEGF-2 sobre Tumor MDA-MB-231
La línea celular MDA-MB-231(ATCC # HTB-26) es una línea celular del cáncer de pecho. El siguiente ensayo puede usarse para comprobar si el tratamiento con anticuerpos VEGF-2 ralentiza o detiene el crecimiento del tumor MDA-MB-231, o efectúa una regresión del tumor MDA-MB-231. Mientras que el siguiente ejemplo explica resumidamente un protocolo experimental que incluye células MDA-MB-231, los expertos en la técnica podrán fácilmente modificar este protocolo para comprobar el efecto del tratamiento con anticuerpos VEGF-2 sobre otros tipos de tumores.
5 El día cero, un millón de células MDA-MB-231 se inyectan a los ratones en los panículos mamarios. El tumor implantado se deja crecer hasta 2 mm x 2 mm que normalmente tarda 5 días. Después de que el tumor haya alcanzado el tamaño 2 x 2 mm2, a un animal se le da una dosis inicial de 0f 0.4 miligramos de anticuerpo VEGF-2. A
10 partir de entonces, se administran 0.2 miligramos de anticuerpo VEGF-2 en los días 5 y 10 después de la primera inyección. Además, animales en ciertos grupos experimentales pueden también tratarse con 5 mg/kg de Taxol (u otra dosis adecuada de otro agente quimioterapéutico) a diario.
15 Numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a la luz de las descripciones presentadas y, por lo tanto, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención puede practicarse de manera diferente a la aquí particularmente descrita.
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LISTADO SECUENCIAL
<110> Human Genome Sciences, Inc.
<120> Vascular Endothelial Growth Factor-2
<130> PF112P9PCT
<150> 60/283,385
<151> 2001-04-13
<150> 60/350,366
<151> 2002-01-24
<160> 85
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1674
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> sig_peptide
<222> (12)..(80)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (12)..(1268)
<223>
<220>
<221> mat_peptide
<222> (81)..()
<223>
<400> 1 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 2
<211> 419
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 3
<211> 1525
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> sig_peptide
<222> (71)..(142)
<223>
<220>
<221> CDS
<222> (71)..(1120)
<223>
<220>
<221> mat_peptide
<222> (143)..()
<223>
<400> 3
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35 imagen1 imagen1
<210> 4
<211> 350
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 5
<211> 196
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5 imagen1
<210> 6
<211> 241
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6 imagen2 imagen1
<210> 7
<211> 232
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7 imagen1
.
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X is equal to any of the naturally occurring amino acids
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X is equal to any of the naturally occurring amino acids
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X is equal to any of the naturally occurring amino acids
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X is equal to any of the naturally occurring amino acids
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X is equal to any of the naturally occurring amino acids
<400> 8 imagen1
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220> <223> M13-2 Reverse Primer
<400> 9 atgcttccgg ctcgtatg 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> M13-2 forward primer
<400> 10 gggttttccc agtcacgac 19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> VEGF primer F4
<400> 11 ccacatggtt caggaaagac a 21
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Forward primer used to amplify DNA encoding truncated VEGF2 prot ein
<400> 12 tgtaatacga ctcactatag ggatcccgcc atggaggcca cggcttatgc 50
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Reverse primer used to amplify DNA encoding truncated VEGF2 protein
<400> 13 gatctctaga ttagctcatt tgtggtct 28
<210> 14
<211> 27 5 <212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Forward primer used to amplify DNA encoding truncated VEGF2 prot ein
10 <400> 14 cgcggatcca tgactgtact ctaccca 27
<210> 15
<211> 60
<212> DNA 15 <213> Artificial sequence
<220>
<223> Reverse primer used to amplify DNA encoding truncated VEGF2 prot ein
<400> 15 20 cgctctagat caagcgtagt ctgggacgtc gtatgggtac tcgaggctca tttgtggtct 60
<210> 16
<211> 3974
<212> DNA
<213> Escherichia coli 25 <400> 16
30 imagen1 imagen1 imagen1
<210> 17
<211> 112
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(112)
<223> regulatory elements of the pHE4a promoter

<400> 17

imagen1

<210> 18

<211> 419

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Forward primer used in cloning DNA encoding VEGF-2 T103L215 and VEGF-2 T103-R227

<400> 19 gcagcacata tgacagaaga gactataaaa 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Reverse primer used in cloning DNA encoding VEGF-2 T103L215

<400> 20 gcagcaggta cctcacagtt tagacatgca 30

<210> 21

<211> 30

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Reverse primer used in cloning DNA encoding VEGF-2.T103R227

<400> 25 gcagcatcta gatcaacgtc taataatgga atgaac 36

<210> 26

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Forward primer used to amplify truncated VEGF-2

<400> 26 gatcgatcca tcatgcactc gctgggcttc ttctctgtgg cgtgttctct gctcg 55

<210> 27

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Reverse primer used to amplify truncated VEGF-2

<400> 27 gcagggtacg gatcctagat tagctcattt gtggtcttt 39

<210> 28

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Forward primer used in cloning VEGF-2 M1-M263

<400> 28 gactggatcc gccaccatgc actcgctggg cttcttctc 39

<210> 29

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Reverse primer used in cloning VEGF-2 M1-M263

<400> 29 gactggtacc ttatcacata aaatcttcct gagcc 35

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Forward primer used in cloning VEGF-2 M1-D311

<400> 30 gactggatcc gccaccatgc actcgctggg cttcttctc 39

<210> 31

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Reverse primer used in cloning VEGF-2 M1-D311

<400> 31 gactggtacc ttatcagtct agttctttgt gggg 34

<210> 32

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Forward primer used in cloning VEGF-2 M1-Q367

<400> 32 gactggatcc gccaccatgc actcgctggg cttcttctc 39

<210> 33

<211> 37 <212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Reverse primer used in cloning VEGF-2 M1-Q367

<400> 33 gactggtacc tcattactgt ggactttctg tacattc 37

<210> 34

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Forward primer used for cloning DNA encoding VEGF-2 T103L215

<400> 34 gcagcaggat ccacagaaga gactataaaa tttgctgc 38

<210> 35

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Reverse primer used for cloning DNA encoding VEGF-2 T103L215

<400> 35 cgtcgttcta gatcacagtt tagacatgca tcggcag 37

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VH Primer Hu VH1-5’

<400> 36 caggtgcagc tggtgcagtc tgg 23

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VH Primer Hu VH2-5’

<400> 37 caggtcaact taagggagtc tgg 23

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VH Primer Hu VH3-5’

<400> 38 gaggtgcagc tggtggagtc tgg 23

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VH Primer Hu VH4-5’

<400> 39 caggtgcagc tgcaggagtc ggg 23

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VH Primer Hu VH5-5’

<400> 40 gaggtgcagc tgttgcagtc tgc 23

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VH Primer Hu VH6-5’ <400> 41 caggtacagc tgcagcagtc agg 23

<210> 42

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VH Primer Hu JH1,2-5’

<400> 42 tgaggagacg gtgaccaggg tgcc 24

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VH Primer Hu JH3-5’

<400> 43 tgaagagacg gtgaccattg tccc 24

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VH Primer Hu JH4,5-5’

<400> 44 tgaggagacg gtgaccaggg ttcc 24

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VH Primer Hu JH6-5’

<400> 45 tgaggagacg gtgaccgtgg tccc 24

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Vkappa1-5’

<400> 46 gacatccaga tgacccagtc tcc 23

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Vkappa2a-5’

<400> 47 gatgttgtga tgactcagtc tcc 23

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Vkappa2b-5’

<400> 48 gatattgtga tgactcagtc tcc 23

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Vkappa3-5’

<400> 49 gaaattgtgt tgacgcagtc tcc 23

<210> 50

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence <220>

<223> VL Primer Hu Vkappa4-5’

<400> 50 gacatcgtga tgacccagtc tcc 23

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Vkappa5-5’

<400> 51 gaaacgacac tcacgcagtc tcc 23

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Vkappa6-5’

<400> 52 gaaattgtgc tgactcagtc tcc 23

<210> 53

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Vlambdal-5’

<400> 53 cagtctgtgt tgacgcagcc gcc 23

<210> 54

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Vlambda2-5’

<400> 54 cagtctgccc tgactcagcc tgc 23

<210> 55

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Vlambda3-5’

<400> 55 tcctatgtgc tgactcagcc acc 23

<210> 56

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Vlambda3b-5’

<400> 56 tcttctgagc tgactcagga ccc 23

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Vlambda4-5’

<400> 57 cacgttatac tgactcaacc gcc 23

<210> 58

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Vlambda5-5’

<400> 58 caggctgtgc tcactcagcc gtc 23

<210> 59

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Vlambda6-5’

<400> 59 aattttatgc tgactcagcc cca 23

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Jkappa1-3’

<400> 60 acgtttgatt tccaccttgg tccc 24

<210> 61

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Jkappa2-3’

<400> 61 acgtttgatc tccagcttgg tccc 24

<210> 62

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Jkappa3-3’

<400> 62 acgtttgata tccactttgg tccc 24

<210> 63

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220> <223> VL Primer Hu Jkappa4-3’

<400> 63 acgtttgatc tccaccttgg tccc 24

<210> 64

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Jkappa5-3’

<400> 64 acgtttaatc tccagtcgtg tccc 24

<210> 65

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Jlambda1-3’

<400> 65 cagtctgtgt tgacgcagcc gcc 23

<210> 66

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Jlambda2-3’

<400> 66 cagtctgccc tgactcagcc tgc 23

<210> 67

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Jlambda3--3’

<400> 67 tcctatgtgc tgactcagcc acc 23

<210> 68

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Jlambda3b-3’

<400> 68 tcttctgagc tgactcagga ccc 23

<210> 69

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Jlambda4-3’

<400> 69 cacgttatac tgactcaacc gcc 23

<210> 70

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Jlambda5-3,

<400> 70 caggctgtgc tcactcagcc gtc 23

<210> 71

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> VL Primer Hu Jlambda6-3’

<400> 71 aattttatgc tgactcagcc cca 23

<210> 72

<211> 250

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 72

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<210> 73

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

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<210> 74

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<211> 251

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 75 <210> 76

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<211> 253

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 76

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<210> 77

<211> 244

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77

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<210> 78

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 78 <210> 79

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<211> 247

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79 <210> 80

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<211> 246

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 80

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<210> 81

<211> 247

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 81 <210> 82

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<211> 235

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 82

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<210> 83

<211> 235

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 83

10

15

20

25

30

35

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<210> 84

<211> 741

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 84

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<210> 85

<211> 738

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 85

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Claims (1)

1. R E I V I N D I C A C I O N E S

   1ª. – Un anticuerpo que de manera inmunoespecífica se enlaza con un polipéptido VEGF-2, consistiendo dicho anticuerpo en una secuencia de aminoácido que es al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo consistente en:

   (a)

   la secuencia de aminoácido del dominio VH de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:79; y

   (b)

   la secuencia de aminoácido del dominio VH del anticuerpo expresado por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Depósito ATCCC PTA-4095.

   2ª. – El anticuerpo de la reivindicación 1 que consiste en una secuencia de aminoácido que es 100% idéntica a una secuencia de aminoácido como la definida en la reivindicación 1 (a) o (b).

   3ª. – El anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2, que además consiste en una secuencia de aminoácido que es al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo consistente en:

   (a)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:79;

   (b)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL del anticuerpo expresado por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Depósito ATCCC PTA-4095;

   (c)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:80;

   (d)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:81;

   (e)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL del anticuerpo expresado por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Depósito ATCCC PTA-4179;

   (f)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:82;

   (g)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL del anticuerpo expresado por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Depósito ATCCC PTA-4096;

   (h)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:83;

   (i)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL del anticuerpo expresado por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Depósito ATCCC PTA-4180;

   (j)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:72;

   (k)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:73;

   (l)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:74;

   (m)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:75;

   (n)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:76;

   (o)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:77; y

   (p)

   la secuencia de aminoácido del dominio VL de un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:78.

   4ª. – El anticuerpo de la reivindicación 3 que consiste en una secuencia de aminoácido que es 100% idéntica a una secuencia de aminoácido como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 3

   (a)

   a (p).

   5ª. – El anticuerpo de la reivindicación 3, donde el dominio VH es al menos 95% idéntico a la secuencia de aminoácido del dominio VH del anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:79 y el dominio VL es al menos 95% idéntico a la secuencia de aminoácido del dominio VL del anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:79.

   6ª. – El anticuerpo de la reivindicación 5, donde el dominio VH es 100% idéntico a la secuencia de aminoácido del dominio VH del anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:79 y el dominio VL es 100% idéntico a la secuencia de aminoácido del dominio VL del anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:79.

   7ª. – El anticuerpo de la reivindicación 3, donde el dominio VH es al menos 95% idéntico a la secuencia de aminoácido del dominio VH del anticuerpo expresado por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Depósito ATCCC PTA-4095 y el dominio VL es al menos 95% idéntico a la secuencia de aminoácido del dominio VL del anticuerpo expresado por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Depósito ATCCC PTA4095.

   8ª. – El anticuerpo de la reivindicación 7, donde el dominio VH es 100% idéntico a la secuencia de aminoácido del dominio VH del anticuerpo expresado por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Depósito ATCCC PTA-4095 y el dominio VL es 100% idéntico a la secuencia de aminoácido del dominio VL del anticuerpo expresado por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Depósito ATCCC PTA4095.

   9ª. – El anticuerpo de la reivindicaciones 1 a 8, que además consiste en un dominio constante VH seleccionado del grupo consistente en:

   (a)un dominio constante IgM

   (b)un dominio constante IgG; y

   (c)un dominio constante IgA. 10ª. – El anticuerpo de la reivindicación 9, donde el dominio constante VH es un dominio constante VH humano.

   11ª. – El anticuerpo de la reivindicación 10, donde el dominio constante VH humano se selecciona del grupo consistente en un dominio constante IgG1, un dominio constante IgG2, un dominio constante IgG3 y un dominio constante IgG4.

   12ª. – El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, que además contiene un dominio constante VL seleccionado del grupo consistente en:

   (a)un dominio constante kappa; y

   (b)un dominio constante lambda.

   13ª. – El anticuerpo de la reivindicación 12, donde el dominio constante VL es un dominio constante VL humano.

   14ª. – El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el polipéptido VEGF-2 se selecciona del grupo consistente en:

   (a)

   un polipéptido VEGF-2 que contiene los aminoácidos 1-419 de SEQ ID NO:18;

   (b)

   un polipéptido VEGF-2 que contiene los aminoácidos 32-419 de SEQ ID NO:18;

   (c)

   un polipéptido VEGF-2 que contiene los aminoácidos 103227 de SEQ ID NO:18;

   (d)

   un polipéptido VEGF-2 que contiene los aminoácidos 112227 de SEQ ID NO:18;

   (e)

   un polipéptido dimérico VEGF-2 que consiste en dos polipéptidos consistiendo cada uno de ellos en aminoácidos 103-227 de SEQ ID NO:18;

   (f)

   un polipéptido dimérico VEGF-2 que consiste en dos polipéptidos consistiendo cada uno de ellos en aminoácidos 112-227 de SEQ ID NO:18;

   (g)

   la secuencia de aminoácido de la forma segregada del polipéptido VEGF-2 de SEQ ID NO:18; y

   (h)

   la secuencia de aminoácido de la forma segregada del polipéptido VEGF-2 codificada por el cADN contenido en el Número de Depósito ATCC 97149.

   15ª. – El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que se enlaza de manera inmunoespecífica con VEGF-2 en un Western blot o en un ELISA.

   16ª. – El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo consistente en:

   (a)

   un fragmento Fab;

   (b)

   un fragmento Fab’;

   (c)

   un F(ab’) 2;

   (d)

   un Fd;

   (e)

   una cadena Fv sencilla;

   (f)

   un Fv enlazado con disulfato;

   (g)

   un anticuerpo monoclonal;

   (h)

   un anticuerpo humano; y

   (i)

   un anticuerpo humanizado.

   17ª. – El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde dicho anticuerpo tiene una constante de disociación (KD) de 10-9 M o menos.

   18ª. – El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde dicho anticuerpo tiene una constante de disociación seleccionada del grupo consistente en:

   (a) una constante de disociación de 10-3/seg o menos; y

   (b) una constante de disociación de 10-4/seg o menos. 19ª. – El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde dicho anticuerpo se fusiona con un polipéptido heterólogo. 20ª. – El anticuerpo de la reivindicación 19, donde el polipéptido heterólogo es albúmina de suero humano.

   21ª. – El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, donde dicho anticuerpo se enlaza o conjuga con una etiqueta detectable.

   22ª. – El anticuerpo de la reivindicación 21, donde la etiqueta detectable es una etiqueta radioactiva.

   23ª. – El anticuerpo de la reivindicación 22, donde la etiqueta radioactiva es 125I, 131I, 111In, 90Y, 99Tc, 177Lu, 166Ho o 153Sm.

   24ª. – El anticuerpo de la reivindicación 21, donde la etiqueta detectable es una enzima, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, o una etiqueta bioluminiscente.

   25ª. – El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde el anticuerpo es biotinilado.

   26ª. – El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, donde dicho anticuerpo es un antagonista de VEGF-2.

   27ª. – El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, donde dicho anticuerpo tiene una actividad seleccionada del grupo consistente en:

   (a)

   neutralización de VEGF-2;

   (b)

   inhibición de enlace de VEGF-2 con flk-1;

   (c)

   inhibición de enlace de VEGF-2 con flt-4;

   (d)

   inhibición de fosforilación inducida por VEGF-2 de Elk-1;

   (e)

   inhibición de proliferación inducida por VEGF-2 de células endoteliales vasculares;

   (f)

   inhibición de proliferación inducida por VEGF-2 de células endoteliales linfáticas; e

   (g) inhibición de angiogénesis. 28ª. – El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, donde dicho anticuerpo es un agonista de VEGF-2.

   29ª. – El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, donde dicho anticuerpo tiene una actividad seleccionada del grupo consistente en:

   (a) inhibición de crecimiento tumoral; y

   (b)inhibición de metástasis tumoral.

   30ª. – El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, donde dicho anticuerpo se conjuga con un agente terapéutico o citotóxico.

   31ª. – El anticuerpo de la reivindicación 30, donde el agente terapéutico o citotóxico es un antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citoquina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, una toxina o un agente apoptótico.

   32ª. – Un anticuerpo que se enlaza con el mismo epítope en VEGF-2 como un anticuerpo seleccionado del grupo consistente en:

   (a)

   un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:79; y

   (b)

   un anticuerpo expresado por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Depósito ATCC PTA-4095.

   33ª. – Un anticuerpo que de manera competitiva inhibe el enlace de un anticuerpo seleccionado del grupo consistente en:

   (a)

   un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:79; y

   (b)

   un anticuerpo expresado por la línea celular de hibridoma depositada bajo el Número de Depósito ATCC PTA-4095.

   34ª. – El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en un portador farmacéuticamente aceptable.

   35ª. -Un polinucleótido que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, 26 a 29, 32 y 33.

   36ª. – Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 35.

   37ª. – Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 36 o el polinucleótido de la reivindicación 35.

   38ª. – Una línea celular fabricada para expresar el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

   39ª. – La línea celular de la reivindicación 38, donde las células son células NSO o células CHO.

   40ª. – Un método para hacer un anticuerpo que consiste en:

   (a)

   expresar el anticuerpo codificado por el polinucleótido de la reivindicación 35; y

   (b)

   recuperar dicho anticuerpo.

   41ª. – Un método para detectar la expresión de un polipéptido VEGF-2 que consiste en:

   (a)

   someter a ensayo la expresión de un polipéptido VEGF-2 en una muestra biológica de un individuo usando el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34; y

   (b)

   comparar el nivel de un polipéptido VEGF-2 con un nivel estándar de un polipéptido VEGF-2.

   42ª. – Un método para detectar, diagnosticar, pronosticar, o controlar cánceres y otros trastornos hiperproliferativos que consiste en:

   (a)someter a ensayo la expresión de un polipéptido VEGF-2 en una muestra biológica de un individuo usando el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34; y

   (b) comparar el nivel de un polipéptido VEGF-2 con un nivel estándar de un polipéptido VEGF-2. 43ª. – Un kit que contiene el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34.

   44ª. – El kit de la reivindicación 49 que además contiene un anticuerpo de control.