CN102816239A - 抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY与偶联物及其制备方法以及多联试剂盒,针对现有癌症治疗技术中存在的副作用很大和无法阻止复发的问题,本发明的复合IgY及其偶联物具有生物导向性,可特异性地识别并穿透细胞膜进入肿瘤细胞发生作用,一方面能直接抑制肿瘤部位端粒酶活性水平,阻滞肿瘤生长和扩散;一方面又可抑制p185erbB2的过量表达,预防和治疗p185erbB2高表达的转移性肿瘤。所制成的复合IgY制剂除了对大部分癌症有治疗作用外,还可用于癌症高危人群的预防。本发明的多联检验试剂盒不但提高了检测的特异性和准确性,还可诊断肿瘤发生的具体部位,为较准确的预警癌症并提早干预和治疗创造了条件。
Description
技术领域
本发明涉及人常见肿瘤的治疗技术,尤其涉及到一种抗端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)和人表皮生长因子受体(humanepidermalgrowth factor receptor-2,HER2)特异性复合IgY及其偶联物、制备方法和多联试剂盒。
背景技术
恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。癌症与心脑血管疾病和意外事故一起,构成当今世界所有国家三大死亡原因。目前全国癌症死亡已位居各类死因的第一位,每死亡5人,即有1人死于癌症。我国农村地区癌症死亡率上升速度明显高于城市,癌症高发区也多分布在农村和西部地区。癌症已经成为我国农民因病致贫、因病返贫的重要原因。因此,世界卫生组织(WHO)和各国政府卫生部门都把攻克癌症列为一项首要任务。
目前世界各国对癌症主要采用手术治疗、放射治疗、化学治疗、激素治疗、基因治疗和免疫治疗等方法进行治疗;其中手术治疗、放射治疗、化学治疗已成为主要手段。手术治疗是癌症治疗中最古老的方法,但不能解决复发问题;放射治疗、化学治疗不但毒副作用相当大,而且也同样存在癌细胞转移、扩散和复发的难题。众所周知,大多数癌病患者都是死于癌症的复发。
因此,研发一种更加安全有效的治疗癌症的新方法,成为全人类的迫切需求,也是摆在全球医药科学界的重大课题。
长期以来普遍认为恶性肿瘤是由破坏细胞正常生长调节的多种基因突变引起的,但随着对恶性肿瘤发病机制研究的深入,发现端粒酶的被激活才是恶性肿瘤发生的先决条件。
科学家Harley率先在1991年提出癌症的“端粒-端粒酶假说”,指出:正常细胞由于端粒的不断缩短必定诱发细胞凋亡;而癌细胞复活了已经休眠的端粒酶基因,因而获得永生而无限增殖。
90年代,陆续在人类80-90%的癌症中发现了绝大部分正常细胞不具有的端粒酶。
美国加利福尼亚旧金山大学的伊丽莎白-布莱克本(Elizabeth Blackburn)、美国巴尔的摩约翰-霍普金斯大学医学院的卡罗尔-格雷德(Carol Greider)和美国哈佛医学院的杰克-绍斯塔克(Jack Szostak)等三位美国科学家凭借“发现端粒和端粒酶是如何保护染色体的”这一成果,揭开了人类罹患癌症等严重疾病的奥秘。他们破解了在大多数癌症生长过程中起着关键作用的端粒酶的秘密,这为研发新型抗癌药物开辟了新途径,是基础癌症生物学的一大突破。他们的研究成果得到国际医学界的高度评价和重视,获得了2009年诺贝尔生理学和医学奖。
大量研究证明,“端粒酶”在几乎所有人类癌症肿瘤中均具活性,而在绝大部分正常细胞中则不具活性;也就是说,端粒酶的激活是许多恶性肿瘤发生的先决条件。这一发现提示医学科学家,只要能有效抑制端粒酶,就能对抗所有癌症,且较少副作用。
为了弥补目前普遍使用的化疗和放疗不仅作用于癌细胞也作用于正常细胞而副作用十分严重的缺陷;国际医药界根据“端粒酶”的理论,设计合成了一系列“端粒酶抑制剂”用于治疗肿瘤。这种“端粒酶抑制剂”通常只作用于癌细胞而不会影响正常细胞,因此,副作用比化疗和放疗少得多。
不过,虽然“端粒酶抑制剂”在严重副作用方面比普通化疗药有了很大改进;但是,“端粒酶抑制剂”也存在使生殖细胞和造血干细胞的端粒酶活性也遭到抑制的副作用。另外,“端粒酶抑制剂”在抑制端粒酶活性的同时,会激活非端粒酶依赖途径,从而使“端粒酶抑制剂”本身失去活性;因此,“端粒酶抑制剂”同其他抗肿瘤药物一样也有耐药性的问题。这些都直接影响了这种新药的应用前景。
鉴于目前的客观现状,完全有必要研发一种更好的方法,突破现有的化疗方法存在的副作用和耐药性两大瓶颈;并解决癌症预防和阻止复发的两大难题。
发明内容
针对现有癌症治疗技术中存在的副作用和耐药性严重以及无法阻止复发,也不能预防癌症的问题,本发明要提供一种抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY,一种抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性IgY,一种抗端粒酶逆转录酶、人表皮生长因子受体及人肿瘤抗原特异性复合IgY,一种抗端粒酶RNA(hTR)特异性IgY,一种抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性IgY,抗人肿瘤复合全抗原特异性IgY和多种抗人肿瘤抗原特异性IgY,以及这些特异性IgY偶联物和制备方法以及相关的IgY多联试剂盒。
本发明提供了一种抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法,包括以下步骤:
(A1)基因重组端粒酶逆转录酶、人表皮生长因子受体蛋白和/或端粒酶RNA并纯化;
和/或培养人体组织肿瘤传代细胞并制备人体组织癌细胞蛋白;
(A2)选取所述端粒酶逆转录酶、人表皮生长因子受体蛋白、端粒酶RNA和/或人体组织癌细胞蛋白中的至少一种,作为抗原成分,并将所述抗原成分按(1-10)∶(10-1)比例加入福氏佐剂,再高速匀化处理形成油包水乳液,制得抗原;
(A3)采用淘汰法筛选具有高免疫应答能力的选择产蛋禽类,用以上抗原液免疫所选择的高免疫应答能力的产蛋禽类,再拣取被选出之产蛋禽类所产的免疫蛋;
(A4)对所述免疫蛋进行消毒,取蛋黄,制备特异性IgY粗提物;
(A5)将所述IgY粗提物通过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化,得特异性IgY纯品。
在本发明所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法中,所述步骤(A1)中所述的人体组织癌细胞为人胃癌细胞、人口腔癌细胞、人食道癌细胞、人鼻咽癌细胞、人肺癌细胞、人结肠癌细胞、人大肠癌细胞、人直肠癌细胞、人宫颈癌细胞、皮肤癌细胞、乳腺癌细胞以及淋巴癌细胞中的单一人体组织癌细胞或多种复合的人体组织癌细胞。
在本发明所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法中,所述步骤(A2)中选取端粒酶逆转录酶作为抗原成分,所述步骤(A5)中制备的特异性IgY为抗端粒酶逆转录酶特异性IgY。
在本发明所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法中,所述制备步骤(A2)中选取人表皮生长因子受体作为抗原成分,所述步骤(A5)中制备的特异性IgY为抗人表皮生长因子受体特异性IgY。
在本发明所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法中,所述制备步骤(A2)中选取端粒酶RNA作为抗原成分,所述步骤(A5)中制备的特异性IgY为抗端粒酶RNA特异性IgY。
在本发明所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法中,所述制备步骤(A2)中选取端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体按(1-10)∶(10-1)混合均匀作为抗原成分,所述步骤(A5)中制备的特异性IgY为抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY。
在本发明所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法中,所述步骤(A2)中选取端粒酶逆转录酶、人表皮生长因子受体、以及所述人体组织癌细胞蛋白混合均匀作为抗原成分,所述步骤(A5)中制备的特异性IgY为抗端粒酶逆转录酶、人表皮生长因子受体及人肿瘤抗原特异性复合IgY。
在本发明所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法中,所述人体组织癌细胞蛋白为单一人体组织癌细胞,则所述步骤(A2)中选取端粒酶逆转录酶、人表皮生长因子受体、以及所述单一人体组织癌细胞蛋白按(10-1)∶(10-1)∶(1-10)的比例混合均匀作为抗原成分;或所述人体组织癌细胞蛋白为按均一比例混合而成的复合人体组织癌细胞,则所述步骤(A2)中选取端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体按(1-10)∶(10-1)混合后,与所述复合人体组织癌细胞蛋白按(1-10)∶(10-1)的比例混合均匀作为抗原成分。
在本发明所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法中,所述步骤(A2)中选取任意一种人体组织癌细胞蛋白作为抗原成分,所述步骤(A5)中制备的特异性IgY为多种抗人肿瘤抗原特异性IgY。
在本发明所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法中,所述步骤(A2)中选取人体组织癌细胞蛋白中的至少二种混合均匀作为抗原成分,所述步骤(A5)中制备的特异性IgY为抗人肿瘤复合全抗原特异性IgY。
本发明还提供了一种抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY,采用如上所述的方法制得。
本发明还提供了一种抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY偶联物,将如上所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY与细胞穿透载体或化疗药偶联制得。
本发明还提供了一种抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY组合制剂,采用如上所述的方法制得的特异性IgY加入各种辅料制成的组合制剂,包括喷雾剂(口喷剂、鼻喷剂等)、雾化剂、胶囊(软胶囊、硬胶囊)、口含片、咀嚼片、口服片、栓剂、泡腾片、乳膏或针剂。
本发明还提供了一种抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY偶联物组合制剂,其特征在于,采用如上所述抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY与细胞穿透载体或化疗药偶联制得的特异性复合IgY偶联物加入各种辅料制成的组合制剂,包括喷雾剂(口喷剂、鼻喷剂等)、雾化剂、胶囊(软胶囊、硬胶囊)、口含片、咀嚼片、口服片、栓剂、泡腾片、乳膏或针剂。
本发明还提供了一种特异性复合IgY多联试剂盒,包括如上所制得的抗端粒酶逆转录酶特异性IgY和如上所制得的抗人表皮生长因子受体特异性IgY以及由如上所制得的抗人肿瘤复合全抗原特异性IgY共三种抗体组合制成的一种【三联检测试剂盒】,以及由如上所制得的抗端粒酶逆转录酶特异性IgY和由如上所制得的抗人表皮生长因子受体特异性IgY以及由如上所制得的多种抗人肿瘤抗原特异性IgY中任意一種IgY共三种抗体组合制成的至少2种【三联检测试剂盒】。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。
一、制备过程具体描述
下面对本发明提供的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY的制备方法进行具体描述,包括以下步骤:
(S1)向美国sigma公司购买端粒酶逆转录酶(hTERT),产品编号:CB8946041),向北京义翘神州生物技术有限公司购买人表皮生长因子受体HER-2/neu编码产物p185erbB2蛋白(产品编码:10004-H02H),向美国sigma公司购买端粒酶RNA(hTR),产品编号:T9285;分别作为肿瘤代表抗原。
(S2)基因重组端粒酶逆转录酶(hTERT)和人表皮生长因子受体HER-2/neu编码产物p185erbB2蛋白以及端粒酶RNA(hTR)并纯化;
(1)hTERT基因片段的克隆和表达:首先用RT-PCR方法克隆hTERTcDNA的一个片段,然后将其连接到GST融合表达载体pGEX-5X-3;测序证明所获得的基因序列正确后,用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化,电泳回收目的片段,与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆,提质粒,酶切鉴定正确后,电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆,然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中,在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时,将培养基换成含甲醇的培养基,继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样,用ELISA法测定上清中HA的表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50%硫酸铵沉淀,截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时,以及Sephacry1 S-200和Sephacry1S-100柱层析后,即获得纯化的端粒酶逆转录酶hTERT融合蛋白抗原成份。
(2)p185erbB2蛋白的克隆和表达:
首先将p185erbB2蛋白连接到GST融合表达载体pGEX-5X-3;测序证明所获得的基因序列正确后,用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化,电泳回收目的片段,与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆,提质粒,酶切鉴定正确后,电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆,然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中,在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时,将培养基换成含甲醇的培养基,继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样,用ELISA法测定上清中HA的表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50%硫酸铵沉淀,截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时,以及Sephacry1 S-200和Sephacry1S-100柱层析后,即获得纯化的p185erbB2蛋白抗原成份。
(3)端粒酶RNA(hTR)蛋白的克隆和表达:
首先用RT-PCR方法克隆端粒酶RNA(hTR)cDNA的一个片段,然后将其连接到GST融合表达载体pGEX-5X-3;测序证明所获得的基因序列正确后,用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化,电泳回收目的片段,与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆,提质粒,酶切鉴定正确后,电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆,然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中,在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时,将培养基换成含甲醇的培养基,继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样,用ELISA法测定上清中HA的表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50%硫酸铵沉淀,截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时,以及Sephacry1 S-200和Sephacry1 S-100柱层析后,即获得纯化的端粒酶RNA(hTR)融合蛋白抗原成份。
(S3)向ATCC(美国标准生物品收藏中心)购买以下12种肿瘤传代培养细胞:
(1)人胃癌细胞MGC-803,(2)人口腔癌细胞CY20294,(3)人食道癌细胞Eca-109,(4)人鼻咽癌细胞bs-1065R,(5)人肺癌细胞A-549CCL-185,(6)人结肠癌细胞HT-29HTB-38TM,(7)人大肠癌细胞HCT-8,(8)人直肠癌细胞HCT-116,(9)人宫颈癌细胞HeLa CCL-2,(10)皮肤癌细胞A431,(11)乳腺癌细胞MDA-MB-435S,(12)淋巴癌细胞U-937。
(S4)培养肿瘤传代细胞并制备癌细胞蛋白:
(1)细胞培养:分别将以上12种肿瘤传代细胞培养于含10%(体积分数)小牛血清的DMEM培养基,5%(体积分数)CO2,培养温度为37℃。
(2)胞浆蛋白的提取:收集6×108~8×108细胞,以0.1mol.L-1PBS洗两遍,以三去污缓冲液裂解法于冰浴中30min裂解细胞、释放胞浆蛋白,15000×g、于4℃离心30min,取上清,测蛋白浓度。
(3)按常规方法将所制备的12种癌细胞蛋白分别进行纯化。
(S5)分别制作8类抗原:
(1)端粒酶逆转录酶hTERT抗原:
将端粒酶逆转录酶hTERT按(1-10)∶(10-1)比例加入福氏佐剂,再高速匀化处理形成油包水乳液,即制得端粒酶逆转录酶hTERT抗原;
(2)HER-2/neu编码产物p185erbB2蛋白抗原:
将HER-2/neu编码产物p185erbB2蛋白按(1-10)∶(10-1)比例加入福氏佐剂,再高速匀化处理形成油包水乳液,即制得HER-2/neu编码产物p185erbB2蛋白抗原;
(3)端粒酶RNA(hTR)抗原:
将端粒酶RNA(hTR)按(1-10)∶(10-1)比例加入福氏佐剂,再高速匀化处理形成油包水乳液,即制得端粒酶RNA(hTR)抗原;
(4)中瘤标志物复合抗原:
将端粒酶逆转录酶hTERT和HER-2/neu编码产物p185erbB2蛋白按(1-10)∶(10-1)比例混合均匀,得到抗原混合液;再将这种抗原混合液按(1-10)∶(10-1)比例加入福氏佐剂,再高速匀化处理形成油包水乳液,即制得端粒酶逆转录酶hTERT和HER-2/neu编码产物p185erbB2蛋白肿瘤标志物复合抗原;
(5)12种人肿瘤复合抗原:
将端粒酶逆转录酶hTERT和HER-2/neu编码产物p185erbB2蛋白按(1-10)∶(10-1)比例混合均匀,得到肿瘤标志物抗原混合液;再将这种肿瘤标志物抗原混合液按(10-1)∶(1-10)比例(或其他任意比例,如优选3∶1)分别与上述12种人体组织癌细胞蛋白中的其中一种混和,充分搅拌均匀,得到12种人肿瘤抗原成份;再将这12种人肿瘤抗原成份中的任意一种按(1-10)∶(10-1)比例加入福氏佐剂,高速匀化处理形成油包水乳液,即制得12种人肿瘤复合抗原;
实际应用中,也可仅将端粒酶逆转录酶hTERT或者仅将HER-2分别与上述12种人体组织癌细胞蛋白中的其中一种混和,充分搅拌均匀,得到12种人肿瘤抗原成份;再将这12种人肿瘤抗原成份中的任意一种按(1-10)∶(10-1)比例加入福氏佐剂,高速匀化处理形成油包水乳液,即制得12种人肿瘤复合抗原;
(6)12种人肿瘤抗原:
将上述12种人体组织癌细胞蛋白中的其中一种按(1-10)∶(10-1)比例加入福氏佐剂,高速匀化处理形成油包水乳液,即制得12种人肿瘤抗原;
(7)人肿瘤复合全抗原:
先将上述12种人体组织癌细胞蛋白按均一比例(每种均占总量的1/12)混和,充分搅拌均匀,得到人肿瘤复合全抗原成份;再将端粒酶逆转录酶hTERT和HER-2/neu编码产物p185erbB2蛋白按(1-10)∶(10-1)比例混合均匀,得到肿瘤标志物抗原混合液;最后将12种人体组织癌细胞蛋白均匀混合得到的人肿瘤复合全抗原成份按(1-10)∶(10-1)比例与肿瘤标志物抗原混合液混合得到人肿瘤蛋白复合全抗原成份,再将这种人肿瘤蛋白复合全抗原成份按(1-10)∶(10-1)比例加入福氏佐剂,高速匀化处理形成油包水乳液,即制得人肿瘤复合全抗原;
(8)人肿瘤全抗原:
先将上述12种人体组织癌细胞蛋白按均一比例(每种均占总量的1/12)混和,充分搅拌均匀,得到人肿瘤全抗原成份;得到的人肿瘤全抗原成份按(1-10)∶(10-1)比例加入福氏佐剂,高速匀化处理形成油包水乳液,即制得人肿瘤全抗原。
(S6)采用淘汰法筛选具有高免疫应答能力的选择产蛋禽类(鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟等),分别用以上8类抗原免疫所选择的高免疫应答能力的产蛋禽类,每只禽类在皮下注射所制备的8类抗原中之一种抗原0.5-1ml;在第一次注射后间隔7天,再以同样剂量、方法注射第二次,第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次,第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋,对所检取的免疫蛋进行编码标记。
(S7)对所述8类免疫蛋分别用0.1%新洁而灭溶液或0.1%KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡消毒,无菌蒸馏水冲洗、晾干,置于打蛋机中将蛋壳打碎,用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均匀,用1.0N NaOH液或者1.0N HCL液调节PH至5.5-6.0,4-6℃下静置过夜,稀释液6,000-12,000r/min高速离心20分钟,取上清液用17万分子量至20万分子量截留超滤浓缩10-20倍。
然后,采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置,彻底滤除各种细菌病毒,确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌。
第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌;第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体;第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。
最后,将所得浓缩液用冷冻干燥机干燥,即制得8类特异性IgY粗提物。
(S8)将所述8类特异性IgY粗提物分别过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化,即得相应的8类特异性IgY特异性纯IgY;分别是:
1.抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性IgY;
2.抗端粒酶RNA(hTR)特异性IgY;
3.抗HER2特异性IgY;
4.抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY;
5.抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及12种人肿瘤细胞特异性复合IgY,
分别是:
(1)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY;
(2)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及口腔癌细胞特异性复合IgY;
(3)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及食道癌细胞特异性复合IgY;
(4)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及鼻咽癌细胞特异性复合IgY;
(5)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及肺癌细胞特异性复合IgY;
(6)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及结肠癌细胞特异性复合IgY;
(7)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及大肠癌细胞特异性复合IgY;
(8)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及直肠癌细胞特异性复合IgY;
(9)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及子宫颈癌细胞特异性复合IgY;
(10)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及皮肤癌细胞特异性复合IgY;
(11)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌细胞特异性复合IgY;
(12)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及淋巴癌细胞特异性复合IgY。
以上12种特异性复合IgY也可以是抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和12种人肿瘤细胞特异性复合IgY,也可以是抗HER2和12种人肿瘤细胞特异性复合IgY。
6.12种抗人肿瘤细胞特异性IgY,
分别是:
(1)抗胃癌细胞特异性IgY;
(2)抗口腔癌细胞特异性IgY;
(3)抗食道癌细胞特异性IgY;
(4)抗鼻咽癌细胞特异性IgY;
(5)抗肺癌细胞特异性IgY;
(6)抗结肠癌细胞特异性IgY;
(7)抗大肠癌细胞特异性IgY;
(8)抗直肠癌细胞特异性IgY;
(9)抗子宫颈癌细胞特异性IgY;
(10)抗皮肤癌细胞特异性IgY;
(11)抗乳腺癌细胞特异性IgY;
(12)抗淋巴癌细胞特异性IgY。
7.抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及人肿瘤全抗原特异性复合IgY;
8.抗人肿瘤全抗原特异性复合IgY;
(S9)分别将上述第5类抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及12种人肿瘤细胞特异性复合纯IgY(以下简称:抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合纯IgY)之其中一种与多聚精氨酸蛋白(细胞穿透载体)偶联,得到12种抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合纯IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物。
具体步骤如下:
(1)将20-200mg多聚精氨酸蛋白、5-100mgN-羟基丁二酰亚胺和20-200mg碳化二亚胺加到1-10毫升超纯水中,在冰浴中搅拌10-50分钟;
(2)上述溶液中边搅拌边逐渐加入含10-100mg第6类12种中任意一种抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合纯IgY的超纯水1-10毫升,加毕在4-30℃搅拌反应3-20小时,合成多聚精氨酸蛋白-IgY偶联物;
(3)多聚精氨酸蛋白-IgY偶联物放入透析袋中,用0.01MpH7.2的磷酸盐缓冲液在4℃透析1-3天;
(4)透析后的多聚精氨酸蛋白-IgY偶联物进行紫外扫描,分析鉴定偶联产物及浓度测定,得到抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合纯IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物成品。
本发明以其中一种细胞穿透载体(多聚精氨酸蛋白)为例说明,实际应用包括各种细胞穿透载体,可得到偶联不同细胞穿透载体且针对12种不同肿瘤的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合纯IgY偶联物成品。
分别是:
(1)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及胃癌细胞特异性复合IgY与细胞穿透载体偶联物;
(2)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及口腔癌细胞特异性复合IgY与细胞穿透载体偶联物;
(3)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及食道癌细胞特异性复合IgY与细胞穿透载体偶联物;
(4)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及鼻咽癌细胞特异性复合IgY与细胞穿透载体偶联物;
(5)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及肺癌细胞特异性复合IgY与细胞穿透载体偶联物;
(6)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及结肠癌细胞特异性复合IgY与细胞穿透载体偶联物;
(7)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及大肠癌细胞特异性复合IgY与细胞穿透载体偶联物;
(8)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及直肠癌细胞特异性复合IgY与细胞穿透载体偶联物;
(9)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及子宫颈癌细胞特异性复合IgY与细胞穿透载体偶联物;
(10)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及皮肤癌细胞特异性复合IgY和细胞穿透载体偶联物;
(11)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌细胞特异性复合IgY和细胞穿透载体偶联物;
(12)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及淋巴癌细胞特异性复合IgY和细胞穿透载体偶联物。
(S10)分别将所述第5类12种抗端粒酶逆转录酶和HER2特异性复合纯IgY与化疗药偶联,这种化疗药可以是希罗达(卡培他滨,英文名Xeloda),但不限于希罗达(卡培他滨,英文名Xeloda);偶联后得到抗端粒酶逆转录酶和HER2特异性复合纯IgY与卡培他滨(Xeloda)偶联物。
具体步骤如下:
(1)将20-200mg卡培他滨(Xeloda)、5-100mgN-羟基丁二酰亚胺和20-200mg碳化二亚胺加到1-10毫升超纯水中,在冰浴中搅拌10-50分钟;
(2)上述溶液中边搅拌边逐渐加入含10-100mg10种中任意一种抗端粒酶逆转录酶和HER2特异性复合纯IgY的超纯水1-10毫升,加毕在4-30℃搅拌反应3-20小时,合成卡培他滨(Xeloda)-IgY偶联物;
(3)卡培他滨(Xeloda)-IgY偶联物放入透析袋中,用0.01MpH7.2的磷酸盐缓冲液在4℃透析1-3天;
(4)透析后的卡培他滨(Xeloda)-IgY偶联物进行紫外扫描,分析鉴定偶联产物及浓度测定,得到抗端粒酶逆转录酶和HER2特异性复合纯IgY与卡培他滨(Xeloda)偶联物成品。
本发明以其中一种希罗达(卡培他滨,英文名Xeloda)为例说明,实际应用包括各种化疗药,可得到偶联不同化疗药且针对第5类12种不同肿瘤的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合纯IgY偶联物成品。
分别是:
(1)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及胃癌细胞特异性复合IgY与化疗药偶联物;
(2)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及口腔癌细胞特异性复合IgY与化疗药偶联物;
(3)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及食道癌细胞特异性复合IgY与化疗药偶联物;
(4)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及鼻咽癌细胞特异性复合IgY与化疗药偶联物;
(5)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及肺癌细胞特异性复合IgY与化疗药偶联物;
(6)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及结肠癌细胞特异性复合IgY与化疗药偶联物;
(7)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及大肠癌细胞特异性复合IgY与化疗药偶联物;
(8)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及直肠癌细胞特异性复合IgY与细胞穿透载体偶联物;
(9)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及子宫颈癌细胞特异性复合IgY与化疗药偶联物;
(10)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2及皮肤癌细胞特异性复合IgY与化疗药偶联物;
(11)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌细胞特异性复合IgY与化疗药偶联物;
(12)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及淋巴癌细胞特异性复合IgY与化疗药偶联物。
以上所述针对不同肿瘤细胞的12种特异性复合纯IgY及其偶联物都可以进行脂质体化处理,制得各种不同的脂质体抗肿瘤特异性复合IgY和偶联物。可以进一步提高表皮渗透性、延效性和靶向性,增加疗效指数。
具体实施方法如下:
把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中,再将相应的特异性复合纯IgY及其偶联物加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成IgY溶液;然后将含卵磷脂和胆固醇的混悬液与IgY溶液混合,超声处理2min(每处理0.5min,间歇.0.5min),立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状,漩涡振荡使凝胶转相,再继续蒸发除尽乙醚,进而超速离心(35000r/min,30min)分离除去未包入的IgY,沉淀用水洗二次,离心,得沉淀,用10mmol/L PBS稀释,即制得各种脂质体抗肿瘤特异性复合IgY和偶联物。
本发明以常见的12种肿瘤为例说明相应的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY与抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY的制备方法,以及这些特异性复合IgY偶联物的制备方法。实际应用中不限于这12种肿瘤,所述方法也适用于其他肿瘤。
本发明还提供多种抗肿瘤特异性复合IgY组合制剂,其中包括前述方法制备的12种抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY与不同细胞穿透载体偶联的偶联物或与不同化疗药的偶联物,还包括偶联不同细胞穿透载体或不同化疗药且针对12种不同肿瘤的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合纯IgY偶联物,也包括偶联不同细胞穿透载体或与不同化疗药且针对12种不同肿瘤的抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY偶联物,并且包括偶联不同细胞穿透载体或与不同化疗药且针对12种不同肿瘤的的抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合纯IgY偶联物;还包括以这些不同抗肿瘤特异性IgY与细胞穿透载体或化疗药偶联物添加各种辅料制成的喷雾剂(口喷剂、鼻喷剂等)、雾化剂、胶囊(软胶囊、硬胶囊)、口含片、咀嚼片、口服片、栓剂、泡腾片、乳膏或针剂。
二、原理分析
端粒酶的激活是大部分恶性肿瘤发生的先决条件,端粒酶也是一个较理想的抗肿瘤靶标;而p185erbB2作为肿瘤抗原同样是国际医学界公认的肿瘤治疗靶点,p185erbB2过度表达显示肿瘤预后差,如复发、转移、耐药、存活期短等。本发明的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY与抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY可以特异性地针对肿瘤细胞内外的端粒酶逆转录酶(hTERT)和生长因子受体以及端粒酶RNA(hTR)等抗原发生抑制作用。一方面能抑制肿瘤部位总体的端粒酶活性水平,阻滞肿瘤生长和扩散;一方面又可抑制p185erbB2的过量表达,预防和治疗p185erbB2高表达的转移性肿瘤。但是,要实现这一点,必须突破两大难关:第一、如何不伤害正常细胞;第二、大分子的IgY如何进入肿瘤细胞内发生作用。
本发明特殊之处在于所制成的12种抗肿瘤复合IgY中都分别包含了针对一种常见肿瘤细胞蛋白的抗体,形成一种特殊的生物导向剂。每一种不同的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY或抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY,都会自动选择性地识别其所对应的肿瘤细胞,象导弹一样特异性地追踪,与所对应的肿瘤细胞结合;从而抑制肿瘤的生长,而不会影响到人的正常细胞。深入研究揭示,在正常人类生殖细胞以及造血干细胞、外周血白细胞与淋巴细胞、肠粘膜基底干细胞、胚胎体细胞、毛发、皮肤、子宫内膜等具有再生能力的细胞中,均可检测到不同水平的端粒酶活性,简单地抑制端粒酶有可能对生殖、造血及免疫系统产生负面影响;这也是目前全球许多医学科学家在积极研究开发各种“端粒酶抑制剂”所遇到的难题。本发明的一系列抗肿瘤特异性复合IgY所具有的“生物导向功能”有效地克服了一般“端粒酶抑制剂”潜在的副作用,仅会有的放矢地抑制肿瘤细胞内的端粒酶活性,对具有再生能力的正常细胞则秋毫无犯;这也是本发明创新之处。
本发明把抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY与抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY分别与“细胞穿透载体”(具有良好穿透真核细胞膜功能的融合蛋白)偶联形成偶联物。一方面利用IgY抗体特异性识别并结合相应的肿瘤细胞株,一方面借助偶联的“细胞穿透载体”特有的细胞穿透能力;从而,使本发明的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY与抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY能有效穿透目标肿瘤细胞的细胞膜而进入胞体内,充分发挥IgY强有力的抑制端粒酶活性和p185erbB2的作用,提高实际疗效。
本发明同时把12种抗肿瘤复合IgY与疗效确切的化疗药偶联成IgY和化疗药偶联物,制成具有特异性导向的治疗肿瘤药物。由于这种针对肿瘤细胞的IgY抗体生物导向剂对细胞有选择性识别作用,这一特征为化疗药提供了重要导向作用。在正常组织细胞与采用病人肿瘤组织培养的细胞所进行的IgY荧光免疫测定对照试验表明,这种特异性导向的肿瘤药物只与与癌细胞反应.与其他细胞无交叉免疫;证明这种IgY能够识别癌细胞。以放射同位素169Yb标记以上12种复合IgY抗体进行动物体内追踪测定,结果也表明IgY主要向肿瘤组织集中,其他器官含量甚微。本发明制备的12种抗肿瘤复合IgY与疗效确切的化疗药偶联成IgY和化疗药偶联物在实际使用中,所进行的“癌细胞反应超微结构观察”,都发现只有癌细胞膜结构被融解破坏、核膜消失、细胞核被破坏,细胞崩溃;而正常细胞则几乎不受影响。因此,将这种具有特异性导向的IgY偶联化疗药用于各种肿瘤治疗,不但可大幅度减低普通化疗药的副作用,还可提升治愈率。
由于IgY是一种从禽类所生蛋的卵黄中提取的天然物质,大量毒理试验和致突变试验已证明它无任何毒副作用,也没有任何致癌性;既使长期服用或使用也不会产生任何不良反应,也不会出现耐药性,而严重的毒副作用和癌细胞对化疗药耐药是肿瘤治疗的两大难题。本发明的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY与抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY等特异性复合IgY与“细胞穿透载体”偶联物及其各种制剂,不但可用于治疗癌症,还可用于癌症高危人群预防癌症;对于经检测发现端粒酶活性偏高或者人表皮生长因子受体(HER2)高表达的人群,可在医生指导下使用相对应的某一种IgY与“细胞穿透载体”偶联物制剂,直至经复查端粒酶活性或者人表皮生长因子受体(HER2)表达恢复正常为止。另外,本发明的脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY与抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY等特异性复合IgY与“细胞穿透载体”偶联物及其各种制剂,也可供肿瘤患者在手术后或化疗后长期使用或服用,有效防止肿瘤复发,延长存活时间。这是目前的治癌药物所做不到的。
在实际应用上,可以采用以本发明的抗端粒酶逆转录酶和HER2特异性复合IgY与抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY与各种“细胞穿透载体”偶联物或化疗药偶联物制成的胶囊、口含片、咀嚼片、口服片通过口服方法预防和治疗消化系统(包括食道和胃以及结肠、小肠、大肠和直肠等)的肿瘤,如果把抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY脂质体化,还可有效防止胃肠道各种消化酶破坏其生物活性,进一步提高疗效;用以本发明的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY与抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY与各种“细胞穿透载体”偶联物或化疗药偶联物制成的口喷剂、口含片、咀嚼片预防和治疗口腔部位的癌症(包括舌癌);用以本发明的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY与抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY与各种“细胞穿透载体”偶联物或化疗药偶联物制成的鼻喷剂、口喷剂预防和治疗鼻咽部位的癌症;用以本发明的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY与抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY与各种“细胞穿透载体”偶联物或化疗药偶联物制成的软胶囊、栓剂、泡腾片、乳膏、阴道灌洗液预防和治疗子宫颈癌等;用以本发明的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY与抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY与各种“细胞穿透载体”偶联物或化疗药偶联物制成的喷雾剂、雾化剂预防和治疗肺癌等呼吸道癌症;用以本发明的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY与抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY与各种细胞穿透载体”偶联物或化疗药偶联物制成的喷雾剂、乳膏、润肤膏预防和治疗皮肤基底细胞癌、非转移性皮肤鳞癌及皮肤黑素瘤;用以本发明的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY与抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY与各种细胞穿透载体”偶联物或化疗药偶联物制成的注射剂治疗乳腺癌和淋巴癌等。
本发明还提供采用抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性IgY和抗HER2特异性IgY以及抗人肿瘤全抗原特异性复合IgY制成的【多联检测试剂盒】,同时也提供采用由抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性IgY和抗HER2特异性IgY以及12种抗人肿瘤细胞特异性IgY共三种特异性IgY制成的12种不同的肿瘤【多联检测试剂盒】。这两类【多联检测试剂盒】都可用于肿瘤预测和预后判断以及肿瘤治疗的疗效监测。任何一种临床标本,除病理性组织外,脱落细胞和细胞针吸出物、渗出液、胸腹水、胰、胆管、乳房吸出物、口腔、结肠、肺、宫颈冲洗物或刷取物等都可作为检测样本。抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性IgY和抗HER2特异性IgY以及人肿瘤全抗原特异性复合IgY制成的【多联检测试剂盒】可用于肿瘤预测和体检筛查;采用抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性IgY和抗HER2特异性IgY以及12种抗人肿瘤细胞特异性IgY制成的12种肿瘤【多联检测试剂盒】不但可检测出端粒酶活性和HER2的过量表达,还可初步判断肿瘤发生的大致部位。大量试验证明以端粒酶为标志物检测癌症,其敏感性显著高于细胞学检查;与其他肿瘤标记物相比,用端粒酶活性检测进行恶性肿瘤诊断有以下优点:(1)端粒酶是通过维持端粒长度使细胞成为肿瘤细胞,因此,端粒酶活性与恶性肿瘤的关系比其他肿瘤标志物更直接;(2)端粒酶活性广泛存在于恶性肿瘤细胞,而通常良性肿瘤和正常体细胞中无活性,因此用端粒酶活性诊断恶性肿瘤具有高度特异性;(3)端粒酶活性检测的灵敏度高,检测所需标本少,只要测定体系中含有3个恶性肿瘤细胞,即可用端粒重复序列扩增方法检测端粒酶的活性。显示高水平的端粒酶活性与预后不良相关;因此,本发明为癌症的早期诊断和预后判断、随访以及疗效监测提供了一种崭新的方法。但是,实际使用中,也暴露了一些问题,主要是仅仅依靠“端粒酶活性”来诊断,容易出现假阳性;因而,影响了检测的准确性和可信度。本发明的从多方面入手弥补了这一缺陷。
由于IgY不会活化哺乳动物的补体系统,不与血清中存在的类风湿因子(RF)和哺乳动物的Fc受体起反应,不与蛋白质A和G起反应;因此,采用本发明制备的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY制成的肿瘤检测试剂盒,特异性较强,可避免免疫测定中的常出现的干扰,减少免疫检测假阳性反应的发生。正因为IgY具有这些特点,所以,本发明的这种肿瘤检测试剂盒明显优于目前广泛使用的采用单抗或哺乳动物IgG制成各种肿瘤检测试剂盒,是一种“实时定量高灵敏度”的试剂盒。特别是,本发明的用抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY制成的多种肿瘤【多联检测试剂盒】除了含有国际医学畀公认的肿瘤标志物-端粒酶和原癌基因人类表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER2)外,还包含了12种常见人肿瘤细胞蛋白的抗体,它除了可检测出端粒酶阳性和HER2高表达外,还对相对应的肿瘤蛋白进行显示。在用于肿瘤早期诊断时,除了可预测肿瘤的发生或提示肿瘤预后,还可诊断肿瘤发生的具体部位。这就为医生进一步检查的准确取样和制订更有针对性的预防和治疗方案提供了可靠的依据;这是目前广泛使用的肿瘤检测试剂盒尚做不到的。
国际医药界治疗癌症的众多案例证明,只有早期诊断和早期治疗才能更多地挽救癌症患者的生命,也才有可能大幅度提高癌症治愈率。评判基准是:只有当二种或三种指标都显示阳性才可初判为肿瘤预后不良或已成癌症或隐形癌症或疑似癌症。这就可大幅度提高检测的特异性和准确性,排除假阳性,特别是可以避免由于仅仅依靠“端粒酶活性”单项检测而可能出现的误判;从而,为较准确的预警癌症并及早干预和早期治疗创造了条件。这是本发明与众不同的特点和独创性,也是本发明所具备的先进性和实用性。采用这种三联结合的【多联检测试剂盒】检测癌症时,肿瘤预测和体检筛查一般采用抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及人肿瘤全抗原特异性复合IgY制成的【多联检测试剂盒】;进一步复查和预后判断以及肿瘤治疗的疗效监测则应采用抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性IgY和抗HER2特异性IgY以及12种抗人肿瘤细胞特异性IgY制成的12种肿瘤【多联检测试剂盒】中一种【多联检测试剂盒】,应用这种系列化的【多联检测试剂盒】除了可判断受检者身体哪部位患癌症的机率较大,为医生进一步检查和更准确地诊断提供有力的依据外,还可检测肿瘤是否转移和复发倾向以及耐药情况等,同时显示预后和治疗效果。
三、试验结果检测
实验例1
抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY和抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY、抗人肿瘤全抗原特异性复合IgY纯品中的IgY含量检测
应用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯凝胶)电泳测定法,对按以上方法所制取的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY和抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性复合纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性复合IgY、抗人肿瘤全抗原特异性复合IgY
粗品进行检测,结果含IgY 45~52%。将这五种IgY粗品经二次过柱纯化后,得到纯IgY。经SDS-PAGE分析,纯度达到PAGE纯,如下表所示:
IgY纯品 | IgY含量 |
抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY纯品 | 99.99% |
抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性IgY纯品 | 99.99% |
抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性IgY纯品 | 99.99% |
抗端粒酶RNA(hTR)特异性IgY纯品 | 99.99% |
抗人肿瘤全抗原特异性复合IgY纯品 | 99.99% |
实验例2
检测脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY和抗HER2特异性复合IgY和抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性IgY对有代表性的端粒酶逆转录酶(hTERT)和人表皮生长因子受体HER-2/neu编码产物p185erbB2以及端粒酶RNA(hTR)等三种抗原的抗体结合效价。
具体是,分别采用端粒酶逆转录酶(hTERT)T和人表皮生长因子受体HER-2/neu编码产物p185erbB2以及端粒酶RNA(hTR)作为检测抗原,用“ELISA”方法检测所制得的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY和抗HER2特异性IgY和抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性IgY的抗体效价。结果如下表
注:测试样本中的五种特异性复合IgY浓度均为1mg/mL。
从以上检测结果可看出,所制备的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合纯IgY和抗HER2特异性纯IgY和抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性纯IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性纯IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性纯IgY对所对应的抗原都有很高的抗体结合效价。试验结果证明,本发明所采用的特殊的免疫激活技术对提高所制备的IgY的抗体效价产生了理想的效果。
实验例3
检测12种抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合纯IgY对12种癌细胞蛋白的抗体结合效价。
实验例4
体外生物学活性试验
以12种抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合纯IgY偶联物之一抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物为例,采用体外生物学活性测定方法试验其抑制肿瘤细胞生长的作用。
1.材料和试剂
(1)人胃癌细胞MGC-803(向ATCC购买);
(2)伊立替康(irinotecan,CPT 11);
(3)抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物
(4)非核素细胞增殖检测试剂盒,购自Promega公司(G5430);
(5)非核素细胞毒性检测试剂盒,购自Promega公司(G1780);
(6)全自动酶标仪
2.操作步骤:
(1)对数生长期的人胃癌细胞(MGC-803)制备成单细胞悬液,重悬于RPMI1640完全培养液,调整细胞密度为6*104/ml。
(2)RPMI 1640完全培养液连续倍比稀释伊立替康(irinotecan,CPT 11)和抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物(64μL/ml-7.8ng/ml)
(3)将伊立替康和抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物稀释液、空白对照(RPMI1640完全培养液)、无关对照(人同型IgG)加入96孔板,100μl/孔。
(4)将人胃癌细胞(MGC-803)细胞悬液加入上述96孔板中,100μl/孔。
(5)37℃、5%CO2细胞培养箱培养7d。
(6)非核素细胞增殖试剂显色。
(7)酶标仪测量D490。
(8)利用Origin软件作4参数Logistic回归,计算伊立替康和抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物的半数有效浓度(EC50)
结论:体外生物学活性测定证明,伊立替康和抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物均能抑制人胃癌细胞MGC-803的生长,体外生物学活性相似,EC50分别为151.6和137.2ng/ml。
实验例5
以淋巴瘤细胞和正常T淋巴细胞为对象,通过体外细胞凋亡试验,验证抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及淋巴癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物对淋巴癌细胞的特异性杀灭作用。
(一)实验步骤
1.细胞培养
(1)U-937人组织细胞淋巴瘤细胞株(向美国ATCC购买)培养:将U-937人组织细胞淋巴瘤细胞株培养于含10%(体积分数)小牛血清的DMEM培养基,5%(体积分数)CO2,培养温度为37℃。隔天换液,取对数生长期的细胞实验。
(2)OKT3总T淋巴细胞(向美国ATCC购买)培养:将OKT3总T淋巴细胞培养于含10%(体积分数)小牛血清的DMEM培养基,5%(体积分数)CO2,培养温度为37℃。隔天换液,取对数生长期的细胞实验。
2.细胞处理
分别调整U-937人组织细胞淋巴瘤细胞株和OKT3总T淋巴细胞浓度至109/L,再分别加入抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及淋巴癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物至所需浓度12h后,分别收获U-937人组织细胞淋巴瘤细胞株和OKT3总T淋巴细胞备用;药物浓度依次为0、2、4、8、16mg/L。
3.凋亡细胞分离
分别分离所收获的U-937人组织细胞淋巴瘤细胞株和OKT3总T淋巴细胞中的凋亡细胞。具体操作方法:
按从下往上1.08×103g/L(1mL)、1.078×103g/L(2mL)、1.076×103g/L(2mL)、1.074×103g/L(2mL)、1.072×103g/L(2mL)、1.07×103g/L(2mL)的密度制备Percoll不连续密度梯度液。用1.06×103g/L Percoll液调整各处理组细胞至109/L,取1mL此细胞悬液加入至上述梯度液上层,400g离心30min,收集1.08×103g/L富含凋亡细胞层细胞备用。
4.以FCM法分别检测“淋巴瘤细胞”和“正常T淋巴细胞”凋亡细胞百分数
约106细胞,70%冷乙醇4℃固定过夜,PI(Sigma)染色,激发光波长488nm,采用流式细胞仪测定凋亡细胞百分数。
5.采用高倍“荧光分析显微镜”进行超微结构观察
6.统计方法
实验重复3次取均值,数据以±s表示,采用student’s t检验判定均数差异显著性。
(二)结果
1.FCM法测得的U-937人组织细胞淋巴瘤细胞株凋亡细胞百分率为95.1±1.21%;而OKT3总T淋巴细胞凋亡细胞百分率为15.2±1.37%
2.超微结构观察结果
抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及淋巴癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物对人组织细胞淋巴瘤细胞反应的超微结构观察表明95%以上淋巴瘤细胞膜结构融解破坏、核膜消失、细胞核被破坏,肿瘤细胞崩溃;而“正常T淋巴细胞”則大部分存活。
实验证明抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及淋巴癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物对目标肿瘤细胞有很强的特异性杀伤作用,对正常细胞则影响很小。
实验例6
采用同位素放射检测法验证抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY的导向性。
试验步骤
1.采用常规方法以放射同位素125I标记抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY
2.采用经同位素125I标记的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY制成IgY口服液供爱检者口服;
3.采用PET显像仪器(正电子发射式计算机断层显像仪)检测;
4.分析显象资料
结论:同位素显象结果表明90%以上抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY附着在胃癌细胞上,正常细胞上抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY的含量极少。
四、具体实施例
实施例1
制备抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和人表皮生长因子受体(HER2)以及人乳腺癌细胞特异性复合IgY偶联物,具体方法如下:
1.制备复合抗原
(1)购买抗原成份
(a)向美国sigma公司购买端粒酶逆转录酶(hTERT),产品编号:CB8946041);
(b)向北京义翘神州生物技术有限公司购买人表皮生长因子受体HER-2/neu编码产物p185erbB2蛋白(产品编码:10004-H02H);
(c)向ATCC(美国标准生物品收藏中心)购买人乳腺癌细胞MDA-MB-435S;
(2)重组或培养抗原
A.基因重组端粒酶逆转录酶(hTERT)融合蛋白并纯化;
首先用RT-PCR方法克隆hTERTcDNA的一个片段,然后将其连接到GST融合表达载体pGEX-5X-3;测序证明所获得的基因序列正确后,用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化,电泳回收目的片段,与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆,提质粒,酶切鉴定正确后,电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆,然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中,在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时,将培养基换成含甲醇的培养基,继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样,用ELISA法测定上清中HA的表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50%硫酸铵沉淀,截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时,以及Sephacry1 S-200和Sephacry1 S-100柱层析后,即获得纯化的端粒酶逆转录酶hTERT融合蛋白抗原成份。
B.克隆和表达p185erbB2蛋白:
首先将p185erbB2蛋白连接到GST融合表达载体pGEX-5X-3;测序证明所获得的基因序列正确后,用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化,电泳回收目的片段,与用同样双酶消化的酵母表达载体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆,提质粒,酶切鉴定正确后,电转化毕氏酵母菌(Pichia pastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆,然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中,在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时,将培养基换成含甲醇的培养基,继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样,用ELISA法测定上清中HA的表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经50%硫酸铵沉淀,截留分子量10kd的透析袋用蒸镏水透析24小时,以及Sephacry1 S-200和Sephacry1S-100柱层析后,即获得纯化的p185erbB2蛋白抗原成份。
C.培养人乳腺癌细胞MDA-MB-435S传代细胞并制备人乳腺癌细胞MDA-MB-435S蛋白:
(a)细胞培养:将人乳腺癌细胞MDA-MB-435S培养于含10%(体积分数)小牛血清的DMEM培养基,5%(体积分数)CO2,培养温度为37℃。
(b)胞浆蛋白的提取:收集6×108~8×108细胞,以0.1mol.L-1PBS洗两遍,以三去污缓冲液裂解法于冰浴中30min裂解细胞、释放胞浆蛋白,15000×g、于4℃离心30min,取上清,测蛋白浓度。
(c)按常规方法将所制备的人乳腺癌细胞MDA-MB-435S蛋白纯化
(3)制作复合抗原
A.将端粒酶逆转录酶(hTERT)融合蛋白和HER-2/neu编码产物p185erbB2蛋白按1∶1比例混合均匀,得到肿瘤代表抗原混合液;再将这种肿瘤代表抗原混合液按4∶1比例与纯化的人乳腺癌细胞蛋白混和,充分搅拌均匀,得到人乳腺癌细胞蛋白复合抗原成份;
B.分别将人乳腺癌细胞蛋白复合抗原成份按1∶1比例加入福氏佐剂,再高速匀化处理形成油包水乳液,即制得人乳腺癌复合抗原;
2.免疫产蛋鸡:
采用淘汰法筛选具有高免疫应答能力的选择产蛋鸡,用所制备的人乳腺癌复合抗原免疫所选择的高免疫应答能力的产蛋鸡,每只鸡在皮下注射所制备的人胃癌复合抗原0.5-1ml;在第一次注射后间隔7天,再以同样剂量、方法注射第二次,第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次,第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋;
3.制备抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌特异性复合IgY粗提物并纯化:
(1)将所拣取的免疫蛋用0.1%新洁而灭溶液浸泡15分钟消毒,无菌蒸馏水冲洗、晾干,置于打蛋机中将蛋壳打碎,用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4-8倍蒸馏水稀释搅拌均匀,用1mol NaOH液或者1mol HCL液调节PH至5.5-6.0,4-6℃下静置过夜,稀释液6,000-12,000r/min高速离心20分钟,取上清液用17万分子量至20万分子量截留超滤浓缩10-20倍。
(2)采用美国Pall Ultrafine Filtration Company制造的除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置,彻底滤除各种细菌病毒,确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌。
第一道细菌滤除装置是用0.22μm膜除菌过滤器除去沙门菌(Salmonella)等细菌;第二道支原体滤除装置是用0.1μm膜除支原体过滤器除去支原体;第三道病毒滤除装置是用Ultipor VFTM DV50除病毒过滤器除去包括禽流感病毒、肠病毒在内的多种病毒。
(3)将所得浓缩液用冷冻干燥机干燥,即制得抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌细胞特异性复合IgY粗提物;
(4)将所制得的IgY粗提物过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化,即得相抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌细胞特异性复合纯IgY;
4.制备抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及人乳癌细胞特异性复合纯IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物:
(1)将20-200mg多聚精氨酸蛋白、5-100mgN-羟基丁二酰亚胺和20-200mg碳化二亚胺加到1-10毫升超纯水中,在冰浴中搅拌10-50分钟;
(2)上述溶液中边搅拌边逐渐加入含10-100mg抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合纯IgY的超纯水1-10毫升,加毕在4-30℃搅拌反应3-20小时,合成多聚精氨酸蛋白-IgY偶联物;
(3)多聚精氨酸蛋白-IgY偶联物放入透析袋中,用0.01MpH7.2的磷酸盐缓冲液在4℃透析1-3天;
(4)透析后的多聚精氨酸蛋白-IgY偶联物进行紫外扫描,分析鉴定偶联产物及浓度测定。得到抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌细胞特异性复合纯IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物成品。
实施例2
以抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌细胞特异性复合纯IgY偶联物为例,采用脂质体技术,将抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌细胞特异性复合纯IgY偶联物脂质体化,提高靶向性、延效性和渗透能力。其他抗肿瘤特异性复合IgY都可参照本例方法或类似方法进行脂质体化。
具体实施步骤如下:
A.把卵磷脂和胆固醇各50%按1∶5比例溶于乙醚中;
B.将实施例1中所制得的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及人乳癌细胞特异性复合纯IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物按1∶100比例加入4mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成浓度1%的IgY溶液;
C.将卵磷脂和胆固醇乙醚溶液和IgY的PBS溶液按3∶1比例混合均匀;
D.超声处理2min(每处理0.5min,间歇0.5min);
E.在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状,漩涡振荡使凝胶转相,再继续蒸发除尽乙醚;
F.超速离心(35000r/min,30min)分离除去未包入的IgY;
G.沉淀用水洗二次,置入高速离心机离心,得沉淀;
H.将所得的沉淀用10mmol/L PBS稀释,即制得脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物。
实施例3
生产脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物硬胶囊。具体实施方案如下:
配方:
工艺:
1.将配方量脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物按1∶1比例和葡萄糖混合,充分搅拌均匀。
2.用胶囊充填机将IgY粉定量分装入药用胶囊。每粒300mg。
3.将胶囊装瓶,检验出厂。
实施例4
生产脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及结肠癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物片剂。具体实施方案如下:
配方:
工艺:
1、山梨糖醇过60目筛两次备用。
2、羧甲基纤维素分散于30%乙醇中制成1%乙醇溶液。
3、将1项用适量2项制软材,14目筛网制粒,60℃通风干燥,18目筛整粒。用40目筛筛出适量细粉与IgY充分混匀。
4.再拌入硬脂酸镁,一起与整批颗粒混合均匀,密闭4小时以上。
5.压片机压片,每片600mg。
6.检验合格后,包装,全验出厂。
实施例5
生产脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及子宫颈癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物软胶囊。具体实施方案如下:
配方:
工艺:
1.将配方量抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及子宫颈癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物和聚乙二醇400以及蒸馏水加入真空搅拌机混合,充分搅拌均匀;
4.将所制成的浆料加入软胶囊机滚压模切断成型,每粒300mg;
5.将压模成型的软胶囊干燥定型
6.采用铝塑包装机包装
7.纸盒包装,检验合格出厂。
实施例6
采用脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及皮肤癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白的偶联物为核心原料生产IgY乳膏,用于皮肤癌的预防和治疗。
具体实施方案如下:
配方:
工艺:
1.将配方量棉籽油加热至100℃,然后冷却至30~45℃成溶液A。
2.将配方量脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及皮肤癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物加入溶液A,充分搅拌均匀,制成溶液B。
3.边搅拌边分别加入钛白粉和微粉硅胶至溶液B,充分搅拌均匀制成成品(乳膏状)。
4.将成品分装,检验出厂。
实施例7
脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及鼻咽癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白的偶联物鼻喷剂生产。
具体实施方案如下:
配方:
工艺:
将蒸馏水煮沸后冷却至室温。把配方量脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及鼻咽癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白的偶联物溶于160升蒸馏水中,再加入甘油混匀。薄荷脑、香精先加入乙醇溶解,再加PEG400混匀,在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤,补加蒸馏水至全量。用0.1mol、NaOH溶液调pH至7.0,灌装。将药液灌入常压喷雾瓶中,每支20ml。全检合格后包装即制得用于防治鼻咽癌的IgY常压喷雾剂。
实施例8
采用脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及人肺癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白的偶联物为主要原料,制成IgY吸入式雾化剂,加入医用吸入式雾化装置中,也可添加到空气加湿器或空气清新器中;用于预防和治疗肺癌。
配方:
工艺:
将蒸馏水煮沸后冷却至室温。把配方量脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及肺癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物溶于240升蒸馏水中,再加入甘油混匀。薄荷脑、香精加入乙醇溶解,再加PEG400混匀,在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤,补加蒸馏水至全量,用0.1mol、NaOH溶液调pH至7.0,灌装。将药液灌入药用瓶中,每瓶500ml,全检合格后包装即得600瓶吸入式雾化剂,置于医用吸入式雾化装置中,或添加到空气加湿器或空气清新器中,供患者或肺癌高危人群直接吸入肺部,起治疗或预防作用。
实施例9
采用脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白的偶联物为主要原料,生产IgY注射剂,用于治疗乳腺癌。具体实施方案如下:
配方:
生产工艺:
1、,取配方量聚山梨醇酯-80,加入PEG400混匀;在搅拌下加入注射用水中;再加0.1%针用活性炭,600C搅拌15min;脱炭过滤;滤液密闭加热1000C30min,冷却至室温备用。
2、取经活性炭处理过的灭菌注射用水,于灭菌容器中加入脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物溶解,继续搅拌下,以细流加于上述混合液中,用0.1mol的NaOH溶液调节pH至6.0~7.5,用脱炭灭菌注射用水补足全量。
3、已灭菌的0.45μm串联0.22μm微孔滤膜除菌过滤。于无菌灌封机中灌封于无菌容器中。每支2ml,每支含脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及乳腺癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物5mg。
4、灯检、检漏、印字、包装即得500支IgY注射剂。
实施例10
采用脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及淋巴癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白的偶联物为主要原料,生产IgY注射剂,用于治疗淋巴癌。具体实施方案如下:
配方:
生产工艺:
1、取配方量聚山梨醇酯-80,加入PEG400混匀;在搅拌下加入注射用水中;再加0.1%针用活性炭,600C搅拌15min;脱炭过滤;滤液密闭加热1000C30min,冷却至室温备用。
2、取经活性炭处理过的灭菌注射用水,于灭菌容器中加入脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及淋巴癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物溶解,继续搅拌下,以细流加于上述混合液中,用0.1mol的NaOH溶液调节pH至6.0~7.5,用脱炭灭菌注射用水补足全量。
3、已灭菌的0.45μm串联0.22μm微孔滤膜除菌过滤。于无菌灌封机中灌封于无菌容器中。每支2ml,每支含脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及淋巴癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物5mg。
4、灯检、检漏、印字、包装即得500支IgY注射剂。
实施例11
生产脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物口服剂。具体实施方案如下:
配方:
工艺:
1.将配方量蒸馏水煮沸后冷却至室温;
2.将配方量脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及胃癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物和葡萄糖以及低聚果糖分别加入蒸馏水中,充分搅拌均匀。
3.用0.1mol、NaOH溶液调pH至7.0。将药液灌入消毒过的药用瓶中,每瓶100ml。
4.全检合格后包装出厂。
实施例12
采用脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及口腔癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白的偶联物为原料,生产一种口腔喷剂用于治疗或预防口腔癌;采用脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及食道癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白的偶联物为原料,生产一种口腔喷剂用于治疗或预防食道癌。
具体实施方案如下:
配方:
工艺:
将蒸馏水煮沸后冷却至室温。把配方量脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及鼻咽癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物或脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及食道癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物溶于160升蒸馏水中,再加入甘油混匀。薄荷脑、香精先加入乙醇溶解,再加PEG400混匀,在搅拌下加于上述溶液搅匀、过滤,补加蒸馏水至全量。用0.1mol、NaOH溶液调pH至7.0,灌装。将药液灌入常压喷雾瓶中,每支20ml。全检合格后包装即得10,000支防治口腔癌或食道癌用的IgY常压喷雾剂。
实施例13
以脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及口腔癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物为原料生产一种防治口腔癌的口含片或以脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及食道癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物为原料生产一种防治食道癌的口含片。具体实施方案如下:
配方:
工艺流程
1、山梨糖醇与阿斯巴甜充分混合均匀,过60目筛两次备用。
2、羧甲基纤维素分散于30%乙醇中制成1%乙醇溶液。
3、将1项用适量2项制软材,14目筛网制粒,60℃通风干燥,18目筛整粒。
4.用40目筛筛出适量细粉与IgY充分混匀并喷入薄荷、香橙香精搅匀,再拌入硬脂酸镁,一起与整批颗粒混合均匀,密闭4小时以上。
5.压片,每片600mg。
6.检验合格后包装出厂。
实施例14
生产脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及直肠癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物柱剂,用于治疗或预防直肠癌。具体实施方案如下:
配方:
工艺:
1.将配方量脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及直肠癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白的偶联物用蒸馏水溶解,得到IgY水溶液;
2.将配方量聚二醇6000置水浴上加热熔化;
3.将配方量甘油加入熔融的聚二醇6000中,充分搅拌均匀,形成膏体;
4.将膏体冷却到500C,迅速加入IgY水溶液,搅拌15-25min(不得超过25min),得到含IgY的稠浸膏体;
5.将含IgY的稠浸膏体迅速倒入已涂过液体石蜡的栓模中,冷却刮平,取出后用铝塑包装即得成品。
6.装盒,检验出厂。
实施例15
生产脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及子宫颈癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物阴道柱剂,用于治疗或预防子宫颈癌。
具体实施方案如下:
配方:
工艺:
1.将配方量脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及直肠癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物用少量蒸馏水溶解,得到IgY水溶液;
2.明胶加蒸馏水溶胀,加温溶解;
3.加入甘油混匀,冷至40℃以下;
4.加入IgY溶液,充分搅拌均匀;
5.倒换冷却,铝塑包装即得成品。
6.装盒,检验出厂。
实施例16
生产脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及子宫颈癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物泡腾片,用于治疗或预防子宫颈癌。具体实施方案如下:
[配方]
[制备工艺]
1.NaHCO360℃干燥2hr,加20%PEG乙醇液适量制软材,14目尼龙筛制粒60℃干燥备用。
2.枸椽酸、乳糖、MCC混匀80目粉碎,加于2%HPMC醇液中搅匀。
3.加入脂质体抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及子宫颈癌细胞特异性复合IgY与多聚精氨酸蛋白偶联物、褐藻蛋白混匀过一次14目筛,再加硬脂酸镁混匀压片即得。
4.检验合格后水泡眼包装,外套铝塑复合膜塑料袋密封,装盒,装箱入库。
实施例17
抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY以及癌细胞多联检验试剂盒的制造。
包括:
(1)胃癌多联检验试剂盒,
(2)口腔癌多联检验试剂盒,
(3)食道癌多联检验试剂盒,
(4)鼻咽癌多联检验试剂盒,
(5)肺癌多联检验试剂盒,
(6)结肠癌多联检验试剂盒,
(7)大肠癌多联检验试剂盒,
(8)直肠癌多联检验试剂盒,
(9)宫颈癌多联检验试剂盒,
(10)皮肤癌多联检验试剂盒,
(11)乳腺癌多联检验试剂盒,
(12)淋巴癌多联检验试剂盒,
共12种。
以【宫颈癌多联检验试剂盒】为例,说明具体实施方案,其他11种依此类推:
(一)试剂盒组成及试剂配制
1.酶联板:三块(96孔)
2.标准品:
(1)抗原I:端粒酶逆转录酶(hTERT)
6瓶,0.5ml/瓶。浓度分别为0ng/ml,1ng/ml,4ng/ml,20ng/ml,100ng/ml,200ng/ml。
(2)抗原II:p185erbB2蛋白
6瓶,0.5ml/瓶。浓度分别为0ng/ml,1ng/ml,4ng/ml,20ng/ml,100ng/ml,200ng/ml。
(3)抗原III:人肿瘤复合全抗原
6瓶,0.5ml/瓶。浓度分别为0ng/ml,1ng/ml,4ng/ml,20ng/ml,100ng/ml,200ng/ml。
3.抗体
(1)抗体I:HRP标记的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY。
1×10ml/瓶。
(2)抗体II:HRP标记的抗HER2特异性复合IgY。
1×10ml/瓶。
(3)抗体III:HRP标记的抗子宫颈癌细胞蛋白特异性复合IgY。
1×10ml/瓶。
4.TMB显色液:1×10ml/瓶。
5.浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍。
6.终止液:1×5ml/瓶(2N H2SO4)。
(二)检测范围:1.0ng/ml-200ng/ml
操作和计算方法按常规。
实施例18
抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2以及人肿瘤复合全抗原特异性复合IgY多联检验试剂盒的制造。
(一)试剂盒组成及试剂配制
1.酶联板:一块(96孔)
2.标准品:
(1)抗原I:端粒酶逆转录酶(hTERT)
6瓶,0.5ml/瓶。浓度分别为0ng/ml,1ng/ml,4ng/ml,20ng/ml,100ng/ml,200ng/ml。
(2)抗原II:p185erbB2蛋白
6瓶,0.5ml/瓶。浓度分别为0ng/ml,1ng/ml,4ng/ml,20ng/ml,100ng/ml,200ng/ml。
(3)抗原III:人肿瘤复合全抗原
6瓶,0.5ml/瓶。浓度分别为0ng/ml,1ng/ml,4ng/ml,20ng/ml,100ng/ml,200ng/ml。
4.抗体
(4)抗体I:HRP标记的抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性复合IgY。
1×10ml/瓶。
(5)抗体II:HRP标记的抗HER2特异性复合IgY。
1×10ml/瓶。
(6)抗体III:HRP标记的抗人肿瘤复合全抗原特异性复合IgY。
1×10ml/瓶。
4.TMB显色液:1×10ml/瓶。
5.浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍。
6.终止液:1×5ml/瓶(2N H2SO4)。
(二)检测范围:1.0ng/ml-200ng/ml
操作和计算方法按常规。
以上所述,仅是本发明抗端粒酶逆转录酶(hTERT)和HER2特异性复合IgY和抗HER2特异性IgY和抗端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性IgY以及抗端粒酶RNA(hTR)特异性IgY和抗人表皮生长因子受体(HER2)特异性IgY及其偶联物和相关制剂以及多联检验试剂盒的较佳实施例而已,并非对本发明的技术范围作任何限制,凡是依据本发明的技术实质对上面实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术的范围内。
Claims (15)
1.一种抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(A1) 基因重组端粒酶逆转录酶、人表皮生长因子受体蛋白和/或端粒酶RNA并纯化;
和/或培养人体组织肿瘤传代细胞并制备人体组织癌细胞蛋白;
(A2) 选取所述端粒酶逆转录酶、人表皮生长因子受体蛋白、端粒酶RNA和/或人体组织癌细胞蛋白中的至少一种,作为抗原成分,并将所述抗原成分按(1-10):(10-1)比例加入福氏佐剂,再高速匀化处理形成油包水乳液,制得抗原;
(A3) 采用淘汰法筛选具有高免疫应答能力的选择产蛋禽类,用以上抗原液免疫所选择的高免疫应答能力的产蛋禽类,再拣取被选出之产蛋禽类所产的免疫蛋;
(A4) 对所述免疫蛋进行消毒,取蛋黄,制备特异性IgY粗提物;
(A5) 将所述IgY粗提物通过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化,得特异性IgY纯品。
2.根据权利要求1所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法,其特征在于,所述步骤(A1) 中所述的人体组织癌细胞为人胃癌细胞、人口腔癌细胞、人食道癌细胞、人鼻咽癌细胞、人肺癌细胞、人结肠癌细胞、人大肠癌细胞、人直肠癌细胞、人宫颈癌细胞、皮肤癌细胞、乳腺癌细胞以及淋巴癌细胞中的单一人体组织癌细胞或多种复合的人体组织癌细胞。
3.根据权利要求1所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法,其特征在于,所述步骤(A2)中选取端粒酶逆转录酶作为抗原成分,所述步骤(A5)中制备的特异性IgY为抗端粒酶逆转录酶特异性IgY。
4.根据权利要求1所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法,其特征在于,所述制备步骤(A2)中选取人表皮生长因子受体作为抗原成分,所述步骤(A5)中制备的特异性IgY为抗人表皮生长因子受体特异性IgY。
5.根据权利要求1所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法,其特征在于,所述制备步骤(A2)中选取端粒酶RNA作为抗原成分,所述步骤(A5)中制备的特异性IgY为抗端粒酶RNA特异性IgY。
6.根据权利要求1或2所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法,其特征在于,所述制备步骤(A2)中选取端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体按(1-10):(10-1)混合均匀作为抗原成分,所述步骤(A5)中制备的特异性IgY为抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY。
7.根据权利要求6所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法,其特征在于,所述步骤(A2)中选取端粒酶逆转录酶、人表皮生长因子受体、以及所述人体组织癌细胞蛋白混合均匀作为抗原成分,所述步骤(A5)中制备的特异性IgY为抗端粒酶逆转录酶、人表皮生长因子受体及人肿瘤抗原特异性复合IgY。
8.根据权利要求7所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法,其特征在于:
所述人体组织癌细胞蛋白为单一人体组织癌细胞,则所述步骤(A2)中选取端粒酶逆转录酶、人表皮生长因子受体、以及所述单一人体组织癌细胞蛋白按(10-1):(10-1):(1-10)的比例混合均匀作为抗原成分;或
所述人体组织癌细胞蛋白为按均一比例混合而成的复合人体组织癌细胞,则所述步骤(A2)中选取端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体按(1-10):(10-1)混合后,与所述复合人体组织癌细胞蛋白按(1-10):(10-1)的比例混合均匀作为抗原成分。
9.根据权利要求2所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法,其特征在于,所述步骤(A2)中选取任意一种人体组织癌细胞蛋白作为抗原成分,所述步骤(A5)中制备的特异性IgY为多种抗人肿瘤抗原特异性IgY。
10.根据权利要求2所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY的制备方法,其特征在于,所述步骤(A2)中选取人体组织癌细胞蛋白中的至少二种混合均匀作为抗原成分,所述步骤(A5)中制备的特异性IgY为抗人肿瘤复合全抗原特异性IgY。
11.一种抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY,其特征在于,采用权利要求1-10中任意一项所述的方法制得。
12.一种抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY偶联物,其特征在于,将权利要求11所述的抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY与细胞穿透载体或化疗药偶联制得。
13.一种抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY组合制剂,其特征在于,采用权利要求1-10中任意一项所述的方法制得的特异性IgY加入各种辅料制成的组合制剂,包括喷雾剂(口喷剂、鼻喷剂等)、雾化剂、胶囊(软胶囊、硬胶囊)、口含片、咀嚼片、口服片、栓剂、泡腾片、乳膏或针剂。
14.一种抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY偶联物组合制剂,其特征在于,采用权利要求11所述抗端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体特异性复合IgY与细胞穿透载体或化疗药偶联制得的特异性复合IgY偶联物加入各种辅料制成的组合制剂,包括喷雾剂(口喷剂、鼻喷剂等)、雾化剂、胶囊(软胶囊、硬胶囊)、口含片、咀嚼片、口服片、栓剂、泡腾片、乳膏或针剂。
15.一种特异性复合IgY多联试剂盒,其特征在于,包括由权利要求3所制得的抗端粒酶逆转录酶特异性IgY和由权利要求4所制得的抗人表皮生长因子受体特异性IgY以及由权利要求10所制得的抗人肿瘤复合全抗原特异性IgY共三种抗体组合制成的一种【三联检测试剂盒】,或由权利要求3所制得的抗端粒酶逆转录酶特异性IgY和由权利要求4所制得的抗人表皮生长因子受体特异性IgY以及由权利要求9所制得的多种抗人肿瘤抗原特异性IgY中任意一种IgY共三种抗体组合制成的至少2种【三联检测试剂盒】。
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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