CN105189782A - 用于分析植物材料中独特的外源遗传元件组的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于在植物材料中检测异源DNA的系统和方法。

Description

用于分析植物材料中独特的外源遗传元件组的系统和方法
优先权声明
本申请要求获得2013年3月15日提交的标题为“用于分析植物材料中独特的外源遗传元件组的系统和方法”(“SYSTEMANDMETHODFORANALYSISOFPLANTMATERIALFORSETOFUNIQUEEXOGENOUSGENETICELEMENTS”)的美国临时专利申请系列号61/799,330的权益。
技术领域
本公开涉及植物生物技术。本公开的实施方案涉及独特的外源异源元件在用于在遗传修饰植物和由遗传修饰植物制备的产品的生产和商品化的过程中检测和跟踪转基因事件系统和方法中的应用。
背景
遗传修饰生物(GMO)，例如遗传修饰植物，是由至少一个转化事件定义的，转化事件通常涉及将异源基因构建体插入到受体生物中。异源基因构建体通常由若干元件构成，包括至少一个感兴趣的基因和用于对基因表达进行控制的调节元件。此外，构建体的两侧可以有来自克隆载体的DNA序列。大部分遗传修饰的植物向来是用含有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(P-35S)和/或CaMV35S终止子(T-35S)，或根癌土壤杆菌胭脂碱合酶终止子(T-Nos)的构建体转化的。最常用的克隆载体来自pBR322，其含有编码氨苄青霉素抗生素抗性的基因(bla)，和含有编码新霉素/卡那霉素抗生素抗性的基因(nptll)的载体。
可能由于许多原因而期望进行GMO的检测。例如，定性检测可用于鉴定未授权的GMO材料或这样的材料的使用。另外，还可能期望进行检测以鉴定安全或不安全的材料或者确认身份保持(identity-preserved)的材料的纯度。可应用定量检测以遵守法定或合同约定的GMO污染阈值(例如，在期望高纯度的产品的情况下，例如在有机农业(organicfarming)或种子批号认证(lotcertification)的情况下)。通过允许对GMO材料进行跟踪，检测也可以在安全评估和风险管理中发挥作用。在许多前述的应用中，检测方法需要有高灵敏度。
开发用于转基因检测和鉴定GMO的有效分析方法可减少分析时间和相关成本，在多年来一直是一个极其活跃的研究领域。Morrisetetal.(2008)Eur.FoodRes.Technol.227:1287-97。然而目前为止，还没有制定足够的策略，为当前使用的许多异源基因构建体和转化事件提供足够的检测能力。DNA是常规实验室检测和定量GMO的优先选择的分析物，因为它可以在从种子、饲料或者甚至高度加工后的食品样品中萃取之后有效地进行检测。
优选的现有转基因检测方法可检测转基因植物中的事件特异性元件(例如，转基因序列)。因为转基因事件中整合的大多数通用遗传元件(例如启动子、报告基因、终止子)被频繁地在多种载体中使用，通过这些遗传元件跟踪特定的事件是具有挑战性的。
由于检测测定系统所期望的灵敏度，在这些测定中通常首先通过聚合酶链式反应(PCR)从样品中扩增DNA。基于PCR的GMO检测方法可以根据它们的特异性水平进行分类。每个类别相应于在PCR反应中被扩增的DNA的身份：(1)筛选靶标；(2)基因特异性靶标；(3)构建体特异性靶标；和(4)事件特异性靶标。
第一类PCR方法(即，扩增筛选靶标，例如P-35S,T-35S,T-Nos,bla,和ornptll遗传元件)在检测被转化的材料中具有广泛应用。Matsuokaetal.(2002)J.Agric.FoodChem.93:35-8。然而，这些方法不能用于鉴定GMO，因为存在筛选靶标不一定意味着存在GMO来源的DNA。例如，P-35S或T-35S的来源可能是天然存在的CaMV。Wolfetal.(2000)Eur.FoodRes.Technol.210:367-72。
第二类PCR方法(即，扩增感兴趣的基因，例如CryIA基因)比第一类方法更有特异性。Vaitilingometal.(1999)J.Agric.FoodChem.47:5261-6。感兴趣的基因之间的多样性比可用的(且常用的)启动子和终止子之间的多样性大，并且通常特定转基因扩增的阳性信号表明样品中存在GM来源的DNA。然而，这些方法不能区分可能包含相同感兴趣基因(例如除草剂抗性基因)的不同GMO。随着人们把常用的转基因与其他转基因堆叠，形成对特定GMO而言特征性的特定组合这种缺陷在未来将会更加成问题。
第三类PCR方法靶标(即，扩增异源基因构建体相邻元件之间、例如启动子和感兴趣基因之间的接点)在当今的技术限制下提供转基因事件的唯一独特的标识(signature)。Zimmermanetal.(1998)Lebensm.-WissuTechnol.31:664-7。不幸的是，即使是事件特异性方法也具有其限制。例如，当两个GMO杂交时(例如，两种不同的GMO玉米，例如T25和Mon810)，所得杂交后代可能同时含有两个事件的标识，因此在PCR测试中无法与其双亲区分。这些检测方法的另一个麻烦的限制是，每一种GMO均要鉴定一个特异的引物对。而且，引物的设计和检测测定法的实施需要有关于构建体插入位点的信息，因此检测尚未表征的GMO是不可能的。
新方法遵循一般的策略，包括选择由不同检测方法构成的最优的组来搜索和鉴定样品中存在的特定GMO。Quercietal.(2010)Anal.Bioanal.Chem.396:1991-2002。最近有人提供了一个数据库，该数据库提供了用于特定GMO的最佳检测方法的信息，并且包括许多GMO中插入的特定DNA序列和侧翼元件。Dongetal.(2008)BMCBioinformatics9:260。随着新的GMO的引入，以及作为一项集合任务，人们针对GMO检测中涉及的实体的检测方法进行研究，该数据库要更新和增容。这个数据库预期会成为执行GMO测试的分析实验室的有用工具。
然而，在未来，根据这种常规思维的GMO检测将变得极其昂贵，因为越来越多的GMO植物被批准，其中每一种都会有其自身的最佳检测方法。此外，将多个农艺性状组合在单个GMO中(“基因堆叠”)也越来越普遍。Taverniersetal.(2008)Environ.BiosafetyRes.7:197-218。基因堆叠为GMO检测带来了一个艰难的挑战。除了检测来自个体植物的单个种子或组织之外，还没有现成的检测方法能够从两种或更多种单性状GMO和单堆叠GMO中充分区分组合存在的材料。Akiyama等(2005)J.Agric.FoodChem.55:5942-7；Holst-Jensen等(2006)J.Agric.FoodChem.54:2799-809；Taverniers等(2008)，同上。
近年来，人们对基于DNA的检测方法，包括微阵列/芯片和多重PCR，用于增加检测测定的灵敏度和输出以及用于鉴定堆叠的GMO的潜力进行了探索。参见，例如，Tengsetal.(2007)BMCBiotechnol.7:91。例如，Peanoetal.(2005)Anal.Biochem.346:90-100和Prinsetal.(2008)BMCGenomics9:584报道了一种组合转基因特异性连接反应、被连接寡核苷酸的PCR扩增、杂交和微阵列检测的方法。在这种方法中使用多个寡核苷酸标签来提供多重能力，这些标签固定化在微阵列表面上，并靶定被扩增的连接产物。人们预期将来会需要针对含有类型多样的大量事件的复杂样品进行灵敏的检测，使用各种手段开发GMO检测方法来应对该预期，此类检测方法和多重化工具是这些手段的代表。
公开
本文描述了一种系统，其提供了用于确定多个独特转基因事件的存在的单一高特异性、高灵敏性、基于PCR的检测测定系统。在一些实施方案中，该系统及其方法不需要任何关于转基因事件的整合位点的信息来实施该方法。在一些实例中，可以使用单独一对寡核苷酸引物(通用引物对)从许多不同外源构建体扩增多核苷酸，然后可以通过单一测定特异性地检测这些多核苷酸。本文的实施方案利用独特的核苷酸序列(在一组载体内)，这些核苷酸序列可具有相似的热动力学性质，且这些序列(在本文的一些地方称作“独特的外源遗传元件”或“UGE”)与特定的转基因唯一相关，并且可以在与该组载体中其它这样的独特核苷酸基本上相同的测定系统中被检测出来。本文的系统和方法可以提供用于检测/筛选多个转基因的单一手段，从而减少偶然存在测试(adventitiouspresencetesting)所需的检测测定系统的总数。
一些实施方案提供了用于在植物或植物材料(例如种子)中鉴定异源核酸的方法，其中该异源核酸包括5’多核苷酸、UGE、和3’多核苷酸。在具体的实施方案中，这种方法包括提供包含来自植物或植物材料的DNA的样品；使DNA接触与5’和3’多核苷酸特异性杂交的寡核苷酸引物对；扩增包含所述5’多核苷酸、所述UGE、和所述3’多核苷酸的扩增子；和使用特异性探针检测UGE(例如，在基于荧光的PCR测定系统，例如水解探针测定系统中)。在特定的实施方案中，这种方法包括通过对包含5’多核苷酸、UGE、和3’多核苷酸的扩增片段进行测序来检测UGE。正如本文中多个实施例所证明的，根据特定实施方案的方法提供了令人惊讶的特异性，这在一般的GMO检测方法中是前所未有的。
一些实施方案提供了用于在植物或植物材料中检测至少一个异源核酸的系统。一些系统包括一组载体，其中每一载体包含含有5’多核苷酸、UGE、和3’多核苷酸的异源核酸，其中5’多核苷酸和3’多核苷酸是该载体组中通用的(即，共有的)，并且其中每个载体的UGE对该组而言是独特的。一些系统可以包括通用的正向引物寡核苷酸，其与所述5’多核苷酸特异性杂交，和通用的反向引物寡核苷酸，其与所述3’多核苷酸特异性杂交。特定的系统可以包括一组探针分子，其中每个探针分子仅与该载体组中的仅一个UGE特异性杂交。
本文的系统和方法可用于在GMO植物中，包括在具有堆叠转基因的GMO植物中，鉴定大量转基因事件的存在，并具有前所未有水平的特异性和可推广性(generalizability)。在一些实例中，本文的系统和方法使得人们无需为了获得良好的GMO覆盖而为不同的事件独立地开发检测测定系统并组合不同的检测方法，这种策略可能是极为昂贵的。
可以将多个感兴趣的基因引入到包含UGE和通用引物位点的植物转化载体中，并且可以使用这些载体获得转基因植物。借此，可以转化多个基因并且可以使用单一的UGE特异性检测测定系统在转基因植物中追踪它们。对于用这些构建体转化的转基因植物，可以使用分离群体分组分析(bulkedsegregateanalysis)方法进行测试，这与既往可用的技术相比，能够显著减少鉴定用于进一步使用的转基因植物所需的测定数目。而且，本文的系统和方法由于有助于分析田间样品中意图性状的存在以及非意图性状的不存在(偶然存在(adventitiouspresence))，可以在性状基因渗透程序中帮助进行产业推进决策。
通过下面参考附图对多个实施方案的更详细的描述，前述和其它特征将不言自明。
附图简述
图1包括的示意图是6个分别来自质粒pEPP1135-pEPP1140的示例性含UGE的多核苷酸(SEQIDNO:55-60)的序列比对。F引物和R引物代表通用的正向和反向PCR引物。
图2包括UGE特异性PCR测定的检测结果。使用UGE特异性质粒DNA作为阳性对照(以圆圈表示)，使用非转基因玉米DNA和无模板对照样品作为阴性对照。样品一式三份进行实验。
图3包括的检测结果显示，极低浓度的靶UGEDNA可以用设计与之特异性杂交的水解探针检测到。在终点PCR中测试的模板(质粒DNA)浓度范围是0.0000001ng-1ng(从左至右方向显示)。纳入无模板对照以测试非特异性(圆圈标识)。
图4包括使用基于荧光的水解PCR测定系统对一种质粒的检测结果，该质粒在非转基因玉米基因组DNA背景中包含靶UGE(SEQIDNO:3)。提供了靶和内部对照的熔解曲线分析和交叉点循环数(Cp)。
图5包括使用基于荧光的水解PCR测定系统对一种质粒的检测结果，该质粒在非转基因玉米基因组DNA背景中包含靶UGE(SEQIDNO:8)。提供了靶和内部对照的熔解曲线分析和交叉点循环数(Cp)。
图6包括显示UGE克隆策略的示意图。在示意图中，“PTU”代表植物转化单元，“ZP”代表包含UGE的扩增子。“LB”和“RB”分别代表T-DNA的左侧和右侧边界。
图7包括显示用于农艺性状项目的UGE克隆策略实例的示意图。这个实例展示了将UGE克隆在可选择标志物(OsAct1-AAD1-ZmLip)和感兴趣的农艺基因之间。
图8包括显示在T1转基因玉米种子中的UGE序列检测的数据。阳性对照：含有UGE序列的质粒DNA；阴性对照：非转基因玉米基因组DNA；8A：含有UGE2的转基因玉米种子；8B：含有UGE3的转基因玉米种子。
图9包括显示在纯合转基因玉米种子样品中的UGE(UGE3)检测的数据。阴性对照-非转基因玉米DNA；阳性对照-ZCZ0000003质粒DNA；样品-表达UGE3的转基因T2玉米种子(pDAB108526,pDAB108527,pDAB108528；使用了如表9所示的6个不同种子来源)。
图10包括显示从转基因玉米检测UGE(UGE3)的灵敏度的数据。阴性对照-非转基因玉米DNA；阳性对照-ZCZ0000003质粒DNA；样品-转基因T2玉米种子DNA(pDAB108526-来源ID#ZQ11LQ199088.0016.016)的稀释物。
图11包括的数据证明了使用水解探针PCR测定在掺杂加标的转基因种子样品中检测UGE。阴性对照-非转基因玉米DNA；阳性对照-1％基因组DNA；样品-来自掺杂加标的玉米种子(1个转基因种子置于99个非转基因种子中)的36个DNA样品-12个生物学重复和3个技术重复。
序列表
附加序列表中列举的核酸序列用如37C.F.R.§1.822所定义的核苷碱基的标准字母缩写显示。仅显示了每个核酸序列的一条链，但是应当理解，对所显示的链的任何指称均包括了互补链。在附加序列表中：
SEQIDNO:1-21显示设计为与UGE多核苷酸(分别为“UGE1”-“UGE21”)特异性杂交(相同)的示例性寡核苷酸探针。
SEQIDNO:22-42显示的扩增子(“扩增子1-21”)，它们各自包含示例性UGE和供通用PCR正向和反向引物结合的5’和3’结合位点。
SEQIDNO:43-46显示的是引物，它们可在某些UGE荧光PCR测定中使用，以产生扩增子供用于通过水解探针测定进行UGE检测。
SEQIDNO:47显示了玉米转化酶基因，其在特定的实施方案中可用作阳性对照，以验证PCR和水解探针反应条件。
SEQIDNO:48显示了玉米ZSSIIb基因，其在特定的实施方案中可用作阳性对照，以验证PCR和水解探针反应条件。
SEQIDNO:49-50显示了可用于扩增部分玉米转化酶基因的引物。
SEQIDNO:51显示了可用于检测玉米转化酶基因的探针寡核苷酸。
SEQIDNO:52-53显示了用于扩增部分玉米ZSSIIb基因的引物。
SEQIDNO:54显示了可用于检测玉米ZSSIIb基因的探针寡核苷酸。
SEQIDNO:55-60显示了来自一组植物转化载体(pEPP1135-pEPP1140)的成员的含GUE的多核苷酸。
实施本发明的模式
I.若干实施方案的概览
遗传修饰生物(GMO)的监测需要有灵敏而可靠的检测方法。现有的DNA检测方法适于靶定转基因植物中的筛选元件、植物特异性元件、或事件特异性元件。本文所述的使用独特的、合成的非编码合成DNA序列(UGE)，当被整合到植物转化载体中时，可以作为靶标用于开发强力的通用测定方法，从而帮助转基因植物的监测。已经测试了一些UGE序列用于开发基于荧光的测定方法的便利性，并证明了它们在监测转基因植物中的用处。将含有被通用引物位点侧翼的UGE的构建体引入到植物转化载体中，并且显示了特定的水解探针检测方法可快速跟踪每个转化载体。
II.缩写
ABC-transporterATP结合盒转运子
AP偶然存在
BHQ2BlackHoleQuencherTM-2
FAM6-羧基荧光素酰胺
FET荧光能量转移
HEX六氯代荧光素
MGBNFQ小沟结合非荧光淬灭剂
PCR聚合酶链式反应
UGE独特的外源遗传元件
III.术语
偶然存在(adventitiouspresence)：如本文所使用的，“偶然存在”(AP)是指痕量转基因材料在植物材料样品中的非故意的、偶然的混在(commingling)。偶然存在的例子可以是，例如，在被认为完全由非转基因材料构成的样品中存在痕量的转基因材料，或者其例子可以是：在被认为完全由一种类型的转基因材料构成的材料样品中存在痕量的另一种类型的转基因材料。
回交：回交方法可用于将核酸序列引入到植物中。回交技术已经广泛使用了数十年，用于将新性状引入到植物中。Jensen,N.编辑.PlantBreedingMethodology,JohnWiley&Sons,Inc.,1988。在典型的回交方案中，原始的感兴趣栽培品种(轮回亲本)与携带待转移感兴趣基因的第二栽培品种(非轮回亲本)杂交。然后，该杂交所得的子代再次与轮回亲本杂交，重复这个过程直到获得这样的植物：其中除了来自非轮回亲本的被转移基因之外，轮回植物基本上全部的期望形态和生理特征也均被回收在被转换植物中。
分离的：“分离的”生物组分(例如核酸或蛋白质)与该组分天然存在的生物体细胞中的其它生物组分(即，其它染色体和染色体外DNA和RNA和蛋白质)基本上分离，与之分开产生，或者从其纯化，同时导致该组分中的化学或功能改变(例如，可以通过断裂将某核酸与染色体中的其余DNA连接的化学键而从染色体中分离该核酸)。已“分离”的核酸分子和蛋白质包括通过常规纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。
核酸分子：如本文所使用的，术语“核酸分子”可以指核苷酸的聚合物形式，其同时包括RNA的有义链和反义链、cDNA、基因组DNA，和上述的合成形式和混合聚合物。核苷酸可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或任一类型核苷酸的修饰形式。如本文所使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义的。除非另有规定，否则核酸分子的长度通常是至少10个碱基。该术语包括DNA的单链和双链形式。核酸分子可以包括天然存在的和通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸连接键连接在一起的经修饰核苷酸中的任一者或两者。
核酸分子可以被化学或生物化学修饰，或者可以含有非自然的或衍生的核苷碱基，这是本领域技术人员容易意识到的。这些修饰包括，例如，标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，核苷酸间修饰(例如，不带电的连接：例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电荷的连接：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；侧基部分：例如，肽；插层剂：例如，吖啶、补骨脂素等；螯合剂；烷化剂；和经修饰的连接：例如，α-异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链、三重复、发夹化(hairpinned)、圆形和挂锁构象。
外源：术语“外源”在本文中应用于核酸(例如，多核苷酸、DNA、RNA和基因)时，是指一个或多个通常不存在于其特定环境或内容中的核酸。例如，如果宿主细胞用天然不存在于非转化宿主细胞内的核酸转化，那么该核酸对宿主细胞是外源的。如本文所使用的，术语“外源”还指一个或多个在序列上与宿主细胞中已经存在的核酸相同，但是与宿主细胞中已经存在的具有相同序列的核酸相比，位于不同的细胞或基因组内容中的核酸。例如，与具有相同序列的核酸在宿主细胞基因组内的通常整合位置相比，整合在宿主细胞基因组的其他位置处的核苷酸对于宿主细胞是外源的。而且，当具有相同序列的核酸通常仅存在于宿主细胞的基因组内时，存在于宿主细胞内的质粒或载体中的核酸(例如，DNA分子)对宿主细胞是外源的。
异源：术语“异源”在本文中应用于核酸(例如，多核苷酸、DNA、RNA和基因)时，意味着不同的来源。例如，如果宿主细胞用天然不存在于非转化宿主细胞内的核酸转化，那么该核酸对宿主细胞是异源的(和外源的)。而且，转化核酸的不同元件(例如，启动子、增强子、编码序列、终止子，等)彼此之间和/或对被转化宿主而言可以是异源的。如本文所使用的，术语“异源”还可用于这样的一个或多个核酸，它们在序列上与宿主细胞已经存在的核酸相同，但是现在与不同的额外序列连接和/或以不同的拷贝数存在，等等。
序列同一性：如本文中所使用的，术语“序列同一性”或“同一性”在两个核酸或多肽序列的内容中，可以指当两个序列经过比对从而在特定比较窗口上具有最大相应度时，两个序列中相同的残基。
如本文所使用的，术语“百分比序列同一性”可以指通过在比较窗口上比较两个处于最佳比对的序列(例如，核酸序列和氨基酸序列)而确定的数值，其中比较窗口中的序列部分与参考序列(其不含有添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)，以实现两个序列的最佳比对。百分比的计算是通过确定两个序列中存在的相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目从而产生匹配位置数目，该匹配位置数目除以比较窗口内的位置总数，并将该结果乘以100从而产生百分比序列同一性。
用于比对比较序列的方法是本领域众所周知的。在下列文献中描述了各种程序和比对算法，例如：SmithandWaterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；NeedlemanandWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；PearsonandLipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；HigginsandSharp(1988)Gene73:237-44；HigginsandSharp(1989)CABIOS5:151-3；Corpetetal.(1988)NucleicAcidsRes.16:1088190；Huangetal.(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearsonetal.(1994)MethodsMol.Biol.24:307-31；Tatianaetal.(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174:247-50。序列比对方法和同源性计算的详细描述可以参见例如Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:40310。
美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLASTTM；Altschuletal.(1990))可从几个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)和在互联网上，与多种序列分析程序联合使用。如何使用这一程序确定序列同一性的描述可以在互联网上在BLASTTM的“帮助”一节中获得。对于核酸序列的比较，可以使用BLASTTM(Blastn)程序的“Blast2sequences”功能，采用缺省参数。当使用这种方法进行评估时，与参考序列具有越大相似性的核酸序列将显示越大的百分比同一性。
如本文所使用的，术语“基本上相同”可以指超过85％相同的序列。例如，基本上相同的核苷酸序列可以和参考序列至少85.5％；至少86％；至少87％；至少88％；至少89％；至少90％；至少91％；至少92％；至少93％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；至少98％；至少99％；或至少99.5％相同。
探针：在一些实施方案中，样品中特定核酸(例如UGE)的存在可以通过使用核酸探针进行检测。探针可以是DNA分子或RNA分子。探针可以含有特定核酸的全部或部分核苷酸序列，并且可以任选地进一步含有至少一个额外的核苷酸序列和/或标记物。
寡核苷酸探针可以合成制备或者通过克隆制备。合适的克隆载体对于本领域技术人员是熟知的。寡核苷酸探针可以被标记或无标记。存在大量用于标记核酸分子的技术，包括例如但不仅限于：通过切口移行的放射性同位素标记；随机引发；用末端脱氧核苷酸转移酶加尾；等，其中所用的核苷酸被标记，例如用放射性32P标记。可以使用的其它标记物包括，例如但不仅限于：荧光团(例如，单独或带有淬灭剂)；酶；酶底物；酶的辅因子；酶抑制剂；等。可选择地，作为使用自身或与其他反应剂一起提供可检测信号的标记物的替代手段，可以使用与受体结合的配体，其中受体被标记(例如，用上面提到的标记物标记)以便自身或者与其它试剂一起提供可检测信号。参见，例如Learyetal.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4045-9。
探针也可以是和待检测的特定核酸(即，靶)“可特异性杂交”或“特异性互补”的核酸分子。术语“可特异性杂交”和“特异性互补”表示有足够程度的互补性使得探针与靶之间发生稳定而特异的结合。核酸分子与其特异性杂交的靶序列不一定100％互补。当存在足够程度的互补性从而避免核酸在期望发生特异性结合的条件下(例如在严格杂交条件下)与非靶序列结合时，核酸分子是可特异性杂交的。
导致特定严格程度的杂交条件随着所选杂交方法的本质和杂交核酸序列的组成和长度而不同。一般地，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(具体地，Na+和/或Mg++浓度)会决定杂交的严格度，尽管清洗时间也会影响严格度。关于获得特定严格程度所需的杂交条件的计算是本领域普通技术人员已知的，并且在例如下列文献中有讨论：Sambrook等(编辑)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,第1-3卷,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989,第9和11章；和HamesandHiggins(eds.)NucleicAcidHybridization,IRLPress,Oxford,1985。关于核酸杂交更详细的说明和指导可以参见例如Tijssen,“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,”收录于LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,第I部分,第2章,Elsevier,NY,1993；和Ausubel等编辑,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2章,GreenePublishingandWiley-Interscience,NY,1995。
如本文所使用的，“严格条件”包括这样的条件，该条件下只有当杂交分子与DNA靶之间的错配小于25％时才会发生杂交。“严格条件”包括其他具体水平的严格度。因此，如本文所使用的，“适度严格”条件是指序列配错大于25％的分子不会杂交的条件；“中等严格”条件是指序列配错大于15％的分子不会杂交的条件；“高严格”条件是指序列配错大于10％的分子不会杂交的条件。“极高严格”条件是指序列配错大于6％的分子不会杂交的条件。
在特定的实施方案中，严格条件是在下列条件杂交：65℃的6x生理盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液，5xDenhardt溶液，0.5％SDS和100μg剪切的鲑鱼精DNA，随后在65℃的2xSSC缓冲液和0.5％SDS，然后是1xSSC缓冲液和0.5％SDS，最后是0.2xSSC缓冲液和0.5％SDS中顺次清洗15-30分钟。
可操作连接：当第一核酸序列与第二核酸序列在功能上关联时，第一核酸序列与第二核酸序列是可操作连接的。例如，当启动子影响编码序列的转录或表达时，启动子与该编码序列可操作连接。当重组产生时，可操作连接的各核酸序列一般是邻接的，并且当需要连接两个蛋白质编码区时，它们处于同一阅读框内。然而，可操作连接的元件不一定是邻接的。
启动子：转录所需的DNA区，其一般位于上游(朝向基因的5’区)。启动子允许受其控制的基因适当激活或抑制。启动子包含被转录因子识别的特定序列。这些因子与启动子DNA序列结合并导致RNA聚合酶的招募，该酶从基因的编码区合成RNA。在一些实施方案中，使用组织特异性启动子。组织特异性启动子是一种DNA序列，其指导相关基因在启动子特异的组织中以与生物体其它组织相比更高水平的转录。组织特异性启动子的实例包括绒毡层特异性启动子；花药特异性启动子；花粉特异性启动子(参见，例如，美国专利No.7,141,424，和国际PCT公开No.WO99/042587)；胚珠特异性启动子(参见，例如，美国专利申请No.2001/047525A1)；果实特异性启动子(参见，例如，美国专利No.4,943,674和5,753,475)；和种子特异性启动子(参见，例如，美国专利No.5,420,034和5,608,152)。在一些实施方案中，也使用发育阶段特异性启动子，例如，在发育晚期阶段激活的启动子。
转化：当病毒或载体将核酸分子转移到细胞内时，病毒或载体“转化”或“转导”细胞。当核酸分子被细胞稳定复制时，通过将核酸分子合并到细胞基因组中或者通过附加体复制，细胞被转导进细胞内的核酸分子“转化”。如本文所使用的，术语“转化”包括能够将核酸分子引入到这样的细胞内的所有技术。实例包括，但不仅限于，用病毒载体转染，用质粒载体转化，电穿孔(Frommetal.(1986)Nature319:791-3),脂质体转染(Felgneretal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7),显微注射(Muelleretal.(1978)Cell15:579-85),土壤杆菌介导的转移(Fraleyetal.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803-7),直接DNA摄取,和微粒轰击(Kleinetal.(1987)Nature327:70)。
转基因：一种外源核酸序列。在一个实例中，转基因是基因序列(例如，除草剂抗性基因)，编码工业上或药物上有用化合物的基因，或编码期望的农艺性状的基因。在另外一个实例中，转基因是反义核酸序列，其中反义核酸序列的表达会抑制靶核酸序列的表达。转基因可以含有与转基因可操作连接的调节序列(例如启动子)。
载体：如本文所使用的，术语“载体”是指能够将至少一个核酸片段转移到细胞内的多核苷酸或其它分子。载体可以任选地包含介导载体维持和/或实现其意图用途的组分/元件(例如，复制必需的序列，赋予药物或抗生素抗性的基因，多克隆位点，和/或能够使被克隆基因表达的操作连接的启动子/增强子元件)。载体可以来自，例如，质粒、噬菌体、或植物或动物病毒。“克隆载体”、“穿梭载体”或“亚克隆载体”一般包括可操作连接的元件，以方便克隆或亚克隆步骤(例如，含有多个限制性核酸内切酶位点的多克隆位点)。
表达载体：如本文所使用的，术语“表达载体”是指这样的载体，它包含可操作连接的多核苷酸序列，这些多核苷酸序列可以促进编码序列在特定宿主生物体内表达的。例如，细菌表达载体可以促进编码序列在细菌内表达。类似地，植物表达载体可以促进编码序列在植物细胞内表达。促进在原核生物体内表达的多核苷酸序列可以包括，例如但不仅限于，启动子；操纵基因；和核糖体结合位点。真核生物表达载体(例如植物表达载体)可以包括，例如，启动子；增强子；终止信号；和多聚腺苷酸信号(以及其它序列)，其一般与在原核生物表达载体中所使用的不同。
性状或表型：术语“性状”和“表型”在本文中可互换使用。出于本公开的目的，特别感兴趣的性状包括农艺学重要的性状，例如可以在例如作物植物中表达的。
独特的外源遗传元件(UGE)：UGE是独特的、合成的DNA序列，当它们被纳入到植物转化载体内时，它们充当DNA检测测定的靶标。首先，将单一的独特的预先验证过的UGE引入到植物转化载体内。然后，利用含有UGE的植物转化载体克隆受同一启动子驱动的多个基因。快速开发UGE特异性的、基于荧光的PCR测定，以相对容易地跟踪每个转化载体。可以用分离群体分组分析(bulkedsegregateanalysis)方法对来源于这些构建体的转基因植物进行测试，从而显著减少测定的数目。
IV.独特的外源遗传元件
本文的实施方案中包括独特的、合成的、非编码合成DNA序列(本文称作“独特的外源遗传元件”，或“UGE”)，其可用于开发通用的UGE特异性核酸检测方法。UGE可以被设计成使组内所有UGE在杂交测定中均具有与寡核苷酸相似的热动力学性质。在一组核酸中，例如用于导入生物体的一组核酸中，可以包含一组截然不同的/独特的UGE，与该核酸组中其他感兴趣的核酸在一起，以便以可特异性鉴定的方式鉴定来自特定公司或实验室的构建体，含有某些类型基因或遗传元件的构建体，和/或包含这些构建体的GMO(例如植物)。
在一些实施方案中，UGE是独特的鉴定标志物，它们被该组通用的共同引物所侧翼并被其扩增，使得包含该UGE的核酸可以被普遍地(universally)和特异地(specifically)鉴定，例如通过DNA序列分析、杂交和基于荧光的PCR分析鉴定。在一些实例中，对于GMO中包含UGE的异源核酸，可以使用与UGE特异性杂交的独特的可淬灭荧光标记的探针(例如，水解探针)通过基于荧光的实时PCR方法加以鉴定。例如，UGE寡核苷酸本身可以纳入到被标记的探针分子中。通用PCR引物和UGE可以在单个测定中对包含许多不同转基因的复杂GMO材料提供高特异性和高效的扩增和基于荧光的检测。在一些实例中，可以通过对被通用引物侧翼的扩增DNA片段进行测序从而确定样品中存在的UGE的身份，来鉴定GMO中的包含UGE的异源核酸。
在特定的实施方案中，利用荧光偶联的PCR作为检测测定系统。这种基于PCR的测定系统是本领域已知的。美国专利Nos.5,210,015和5,487,972。例如，特定的实施方案利用涉及三个寡核苷酸的PCR反应：正向引物；反向引物；和产荧光探针。产荧光探针可以包括，例如但不仅限于，在5'端用报告荧光染料(例如，FAM和HEX)标记，并在3'端用淬灭剂染料(例如，MGBNFQ和BHQ2)标记的寡核苷酸。在这种示例性探针分子中，由于在空间上与淬灭剂染料邻近而导致的FET抑制，在特定波长(488nm)激发报告荧光染料并不会产生荧光。在水解探针PCR测定过程中，探针和引物最初与靶DNA杂交。在延伸期，位于引物与引物之间的探针与聚合酶接触，并被其核酸外切酶活性水解。探针水解导致荧光报告物从FET抑制中释放出来，并且报告物荧光在每个PCR循环中与PCR产物的累积一致地增加。
在一些实施方案中，UGE被设计成具有足够的长度，以便在包含UGE的系列中提供足够的序列多样性，使得寡核苷酸探针可以被设计成与组中的每一个UGE特异性杂交。例如，UGE可以被设计成，例如但不仅限于：长度超过大约10个核苷酸；超过大约15个；超过大约20个；超过大约25个；大约10个-大约25个；大约15个-大约25个；大约10个-大约20个；和大约15-大约20个核苷酸。在特定的实施方案中，UGE从下组中选出：UGE1-UGE21(SEQIDNO:1-21)。
在一些实施方案中，UGE可以被包含在可扩增的核酸(扩增子)中，该可扩增的核酸也包含侧翼通用引物。在一些实例中，侧翼的通用引物可以与UGE直接毗邻；即不被任何其他核苷酸序列隔开。包含UGE和侧翼通用引物的扩增子可以具有足够的长度，以便能够在PCR反义中被扩增。例如但不仅限于，这样的扩增子的长度可以是小于大约150；小于大约130；小于大约110；小于大约100个；小于大约90个；小于大约85个；小于大约80个；大约60-大约100个；大约60-大约90个；大约60-大约80个；大约70-大约100个；大约70-大约90个；和大约70-大约80个核苷酸。在特定的实施方案中，包含UGE和侧翼引物位点的扩增子可以选自下组：扩增子1-21(SEQIDNO:22-42)。
在一些实施方案中，UGE(例如在还包含侧翼通用引物的扩增子中)可以，例如，被包含在载体系统中，载体系统包括例如但不仅限于，线性质粒和闭环质粒。在特定的实例中，载体可以是表达载体。根据特定实施方案，包含UGE的扩增子可以被，例如，插入到载体中，使该核酸序列与一个或多个调节序列可操作连接。有许多载体可供用于这种目的，并且具体载体的选择取决于例如待插入到载体内的核酸的大小，待被载体转化的特定宿主细胞，和/或期望表达的融合蛋白的量。载体通常含有各种组分，组分的身份取决于载体的功能(例如，DNA扩增和DNA表达)，和与载体相容的特定宿主细胞。
一些实施方案可以包括植物转化载体，其包括侧翼是通用引物位点的UGE，和与至少一个调节序列可操作连接的感兴趣的基因。感兴趣的基因可以在调节序列的控制下在植物细胞、组织或生物体中表达以产生融合蛋白。这样的调节序列可以是在宿主植物细胞中发挥功能的启动子序列。
适用于根据本发明的一些实施方案的核酸分子中的启动子包括可诱导的、病毒、合成的或组成型启动子，这些启动子都是本领域众所周知的。可用于本发明一些实施方案的启动子的非限制性实例由下提供：美国专利No.6,437,217(玉米RS81启动子)；5,641,876(水稻肌动蛋白启动子)；6,426,446(玉米RS324启动子)；6,429,362(玉米PR-1启动子)；6,232,526(玉米A3启动子)；6,177,611(组成型玉米启动子)；5,322,938,5,352,605,5,359,142,和5,530,196(35S启动子)；6,433,252(玉米L3oleosin启动子)；6,429,357(水稻肌动蛋白2启动子,和水稻肌动蛋白2内含子)；6,294,714(光诱导的启动子)；6,140,078(盐诱导的启动子)；6,252,138(病原体诱导的启动子)；6,175,060(磷缺乏诱导的启动子)；6,388,170(双向启动子)；6,635,806(γ-coixin启动子)；和美国专利申请系列No.09/757,089(玉米叶绿体醛缩酶启动子)。
额外的示例性启动子包括胭脂氨酸合成酶(NOS)启动子(Ebertetal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(16):5745-9)；章鱼碱合成酶(OCS)启动子(其被携带在根癌土壤杆菌的肿瘤诱导质粒上)；花椰菜花叶病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawtonetal.(1987)PlantMol.Biol.9:315-24)；CaMV35S启动子(Odelletal.(1985)Nature313:810-2)；玄参花叶病毒35S启动子(Walkeretal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(19):6624-8)；蔗糖合酶启动子(YangandRussell(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:4144-8)；R基因复合启动子(Chandleretal.(1989)PlantCell1:1175-83)；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；CaMV35S(美国专利No.5,322,938,5,352,605,5,359,142,和5,530,196)；FMV35S(美国专利Nos.6,051,753,和5,378,619)；PC1SV启动子(美国专利No.5,850,019)；SCP1启动子(美国专利No.6,677,503)；和AGRtu.nos启动子(GenBank登录号V00087；No.V00087；Depickeretal.(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:561-73；Bevanetal.(1983)Nature304:184-7)。
在特定的实施方案中，本发明的核酸分子可以包括组织特异性启动子。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列，其与生物体的其它组织相比，指导可操作连接的核苷酸序列在启动子特异的组织中以更高水平转录。组织特异性启动子的实例包括，但不仅限于：绒毡层特异性启动子；花药特异性启动子；花粉特异性启动子(参见，例如，美国专利No.7,141,424，和国际PCT申请No.WO99/042587)；胚珠特异性启动子(参见，例如，美国专利申请No.2001/047525A1)；果实特异性启动子(参见，例如，美国专利No.4,943,674和5,753,475)；和种子特异性启动子(参见，例如，美国专利No.5,420,034和5,608,152)。在一些实施方案中，在本发明的组合物或方法中可以使用发育阶段特异性的启动子(例如，在发育后期激活的启动子)。
在一些实施方案中可以和核酸分子可操作连接的其它调节序列包括位于启动子序列和编码序列之间的5’UTR，其发挥翻译前导序列的功能。翻译前导序列存在于完全加工后的mRNA中，并且会影响初级转录本的加工和/或RNA稳定性。翻译前导序列的实例包括玉米和矮牵牛热休克蛋白前导序列(美国专利No.5,362,865)，植物病毒外壳蛋白前导序列，植物rubisco前导序列，和其他。参见，例如，TurnerandFoster(1995)MolecularBiotech.3(3):225-36。5’UTR的非限制性实例由下提供：GmHsp(美国专利No.5,659,122)；PhDnaK(美国专利No.5,362,865)；AtAnt1；TEV(CarringtonandFreed(1990)J.Virol.64:1590-7)；和AGRtunos(GenBank登录号No.V00087；和Bevanetal.(1983)，同上)。
在一些实施方案中可以和核酸分子可操作连接的其它调节序列还包括3’非翻译序列、3’转录终止区，或多聚腺苷酸区。这些是位于核苷酸序列的下游的遗传元件，并且包括可提供多聚腺苷酸化信号、和/或其它能够影响转录或mRNA加工的调节信号的多核苷酸。多聚腺苷酸化信号在植物中发挥功能，导致在mRNA前体的3’端添加多聚腺嘌呤核苷酸。多聚腺苷酸化序列可以来自多种植物基因，或者来自T-DNA基因。3’转录终止区的非限制性实例是胭脂氨酸合酶3'区(nos3’；Fraleyetal.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803-7)。使用不同3'非翻译区的一个实例在Ingelbrechtetal.(1989)PlantCell1:671-80中提供。多聚腺苷酸信号的非限制性实例包括来自豌豆RbcS2基因(Ps.RbcS2-E9；Coruzzietal.(1984)EMBOJ.3:1671-9)和AGRtu.nos(GenBank登录号No.E01312)的信号。
关于可用于特定实施方案的调节序列的其他信息在下列文献中有描述，例如：Goeddel(1990)“GeneExpressionTechnology,”MethodsEnzymol.185,AcademicPress,SanDiego,CA。
本发明的重组核酸分子或载体可以包括可选择标志物，可选择标志物赋予被转化的细胞(例如植物细胞)可选择的表型。可选择标志物还可用于选择包含本发明核酸分子的植物或植物细胞。标记可以编码杀生物剂抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、遗传霉素(G418)、博来霉素和潮霉素)，或除草剂抗性(例如，草甘膦)。可选择标志物的实例包括，但不仅限于：neo基因，其赋予卡那霉素抗性并可以使用例如卡那霉素和G418进行选择；bar基因，其赋予双丙氨磷抗性；突变的EPSP合酶基因，其赋予草甘膦抗性；腈水解酶基因，其赋予溴苯腈抗性；突变的乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，其赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性；和氨甲喋呤抗性DHFR基因。有多种赋予对化学剂的抗性的可选择标志物可供使用，化学剂包括例如但不仅限于，氨苄青霉素；博莱霉素；氯霉素；庆大霉素；潮霉素；卡那霉素；林可霉素；甲氨蝶呤；膦丝菌素；嘌呤霉素；壮观霉素；利福平；链霉素；和四环素。这些可选择标志物的实例在，例如，美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047中有例证。
本发明的核酸分子或载体还可/另可包括可筛选标志物。可筛选标志物可用于监视表达。示例性的可筛选标志物包括β-葡萄糖醛酸酶或uidA基因(GUS)，其编码各种生色底物已知的酶(Jeffersonetal.(1987)PlantMol.Biol.Rep.5:387-405)；R-座位基因，其编码调节植物组织中花青素色素(红色)的产生的产物(Dellaportaetal.(1988)“MolecularcloningofthemaizeR-njallelebytransposontaggingwithAc.”收录于18thStadlerGeneticsSymposium,P.GustafsonandR.Appels编辑.,Plenum,NY(第263-82页)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffeetal.(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:3737-41)；编码各种生色底物已知的酶的基因(例如PADAC，一种发色头孢菌素)；荧光素酶基因(Owetal.(1986)Science234:856-9)；xylE基因，其编码儿茶酚双加氧酶，可以转换生色儿茶酚(Zukowskietal.(1983)Gene46(2-3):247-55)；淀粉酶基因(Ikatuetal.(1990)Bio/Technol.8:241-2)；酪氨酸酶基因，其编码的酶能够将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌，其进一步缩合成黑色素(Katzetal.(1983)J.Gen.Microbiol.129:2703-14)；和α-半乳糖苷酶。
合适的转化宿主细胞的方法包括任何能够将DNA引入到细胞内的方法，例如但不仅限于：通过原生质体转化(见例如美国专利5,508,184)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(见例如，Potrykusetal.(1985)Mol.Gen.Genet.199:183-8)；通过电穿孔(见例如，美国专利5,384,253)；通过用碳化硅纤维搅拌(见例如，美国专利5,302,523和5,464,765)；通过土壤杆菌介导的转化(见例如，美国专利5,563,055，5,591,616，5,693,512，5,824,877，5,981,840，和6,384,301)；和通过DNA包被粒子的加速(见例如，美国专利5,015,580，5,550,318，5,538,880，6,160,208，6,399,861，和6,403,865)。通过例如这些技术的应用，几乎任何物种的细胞均可被稳定地转化。在一些实施方案中，转化DNA被整合到宿主细胞的基因组中。在多细胞物种的情况下，转基因细胞可以再生为转基因生物。任何这些技术均可以用于产生转基因植物，例如在转基因植物的基因组中包含一个或多个本发明的核酸序列的转基因植物。
最广泛使用的将表达载体引入到植物内的方法是基于土壤杆菌的天然转化系统。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌是可以遗传转化植物细胞的植物致病性土壤细菌。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。Ti(肿瘤诱导)质粒含有一个被称为T-DNA的大节段，其被转移到被转化植物中。Ti质粒的另一个节段，vir区域，负责T-DNA转移。T-DNA区域以左手和右手边界为边界，左手和右手边界分别由末端重复核苷酸序列构成。在一些经过修改的二元载体中，肿瘤诱导基因被删除，而利用vir区域的功能来转移以T-DNA边界序列为边界的外来DNA。T区还可以包含，例如，用于高效回收转基因植物和细胞的可选择标志物，和用于插入供转移的序列(例如编码本发明融合蛋白的核酸)的多克隆位点。
因此，在一些实施方案中，植物转化载体源自根癌土壤杆菌的Ti质粒(参见，例如美国专利No.4,536,475,4,693,977,4,886,937,和5,501,967；和欧洲专利EP0122791)或者发根土壤杆菌的Ri质粒。其它的植物转化载体包括，例如但不仅限于，下列文献中描述的那些：Herrera-Estrellaetal.(1983)Nature303:209-13；Bevanetal.(1983),同上；Kleeetal.(1985)Bio/Technol.3:637-42；和欧洲专利EP0120516，和源自前述任何者的载体。其它与植物自然相互作用的细菌，例如中华根瘤菌、根瘤菌和慢生根瘤菌，也可以被修饰用以介导将基因转移到许多不同的植物中。这些植物相关共生细菌通过同时获得卸甲的Ti质粒和合适的二元载体能够取得基因转移的能力。
提供外源DNA到受体细胞之后，一般对被转化的细胞进行鉴定用于进一步的培养和植株再生。为了提高鉴定被转化细胞的能力，人们可能期望在用于产生转化体的载体中使用可选择的或可筛选的标志物基因，如前文所述。在使用可选择标志物的情况下，通过将细胞暴露于选择剂(或多种选择剂)，在潜在的被转化细胞群体中鉴定出被转化的细胞。在使用可筛选标志物的情况下，细胞可以根据期望的标记基因性状进行筛选。
对于暴露于选择剂后存活的细胞或者在筛选测定中被评定为阳性的细胞，可以将其在支持植株再生的培养基中进行培养。在一些实施方案中，任何合适的植物组织培养基(例如MS和N6培养基)均可以通过包含加入其它物质，例如生长调节剂来进行改良。组织可以保持在含有生长调节剂的基础培养基中，直到可以获得足够的组织以开始植株再生工作，或者进行重复多轮的人工筛选，直到组织形态适合于再生(例如，至少2周)，然后转移到有利于芽形成的培养基中。定期转移培养物，直到出现足够的芽。一旦形成芽，便将它们转移到有利于根发生的培养基中。一旦形成足够的根，便可以将植物转移到土壤中用于进一步的生长和成熟。
使用土壤杆菌依赖的转化方法形成的转基因植物通常含有被插入到一个染色体内的单个重组DNA序列。单个重组DNA序列被称作“转基因事件”或“整合事件”。这类转基因植物对于插入的DNA序列而言是杂合的。在一些实施方案中，通过将含有单个外源基因序列的独立分离的转基因植物与其自身(例如F0植物)进行有性交配(自交)，以产生Fl种子，可以获得对转基因而言纯合的转基因植物。四分之一的所产生的Fl种子对于转基因是纯合的。萌发Fl种子产生能够用于杂合性测试的植物，通常使用能够区分杂合子和纯合子的SNP测定或热扩增测定(即，接合性测定)。
除了用本发明的核酸分子直接转化植物或植物细胞之外，在一些实施方案中可以通过将具有至少一个转基因事件的第一植物与缺少该事件的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可以将包含UGE的核酸分子引入到适合被转化的第一植物品系中来产生转基因植物，该转基因植物可以和第二植物品系杂交，从而将包含该UGE的核酸分子基因渗入到第二植物品系中。
在本文的一些实施方案中，可以对任何GMO进行分析。在特定的实施方案中，GMO是经过遗传修饰的植物。用本文特定系统和方法分析的植物材料样品可以是任何可能包含不同的和多种外源核酸的物质，例如但不仅限于，对遗传修饰植物特异的外源核酸，或来源于遗传修饰植物的外源核酸。在一些实施例中，样品可以是食物、食物成分、食品添加剂、和/或包含来自GMO的材料的固体或液体提取物。在一些实例中，可以在分析之前从植物材料样品中将核酸提取出来。
遗传修饰的植物可以是双子叶或单子叶植物物种。可以根据本发明具体实施方案进行分析的来自双子叶植物的细胞的非限制性实例包括：紫花苜蓿(alfalfa)；豆类(beans)；芸苔属植物(Brassica)；西兰花；卷心菜；芥花(canola)；胡萝卜；花椰菜；芹菜；大白菜；棉花；黄瓜；茄子；莴苣；瓜；豌豆；胡椒；花生；土豆；南瓜；萝卜；油菜；菠菜；大豆；西葫芦(squash)；甜菜；向日葵；烟草；番茄；和西瓜。可以根据本发明具体实施方案进行分析的来自单子叶植物的细胞的非限制性实例包括：玉米；洋葱；水稻；高粱；小麦；黑麦；小米；甘蔗；燕麦；小黑麦(triticale)；柳枝稷；和草坪草。
提供了下面的实施例以示例说明某些特定的特征和/或实施方案。不应认为这些实施例将本公开限制在这些特定的特征或所示例说明的实施方案中。
实施例
实施例1:用于产生转基因植物的包含独特遗传元件的载体的设计和构建
使用(MICROSOFT)应用中的宏生成了包含15-25bp随机核苷酸序列的独特合成遗传元件(UGE)。生成了期望长度的包含数字1-4的随机编号系列。每个数字与特定的核苷酸碱基相匹配(例如1＝A；2＝C；3＝G；和4＝T)，从而产生多核苷酸，随后由商业供应商合成该多核苷酸用于克隆操作。
将这些UGE纳入到70-80bp的较长序列中(本文称作扩增子)，它们包含用于结合通用PCR正向和反向引物的侧翼序列。设计了21个UGE和21个相关扩增子(每一个包含UGE序列和侧翼通用引物结合位点)，并由商业供应商(DNA2.0；MenloPark,CA)合成到高拷贝质粒中。表1列出了21个UGE和相应扩增子的序列。
表1.UGE和包含特定UGE(下划线)和通用引物结合位点的扩增子的序列
如下构建修饰的高拷贝植物转化载体组：将包含UGE的选定扩增子片段，该UGE对该组而言是独特的，克隆到祖先植物转化载体(一种土壤杆菌双元载体)的NarIII和AsiSI位点中。各扩增子片段均位于设计用作植物可选择标志物的基因(例如，除草剂抗性基因)的启动子区与(反向的)第一感兴趣基因的启动子区之间。在T-DNA边界之间往往还包含其它感兴趣的基因。
实施例2:玉米基因组DNA提取
使用改良的FastIDTM方法(FastIDTM基因组DNA96孔提取试剂盒；GENETICID,Fairfield,IA)从单个玉米种子样品提取基因组DNA。将种子样品在GENO/GRINDERTM2010(SPEXSAMPLEPREP,Metuchen,NJ)上在4mL聚碳酸酯小瓶(OPSDiagnosticsLLC,Lebanon,NJ)中用9.65cm不锈钢球以1500rpm研磨2分钟。向单个种子研磨粉添加1mL含有蛋白酶K的裂解缓冲液(FastIDTM基因组DNA试剂盒)，将浆液进一步以1500rpm均质20秒。将小瓶以1450xg离心3分钟，将200μL上清液转移到含有结合缓冲液和磁珠(MAGATTRACTTMSuspensionG；Qiagen)的KINGFISHERTM96孔深孔板(ThermoFisherScientificInc.,Indianapolis,IN)中。
或者，在要用大批(bulk)研磨粉进行偶然存在测试的实验中，添加600μL裂解缓冲液，并在GENO/GRINDERTM2010上以1360rpm对浆液均质5分钟。将样品以6800xg离心沉降5分钟，将200μL上清液转移到含有结合缓冲液和磁珠的KINGFISHERTM平板中。
在两种情况下(单种子和大批研磨种子)，使用KINGFISHERTM自动DNA提取平台对与磁珠结合的DNA进行清洗和洗脱。在200μL1xTE缓冲液(10mMTrisHCL,1mMEDTA,pH8.0)中将DNA洗脱，并保存于4℃直至进一步使用。提取的DNA用QUANT-ITTMPICOGREENDNA测定试剂盒(MOLECULARPROBES；Invitrogen,Carlsbad,CA)进行定量，并添加缓冲液至终浓度为10ng/μL。
实施例3:转基因玉米植物的产生
当胚长度为大约1.8-2.4mm时，从玉米自交系B104的穗分离未成熟的胚。将胚与含有乙酰丁香酮和表面活性剂BREAKTHRUTMS-233、光密度为1.0的土壤杆菌混悬液温育20-30分钟，然后置于共培养培养基上，盾片向上。
共培养步骤持续3-4天，然后将胚转移到含有抗生素的植物组织培养培养基上7天，以抑制土壤杆菌生长和触发愈伤组织形成。将愈伤组织移到含有合适选择剂的培养基上以抑制非转化组织生长，历时3周，然后置于含有植物生长激素的选择培养基上，历时7天，以诱导体细胞胚萌发。暴露于植物生长激素培养基1周之后，将愈伤组织置于有选择的植物再生培养基上。
在转移到植物再生培养基上1-2周内通常会形成植物，随着幼苗发育，将它们移到植物生长培养基上。从每个植物取样10-15mg叶片组织用于可选择标志物基因(AAD1；美国专利No.7,838,733)的水解探针PCR分析，1周后将每个构建体的30-40个低拷贝数事件(即，可选择标志物基因的1-3个拷贝)转移到温室，以便移植并在温室中生长。所有的T0事件均去雄(de-tassel)并用B104花粉授粉以产生T1种子。T1和T2植物自花授粉以产生纯合的种子。
实施例4:载体组中包含的独特遗传元件的检测
含有UGE扩增子的质粒DNA中的各个UGE使用具有独特水解寡核苷酸探针的PCR方法进行检测。在PCR测定中，使用通用引物从不同构建体组扩增和检测UGE。用于扩增表1所列扩增子的通用引物如表2所述。设计可与靶UGE特异性杂交的可淬灭的基于荧光的PCR水解探针，并用FAM荧光报告染料(MGBNFQ作为淬灭剂)进行标记。水解探针寡核苷酸包含与要检测的UGE相同的核苷酸序列。
通过测试下述者的系列稀释物来进行UGE的预验证：含有UGE的质粒DNA自身、和掺杂有不同浓度的含有UGE的质粒DNA的非转基因玉米基因组DNA。因此，还设计了引物和水解探针，用于扩增并特异性杂交靶玉米内部对照ZSSIIb(SEQIDNO:48)和转化酶(SEQIDNO:47)，表3。这些对照探针用HEX荧光报告染料(BHQ2作为淬灭剂)标记。引物和探针从AppliedBioSystems(Carlsbad,CA)或IntegratedDNATechnologies(Coralville,IA)获得。PCR试剂从Qiagen(Valencia,CA)获得。
表2.用于扩增包含UGE的片段用于水解探针测定的引物对和PCR引物序列
表3.用于检测玉米内部对照基因的PCR引物和探针序列
水解探针PCR的验证证明，以高准确度、高特异性和高效率检测到了各个UGE。根据表4-5的条件使用终点和实时PCR技术从质粒和玉米基因组DNA检测UGE。实施双重(Biplex)PCR测定以检测靶(UGE)和内部对照(转化酶或ZSSIIb)二者。
表4.PCR反应的组分
*适量；包括在含有玉米基因组DNA的实验中.
**适量，调节至总体积为12μL
制备PCR预混物(表4)之后，向每个孔转移7μL预混物(用于384孔板)或12μL预混物(用于96孔板)，添加3μLDNA样品(最多达30ng/反应)。PCR平板用FLEXISEALTM膜密封，并在热循环仪中进行反应。
当将UGE质粒掺杂加标到从非转基因玉米制备的基因组DNA中时(表5b)，或者当测定从转基因玉米制备的基因组DNA中的UGE时(表5c)，利用不同的PCR条件检测质粒样品中的UGE(表5a)。在UGE质粒被掺杂加标到玉米基因组DNA的实验中，以及当测定转基因玉米DNA中的UGE时，实施双重水解探针PCR测定来同时检测UGE和玉米内部对照(参考)基因(转化酶或ZSSIIb)。对于终点PCR反应，使用C1000热循环仪(BIORAD)或PE9700热循环仪(PERKINELMER)。对于实时PCR反应，使用II热循环仪(ROCHE)。
表5.PCR反应参数
完成的PCR平板在PHERASTARTMFS荧光酶标仪(BMGLABTECH；Cary,NC)上读数。
合成含有6个UGE(表1；UGE1-UGE6)其中之一的扩增子，并将它们克隆到高拷贝数质粒中，并使用合适的质粒DNA(即，pEPP1135-pEPP1140；其分别对应于UGE1-UGE6)在终点PCR反应中测试PCR扩增和检测效率、特异性和灵敏度。在VectorNTI中对含有这6个UGE和侧翼元件的多核苷酸序列进行比对，以显示核苷酸序列的差异，图1。
UGE检测的特异性
测试靶向6个UGE的各水解探针(用FAM荧光染料标记)对每一个UGE质粒DNA(pEPP1135-pEPP1140)的作用。每个设计的水解探针靶向6个不同UGE中之一，这些水解探针均特异性地扩增了靶UGE(用圆圈标出)，并且没有见到来自其它探针的非特异性扩增/交叉反应性，图2。显示水解探针可以区分质粒DNA中的所有6个不同的含UGE的盒(pEPP1135-pEPP1140)。还用无模板对照和阴性对照玉米DNA对探针进行了测试，以排除任何非特异性结合，图2。
UGE检测的灵敏性
为每个含UGE的质粒使用合适的UGE模板/水解探针组合实施了水解探针测定终点PCR反应，用来确定方法灵敏度水平。使用含有UGE的质粒DNA作为PCR扩增模板。测试的浓度范围是0.0000001ng-1ng质粒DNA。结果显示，使用所有水解探针可以检测极低浓度的含UGE的模板DNA，图3。还针对无模板对照和阴性对照玉米DNA对探针进行测试，以排除任何非特异性结合，图3。
实施例5:玉米DNA中独特遗传元件的特异和灵敏检测
在非转基因玉米基因组DNA中检测UGEDNA
当UGE(UGE2,UGE3,和UGE7-UGE21)被掺杂加标到玉米基因组DNA背景中时，通过实时水解探针PCR将它们检测出来。测试的稀释范围是0.0000001ng-1ng。实时PCR使用LIGHTCYCLERTMII热循环仪实施。为每个靶DNA稀释物分析熔解曲线，并计算平均Cp值。为测试的每个UGE确定的检测限如表6所示。单个测定的实例(检测UGE3和UGE4)分别如图4和图5所示。这些PCR结果证明了以高灵敏度检测UGE的可行性，这提示UGE能够提供用于检测植物转化构建体的新工具。
表6.当UGE掺杂加标到非转基因玉米基因组DNA中时UGE的检测限。“最低检测量”表示每个UGE在水解探针实时PCR测定中的检测限。
UGE No. 最低检测量(ng)
2 0.0001
3 0.00001
7 0.0000001
8 0.0000001
9 0.0000001
10 0.0000001
11 0.000001
12 0.0000001
13 0.0000001
14 0.000001
15 0.0000001
16 0.000001
17 0.000001
18 0.0000001
19 0.000001
20 0.0000001
21 0.000001
在来自转基因玉米植物种子的基因组DNA中检测UGE
进一步按照图6-7所述的策略将UGE扩增子克隆到植物转化载体中。在366个携带不同感兴趣基因的植物表达载体中使用了12个包含UGE的扩增子，产生了将近8,000个转基因事件。表7。
表7.包含整合到植物转化载体内的UGE的扩增子
用含有UGE2和UGE3的构建体转化获得杂合T1转基因事件，从杂合T1转基因事件的种子分离基因组DNA，用该基因组DNA测试UGE检测(种子来源如表8所列)。基因组DNA的分离如早前所述。将基因组DNA的浓度调节到10ng/μL，每个PCR反应使用总共30ng基因组DNA。使用非转基因玉米种子DNA作为阴性对照。
表8.用于在从杂合转基因玉米植物的种子制备的基因组DNA中进行UGE检测的材料
UGE No. 种子ID 事件ID 转化质粒
2 ZT00274311 ZX17897-0859190 pDAB106476
2 ZT00276232 ZX18037-0867761 pDAB106479
2 ZT00328210 ZX18758-0889569 pDAB106529
3 ZT00305360 ZX20077-0912363 pDAB108323
4 ZT00328418 ZX19537-0906115 pDAB108526
4 ZT00297283 ZX19538-0905769 pDAB108527
实施UGE特异性终点水解探针PCR测定，结果作为标准化荧光对样品编号的函数进行分析。图8。结果显示，从转基因样品获得了灵敏的扩增并且检测到靶UGE序列，而非转基因玉米样品则没有扩增，从而证明了本检测方法的特异性。
实施例6:使用独特的异源元件用于偶然存在试验
为了检验UGE用于检测偶然存在的应用，用含有UG3的构建体转化产生转基因植物，从转基因植物获得T2纯合种子(种子来源如表9所列)。每个事件总共选择35个纯合转基因种子，并分离DNA。
表9.用于在从纯合T2转基因玉米植物的种子制备的基因组DNA中进行UGE3检测的材料的身份
谱系 来源ID
B104/pDAB108526{ZX19537}0906118.001-B ZQ11LQ199088.0016.016
B104/pDAB108526{ZX19537}0906133.001-B ZQ11LQ199111.0092.092
B104/pDAB108527{ZX19538}0907077.001-B ZQ11LQ199735.2436.2436
B104/pDAB108527{ZX19698}0907681.001-B ZQ11LQ199785.2620.2620
B104/pDAB108528{ZX19737}0908226.001-B ZQ11LQ199807.2688.2688
B104/pDAB108528{ZX19737}0908230.001-B ZQ11LQ199831.2740.2740
进行UGE特异性终点水解探针PCR测定，并且如实施例5所述分析结果。结果显示，从纯合转基因样品和阳性对照样品清晰地扩增了靶UGE3序列，从非转基因玉米样品(阴性对照)没有扩增。图9。
将从转基因来源IDNo.ZQ11LQ199088.0016.016(表9)的35个纯合种子制备的玉米基因组DNA样品汇集在一起，并以非转基因玉米基因组DNA作为背景(稀释剂)产生系列稀释物(100％,10％,1％,0.5％和0.1％转基因DNA)。在终点水解探针PCR测定中对每个转基因DNA稀释物的6个重复样品进行分析(40个循环)。
结果作为相对荧光对样品号的函数加以分析。图10。从所有稀释物均测量得到了相对荧光。从阴性样品(无模板对照和非转基因DNA对照)没有观察到非特异性扩增。这些结果证明，能够以极高的灵敏度和准确度检测到从转基因玉米种子制备的基因组DNA中的UGE。
通常对含100个种子的池检测偶然存在，这需要合适的检测方法以从99个非转基因种子中鉴定出单个污染性转基因种子，相当于要求1％的灵敏度。将含有UGE(UGE3)的单个转基因T2玉米种子(pDAB108526-来源ID#ZQ11LQ199088.0016.016)掺杂到99个非转基因玉米种子的池中。使用终点水解探针PCR对从种子池分离的DNA进行检测。结果证明，使用UGE特异性测定可以容易地检测出污染性种子(图11)，进一步增强了UGE能够用于AP测试和用于监测转基因事件的主张。

Claims (44)

1.一种在含有植物DNA的样品中鉴定异源核酸群体中的一个或多个异源核酸的方法，其中每个异源核酸均包含这样的扩增子，该扩增子沿着5’-3’方向包含：第一多核苷酸，其具有在该群体的所有成员之间都相同的核苷酸序列；第二多核苷酸，其具有在该群体的所有成员中独特的核苷酸序列；和第三多核苷酸，其具有在该群体的所有成员之间都相同的核苷酸序列，该方法包括：
提供包含植物DNA的样品；
使植物DNA与寡核苷酸引物对接触，该引物对与所述第一和第三多核苷酸特异性杂交；
在聚合酶链式反应(PCR)中扩增该样品中的异源核酸中存在的每个所述扩增子；和
使所述扩增子与至少一个探针分子接触，该探针分子包含与所述第二多核苷酸特异性杂交的寡核苷酸，其中该探针与包含所述第二多核苷酸的扩增子特异性杂交而产生可检测的信号。
2.根据权利要求1的方法，其中所述异源核酸群体中的每个异源核酸均包含感兴趣的基因，并且其中在该异源核酸群体中的每个异源核酸中所述第二多核苷酸均位于所述感兴趣的基因的外部。
3.根据权利要求2的方法，其中在该异源核酸群体中每一个异源核酸中所述第一多核苷酸和所述第三多核苷酸均位于所述感兴趣的基因的外部。
4.根据权利要求1的方法，其中所述探针分子包含荧光团和淬灭剂，并且其中对包含与所述寡核苷酸特异性杂交的第二多核苷酸的扩增子的PCR扩增使所述探针分子中的荧光团从淬灭剂释放，从而产生可检测的荧光信号。
5.根据权利要求1的方法，其中每个扩增子的长度为约70至约80个核苷酸。
6.根据权利要求1的方法，其中每个第二多核苷酸的长度为约15至约25个核苷酸。
7.根据权利要求1的方法，其中在每个扩增子中所述第二多核苷酸与所述第一多核苷酸和所述第三多核苷酸直接毗邻。
8.根据权利要求1的方法，其中使植物DNA与寡核苷酸引物接触、扩增每个扩增子、以及使扩增子与探针分子接触均在终点PCR反应中实施。
9.根据权利要求1的方法，其中使植物DNA与寡核苷酸引物接触、扩增每个扩增子、以及使扩增子与探针分子接触均在实时PCR反应中实施。
10.根据权利要求1的方法，其中样品包含与该样品中DNA的总量相比为至少约8.33x10-8％的量的异源核酸，并且探针通过与异源核酸中的扩增子的特异性杂交产生可检测信号。
11.根据权利要求1的方法，其中异源核酸是感兴趣的农艺基因，并且所述样品来自为引入该感兴趣的农艺基因而进行的性状基因渗入程序中的植物。
12.根据权利要求1的方法，其中该方法是为了鉴定样品不含有所述异源核酸而实施的。
13.一种用于在遗传修饰植物中检测异源核酸群体中的一种或多种异源核酸的系统，该系统包括：
一组植物表达载体，其中每个载体包含表达盒，该表达盒含有异源核酸，该异源核酸沿着5’-3’方向包含：
第一多核苷酸，
第二多核苷酸，其具有在该组的所有载体中独特的核苷酸序列，和
第三多核苷酸，
通用正向引物寡核苷酸，其与所述第一多核苷酸特异性杂交；和
通用反向引物寡核苷酸，其与所述第三多核苷酸特异性杂交。
14.权利要求13的系统，该系统还包括一组探针分子，其中每个探针分子包含仅与该组中一个载体的第二多核苷酸特异性杂交的寡核苷酸，其中该探针与包含该第二多核苷酸的扩增子的特异性杂交产生可检测的信号。
15.权利要求13的系统，其中所述表达盒包括一个或多个与感兴趣的基因可操作连接的调节元件。
16.权利要求13的系统，其中每个表达盒均包含感兴趣的基因，并且其中在该异源核酸群体中的每个异源核酸中所述第二多核苷酸均位于感兴趣的基因的外部。
17.权利要求15的系统，其中在每个所述表达盒中所述第一多核苷酸和所述第三多核苷酸均位于感兴趣的基因的外部。
18.权利要求14的系统，其中所述探针分子包含荧光团和淬灭剂，并且其中对包含与所述寡核苷酸特异性杂交的第二多核苷酸的扩增子的PCR扩增使探针分子中的荧光团从淬灭剂释放，从而产生可检测的荧光信号。
19.权利要求13的系统，其中每个异源核酸的长度为约70至80个核苷酸。
20.权利要求13的系统，其中每个第二多核苷酸的长度为约15至25个核苷酸。
21.权利要求13的系统，其中在每个异源核酸中所述第二多核苷酸与所述第一多核苷酸和所述第三多核苷酸直接毗邻。
22.权利要求13的系统，该系统进一步包括至少一个包含来自用该组表达载体中的至少一个表达载体转化的植物的DNA的样品。
23.一种用于在遗传修饰植物中检测异源核酸群体中的一个或多个异源核酸的方法，该方法包括：
提供权利要求22的系统；
使来自该植物的DNA与通用正向引物和通用反向引物接触；
在聚合酶链式反应(PCR)中从该组中的载体扩增出所述异源核酸；和
检测一个或多个所述第二多核苷酸。
24.根据权利要求23的方法，其中从该组中的载体扩增出异源核酸的群体。
25.根据权利要求23的方法，其中检测一个或多个第二多核苷酸包括使扩增出的核酸与一个或多个探针分子接触，其中每个探针分子包含仅与该组载体中一个载体的第二多核苷酸特异性杂交的寡核苷酸，其中该探针与包含第二多核苷酸的扩增子的特异性杂交产生可检测的信号。
26.根据权利要求25的方法，其中使DNA与通用正向引物和通用反向引物接触、扩增异源核酸、以及使扩增出的异源核酸与探针分子接触均是在水解探针PCR测定中实施的。
27.根据权利要求23的方法，其中检测一个或多个第二多核苷酸包括对扩增出的核酸进行测序。
28.一种核酸，其包含具有选自下组的核苷酸序列的多核苷酸：SEQIDNO:1-21。
29.权利要求28的核酸，其中该核酸包含选自下组的核苷酸序列：SEQIDNO:22-42。
30.一种用于在遗传修饰生物中检测外源核酸的系统，该组包括：
至少一个包含具有选自SEQIDNO:1-21的核苷酸序列的多核苷酸的核酸；和
至少一个探针分子，所述探针分子包含与该系统中的所述至少一个核酸中的每一个特异性杂交的寡核苷酸。
31.权利要求30的系统，其中包含具有选自SEQIDNO:1-21的核苷酸序列的多核苷酸的核酸包含选自SEQIDNO:22-42的核苷酸序列。
32.权利要求30的系统，该系统进一步包括两个引物寡核苷酸，它们与所述包含具有选自SEQIDNO:1-21的核苷酸序列的多核苷酸的核酸特异性杂交。
33.权利要求31的系统，该系统进一步包括两个引物寡核苷酸，它们与所述核酸在选自SEQIDNO:22-42的核苷酸序列内的位点处特异性杂交，其中所述引物寡核苷酸不与所述核酸在选自SEQIDNO:1-21的核苷酸序列内的位点处特异性杂交。
34.一种用于在包含植物DNA的样品中鉴定异源核酸群体中的一个或多个异源核酸的方法，其中每个异源核酸包含这样的扩增子，该扩增子沿着5’-3’方向包括：第一多核苷酸，其具有在该群体的所有成员之间都相同的核苷酸序列；第二多核苷酸，其具有在该群体的所有成员中独特的核苷酸序列；和第三多核苷酸，其具有在该群体的所有成员之间都相同的核苷酸序列，该方法包括：
提供含有植物DNA的样品；
使植物DNA与寡核苷酸引物对接触，该寡核苷酸引物对与所述第一和第三多核苷酸特异性杂交；
在聚合酶链式反应(PCR)中扩增该样品中的异源核酸中存在的每个扩增子；和
对扩增出的扩增子进行测序以确定一个或多个独特的第二多核苷酸的存在。
35.根据权利要求34的方法，其中该异源核酸群体中的每个异源核酸均包含感兴趣的基因，并且其中在该异源核酸群体中的每个异源核酸中第二多核苷酸均位于感兴趣的基因的外部。
36.根据权利要求34的方法，其中在该异源核酸群体中的每个异源核酸中第一多核苷酸和第三多核苷酸均位于感兴趣的基因的外部。
37.根据权利要求34的方法，其中每个扩增子的长度为约70至约80个核苷酸。
38.根据权利要求34的方法，其中每个第二多核苷酸的长度为约15至约25个核苷酸。
39.根据权利要求34的方法，其中在每个扩增子中所述第二多核苷酸与所述第一多核苷酸和所述第三多核苷酸直接毗邻。
40.根据权利要求34的方法，其中使植物DNA与寡核苷酸引物接触、扩增每个扩增子、以及使扩增子与探针分子接触均在终点PCR反应中实施。
41.根据权利要求34的方法，其中使植物DNA与寡核苷酸引物接触、扩增每个扩增子、以及使扩增子与探针分子接触均在实时PCR反应中实施。
42.根据权利要求34的方法，其中样品包含与样品中DNA的总量相比为至少约8.33x10-8％的量的异源核酸，且通过该探针与异源核酸中的扩增子的特异性杂交产生可检测信号。
43.根据权利要求34的方法，其中所述异源核酸是感兴趣的农艺基因，且样品来自用于引入该感兴趣农艺基因的性状基因渗入程序中的植物。
44.根据权利要求34的方法，其中该方法是为了鉴定样品不含有所述异源核酸而实施的。
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