BR112015020703B1 - Métodos para identificação e sistemas para detecção de ácidos nucleicos exógenos em um organismo geneticamente modificado em uma amostra compreendendo dna de planta e polinucleotídeo - Google Patents

Abstract

métodos para identificação e sistemas para detecção de ácidos nucleicos exógenos em um organismo geneticamente modificado em uma amostra compreendendo dna de planta e ácido nucleico. a presente invenção refere-se a um sistema e método para detecção de dna heterólogo em materiais de planta.

Description

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. de Série 61/799.330, depositado em 15 de março de 2013, para SISTEMA E MÉTODO PARA ANÁLISE DE MATERIAL DE PLANTA PARA CONJUNTO DE ELEMENTOS GENÉTICOS EXÓGENOS ÚNICOS.

CAMPO TÉCNICO

[0002] A presente revelação se relaciona a biotecnologia de plan ta. Concretizações da revelação se relacionam ao uso de elementos genéticos exógenos únicos em um sistema, e método para detecção e rastreio de eventos transgênicos através de produção e comercialização de plantas geneticamente modificadas e produtos produzidos a partir destas.

ANTECEDENTES

[0003] Um organismo geneticamente modificado (GMO), tal como uma planta geneticamente modificada, é definido pelo menos um evento de transformação que usualmente envolve a inserção de um construto de gene heterólogo no organismo recipiente. O construto de gene heterólogo é tipicamente composto de vários elementos, incluindo pelo menos um gene de interesse e regiões regulatórias para exercer controle de expressão de gene. Em adição, o construto pode ser flanqueado por sequências de DNA a partir do vetor de clonagem. A maioria de plantas geneticamente modificadas foram transformadas com construtos contendo o promotor de Vírus de Mosaico de Couve- Flor (CaMV) 35S (P-35S) e/ou o terminador 35S de CaMV (T-35S), ou dos de pBR322, contendo um gene que codifica para resistência a an-tibióticos de ampicilina (bla), e vetores contendo um gene que codifica para resistência a antibióticos de neomicina/canamicina (nptll).

[0004] A detecção de GMOs pode ser desejada por muitas razões. Por exemplo, a detecção qualitativa pode ser usada para identificar material de GMO não-autorizado, ou uso de tal material. Adicionalmente, a detecção pode ser desejada para identificar material seguro ou não-seguro, ou para a certificação de pureza de material de identidade preservada. A detecção quantitativa pode ser usada para cumprir com limites legais ou contratualmente acordados de contaminação de GMO (por exemplo, quando produtos de alta pureza são desejados como no caso de agricultura orgânica ou certificação de lote de semente). A detecção pode também desempenhar um papel na avaliação da segurança e controle de risco por permitir o rastreio do material de GMO. Em muitas das aplicações precedentes, alta sensibilidade é requerida para o método de detecção.

[0005] O desenvolvimento de métodos analíticos efetivos para detecção e identificação de transgene de GMOs que reduzem tempo e custos associados de análise tem sido uma área extremamente ativa de pesquisa por muitos anos. Morriset et al. (2008) Eur. Food Res. Technol. 227:1287-97. Ainda, nenhuma estratégia adequada tem sido aconselhada que proporciona capacidades de detecção adequadas para os muitos construtos de gene heterólogos e eventos de transformação atualmente em uso. O DNA é o analito de escolha para a detecção de laboratório de rotina e quantificação de GMOs, visto que ele pode ser efetivamente detectado após extração de semente, alimentação, ou mesmo amostras de alimentação altamente processadas.

[0006] Os métodos de detecção de transgene atuais preferidos detectam elementos específicos de evento (por exemplo, sequências de transgene) em plantas transgênicas. Desde que muitos dos ele- mentos genéticos genéricos integrados em um evento transgênico (por exemplo, promotor, gene repórter, terminador) são frequentemente usados em múltiplos vetores, rastreando eventos específicos por estes elementos genéticos tornados desafiadores.

[0007] Devido a sensibilidade desejada para ensaios de detecção, o DNA é tipicamente primeiro amplificado por reação de cadeia de po- limerase (PCR) a partir da amostra em tal ensaio. Os métodos de detecção de GMO à base de PCR podem ser classificados de acordo com seu nível de especificidade. Cada categoria corresponde a identidade do DNA que é amplificado na reação de PCR: (1) classificação de alvos; (2) alvos específicos de gene; (3) alvos específicos de cons- truto; e (4) alvos específicos de evento.

[0008] A primeira categoria de métodos de PCR (isto é, amplificação de classificação de alvos, por exemplo, os elementos genéticos P-35S, T-35S, T-Nos, bla, e ornptll), tem amplas aplicações para detecção de material transformado. Matsuoka et al. (2002) J. Agric. Food Chem. 93:35-8. Contudo, estes métodos não podem ser usados para identificar o GMO, visto que a presença de DNA derivado de GMO não se segue necessariamente a partir da presença da classificação do alvo. Por exemplo, a fonte de P-35S ou T-35S pode ser CaMV que ocorre naturalmente. Wolf et al. (2000) Eur. Food Res. Technol. 210:367-72.

[0009] A segunda categoria de métodos de PCR (isto é, amplificação de um gene de interesse, por exemplo, o gene CryIA) é mais específica do que a primeira categoria de métodos. Vaitilingom et al. (1999) J. Agric. Food Chem. 47:5261-6. Existe grande diversidade entre os genes de interesse do que entre os promotores e terminadores disponíveis (e comumente usados), e normalmente um sinal positivo para a amplificação de um transgene específico implica que o DNA derivado de GM está presente na amostra. Contudo, estes métodos não podem se distinguir entre GMOs diferentes que podem compreender o mesmo gene de interesse, tal como um gene de resistência á herbicida. Esta falha se tornará mais problemática no futuro, visto que transgenes comuns são empilhados juntos com outras em particular combinações que são características de GMOs específicos.

[0010] A terceira categoria de métodos de PCR alvos (isto é, amplificação de uma junção entre elementos adjacentes do construto de gene heterólogo, por exemplo, entre o promotor e o gene de interesse), proporciona a somente única assinatura de um evento de transformação, dentro das limitações da tecnologia dos dias atuais. Zimmerman et al. (1998) Lebensm.-Wiss u Technol. 31: 664-7. Infelizmente,métodos ainda específico de evento têm suas limitações. Por exemplo, quando dois GMOs são cruzados (por exemplo, dois milhos de GM diferentes, tais como T25 e Mon810), o descendente híbrido resultante pode conter assinaturas de ambos eventos e, portanto, será indistinguível de seus parentes em um teste de PCR. Uma limitação adicional onerosa destes métodos de detecção é que um par de iniciadorespecífico é requerido para cada GMO a identificar. Além disso, a informação relacionada ao local de inserção do construto é necessária para designar iniciadores e conduzir o ensaio de detecção, que produz detecção de GMOs impossíveis não-caracterizados.

[0011] Novas abordagens aderem a uma estratégia geral incluindo a seleção de um conjunto ótimo de métodos de detecção diferentes para pesquisar e identificar GMOs particulares presentes em uma amostra. Querci et al. (2010) Anal. Bioanal. Chem. 396:1991-2002. Recentemente, uma base de dados que proporciona informação nos métodos de detecção ótimos para GMOs particulares, e incluindo sequências de DNA específicas de elementos inseridos e de flanquea- mento em muitos dos GMOs, foi proporcionada. Dong et al. (2008) BMC Bioinformatics 9:260. A base de dados é para ser atualizada e aumentada a medida que novos GMOs são introduzidos e métodos de detecção investigados como uma tarefa coletiva para entidades envolvidas na detecção de GMOs. Esta base de dados é esperada ser uma ferramenta útil para laboratórios analíticos que realizam teste de GMO.

[0012] No futuro, contudo, a detecção de GMO de acordo com estavisão convencional se tornará proibitivamente custosa, devido a números aumentados de plantas de GMO aprovadas, cada uma da qual terá seu próprio método de detecção ótimo. Além disso, é aumen- tadamente comum combinar traços agronômicos múltiplos em um GMO único ("empilhamento de gene"). Taverniers et al. (2008) Environ. Biosafety Res. 7:197-218. O empilhamento de gene introduz um desafiodifícil para detecção de GMO. Com a exceção de teste de sementes simples ou tecido derivado de plantas individuais, nenhum método de detecção existente pode adequadamente discriminar entre a presença combinada de material de dois ou mais GMOs de traço simples, e GMOs empilhados simples. Akiyama et al. (2005) J. Agric. Food Chem. 55:5942-7; Holst-Jensen et al. (2006) J. Agric. Food Chem. 54:2799-809; Taverniers et al. (2008), supra.

[0013] Nos anos recentes, métodos de detecção à base de DNA incluindo microarray/chip e PCRs multiplex foram explorados para o potencial de aumento de sensibilidade de ensaio de detecção e saída, e para identificação de GMOs empilhados. Ver, por exemplo, Tengs et al. (2007) BMC Biotechnol. 7:91. Por exemplo, Peano et al. (2005) Anal. Biochem. 346:90-100 and Prins et al. (2008) BMC Genomics 9:584, reportaram uma abordagem combinando uma reação de ligação específica de transgene, amplificação de PCR do oligonucleotídeo ligado,hibridização, e detecção de microarray. Etiquetas de oligonu- cleotídeo múltiplos na superfície da microarray que tem como alvo os produtos de ligação amplificados foram usadas para proporcionar capacidades de multiplex nesta abordagem. Tais métodos de detecção e ferramentas de multiplexação representam as abordagens atualmente usadas para desenvolver métodos de detecção de GMO que determinam a expectativa que detecção sensível será requerida no futuro de amostras complicadas contendo uma pluralidade diversa de eventos.

REVELAÇÃO

[0014] É aqui descrito um sistema que proporciona um ensaio de detecção à base de PCR altamente específico simples e altamente sensível, para determinação da presença de uma pluralidade de eventostransgênicos únicos. Em algumas concretizações, o sistema e método deste não requer qualquer informação relacionada ao local de integração do evento transgênico para realizar o método. Em alguns exemplos, um par simples de iniciadores de oligonucleotídeo (um par de iniciador universal) pode ser utilizado para amplificar polinucleotí- deos de muitos construtos exógenos diferentes que podem, em seguida, serem especificamente detectados, via um ensaio simples. As concretizações aqui utilizam sequências de nucleotídeo únicas (dentro de um conjunto de vetores) que podem ter propriedades termodinâmicas similares, cujas sequências (referidas em alguns locais aqui como "elementos genéticos exógenos únicos", ou "UGEs") são unicamente associadas com um transgene particular, e podem ser detectadas em substancialmente o mesmo ensaio como outro tais nucleotídeos únicos dentro do conjunto de vetores. Os sistemas e métodos aqui podem proporcionar um meio simples de detectar/classificar transgenes múltiplos, reduzindo, desse modo, o número total de ensaios de detecção requeridos para teste de presença acidental.

[0015] Algumas concretizações proporcionam métodos para identificação de um ácido nucleico heterólogo em uma planta ou material de planta (por exemplo, semente), no qual o ácido nucleico heterólogo compreende um 5’ polinucleotídeo, um UGE, e um 3’ polinucleotídeo. Em concretizações particulares, tal método compreende proporcionar uma amostra compreendendo DNA a partir da planta ou material de planta; contato do DNA com um par de iniciadores de oligonucleotídeo que especificamente hibridizam aos 5’ e 3’ polinucleotídeos; amplificação de um amplicon compreendendo o 5’ polinucleotídeo, o UGE, e o 3’ polinucleotídeo; e detecção do UGE usando uma sonda específica (por exemplo, em um ensaio de PCR à base de fluorescência, tal como um ensaio de sonda de hidrólise). Em concretizações particulares, tal método compreende detecção do UGE por sequenciamento dos fragmentos amplificados compreendendo o 5’ polinucleotídeo, o UGE, e o 3’ polinucleotídeo. Conforme demonstrado pelos vários Exemplos aqui, os métodos de acordo com as concretizações particulares proporcionam surpreendentemente especificidade que é não-precedente em um método de detecção de GMO generalizado.

[0016] Algumas concretizações proporcionam sistemas para detecção de pelo menos um ácido nucleico heterólogo em uma planta ou material de planta. Alguns sistemas compreendem um conjunto de vetores cada um compreendendo um ácido nucleico heterólogo contendo um 5’ polinucleotídeo, um UGE, e um 3’ polinucleotídeo, no qual o 5’ polinucleotídeo e 3’ polinucleotídeo são universais (isto é, comuns a todos) no conjunto de vetor, e no qual o UGE de cada um dos vetores é único ao conjunto. Alguns sistemas podem compreender um oligo- nucleotídeo de iniciador de avanço universal que especificamente hi- bridiza ao 5’ polinucleotídeo, e um oligonucleotídeo de iniciador reverso universal que especificamente hibridiza ao 3’ polinucleotídeo. Sistemas particulares podem compreender um conjunto de moléculas de sonda, no qual cada uma das moléculas de sonda especificamente hibridiza a somente um dos UGEs no conjunto de vetor.

[0017] Os sistemas e métodos aqui podem ser usados para identificar a presença de um vasto número de eventos transgênicos em plantas de GMO, incluindo aqueles com transgenes empilhados, com um nível previamente indisponível de especificidade e generabidade. Em alguns exemplos, os sistemas e métodos aqui tornam óbvios a ne-cessidade de desenvolver independentemente ensaios de detecção para eventos diferentes e combinar métodos de detecção diferentes para obter boa cobertura de GMO, que pode ser uma estratégia proibitivamente custosa.

[0018] Os genes múltiplos de interesse podem ser introduzidos em vetores de transformação de planta compreendendo UGEs e locais de iniciador universais, e plantas transgênicas podem ser obtidas usando estes vetores. Desse modo, genes múltiplos podem ser transformados e rastreados em plantas transgênicas usando um ensaio de detecção específico de UGE simples. As plantas transgênicas transformadas com estes construtos podem ser testadas usando uma abordagem de análise segregada de massa que significantemente reduz o número de ensaios requerido para identificar as plantas transgênicas para usos adicionais, comparado a técnicas previamente disponíveis. Adicionalmente, sistemas e métodos aqui podem auxiliar decisões de avanço comerciais em programas de introgressão de traço por facilitação da análise de amostras de campo para a presença de traços pretendidos, bem como a ausência de traços não-pretendidos (presença acidental).

[0019] O precedente e outras características tornar-se-ão mais aparentes a partir da seguinte descrição detalhada de várias concretizações, que procedem com referência às figuras acompanhantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] A FIG. 1 inclui uma apresentação esquemática de um alinhamento de sequência entre seis polinucleotídeos contendo UGE exemplares (SEQ ID NOs:55-60), de plasmídeos pEPP1135-pEPP1140, respectivamente. F-Iniciador e R-Iniciador representam iniciadores de PCR de avanço e reverso universais.

[0021] A FIG. 2 inclui resultados de detecção de ensaios de PCR específicos de UGE. O DNA de plasmídeo específico de UGE foi usado como os controles positivos (mostrado em círculos) e DNA de milho não-transgênico e nenhuma amostra de controle de gabarito foi usada como controles negativos. As amostras foram operadas em triplicatas.

[0022] A FIG. 3 inclui resultados de detecção mostrando que concentrações extremamente baixas de DNA UGE alvo podem ser detectadas usando sondas de hidrólise designadas para especificamente hibridizar os mesmos. Concentrações de gabarito (DNA de plasmídeo) variando de 0,0000001 ng a 1 ng foram testadas (mostradas da orientação da esquerda para a direita) em PCRs de ponto final. Nenhum controle de gabarito foi incluído para testar a não-especificidade (marcada em círculo).

[0023] A FIG. 4 inclui resultados de detecção de um plasmídeo compreendendo um UGE alvo (SEQ ID NO:3) em fundo de DNA ge- nômico de milho não-transgênico usando um ensaio de PCR de hidróliseà base de fluorescência. A análise de curva de fusão e número de ciclo para alvo e pontos de cruzamento de controle interno (Cp), são apresentados.

[0024] A FIG. 5 inclui resultados de detecção de um plasmídeo compreendendo um UGE alvo (SEQ ID NO:8) em fundo de DNA ge- nômico de milho não-transgênico usando um ensaio de PCR de hidróliseà base de fluorescência. Análise de curva de fusão e número de ciclo para alvo e pontos de cruzamento de controle interno (Cp), são apresentados.

[0025] A FIG. 6 inclui um esquema mostrando uma estratégia de clonagem de UGE. No esquema, "PTU" representa uma Unidade de Transformação de Planta e "ZP" representa o amplicon compreendendo o UGE. "LB" e "RB" representam bordas Esquerda e Direita de T-DNA, respectivamente.

[0026] A FIG. 7 inclui um esquema mostrando um exemplo de uma estratégia de clonagem de UGE para projetos de traço agronômicos. Este exemplo ilustra que um UGE foi clonado entre um marcador sele- cionável (OsAct1-AAD1-ZmLip) e o gene de interesse agronômico.

[0027] A FIG. 8 inclui dados mostrando detecção de sequências de UGE em semente de milho transgênico T1. Controles positivos: DNA de plasmídeo contendo as sequências de UGE; Controles negativos: DNA genômico de milho não-transgênico; 8A: Semente de milho transgênico contendo UGE2; 8B: Semente de milho transgênico contendo UGE3.

[0028] A FIG. 9 inclui dados mostrando detecção de uma sequência de UGE (UGE3) em amostras de semente de milho transgênico homozígua. Controles negativos - DNA de milho não-transgênico; Controles positivos - DNA de plasmídeo ZCZ0000003; Amostras - DNA de semente de milho T2 transgênico que expressa UGE3 (pDAB108526, pDAB108527, pDAB108528; 6 fontes de semente diferentes foram usadas conforme listado na Tabela 9).

[0029] A FIG. 10 inclui dados mostrando a sensibilidade de detecção de UGE de milho transgênico (UGE3). Controles negativos - DNA de milho não-transgênico; Controles positivos - Amostras de DNA de plasmídeo ZCZ0000003 - Diluições de DNA de semente de milho T2 transgênica (pDAB108526 - Fonte ID # ZQ11LQ199088.0016.016).

[0030] A FIG. 11 inclui dados demonstrando a detecção de um UGE em uma amostra de semente transgênica perfurada com um Ensaio de PCR de sonda de hidrólise. Controles negativos - DNA de milho não-transgênico; Controles positivos - 1% de DNA genômico; Amostras - 36 amostras de DNA de semente de milho perfurada (1 semente transgênica em 99 sementes não-transgênicas) - 12 réplicas biológicas e 3 réplicas técnicas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0031] As sequências de ácido nucleico listadas na listagem de sequências acompanhantes são mostradas usando abreviações de letra padrão para bases de nucleotídeo, conforme definido em 37 C.F.R. § 1.822. Somente um trançado de cada sequência de ácido nu- cleico é mostrado, mas o trançado complementar é compreendido estar incluído por qualquer referência ao trançado revelado. Na listagem de sequências acompanhante:

[0032] SEQ ID NOs:1-21 mostra sondas de oligonucleotídeo exemplares designadas para especificamente hibridizar a (idênticos) polinucleotídeos de UGE ("UGE1"-"UGE21," respectivamente);

[0033] SEQ ID NOs:22-42 mostra amplicons ("Amplicons 1-21"), cada um compreendendo um UGE exemplar e locais de ligação 5’ e 3’ para Iniciadores de avanço e reverso de PCR universais.

[0034] SEQ ID NOs:43-46 mostra iniciadores úteis em certos ensaios de PCR à base de fluorescência de UGE para gerar amplicons para detecção de UGE, via um ensaio de sonda de hidrólise.

[0035] SEQ ID NO:47 mostra um gene de invertase de milho que pode ser usado como um controle positivo em concretizações particulares para validar PCR e condições de reação de sonda de hidrólise.

[0036] SEQ ID NO:48 mostra um gene ZSSIIb de milho que pode ser usado como um controle positivo em concretizações particulares para validar PCR e condições de reação de sonda de hidrólise.

[0037] SEQ ID NOs:49-50 mostra iniciadores úteis para amplificação de uma porção de um gene invertase de milho.

[0038] SEQ ID NO:51 mostra um oligonucleotídeo de sonda que pode ser usado para detectar um gene invertase de milho.

[0039] SEQ ID NOs:52-53 mostra iniciadores úteis para amplificação de uma porção de um gene ZSSIIb de milho.

[0040] SEQ ID NO:54 mostra um oligonucleotídeo de sonda que pode ser usado para detectar um ZSSIIb de milho.

[0041] SEQ ID NOs:55-60 mostra polinucleotídeos contendo UGE de membros de um conjunto de vetores de transformação de planta (pEPP1135-pEPP1140).

MODO(S) PARA EFETUAR A INVENÇÃO I. Visão geral de várias concretizações

[0042] Métodos de detecção sensíveis e seguros são necessários para monitoramento de organismos geneticamente modificados (GMO). Os métodos de detecção de DNA existentes são orientados para direcionamento dos elementos de classificação, elementos específicos de planta, ou elementos específicos de evento em plantas transgênicas. Aqui descrito é o uso de sequências de DNA sintético de não-codificação sintética única (UGEs) que, quando incorporadas nos vetores de transformação de planta, podem auxiliar no monitoramento de plantas transgênicas por servirem como alvos para desenvolvimento de ensaio universal robusto. Várias sequências de UGE foram testadas para a facilidade de desenvolvimento de ensaio à base de fluorescência, e sua utilidade no monitoramento das plantas transgênicas foi demonstrada. Os construtos compreendendo um UGE flanqueado por locais de iniciador universal foram introduzidos em vetores de transformação de planta, e ensaios de detecção de sonda de hidrólise específica foram mostrados rastrear rapidamente cada vetor de transformação. II. Abreviações ABC-transportador ATP-transportador de cassete de ligação AP presença acidental BHQ2 Supressor de Furo Negro™-2 FAM 6-carboxi fluoresceína amidite FET transferência de energia fluorescente HEX hexacloro-fluoresceína MGBNFQ Supressor Não-Fluorescente de Ligante de Ra nhura Menor PCR reação de cadeia de polimerase UGE elemento genético exógeno único

III. Termos

[0043] Presença acidental: Conforme aqui usado, "Presença Acidental" (AP) se refere a ausência de segregação unintencional e incidental de quantidades de traço de material transgênico em uma amostra de material de planta. A presença acidental pode ser exemplificada, por exemplo, pela presença de quantidades de traço de material transgênico em uma amostra acreditada ser completamente compreendida de material não-transgênico, ou pode ser exemplificada pela presença de quantidades de traço de material transgênico de um tipo em uma amostra de material acreditado ser completamente compreendido de material transgênico de um tipo diferente.

[0044] Retrocruzamentos: Métodos de retro cruzamentos podem ser usados para introduzir uma sequência de ácido nucleico em plantas. A técnica de retro cruzamentos foi amplamente usada por décadas para introduzir novos traços em plantas. Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. Em um protocolo de retro cruzamento típico, a variedade original de interesse (origem recorrente)é cruzada a uma segunda variedade (origem não-recorrente) que transporta um gene de interesse a ser transferido. As progenias resultantes deste cruzamento são então cruzadas novamente à origem recorrente, e o processo é repetido até que uma planta seja obtida na qual essencialmente todas das características morfológicas e fisiológicas desejadas da planta recorrente são recuperadas na planta convertida, em adição ao gene transferido a partir da origem não-recorrente.

[0045] Isolado: Um componente biológico "isolado" (tal como um ácido nucleico ou proteína) foi substancialmente separado, produzido à parte de, ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente (isto é, outro DNA cromossomal e extra-cromossomal e RNA, e proteínas), enquanto que efetua uma mudança química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser isolado de um cromossomo pela quebra das ligações químicas que ligam o ácido nucleico ao DNA re-manescente no cromossomo). As moléculas de ácido nucleico e proteínas que foram "isoladas" incluem moléculas de ácido nucleico e proteínas purificadas por métodos de purificação padrões. O termo também envolve ácidos nucleicos e proteínas preparados por expressão re- combinante em uma célula hospedeira, bem como moléculas de ácido nucleico quimicamente sintetizadas, proteínas, e peptídeos.

[0046] Molécula de ácido nucleico: Conforme aqui usado, o termo "molécula de ácido nucleico" pode se referir a uma formas poliméricas de nucleotídeo, que podem incluir ambos trançados de sentido e de anti-sentido de RNA, cDNA, DNA genômico, e formas sintéticas e polímeros misturados dos acima. Um nucleotídeo pode se referir a um ribonucleotídeo, deoxiribonucleotídeo, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma "molécula de ácido nucleico", conforme aqui usado, é sinônimo de "ácido nucleico" e "polinucleotídeo". Uma molécula de ácido nucleico é usualmente pelo menos de 10 bases de comprimento, a menos que de outro modo especificado. O termo inclui formas de trançado duplo e de trançado único de DNA. Uma molécula de ácido nucleico pode incluir qualquer ou ambos nucleotí- deos que ocorrem naturalmente e modificado ligados juntos pelas ligações de nucleotídeo que ocorrem naturalmente e/ou não-naturalmente.

[0047] As molécula de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente, ou podem conter bases de nucleotí- deo não-naturais ou derivatizadas, conforme será prontamente apreciado pelo técnico no assunto. Tais modificações incluem, por exemplo, etiquetas, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo, modificações de internucleotí- deo (por exemplo, ligações não-carregadas: por exemplo, metil fosfo- natos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações car-regadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc; frações pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoralen, etc.; quelantes; alquiladores; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). O termo "molécula de ácido nucleico"também inclui qualquer conformação to- pológica, incluindo conformações de trançado único, de trançado duplo, parcialmente duplexada, triplexada, em grampo de cabelo, circular, e de cadeado.

[0048] Exógeno: O termo "exógeno", conforme aplicado a ácidos nucleicos (por exemplo, polinucleotídeos, DNA, RNA, e genes) aqui, se refere a um ou mais ácido(s) nucleico(s) que não estão normalmente presentes dentro de seu ambiente específico ou contexto. Por exemplo, se uma célula hospedeira é transformada com um ácido nu- cleico que não ocorre na célula hospedeira não-transformada na natureza,então este ácido nucleico é exógeno à célula hospedeira. O termo exógeno, conforme aqui usado, também se refere a um ou mais ácido(s) nucleico(s) que são idênticos em sequência a um ácido nu- cleico já presente em uma célula hospedeira, mas que estão localizados em um contexto celular ou genômico diferente do que o ácido nu- cleico com a mesma sequência já presente na célula hospedeira. Por exemplo, um ácido nucleico que é integrado no genoma da célula hospedeira em uma localização diferente do que um ácido nucleico com a mesma sequência é normalmente integrado no genoma da célula hospedeiraé exógena à célula hospedeira. Além disso, um ácido nucleico (por exemplo, uma molécula de DNA) que está presente em um plas- mídeo ou vetor na célula hospedeira é exógeno à célula hospedeira quando um ácido nucleico com a mesma sequência está somente normalmente presente no genoma da célula hospedeira.

[0049] Heterólogo: O termo "heterólogo", conforme aplicado a ácidos nucleicos (por exemplo, polinucleotídeos, DNA, RNA, e genes) aqui, significa de origem diferente. Por exemplo, se uma célula hospedeiraé transformada com um ácido nucleico que não ocorre na célula hospedeira não-transformada na natureza, então este ácido nucleico é heterólogo (e exógeno) à célula hospedeira. Além disso, elementos diferentes (por exemplo, promotor, intensificador, sequência de codificação, terminador, etc.) de um ácido nucleico de transformação, podem ser heterólogos entre si, e/ou ao hospedeiro transformado. O termo heterólogo, conforme aqui usado, pode também ser aplicado a um ou mais ácido(s) nucleico(s) que são idênticos em sequência a um ácido nucleico já presente em uma célula hospedeira, mas estes estão agora ligados a sequências adicionais diferentes, e/ou estão presentes em um número de cópia diferente, etc.

[0050] Identidade de sequência: O termo "identidade de sequência" ou "identidade", conforme aqui usado, no contexto de dois ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeo, pode se referir a resíduos nas duas sequências que são as mesmas quando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada.

[0051] Conforme aqui usado, o termo "percentagem de identidade de sequência"pode se referir ao valor determinado por comparação de duas sequências otimamente alinhadas (por exemplo, sequências de ácido nucleico, e sequências de amino ácido) sobre uma janela de comparação, no qual a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou anulações (isto é, folgas) conforme comparado às sequências de referência (que não compreendem adições ou anulações) para alinhamento ótimo das duas sequências. A percentagem é calculada por determinação do número de posições em que o nucleotídeo idêntico ou resíduo de amino ácido ocorre em ambassequências para produzir o número de posições equiparadas, divi- dindo o número de posições equiparadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100, para produzir a percentagem de identidade de sequência.

[0052] Métodos para alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de ali-nhamentosão descritos em, por exemplo: Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homologia pode ser encontrada em, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

[0053] National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul et al. (1990)) é disponível de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), e na internet, para uso em conjunto com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência usando este programa é disponível na internet sob a seção "ajuda" para BLAST™. Para comparações de sequências de ácido nucleico, a função "sequências Blast 2" do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregada usando os parâmetros default. As sequências de ácido nucleico com similaridade ainda maior para as sequências de referência mostrarão percentagem de identidade aumentada quando avaliadas por este método.

[0054] Conforme aqui usado, o termo "substancialmente idêntico"pode se referir a sequências de nucleotídeo que são mais do que 85% idênticas. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeo substancial-menteidêntica pode ser pelo menos 85,5%; pelo menos 86%; pelo menos 87%; pelo menos 88%; pelo menos 89%; pelo menos 90%; pelo menos 91%; pelo menos 92%; pelo menos 93%; pelo menos 94%; pelo menos 95%; pelo menos 96%; pelo menos 97%; pelo menos 98%; pelo menos 99%; ou pelo menos 99,5% idênticas à sequência de referência.

[0055] Sonda: Em algumas concretizações, a presença de um ácido nucleico particular (por exemplo, um UGE) em uma amostra pode ser detectada através do uso de uma sonda de ácido nucleico. Uma sonda pode ser uma molécula de DNA ou uma molécula de RNA. Uma sonda pode conter toda ou uma porção da sequência de nucleotídeo do ácido nucleico particular, e pode, opcionalmente, conter adicionalmente pelo menos uma sequência de nucleotídeo adicional e/ou eti- queta(s).

[0056] Uma sequência de sonda de oligonucleotídeo pode ser preparada sinteticamente, ou por clonagem. Vetores de clonagem adequados são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto. Uma sonda de oligonucleotídeo pode ser etiquetada ou não-etiquetada. Uma ampla variedade de técnicas existe para etiquetação de moléculas de ácido nucleico, incluindo, por exemplo, e sem limitação: Radio- marcação por tradução de corte; composição iniciadora aleatória; resíduo com deoxitransferase terminal; etc., onde os nucleotídeos empregadossão etiquetados, por exemplo, com 32P radioativo. Outras etiquetas que podem ser usadas incluem, por exemplo, e sem limitação: Fluoróforos (por exemplo, sozinhos ou com um supressor); enzimas; substratos de enzima; cofatores de enzima; inibidores de enzima; etc. Alternativamente, o uso de uma etiqueta que proporciona um sinal de- tectável, por si própria, ou em conjunto com outros agentes reativos, pode ser substituído por ligantes aos quais receptores se ligam, onde os receptores são etiquetados (por exemplo, pelas etiquetas acima in-dicadas), para proporcionar sinais detectáveis, ou por si próprios, ou em conjunto com outros reagentes. Ver, por exemplo, Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045-9.

[0057] Uma sonda pode também ser uma molécula de ácido nu- cleico que é "especificamente hibridizável", ou "especificamente complementar", ao ácido nucleico particular a ser detectado (isto é, o alvo). "Especificamente hibridizável"e "especificamente complementar"são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade, tal que ligação estável e específica ocorre entre a sonda e o alvo. Uma molécula de ácido nucleico não necessita ser 100% complementar a sua sequência alvo a ser especificamente hibridizável. Uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando existe um grau suficiente de complementaridade para evitar ligação não-específica do ácido nucleico a sequências de não-alvo sob condições onde ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições de hibridização es- tringentes.

[0058] As condições de hibridização resultantes em graus particulares de estringência variarão, dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e da composição e comprimento das sequências de ácido nucleico de hibridização. Geralmente, a temperatura de hibridização e a resistência iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg++) do tampão de hibridização, determinarão a estringência de hibridização, embora tempos de lavagem também influenciem na estringência. Os cálculos relacionados às condições de hibridização requeridas para alcançar graus particulares de estringência são conhecidosàqueles técnicos no assunto, e são discutidos, por exemplo, em Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 e 11; e Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instrução e orientação detalhadas adicionais com relação a hibridização de ácidos nucleicos podem ser encontradas, por exemplo, em Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," em La-boratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization com Nucleic Acid Probes, Parte I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995.

[0059] Conforme aqui usado, "condições estringentes" envolvem condições sob as quais hibridização somente ocorrerá se existe menos do que 25% de incompatibilidade entre a molécula de hibridização e o DNA alvo. "Condições estringentes" incluem níveis adicionais particulares de estringência. Desse modo, conforme aqui usado, condições de "estringência moderada"são aquelas sob as quais as moléculas com mais do que 25% de incompatibilidade de sequência não hibridi- zarão; condições de "estringência média" são aquelas sob as quais as moléculas com mais do que 15% de incompatibilidade não hibridiza- rão; e condições de "alta estringência" são aquelas sob as quais sequências com mais do que 10% de incompatibilidade não hibridizarão. Condições de "estringência muito alta"são aquelas sob as quais sequências com mais do que 6% de incompatibilidade não hibridizarão.

[0060] Em concretizações particulares, condições estringentes são hibridização a 65°C em 6x de tampão de salina-citrato de sódio (SSC), 5x de solução de Denhardt, 0,5% de SDS, e 100 μg de DNA testes de salmão compartilhados, seguido por 15-30 minutos de lavagens sequenciais a 65°C em 2x tampão de SSC e 0,5% de SDS, seguido por 1x de tampão de SSC e 0,5% de SDS, e, finalmente, 0,2x de tampão de SSC e 0,5% de SDS.

[0061] Operavelmente ligado: Uma primeira sequência de ácido nucleico é operavelmente ligada com uma segunda sequência de áci- do nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico está em um relacionamento funcional com a segunda sequência de ácido nu- cleico. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado com uma sequência de codificação quando o promotor afeta a transcrição ou expressão da sequência de codificação. Quando recombinantemente produzidas, as sequências de ácido nucleico operavelmente ligadas são geralmente contíguas e, onde necessário, para unir duas regiões de codificação de proteína, na mesma estrutura de leitura. Contudo, os elementos não necessitam serem contíguos para serem operavelmen- te ligados.

[0062] Promotor: Uma região de DNA que geralmente está localizadaà montante (em direção a região 5’ de um gene) que é necessária para transcrição. Os promotores permitem a ativação correta, ou repressão do gene que eles controlam. Um promotor contém sequênciasespecíficas que são reconhecidas por fatores de transcrição. Estes fatores se ligam às sequências de DNA do promotor, e resultam no recrutamento de RNA polimerase, a enzima que sintetiza o RNA a partir da região de codificação do gene. Em algumas concretizações, promotores específicos de tecido são usados. Um promotor específico de tecido é uma sequência de DNA que direciona um nível mais alto de transcrição de um gene associado no tecido para qual o promotor é específico relativo aos outros tecidos do organismo. Exemplos de promotores específicos de tecido incluem promotores específicos de tapetum; promotores específicos de antera; promotores específicos de pólen (Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 7.141.424, e Publicação PCT Internacional No. WO 99/042587); promotores específicos de óvulo; (Ver, por exemplo, Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2001/047525 A1); promotores específicos de fruto (Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.943.674, e 5.753.475); e promotores específicos de semente (Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.420.034, e 5.608.152). Em algumas concreti-zações, promotores específicos de estágio de desenvolvimento são também usados, por exemplo, um promotor ativo em um estágio posterior no desenvolvimento.

[0063] Transformado: Um vírus ou vetor "transforma" ou "transduz" uma célula quando ela transfere moléculas de ácido nucleico na célula. Uma célula é "transformada" por uma molécula de ácido nucleico transduzida na célula quando a molécula de ácido nucleico torna-se estavelmente replicada pela célula, ou por incorporação da molécula de ácido nucleico no genoma celular, ou por replicação epissomal. Conforme aqui usado, o termo "transformação"envolve todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em tal célula. Exemplos incluem, mas não são limitados a, transfecção com vetores virais, transformação com vetores de plasmídeo, eletropo- ração (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3), lipofecção (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7), microinjeção (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85), transferência mediada por Agrobacterium (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7), entrada de DNA direta, e bombardeio de microprojétil (Klein et al. (1987) Nature 327:70).

[0064] Transgene: Uma sequência de ácido nucleico exógena. Em um exemplo, um transgene é uma sequência de gene (por exemplo, um gene de resistência à herbicida), um gene que codifica um composto industrialmente ou farmaceuticamente útil, ou um gene que codifica um trato agrícola desejável. Em ainda outro exemplo, o transgene é uma sequência de ácido nucleico de antessentido, no qual a expressão da sequência de ácido nucleico de antessentido inibe a expressão de uma sequência de ácido nucleico alvo. Um transgene pode conter sequências regulatórias operavelmente ligadas ao transgene (por exemplo, um promotor).

[0065] Vetor: Conforme aqui usado, o termo "vetor" se refere a um polinucleotídeo, ou outra molécula, que é capaz de transferir pelo menos um segmento(s) de ácido nucleico em uma célula. Um vetor pode, opcionalmente, compreender componentes/elementos que mediam a manutenção do vetor, e/ou capacitam seu uso pretendido (por exem-plo,sequências necessárias para replicação, genes que concedem resistência à droga ou à antibiótico, um local de clonagem múltiplo, e/ou elementos promotores/intensificadores operavelmente ligados que capacitam a expressão de um gene clonado). Os vetores podem ser derivados, por exemplo, de plasmídeos, bacteriófagos, ou vírus de planta ou de animal. Um "vetor de clonagem", "vetor de lançadeira", ou "vetor de subclonagem", geralmente compreende elementos opera- velmente ligados para facilitar as etapas de clonagem ou de subclona- gem (por exemplo, um local de clonagem múltiplo contendo locais de endonuclease de restrição múltiplos).

[0066] Vetor de Expressão: O termo "vetor de expressão", conforme aqui usado, se refere a um vetor compreendendo sequências de polinucleotídeo operavelmente ligadas que podem facilitar expressão de uma sequência de codificação em um organismo hospedeiro particular. Por exemplo, um vetor de expressão bacterial pode facilitar expressão de uma sequência de codificação em uma bactéria. Do mesmo modo, um vetor de expressão de planta pode facilitar a expressão de uma sequência de codificação em uma célula de planta. As sequências de polinucleotídeo que facilitam a expressão de procariotes podem incluir, por exemplo, e sem limitação, um promotor; um operador; e um local de ligação de ribossomo. Os vetores de expressão eu- carióticos (por exemplo, um vetor de expressão de planta) podem compreender, por exemplo, promotores; intensificadores; sinais de terminação; e sinais de poliadenilação (e outras sequências) que são geralmente diferentes daqueles usados em vetores de expressão pro- carióticos.

[0067] Traço ou fenótipo: Os termos "traço"e "fenótipo" são usados intercambiavelmente aqui. Para a proposta da presente revelação, os traços de interesse particular incluem traços agronomicamente im-portantes, conforme pode ser expresso, por exemplo, em uma planta.

[0068] Elemento genético exógeno único (UGE): UGEs são sequências de DNA sintéticas únicas que quando incorporadas em vetores de transformação de planta, servem como alvos para ensaios de detecção de DNA. Primeiro, um UGE pré-validado único simples é introduzido em um vetor de transformação de planta. Segundo, o vetor de transformação de planta contendo UGE é usado para clonagem de genes múltiplos acionados pelo mesmo promotor. Os ensaios de PCR à base de fluorescência específicos de UGE são rapidamente desenvolvidos para rastrear cada vetor de transformação com relativa facilidade. Plantas transgênicas derivadas destes construtos podem ser testadas usando uma abordagem de análise segregada volumosa para reduzir o número de ensaios significantemente.

[0069] IV. Elementos genéticos exógenos únicos

[0070] As concretizações aqui incluem sequências de DNA de não-codificação sintéticas únicas (referidas aqui como "Elementos Genéticos Exógenos Únicos", ou "UGEs") que podem ser usados para desenvolver um método universal para a detecção específica de UGE de ácidos nucleicos. Os UGEs podem ser designados tal que todos daqueles em um conjunto têm propriedades termodinâmicas similares como os oligonucleotídeos em um ensaio de hibridização. Dentro de um conjunto de ácidos nucleicos, por exemplo, para introdução em um organismo, um conjunto de UGEs distintos/únicos pode ser incluído com um ácido nucleico adicional de interesse no ácido nucleicos do conjunto, para identificar em um modo especificamente identificável, construtos de uma companhia ou laboratório particular, construtos con- tendo certas classes de genes ou elementos genéticos, e/ou GMOs (por exemplo, plantas) compreendendo tais construtos.

[0071] Em algumas concretizações, os UGEs são marcadores de identificação únicos que são flanqueados e amplificados por iniciadores comuns, universais ao conjunto, tal que os ácidos nucleicos com-preendendo os UGEs podem ser universalmente e especificamente identificados, por exemplo, por análise de sequência de DNA, hibridi- zação, e análise de PCR à base de fluorescência. Em alguns exemplos, os ácidos nucleicos heterólogos compreendendo UGEs em um GMO podem ser identificados usando um método de PCR de tempo real à base de fluorescência com sondas fluorescentemente etiquetadas supressoras únicas (por exemplo, uma sonda de hidrólise) que hibridiza especificamente aos UGEs. Por exemplo, os próprios oligo- nucleotídeos de UGE podem ser incorporados em uma molécula de sonda etiquetada. Iniciadores de PCR iniversal e UGEs podem proporcionaramplificação altamente específica e altamente eficiente, e detecção à base de fluorescência em um ensaio único para o material de GMO complicado compreendendo muitos transgenes diferentes. Em alguns exemplos, os ácidos nucleicos heterólogos compreendendo um UGE em um GMO podem ser identificados por sequenciamento de um fragmento de DNA amplificado que é flanqueado pelos iniciadores universais, de modo a determinar a identidade do UGE presente na amostra.

[0072] A PCR acoplada por fluorescência é utilizada como um ensaio de detecção em concretizações particulares. Tais ensaios à base de PCR são conhecidos na técnica. As Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.210.015 e 5.487.972. Por exemplo, concretizações particulares utilizam uma reação de PCR envolvendo três oligonucleotídeos: um iniciador de avanço; um iniciador reverso; e uma sonda fluorogênica. A sonda fluorogênica pode compreender, por exemplo, e sem limitação, um oligonucleotídeo etiquetado na extremidade 5’ com um corante flu-orescenterepórter (por exemplo, FAM e HEX), e etiquetado na extremidade 3' com um corante supressor (por exemplo, MGBNFQ e BHQ2). Em tais moléculas de sonda exemplares, a excitação do corante fluorescente repórter em um comprimento de onda específico (488 nm), não conduzirá a fluorescência, devido a supressão de FET como um resultado de proximidade espacial ao corante supressor. Durante um ensaio de PCR de sonda de hidrólise, a sonda com os iniciadores inicialmente hibridizam ao DNA alvo. Na fase de extensão, a sonda posicionada entre os iniciadores contata a polimerase, e é hidro- lisada através de sua atividade de exonuclease. A hidrólise de sonda libera o repórter fluorescente a partir da supressão de FET, e a fluorescência do repórter aumenta com cada ciclo de PCR, de acordo com o acúmulo de produto de PCR.

[0073] Em algumas concretizações, um UGE é designado para ter um comprimento suficiente para proporcionar diversidade de sequência adequada dentro do conjunto compreendendo o UGE, tal que as sondas de oligonucleotídeo podem ser designadas para hibridizar especificamente para cada um dos UGEs no conjunto. Por exemplo, um UGE pode ser designado para ser, por exemplo, e sem limitação: mais do que cerca de 10; mais do que cerca de 15; mais do que cerca de 20; mais do que cerca de 25; entre cerca de 10 e cerca de 25; entre cerca de 15 e cerca de 25; entre cerca de 10 e cerca de 20; e entre cerca de 15 e cerca de 20 nucleotídeos de comprimento. Em concretizações particulares, um UGE é selecionado a partir do grupo consistindo em UGE1-UGE21 (SEQ ID NOs:1-21).

[0074] Em algumas concretizações, um UGE pode ser compreendido em um ácido nucleico amplificável (um amplicon) que também compreende iniciadores universais de flanqueamento. Em alguns exemplos, os iniciadores universais de flanqueamento podem ser dire- tamente adjacentes ao UGE; isto é, não separados por qualquer sequência de nucleotídeo adicional. Um amplicon compreendendo um UGE e iniciadores universais de flanqueamento pode ser de comprimento suficiente para ser amplificável em uma reação de PCR. Por exemplo e sem limitação, tal amplicon pode ser menor do que cerca de 150; menor do que cerca de 130; menor do que cerca de 110; menor do que cerca de 100; menor do que cerca de 90; menor do que cerca de 85; menor do que cerca de 80; entre cerca de 60 e cerca de 100; entre cerca de 60 e cerca de 90; entre cerca de 60 e cerca de 80; entre cerca de 70 e cerca de 100; entre cerca de 70 e cerca de 90; e entre cerca de 70 e cerca de 80 nucleotídeos de comprimento. Em concretizações particulares, um amplicon compreendendo um UGE, e locais de iniciador de flanqueamento são selecionados a partir do grupo consistindo em Amplicons 1-21 (SEQ ID NOs:22-42).

[0075] Em algumas concretizações, um UGE (por exemplo, em um amplicon também compreendendo iniciadores universais de flanquea- mento) pode, por exemplo, ser compreendido em um sistema de vetor incluindo, por exemplo, e sem limitação, um plasmídeo linear, e um plasmídeo circular fechado. Em exemplos particulares, o vetor pode ser um vetor de expressão. Amplicons compreendendo UGEs, de acordo com concretizações particulares, podem, por exemplo, serem inseridos em um vetor, tal que a sequência de ácido nucleico é opera- velmente ligada a uma ou mais sequências regulatórias. Muitos vetoressão disponíveis para esta proposta, e seleção do vetor particular pode depender, por exemplo, do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor, a célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor, e/ou a quantidade da proteína de fusão que é desejada ser expressa. Um vetor tipicamente contém vários componentes, a identidade do qual depende de uma função do vetor (por exemplo, amplificação de DNA e expressão de DNA), e a(s) célula hospedeira(s) particu lar(es) com as quais o vetor é compatível.

[0076] Algumas concretizações podem incluir um vetor de transformação de planta que compreende um UGE flanqueado por locais de iniciador universal, e um gene de interesse que é operativamente ligado a pelo menos uma sequência regulatória. O gene de interesse pode ser expresso, sob o controle da(s) sequência(s) regulatória(s), em uma célula de planta, tecido, ou organismo, para produzir a proteína de fusão. Tal sequência regulatória pode ser uma sequência promotora que funciona em uma célula de planta hospedeira.

[0077] Promotores adequados para uso em moléculas de ácido nucleico, de acordo com algumas concretizações, incluem aqueles que são induzíveis, virais, sintéticos, ou constitutivos, todos dos quais são bem conhecidos na técnica. Exemplos não-limitativos de promotores que podem ser úteis nas concretizações da invenção são proporcionados por: Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.437.217 (promotor RS81 do milho); 5.641.876 (promotor de atina do arroz); 6.426.446 (promotor RS324 do milho); 6.429.362 (promotor PR-1 do milho); 6.232.526 (promotor A3 do milho); 6.177.611 (promotores do milho constitutivo); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142, e 5.530.196 (promotor 35S); 6.433.252 (promotor de oleosa a L3 do milho); 6.429.357 (promotor 2 de actina do arroz, e intron 2 de actina do arroz); 6.294.714 (promotoresinduzíveis por luz); 6.140.078 (promotores induzíveis por sal); 6.252.138 (promotores induzíveis por patógeno); 6.175.060 (promotoresinduzíveis de deficiência de fósforo); 6.388.170 (promotores bidirecionais); 6.635.806 (promotor de gama-coixina); e Pedido de Patente dos Estados Unidos No. de Série 09/757.089 (promotor de aldolase de cloroplasto do milho).

[0078] Os promotores exemplares adicionais incluem o promotor de nopalina sintase (NOS) (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9); o promotor de octopina sintase (OCS) (que é conduzido em plasmídeos de indução de tumor de Agrobacterium tu- mefaciens); os promotores de caulimovírus tais como o promotor 19S do vírus de mosaico de couve-flor (CaMV) (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); o promotor 35S CaMV (Odell et al. (1985) Nature 313:810-2; o promotor 35S do vírus de mosaico da escrofulária (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); o promotor de sacarose sintase (Yang e Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); o promotor complexo de gene R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83); o promotor de gene de proteína de ligação de clorofila a/b; CaMV35S (Patente dos Estados Unidos Nos. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142, e 5.530.196); FMV35S (Patente dos Estados Unidos Nos. 6.051.753, e 5.378.619); um promotor PC1SV (Patente dos Estados Unidos No. 5.850.019); o promotor SCP1 (Patente dos Estados Unidos No. 6.677.503); e promotores AGRtu.nos (Acesso no Banco de Genes No. V00087; Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7).

[0079] Em concretizações particulares, as moléculas de ácido nu- cleico da invenção podem compreender um promotor específico de tecido. Um promotor específico de tecido é uma sequência de nucleo- tídeo que direciona um nível mais alto de transcrição de uma sequência de nucleotídeo operavelmente ligada no tecido para qual o promotor é específico, relativo aos outros tecidos do organismo. Exemplos de promotores específico de tecido incluem, sem limitação: promotores específicos de tapetum; promotores específico de antera; promotores específicos de pólen (Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 7.141.424, e Publicação PCT Internacional No. WO 99/042587); promotores específicos de óvulo; (Ver, por exemplo, Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2001/047525 A1); promotores específicos de fruto (Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.943.674, e 5.753.475); e promotores específicos de semente (Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.420.034, e 5.608.152). Em algu-masconcretizações, um promotor específico de estágio de desenvol-vimento (por exemplo, um promotor ativo em um estágio posterior em desenvolvimento) pode ser usado em uma composição ou método da invenção.

[0080] As sequências regulatórias adicionais que podem, em al-gumasconcretizações, serem operavelmente ligadas a uma molécula de ácido nucleico, incluem 5’ UTRs localizados entre uma sequência promotora e uma sequência de codificação que funciona como uma sequência líder de tradução. A sequência líder de tradução está presente no mRNA completamente processado, e pode afetar o processamento da transcrição primária, e/ou estabilidade de RNA. Exemplos de sequências líder de tradução incluem líderes de proteína de choque de milho e petúnia (Patente dos Estados Unidos No. 5.362.865), líderes de proteína de camada de vírus de planta, líderes de planta rubis- co, e outros. Ver, por exemplo, Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Exemplos não-limitativos de 5’ UTRs são proporcionados por: GmHsp (Patente dos Estados Unidos No. 5.659.122); PhDnaK (Patente dos Estados Unidos No. 5.362.865); AtAnt1; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (Acesso ao Banco de Genes No. V00087; e Bevan et al. (1983), supra).

[0081] As sequências regulatórias adicionais que podem, em al-gumasconcretizações, serem operavelmente ligadas a uma molécula de ácido nucleico também incluem sequências 3’ não-traduzidas, regiões de terminação de transcrição 3’, ou regiões de poli-adenilação. Estes são elementos genéticos localizados à montante de uma sequência de nucleotídeo, e incluem polinucleotídeos que proporcionam sinal de poliadenilação, e/ou outros sinais regulatórios capazes de afe-tartranscrição ou processamento do mRNA. O sinal de poliadenilação funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos polialdenila- tados à extremidade 3’ do precursor de mRNA. A sequência de polia- denilação pode ser derivada de uma variedade de genes de planta, ou de genes de T-DNA. Um exemplo não-limitativo de uma região de terminação de transcrição 3’ é a região de nopalina sintase 3’ (nos 3’; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7). Um exemplo do uso de regiões não-traduzidas 3’ diferentes é proporcionado em Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-80. Exemplos não-limitativos de sinais de poliadenilação incluem um de um gene Pisum sativum RbcS2 (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) e AGR- tu.nos (Acesso ao Banco de Genes No. E01312).

[0082] A informação adicional relacionada às sequências regulató- rias que pode ser útil em concretizações particulares é descrita, por exemplo, em Goeddel (1990) "Gene Expression Technology", Methods Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, CA.

[0083] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor da presente invenção pode compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável em uma célula transformada, tal como uma célula de planta. Marcadores selecionáveis podem também serem usados para selecionar plantas ou células de planta que compreendem uma molécula de ácido nucleico da invenção. O marcador pode codificar resistência á biocida, resistência à antibiótico (por exemplo, canamicina, Geneticina (G418), bleomicina, e higromicina), ou resistência à herbicida (por exemplo, glifosato). Exemplos de marcadoresselecionáveis incluem, mas não são limitados a: um neo gene que confere resistência à canamicina, e pode ser selecionado para uso, por exemplo, canamicina e G418; um gene bar que confere resistência à bialafos; um gene mutante EPSP sintase que confere resistência á glifosato; um gene nitrilase que confere resistência á bromoxinila; um gene mutante acetolactato sintase (ALS) que confere resistência à imidazolinona ou sulfonilureia; e um gene DHFR resistente à metotrexato. Marcadores selecionáveis múltiplos são disponíveis que conferem resistência a agentes químicos incluindo, por exemplo, e sem limitação, ampicilina; bleomicina; cloranfenicol; gentamicina; hi- gromicina; canamicina; lincomicina; metotrexato; fosfinotricina; puromi- cina; espectinomicina; rifanpicina; estreptomicina; e tetraciclina. Exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustrados em, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.

[0084] Uma molécula de ácido nucleico ou vetor da presente invenção pode também, ou alternativamente incluir, um marcador classificável. Os marcadores selecionáveis podem ser usados para monitorarexpressão. Os marcadores selecionáveis exemplares incluem um gene β-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); um gene R-locus, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos de planta (Dellaporta et al. (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson e R. Appels, eds., Plenum, NY (pp. 263-82); um gene β-lactamase (Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41); um gene que codifica uma enzima para qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene luciferase (Ow et al. (1986) Science 234:856-9); um gene xylE que codifica um cate- col dioxigenase que converte catecóis cromogênicos (Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55); um gene amilase (Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2); um gene tirosinase que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA e dopaquinona, que, por sua vez, condensa em melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); e uma α-galactosidase.

[0085] Métodos adequados para transformação de células hospedeiras incluem qualquer método pelo qual DNA pode ser introduzido em uma célula, por exemplo, e sem limitação: por transformação de protoplastos (Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 5.508.184); por entrada de DNA mediada por desecação/inibição (Ver, por exemplo, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8); por eletroporação (Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 5.384.253); por agitação com fibras de carbeto de silício (Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos 5.302.523 e 5.464.765); por transformação mediada por Agrobacterium (Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos 5.563.055, 5.591.616, 5.693.512, 5.824.877, 5.981.840, e 6.384.301); e por aceleração de partículas revestidas com DNA (Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos 5.015.580, 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208, 6.399.861, e 6.403.865). Através da aplicação de técnicas tais como estas, as células de virtualmente qualquerespécie podem ser estavelmente transformadas. Em algumas concretizações, o DNA de transformação é integrado no genoma da célula hospedeira. No caso de espécie multicelular, as células trans- gênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Qualquer destas técnicas pode ser usada para produzir uma planta trans- gênica, por exemplo, compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico da invenção no genoma da planta transgênica.

[0086] Método mais amplamente utilizado para introdução de um vetor de expressão em plantas é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenessão bactérias de solo patogênicas de planta que geneticamente transformamcélulas de planta. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, conduzem genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plasmídeos Ti (de indução de tumor) contêm um grande segmento, conhecido como T-DNA, que é transferido para as plantas transformadas. Outro segmento do plasmí- deo Ti, a região vir, é responsável pela transferência de T-DNA. A região de T-DNA é limitada pelas bordas esquerda e direita que são cada composta de sequências de nucleotídeo repetidas terminais. Em alguns vetores binários modificados, os genes de indução de tumor foram anulados, e as funções da região vir são utilizadas para transferir o DNA precedente limitado pelas sequências de borda de T-DNA. A região T pode também conter, por exemplo, um marcador selecionável para recuperação eficiente de plantas transgênicas e células, e um local de clonagem múltiplo para inserção de sequências para transferência de tal ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão da invenção.

[0087] Desse modo, em algumas concretizações, um vetor de transformação de planta é derivado de um plasmídeo Ti de A. tumefa- ciens (Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Nos. 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937, e 5.501.967; e Patente Europeia EP 0 122 791), ou um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Os vetores de transformação de planta adicionais incluem, por exemplo, e sem limitação, aqueles descritos por Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983), supra; Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42; e na Patente Europeia EP 0 120 516, e aqueles derivados de qualquer dos precedentes. Outras bactérias, tais como Sinorhizobium, Rhizobium, e Me- sorhizobium, que interagem naturalmente com plantas podem ser modificadas para mediar transferência de gene a um número de plantas diversas. Estas bactérias simbióticas associadas a planta podem ser tornadas competentes para transferência de gene por aquisição de ambos um plasmídeo desarmado Ti e um vetor binário adequado.

[0088] Após provisão de DNA exógeno a células recipientes, as células transformadas são geralmente identificadas para cultura adicional e regeneração de planta. De modo a aperfeiçoar a capacidade de identificar células transformadas, pode-se desejar empregar um gene marcador selecionável ou classificável, conforme anteriormente colocado, com o vetor usado para gerar o transformante. No caso onde um marcador selecionável é usado, as células transformadas são identificadas dentro da população de célula potencialmente transformada por exposição a células a um agente ou agentes seletivos. No caso onde um marcador classificável é usado, as células podem ser classificadas para o traço de gene desejado.

[0089] As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou células que foram classificadas positivas em um ensaio de classificação, podem ser cultivadas em meio que suporta regeneração de plantas. Em algumas concretizações, qualquer meio de cultura de tecido de planta adequado (por exemplo, meio MS e N6) pode ser modificado por inclusão de substâncias adicionais, tais como reguladores de crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para começar esforços de regeneração de planta, ou seguindo etapas repetidas de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), em seguida, transferida ao meio favorável para formação de brotos. As culturassão transferidas periodicamente até que formação de brotos suficiente tenha ocorrido. Uma vez que os brotos são formados, eles são transferidos ao meio favorável para formação de raiz. Uma vez que raízes suficientes são formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para crescimento adicional e maturidade.

[0090] Uma planta transgênica formada usando métodos de transformação dependentes de Agrobacterium tipicamente contém uma sequência de DNA recombinante simples inserida em um cromossomo. A sequência de DNA recombinante simples é referida como um "evento transgênico"ou "evento de integração". Tais plantas transgênicas são heterozigóticas para a sequência de DNA inserida. Em algumas con-cretizações, uma planta transgênica homozigótica com relação a um transgene pode ser obtida por acoplamento sexualmente (selfing) de uma planta transgênica segregante independente que contém uma sequência de gene exógeno simples em si, por exemplo, uma planta F0, para produzir semente Fl. Um quarto da semente Fl produzida será homozigótica com relação ao transgene. A germinação de semente Fl resulta em plantas que podem ser testadas para heterozigosidade, tipicamente usando um ensaio de SNP, ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (istoé, um ensaio de zigosidade).

[0091] Em adição a transformação direta de uma planta ou célula de planta com uma molécula de ácido nucleico da invenção, as plantas transgênicas podem ser preparadas em algumas concretizações por cruzamento de uma primeira planta tendo pelo menos um evento transgênico com uma segunda planta carecendo de tal evento. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico compreendendo um UGE pode ser introduzida em uma primeira linha de planta que é receptiva a transformação, para produzir uma planta transgênica, cuja planta transgênica pode ser cruzada com uma segunda linha de planta para introgredir a molécula de ácido nucleico compreendendo o UGE na segunda linha de planta.

[0092] Em algumas concretizações aqui, qualquer GMO pode ser analisado. Em concretizações particulares, o GMO é uma planta gene-ticamente modificada. Uma amostra de material de planta que é analisada usando sistemas e métodos particulares aqui pode ser qualquer substância que pode compreender ácidos nucleicos exógenos múltiplos e diferentes, por exemplo, e sem limitação, ácidos nucleicos exógenos que são específicos a uma planta geneticamente modificada, ou tendo uma origem de planta geneticamente modificada. Em alguns exemplos, uma amostra pode ser um alimento, um ingrediente de ali-mentação, um aditivo de alimentação, e/ou um extrato sólido ou líquido que pode compreender material de um GMO. Em alguns exemplos, os ácidos nucleicos podem ser extraídos a partir da amostra de material de planta antes da análise.

[0093] As plantas geneticamente modificadas podem ser uma espécie de planta dicoteledônea ou monocotiledônea. Exemplos não- limitativos de células de planta de plantas dicotiledôneas que podem ser analisadas de acordo com concretizações específicas da invenção incluem: alfalfa; feijões; Brassica; brócolis; repolho; canola; cenoura; couve-flor; aipo; couve chinesa; algodão; pepino; berinjela; alface; melão; ervilha; pimenta; amendoim; batata; abóbora; rábano; colza; espinafre; soja; beterraba; girassol; tabaco; tomate; e melancia. Exemplos não-limitativos de células de planta de plantas monocotiledôneas que podem ser transformadas de acordo com concretizações específicas da invenção incluem: milho; cebola; arroz; sorgo; trigo; centeio; painço; cana de açúcar; aveia; triticale; "switchgrass"; e relva.

[0094] Os seguintes exemplos são proporcionados para ilustrar certas características e/ou concretizações particulares. Os exemplos não devem ser construídos para limitar a revelação às características ou concretizações particulares exemplificadas.

EXEMPLOS Exemplo 1: Projeto e Construção de Vetores Compreendendo Elemen-tosGenéticos Únicos para Produção de Planta Transgênica

[0095] Os elementos genéticos sintéticos únicos (UGEs) compre-endendosequências de nucleotídeo aleatórias de 15-25 bp foram gerados usando uma macro na aplicação Excel® (MICROSOFT). Uma série de número aleatória foi gerada do comprimento desejado com-preendendodígitos 1 a 4. Cada dígito foi equiparado a uma base de nucleotídeo especificada (por exemplo, 1 = A; 2 = C; 3 = G; e 4 = T) para gerar um polinucleotídeo que foi, então, sintetizado por um fornecedor comercial para manipulações de clonagem.

[0096] Os UGEs foram cada incorporados em uma sequência mais longa de 70-80 bp (referida aqui como um amplicon) compreendendo sequências de flanqueamento para ligação de Iniciador de PCR de avanço e reverso universais. 21 UGEs e 21 amplicons relacionados (cada um compreendendo uma sequência de UGE e locais de ligação de iniciador universal de flanqueamento) foram projetados, e foram sintetizados em plasmídeos de alta cópia por um fornecedor comercial (DNA 2.0; Menlo Park, CA). A Tabela 1 lista as sequências de 21 UGEs e os amplicons correspondentes. Tabela 1. Sequências de UGEs e de amplicons compreendendo um UGE específico (sublinhado) e locais de ligação de iniciador universal

[0097] Os conjuntos de vetores de transformação de planta de alta cópia modificados foram construídos por clonagem de um fragmento de amplicon selecionado compreendendo um UGE, único ao conjunto, em locais NarIII e AsiSI de um vetor de transformação de planta progenitor (um vetor binário de Agrobacterium). Os fragmentos de amplicon foram comumente posicionados entre a região promotora de um gene designado para servir como um marcador selecionável de planta (por exemplo, um gene de tolerância à herbicida) e a região promotora (opostamente orientada) de um primeiro gene de interesse. Frequen- temente, outros genes de interesse foram também incluídos entre as bordas de T-DNA.

Exemplo 2: Extração de DNA Genômico de Milho

[0098] O DNA genômico de amostras de semente de milho simples foi extraído usando um método de FastID™ modificado (Kit de Extração de 96 cavidades de DNA Genômico FastID™; GENETIC ID, Fairfield, IA). As amostras de semente foram moídas usando esferas de aço inoxidável de 9,65 cm em frascos de policarbonato de 4 mL (OPS Diagnostics LLC, Lebanon, NJ) em um GENO/GRINDER™ 2010 (SPEX SAMPLEPREP, Metuchen, NJ) por 2 minutos a 1500 rpm. 1 mL de tampão de lise contendo Proteinase K (FastID™ Genomic DNA Kit) foi adicionado ao pó moído de semente simples, e a pasta fluida foi adicionalmente homogeneizada por 20 segundos a 1500 rpm. Os frascosforam centrifugados por 3 minutos a 1450 x g, e 200 μL de sobre- nadante foi transferido para placas de Cavidade Profunda de 96 cavidades KINGFISHER™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Indianapolis, IN) contendo tampão de ligação com contas magnéticas (MAGAT- TRACT™ Suspension G; Qiagen).

[0099] Alternativamente, em experimentos nos quais o pó moído de volume foi destinado para teste de Presença Acidental, 600 μL de tampão de lise foi adicionado, e a pasta fluida foi homogeneizada por 5 minutos a 1360 rpm no GENO/GRINDER™ 2010. As amostras foram centrifugadas por 5 minutos a 6800 x g, e 200 μL de sobrenadante foi transferido para placas KINGFISHER™ contendo o tampão de ligação com contas magnéticas.

[00100] Em ambos os exemplos (semente simples e semente moída de volume), o DNA ligado às contas magnéticas foi lavado e eluído usando uma plataforma de extração de DNA automática KINGFISHER™. O DNA foi eluído em 200 μL de 1x de tampão de TE (10 mM de Tris HCL, 1 mM de EDTA, pH 8,0), e foi armazenado a 4°C até uso adicional. O DNA extraído foi quantificado usando um kit de ensaio de DNA QUANT-IT™ PICO GREEN (MOLECULAR SONDAS; Invitrogen, Carlsbad, CA), e tampão foi adicionado a uma concentração final de 10 ng/μL.

Exemplo 3: Produção de Plantas de Milho Transgênicas

[00101] Embriões imaturos foram isolados de ouvidos de linha pura de Zea mays B104 quando os embriões foram cerca de 1,8 a 2,4 mm de comprimento. Os embriões foram incubados com uma suspensão de Agrobacterium contendo acetosiringona e o surfactante, BREAK THRU™ S-233 a uma Densidade Ótica de 1,0 por 20 a 30 minutos, e então colocados em meio de co-cultivo, scutellum-up orentados.

[00102] A etapa de co-cultivo foi continuada por 3 a 4 dias, em seguida os embriões foram transferidos em meio de cultura de tecido de planta contendo antibióticos por 7 dias para suprimir crescimento de Agrobacterium e iniciar formação de calos. Os calos foram movidos para o meio contendo um agente de seleção apropriado para suprimir crescimento de tecido não-transformado por 3 semanas, e, em seguida, foram colocados em meio de seleção contendo hormônios de crescimento de planta por 7 dias para induzir germinação de embrião somática. Após uma semana de exposição ao meio de hormônio de crescimento de planta, os calos foram colocados em um meio de regeneração de planta com seleção.

[00103] As plantas tipicamente formadas dentro de 1 a 2 semanas após serem transferidas para o meio de regeneração de planta, e como plântulas desenvolvidas, elas foram movidas para o meio de crescimento de planta. 10-15 mg de tecido de folha de cada planta foram amostrados para análise de PCR de sonda de hidrólise do gene mercadorselecionável (AAD1; Patente dos Estados Unidos No. 7.838.733) uma semana antes de 30 a 40 eventos de número de cópia baixo (isto é, 1 a 3 cópias do gene marcador selecionável) por construto foram transferidos para a estufa para transplantação e crescimento na estufa. Todos eventos T0 foram de-borlados e polinizados com pólen B104 para produção de semente T1. As plantas T1 e T2 foram auto-polinizadas para produzir sementes homozigóticas.

[00104] Exemplo 4: Detecção de Elementos Genéticos Únicos Compreendidos em um Conjunto de Vetor

[00105] UGEs individuais em DNA de plasmídeo contendo os amplicons de UGE foram detectados usando um método de PCR com uma sonda de oligonucleotídeo de hidrólise única. Iniciadores universais foram usados nos ensaios de PCR para amplificação e detecção de UGEs de grupos diferentes de construtos. Iniciadores universais usados para amplificar os amplicons listados na Tabela 1 são descritos na Tabela 2. Sondas de hidrólise de PCR à base de fluorescência su- primível foram projetadas para serem especificamente hibridizáveis a UGEs alvos, e foram etiquetados com corante repórter de fluorescência de FAM (MGBNFQ como supressor). Os oligonucleotídeos de sonda de hidrólise compreendem uma sequência de nucleotídeo idêntica ao UGE a ser detectado.

[00106] Pré-validação de UGEs foi efetuada por testes de diluições em série de DNA de plasmídeo contendo UGE por si próprio, e DNA genômico de milho não-transgênico perfurado com concentrações variadas de DNA de plasmídeo contendo UGE. Desse modo, iniciadores e sondas de hidrólise foram também projetadas para amplificar e hibri- dizar especificamente a controles internos de milho alvo, ZSSIIb (SEQ ID NO:48) e Invertase (SEQ ID NO:47). Tabela 3. Estas sondas de controle foram etiquetadas com corante repórter de fluorescência de HEX (BHQ2 como supressor). Iniciadores e sondas foram obtidos de Applied BioSistemas (Carlsbad, CA) ou Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Reagentes de PCR foram obtidos de Qiagen (Valencia, CA). Tabela 2. Pares de iniciadores e sequências de iniciadores de PCR usados para amplificar fragmentos compreendendo UGEs para ensaios de sonda de hidrólise.

Tabela 3. Iniciador de PCR e sequências de sonda usadas para detectar genes de controle interno de milho.

[00107] Validação por ensaios de PCR de Sonda de Hidrólise demonstrou que UGEs individuais foram detectados com alta precisão, especificidade, e eficiência. Técnicas de PCR de tempo real e de ponto final foram utilizadas para detectar UGEs de plasmídeos e DNA genô- mico de milho, de acordo com as condições nas Tabelas 4-5. Ensaios de PCR biplex (TAQMAN®) foram realizados para detectar ambos o alvo (UGE), bem como o controle interno (Invertase ou ZSSIIb). Tabela 4. Componentes da reação de PCR.

* Conforme apropriado; incluído em experimentos contendo DNA ge- nômico de milho.

[00108] Após PCR, misturas foram produzidas (Tabela 4), 7 L de mistura (para uma placa de 384 cavidades), ou 12 L de mistura (para uma placa de 96 cavidades) foram transferidas em cada cavidade, e 3 L de amostra de DNA (até 30 ng/reação) foram adicionados. As placas de PCR foram seladas com uma membrana FLEXISEAL™, e as reações foram efetuadas em um ciclador térmico.

[00109] Condições de PCR diferentes foram utilizadas para detectar UGEs em amostras de plasmídeo (Tabela 5a), quando os plasmídeos de UGE foram perfurados em DNA genômico DNA preparado de milho não-transgênico (Tabela 5b), ou quando os UGEs foram ensaiados em DNA genômico preparado de milho transgênico (Tabela 5c). Em expe-rimentos no qual os plasmídeos de UGE foram perfurados em DNA genômico de milho, e quando os UGEs foram ensaiados em DNA de milho transgênico, ensaios de PCR de sonda de hidrólise biplex foram efetuados para detectar ambos o UGE e os genes de controle interno de milho (referência) (invertase ou ZSSIIb). Para reações de PCR de ponto final, ou um ciclador térmico C1000 (BIORAD), ou um ciclador térmico PE9700 (PERKIN ELMER) foi usado. Para reações de PCR de tempo real, um ciclador térmico LIGHTCYCLER® II (ROCHE) foi usado. Tabela 5. Parâmetros de Reação de PCR.

[00110] As placas de PCR completadas foram lidas em uma leitora de placa de fluorescência PHERASTAR™ FS (BMG LABTECH; Cary, NC).

[00111] Amplicons compreendendo um de seis UGEs (Tabela 1; UGE1-UGE6) foram sintetizadas e clonadas em plasmídeos de alto número de cópia, e DNAs de plasmídeo apropriados (isto é,pEPP1135 a pEPP1140; correspondente a UGE1-UGE6, respectivamente) foram usados para testar a eficiência de amplificação e detecção de PCR, especificidade, e sensibilidade nas reações de PCR de ponto final. As sequências de polinucleotídeos compreendendo os seis UGEs e elementos de flanqueamento foram alinhados em Vector NTI para mostrar as diferenças em sequência de nucleotídeo. FIG. 1.

Especificidade de detecção de UGE

[00112] Sondas de hidrólise (etiquetadas com corante fluorescente FAM) tendo como alvo os seis UGEs foram testadas contra cada um dos DNAs de plasmídeo de UGE (pEPP1135-pEPP1140). Cada sonda de hidrólise designada tendo como alvo um dos seis UGEs diferentes especificamente amplificam o UGE alvo (marcado com círculos), e ne-nhumaamplificação/reatividade cruzada não-específica foi vista de outras sondas. FIG. 2. As sondas de hidrólise mostraram-se se distinguir entre todos os seis cassetes contendo UGE diferentes em DNA de plasdmídeo (pEPP1135-pEPP1140). As sondas foram também testadas contra controle sem gabarito e DNA de milho de controle negativo para descartar qualquer ligação não-específica. FIG. 2.

Sensibilidade de detecção de UGE

[00113] Usando combinações de gabarito de UGE/sonda de hidrólise apropriada para cada dos plasmídeos contendo UGE, reações de PCR de ponto final de ensaio de sonda de hidrólise foram realizadas para determinar o nível de sensibilidade do método. O DNA de plasmí- deo contendo os UGEs foi usado como gabarito para amplificação de PCR. Concentrações variando de 0,0000001 ng a 1 ng de DNA de plasmídeo foram testadas. Os resultados mostraram que concentrações muito baixas de DNA de gabarito contendo UGE podem ser detectadas com todas as sondas de hidrólise. FIG. 3. As sondas foram também testadas contra controle sem gabarito e DNA de milho de controle negativo para descartar qualquer ligação não-específica. FIG. 3.

Exemplo 5: Detecção Específica e Sensível de Elementos Genéticos únicos em DNA de Milho

[00114] Detecção de DNA de UGE em DNA genômico de milho não-transgênico

[00115] UGEs (UGE2, UGE3, e UGE7-UGE21) foram detectados por PCR de sonda de hidrólise de tempo real quando perfurados em um fundo de DNA genômico do milho. Diluições variando de 0,0000001 ng a 1 ng foram testadas. PCRs de tempo real foram realizados usando o ciclador térmico LIGHTCYCLER™ II. As curvas de fusão foram analisadas e calores médios Cp foram calculados para cada diluição de DNA alvo. Limites de detecção determinados para cada um dos UGEs testado são listados na Tabela 6. Exemplos de ensaios individuais (detecção de UGE3 e UGE4) são mostrados na FIG. 4 e FIG. 5, respectivamente. Estes resultados de PCR demonstram a praticabilidade de detecção de UGEs com alta sensibilidade, que sugere que UGEs podem proporcionar uma nova ferramenta para detectar construtos de transformação de planta. Tabela 6. Limites de detecção de UGEs quando perfurados em DNA genômico de milho não-transgênico. "Quantidade Mais Baixa Detectada" representa o limite de detecção para cada UGE em um ensaio de PCR de tempo real de sonda de hidrólise.

[00116] Detecção de UGEs em DNA genômico de sementes de plantas de milho transgênico.

[00117] Amplicons de UGE foram adicionalmente clonados em vetores de transformação de planta seguindo a estratégia descrita nas FIGs. 6-7. Doze amplicons compreendendo um UGE foram usados em 366 vetores de expressão de planta que conduzem genes de interesse diferentes, e quase 8.000 eventos transgênicos foram gerados. Tabela 7. Tabela 7. Amplicons compreendendo um UGE incorporado em vetores de transformação de planta.

[00118] DNA genômico isolado de sementes de eventos transgêni- cos T1 heterozigóticos obtidos por transformação com construtos que continham UGE2 e UGE3 foram usados para testar detecção de UGE (fontes de semente são listadas na Tabela 8). O DNA genômico foi iso- lado conforme descrito anteriormente. A concentração do DNA genô- mico foi ajustada para 10 ng/μL, e um total de 30 ng de DNA genômico foi usado para cada reação de PCR. DNA de semente de milho não-transgênico foi usado como um controle negativo. Tabela 8. Materiais usados para detecções de UGE em DNA genômico preparado de sementes de plantas de milho transgênico heterozigóti- cas.

[00119] Ensaios de PCR de sonda de hidrólise de ponto final específica de UGE foram efetuados, e os resultados foram analisados como uma função de fluorescência normalizada vs. número de amostra. FIG. 8. Os resultados mostraram uma amplificação sensível e detecção de sequências de UGE alvos de amostras transgênicas e nenhuma ampli-ficação de amostras de milho não-transgênicas, demonstrando, desse modo, a especificidade do método de detecção.

[00120] Exemplo 6: Uso de Elementos Genéticos Únicos para Teste de Presença Acidental

[00121] Para testar o uso de UGEs para detenção de presença acidental, sementes homozigóticas T2 foram obtidas de plantas transgêni- cas produzidas por transformação com construtos contendo UGE3 (fontes de semente listadas na Tabela 9). No total, 35 sementes trans- gênicas homozigóticas por evento foram escolhidas e DNA genômico foi isolado.

[00122] Table 9. Identidades de materiais usados para detecção de UGE3 em DNA genômico preparado de sementes de plantas de milho transgênico T2 homozigóticas.

[00123] Os ensaios de PCR de sonda de hidrólise de ponto final específicos de UGE foram efetuados, e os resultados foram analisados conforme descrito no Exemplo 5. Os resultados mostraram clara ampli-ficação de sequências de UGE3 alvos a partir das amostras transgêni- cas homozigóticas e amostras de controle positivo, e nenhuma amplifi-cação de amostras de milho não-transgênicas (controles negativos). FIG. 9.

[00124] As amostras de DNA genômico de milho preparadas de 35 sementes homozigóticas de ID de Fonte transgênica No. ZQ11LQ199088.0016.016 (Tabela 9) foram reunidas e diluições em série (100%, 10%, 1%, 0,5% e 0,1% de DNA transgênico) foram geradas usando DNA genômico de milho não-transgênico como o antecedente (diluente). Seis réplicas de cada diluição de DNA transgênico foram efetuadas em ensaios de PCR de sonda de hidrólise de ponto final (40 ciclos).

[00125] Os resultados foram analisados como uma função de fluo-rescência relativa vs. número de amostra. FIG. 10. A fluorescência relativa medida de todas as diluições foi detectada. Nenhuma amplificação não-específica foi observada de amostras negativas (nenhum controle de gabarito e controles de DNA não-transgênicos). Estes resulta- dos demonstram que UGEs podem ser detectados em DNA genômico preparado de sementes de milho transgênico com sensibilidade e precisão extremamente altas.

[00126] Conjuntos de 100 sementes são tipicamente testados para presença acidental, que requer um método de detecção adequado para identificar uma semente transgênica de contaminação simples entre 99 sementes não-transgênicas, que se iguala a 1% de requisição de sensibilidade. Uma semente de milho T2 transgênica simples (pDAB108526 - ID de Fonte # ZQ11LQ199088.0016.016) contendo um UGE (UGE3) foi perfurada em um conjunto de 99 sementes de milho não-transgênicas. O DNA isolado a partir do conjunto de semente foi testado usando o PCR de sonda de hidrólise de ponto final. Os resultados demonstraram que semente de contaminação pode ser facilmente detectada usando o ensaio específico de UGE (FIG. 11), fortalecendo adicionalmente o argumento que UGEs podem ser usadas para teste de AP, e para monitoramento de eventos transgênicos.

Claims (15)

1. Método para identificação em uma amostra compreen-dendo DNA de planta de um ou mais de uma pluralidade de polinucle- otídeos heterólogos, no qual cada um dos polinucleotídeos heterólo- gos compreende na direção 5’ a 3’: uma primeira sequência de nucleo- tídeo que é idêntica entre todos dos membros da pluralidade; uma se-gundasequência de nucleotídeo que é única entre todos dos membros da pluralidade; e uma terceira sequência de nucleotídeo que é idêntica entre todos dos membros da pluralidade de polinucleotídeos heterólo- gos, o referido método sendo caracterizado pelo fato de que compreende: proporcionar a amostra compreendendo DNA de planta; contatar o DNA de planta com um par de iniciadores de oli- gonucleotídeo que especificamente hibridizam às primeira e terceira sequências de nucleotídeos respectivamente; amplificar em uma reação de cadeia de polimerase (PCR) uma pluralidade de amplicons, cara um contendo uma das segundas sequências de nucleotídeos que estão presentes em polinucleotídeos heterólogos na amostra; e contatar os amplicons com uma molécula de sonda que es-pecificamente hibridiza a um local de ligação na segunda das segunda sequências de nucleotídeos, no qual o local de ligação compreende o polinucleotídeo da reivindicação 13 e a hibridização específica da sonda ao local de ligação produz um sinal detectável.

2. Sistema para detecção de um ou mais de uma pluralidade de ácidos nucleicos heterólogos em uma planta geneticamente mo-dificada, o referido sistema sendo caracterizado pelo fato de que que compreende: um conjunto de vetores de expressão de planta, no qual cada um dos vetores compreende um cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico heterólogo compreendendo, na direção 5’ - 3’: uma primeira sequência de nucleotídeo, uma segunda sequência de nucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeo compreendendo um local de ligação compreendendo o polinucleotídeo da reivindicação 13 que é única entre todos dos vetores do conjunto, e uma terceira sequência de nucleotídeo, um oligonucleotídeo de iniciador de avanço universal que especificamente hibridiza a primeira sequência de nucleotídeo; e um oligonucleotídeo de iniciador reverso universal que es-pecificamente hibridiza a terceira sequência de nucleotídeo.

3. Método para identificação em uma amostra compreen-dendo DNA de planta, um ou mais de uma pluralidade de polinucleotí- deos, caracterizado pelo fato de que cada um dos polinucleotídeos he- terólogos compreende na direção 5’ a 3’: uma primeira sequência de nucleotídeo que é idêntica entre todos dos membros da pluralidade; uma segunda sequência de nucleotídeo que é única entre todos dos membros da pluralidade; e uma terceira sequência de nucleotídeo que é idêntica entre todos dos membros da pluralidade, o referido método compreendendo: proporcionar a amostra compreendendo DNA de planta; contatar o DNA de planta com um par de iniciadores de oli- gonucleotídeo que especificamente hibridizam às primeira e terceira sequências de nucleotídeos respectivamente; amplificar em uma reação de cadeia de polimerase (PCR) uma pluralidade de amplicons, cada um contendo uma das segundas sequências de nucleotídeos que estão presentes na pluralidade de po- linucleotídeos na amostra; e sequenciar os amplicons para determinar a presença de uma segunda sequência de nucleotídeo que compreende o polinucleo- tídeo da reivindicação 13.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracteri-zado pelo fato de que cada um da pluralidade de polinucleotídeos he- terólogos compreende um gene, e no qual a segunda sequência de nucleotídeo está fora do gene em cada um da pluralidade de polinu- cleotídeos heterólogos.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracteri-zado pelo fato de que a primeira sequência de nucleotídeo e a terceira sequência de nucleotídeo estão ambas fora do gene em cada um da pluralidade de polinucleotídeos heterólogos.

6. Sistema, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende um conjunto de moléculas de sonda, no qual cada molécula de sonda compreende um oligo- nucleotídeo que especificamente hibridiza ao local de ligação no segundo polinucleotídeo de somente um dos vetores no conjunto, no qual a hibridização específica da sonda a um amplicon compreendendo o segundo polinucleotídeo produz um sinal detectável.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 6, caracteri-zado pelo fato de que a molécula de sonda compreende um fluoróforo e um supressor de modo que quanto a sonda liga especificamente ao local de ligação na segunda sequência de nucleotídeo, o fluoróforo liberado a partir do supressor, produzindo, desse modo, um sinal de fluorescência detectável.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracteri-zado pelo fato de que: (i) os amplicons estão, cada um, entre cerca de 70 e cerca de 80 nucleotídeos de comprimento, (ii) as segundas sequências de nucleotídeos estão cada en-tre cerca de 15 e cerca de 25 nucleotídeos de comprimento, (iii) a segunda sequência de nucleotídeo é diretamente ad-jacente ao primeiro polinucleotídeo e ao terceiro polinucleotídeo em cada amplicon, (iv) o PCR e contato dos amplicons com a(s) molécula(s) de sonda, são realizados em uma reação de PCR de ponto final, ou em uma reação de PCR de tempo real, ou (v) a amostra compreende polinucleotídeos heterólogos em uma quantidade de pelo menos cerca de 8,33 x 10-8% comparada à quantidade total de DNA na amostra.

9. Sistema, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que: (i) os cassetes de expressão compreendem um ou mais elementos regulatórios operacionalmente ligados ao gene, em que, preferivelmente, a primeira sequência de nucleotídeo e a terceira se-quência de nucleotídeo estão, ambos, fora do gene de interesse em cada um dos cassetes de expressão, (ii) os polinucleotídeos heterólogos são, cada um, entre cerca de 70 e 80 nucleotídeos de comprimento, (iii) em que as segundas sequências de nucleotídeos são cada entre cerca de 15 e 25 nucleotídeos de comprimento, ou (iv) a segunda sequência de nucleotídeo é diretamente ad-jacente a primeira sequência de nucleotídeo e a terceira sequência de nucleotídeo em cada ácido nucleico heterólogo.

10. Sistema, de acordo com a reivindicação 2, o referido sistema sendo caracterizado pelo fato de que compreende adicional-mente pelo menos uma amostra compreendendo DNA de uma planta transformada com pelo menos um do conjunto de vetores de expressão.

11. Método para detecção de um ou mais de uma pluralidade de ácidos nucleicos heterólogos em uma planta geneticamente mo-dificada, o referido método sendo caracterizado pelo fato de que compreende: proporcionar o sistema como definido na reivindicação 10; contatar o DNA a partir da planta com um iniciador de avanço universal e um iniciador reverso universal; realizar uma reação de cadeia de polimerase (PCR) para amplificar o ácido nucleico heterólogo de um vetor no conjunto; e detectar uma ou mais das segundas sequências de nucleo- tídeos.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que: (i) uma pluralidade dos ácidos nucleicos heterólogos, a partir dos vetores no conjunto, é amplificada, (ii) a detecção de uma ou mais das segundas sequências de nucleotídeos compreende contatar o ácido nucleico amplificado com uma ou mais molécula de sondas, no qual cada molécula de sonda especificamente hibridiza ao local de ligação na segunda sequência de nucleotídeo de somente um dos vetores no conjunto, no qual a hi- bridização específica da sonda ao local de ligação produz um sinal de- tectável, (iii) realizar PCR compreende ensaio de PCR de sonda de hidrólise, ou (iv) a detecção de uma ou mais das segundas sequências de nucleotídeos compreende o sequenciamento do ácido nucleico am-plificado.

13. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que apresen- tanda uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1-21 e seus complementos, em que, pre-ferivelmente, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleo- tídeo selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:22-42.

14. Sistema para detecção de ácidos nucleicos exógenos em um organismo geneticamente modificado, o referido sistema sendo caracterizado pelo fato de que compreende: um ácido nucleico compreendendo um local de ligação que compreende o polinucleotídeo da reivindicação 13; e pelo menos uma molécula de sonda compreendendo um oligonucleotídeo que especificamente hibridiza ao local de ligação.

15. Sistema, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:22-42, o sistema, opcionalmente, ainda compreendendo dois oli- gonucleotídeos de iniciador que especificamente hibridizam ao local de ligação, e preferivelmente o sistema ainda compreendendo dois oligo- nucleotídeos de iniciador que especificamente hibridizam ao ácido nu- cleico em um local dentro da sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:22-42, no qual os oligonu- cleotídeos de iniciador não hibridizam especificamente ao ácido nu- cleico no local de ligação.

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