CN118147329A - 美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RPA-CRISPR-Cas12a检测试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RPA‑CRISPR‑Cas12a检测试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的特异性RPA引物和crRNA；还公开了利用所述试剂盒检测美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的方法，该方法具有快速、特异性好、敏感度高且可视化的特点，可以用作一种临床检测美人鱼发光杆菌杀鱼亚种导致的类结节病的技术手段，且对设备要求较低，特别适用于现场检测，为海洋鱼类养殖的监测提供了一种良好的技术手段。本发明还进一步公开了上述试剂盒在制备美人鱼发光杆菌杀鱼亚种检测产品中的应用。

Description

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RPA-CRISPR-Cas12a检测试剂盒及 应用

技术领域

本发明属于水产养殖动物病原体检测技术领域，具体涉及一种美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RPA-CRISPR-Cas12a检测试剂盒及应用。

背景技术

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种是鱼类发光杆菌病或类结节病的病原体，能够导致鱼类发生细菌性败血症，引起鱼类表皮溃疡症状，急性病变的肝、脾、肾多灶性坏死，吞噬细胞、毛细血管和间质中增殖；慢性病变的特征是内脏存在直径约1-5mm的白色结节，又称为“假结节病”。由于美人鱼发光杆菌杀鱼亚种能在自然环境和水产养殖中造成严重的死亡率，因此，对全球海洋水产养殖造成了巨大的经济损失，是水产养殖中危害最为严重的的细菌性疾病之一。因此，建立一种敏感、低成本且快速的美人鱼发光杆菌杀鱼亚种检测方法，对该致病菌引起的类结节病防控具有重要意义。

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种具有嗜盐性、胞内寄生、兼性厌氧等特性的革兰氏阴性菌，菌体呈球杆状或者短杆状，不具有运动性。菌落呈白色、表面光滑的圆形，在绵羊血平板上生长良好，能够形成鲜明的溶血现象。美人鱼发光杆菌杀鱼亚种能够发酵甲基红、葡萄糖、发酵L-甘乳糖和L-半乳糖，V-P试验、精氨酸双水解酶为阳性，吲哚试验为阴性等，不能在TCBS培养基生长，对多粘菌素B、弧菌抑制剂O/129具有抗性。

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种能够感染多种海洋经济鱼类，且没有明显的宿主特异性。美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的致病性与其致病因子密切相关，主要的致病因子分为胞外蛋白酶类，胞外溶血素以及细胞毒素三大类，而这些致病因子能够引起多种海洋鱼类出血性败血症、创伤性感染，以至于发生大量海洋鱼类死亡的现象。

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种检测方法有常规的微生物学方法；免疫学方法有凝集反应或者酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)，美人鱼发光杆菌杀鱼亚种检测技术成熟且已商业化；分子生物学方法发展迅速且已被广泛应用于细菌的分类。扩增细菌16S rRNA序列并进行测序，能够鉴定到美人鱼发光杆菌种的水平，但不能区分杀鱼亚种和美人鱼亚种。16S rRNA扩增能够检测到美人鱼发光杆菌，再联合使用ureC基因进行鉴定可区分美人鱼发光杆菌杀鱼亚种和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种两个亚种。此外，细菌染色体DNAG+Cmol含量测定法、核酸杂交法等也因探针技术操作方便而逐渐应用于临床。然而，上述美人鱼发光杆菌杀鱼亚种检测方法具有需要精密仪器、检测时间长、灵敏度低，假阳性率高等缺点。

环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型的核酸等温扩增技术，可用于美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的鉴定。与传统PCR检测方法相比，LAMP检测方法灵敏度高，但反应中加入多对引物致使其可信度降低，增大了假阳性的结果。重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymerase amplification,RPA)是一种新型核酸等温扩增技术，具有简单、快速和低成本等优点，且对仪器设备要求极低，在37-42℃的恒温下即可对特定的DNA或RNA进行指数扩增。

CRISPR/Cas系统的最新进展为分子诊断提供了一条新的检测途径，在靶向识别与CRISPR RNA(crRNA)互补的DNA序列后，Cas12a显示顺式切割活性，切割双链DNA。Cas12a在识别双链DNA(dsDNA)后被激活，表现出侧支反式切割活性，即对附近的非靶向单链DNA(ssDNA)进行非特异性切割。但有研究表明，Cas12a的侧裂活性在靶标DNA浓度过低时无法产生可检测的信号，因此，核酸预扩增是能否提高检测方法敏感性的关键。基于RPA，利用CRISPR/Cas系统已成功开发了多种高灵敏、特异、低成本的检测平台，用该技术已被广泛应用于检测淋病奈瑟菌、白斑综合征病毒等病原体。迄今为止，还没有报道利用CRISPR/Cas12a系统检测美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的诊断策略。

发明内容

本发明的目的在于一种美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RPA-CRISPR-Cas12a检测试剂盒。

本发明的目的还在于提供利用所述试剂盒检测美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的方法。

本发明的最后一个目的在于提供上述试剂盒在制备美人鱼发光杆菌杀鱼亚种检测产品中的应用以及上述方法在美人鱼发光杆菌杀鱼亚种检测中的应用。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RPA-CRISPR-Cas12a检测试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的特异性RPA引物和crRNA；

所述特异性RPA引物包括SIR2-RPA-F和SIR2-RPA-R，所述SIR2-RPA-F的序列如SEQID NO.1所示，所述SIR2-RPA-R的序列如SEQ ID NO.2所示；

所述crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。

具体地：

SIR2-RPA-F：

5’-TTCTTTCTATTCGATCCTCACCTTCCTTTAA-3’(SEQ ID NO.1)；

SIR2-RPA-R：

5’-TTTTGAACGAGTAATATTTAGAGATGCCTTG-3’(SEQ ID NO.2)。

crRNA：

5’-GGGUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGCCACAAGUUCUGUCAUUU-3’，即：

5’-GGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATAGCCACAAGTTCTGTCATTT-3’

(SEQ ID NO.3)。

进一步地，本发明所述试剂盒还包括Cas12a蛋白。

可选地，所述Cas12a蛋白为LbCas12a蛋白。

更进一步地，本发明所述试剂盒还包括信号报告探针。

可选地，所述信号报告探针为荧光报告探针或试纸条报告探针。

进一步地，所述信号报告探针为含有TTATT的单链DNA报告序列。

可选地，所述荧光报告探针为5′FAM-TTATT-BHQ-3′。

可选地，所述试纸条报告探针为5′FAM-TTTTTTTATTTTTTT-biotin-3′。

进一步地，所述试纸条报告探针和Cas12/13通用侧流层析试纸条搭配使用。

本发明通过RPA反应增强CRISPR-Cas12a体系检测灵敏度，并利用CRISPR-Cas12a的切割效应，弥补RPA易产生假阳性的检测结果，还可结合Cas12/13通用侧流层析试纸条分析，对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种进行灵敏度高、特异性强、无需昂贵设备和可视化检测。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：利用所述试剂盒检测美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本基因组的DNA；

(2)配制RPA反应体系，利用所述RPA引物对待测样本基因组的DNA进行RPA扩增反应，得RPA扩增靶基因产物；

(3)取RPA扩增靶基因产物，加入Cas12a蛋白、crRNA和信号报告探针，进行CRISPR-Cas12a反应检测，读取检测信号，即得。

在上述利用所述试剂盒检测美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的方法中：

可选地，步骤(2)中所述RPA反应体系包括Abuffer 29.4μL，B buffer 2.5μL，终浓度为0.40μM的RPA上、下游扩增引物各2μL，待检测样本基因组DNA2μL，其余用无酶水补足至50μL。

可选地，步骤(2)中RPA扩增反应时，置于37℃的恒温反应器上反应20min。

可选地，步骤(3)中所述CRISPR-Cas12a反应检测体系包括：NE Buffer r2.1(10×)2μL，浓度为1μM的Cas12a蛋白1μL，浓度为1μM的crRNA1μL，RPA扩增靶基因产物2μL，信号报告探针100nM，加DEPC water补足至20μL。

可选地，步骤(3)中CRISPR-Cas12a反应程序为：在实时荧光PCR仪中37℃反应20min后，进行荧光检测，或在37℃恒温反应器反应20min后加入无酶水补足至50μL后滴加于Cas12/13通用侧流层析试纸条上观察结果。

本发明中的方法使用RPA/CRISPR-Cas12a体系可视化检测美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的方法，将RPA特异性扩增与crRNA特异性序列鉴定相结合，使CRISPR-Cas12a检测更具特异性；并在37℃条件下进行检测，适合在缺乏PCR仪等仪器设备的实验室或现场使用；同时可以根据现有条件选取荧光法或Cas12/13通用侧流层析试纸条观察。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述试剂盒在制备美人鱼发光杆菌杀鱼亚种检测产品中的应用以及上述方法在美人鱼发光杆菌杀鱼亚种检测中的应用。

本发明具有以下优点：

(1)本发明中的RPA-CRISPR-Cas12a检测不仅能够用于荧光检测样品的分析，还可以结合侧向流免疫层析试纸条进行可视化检测，既能够应用于实验室，也能够应用于现场检测；

(2)本发明中的RPA-CRISPR-Cas12a检测具有稳定性高、实用性强、扩增效率高、无交叉反应，能够特异性地识别SIR2基因序列，荧光法和侧向层析试纸条检测法符合率高达100％；

(3)本发明在37℃条件下设计并实现了基于RPA的CRISPR-Cas12a检测方法，使其易于在设备条件较差的实验室或现场使用，同时其单管反应，也避免了反应过程中开盖操作，而引起的交叉污染；

(4)本发明方法具有快速、特异性好、敏感度高且可视化的特点，可以用作一种临床检测美人鱼发光杆菌杀鱼亚种导致的类结节病的技术手段，且对设备要求较低，特别适用于现场检测，为海洋鱼类养殖的监测提供了一种良好的技术手段。本发明还进一步公开了上述试剂盒在制备美人鱼发光杆菌杀鱼亚种检测产品中的应用。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

图1为具体实施方式中提供的基于RPA-CRISPR-Cas12a体系检测美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的流程图；

图2为本发明实施例5中美人鱼发光杆菌杀鱼亚种基因RPA扩增后的特异性检测结果，其中美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(RC230406a)、美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(TOCT-1)、副溶血性弧菌(B220122)、哈维氏弧菌(VA-lv-B)、溶藻弧菌(X20XC22)、创伤弧菌(TOVV-1)、最小弧菌(B210904)、霍乱弧菌(G201005)，M:DL2000Marker，NTC：体系中未加入模板，下同；

图3为本发明实施例5中美人鱼发光杆菌杀鱼亚种基因的荧光检测结果，注：***有显著差异(P<0.0001)；

图4为本发明实施例5中美人鱼发光杆菌杀鱼亚种基因的试纸条检测结果；

图5为本发明实施例6中美人鱼发光杆菌杀鱼亚种基因的RPA扩增后灵敏度检测结果；

图6为本发明实施例6中美人鱼发光杆菌杀鱼亚种基因的灵敏度荧光检测结果；

图7分别为本发明实施例6中美人鱼发光杆菌杀鱼亚种基因的试纸条灵敏度检测结果(NTC：体系中未加入模板，M：DL2000 Marker，注：***有显著差异(P<0.0001))。

图8为本发明实施例7中美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RPA/CRISPR Cas12a的试纸条测试临床检测结果；

图9为本发明实施例7中美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RPA/CRISPR Cas12a的LFD法临床检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂，材料均为市购，合成的引物探针等均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

RPA试剂盒也叫DNA恒温扩增试剂盒，推荐但不限于购买于安普未来生物科技有限公司。

Lbcas12a试剂盒和Cas12/13通用侧流层析试纸条推荐但不限于购买于广州艾迪基因科技有限责任公司。

作为本发明的一种优选实施例，本发明提供的一种基于RPA-CRISPR-Cas12a体系检测美人鱼发光杆菌杀鱼亚种方法，检测流程如图1所示，具体包括：首先进行提取样本的DNA，对提取到的样本DNA进行RPA恒温快速扩增，得到扩增产物，将扩增产物加入CRISPR-Cas12a体系中，CrRNA和扩增产物dsDNA在Cas12a酶的作用下，进行超灵敏的特异性识别，进而启动附属切割功能切割ssDNA，最终实现荧光法显示结果或者试纸条显示结果。

实施例1针对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种特定基因靶标序列的RPA引物设计

首先，选取GenBank中发表的美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的全基因组序列进行比较分析，确定特定基因的靶标序列，然后针对靶标序列设计了5组RPA引物对，合成后进行引物的条带特异性和灵敏度的筛选检测后，最终得到如下最合适的引物，通过该引物对得到的基因扩增片段长度为183bp。

SIR2-RPA-F：

5’-TTCTTTCTATTCGATCCTCACCTTCCTTTAA-3’(SEQ ID NO.1)；

SIR2-RPA-R：

5’-TTTTGAACGAGTAATATTTAGAGATGCCTTG-3’(SEQ ID NO.2)。

实施例2CrRNA的优化

在183bp的基因的片段上，本实施例进行了CrRNA的设计和筛选，一共设计了4组，最终优化得到如下1组识别效率最高的CrRNA引导序列：

SIR2-CrRNA-1：

5’-GGGUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGCCACAAGUUCUGUCAUUU-3’，即：

5’-GGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATAGCCACAAGTTCTGTCATTT-3’

(SEQ ID NO.3)。

其中CrRNA的识别长度均为44bp，后续实施例中所用均为SIR2-CrRNA-1。

实施例3RPA体系时间优化

本实施例对RPA体系进行了时间优化，最终选择RPA扩增时间为20min。

实施例4CRISPR-Cas12a反应体系的优化

本实施例对Cas12/crRNA含量和比例进行优化，以及探针浓度进行优化，最终选择LbCas12a与crRNA的比例为2:1(100nM/50nM)，选择荧光探针浓度为200nM。

CRISPR-Cas12a最终的反应体系为：包含NE Buffer r2.1(10×)2μL，Lb Cas12a(1μM)2μL，实施例1中筛选获得的crRNA(1μM)1μL，RPA扩增靶基因产物2μL，DNA探针(1μM)4μL，加DEPC water补足至20μL。

RPA扩增靶基因产物采用实施例3中的方法扩增获得。

DNA探针即信号报告探针，信号报告探针为荧光报告探针或试纸条报告探针，信号报告探针为含有TTATT的单链DNA报告序列，

其中：

荧光报告探针为5′FAM-TTATT-BHQ-3′；

试纸条报告探针为5′FAM-TTTTTTTATTTTTTT-biotin-3′。

实施例5一种基于RPA-CRISPR-Cas12a系统快速检测美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的方法

根据优化后实施例，提供一种基于RPA-CRISPR-Cas12a系统快速检测美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的方法，包括以下步骤：

(1)将RPA扩增体系预混物均匀分配到反应管中充分混合，所述反应管中含有RPA扩增用酶的试剂盒(RPA试剂盒，即dna恒温扩增试剂盒，推荐但不限于购买于安普未来生物科技有限公司)冻干颗粒；

RPA扩增体系采用实施例3获得的优化体系，包括：其中包括Abuffer 29.4μL，Bbuffer 2.5(RPA试剂盒自带)，RPA上、下游扩增引物各2μL(终浓度为0.40μM的上游引物、终浓度为0.40μM的下游引物)，待检测样本基因组DNA 2μL，无酶水12.1μL；

(2)反应混合管倒置10次，混合均匀，置于37℃的恒温反应器(如水浴锅)上反应，20min后获得RPA扩增靶基因产物；

(3)对RPA扩增产物进行CRISPR-Cas12a体系反应并进行荧光检测或试纸条检测。

CRISPR-Cas12a附属切割反应体系及过程为：NE Buffer r2.1(10×)2μL(Lbcas12a试剂盒自带)，Lb Cas12a(1μM)2μL，crRNA(1μM)1μL，RPA扩增靶基因产物2μL，探针200nM，加DEPC water补足至20μL；置于37℃的恒温扩增仪中酶切20min，反应结束后，用荧光或试纸条检测。

荧光检测方法和试纸条检测方法说明如下：

a)荧光方法具体包括：酶切完成后，置于实时荧光PCR仪读取荧光数值，进行荧光值的测定，和NTC相比，***有显著差异(P<0.0001)，则为阳性，反之为阴性。

b)试纸条检测方法具体包括：在酶切完成后，向离心管中加入DEPC water或者CRISPR缓冲液至50μL，将试纸条结合垫端插入离心管。液面不应超过高端绑定垫，孵化2-5min后，观察检测线(T)和控制线(C)的条带情况。

检测结果的确定方法如下：如果T线和C线都出现条带则为阳性；如果只有C线出现条带则为阴性；如果C线和T线均未着色，则检测结果无效。

根据本发明，以患病鱼类的DNA为研究对象，对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的特定基因在恒温条件下的现场速测，利用RPA技术实现美人鱼发光杆菌杀鱼亚种靶标基因序列的指数扩增，设计基于CRISPR-Cas12a系统的美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的特异性精准识别靶向的引导crRNA和荧光报告探针或侧向层析试纸条探针，通过荧光法实现检测技术或结合侧向层析试纸条检测技术使结果可视化，整个反应在37℃完成检测流程，且在40+5/min内完成。

如图2所示，美人鱼发光杆菌杀鱼亚种基因RPA扩增后的特异性检测结果示出，含有美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RC230406a出现了183bp的目标条带，实验对照组样本的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(TOCT-1)、副溶血性弧菌(B220122)、哈维氏弧菌(VA-lv-B)、溶藻弧菌(X20XC22)、创伤弧菌(TOVV-1)、最小弧菌(B210904)、霍乱弧菌(G201005)及阴性对照(NTC)则未出现相应位置的条带。

如图3所示，荧光检测结果表明：含有美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的样本RC230406a产生了显著的荧光信号，实验对照组及阴性对照均只产生较弱的荧光信号。

如图4所示，试纸条检测结果表明：针对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种基因设计的CrRNA的检测结果呈阳性，即检测线与质控线都出现，且检测线条带明显，阴性对照(NTC)的质控线条带较明显，检测线条带极弱。实验证明，试纸条检测结果与荧光检测结果相同。

实施例6RPA-CRISPR-Cas12a系统快速检测美人鱼发光杆菌杀鱼亚种方法的灵敏度检测

本实施例中，分别选取不同DNA浓度(100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL)的美人鱼发光杆菌杀鱼亚种基因片段，对RPA-CRISPR-Cas12a系统的灵敏度进行检测。其中，图5为美人鱼发光杆菌杀鱼亚种基因的RPA扩增后灵敏度检测结果；图6为美人鱼发光杆菌杀鱼亚种基因的灵敏度荧光检测结果；图7分别为美人鱼发光杆菌杀鱼亚种基因的试纸条灵敏度检测结果。

图5中的结果表明：含有美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RC230406a出现了183bp的目标条带，实验对照组样本的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(TOCT-1)、副溶血性弧菌(B220122)、哈维氏弧菌(VA-lv-B)、溶藻弧菌(X20XC22)、创伤弧菌(TOVV-1)、最小弧菌(B210904)、霍乱弧菌(G201005)及阴性对照(NTC)则未出现相应位置的条带。

图6中结果表明：含有美人鱼发光杆菌杀鱼亚种基因片段的10fg/μL的荧光值差异非常小，在10fg/μL时荧光强度与N值的荧光强度仍然具有显著差异，因此，根据本发明提供的检测方法的荧光检测灵敏度为10fg/μL。

图7中的试纸条检测结果显示，在10pg/μL的极限下，SIR2基因的试纸条T线的信号依然明显。当模板浓度低于1pg/μL拷贝时，只观察到明显的C线的信号，即根据本发明提供的检测方法的试纸条检测的检测限为1pg/μL。

实施例7RPA-CRISPR-Cas12a系统快速检测美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的临床检测

本实施例中，选取十份疑似患美人鱼发光杆菌杀鱼亚种感染病鱼的临床样本，分别用RPA/CRISPR-Cas12a荧光法、LFD法(荧光分析法)进行检测。

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RPA/CRISPR Cas12a的试纸条测试临床检测结果如图8所示。

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RPA/CRISPR Cas12a的LFD法临床检测结果如图9所示。

图8-图9中的结果表明，两种检测方法结果均一致，阳性结果占70％，其中第3、7、10份样本为阴性。

综上所述，根据本发明提供的RPA-CRISPR-Cas12a体系可视化美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的检测在37℃完成检测流程，且在45min内完成，特异性良好(图2-图4)，荧光检测最低灵敏度达到10fg/μL(图5-图7)；试纸条检测灵敏度最低达到1pg/μL；该系统在患美人鱼发光杆菌杀鱼亚种病鱼类提取组织DNA进行了应用检测，均可检出，特异性和灵敏度较好。本发明建立的RPA-CRISPR-Cas12a检测方法高效特异，且无需复杂的设备。

以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。

Claims (10)

1.一种美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RPA-CRISPR-Cas12a检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于扩增美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的特异性RPA引物和crRNA；

所述特异性RPA引物包括SIR2-RPA-F和SIR2-RPA-R，所述SIR2-RPA-F的序列如SEQ IDNO.1所示，所述SIR2-RPA-R的序列如SEQ ID NO.2所示；

所述crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RPA-CRISPR-Cas12a检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Cas12a蛋白，所述Cas12a蛋白为LbCas12a蛋白。

3.根据权利要求2所述美人鱼发光杆菌杀鱼亚种RPA-CRISPR-Cas12a检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括信号报告探针，所述信号报告探针为荧光报告探针或试纸条报告探针，所述荧光报告探针为5′-FAM-TTATT-BHQ-3′，所述试纸条报告探针为5′-FAM-TTTTTTTATTTTTTT-biotin-3′。

4.利用权利要求3所述试剂盒检测美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提取待测样本基因组的DNA；

(2)配制RPA反应体系，利用所述RPA引物对待测样本基因组的DNA进行RPA扩增反应，得RPA扩增靶基因产物；

(3)取RPA扩增靶基因产物，加入Cas12a蛋白、crRNA和信号报告探针，进行CRISPR-Cas12a反应检测，读取检测信号。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中所述RPA反应体系包括A buffer29.4μL，B buffer 2.5μL，终浓度为0.40μM的RPA上、下游扩增引物各2μL，待检测样本基因组DNA2μL，其余用无酶水补足至50μL。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(2)中RPA扩增反应时，置于37℃的恒温反应器上反应20min。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所述CRISPR-Cas12a反应检测体系包括：NE Buffer r2.1(10×)2μL，浓度为1μM的Cas12a蛋白1μL，浓度为1μM的crRNA 1μL，RPA扩增靶基因产物2μL，信号报告探针100nM，加DEPC water补足至20μL。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)中CRISPR-Cas12a反应程序为：在实时荧光PCR仪中37℃反应20min后，进行荧光检测，或在37℃恒温反应器反应20min后加入无酶水补足至50μL后滴加于Cas12/13通用侧流层析试纸条上观察结果。

9.权利要求1-3任一项所述试剂盒在制备美人鱼发光杆菌杀鱼亚种检测产品中的应用。

10.权利要求4-8任一项所述的方法在美人鱼发光杆菌杀鱼亚种检测中的应用。