CN113817857A - 基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法、反应体系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法、反应体系及其应用。该反应体系用于植物转基因成分的检测，以体积份数计，每份反应体系各包括如下体积份的各成分：2份10xNE缓冲液2.1（50mM氯化钠，10mM Tris‑盐酸，10mM氯化镁，100ug/ml牛血清白蛋白，pH7.9/25摄氏度）、1份1uM引导序列、1份1uM Lba Cas12a、1份RNA酶抑制剂、1份转基因植物DNA提取物的RPA等温扩增产物或转基因植物的质粒裂解液、1份反应标记物及13份水。本发明为转基因植物的核酸检测提供了新的技术和方法，必将推进基因编辑检测技术在植物核酸检测上的应用研究，具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法、反应体系及其应用。
背景技术
2017-2019年以Cas12a(CRISPR DNA内切酶)为基础的DNA检测技术DETECTR，以Cas13a(CRISPR RNA内切酶)为基础的SHERLOCK RNA检测技术的出现，开拓了在核酸基础上利用基因编辑技术作为高通量、快速、准确、灵敏、易用检测技术的先河，基因编辑检测技术建立在高效核酸检测的基础上，与传统的单克隆抗体蛋白检测技术相比，以无可比拟的优势让多样的植物病毒和转基因植物的高效、快速监管成为可能。目前，以Cas13a为基础的体外核酸检测技术已初步在医学和植物检测上运用，显示高度敏感性、准确性；以Cas12a为基础的体外核酸检测技术已初步在医学上运用，但还没有在植物基因检测上应用；无论是CRISPR DNA内切酶还是CRISPR RNA内切酶都还没有在植物转基因成分检测上的应用报道。CRISPR DNA内切酶报告检测技术由于检测对象是DNA序列，反应体系具有更高的稳定性，在植物基因检测上更容易与传统的PCR、等温扩增等检测技术衔接起来。
发明内容
为充分利用CRISPR DNA内切酶检测技术的优势，填补以Cas12a为基础的体外核酸检测技术在植物基因检测上的空白，本发明利用Cas12a酶开展转基因植物DNA成分的检测，为转基因植物的检测提供新的技术和方法。
具体的，本发明提供了一种基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测反应体系，该反应体系用于植物转基因成分的检测，以体积份数计，每份反应体系各包括如下体积份的各成分：2份10xNE缓冲液2.1、1份1uM引导及折叠序列、1份1uM Lba Cas12a、1份RNA酶抑制剂、1份转基因植物DNA提取物的RPA等温扩增产物、1份反应标记物及13份水。
其中，该反应体系对应的植物转基因成分为CaMV35S启动子、HPT基因、Bar基因或NPTⅡ基因，其各自对应的引导及折叠序列如下：
其中，加粗的为引导序列。
其中，该反应体系用于植物转基因成分的酶标仪检测、定量PCR仪检测以及试纸条显色检测等。
其中，酶标仪检测的反应标记物选自S2或S4，标记方法：两端分别带有FAM和BHQ1基团的含TAT碱基序列单链DNA分子，S2为5`6-FAM-TTAT-3`BHQ1，S4为5`6-FAM-TAT-3`BHQ1；
试纸条检测的反应标记物选自S3，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6-FAM-TAT-Biotin-3；
定量PCR仪检测的反应标记物选自S5，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6-FAM-TTATT-3`BHQ1。
本发明另外提供一种基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法，包括如下步骤：
步骤S1：通过CTAB法提取植物DNA；
步骤S2：制备DNA的RPA等温扩增引物；
步骤S3：构建权利要求1-3中任一项所述的反应体系；
步骤S4：通过酶标仪、定量PCR仪或试纸条显色技术等进行植物转基因成分的检测。
其中，所述步骤S2包括如下步骤：
步骤S21：以体积份数计，分别将如下体积份的各成分混合：2.2-2.5份第一引物、2.2-2.5份第二引物、29-20份Primer Free Rehydration buffer、2份步骤S1提取的DNA、11-12份水；
步骤S22：将步骤S21中各成分混匀，瞬时离心；
步骤S23：将所获取的混合液加入到TwistAmp Basic reaction，混匀；
步骤S24：加入2.5份体积份的280mM MgOAc，混匀
步骤S25：38-40摄氏度下反应20分钟；
步骤S26：-20摄氏度下保存备用。
酶标仪检测的反应标记物选自S2或S4，标记方法：两端分别带有FAM和BHQ1基团的含TAT碱基序列单链DNA分子，S2为5`6-FAM-TTAT-3`BHQ1，S4为5`6-FAM-TAT-3`BHQ1；
试纸条检测的反应标记物选自S3，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6-FAM-TAT-Biotin-3`；
定量PCR仪检测的反应标记物选自S5，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6-FAM-TTATT-3`BHQ1。
其中，该方法用于检测植物转基因成分CaMV35S启动子、HPT基因、Bar基因或NPTⅡ基因，其各自的引物如下：
| 引物名称 | 引物序列 |
| RPA-35S-F | CCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTG |
| RPA-35S-R | GAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCG |
| RPA-Bar-F | CTTCAAGCACGGGAACTGGCATGACGTGGGTTTC |
| RPA-Bar-r | GGAGAAACTCGAGTCAAATCTCGGTGACGG |
| RPA-HPT2-F | GTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGG |
| RPA-HPT2-R | CTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAG |
| RPA-NPTII-F: | GATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCC |
| RPA-NPTII-R: | CCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCC |
其中，引导及折叠序列经过硫代修饰，硫代修饰情况如下：
本发明还提供CRISPR Cas酶基因编辑技术在转基因成分检测上的应用，用于转基因植物CaMV35S启动子、HPT基因、Bar基因或NPTⅡ基因的检测。
本发明提供的基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法、反应体系及其应用，为转基因植物的核酸检测提供了新的技术和方法，必将推进基因编辑检测技术在植物核酸检测上的应用研究，具有重要的现实意义。
附图说明
图1：Cas12a荧光检测系统针对剪切位点HPT1、HPT2及标记方法S2、S4对转基因植物潮霉素基因检测效率比较结果；
图2：Cas12a荧光检测系统针对剪切位点HPT1、HPT2及标记方法S2、S4对转基因植物潮霉素基因检测效率在不同时间的反应强度差异图；
图3：Cas12a荧光检测系统检测转基因植物CaMV 35S启动因子结果；
图4：Cas12a荧光检测系统检测阳性植物表达载体与DNA扩增产物的CaMV 35S启动因子在不同时间的反应强度差异图；
图5：Cas12a荧光检测系统检测转基因植物Bar基因成分结果；
图6：Cas12a荧光检测系统检测阳性植物表达载体与DNA扩增产物的Bar基因在不同时间的反应强度差异图；
图7：Cas12a荧光检测系统检测转基因植物HPT基因成分结果；
图8：Cas12a荧光检测系统检测阳性植物表达载体与DNA扩增产物的HPT基因在不同时间的反应强度差异图；
图9：Cas12a荧光检测系统检测转基因植物NPTⅡ基因成分结果；
图10：Cas12a荧光检测系统检测阳性植物表达载体与DNA扩增产物的NPTⅡ基因在不同时间的反应强度差异图；
图11：硫代修饰及甲基化修饰对Cas12a荧光检测系统检测潮霉素基因效率的比较结果；
图12：Cas12a荧光检测系统检测转基因植物CaMV 35S启动因子的试纸条显色情况；
图13：Cas12a荧光检测系统检测转基因植物Bar基因的试纸条显色情况；
图14：Cas12a荧光检测系统检测转基因植物HPT基因的试纸条显色情况；
图15：Cas12a荧光检测系统检测转基因植物NPTⅡ基因的试纸条显色情况；
图16：Cas12a荧光检测系统检测转基因植物CaMV 35S启动因子、Bar基因、HPT基因及NPTⅡ基因的荧光定量PCR仪器检测结果。
具体实施方式
为了对本发明的技术方案及有益效果有更进一步的了解，下面结合附图详细说明本发明的技术方案及其产生的有益效果。
本发明的目的是提供含CaMV35S启动子、潮霉素基因、Bar基因、NPT II基因等植物转基因成分的植物材料的Cas12a酶基因编辑检测技术高效RPA等温扩增引物和对应Cas12a酶高效检测位点，并利用酶标仪、定量PCR仪，以及试纸条显色技术等实现目标转基因成分的检测，为植物转基因成分的检测建立新的检测体系。
一、反应体系的构建
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供含CaMV 35S启动子、HPT基因、Bar基因、NPTII基因等植物转基因成分的植物材料的RPA等温扩增引物和反应体系，以及对应扩增区段Cas12a酶高效检测位点和反应体系，RPA等温扩增引物和高效检测位点序列信息分别具有序列表1和表2中所示的核苷酸序列。
表1：目标基因等温扩增引物
表2：目标基因LbCas12a crRNA-Target引导及折叠序列，加粗的为引导序列。
具体的反应方法如下：
1、碱裂解法提取质粒，CTAB法提取植物DNA。
2、在CaMV 35S启动子、HPT、Bar基因、NPTII等基因目标检测位点前后设计RPA等温扩增引物，引物对见表一。
RPA方法(TwisAmpTM Basic Kit TwistDx试剂盒)：
(1)在1.5ml离心管中加入
(2)混匀，瞬时离心；
(3)将混合液加入到TwistAmp Basic reaction，混匀
(4)加入2.5μl的280mM MgOAc，混匀
(5)39℃，20min
(6)-20℃保存，用于下一步试验
3、酶检测反应体系【EnGen Lba Cas12a(Cpf1)(BioLabs)酶反应体系】：
在20μl离心管中加入
其中，针对酶标仪检测、定量PCR仪检测以及试纸条检测反应体系的区别在于反应标记物的选择及标记方法的不同，下文详述。
4、检测方法和结果分析
(1)酶标仪检测
采用多功能微孔板检测仪Synergy H1生产厂家BioTek Instruments,Inc.，37℃温浴反应1小时，每5min测量一次荧光值。
检测统计方法：以各反应0min时荧光值为比值，计取每隔5min反应的荧光值比值，反应设计3个重复，Excel软件绘制检测反应曲线，DPS数据分析系统Duncan新复极差法分析差异显著性。
其中，反应标记物选自S2或S4，标记方法：两端分别带有FAM和BHQ1基团的含TAT碱基序列单链DNA分子，S2为5`6-FAM-TTAT-3`BHQ1，S4为56-FAM-TAT-3`BHQ1。
(2)试纸条检测
试纸条检测反应体系，37℃温浴5、15、30min后，取5μl反应液用100μl纯净水稀释进行试纸条显色(舜丰基因编辑公司产品)，3min后观察试纸条显色情况。
其中，反应标记物选自S3，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6-FAM-TAT-Biotin-3。
(3)定量PCR仪检测
荧光PCR仪器使用ABI QuantStudio6 FAM通道，每隔1分钟取一次荧光。其中，反应标记物选自S5，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6-FAM-TTATT-3`BHQ1。
二、酶标仪检测方法
1、反应标记物的选择
本实施例中，通过不同报告序列以及不同标记方法S2和S4验证其对酶标仪检测效率的影响。
以潮霉素阳性水稻DNA扩增产物为检测对象，潮霉素的2个不同剪切位点(HPT1，HPT2)与2种报告反应标记物(S2，S4)组成4个检测反应组合，分别是：HPT1+S2，HPT1+S4，HPT2+S2，HPT2+S4，从检测结果可知(图1)，在Cas12a fluorescence detection system下，不同检测报告序列标记方法对检测反应强度有较大的影响，S4标记方法优于S2标记方法，特别对高效剪切位点，S4的标记方法具有极显著的优势。
图1中，由上至下的四条曲线分别代表如下组合的均值结果：HPT2+S4阳性、HPT1+S4阳性、HPT1+S2阳性及HPT2+S2阳性；下方的四条曲线代表HPT2+S4阴性、HPT1+S4阴性、HPT1+S2阴性及HPT2+S2阴性均值结果。
差异显著性分析5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min时，不同组合阳性检测反应的强弱。分析结果显示(图2、表3)，反应5min后，S4标记物的反应(HPT1+S4，HPT2+S4)已极显著高于S2(HPT1+S2，HPT2+S2)的反应，针对S4的反应，HPT2切点的反应极显著高于HPT1切点，针对S2的反应，HPT1和HPT2切点差异不显著；反应10min时，HPT2+S4反应显著高于HPT1+S4，极显著高于HPT1+S2和HPT2+S2，HPT1+S2和HPT2+S2差异不显著，HPT1+S4和HPT2+S2差异不显著；反应15和20min时，HPT2+S4反应都极显著高于其它反应，HPT1+S4极显著高于HPT1+S2，HPT1+S2和HPT2+S2差异不显著；反应25min后，HPT2+S4反应都极显著高于其它反应，HPT1+S4、HPT1+S2和HPT2+S2之间差异不显著。从检测反应整体水平看，HPT2+S4反应检测水平最高，HPT2是比HPT1更高效的检测位点，S4是比S2更高效的检测报告反应标记方法，并且S4在高效剪切位点的检测上有更大的优势。
图2中，各时间点柱状图从左至右分别对应HPT1+S2、HPT1+S4、HPT2+S2、HPT2+S4的实验结果。
因此，下文2-5节，在利用酶标仪编辑检测转基因时，反应体系选择S4检测报告反应标记方法。
表3.Cas12a fluorescence detection system系统检测潮霉素阳性水稻DNA扩增产物，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min时，不同剪切位点(HPT-1和HPT-2)与不同报告序列标记方法(S2和S4)进行组合检测的反应强度差异分析数据。
注：数据采用Duncan新复极差法分析,a,b,c代表反应体系间的显著性差异，A,B,C代表反应体系间的极显著差异。
2、转基因植物CaMV 35S启动子酶标仪编辑检测
以非转基因玉米和番木瓜DNA为阴性对照，以具有CaMV 35S启动子的植物表达载体为阳性对照，以玉米5％阳性DNA、玉米100％阳性DNA、玉米阳性DNA等温扩增、番木瓜5％阳性DNA、番木瓜100％阳性DNA、番木瓜阳性DNA等温扩增产物为检测目标开展检测实验。从检测结果可知，在Cas12a fluorescence detection system下，只有阳性植物表达载体、玉米阳性DNA等温扩增和番木瓜阳性DNA等温扩增产物在检测时间内才能产生可检测的荧光报告反应，水、空白、阴性、玉米5％阳性DNA、玉米100％阳性DNA、番木瓜5％阳性DNA、番木瓜100％阳性DNA，都不能直接引起可检测的荧光报告反应(图3)。其中，5％及100％分别表示检测样品中阳性样品的质量含量，下文亦同。
具体的，图3中，横坐标代表检测时间(min)，纵坐标代表荧光比，上面三条曲线由上至下分别代表番木瓜DNA等温扩增产物、玉米DNA等温扩增产物以及具有CaMV 35S启动子的植物表达载体(即阳性质粒)的检测曲线，剩下七条曲线分别代表玉米5％阳性DNA、玉米100％阳性DNA、番木瓜5％阳性DNA、番木瓜100％阳性DNA、阴性对照、空白对照及水对照，并且，剩下的七条曲线在整个检测周期均未出现检测值。
对能引起检测反应的阳性植物表达载体、玉米阳性DNA等温扩增和番木瓜阳性DNA等温扩增产物在0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min的时候分别进行差异显著性分析，分析结果显示(图4，表4)，反应5min时，三者无显著差异；反应10和15min时番木瓜等温扩增产物依次表现出10％的显著性差异和极显著的差异；反应20min后，等温扩增的产物与质粒相比，都表现出极显著的差异，等温扩增产物反应强于质粒；反应20、25min期间，3个反应表现出极显著差异，反应强弱：番木瓜阳性等温扩增产物>玉米阳性等温扩增产物>阳性植物表达载体；反应30、35、40min时，番木瓜阳性等温扩增产物和玉米阳性等温扩增产物相比，差异显著性下降，依次为5％显著性差异、10％显著性差异、差异不显著；反应40min后，等温扩增产物间反应强弱无显著性差异。
图4中，各时间点柱状图中，从左至右分别对应：阳性植物表达载体、玉米阳性等温扩增产物及番木瓜阳性等温扩增产物。
实验结果表明：碱裂解法提取的质粒能直接引起检测反应，CTAB法提取的植物DNA不能引起检测反应，但植物DNA目标扩增产物能引起检测反应；从总的反应看扩增产物引起的检测反应强度极显著大于质粒的检测反应，扩增产物之间会有一些反应强弱的变化差异，但随着反应时间的延长，反应40分钟后差异就不显著了。
表4.CaMV 35S启动子成分Cas12a fluorescence detection system系统检测5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min时阳性植物表达载体与玉米和番木瓜阳性DNA扩增产物间的反应强度差异分析数据
注：数据采用Duncan新复极差法分析,a,b,c代表反应体系间的显著性差异，A,B,C代表反应体系间的极显著差异。
3、转基因植物Bar基因位点酶标仪编辑检测
以非转基因玉米、大豆和水稻DNA为阴性对照，以具有Bar基因的植物表达载体为阳性对照，以玉米100％阳性DNA、玉米阳性DNA等温扩增、大豆100％阳性DNA、大豆阳性DNA等温扩增产物、水稻100％阳性DNA、水稻阳性DNA等温扩增产物为检测目标开展检测实验。从检测结果可知，在Cas12a fluorescence detection system下，只有阳性植物表达载体，玉米、大豆和水稻阳性DNA等温扩增产物在短时间内才能产生可检测的荧光报告反应，水、空白、阴性、玉米100％阳性DNA、大豆100％阳性DNA、水稻100％阳性DNA，都不能直接引起可检测的荧光报告反应(图5)。
具体的，图5中，横坐标代表检测时间(min)，纵坐标代表荧光比，上面四条曲线由上至下分别代表玉米DNA等温扩增产物、水稻DNA等温扩增产物、大豆DNA等温扩增产物及具有Bar基因的植物表达载体(即阳性质粒)的检测曲线，剩下六条曲线分别代表玉米100％阳性DNA、水稻100％阳性DNA、大豆100％阳性DNA、阴性对照、空白对照及水对照，并且，剩下的四条曲线在整个检测周期均未出现检测值。
对能引起检测反应的阳性植物表达载体、玉米、水稻和大豆阳性DNA等温扩增产物在0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min的时候分别进行差异显著性分析，分析结果显示(图6、表5)，反应50min前4个反应都没有极显著的差异；反应55、60min时只有玉米阳性等温扩增产物与阳性质粒间反应强度差异达到极显著，而水稻和大豆阳性等温扩增产物与质粒间的反应强度差异不显著，等温扩增产物间的反应强度略有差异，但差异不显著(图6)。
图6中，各时间点柱状图中，从左至右分别对应：阳性植物表达载体、玉米阳性等温扩增产物、大豆阳性等温扩增产物及水稻阳性等温扩增产物。
实验结果表明：碱裂解法提取的质粒能直接引起检测反应，CTAB法提取的植物DNA不能引起检测反应，但植物DNA目标扩增产物能引起检测反应；从总的反应看扩增产物引起的检测反应略强于质粒的检测反应，但没有显著和极显著的差异。
表5.Bar基因成分Cas12a fluorescence detection system系统检测5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min时阳性植物表达载体与玉米、大豆、水稻阳性DNA扩增产物间的反应强度差异分析数据
注：数据采用Duncan新复极差法分析,a,b,c代表反应体系间的显著性差异，A,B,C代表反应体系间的极显著差异。
4、转基因植物HPT基因位点酶标仪编辑检测
以非转基因水稻和狗尾草DNA为阴性对照，以具有HPT基因的植物表达载体为阳性对照，以水稻100％阳性DNA、水稻阳性DNA等温扩增产物、狗尾草100％阳性DNA、狗尾草阳性DNA等温扩增产物为检测目标开展检测实验。从检测结果可知，在Cas12a fluorescencedetection system下，只有阳性植物表达载体、水稻阳性DNA等温扩增和狗尾草阳性DNA等温扩增产物在检测时间内才能产生可检测的荧光报告反应，水、空白、阴性、水稻100％阳性DNA、狗尾草100％阳性DNA，都不能直接引起可检测的荧光报告反应(图7)。
具体的，图7中，横坐标代表检测时间(min)，纵坐标代表荧光比，上面三条曲线由上至下分别代表水稻DNA等温扩增产物、狗尾草阳性DNA等温扩增产物、植物表达载体(即阳性质粒)，剩下五条曲线分别代表水稻100％阳性DNA、狗尾草100％阳性DNA、阴性对照、空白对照及水对照，并且，剩下的五条曲线在整个检测周期均未出现检测值。
对能引起检测反应的阳性植物表达载体、水稻阳性DNA等温扩增和狗尾草阳性DNA等温扩增产物在0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min的时候分别进行差异显著性分析，分析结果显示，(图8、表6)，反应5min时，三者就有极显著差异，在检测时间范围内(60min)等温扩增的产物反应强度一直极显著高于阳性质粒，水稻扩增产物在反应20分钟前有极显著高于狗尾草扩增产物，25min后无显著性差异，整个反应强度：水稻等温扩增产物>狗尾草等温扩增产物>阳性植物表达载体。
图8中，各时间点柱状图中，从左至右分别对应：阳性植物表达载体、狗尾草阳性等温扩增产物及水稻阳性等温扩增产物。
实验结果表明：碱裂解法提取的质粒能直接引起检测反应，CTAB法提取的植物DNA不能引起检测反应，但植物DNA目标扩增产物能引起检测反应；从总的反应看扩增产物引起的检测反应强度极显著大于质粒的检测反应，扩增产物之间会有一些反应强弱的变化差异，但随着反应时间的延长，反应20分钟后差异就不显著了。
表6.HPT基因成分Cas12a fluorescence detection system系统检测5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min时阳性植物表达载体与水稻、狗尾草阳性DNA扩增产物间的反应强度差异分析数据(HPT2切点)
注：数据采用Duncan新复极差法分析,a,b,c代表反应体系间的显著性差异，A,B,C代表反应体系间的极显著差异。
5、转基因植物NPTII基因位点酶标仪编辑检测
以非转基因玉米和番木瓜DNA为阴性对照，以具有NPTII基因的植物表达载体为阳性对照，以玉米100％阳性DNA、玉米阳性DNA等温扩增产物、番木瓜100％阳性DNA、番木瓜阳性DNA等温扩增产物为检测目标开展检测实验。从检测结果可知，在Cas12a fluorescencedetection system下，只有阳性植物表达载体、玉米阳性DNA等温扩增和番木瓜阳性DNA等温扩增产物在检测时间内才能产生可检测的荧光报告反应，水、空白、阴性、玉米100％阳性DNA、番木瓜100％阳性DNA，都不能直接引起可检测的荧光报告反应(图9)。
具体的，图9中，横坐标代表检测时间(min)，纵坐标代表荧光比，上面三条曲线由上至下分别代表玉米DNA等温扩增产物、番木瓜阳性DNA等温扩增产物、植物表达载体(即阳性质粒)，剩下五条曲线分别代表玉米100％阳性DNA、番木瓜100％阳性DNA、阴性对照、空白对照及水对照，并且，剩下的五条曲线在整个检测周期均未出现检测值。
对能引起检测反应的阳性植物表达载体、玉米阳性DNA等温扩增和番木瓜阳性DNA等温扩增产物在0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min的时候分别进行差异显著性分析，分析结果显示，(图10、表7)三者差异不大，在检测时间范围内(60min)只有50min时玉米和番木瓜阳性扩增产物极显著高于阳性质粒，其它时间三者差异不显著。整个反应强度：玉米等温扩增产物>番木瓜等温扩增产物>阳性植物表达载体。
图10中，各时间点柱状图中，从左至右分别对应：玉米阳性等温扩增产物、番木瓜阳性等温扩增产物及阳性植物表达载体。
实验结果表明：碱裂解法提取的质粒能直接引起检测反应，CTAB法提取的植物DNA不能引起检测反应，但植物DNA目标扩增产物能引起检测反应；从总的反应看扩增产物引起的检测反应强度略高于与质粒的检测反应，但差异不显著，扩增产物之间会有一些反应强弱的变化差异，但随着反应时间的延长，反应差异不显著了。
表7.NPTII基因成分Cas12a fluorescence detection system系统检测5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min时阳性植物表达载体与玉米、番木瓜阳性DNA扩增产物间的反应强度差异分析数据
注：数据采用Duncan新复极差法分析,a,b,c代表反应体系间的显著性差异，A,B,C代表反应体系间的极显著差异。
6、引导和折叠序列修饰对检测反应的影响
由于crRNA和sgRNA都是RNA，在体外稳定性不强，为了提高检测反应的稳定性，研究尝试对检测的crRNA-Target RNA序列进行甲基化和硫代修饰(表8)，实验结果表明：甲基化修饰的复合结构无法正常工作，硫代修饰在初次检测中与不修饰的相比，检测效率无大的差异(图11)。
具体的，图11中，上方的两条曲线代表不修饰的crRNA-Target RNA序列及进行了硫代修饰的crRNA-Target RNA序列，下方的曲线代表经过甲基化修饰的crRNA-Target RNA序列。
表8.Cas12a fluorescence detection system系统使用硫代修饰或甲基化修饰crRNA-Target序列具体情况
将检测用硫代修饰crRNA-Target RNA与不修饰的crRNA-Target RNA序列，放于4℃保存，1、2、3、5、7、9、11、13、15、17、19、23、30d后分别进行检测，反应时间60min，实验结果表明：1-9d硫代修饰与不修饰的反应强弱无显著性差异，11-30d硫代修饰与不修饰的反应强弱都有显著性差异，并且反应强度都大于非修饰的，说明硫代修饰对提高编辑检测的稳定性有较好的促进作用。
表9.Cas12a fluorescence detection system系统使用硫代修饰sgRNA与不修饰的sgRNA 1、2、3、5、7、9、11、13、15、17、19、23、30d时，检测的反应强度差异分析数据。
注：数据采用Duncan新复极差法分析,a,b,c代表反应体系间的显著性差异，A,B,C代表反应体系间的极显著差异。
三、试纸条显色检测方法
如上文所述，试纸条检测反应体系，37℃温浴5、15、30min后，取5μl反应液用100μl纯净水稀释进行试纸条显色(舜丰基因编辑公司产品)，3min后观察试纸条显色情况。
试纸选自测流免疫层析试纸，在测流免疫层析试纸上依次有上样区、Gold-NP抗FITC抗体区体区、strepavidin条带(即control条带)及抗抗体条带(即检测条带)。反应体系中的S序列经Gold-NP抗FITC抗体区体区与抗体结合，control条带与S序列3端生物素结合显色，阳性样品中被切断的S序列5端FAM继续上行，与抗抗体结合，检测条带显色，阴性样品中的S序列被拦截在control条带，检测条带不显色。
图12中，从左至右分别代表阴性对照，具有CaMV 35S启动子的转基因植物DNA等温扩增产物5分钟、15分钟及30分钟显色情况。
图13中，从左至右分别代表阴性对照，具有Bar基因的转基因植物DNA等温扩增产物5分钟、15分钟及30分钟显色情况。
图14中，从左至右分别代表阴性对照，具有HPT基因的转基因植物DNA等温扩增产物5分钟、15分钟及30分钟显色情况。
图15中，从左至右分别代表阴性对照，具有NPTⅡ基因的转基因植物DNA等温扩增产物5分钟、15分钟及30分钟显色情况。
本发明中，荧光显色所对应样品为DNA等温扩增产物。
四、PCR定量检测方法
如上文所述，荧光PCR仪器使用ABI QuantStudio6 FAM通道，每隔1分钟取一次荧光。
其中，反应标记物选自S5，标记方法：5`6-FAM-TTATT-3`BHQ1。
结果如图16所示：与酶标仪的结果一致，选择的转基因原件的crRNA靶点活性都很高。
从我们的研究结果可知，Cas12a fluorescence detection system编辑系统在体外能成功实现植物DNA的检测，但是常规提取的植物DNA很难直接引起转基因成分的检测反应，需要在检测反应前加上等温扩增或PCR过程。影响检测体系效率的主要因素有：扩增反应体系、酶的稳定性和活性、编辑位点的选择等。不同的编辑位点效率是有较大差异的，建立高效的检测体系，需要设计多个剪切位点，并选择高效的剪切位点建立具体检测反应；检测报告序列标记方法对检测反应也有影响，比如S4(5`6-FAM-TAT-3`BHQ1)标记方法优于S2(5`6-FAM-TATT-3`BHQ1)标记方法，特别对高效剪切位点S4的标记方法具有极显著的优势；引导序列RNA的稳定性也显著影响反应的稳定性，将crRNA-Target RNA序列进行甲基化和硫代修饰，甲基化修饰的复合结构无法正常工作，硫代修饰在初次检测中与不修饰的相比，检测效率无大的差异，但随着crRNA-Target RNA序列在4℃冰箱保存时间的延长，不到2周的时间硫代修饰的反应就显著高于不修饰的检测反应，所以引导序列RNA硫代修饰后能增强检测反应的稳定性和检测能力。本研究为转基因植物的核酸检测提供新的技术和方法，必将推进基因编辑检测技术在植物核酸检测上的应用研究，具有重要的现实意义。
本发明中，所谓的CaMV35S启动子，是指花椰菜花叶病毒35S启动子；所谓的HPT基因，是指潮霉素基因；所谓的Bar基因，是指双丙氨酰磷抗性基因；所谓的NPTⅡ基因，是指新霉素磷酸转移酶基因。
本发明中，所谓的CTAB，是指溴化十六烷基三甲铵。
本发明中，所谓的Primer Free Rehydration buffer，是指RPA无引物再水合缓冲液，为市场上可以直接购置的缓冲液。
本发明中，所谓的TwistAmp Basic reaction，为市售的装有冻干粉的离心管，为本领域技术人员构建等温扩增反应体系的通用物质。
本发明中，所谓的Lba Cas12a，即是指Cas12a内切酶。
本发明中，标记方法“S2、S4、S3及S5”，并无特殊指代，仅为相应标记方法的简称。
虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明，然其并非用以限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行各种变动与修改仍属本发明所保护的范围，因此本发明的保护范围以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国热带农业科学院三亚研究院、山东舜丰生物科技有限公司
<120> 基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因检测方法、反应体系及其应用
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
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<212> RNA
<213> 人工合成
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uaauuucuac uaaguguaga uggcuccaac aauguccuga cgga 44
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<212> RNA
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uaauuucuac uaaguguaga uagcuucgau guaggagggc gugg 44
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<211> 44
<212> RNA
<213> 人工合成
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uaauuucuac uaaguguaga uuggcagcug gacuucagcc ugcc 44
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<211> 44
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<213> 人工合成
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uaauuucuac uaaguguaga ucuuuaucgc aaugauggca uuug 44
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<212> RNA
<213> 人工合成
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<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 14
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Claims (10)
1.基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测反应体系，其特征在于：该反应体系用于植物转基因成分的检测，以体积份数计，每份反应体系各包括如下体积份的各成分：2份10xNE缓冲液2.1、1份1uM引导及折叠序列、1份1uM Lba Cas12a、1份RNA酶抑制剂、1份转基因植物DNA提取物的RPA等温扩增产物、1份反应标记物及13份水。
2.如权利要求1所述的基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测反应体系，其特征在于：该反应体系对应的植物转基因成分为CaMV35S启动子、HPT基因、Bar基因或NPTⅡ基因，其各自对应的引导及折叠序列如下：
其中，加粗的为引导序列。
3.如权利要求1所述的基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测反应体系，其特征在于：该反应体系用于包括但不限于植物转基因成分的酶标仪检测、定量PCR仪检测以及试纸条显色检测。
4.如权利要求3所述的基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测反应体系，其特征在于：
酶标仪检测的反应标记物选自S2或S4，标记方法：两端分别带有FAM和BHQ1基团的含TAT碱基序列单链DNA分子，S2为5`6-FAM-TTAT-3`BHQ1，S4为5`6-FAM-TAT-3`BHQ1；
试纸条检测的反应标记物选自S3，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6-FAM-TAT-Biotin-3`；
定量PCR仪检测的反应标记物选自S5，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6-FAM-TTATT-3`BHQ1。
5.基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1：通过CTAB法提取植物DNA；
步骤S2：制备DNA的RPA等温扩增引物；
步骤S3：构建权利要求1-3中任一项所述的反应体系；
步骤S4：通过包括但不限于酶标仪、定量PCR仪或试纸条显色技术进行植物转基因成分的检测。
6.如权利要求5所述的基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下步骤：
步骤S21：以体积份数计，分别将如下体积份的各成分混合：2.2-2.5份第一引物、2.2-2.5份第二引物、29-20份Primer Free Rehydration buffer、2份步骤S1提取的DNA、11-12份水；
步骤S22：将步骤S21中各成分混匀，瞬时离心；
步骤S23：将所获取的混合液加入到TwistAmp Basic reaction，混匀；
步骤S24：加入2.5份体积份的280mM MgOAc，混匀
步骤S25：38-40摄氏度下反应20分钟；
步骤S26：-20摄氏度下保存备用。
7.如权利要求5所述的基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法，其特征在于：
酶标仪检测的反应标记物选自S2或S4，标记方法：两端分别带有FAM和BHQ1基团的含TAT碱基序列单链DNA分子，S2为5`6-FAM-TTAT-3`BHQ1，S4为5`6-FAM-TAT-3`BHQ1；
试纸条检测的反应标记物选自S3，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6-FAM-TAT-Biotin-3`；
定量PCR仪检测的反应标记物选自S5，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6-FAM-TTATT-3`BHQ1。
8.如权利要求6所述的基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法，其特征在于，该方法用于检测植物转基因成分CaMV35S启动子、HPT基因、Bar基因或NPTⅡ基因，其各自的引物如下：
。
9.如权利要求8所述的基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法，其特征在于，引导及折叠序列经过硫代修饰，硫代修饰情况如下：
10.CRISPR Cas酶基因编辑技术在转基因成分检测上的应用，其特征在于，用于转基因植物CaMV35S启动子、HPT基因、Bar基因或NPTⅡ基因的检测。
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
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| CN109652439A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-04-19 | 宜春学院 | 利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| HUA LIU 等: "RPA-Cas12a-FS: A frontline nucleic acid rapid detection system for food safety based on CRISPR-Cas12a combined with recombinase polymerase amplification", 《FOOD CHEMISTRY》 * |
| HUI WU 等: "Contamination-free visual detection of CaMV35S promoter amplicon using CRISPR/Cas12a coupled with a designed reaction vessel: rapid, specific and sensitive", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 * |
| SHI-YUAN LI 等: "CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection", 《CELL DISCOVERY》 * |
| YUN-MU ZHANG 等: "Evaluation of CRISPR/Cas12a-based DNA detection for fast pathogen diagnosis and GMO test in rice", 《MOL BREEDING》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115087750A (zh) * | 2022-03-30 | 2022-09-20 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 基于全基因组分析的真核生物物种鉴定方法及应用 |
| CN116162688A (zh) * | 2022-09-09 | 2023-05-26 | 浙江大学 | 一种检测多种转基因标记的rpa引物组和可视化检测体系及检测方法 |
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