CN105936942A - 一种lgr4基因检测试剂盒 - Google Patents

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张翼飞
张志国
姚霜霜
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Abstract

本发明涉及一种LGR4基因检测试剂盒，所述试剂盒含有m36b4、mPEPCK、mG6pase、mHNF4a、mChREBP、mSREBP1c、mFAS、mSCD1和mLGR4的引物对。本发明检测灵敏度高，经过本发明试剂盒的检测，得到肝脏糖代谢的关键基因表达以及相关通路的验证，为临床上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。

Description

一种LGR4基因检测试剂盒
技术领域
本发明属于2型糖尿病领域，特别涉及一种LGR4基因检测试剂盒。
背景技术
近年来，由于肥胖、不健康的饮食和生活方式以及人口老龄化等原因，世界各国糖尿病的发病率急剧增加，死亡率仅次于癌症和心血管疾病，成为威胁人类健康的第三大类疾病。根据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation,IDF)的最新数据显示，2014年全世界糖尿病患者已经达到3.8亿；预计到2035年，全球糖尿病患者将达到5.9亿，这其中，90％-95％是2型糖尿病患者。在我国，糖尿病发病率也日益增高，而且发病人群有年轻化的趋势。2型糖尿病已成为严重威胁人类生命健康和生活质量的重要疾病之一。
肝脏的胰岛素抵抗是导致2型糖尿病的一个重要推动因素，尤其是肝脏的脂肪异位沉积、内质网应激以及炎症都可能使肝脏发生胰岛素抵抗，进而影响全身的胰岛素敏感性。有报道给予小鼠或大鼠3天的高脂饮食，在未出现肥胖等全身代谢紊乱的症状之前，即可诱导出肝脏的胰岛素抵抗，而且肝脏发生胰岛素抵抗之后，会通过肝-脂肪、肝-骨骼肌的组织对话来影响外周组织的胰岛素敏感性，进而加剧全身的胰岛素抵抗，多项研究表明改善肝脏的胰岛素抵抗则可以改善这种状况。
LGRs(Leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled Receptors)，是一类特别的G蛋白偶联受体家族，是因为其拥有特别大的胞外结构域来识别配体。LGR4又称GPR48，LGR4基因位于染色体11p13-14区段，全长约106kb，含18个外显子，编码951氨基酸，其中胞外548个氨基酸残基，富含亮氨酸，有5个糖基化位点，又属于糖蛋白激素受体。近年来，LGR4得到越来越多的重视和研究，LGR4在肿瘤发生、干细胞及组织发育过程中的作用已开始被逐渐研究和揭示。遗憾的是，目前很少有研究组对LGR4在营养、代谢等方面的功能进行研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种LGR4基因检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高，经过本发明试剂盒的检测，得到肝脏糖代谢的关键基因表达以及相关通路的验证，为临床上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。
本发明的一种LGR4基因检测试剂盒，所述试剂盒含有下列引物对：
所述试剂盒还包括DNA提取试剂、ROX染料和PCR缓冲液。
所述试剂盒的PCR反应条件为：95℃15s，95℃15s，60℃30s，共40个循环；95℃5min。
所述试剂盒的PCR反应结束后1.5％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察并确认条带位置。
抽提组织总RNA后先进行逆转录再使用试剂盒。
有益效果
本发明检测灵敏度高，经过本发明试剂盒的检测，得到肝脏糖代谢的关键基因表达以及相关通路的验证，为临床上患者的个体化治疗、预后判断和预防干预提供便利。
附图说明
图1(a)为给予腹腔注射葡萄糖后，小鼠血糖浓度变化；(b)为肝脏中糖异生相关基因的表达；
图2(a)为小鼠肝脏甘油三酯含量；(b)为肝脏组织透射电镜；(c)为肝脏中脂质合成相关基因的表达；
图3(a)为体内营养水平波动时，肝脏内LGR4表达；(b)、(c)、(d)为不同代谢紊乱动物模型中，肝脏LGR4表达；
实验数据用均数±标准误表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.组织总RNA抽提
(1)组织匀浆：每份肝脏约取20-30mg加入1mLTRIZOL试剂裂解。在冰浴条件下用匀浆仪匀浆，将样品转移至1.5mL离心管，室温放置5min。
(2)液相分离：在RNA提取专用通风橱内操作，按0.2mL/mL Trizol的比例加入氯仿，剧烈振荡混匀后放置于室温2-3min，然后以12000g的转速4℃离心15min。
(3)RNA沉淀：小心转移上层水相至新的1.5mL离心管，按照1：1的比例加入异丙醇，放置于室温10min后，12000g，4℃，离心15min。
(4)RNA漂洗：离心后管底出现白色沉淀，去上清，以75％乙醇(DEPC水配置)漂洗RNA沉淀，7500g，4℃，离心5min。
(5)RNA重溶：去除乙醇后，干燥5-10min，将RNA重新溶解于RNase-free的DEPC去离子水中。
(6)检测RNA纯度及RNA定量：取1μL样品检测A260和A260/A280。
2.逆转录反应
(1)按照测定的RNA浓度，计算后取一定体积RNA，使RNA总量达到1000ng，再加入DEPC水将总体积补至10μL，70℃预变性10min。
(2)按照下表配制反应体系
定量后的RNA(1000ng) 10μL
dNTP 2μL
10x buffer 2μL
MgCl2 4μL
Oligo(dT) 1μL
RNAsin(40U/μl) 0.5μL
AMV(25U/μl) 0.5μL
(3)将上述混合液按照42℃60min，95℃5min的程序逆转录成cDNA。cDNA放置于-20℃保存。
3.Real time PCR
反应体系如下：
样本cDNA 2μL
2X SYBR Green Buffer(Takara公司) 10μL
引物(上下游引物按照1：1混合) 0.8μL
ROX染料 0.4μL
ddH2O 6.8μL
将上述体系加入96孔PCR板中，然后放入ABI 7300荧光定量PCR仪中开始荧光定量。
反应条件为：
95℃ 15s
95℃ 15s
60℃ 30s
循环数 40个
95℃ 5min
所有引物序列如下，引物均根据NCBI提供序列设计，并由sangon上海公司合成：
4.结果
(1)全身性敲除LGR4改善小鼠的胰岛素抵抗，抑制肝脏糖异生。
通过实验发现，不论是在正常饮食条件下，还是给予高脂喂养，与野生型小鼠相比，全身LGR4KO小鼠与肝脏糖代谢相关的指标都得到显著改善：腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT)显示其胰岛素抵抗状况得到改善(图1a)，对LGR4KO小鼠肝脏进行分子生物学初步分析的结果显示，与野生型小鼠相比，LGR4KO小鼠的肝脏中PEPCK、G6pase、HNF4a等糖异生相关基因受到显著抑制(图1b)。
(2)全身敲除LGR4减少小鼠肝脏脂质沉积，抑制肝脏脂质合成的基因表达。
通过对LGR4KO小鼠与野生型小鼠肝脏组织甘油三酯含量的测定，发现无论是正常饮食还是高脂喂养情况下，LGR4KO小鼠肝脏内TG含量都显著低于野生型小鼠(图2a)，说明其肝脏脂质沉积减少，透射电镜结果也显示肝细胞内线粒体增多，脂滴变少(图2b)。Realtime PCR结果也显示，与野生型小鼠相比，LGR4KO小鼠的肝脏中ChREBP、SREBP1c、FAS、SCD1等脂质合成相关基因的表达受到显著抑制(图2c)。
(3)机体营养水平及代谢紊乱状况对肝脏LGR4的影响。
在分析上述结果的同时，综合LGR4KO小鼠的各代谢指标，认为LGR4在肝脏的糖脂代谢过程中可能发挥了重要的生物学作用。
进一步分析了体内营养水平充足或缺乏时LGR4在肝脏中的表达情况，发现正常喂食的老鼠经过长时间禁食(Fasting)以及禁食后再进食6小时(Refed)后，LGR4在肝脏中的表达发生了非常剧烈的变化(图3a)，这一结果表明LGR4的表达变化与体内的营养水平的波动存在某种程度的一致性。
其次，利用了几种经典的胰岛素抵抗和2型糖尿病的动物模型分析了LGR4在肝脏组织中的表达情况。不论是高脂饮食诱导的肥胖小鼠，还是在遗传性肥胖的db/db、ob/ob小鼠中，与对照组或野生型相比，LGR4在肝脏中的表达水平都是显著升高的(图3b，c，d)。
本实施例发现，全身敲除LGR4能改善肝脏胰岛素抵抗引起的一系列代谢紊乱的症状：LGR4KO小鼠胰岛素敏感性增加，肝糖异生减少；肝脏脂肪沉积减少，脂质合成相关的基因表达下调。这种改善在高脂喂养引起的代谢紊乱的小鼠模型中表现得尤为明显。这些发现都提示LGR4可能在肝脏的糖脂代谢中起到重要的调控作用，而肝脏是机体营养物质代谢的重要器官。此外，对于代谢紊乱的动物模型肝脏中LGR4表达的分析，也证实了机体代谢状态可能影响肝脏内LGR4的表达。

Claims (5)

1.一种LGR4基因检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有下列引物对：
m36b4 F:5'-AAGCGCGTCCTGGCATTGTCT-3'；
R:5'-CCGCAGGGGCAGCAGTGGT-3'；
mPEPCK F:5'-ATGAAAGGCCGCACCATGTA-3'；
R:5'-GCACAGATATGCCCATCCGA-3'；
mG6pase F:5'-GCTGGAGTCTTGTCAGGCAT-3'；
R:5'-ATCCAAGCGCGAAACCAAAC-3'；
mHNF4a F:5'-ATGCGACTCTCTAAAACCCTTG-3'；
R:5'-ACCTTCAGATGGGGACGTGT-3'；
mChREBP F:5'-AGATGGAGAACCGACGTATCA-3'；
R:5'-ACTGAGCGTGCTGACAAGTC-3'；
mSREBP1c F:5'-CGGAAGCTGTCGGGGTAG-3'；
R:5'-GGGAAGTCACTGTCTTGGTTG-3'；
mFAS F:5'-AGAGATCCCGAGACGCTTCT-3'；
R:5'-GCCTGGTAGGCATTCTGTAGT-3'；
mSCD1 F:5'-TTCTTGCGATACACTCTGGTGC-3'；
R:5'-CGGGATTGAATGTTCTTGTCGT-3'；
mLGR4 F:5'-TTGTGGGTAACTTCCAGCTGA-3'；
R:5'-GTGGCATTTGCTGCATCTGTA-3'。
2.根据权利要求1所述的一种LGR4基因检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括DNA提取试剂、ROX染料和PCR缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种LGR4基因检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的PCR反应条件为：95℃15s，95℃15s，60℃30s，共40个循环；95℃5min。
4.根据权利要求3所述的一种LGR4基因检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的PCR反应结束后1.5％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察并确认条带位置。
5.根据权利要求1所述的一种LGR4基因检测试剂盒，其特征在于：抽提组织总RNA后先进行逆转录再使用试剂盒。
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