CN110669838A - Lgr4作为奶牛乳腺炎预防、诊断或治疗标志物的应用 - Google Patents
Lgr4作为奶牛乳腺炎预防、诊断或治疗标志物的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110669838A CN110669838A CN201911006567.9A CN201911006567A CN110669838A CN 110669838 A CN110669838 A CN 110669838A CN 201911006567 A CN201911006567 A CN 201911006567A CN 110669838 A CN110669838 A CN 110669838A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mastitis
- lgr4
- methylation
- gene
- cow
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本公开属于奶牛乳腺炎标志物技术领域,具体涉及LGR4作为奶牛乳腺炎预防、诊断或治疗标志物的应用。本公开以半同胞健康和大肠杆菌乳腺炎奶牛为模型,对血液嗜中性粒细胞进行DNA甲基化和RNA‑seq测序,整合分析转录组和甲基化数据,筛选出奶牛嗜中性粒细胞中的关键基因LGR4。通过亚硫酸盐测序法、克隆测序法和实时荧光定量PCR实验等方法检测关键基因LGR4在血液嗜中性粒细胞中外显子区域的甲基化水平、可变剪接体和基因的表达情况,鉴定出调控LGR4基因可变剪接模式的DNA甲基化分子标记,揭示了基因外显子区DNA甲基化在奶牛乳腺炎中发挥调控作用的分子机制,为奶牛乳腺炎的抗病分子育种提供新证据。
Description
技术领域
本公开属于奶牛乳腺炎标志物技术领域,具体涉及LGR4作为奶牛乳腺炎预防、诊断或治疗标志物的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
乳腺炎是严重威胁奶牛业的一种多发疾病,造成经济损失巨大。造成乳腺炎的主要因素之一是外界病原菌的入侵,其中环境型致病菌大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli),是引起奶牛泌乳早期急性临床乳腺炎发生的最常见病因。大肠杆菌感染后,易引起奶牛发生严重的全身临床症状,如败血症,严重时导致奶牛死亡。大肠杆菌等病原菌侵染乳腺,会刺激机体产生炎症反应。嗜中性粒细胞是炎症反应的效应细胞,属于机体的第一道防御屏障。乳腺发生感染后,嗜中性粒细胞在细胞因子的诱导下向炎症部位聚集,在到达感染部位后吞噬杀灭细菌。
在机体响应乳腺炎症反应过程中,会分泌相应的细胞因子,引起基因的表达调控发生变化。DNA甲基化在炎症的发生、发展过程中发挥调控作用,并且与疾病易感性密切相关。人类不同个体嗜中性粒细胞的DNA甲基化模式存在差异,其差异可改变个体对疾病的易感性。奶牛中免疫相关基因启动子甲基化水平在健康和乳腺炎牛中存在差异。Song等(2016)研究也发现在金黄色葡萄球菌感染乳腺后,会引起乳腺炎牛血液淋巴细胞DNA甲基化模式发生变化,从而影响了基因的表达调控。甲基化、转录组整合分析,是一个系统性双层次联合研究甲基化调控基因表达分子机制的方法。采用甲基化测序得到甲基化位点,同时与mRNA表达谱结合找到关键的调控基因表达的甲基化位点;通过甲基化与基因的调控关系,探讨甲基化参与各种复杂事件的机制。
可变剪接是一种进化上保守的机制,可从单个基因产生多种剪接产物来提高转录组和蛋白质组的多样性。新出现的证据表明DNA甲基化可调节可变剪接,大约22%的可变剪接外显子受DNA甲基化调控。外显子区域的DNA甲基化,通过影响RNA聚合酶的延伸速率或招募剪接因子调控基因的表达水平和可变外显子的包含水平。DNA甲基化作为可变剪接外显子的“微调”机制发挥作用。
发明内容
基于上述研究背景,本公开针对健康奶牛和大肠杆菌感染引起的乳腺炎奶牛血液嗜中性粒细胞进行简化甲基化测序(RRBS)及转录组测序(RNA-seq),探讨DNA甲基化在奶牛乳腺炎感染过程中发挥作用的分子机制。为尽可能地减少遗传因素和不同年龄、不同场次等环境因素对DNA甲基化所造成的影响,本公开以半同胞健康和大肠杆菌乳腺炎奶牛为模型,利用RRBS及转录组测序技术进行甲基化和转录组测序,对这些样品的转录组和甲基化数据进行分析,筛选出奶牛嗜中性粒细胞中的关键基因;通过亚硫酸盐测序法、克隆测序法和实时荧光定量PCR实验等检测关键基因LGR4在血液嗜中性粒细胞中外显子区域的甲基化水平、可变剪接体和基因的表达情况,筛选出调控LGR4基因可变剪接模式的甲基化分子标记,揭示基因外显子区DNA甲基化在大肠杆菌奶牛乳腺炎中发挥作用的分子机制,为奶牛乳腺炎的育种和治疗提供新的靶点。
基于上述研究结果,本公开提供以下技术方案:
本公开第一方面,提供LGR4基因作为奶牛乳腺炎预防/诊断/治疗标志物的应用。
优选的,所述LGR4基因为LGR4外显子5。
本公开通过筛选鉴定出LGR4基因为大肠杆菌乳腺炎牛血液嗜中性粒细胞中的关键基因;在已知DNA甲基化水平与炎症相关的前提下,本领域内通常针对关键基因的启动子甲基化水平进行研究,而本公开通过简便可靠的筛选方法确定了LGR4基因外显子区域的甲基化水平与乳腺炎相关,并进一步确定了所述甲基化水平差异通过可变剪接模式实现,为LGR4作为预防/诊断/治疗标志物的应用提供了较为详细的机制研究和可靠的依据。
本公开第二方面,提供LGR4检测试剂在制备预防/治疗/诊断奶牛乳腺炎制剂中的应用。
优选的,所述LGR4检测试剂为LGR4甲基化水平检测试剂。
进一步优选的,所述LGR4甲基化水平为LGR4基因外显子5区域CpG岛的甲基化水平。
更为优选的,所述甲基化位点为chr15:58890531bp-58891275bp。
优选的,所述LGR4来自奶牛血液嗜中性粒细胞。
优选的,所述乳腺炎为革兰氏阴性菌引发的乳腺炎;更优选的,为大肠杆菌引发的乳腺炎。
本公开第三方面,提供一种奶牛乳腺炎诊断试剂盒,所述试剂盒中包括LGR4检测试剂。
本公开第四方面,提供一种奶牛乳腺炎诊断方法,通过检测奶牛血液嗜中性粒细胞中LGR4基因外显子5区域的甲基化水平。
优选的,所述检测通过亚硫酸盐测序、克隆测序法或实时荧光定量PCR方法进行。
优选的,所述甲基化率高于20%,判定为健康牛样品,所述甲基化率低于15%判定为大肠杆菌乳腺炎牛样品。
本公开第五方面,提供一种奶牛育种方法,所述育种方法包括采用第四方面所述判断是否是大肠杆菌乳腺炎牛样品从而筛选高乳腺炎抗性牛。
与现有技术相比,本公开的有益效果是:
1.本公开通过对健康和大肠杆菌感染引起的乳腺炎奶牛血液嗜中性粒细胞进行高通量测序,筛选出健康组和乳腺炎组中的差异甲基化基因以及差异表达基因。表明LGR4基因外显子5区的甲基化可通过调控基因的可变剪接模式,从而在大肠杆菌乳腺炎中发挥调控作用,为奶牛乳腺炎的预防/诊断/治疗提供了可靠的靶点。
2.本公开检测方法设计合理,可以筛选出奶牛嗜中性粒细胞中影响基因可变剪接模式的DNA甲基化分子标记,并且揭示了基因外显子区DNA甲基化在奶牛乳腺炎中发挥调控作用的分子机制。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解,本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开,并不构成对本公开的不当限定。
图1:实施例1中健康和乳腺炎牛嗜中性粒细胞差异甲基化基因的蛋白互作网络分析。
图2:实施例1中健康和乳腺炎牛嗜中性粒细胞甲基化和转录组数据中的共有基因。
图3:实施例2中CpG岛预测结果显示LGR4基因外显子5差异甲基化区域存在一个CpG岛。
图4:实施例2中LGR4基因在健康和乳腺炎牛血液嗜中性粒细胞中的外显子5区域的甲基化水平。
图5:实施例2中LGR4基因可变剪接体(LGR4-reference和LGR4-TV)结构示意图。
图6:实施例2中LGR4-reference和LGR4-TV转录本在健康和乳腺炎牛嗜中性粒细胞中的表达分析。
图7:实施例2中LGR4基因在健康和乳腺炎牛血液嗜中性粒细胞中的相对外显子包含水平。
注:包含外显子的量除以缺失外显子的量得出相对外显子包含水平。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的,乳腺炎是一种严重威胁奶牛业的疾病,其中大肠杆菌是引发早期急性临床乳腺炎的常见病因。现有技术中相关研究表明DNA甲基化在炎症的发生、发展过程中具有调控作用。本公开简化甲基化测序及转录组测序确定了关键基因LGR4在血液嗜中性粒细胞中外显子区域的甲基化水平与在健康组与乳腺炎组具有显著的区别,启示了LGR4可作为奶牛乳腺炎检测标志物的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案,以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1:大肠杆菌乳腺炎奶牛血液嗜中性粒细胞中关键甲基化基因的筛选
1.半同胞实验牛的选择及样品的采集
根据济南某奶牛场的系谱记录,挑选出年龄相近的半同胞中国荷斯坦奶牛52头。基于这些奶牛的体细胞数记录、血液学分析和细菌学鉴定结果,从52头候选奶牛中选择出3头健康奶牛和3头大肠杆菌感染的乳腺炎奶牛作为研究对象。
2.血液嗜中性粒细胞中DNA和RNA的提取
使用牛外周血中性粒细胞分离试剂盒分离血液嗜中性粒细胞。通过细胞DNA提取试剂盒和RNA提取试剂盒从健康和大肠杆菌感染引起的乳腺炎奶牛血液嗜中性粒细胞中分离基因组DNA和总RNA。
3.简化甲基化测序分析
构建6个DNA文库,即健康牛(HC1,HC2,HC3)和大肠杆菌乳腺炎牛(MC1,MC2,MC3)DNA文库。选择富含CpG的DNA片段(40-220bp),进行亚硫酸氢盐转化,以将任何未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。使用Agilent 2100生物分析仪分析文库,通过实时PCR定量并在Illumina HiSeq4000测序仪上测序。甲基化数据分析,使用Bismark软件对reads进行转变,统计甲基化胞嘧啶在牛的29条常染色体和1条X染色体上的分布。根据分布情况,绘制全基因组甲基化图谱,直观的展现染色体某区域甲基化水平。使用methylkit软件包、edmr软件检测健康和大肠杆菌感染引起的奶牛血液嗜中性粒细胞两组之间差异甲基化位点和区域。对筛选到的健康和乳腺炎组奶牛血液嗜中性粒细胞中的差异甲基化基因,通过GO和KEGG富集途径分析鉴定这些基因的重要生物学功能和途径。
根据基因组比对结果,统计了6个样品中牛的29条常染色体和1条X染色体的甲基化分布情况。共检测到494个差异甲基化区域,其中61个DMRs甲基化水平乳腺炎组高于健康组,433个DMRs区域甲基化水平乳腺炎组低于健康组。这说明在大肠杆菌感染后,奶牛血液嗜中性粒细胞DNA甲基化水平降低。为分析差异甲基化基因之间的互作关系,本实施例通过STRING软件,对GO分析中富集到参与免疫、炎症和防御反应的52个基因进行蛋白互作网络分析,发现14个基因之间存在互作(图1),其中有LGR4基因。LGR4基因是TLR2/4相关免疫反应的负调节因子,通过靶向CD14表达在先天免疫反应中发挥重要作用。
4.RNA-seq测序分析
构建健康牛和乳腺炎牛6个样品的cDNA文库,Illumina HiSeq2500平台对构建的文库进行测序。转录组数据初步分析,采用Trinity软件进行转录组拼接,将拼接的Unigene与数据库做BLAST比对。差异表达基因的鉴定,使用RPKM方法计算基因的表达水平,以鉴定健康的HC组和乳腺炎MC组之间的差异表达基因。根据GO和KEGG蛋白质数据库对组装的差异表达基因的潜在功能进行预测和注释。基因可变剪接分析,使用SOAPsplice软件和RNA-Seq数据来检测剪接点并识别基因的潜在可变剪接模式。
使用cufflinks软件对健康组和大肠杆菌感染的乳腺炎组样品中的基因做差异表达分析。在本研究中,共检测到1339个差异表达基因,其中1094个基因在乳腺炎组中的表达水平高于在健康组中的表达水平,245个基因在乳腺炎组中的表达水平低于在健康组中的表达水平。本研究中,发明人检测到829个差异表达基因存在可变剪接事件,其中109个基因可变剪接现象是健康牛特异性的,125个基因可变剪接现象是乳腺炎牛特异性的,并且LGR4基因外显子5区域存在可变3'剪接模式。
5.甲基化和转录组数据联合分析
联合分析甲基化和转录组数据,本实施例鉴定了两组中共有的差异甲基化基因和差异表达基因。在RNA-seq测序中共发现1339个差异表达基因,在RRBS测序中发现356个差异甲基化基因,其中在RNA-seq和RRBS测序中筛选到29个共有基因(图2)。在这些基因中,11个基因外显子区域存在差异甲基化,其中包括LGR4基因。
实施例2:影响关键基因LGR4可变剪接模式的DNA甲基化分子标记的检测
1.LGR4基因在嗜中性粒细胞中外显子5甲基化水平检测
CpG岛预测结果显示LGR4基因外显子5差异甲基化区域存在一个CpG岛(图3)。根据LGR4基因差异甲基化区域的序列(具体位置信息分别是chr15:58890531bp-58891275bp),使用Methyl Primer Express软件v1.0,设计两对巢式PCR引物:
(LGR4-out F:TTGTGGTTATGGTTATTTTTGTAAT,
R:AATACCAAAATCAACRCCTAC;
LGR4-in F:TGTGGTTATGGTTATTTTTGTAAT,
R:AAATCAACRCCTACAAAAT)。
巢式PCR反应体系为:5μL 2×GC缓冲液(5mM Mg2+Plus),1.6μL 2.5mM dNTP混合物,0.1μL LA Taq(5U/μL),0.5μL上下游引物(10mM)和0.5μL模板DNA,总体积为10μL。PCR程序采用降落PCR,第一步如下进行:(1)94℃变性5min,(2)15个热循环,包括94℃变性30s;从60℃(Tm+10℃)开始退火30s,并每循环减少1℃;72℃延伸30s。(3)30个热循环,包括94℃变性30s,45℃(Tm-5℃)退火30s,72℃延伸30s,每循环增加1℃。(4)72℃延伸10min,4℃保存。将第一步的PCR产物用作巢式PCR反应第二步的模板,用设计的内侧引物进行第二轮PCR。将第二轮的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测、回收纯化、克隆到pEASY-T3载体,并转化到感受态细胞Trans5α中,进行克隆测序。参考LGR4基因序列,利用BiQ Analyzer软件对测序结果进行分析,比较样品的甲基化情况。
LGR4基因外显子5CpG岛区域在健康组样品的平均甲基化水平为23.33%,其中HC1甲基化率为HC1-20%,HC2-24%,HC3-26%。在乳腺炎牛组样品的平均甲基化水平为12.67%,其中MC1-12%,MC2-14%,MC3-12%。健康组LGR4基因甲基化水平显著高于乳腺炎组(P<0.05,图4)。依据该统计学结果,当待测奶牛的嗜中性粒细胞中LGR4基因外显子5区域的甲基化水平在20%以上时,视为未患乳腺炎的健康奶牛,甲基化水平低于15%时,视为患有大肠杆菌乳腺炎的奶牛。
2.LGR4基因外显子5可变剪接体的鉴定及表达分析
LGR4基因位于染色体15上,测序数据显示这个基因DMR区域包含外显子5,基因外显子甲基化水平乳腺炎组低于健康组,转录组数据还显示这个基因存在可变3'剪接事件。为此,本实施例根据牛LGR4基因mRNA序列(GenBank,NM_001205511.1),设计引物LGR4-cDNA(LGR4-cDNA F:CTGTAGCTGCGACGGAGA,R:ATCCGGAACTGTCTGAGGTG)以扩增LGR4基因的整个编码区。将目的条带切胶回收后,与载体连接、转化、克隆和测序,测序结果与牛LGR4基因mRNA序列进行比对,比对结果显示在奶牛血液嗜中性粒细胞中发现了一种新的转录本,命名为LGR4-TV。LGR4基因参考转录本命名为LGR4-reference。新转录本LGR4-TV的可变剪接类型属于可变3'剪接模式,缺失了139bp的部分外显子5序列,因此,LGR4基因的外显子5被认为是可变剪接的外显子(图5)。
利用荧光定量PCR技术,将LGR4基因参考转录本LGR4-reference(LGR4-referenceF:GAGGGACTCACTCAGTTGCG,R:AAGTCAGGGATGCTGGAGAT)和鉴定到的可变剪接转录本LGR4-TV(LGR4-TV F:AGACCGTCGGGTGGACTGCT,R:GGTCGTTGCCAGCCAATCGT),在健康和乳腺炎牛血液嗜中性粒细胞中进行荧光定量表达分析。荧光定量PCR结果显示LGR4-reference和LGR4-TV两种转录本,在正常和乳腺炎牛的血液嗜中性粒细胞中均有表达。两种转录本LGR4-reference和LGR4-TV在健康牛血液嗜中性粒细胞中的表达水平显著高于在乳腺炎牛血液嗜中性粒细胞中的表达水平(图6)
3.LGR4基因在嗜中性粒细胞中的相对外显子包含水平分析
在本实施例中,发明人发现乳腺炎牛中发生外显子5缺失现象的比例略高于健康牛。通过计算LGR4基因外显子5的包含水平,健康牛外显子相对包含水平为0.92±0.04,乳腺炎牛相对外显子包含水平为0.72±0.02,健康牛显著高于乳腺炎牛(图7)。有研究报道DNA甲基化修饰在外显子识别及可变剪接调控方面发挥重要作用,通过影响可变剪接外显子的识别来影响前体mRNA的剪接。在两组样品中LGR4基因外显子5的甲基化水平存在差异,相对外显子包含水平也存在差异。所以LGR4基因外显子5的DNA甲基化调控其外显子5的可变剪接。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已,并不用于限制本公开,对于本领域的技术人员来说,本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本公开的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院奶牛研究中心 山东奥克斯畜牧种业有限公司
<120> LGR4作为奶牛乳腺炎预防、诊断或治疗标志物的应用
<130> 2010
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttgtggttat ggttattttt gtaat 25
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aataccaaaa tcaacrccta c 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtggttatg gttatttttg taat 24
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaatcaacrc ctacaaaat 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctgtagctgc gacggaga 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atccggaact gtctgaggtg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gagggactca ctcagttgcg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aagtcaggga tgctggagat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agaccgtcgg gtggactgct 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggtcgttgcc agccaatcgt 20
Claims (10)
1.LGR4基因作为奶牛乳腺炎预防/诊断/治疗标志物的应用。
2.LGR4检测试剂在制备预防/治疗/诊断奶牛乳腺炎制剂中的应用。
3.如权利要求2所述LGR4检测试剂在制备预防/治疗/诊断奶牛乳腺炎制剂中的应用,其特征在于,所述LGR4检测试剂为LGR4甲基化水平检测试剂。
4.如权利要求3所述LGR4检测试剂在制备预防/治疗/诊断奶牛乳腺炎制剂中的应用,其特征在于,所述LGR4甲基化水平为LGR4基因外显子5区域CpG岛的甲基化水平。
5.如权利要求4所述LGR4检测试剂在制备预防/治疗/诊断奶牛乳腺炎制剂中的应用,其特征在于,所述甲基化位点为chr15:58890531bp-58891275bp。
6.如权利要求2所述LGR4检测试剂在制备预防/治疗/诊断奶牛乳腺炎制剂中的应用,其特征在于,所述LGR4来自奶牛血液嗜中性粒细胞。
7.如权利要求2所述LGR4检测试剂在制备预防/治疗/诊断奶牛乳腺炎制剂中的应用,其特征在于,所述乳腺炎为革兰氏阴性菌引发的乳腺炎;更优选的,为大肠杆菌引发的乳腺炎。
8.一种奶牛乳腺炎诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包括LGR4检测试剂。
9.一种奶牛乳腺炎诊断方法,其特征在于,通过检测奶牛血液嗜中性粒细胞中LGR4基因外显子5可变剪接体甲基化水平;优选的,所述检测通过亚硫酸盐测序、克隆测序法或实时荧光定量PCR方法进行;优选的,所述甲基化率高于20%,判定为健康牛样品,所述甲基化率低于15%判定为大肠杆菌乳腺炎牛样品。
10.一种奶牛育种方法,其特征在于,所述育种方法包括采用权利要求9所述判断是否是大肠杆菌乳腺炎牛样品从而筛选高乳腺炎抗性牛。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911006567.9A CN110669838B (zh) | 2019-10-22 | 2019-10-22 | Lgr4作为奶牛乳腺炎预防、诊断或治疗标志物的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911006567.9A CN110669838B (zh) | 2019-10-22 | 2019-10-22 | Lgr4作为奶牛乳腺炎预防、诊断或治疗标志物的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110669838A true CN110669838A (zh) | 2020-01-10 |
CN110669838B CN110669838B (zh) | 2022-07-05 |
Family
ID=69083542
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201911006567.9A Active CN110669838B (zh) | 2019-10-22 | 2019-10-22 | Lgr4作为奶牛乳腺炎预防、诊断或治疗标志物的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110669838B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7465485B2 (ja) | 2022-03-24 | 2024-04-11 | 国立大学法人東京農工大学 | 乳房炎発症リスクの判定に用いるdnaマーカー及びそれを用いた乳房炎リスクの判定方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5849488A (en) * | 1996-02-27 | 1998-12-15 | Oulutech Ltd. | DNA-sequence-based diagnosis of mastitis from a milk sample |
CN103290004A (zh) * | 2013-05-24 | 2013-09-11 | 中国农业大学 | 一种检测奶牛乳房炎抗性的dna甲基化的分子标记 |
CN105936942A (zh) * | 2016-07-06 | 2016-09-14 | 上海市内分泌代谢病研究所 | 一种lgr4基因检测试剂盒 |
-
2019
- 2019-10-22 CN CN201911006567.9A patent/CN110669838B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5849488A (en) * | 1996-02-27 | 1998-12-15 | Oulutech Ltd. | DNA-sequence-based diagnosis of mastitis from a milk sample |
CN103290004A (zh) * | 2013-05-24 | 2013-09-11 | 中国农业大学 | 一种检测奶牛乳房炎抗性的dna甲基化的分子标记 |
CN105936942A (zh) * | 2016-07-06 | 2016-09-14 | 上海市内分泌代谢病研究所 | 一种lgr4基因检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JULIANE GÜNTHER等: "Differentiating Staphylococcus aureus from Escherichia coli mastitis: S. aureus triggers unbalanced immune-dampening and host cell invasion immediately after udder infection", 《SCIENTIFIC REPORTS》 * |
王梦琦等: "中国荷斯坦牛金黄色葡萄球菌诱导型乳房炎CDH13基因甲基化分析", 《中国畜牧兽医》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7465485B2 (ja) | 2022-03-24 | 2024-04-11 | 国立大学法人東京農工大学 | 乳房炎発症リスクの判定に用いるdnaマーカー及びそれを用いた乳房炎リスクの判定方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110669838B (zh) | 2022-07-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Ju et al. | Genome-wide methylation and transcriptome of blood neutrophils reveal the roles of DNA methylation in affecting transcription of protein-coding genes and miRNAs in E. coli-infected mastitis cows | |
Kosciuczuk et al. | Transcriptome profiling of Staphylococci-infected cow mammary gland parenchyma | |
Russell et al. | Identification of single nucleotide polymorphisms in the bovine Toll-like receptor 1 gene and association with health traits in cattle | |
Qureshi et al. | Comparative genomics and host resistance against infectious diseases. | |
Pant et al. | Identification of single nucleotide polymorphisms in bovine CARD15 and their associations with health and production traits in Canadian Holsteins | |
US20200102610A1 (en) | Method for cerebral palsy prediction | |
Zhang et al. | Whole-genome resequencing from bulked-segregant analysis reveals gene set based association analyses for the Vibrio anguillarum resistance of turbot (Scophthalmus maximus) | |
Verbeke et al. | Pathogen-group specific association between CXCR1 polymorphisms and subclinical mastitis in dairy heifers | |
Zhang et al. | Goat sperm associated antigen 17 protein gene (SPAG17): Small and large fragment genetic variation detection, association analysis, and mRNA expression in gonads | |
CN110669838B (zh) | Lgr4作为奶牛乳腺炎预防、诊断或治疗标志物的应用 | |
JP2002512511A (ja) | 遺伝子組成物および方法 | |
Wang et al. | Polymorphism in PGLYRP-1 gene by PCR-RFLP and its association with somatic cell score in Chinese Holstein | |
Khan et al. | Genetic polymorphisms of TRAPPC9 and CD4 genes and their association with milk production and mastitis resistance phenotypic traits in Chinese Holstein | |
CN104450727A (zh) | X-连锁低磷酸盐血症性佝偻病的致病基因及其编码蛋白质和应用 | |
Liu et al. | Polymorphisms of the ATP1A1 gene associated with mastitis in dairy cattle | |
Igarashi et al. | Polymorphisms of nucleotide-binding oligomerization domain 2 (NOD2) gene in miniature dachshunds with inflammatory colorectal polyps | |
US20030175755A1 (en) | Method of collecting data for estimation of susceptibility to periodontal disease | |
CN113789376B (zh) | 用于预测和筛选青少年特发性脊柱侧凸的试剂盒及应用 | |
US20190226023A1 (en) | Method for Evaluating the Risk of Drug Hypersensitivity Reaction Induced by Sulfamethoxazole and/or Trimethoprim | |
Wang et al. | Haplotype analysis of TLR4 gene and its effects on milk somatic cell score in Chinese commercial cattle | |
Ahlawat et al. | First report on delineation of differentially expressed genes and pathways in milk somatic cells of mastitic and healthy Murrah buffaloes | |
Al-Sharif et al. | DNA polymorphisms and expression profile of immune and antioxidant genes as biomarkers for reproductive disorders tolerance/susceptibility in Baladi goat | |
El Nahas et al. | Acu I identifies water buffalo CSN3 genotypes by RFLP analysis | |
CN104372010A (zh) | 热性惊厥新的突变致病基因及其编码蛋白和应用 | |
Ewuola et al. | Insilico analysis of myostatin gene in selected poultry species |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |