CN109628581A - 一种肥胖基因突变的诊断试剂盒及应用 - Google Patents
一种肥胖基因突变的诊断试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种肥胖基因突变的诊断试剂盒，针对肥胖相关致病基因编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补原则设计探针序列，在每个探针序列的连接接头，采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸大规模合成，用氨水将芯片上的寡核苷酸洗脱形成寡核苷酸混合物，通过PCR的方法，采用5’端带有生物素标记的引物，形成带生物素标记的肥胖相关致病基因DNA探针文库。本发明实现对肥胖相关的已知位点的高通量筛查方法及应用，比单独进行位点筛查和全基因组或者全外显子测序的检测更快速、更经济和简便，且对设备及环境要求低，可在与肥胖相关的已知核基因的多态性位点中的应用，适用于肥胖相关人群的大规模筛查和预防性检查。
Description
技术领域
本发明属于生命科学与生物技术领域，具体涉及一种肥胖基因突变的诊断试剂盒，以及利用该试剂盒在检测与人肥胖相关的核基因的多态性位点中的应用。
背景技术
肥胖是指一定程度的明显超重与脂肪层过厚，是体内脂肪，尤其是甘油三酯积聚过多而导致的一种状态。它不是指单纯的体重增加，而是体内脂肪组织积蓄过剩的状态。由于食物摄入过多或机体代谢的改变而导致体内脂肪积聚过多造成体重过度增长并引起人体病理、生理改变或潜伏。认为遗传因素在肥胖形成过程中起着重要作用。父母中有一人肥胖，则子女有40％肥胖的机率，如果父母双方皆肥胖，子女可能肥胖的机率升高至70％～80％。
肥胖对人体损伤极大，增加心血管疾病的危险，肥胖影响消化系统的功能，肥胖影响内分泌系统的功能，肥胖增加癌症发生的危险性，肥胖不仅影响形体美，而且给生活带来不便。此外还有关节软组织损伤、生殖能力下降以及心理障碍、心脏病、糖尿病、动脉粥样硬化、脂肪肝、胆结石、水肿、痛风等。随着高通量测序技术的发展与成熟，人全基因组测序已经成为肥胖相关致病基因突变研究和诊断的重要工具。通过全基因组测序对被测样本进行全基因组扫描，可实现对基因突变零遗漏，从而成为肥胖相关致病基因突变研究和诊断的有效工具。
由于人类基因组的大小约为3Gb，对其进行全基因组测序总计约需90Gb测序数据。巨大的数据量要求所致高昂的测序成本，导致全基因组测序应用于肥胖的基因诊断受到限制。全基因组测序和全外显子测序需要产生大量的测序数据量，测序成本高，因此测序深度不可能太深。对于检查基因突变而言，想要实现突变检查的零遗漏，全基因组测序确实难以担当此任。特别是对于，一次检测数百个基因上发生的所有突变，高深度测序才能实现对突变检测的准确性。
因此，开发一款价格低廉的，准确性高的基因突变检查产品，特别是对于肥胖基因突变的诊断产品，具有重要的作用。
发明内容
本发明的目的是针对目前检测肥胖相关的目的基因的方法所存在的缺点，提供一种肥胖基因突变的诊断试剂盒，是一种通过构建具有快速、高通量特点，更好的有利于高效、快速、便捷、经济的进行肥胖相关的目的区域DNA全序文库，从而进行高通量测序的一种试剂盒。
本发明提供的试剂盒，通过制备带生物素标记的肥胖相关基因DNA探针文库构成，主要由全基因组DNA打断后的加A尾的体系、接头连接体系、纯化体系、PCR前反应体系、探针杂交体系、PCR后反应体系等6个组分构成，具体通过以下步骤实现：
(1)针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为100bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3，共计535个基因；
(2)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT和GTGACTGGAGTTCAGACGTG序列及特异性样本识别序列，形成两端带有接头序列；
(3)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下列，形成寡核苷酸混合物。
(4)通过PCR的方法，采用5’端均带有生物素标记的正向引物TTAGATAGGTGTGTAGGCGC和反向引物TAAGGTGCGTACTAGCTGAC，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的基因DNA探针文库。其中PCR条件：热盖105℃，95℃5min，65℃延伸保存。
本发明对带有样本识别序列的接头探针，采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下列，形成寡核苷酸混合物。
本发明所述基因选自表1中示出的肥胖相关致病基因535个，例如表1中的所有基因。
本发明所述探针序列的长度为100bp，所述探针在每两个相邻的探针序列之间存在60bp或80bp的重叠，共计535个基因。
本发明所述基因选自表3中示出的肥胖相关靶向捕获致病基因，例如表3中的所有基因。
本发明的另一个目的是提供所述试剂盒在检测人肥胖相关的核基因的多态性位点，通过以下步骤实现：
1)根据人类参考基因组HG19，结合Ensembl、CCDS、Gencode、VEGA、SNP以及CytoBand数据库，获取实施例2表1中耳聋相关致病基因的所有编码序列；
2)提取所述受试者的基因组DNA，将其打断至200-300bp的范围；
3)针对每个编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为90bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在60bp或者80bp的重叠；
4)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加序列和测序识别序列接头，形成两端带有同样序列的探针序列96条序列表的第5-100号，
5)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列列表中的序列；
6)通过PCR的方法，采用5’端带有生物素标记的正向引物TTAGATAGGTGTGTAGGCGC和5’端带有同样标记的反向引物TAAGGTGCGTACTAGCTGAC，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的耳聋相关致病基因DNA探针文库。
反应体系如下：
| 试剂名称 | 体积 |
| 2G Buffer B 5× | 10μl |
| dNTP(10mM each) | 1μl |
| 正向引物(25μM) | 0.5μl |
| 反向引物(25μM) | 0.5μl |
| 寡核苷酸混合物 | 5μl |
| 2G robust DNA Taq | 0.8μl |
| H<sub>2</sub>O | 32.2μl |
反应条件如下：
7)对步骤4)获得的扩增产物进行上机测序，得到所述基因的测序数据；
8)将步骤5)的测序数据与人类参考基因组进行比对，从而得到与参考基因组不同的单核苷酸多态性、插入或缺失，即所检测到的基因突变。
本发明提供将人体全基因组进行打断、靶向基因捕获芯片、探针以及相关的检测试剂盒。本发明主要提供了：(1)对人基因组DNA打断后的接头连接探针；(2)提供肥胖相关的靶向基因捕获芯片；(3)捕获目标区域DNA文库的纯化和扩增；(4)一种用于靶向捕获肥胖相关目标区域基因的二代测序文库构建的方法及试剂盒。
本发明的试剂盒具有如下优点：(1)相对于全基因组测序，大大节约了所需要的测序数据量；(2)一次性检测疾病相关致病基因的所有突变，实现对疾病基因诊断的零遗漏，为疾病的治疗和干预提供保障；(3)高深度的测序，实现对基因突变的高准确性检测；(4)成本低，一次检测数百个基因上发生的所有突变；应用本发明提供的试剂盒进行mtDNA突变检测，成本较其他检测方法更低；检测流程简便、快速，结果判读直观；适合在一般医院、分子生物实验室开展，便于在全国范围内特别是欠发达地区实行遗传性视神经病变相关的mtDNA突变的大规模筛查和预防性检查。(5)高深度测序实现对突变检测的准确性。
附图说明
图1是本发明的肥胖基因靶向捕获DNA文库构建示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1本发明一种肥胖基因突变的诊断试剂盒及制备方法
本发明提供的诊断试剂盒，通过以下制备步骤实现：
1)针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为100bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3，共计535个基因；
2)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT和GTGACTGGAGTTCAGACGTG序列及特异性样本识别序列，形成两端带有接头序列；
3)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下列，形成寡核苷酸混合物。
4)通过PCR的方法，采用5’端均带有生物素标记的正向引物TTAGATAGGTGTGTAGGCGC和反向引物TAAGGTGCGTACTAGCTGAC，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的基因DNA探针文库。
实施例2
1.肥胖相关致病基因的试剂盒制备
根据人类参考基因组HG19，结合Ensembl、CCDS、Gencode、VEGA、SNP以及CytoBand数据库，获取以下表1中肥胖相关致病基因的所有编码序列；按照图1所示的示意图进行制备的肥胖相关致病基因DNA探针文库：
第一步、基因组DNA打断
1)将基因组DNA按照以上体系转移至0.6ml微样离心管内，充分混匀，短暂离心后置于冰上待用；
2)提前打开超声打断仪，待冷循环仪温度降至4℃后，设置参数开30s，关30s为1个循环，每10cycles为一轮，共进行3轮，每轮结束后将样品置于振荡器上充分混匀，短暂离心后进行下一轮打断(混匀越充分，打断样品片段大小越集中)；
3)取1μl样品使用核酸质量控制仪进行片段检测，正常打断后样品检测主峰约在150bp-200bp。
第二步、末端修复、3’端加“A”
1)将打断后的样品完全转移至PCR管中，按如下表格配置反应体系(此操作需在冰盒上进行)：DNA片段35μl，10×ERA缓冲液5μl，5×ERA-尾酶混合物10μl，总计50μl；
2)使用移液器吹打混匀(避免剧烈震荡混匀)，将PCR管放回冰盒上备用；运行PCR程序，设置PCR仪参数如下：热盖85℃，4℃1min，20℃30min，65℃30min，4℃保存
第三步、接头连接、纯化
1)在上述步骤2反应的PCR管中，按如下表格配置反应体系(此操作需在冰盒上进行)：来自步骤2反应结束的样品50μl，接头)5μl，Nuclease-free water 15μl，5×连接缓冲液酶20μl，连接酶10μl，总计100μl；
2)轻轻吸打混匀6次，避免产生气泡，然后短暂离心；
3)运行PCR仪程序(要求无热盖)，设置PCR仪参数如下：不需要热盖，20℃15min，4℃保存
4)将磁珠拿至室温，震荡混匀备用；
5)在step3中程序运行完的PCR管中，按照0.8×体积的纯化磁珠进行实验，按下面表格配置反应体系：来自step3反应结束的样品100μl，磁珠80μl，总计180μl
6)轻轻吸打混匀6次，室温静置孵育5-15min，将PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清；
7)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向PCR管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s；
8)移除上清，再向PCR管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；
9)室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发；
10)加入22μl的去离子水，把PCR管从磁力架取下，轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
11)将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清；
12)用移液器吸取20μl上清液，转移到新的PCR管中(置于冰盒上)，在反应管上标记样本编号，准备下一步反应。
第四步、前PCR反应、纯化
1)预先从﹣20℃保存的试剂盒中取出PCR混合物、引物TPE1.0和TPE2.0试剂，置于冰盒上溶解，混匀后置于冰上待用；
2)来自上一步反应结束的样品20μl，PCR混合物25μl，引物TPE1.0(10μM)2.5μl，TPE2.0接头-8(10μM)2.5μl，总计50μl；
3)使用移液器轻轻吹打混匀，然后短暂离心；将样品置于PCR仪上，启动PCR程序，如下：热盖105℃，98℃2min，98℃20s，60℃30s 16循环，72℃30s，72℃1min，4℃保存
4)向上述反应后的PCR管中加入50μl磁珠，用移液器吹打混匀，避免产生气泡；
5)室温孵育5-15min，把PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清；
6)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向PCR管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s；
7)移除上清，再向PCR管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；
8)室温静置5min，使残留乙醇彻底挥发；
9)加入30μl的去离子水，将离心管从磁力架取下，使用移液器，轻轻吸打重悬磁珠；
10)室温静置2min，将200μl PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清；
11)用移液器将上清液转移到新的200μl PCR管中(置于冰盒上)，在反应管上标记好样本号，准备下一步反应；
12)取1μl样品使用核酸分析仪进行文库浓度测定，记录文库浓度，如下游进行液相捕获，则需文库浓度>25ng/μl；
13)取1μl样品使用核酸质量控制仪进行片段长度测定，文库长度约在270bp-320bp间。
第五步、样品、探针杂交
1)预先从﹣20℃保存的捕获试剂盒中，取出下表所示Block试剂，放置于冰盒上溶解，溶解混匀后置于冰上或4℃待用；
2)按照以下体系配置反应体系开展实验，将样品文库与各杂交盒混匀，标记为B管，按照下面所对应的体系进行配制：样品文库(来自上一步反应结束的样品)750ng，杂交1盒5μl，杂交盒-A0 1μl，杂交接头-8 5μl；
3)将杂交缓冲液置于室温融化，融解之后会有沉淀出现，混匀后置于65℃恒温混匀仪内预热，完全溶解后(无沉淀及浑浊物)取20μl杂交缓冲液置于新的200μlPCR管内，盖好管盖,置于65℃恒温混匀仪孵育待用，标记为A管；
4)取5μl RNase与2μl探针置于200μl PCR管内，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上或4℃待用，标记为C管。
5)将B管放入真空浓缩离心机，打开PCR管盖，启动离心机，打开真空泵开关，开始浓缩(浓缩之前可以先用相同体积的水进行浓缩时间测试，计算样品单位体积减少的时间，确认浓缩速率，避免因浓缩时间过长导致过度干燥，造成样品损耗)；
6)将B管浓缩至体积小于10μl，之后用去离子水补足至10μl，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用；
7)设置PCR仪参数如下：热盖105℃，95℃ 5min，65℃保存
8)PCR仪温度降至65℃时，将A管置于PCR仪上孵育，盖上PCR仪热盖；
9)5min后，将C管置于PCR上孵育，盖上PCR仪热盖；
10)2min后，把移液器调至13μl，从A管中吸取13μl杂交缓冲液移至C管中，吸取全部B管中样品移至C管中，轻轻吸打10次，充分混匀，避免产生大量气泡，密封管盖，盖上PCR仪热盖，65℃孵育过夜(16-24h)。
第六步、捕获磁珠平衡
1)捕获磁珠从4℃取出，涡旋震荡重悬；
2)取50μl磁珠置于新的PCR管内，置于磁力架上1min使溶液澄清，移除上清；
3)从磁力架上取下PCR管，加入200μl连接缓冲液轻轻吸打数次混匀，重悬磁珠；
4)置磁力架上1min，移除上清；
5)重复步骤3-4两次，共清洗磁珠3次；
6)从磁力架上取下PCR管，加入200μl连接缓冲液轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
第七步、捕获目标区域DNA文库
1)保持杂交产物在PCR仪上，将步骤上一步中第6步重悬后的200μl磁珠加入到杂交产物中，用移液器吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上室温结合30min；
2)将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清液；
3)向杂交产物内加入200μl的洗脱液1，轻轻吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上清洗15min，然后短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min，使溶液澄清，移除上清；
4)加入200μl的65℃预热的洗脱液2，轻轻吸打6次混匀，置于恒温振荡混匀仪上65℃孵育10min，800转/min进行清洗；
5)短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min，移除上清。使用洗脱液2清洗2次，共计3次。最后一次彻底移除洗脱液2(可用10μl移液器移除残留)；
6)保持样品在磁力架上，向PCR管内加入200μl 80％乙醇，静置30s后彻底移除乙醇溶液(可用10μl移液器移除残留)，室温晾干；
7)向PCR管加入30μl去离子水，从磁力架上取下PCR管，轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
第八步、Post-PCR反应、纯化
1)预先从-20℃保存的试剂盒中取出Post PCR缓冲液、Post PCR引物(25μM,forILM)试剂，放置冰上溶解，溶解混匀后置于冰上待用。取出Post PCR酶简短离心后立即使用。
2)捕获后需要对DNA文库进行富集，根据下表配制反应体系：来自step 9反应结束的样品30μl，Post PCR缓冲液18μl，Post PCR引物(25μM,for ILM)1μl，Post PCR聚合酶1μl，总计50μl；
3)将移液器调至40μl，轻轻吸打混匀6次，然后立即置于PCR仪上。
4)运行PCR仪程序：热盖105℃，95℃4min，98℃20s，60℃30s 14循环，72℃30s，72℃5min，4℃保存；
5)PCR结束后向样品加入55μl磁珠，用移液器轻轻吸打6次混匀；
6)室温孵育5min，把PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清；
7)移除上清，PCR管继续置于磁力架上，加入200μl 80％无水乙醇，静置30s；
8)移除上清，再向PCR管内加入200μl 80％无水乙醇，静置30s后彻底移除上清(可用10μl移液器移除底部残留酒精)；
9)室温放置5min，使得残留乙醇彻底挥发；
10)加入25μl去离子水，将PCR管从磁力架拿下，轻轻吹打混匀重悬磁珠，室温放置2min；将PCR管置于磁力架上2min；
11)用移液器吸23μl上清液转移到1.5ml离心管，标记样品信息；
12)取1μl文库使用核酸分析仪进行定量，记录文库浓度，文库浓度约在1-10ng/μl；
13)取1μl样品使用核酸质量控制仪进行片段长度测定，文库长度约在270bp-320bp间；
14)使用高通量测序平台进行测序。
表1肥胖相关535目的基因列表(基因名称来自http://www.genenames.org/)
2)针对每个编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为120bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在60bp的重叠；
3)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加序列和测序识别序列接头，形成两端带有同样序列的探针序列96条序列，见序列表第5-100号；
4)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列列表中的序列；
5)通过PCR的方法，采用5’端带有生物素标记的正向引物TTAGATAGGTGTGTAGGCGC和5’端带有同样标记的反向引物TAAGGTGCGTACTAGCTGAC，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的肥胖相关致病基因DNA探针文库。
反应体系如下：
反应条件如下：
2.肥胖相关致病基因的试剂盒筛查突变
1)取人受试者的基因组DNA 1μg，采用超声破碎仪，打断至200-300bp的范围；
2)采用液相杂交的方法，进行DNA小片段文库的制备；
3)将DNA小片段文库和上述制备的肥胖相关致病基因DNA探针文库进行液相杂交，进行肥胖相关致病基因的捕获；
4)采用PCR，对捕获后的产物进行扩增，得到测序文库；
反应体系如下：
反应条件如下：
5)采用Illumina高通量测序仪，对测序文库进行上机测序，得到肥胖相关致病基因的测序数据；
6)利用BWA MEM软件，将测序数据与到人类参考基因组HG19进行比对，所用的参数为：bwa mem-M-k 40-t 8-R"@RG\tID:Hiseq\tPL:Illumina\tSM:sample"，从而得到与参考基因组不同的单核苷酸多态性、插入或缺失，即所检测到的基因突变。
3.目标区域捕获效果评估
1)采用samtools-1.2软件中的samtools stats工具统计数据的大小、比对率、重复率、质量值，接着再用软件中的samtools depth工具，计算目标区域每个位置的测序深度；
2)用比对到目标区域的数据量除以总数据量，获得捕获效率；
3)根据目标区域每个位置的测序深度，分别统计测序深度≥1、≥4、≥10及≥20的碱基数量，再将该碱基数量除以目标区域的总碱基数量，从而得到1×覆盖率、4×覆盖率、10×覆盖率及20×覆盖率的参数。
4.全基因组测序以及目标区域捕获效果评估
利用相同的实验手段、技术条件分别对样本进行全基因组测序和目标区域捕获测序，对原始数据量(Mb,reads)、干净数据量(Mb,reads)、比对率、目标区域大小、目标区域所测到的碱基数量、目标区域覆盖度、有效数据量(Mb)、比对到目标区域的有效数据量(Mb)、捕获效率数据利用率、目标区域平均深度、深度4×的目标区域比例、深度10×的目标区域比例、深度20×的目标区域比例、重复率进行比对结果分析，见下表2.
表2：肥胖相关致病基因的试剂盒筛查和全基因组测序所得结果比较
从以上表可以看出，全基因组测序和肥胖相关致病基因的试剂盒筛查相比，1)全基因组测序的绝大多数数据(99.98％)是没有用的，数据利用率仅为0.02％；2)目标区域有效数据量相比也比较小，导致目标区域的平均深度只有34.46层，相比之下，肥胖相关致病基因的试剂盒筛查的平均深度高达368.04层；3)全基因组测序在深度为20×的目标区域比例也比较小，仅为88.73％，而肥胖相关致病基因的试剂盒筛查的为99.60％。
由于表1中的基因，从其DNA序列碱基组成的角度来看，其碱基组成没有经过任何选择和筛选，所以本发明的方法和试剂盒对于所适用的基因没有特别要求。从发明人对表1中列出的每个基因分别考察来看，利用本发明的方法和试剂盒对基因突变的检测都明显优于全基因测序的方法。
然而，不希望拘囿于任何理论，发明人进一步以类似的方法对于每个测试基因分析了表2中的比较结果，实施例中的方法和试剂盒(选择所述探针长度为114、所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的2/3的情况)对如下表3中的基因的突变检测而言，相对于全基因组检测，比其余基因具有更加优的检测效果(肥胖相关致病基因的试剂盒筛查在深度为20×的目标区域比例为99.93％)。这可能和选择的探针序列的长度为114bp，所述探针在每两个相邻的探针序列之间存在76bp的重叠有关，将探针序列的长度为110-130bp之间、探针在每两个相邻的探针序列之间的重叠进行调整，对于每个基因的基因突变检测会找到更优的探针序列的长度和探针在每两个相邻的探针序列之间存在的重叠。
虽然已经结合优选实施例对本发明进行了描述，但应当理解本发明的保护范围并不局限于这里所描述的实施例。结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种肥胖基因突变的诊断试剂盒及应用
<160> 100
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 1
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 2
gtgactggag ttcagacgtg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 3
ttagataggt gtgtaggcgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 4
taaggtgcgt actagctgac 20
<210> 5
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 5
gtcatgca 8
<210> 6
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 6
cgatagca 8
<210> 7
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 7
tgcttgtg 8
<210> 8
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 8
atcagcga 8
<210> 9
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 9
acaaagcg 8
<210> 10
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 10
ttcatcgg 8
<210> 11
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 11
tgtggtca 8
<210> 12
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 12
atggcttc 8
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<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 13
caccagaa 8
<210> 14
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 14
gttttcgg 8
<210> 15
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 15
ccttttcg 8
<210> 16
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 16
agctggtt 8
<210> 17
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 17
aaatcggc 8
<210> 18
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 18
gttaaggg 8
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<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 19
taggtagg 8
<210> 20
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 20
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<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
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<212> DNA
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<400> 22
ctcttgca 8
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<211> 8
<212> DNA
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<400> 23
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<210> 24
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 24
gaataggg 8
<210> 25
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 25
ttcggtca 8
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<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 26
gaaaaccg 8
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<211> 8
<212> DNA
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<400> 27
acgagtga 8
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<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 28
gcgctttt 8
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<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 29
cacaacgt 8
<210> 30
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 30
ggacacta 8
<210> 31
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 31
gcggtaat 8
<210> 32
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 32
tgcctcaa 8
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<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 33
gtctacgt 8
<210> 34
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 34
aggtcttg 8
<210> 35
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 35
ctcgttct 8
<210> 36
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 36
ttgtccag 8
<210> 37
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<213> 人(homo sapiens)
<400> 37
aacgcaga 8
<210> 38
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 38
gtgcatga 8
<210> 39
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 39
cgtacaga 8
<210> 40
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 40
tggaggta 8
<210> 41
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 41
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<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 42
aatacggc 8
<210> 43
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 43
ttagaggg 8
<210> 44
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 44
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<210> 45
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 45
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<210> 46
<211> 8
<212> DNA
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<400> 46
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<210> 47
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 47
ctgtacga 8
<210> 48
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 48
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<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 49
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<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 50
tcccatac 8
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<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 51
attgctgc 8
<210> 52
<211> 8
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<213> 人(homo sapiens)
<400> 52
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<210> 53
<211> 8
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<400> 53
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<400> 54
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<211> 8
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<400> 55
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<210> 56
<211> 8
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<400> 56
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<211> 8
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<213> 人(homo sapiens)
<400> 57
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<210> 58
<211> 8
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<213> 人(homo sapiens)
<400> 58
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<210> 59
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 59
aatcctgg 8
<210> 60
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 60
tgcttcag 8
<210> 61
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 61
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<210> 62
<211> 8
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<213> 人(homo sapiens)
<400> 62
ttcagagg 8
<210> 63
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 63
gttgcagt 8
<210> 64
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 64
ctgaagag 8
<210> 65
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 65
aactggac 8
<210> 66
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 66
agacacgt 8
<210> 67
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 67
tcacctga 8
<210> 68
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 68
tcgcaatc 8
<210> 69
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 69
aaccagac 8
<210> 70
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 70
aactccga 8
<210> 71
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 71
ctggctaa 8
<210> 72
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 72
gatgctac 8
<210> 73
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 73
ctagtctc 8
<210> 74
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 74
ctagcttc 8
<210> 75
<211> 8
<212> DNA
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<400> 75
ctaaggac 8
<210> 76
<211> 8
<212> DNA
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<400> 76
tggcctaa 8
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<211> 8
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<400> 77
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<211> 8
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<400> 78
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<211> 8
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<400> 79
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<211> 8
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<400> 80
tttcgacc 8
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<211> 8
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<400> 81
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<211> 8
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<400> 82
ttctccac 8
<210> 83
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 83
tggaagtc 8
<210> 84
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 84
atagcacc 8
<210> 85
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 85
gtagatgc 8
<210> 86
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 86
gcttccta 8
<210> 87
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 87
ccaaactc 8
<210> 88
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 88
atcgaagg 8
<210> 89
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 89
ccgtttgt 8
<210> 90
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 90
tacgagtc 8
<210> 91
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 91
tcaggtag 8
<210> 92
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 92
caacagag 8
<210> 93
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 93
gacaagtc 8
<210> 94
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 94
aaggacag 8
<210> 95
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 95
acttcctg 8
<210> 96
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 96
acagaacc 8
<210> 97
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 97
ccgtgtaa 8
<210> 98
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 98
agttcacc 8
<210> 99
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 99
cgtatctg 8
<210> 100
<211> 8
<212> DNA
<213> 人(homo sapiens)
<400> 100
gatgtgca 8
Claims (8)
1.一种肥胖基因突变的诊断试剂盒，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为100bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3，共计535个基因；
(2)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加SEQ:NO.1和SEQ:NO.2序列，形成两端带有接头序列；
(3)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下来，形成寡核苷酸混合物；
(4)通过PCR的方法，采用5’端均带有生物素标记的正向引物TTAGATAGGTGTGTAGGCGC和反向引物TAAGGTGCGTACTAGCTGAC，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的基因DNA探针文库。其中PCR条件：热盖105℃，95℃5min，65℃延伸保存。
2.根据权利要求1所述的一种肥胖基因突变的诊断试剂盒，其特征在于，方法步骤(1)中的所述探针序列的长度为100bp，所述探针在每两个相邻的探针序列之间存在60bp或80bp的重叠。
3.根据权利要求1所述的一种肥胖基因突变的诊断试剂盒，其特征在于，方法步骤(3)中采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下来，形成寡核苷酸混合物。
4.根据权利要求1所述的一种肥胖基因突变的诊断试剂盒，其特征在于，方法步骤(4)中的所述标记是水溶性维生素B的生物素标记。
5.根据权利要求1-4任一所述的一种肥胖基因突变的诊断试剂盒，其特征在于，方法中所述基因选自步骤(1)中535个基因中的肥胖相关基因。
6.权利要求1-4任一所述的一种肥胖基因突变的诊断试剂盒在与肥胖相关的已知核基因的多态性位点中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)提取所述受试者的基因组DNA，将其打断至200-300bp的范围；
(2)对上述打碎的基因组DNA进行DNA小片段文库的制备；
(3)将DNA小片段文库和权利要求7的基因DNA探针文库或试剂盒进行杂交，进行基因的捕获；
(4)采用PCR，对步骤(3)中捕获的产物进行扩增，得到扩增的产物；
(5)步骤(4)获得的扩增产物进行上机测序，得到所述基因的测序数据；
(6)将步骤(5)的测序数据与人类参考基因组进行比对，从而得到与人类参考基因组不同的单核苷酸多态性、插入或缺失，即所检测到的基因突变。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤6)中所述人类参考基因组是HG19。
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