CN107974496A - 一种肥胖相关基因的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肥胖相关基因的检测方法，具体步骤如下：利用检测者的口腔黏膜细胞提取DNA；以口腔黏膜细胞提取DNA为模板进行PCR反应；对肥胖6个相关基因设计了6对特异性引物；进行普通PCR扩增后将PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳；将1％的琼脂糖凝胶电泳目的条带用天跟的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收；进行测序反应；测序反应产物纯化；变性，上3730测序仪测序；将测序结果用Chromas软件分析6个SNP基因型。本发明具有检测高效、特异性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体来说是一种肥胖相关基因的检测方法。
背景技术
现在随着经济水平的日益提高，肥胖人群逐渐增多，肥胖会对人的生活、健康等带来不利的影响，尽管引起肥胖的因素众多，但目前较为一致的认识是由环境因素和遗传因素行为因素等共同决定的。
肥胖已成为世界性的公共卫生问题，肥胖与许多疾病相关联，典型的如糖尿病，冠心病和动脉硬化等，同时肥胖还带来了种种心理问题和社会歧视，全球有约11亿超重人群，中国的肥胖人群也在不断激增，统计表明现今中国至少有3亿肥胖患者，人类肥胖是基因与环境共同作用的结果，缺乏运动和过度饮食是导致肥胖的外在因素，然而内在的基因因素也在很大程度上决定了一个人的肥胖程度，以及饮食和运动对肥胖的影响。
经研究发现体脂率的降低程度与人类的基因密切相关，目前掌握的基因有：PPARG作为转录因子参与脂质分化、利用、代谢及肥胖基因的调节；脂蛋白酯酶活性受APOA5基因的调节，目前，共发现了10余个人类常见的APOA5基因SNP位点，其中rs662799位点基因多态性与人群血脂代谢密切相关；APOA2基因与内脏脂肪聚集和富含甘油三酯的脂蛋白代谢有关，在脂类物质代谢和肥胖相关性状中起着至关重要的作用；FTO基因是首个得以广泛验证的肥胖易感基因，该基因rs9939609位点与BMI、体脂百分比和腰围显著性相关，该位点突变携带者，在相同强度运动下，可以获得更好的减肥效果。
目前大部分减肥方案的制定未考虑并重视基因信息的作用，无法分析得到导致其肥胖的遗传因素，从而难以得到合适的减肥方案，可能对肥胖者无效甚至有害健康，目前对检测肥胖基因，由于引物设计的不足，难以达到检测的高效性、特异性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的检测不高效、特异性差的缺陷，而提供一种肥胖相关基因的检测方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种肥胖相关基因的检测方法，具体步骤如下：
一、利用检测者的口腔黏膜细胞提取DNA；
二、分别用SEQ NO 1和SEQ NO 2为引物扩增FTO基因SNP rs9939609位点，用SEQNO 3和SEQ NO 4为引物扩增PPARG基因SNP rs1801282位点，用SEQ NO 5和SEQ NO 6为引物扩增LIPC基因SNP rs1800588位点，用SEQ NO 7和SEQ NO 8为引物扩增ADRB3基因SNPrs4994位点，用SEQ NO 9和SEQ NO 10为引物扩增APOA5基因SNP rs662799位点，用SEQ NO11和SEQ NO 12为引物扩增APOA2基因SNP rs5082位点，以口腔黏膜细胞提取DNA为模板进行PCR反应；
三、将上述6对引物进行普通PCR扩增后PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳；
四、将1％的琼脂糖凝胶电泳目的条带用天跟的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带；
五、进行测序反应；
六、测序反应产物纯化：
测序反应产物中加3ul EDTA和18ul无水乙醇，3700r/min，离心30min，后倒置800r/min离心10s后取出加50ul 80％乙醇，3700r/min，离心15min，后倒置800r/min离心10s取出；
七、变性，上3730测序仪测序：
在上一步测序反应产物纯化后的样本中加10ul去离子甲酰胺，上PCR仪变性，94℃条件下变性2min，4℃保存3min后上3730测序；
八、将测序结果用Chromas软件分析6个SNP基因型。
作为优选，所述的步骤一中，采用口腔拭子DNA提取试剂盒对检测者的口腔黏膜细胞提取DNA；
作为优选，所述的步骤一中，提取的DNA浓度不低于10ng/ul，260/280＝1.9±2。
作为优选，所述的步骤二中，PCR反应体系为25uL，其包括:
模板：2uL、SEQ NO 1:1uL、SEQ NO 2：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL。
模板：2uL、SEQ NO 3:1uL、SEQ NO4：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL。
模板：2uL、SEQ NO 5:1uL、SEQ NO 6：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL。
模板：2uL、SEQ NO 7:1uL、SEQ NO 8：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL。
模板：2uL、SEQ NO 9:1uL、SEQ NO10：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL。
模板：2uL、SEQ NO 11:1uL、SEQ NO 12：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL。
作为优选，所述的步骤二中，PCR反应条件为：
95℃预变性5min后进入循环反应95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40个循环，之后72℃延伸5min，4℃保存。
作为优选，所述的步骤二中，所述的6对引物检测6个SNP位点，具体如下：
针对FTO基因SNP rs9939609的引物组：
SEQ NO 1：TGGTACGCTGCTATGGTTCTAC
SEQ NO 2：AGCCCAAGGATGGTGTTTCT
针对PPARG基因SNP rs1801282的引物组：
SEQ NO 3：CTGTTATGGGTGAAACTCTGGG
SEQ NO 4：AATGAACGCGATAGCAACG
针对LIPC基因SNP rs1800588的引物组：
SEQ NO 5：AGGGCATCTTTGCTTCTTCG
SEQ NO 6：CTGGCTCAGGAAAGTGGTGT
针对ADRB3基因SNP rs4994的引物组：
SEQ NO 7：CCAATACCGCCAACACCAG
SEQ NO 8：TTGGTCATGGTCTGGAGTCTC
针对APOA5基因SNP rs662799的引物组：
SEQ NO 9：TGGAACAAGCAAGGGAAGC
SEQ NO 10：AGGACCAAGAATCGGGAGC
针对APOA2基因SNP rs5082的引物组：
SEQ NO 11：CCCTCTTACCCGACCCTCAT
SEQ NO 12：ATACCTGTCTGTTTACCCACCC
作为优选，所述的步骤五中，测序反应体系为5ul，如下：引物1uL，胶回收产物为模板和水共3ul，bigdye 1ul。
作为优选，所述的步骤五中，测序反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共25个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存。
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：
本发明提供一种检测肥胖相关基因的方法，包括如下步骤：获取受检者核酸，所述核酸包含DNA片段，所述的DNA片段使用口腔拭子刮取口腔黏膜细胞，用天跟口空拭子提取试剂盒提取DNA；检测一下肥胖相关基因的SNP位点的基因型，FTO基因rs9939609位点、PPARG基因rs1801282位点、LIPC基因rs1800588位点、ADRB3基因rs4994位点、APOA5基因rs662799位点和APOA2基因rs5082位点，其中包括6对引物扩增包含所述SNP位点的DNA片段，确定所述SNP位点的碱基类型，经研究发现体脂率的降低程度与人类的基因密切相关，目前掌握的基因有：PPARG作为转录因子参与脂质分化、利用、代谢及肥胖基因的调节；脂蛋白酯酶活性受APOA5基因的调节，目前，共发现了10余个人类常见的APOA5基因SNP位点，其中rs662799位点基因多态性与人群血脂代谢密切相关；APOA2基因与内脏脂肪聚集和富含甘油三酯的脂蛋白代谢有关，在脂类物质代谢和肥胖相关性状中起着至关重要的作用；FTO基因是首个得以广泛验证的肥胖易感基因，该基因rs9939609位点与BMI、体脂百分比和腰围显著性相关，该位点突变携带者，在相同强度运动下，可以获得更好的减肥效果，根据数据库如SNP数据库中确定并获得特定SNP位点基因序列上的位置信息的同时，也能获得其前后序列、分布频率等，本发明利用6个SNP位点，确定了6个位点的6对引物，用PCR扩增Sanger测序获得6个位点的基因型，该方法是一种成本低，速度快、高准确度的肥胖相关基因分型的方法。
附图说明
图1为实施例1中的胶图；
图2为实施例1中的FTO基因SNP rs9939609位点Chromas结果图；
图3为实施例1中的PPARG基因SNP rs1801282位点Chromas结果图；
图4为实施例1中的LIPC基因SNP rs1800588位点Chromas结果图；
图5为实施例1中的ADRB3基因SNP rs4994位点Chromas结果图；
图6为实施例1中的APOA5基因SNP rs662799位点Chromas结果图；
图7为实施例1中的APOA2基因SNP rs5082位点Chromas结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
参照图1-7，将李某进行肥胖相关基因检测
一、利用李某的口腔黏膜细胞用口腔拭子DNA提取试剂盒提取DNA，测试得DNA浓度25ng/ul，260/280＝1.91；
二、分别用SEQ NO 1和SEQ NO 2为引物扩增FTO基因SNP rs9939609位点，用SEQNO 3和SEQ NO 4为引物扩增PPARG基因SNP rs1801282位点，用SEQ NO 5和SEQ NO 6为引物扩增LIPC基因SNP rs1800588位点，用SEQ NO 7和SEQ NO 8为引物扩增ADRB3基因SNPrs4994位点，用SEQ NO 9和SEQ NO 10为引物扩增APOA5基因SNP rs662799位点，用SEQ NO11和SEQ NO 12为引物扩增APOA2基因SNP rs5082位点，以口腔黏膜细胞提取DNA为模板进行PCR反应：
取25uLPCR反应体系，其包括:
模板：2uL、SEQ NO 1:1uL、SEQ NO 2：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL，
模板：2uL、SEQ NO 3:1uL、SEQ NO4：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL，
模板：2uL、SEQ NO 5:1uL、SEQ NO 6：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL，
模板：2uL、SEQ NO 7:1uL、SEQ NO 8：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL，
模板：2uL、SEQ NO 9:1uL、SEQ NO10：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL，
模板：2uL、SEQ NO 11:1uL、SEQ NO 12：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL，
PCR反应条件：
95℃预变性5min后进入循环反应95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40个循环，之后72℃延伸5min，4℃保存；
三、将上述6对引物进行普通PCR扩增后PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，胶图如图1；
四、将1％的琼脂糖凝胶电泳FTO基因目的条带大小为497bp；PPARG基因目的条带大小为244bp；LIPC基因目的条带大小为199bp；ADRB3基因目的条带大小为154bp；APOA5基因目的条带大小为209bp；APOA2基因目的条带大小为500bp，用天跟的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收；
五、测序反应：
测序反应5ul体系：引物1uL，胶回收产物为模板和水共3ul，bigdye 1ul，
测序反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共25个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存；
六、测序反应产物纯化：
测序反应产物中加3ul EDTA和18ul无水乙醇，3700r/min，离心30min，后倒置800r/min离心10s后取出加50ul 80％乙醇，3700r/min，离心15min，后倒置800r/min离心10s取出；
七、变性，上3730测序仪测序：
在上一步测序反应产物纯化后的样本中加10ul去离子甲酰胺，上PCR仪变性，94℃条件下变性2min，4℃保存3min后上3730测序；
八、将测序结果用Chromas软件分析：
李某肥胖6个相关基因的6个SNP分型结果如下表1：
表1
根据表1，通过对肥胖相关基因分型结果，即可提供合理的减肥方案。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种肥胖相关基因的检测方法，其特征在于：具体步骤如下：
一、利用检测者的口腔黏膜细胞提取DNA；
二、分别用SEQ NO 1和SEQ NO 2为引物扩增FTO基因SNP rs9939609位点，用SEQ NO 3和SEQ NO 4为引物扩增PPARG基因SNP rs1801282位点，用SEQ NO 5和SEQ NO 6为引物扩增LIPC基因SNP rs1800588位点，用SEQ NO 7和SEQ NO 8为引物扩增ADRB3基因SNP rs4994位点，用SEQ NO 9和SEQ NO 10为引物扩增APOA5基因SNP rs662799位点，用SEQ NO 11和SEQNO 12为引物扩增APOA2基因SNP rs5082位点，以口腔黏膜细胞提取DNA为模板进行PCR反应；
三、将上述6对引物进行普通PCR扩增后PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳；
四、将1％的琼脂糖凝胶电泳目的条带用天跟的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带；
五、进行测序反应；
六、测序反应产物纯化：
测序反应产物中加3ul EDTA和18ul无水乙醇，3700r/min，离心30min，后倒置800r/min离心10s后取出加50ul 80％乙醇，3700r/min，离心15min，后倒置800r/min离心10s取出；
七、变性，上3730测序仪测序：
在上一步测序反应产物纯化后的样本中加10ul去离子甲酰胺，上PCR仪变性，94℃条件下变性2min，4℃保存3min后上3730测序；
八、将测序结果用Chromas软件分析6个SNP基因型。
2.根据权利要求1所述的一种肥胖相关基因的检测方法，其特征在于：所述的步骤一中，采用口腔拭子DNA提取试剂盒对检测者的口腔黏膜细胞提取DNA。
3.根据权利要求1或2所述的一种肥胖相关基因的检测方法，其特征在于：所述的步骤一中，提取的DNA浓度不低于10ng/ul，260/280＝1.9±2。
4.根据权利要求1所述的一种肥胖相关基因的检测方法，其特征在于：所述的步骤二中，PCR反应体系为25uL，其包括:
模板：2uL、SEQ NO 1:1uL、SEQ NO 2：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hotstart taq：0.3ul、去离子水：16.2uL。
模板：2uL、SEQ NO 3:1uL、SEQ NO4：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hotstart taq：0.3ul、去离子水：16.2uL。
模板：2uL、SEQ NO 5:1uL、SEQ NO 6：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hotstart taq：0.3ul、去离子水：16.2uL。
模板：2uL、SEQ NO 7:1uL、SEQ NO 8：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hotstart taq：0.3ul、去离子水：16.2uL。
模板：2uL、SEQ NO 9:1uL、SEQ NO10：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hotstart taq：0.3ul、去离子水：16.2uL。
模板：2uL、SEQ NO 11:1uL、SEQ NO 12：1uL、10×MSP buffer：2.5uL、20mM dNTP：2ul、Hot start taq：0.3ul、去离子水：16.2uL。
5.根据权利要求1或4所述的一种肥胖相关基因的检测方法，其特征在于：所述的步骤二中，PCR反应条件为：
95℃预变性5min后进入循环反应95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共40个循环，之后72℃延伸5min，4℃保存。
6.根据权利要求1所述的一种肥胖相关基因的检测方法，其特征在于：所述的步骤二中，所述的6对引物检测6个SNP位点，具体如下：
针对FTO基因SNP rs9939609的引物组：
SEQ NO 1：TGGTACGCTGCTATGGTTCTAC
SEQ NO 2：AGCCCAAGGATGGTGTTTCT
针对PPARG基因SNP rs1801282的引物组：
SEQ NO 3：CTGTTATGGGTGAAACTCTGGG
SEQ NO 4：AATGAACGCGATAGCAACG
针对LIPC基因SNP rs1800588的引物组：
SEQ NO 5：AGGGCATCTTTGCTTCTTCG
SEQ NO 6：CTGGCTCAGGAAAGTGGTGT
针对ADRB3基因SNP rs4994的引物组：
SEQ NO 7：CCAATACCGCCAACACCAG
SEQ NO 8：TTGGTCATGGTCTGGAGTCTC
针对APOA5基因SNP rs662799的引物组：
SEQ NO 9：TGGAACAAGCAAGGGAAGC
SEQ NO 10：AGGACCAAGAATCGGGAGC
针对APOA2基因SNP rs5082的引物组：
SEQ NO 11：CCCTCTTACCCGACCCTCAT
SEQ NO 12：ATACCTGTCTGTTTACCCACCC 。
7.根据权利要求1所述的一种肥胖相关基因的检测方法，其特征在于：所述的步骤五中，测序反应体系为5ul，如下：引物1uL，胶回收产物为模板和水共3ul，bigdye 1ul。
8.根据权利要求1或7所述的一种肥胖相关基因的检测方法，其特征在于：所述的步骤五中，测序反应条件如下：95℃预变性5min，接着进入循环，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，共25个循环，之后，继续72℃延伸5min，4℃保存。
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- 2017-06-20 CN CN201710469563.9A patent/CN107974496A/zh active Pending
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20180501 |