JP2015524282A - 配列タグを用いた高感度突然変異検出 - Google Patents
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Abstract
Description
術および説明を利用しうる。そのような従来の技術としては、血液細胞のサンプリングおよび分析、核酸のシーケンシングおよび分析などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。以下の本明細書の実施例を参照することにより、好適な技術の特定例を得ることが可能である。しかしながら、もちろん、他の均等な従来の手順を使用することも可能である。そのような従来の技術および説明は、標準的な実験マニュアル、たとえば、ゲノム解析:実験室マニュアルシリーズ(Genome Analysis:A Laboratory Manual Series)、第I〜IV巻、PCRプライマー:実験室マニュアル(PCR Primer:A Laboratory Manual)、および分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(すべてコールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)刊)などに見いだしうる。
および1個のTが測定された場合、その位置でベースコールは行われないであろう。所与の位置で測定されたヌクレオチドの頻度に基づいてベースコールする他のアルゴリズムもまた、本発明の実装形態で使用されうる。特定のシーケンシング化学の性能特性を考慮したこのほかのアルゴリズムもまた、適用されうる(たとえば、塩基組込みバイアス、異なる標識により生成された異なるシグナル、配列コンテキスト因子、または配列リードの初期もしくは後期に塩基が組み込まれるかなどを考慮する)。
とにより、作製されうる。たとえば、zはAまたはCのいずれかであり、かつxはGまたはTのいずれかであり、
[(z)1(z)2…(z)i][(x)1(x)2…(x)j]…
(式中、iおよびjは、同一であっても異なっていてもよく、いずれのホモポリマーセグメントのサイズも制限するように選択される)の配列タグ構造を与えるとしよう。一実施形態では、iおよびjは、1〜6の範囲内である。ヌクレオチドの他のペアが使用されうる他の実施形態では、たとえば、zはAまたはTであり、かつxはGまたはCであり、またはzはAまたはGであり、かつxはTまたはCである。他の選択肢として、z’は4種の天然のヌクレオチドのうち3種の任意の組合せであり、かつx’はヌクレオチドがz’でなければなんでもよいとしよう(たとえば、z’はA、C、またはGであり、かつx’はTである)。これは、以下の配列タグ構造、すなわち、
[(z’)1(z’)2…(z’)i]x’[(z’)1(z’)2…(z’)i]x’…
(式中、iは以上のように選択され、x’の存在は、いかなる望ましくないホモポリマーも終了させる終点として機能する)を与える。
Faham)らの米国特許第7,862,999号明細書、ドルマナック(Drmanac)らの米国特許出願公開第2009/0264299号明細書、チェン(Zheng)らの米国特許第7,862,999号明細書、ランデグレン(Landegren)らの米国特許第8,053,188号明細書、ウンラウ(Unrau)およびジューガウ(Deugau)著、ジーン(Gene)、第145巻、p.163〜169、1994年、チャーチ(Church)の米国特許第5,149,625号明細書など(参照により本明細書に組み込まれる)に開示されている。
12)は、付着反応からのタグ−テンプレートコンジュゲートを含む。
イゲーションにより付着される。そのような固体基材上に修飾タグ−テンプレートコンジュゲートを配設した後、ブリッジ増幅反応を行って、第1のアンプリコン(またはそのサンプル)からタグ−テンプレートコンジュゲートのそれぞれに対応する第2のアンプリコンまたはクラスタを形成する。他のシーケンシング手法では、他の二次増幅スキームを利用しうる。たとえば、ピロシーケンシング(たとえば、454ライフ・サイエンス(454 Life Sciences)により商品化されている)またはpHベースのシーケンシング(たとえば、ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)により商品化されている)などのいくつかのシーケンシング化学では、第1のアンプリコンのメンバータグ−テンプレートコンジュゲートは、後続的にエマルションPCRにより指数関数的に増幅されうる。たとえば、米国特許第8,012,690号明細書、同第7,842,457号明細書、米国特許出願公開第2011/0195459号明細書、同第2011/0195252号明細書など(参照により本明細書に組み込まれる)。したがって、タグ−テンプレートコンジュゲートを線形増幅して第1のアンプリコンを形成する工程に続いて、次の工程、すなわち、(i)タグ−テンプレートコンジュゲートのそれぞれを増幅して、そのようなタグ−テンプレートコンジュゲートのそれぞれに対して第2のアンプリコンを形成する工程と、(ii)第2のアンプリコンのそれぞれでタグ−テンプレートコンジュゲートのそれぞれのヌクレオチド配列を決定して、各第2のアンプリコンに対する配列リードを提供する工程と、を含む、複数の配列リードを生成する工程が行われうる。いくつかの実施形態では、増幅工程は、ブリッジPCRにより行われうる。他の実施形態では、増幅工程は、エマルションPCRにより行われうる。
本発明のいくつかの実施形態では、標的核酸、たとえば、ゲノムDNAの断片に配列タグを付着する方法は、第1のアダプタ(配列タグを含有する)のライゲーションから開始され、続いて環形成を行う。100〜300(または300〜600)塩基長のゲノム断片は、ライゲーションに好適な5’リン酸および3’OH基を生成するDNアーゼ断片化により調製されうる。高複雑性ゲノムDNAは、加熱(変性)および急速冷却により一本鎖(ss)DNAとして調製可能である。DNAは高複雑性であるので、任意の断片に対する相補的配列の局所濃度は、無視しうる。したがって、DNAが主に一本鎖状態である場合、十分な時間をかけて後続の手順を行うことが可能である。ssDNAを使用すると、各ssDNA断片の5’末端および3’末端の極性が異なるので、環形成が有意に単純化される。第1の段階は、各一本鎖ゲノム断片の末端へのアダプタ配列のライゲーションである。すべての可能な配列の組合せがゲノムDNA中に提示されうるので、アダプタは、すべての可能な配列を用いて合成された架橋テンプレート分子を利用して一方の末端にライゲート可能である。これらのオリゴヌクレオチドは、ゲノムDNAと対比して比較的高濃度でありうるので、ゲノム断片の末端に相補的なオリゴヌクレオチド(またはミスマッチを有する相補体)がハイブリダイズしうる。架橋がこのように形成されると、一本鎖ゲノム断片の5’末端がアダプタにライゲート可能になる。
またはその両方により、適宜、単離されうる。
標的核酸が取得されるサンプル(「組織サンプル」として参照されることもある)は、たとえば、腫瘍組織、血液および血漿、リンパ液、脳および脊髄を取り囲む脳脊髄液、骨関節を取り囲む滑液などを含めて、さまざまな組織に由来しうる。一実施形態では、サンプルは、血液サンプルである。血液サンプルは、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、または5.0mLでありうる。サンプルは、腫瘍生検組織でありうる。生検組織は、たとえば、脳、肝臓、肺、心臓、結腸、腎臓、または骨髄の腫瘍に由来しうる。対象からサンプルを単離するために、当業者により使用される任意の生検技術を使用することが可能である。たとえば、生検は、全身麻酔が使用される直視下生検でありうる。生検は、直視下生検よりも小さい切込みが行われる閉鎖生検でありうる。生検は、組織の一部が除去されるコア生検または切開生検でありうる。生検は、全病変を除去する試みがなされる切除生検でありうる。生検は、組織または流体のサンプルが針を用いて取り出される穿刺吸引生検でありうる。
)ら著、カレント・モレキュラー・メディスン(Curr.Mol.Med.)、第10巻、p.142〜165、2010年、スワラップ(Swarup)ら著、FEBSレターズ(FEBS Lett.)、第581巻、p.795〜799、2007年。本発明に係る方法では、分析可能な対象からのRNAまたはDNAの量は、さまざまな変動を含む。本発明に係る方法で使用されるRNAは、組織サンプルから抽出された全RNA、または組織サンプルから直接抽出されたポリA RNA、または組織サンプルから抽出された全RNAから抽出されたポリA RNAのいずれかでありうる。以上の核酸抽出は、たとえば、インビトロジェン(Invitrogen)(カリフォルニア州カールズバッド)、キアゲン(Qiagen)(カリフォルニア州サンディエゴ)などの販売業者から市販されているキットを用いて行われうる。RNAを抽出するための指針は、リートケ(Liedtke)ら著、PCRメソッド・アンド・アプリケーションズ(PCR Methods and Applications)、第4巻、p.185〜187、1994年などの参照文献に見いだされる。
Biotec)、カリフォルニア州オーバーン)などを用いて、本発明に係る方法で使用すべく単離されうる。血液サンプルは、体積が100μL〜10mLの範囲内でありうる。一態様では、血液サンプル体積は、200 100μLから2mLまでの範囲内である。次いで、DNAおよび/またはRNAは、本発明に係る方法に使用すべく、従来技術、たとえば、DNイージー・ブラッド・アンド・ティシュー・キット(DNeasy Blood & Tissue Kit)(キアゲン(Qiagen)、カリフォルニア州バレンシア)を用いて、そのような血液サンプルから抽出されうる。任意選択で、白血球細胞のサブセット、たとえば、リンパ球は、従来技術、たとえば、蛍光活性化細胞選別(FACS:fluorescently activated cell sorting)(ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson)、カリフォルニア州サンノゼ)、磁気活性化細胞選別(MACS:magnetically activated cell sorting)(ミルテニ・バイオテク(Miltenyi Biotec)、カリフォルニア州オーバーン)を用いて、さらに単離されうる。
核酸の配列決定を行うためのハイスループット技術はいずれも、本発明に係る方法で使用可能である。DNAシーケンシング技術としては、標識されたターミネーターまたはプライマーを用いた伝統的なジデオキシシーケンシング反応(サンガー法)およびスラブまたはキャピラリーゲル分離、可逆的末端標識ヌクレオチドを用いたシーケンシングバイシンセシス、ピロシーケンシング、454シーケンシング、シーケンシングバイシンセシス、重合工程時の標識ヌクレオチドの組込みのリアルタイムモニタリング、ポロニーシーケンシング、SOLiDシーケンシングなどが挙げられる。本発明のいくつかの実施形態では、固体表面上に個々の分子を空間的に分離する工程を含む高スループットシーケンシング方法が利用される。この場合、パラレルに配列決定される。そのような固体表面としては、非多孔性表面(たとえば、ソレキサ(Solexa)シーケンシング、たとえば、ベントレー(Bentley)ら著、ネイチャー(Nature)、第456巻、p.53〜59、2008年、またはコンプリート・ゲノミクス(Complete Genomics)シーケンシング、たとえば、ドルマナック(Drmanac)ら著、サイエンス
(Science)、第327巻、p.78〜81、2010年)、ビーズまたは粒子に結合されたテンプレートを含みうるウェルのアレイ(たとえば、454、たとえば、マーギュリーズ(Margulies)ら著、ネイチャー(Nature)、第437巻、p.376〜380、2005年、またはイオン・トレント(Ion Torrent)シーケンシング、米国特許出願公開第2010/0137143号明細書または同第2010/0304982号明細書)、マイクロマシン加工膜(たとえば、SMRTシーケンシング、たとえば、エイド(Eid)ら著、サイエンス(Science)、第323巻、p.133〜138、2009年)、またはビーズアレイ(たとえば、SOLiDシーケンシングまたはポロニーシーケンシング、たとえば、キム(Kim)ら著、サイエンス(Science)、第316巻、p.1481〜1414、2007年)が挙げられうる。いくつかの実施形態では、そのような方法は、固体表面上に空間的に分離する前または分離した後のいずれかで、分離分子を増幅することを含む。従来の増幅は、エマルションPCRなどのエマルションベースの増幅またはローリングサークル増幅を含みうる。とくに興味深いのは、ソレキサ(Solexa)ベースのシーケンシングであり、この場合、ベントレー(Bentley)ら著(前掲)および製造業者の説明書(たとえば、TruSeq(商標)サンプル調製キットおよびデータシート(Sample Preparation Kit and Data Sheet)、イルミナ・インコーポレーテッド(Illumina Inc.)、カリフォルニア州サンディエゴ、2010年)ならびにさらに次の参照文献、すなわち、米国特許第6,090,592号明細書、同第6,300,070号明細書、同第7,115,400号明細書、および欧州特許第0972081B1号明細書(参照により組み込まれる)に記載されるように、個々のテンプレート分子は、固体表面上に空間的に分離され、その後、ブリッジPCRによりパラレルに増幅されて別々のクローン集団またはクラスタを形成し、次いで、配列決定される。一実施形態では、固体表面上に配設され増幅された個々の分子は、少なくとも105クラスタ/cm2の密度で、または少なくとも5×105/cm2の密度で、または少なくとも106クラスタ/cm2の密度で、クラスタを形成する。
とくに本明細書に定義されていないかぎり、本明細書で用いられる核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、当該分野の標準的な論文および教科書、たとえば、コーンバーグ(Kornberg)およびベーカ(Baker)著、DNA複製(DNA Replication)、第2版、W.H.フリーマン(W.H.Freeman)、ニューヨーク、1992年、レーニンジャ(Lehninger)著、生化学(Biochemistry)、第2版、ワース・パブリッシャーズ(Worth Publishers)、ニューヨーク、1975年、ストラッチャン(Strachan)およびリード(Read)著、ヒトの分子遺伝学(Human Molecular Genetics)、第2版、ワイリーリス(Wiley−Liss)、ニューヨーク、
1999年、アッバス(Abbas)ら著、細胞分子免疫学(Cellular and
Molecular Immunology)、第6版、サーンダーズ(Saunders)、2007年のものに従う。
ることにより、生成されうる。他の物理的方法は、超音波処理(ソニケーション)および噴霧化処理(ネブライゼーション)を含む。物理的断片化方法と化学的断片化方法との組合せ、たとえば、熱媒介およびイオン媒介の加水分解による断片化を同様に利用しうる。たとえば、サムブルック(Sambrook)ら著、「分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」、第3版、コールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ、2001年(サムブルック(Sambrook)ら著)(参照によりあらゆる目的で本明細書に組み込まれる)を参照されたい。これらの方法は、核酸を選択されたサイズ範囲の断片に消化するように最適化可能である。
GTP、ならびに1.0mM ITPである。プライマー濃度は0.1μΜであり、かつ分子ビーコン濃度は40nMである。酵素ミックスは、375ソルビトール、2.1μg BSA、0.08U RNアーゼH、32U T7 RNAポリメラーゼ、および6.4U AMV逆転写酵素である。反応は、20μLの全反応体積に対して、5μLサンプル、10μL NASBA反応ミックス、および5μL酵素ミックスを含みうる。リアルタイムNASBA反応を行うためのさらなる指針は、参照により組み込まれる次の参照
文献、すなわち、ポルストラ(Polstra)ら著、BMCインフェクシャス・デイージズ(BMC Infectious Diseases)、第2巻、p.18、2002年、レオーネ(Leone)ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research)、第26巻、p.2150〜2155、1998年、グリクセン(Gulliksen)ら著、アナリティカル・ケミストリー(Anal.Chem.)、第76巻、p.9〜14、2004年、ウェウステン(Weusten)ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research)、第30巻、第6号、p.e26、2002年、デイマン(Deiman)ら著、モレキュラー・バイオテクノロジー(Mol. Biotechnol、第20巻、p.163〜179、2002年に開示されている。ネステッドNASBA反応は、ネステッドPCRと同様に行われる。すなわち、第1のNASBA反応のアンプリコンは、新しいプライマーセット(そのうち少なくとも1つは、第1のアンプリコンの内側位置に結合する)を用いる第2のNASBA反応のためのサンプルになる。
1つは、第1のアンプリコンの内側位置に結合する)を用いる第2のPCRのためのサンプルになる。本明細書で用いられる場合、ネステッド増幅反応に関する「一次プライマー」とは、第1のアンプリコンを生成するために使用されるプライマーを意味し、「二次プライマー」とは、第2のアンプリコンまたはネステッドアンプリコンを生成するために使用される1つ以上のプライマーを意味する。「非対称PCR」とは、反応が、主に、標的核酸の2つの鎖の一方が優先的にコピーされる線形増幅であるように、利用される2つのプライマーの一方が大過剰の濃度で存在するPCRを意味する。非対称PCRプライマーの過剰の濃度は、濃度比として表されうる。典型的な比は10〜100の範囲内である。「多重PCR」とは、複数の標的配列(または単一の標的配列および1つ以上の参照配列)が同一の反応混合物中で同時に達成されるPCRを意味する。たとえば、バーナード(Bernard)ら著、アナリティカル・バイオケミストリー(Anal.Biochem.)、第273巻、p.221〜228、1999年(二色リアルタイムPCR)。通常、増幅される各配列に対して異なるプライマーセットが利用される。典型的には、多重PCRにおける標的配列の数は、2〜50、2〜40、2〜30の範囲内である。「定量PCR」とは、サンプル中または試料中の1つ以上の特異的標的配列の存在量を測定するように設計されたPCRを意味する。定量PCRは、そのような標的配列の絶対定量および相対定量の両方を含む。定量測定は、別個にまたは標的配列と一緒にアッセイされうる1つ以上の参照配列または内部標準を用いて行われる。参照配列は、サンプルまたは試料に対して内因性また外因性でありうる。後者の場合、1つ以上のコンペティターテンプレートを含みうる。典型的な内因性参照配列は、次の遺伝子、すなわち、β−アクチン、GAPDH、β2−ミクログロブリン、リボソームRNAなどの転写物のセグメントを含む。定量PCRのための技術は、参照により組み込まれる次の参照文献、すなわち、フリーマン(Freeman)ら著、パイオテクニクス(Biotechniques)、第26巻、p.112−126、1999年、ベッカー−アンドレ(Becker−Andre)ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research)、第17巻、p.9437〜9447、1989年、ジマーマン(Zimmerman)ら著、パイオテクニクス(Biotechniques)、第21巻、p.268〜279、1996年、ディビアッコ(Diviacco)ら著、ジーン(Gene)、第122巻、p.3013〜3020、1992年、ベッカー−アンドレ(Becker−Andre)ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research)、第17巻、p.9437〜9446、1989年などに例証されるように、当業者に周知である。
。特定の状況に対して、たとえば、異なるシーケンシング化学、検出系、ベースコーリングアルゴリズムなどの結果としてコールされる塩基に対して、品質スコアを計算するためのさまざまな方法が当業者に周知である。一般的には、品質スコア値は、適正ベースコーリングの可能性に単調に関連付けられる。たとえば、品質スコアまたはQが10であるということは、塩基が適正にコールされる可能性が90パーセントであることを意味しうる。Qが20であるということは、塩基が適正にコールされる可能性が99パーセントであることを意味しうる。いくつかのシーケンシングプラットフォームでは、とくに、シーケンシングバイシンセシス化学を用いるものでは、平均品質スコアは、配列リードの長さの関数として減少し、結果的に、配列リードの開始時の品質スコアは、配列リードの終了時のものよりも高く、そのような低下は、不完全伸長、キャリーフォワード伸長、テンプレート損失、ポリメラーゼ損失、キャッピング障害、脱保護障害などの現象に起因する。
、ポリヌクレオチドのセットを明確に同定するのに必要とされる識別可能なオリゴヌクレオチドタグの数など、および信頼性のある同定を保証するためにセットのタグがどれくらい異ならなければならないか、たとえば、クロスハイブリダイゼーションからの自由度またはシーケンシングエラーからの誤同定を含めて、いくつかの因子に依存する。一態様では、各配列タグは、それぞれ、2〜36ヌクレオチドまたは4〜30ヌクレオチドまたは8〜20ヌクレオチドまたは6〜10ヌクレオチドの範囲内の長さを有しうる。一態様では、セットの各配列タグが、同一のセットのすべての他のタグと少なくとも2塩基異なる特異ヌクレオチド配列を有する、配列タグのセットが使用される。他の態様では、セットの各タグの配列が、同一のセットのすべての他のタグの配列と少なくとも3塩基異なる、配列タグのセットが使用される。
Claims (9)
- 核酸の配列決定を行う方法であって、
サンプル中の核酸からテンプレートを調製する工程と、
前記テンプレートをサンプリングにより標識してタグ−テンプレートコンジュゲートを形成する工程であって、タグ−テンプレートコンジュゲートの実質的にすべてのテンプレートが、特異配列タグを有する、工程と、
前記タグ−テンプレートコンジュゲートを線形増幅する工程と、
前記線形増幅されたタグ−テンプレートコンジュゲートから複数の配列リードを生成する工程と、
同一の配列タグを有する複数の配列リードの各々の各ヌクレオチド位置における各タイプのヌクレオチドの頻度に基づいて、前記核酸のそれぞれのヌクレオチド配列を決定する工程と、
を含む方法。 - 稀な核酸のヌクレオチド配列を決定する方法であって、
サンプルからの核酸に配列タグを付着してタグ−テンプレートコンジュゲートを形成する工程であって、前記タグ−テンプレートコンジュゲートの実質的にすべての核酸が、特異配列タグを有する、工程と、
前記タグ−テンプレートコンジュゲートを線形増幅する工程と、
前記線形増幅されたタグ−テンプレートコンジュゲートから複数の配列リードを生成する工程と、
同一の配列タグを有する複数の配列リードの各々の各ヌクレオチド位置における各タイプのヌクレオチドの頻度に基づいて、前記核酸のそれぞれのヌクレオチド配列を決定する工程と、
を含む方法。 - 稀な核酸のヌクレオチド配列を決定する方法であって、
サンプルからの核酸に配列タグを付着してタグ−テンプレートコンジュゲートを形成する工程であって、前記タグ−テンプレートコンジュゲートの実質的にすべての核酸が、特異配列タグを有する、工程と、
前記タグ−テンプレートのコピーまたは前記タグ−テンプレートのコピーのコピーのみを含むアンプリコンが形成されるように、前記タグ−テンプレートコンジュゲートを線形増幅する工程と、
前記アンプリコン中の前記タグ−テンプレートコンジュゲートの各コピーに対して複数の配列リードを生成する工程と、
同一の配列タグを有する複数の配列リードの各々の各ヌクレオチド位置における各タイプのヌクレオチドの頻度に基づいて、前記核酸のそれぞれのヌクレオチド配列を決定する工程と、
を含む方法。 - 前記テンプレートまたは前記核酸が一本鎖DNAである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 複数の配列リードを生成する前記工程が、前記タグ−テンプレートコンジュゲートのそれぞれを別々に増幅することと、前記別々に増幅されたタグ−テンプレートコンジュゲートのそれぞれの配列決定を行って前記配列リードを提供することと、を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 別々に増幅する前記工程がブリッジPCRまたはエマルションPCRにより行われる、
請求項5に記載の方法。 - 決定する前記工程が、同一の配列タグを有する複数の配列リードの各々の各ヌクレオチド位置における複数のヌクレオチドを決定することを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド位置のそれぞれにおける前記複数のヌクレオチドは、そのような位置における大多数のヌクレオチドである、請求項7に記載の方法。
- 線形増幅する前記工程が、非対称PCR、NASBA、またはRCAにより行われる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
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