CN107429298B - 供聚合酶连锁反应的引物的设计方法及引物组合 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种供聚合酶连锁反应的引物的设计方法及引物组合，所述设计方法具有：对引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分的局部比对工序；及对包含上述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分的全局比对工序。

Description

供聚合酶连锁反应的引物的设计方法及引物组合
技术领域
本发明涉及一种供聚合酶连锁反应的引物的设计方法及引物组合。
背景技术
近年来，通过下一代测序技术的普及，变得容易担保碱基序列数据的质及量，因此可轻松进行基因分析。通过导入NGS(Next Generation Sequencing：下一代测序)技术，逐渐消除全基因组分析的大部分技术性困难。但是，在人类基因组的情况下，基因组的总碱基长度通常为30亿碱基对以上，较庞大，即使利用NGS技术，进行全基因组分析时，需要相当多的费用及时间。
另一方面，作为用于实现检测基因异常的目的的方法，无法说全基因组分析最适合。这是因为只要分析与基因异常有关的基因区域就足够。另外，与基因异常有关的基因区域包含编码区域及非编码区域双方。因此，作为通过仅扩增需要的特定基因区域，并限定在其碱基序列而进行读段，由此有效且高精度地进行基因分析的技术，普及有PCR(Polymerase Chain Reaction：聚合酶连锁反应)法。尤其，将通过对某一PCR反应系统同时供给多种引物来选择性地扩增多个基因区域的方法称作多重PCR。
然而，通常，通过多重PCR同时扩增的区域的数量无法设为太多。作为其原因之一，可举出通过引物彼此发生反应，生成被称作引物二聚体的多余的扩增产物，变得无法有效地扩增目标基因区域之类的问题。该问题例如在单细胞(单一细胞)分析之类的成为PCR反应的模板的DNA(Deoxyribonucleic acid：脱氧核糖核酸)量极少的情况下较显著。
作为抑制引物二聚体的形成的方法，例如，专利文献1中记载有如下方法，即，将引物的碱基序列分割为稳定区域与可变区域，在稳定区域中配置相同碱基列，在可变区域中仅限定为胞嘧啶(C)、胸苷(T)、鸟嘌呤(G)及腺嘌呤(A)中的如不会相互互补那样的2种碱基，由此对庞大数量的区域施加PCR。并且，专利文献2中记载有如下内容，即，对引物的所有组合，计算表示引物之间的3’末端中的互补性的评分(3’末端的局部比对评分)，并选出引物彼此的互补性较低的引物的组合，由此降低通过多重PCR，不同的目标引物彼此形成引物二聚体的可能性。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2004/081225号
专利文献2：国际公开第2008/004691号
发明内容
发明要解决的技术课题
本发明人进行研究的结果，专利文献1中记载的方法的目的在于，通过提供通用引物，对全基因组区域提供无偏移的扩增方法，仅能将夹在包含特定可变区域的碱基序列的区域作为对象，无法有效地仅选择多个特定区域。并且，如从单一细胞的多重PCR那样的针对极微量的模板DNA的PCR反应中，考虑仅在引物端部进行退火而形成的引物二聚体也较重要，但专利文献2中记载的方法并未考虑到该内容。作为其结果，专利文献1或2中记载的方法中，无法以近来要求的水平仅对基因组上的多个区域有效地进行选择扩增。
因此，本发明的课题在于，提供一种能够选择性且有效地扩增目标基因区域的供聚合酶连锁反应的引物的设计方法。
用于解决技术课题的方法
本发明人为了解决上述课题而反复进行深入研究，其结果，发现如下内容并完成了本发明：对引物二聚体形成性进行评价，对引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含引物的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分，根据所求出的局部比对评分进行第1阶段的选拔，对包含引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分，根据所求出的全局比对评分进行第2阶段的选拔，若采用在第1阶段及第2段階的任一阶段中均被选拔的引物，则可获得能够选择性且有效地扩增目标基因区域的供聚合酶连锁反应的引物组合。
即，本发明为以下的(1)～(3)。
(1)一种供聚合酶连锁反应的引物的设计方法，其具备：
目标区域选择工序，从基因组上的区域选择通过上述聚合酶连锁反应扩增的目标区域；
引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的上述目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增上述目标区域的引物候选的碱基序列；
局部比对工序，对上述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
第1阶段选拔工序，根据在上述局部比对工序中求出的局部比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
全局比对工序，对包含上述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
第2阶段选拔工序，根据在上述全局比对工序中求出的全局比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及
引物采用工序，采用在上述第1阶段选拔工序及上述第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增上述目标区域的引物的碱基序列，
其中，上述局部比对工序及上述第1阶段选拔工序这两个工序在上述全局比对工序及上述第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与上述全局比对工序及上述第2阶段选拔工序这两个工序同时进行。
(2)根据上述(1)所述的供聚合酶连锁反应的引物的设计方法，其具备：
第1目标区域选择工序，从基因组上的区域选择通过上述聚合酶连锁反应扩增的第1目标区域；
第1引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的上述第1目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增上述第1目标区域的引物候选的碱基序列；
第1局部比对工序，对上述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
第一第1阶段选拔工序，根据在上述局部比对工序中求出的局部比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
第1全局比对工序，对包含上述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
第一第2阶段选拔工序，根据在上述全局比对工序中求出的全局比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；
第1引物采用工序，采用在上述第一第1阶段选拔工序及上述第一第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增上述第1目标区域的引物的碱基序列；
第2目标区域选择工序，从基因组上的区域选择通过上述聚合酶连锁反应扩增的第2目标区域；
第2引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的上述第2目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，制作至少各1个用于扩增上述第2目标区域的引物候选的碱基序列；
第2局部比对工序，对用于扩增上述第2目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述引物候选的碱基序列及上述已采用的引物的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
第二第1阶段选拔工序，根据上述局部比对评分，进行用于扩增上述第2目标区域的引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
第2全局比对工序，对包含用于扩增上述第2目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
第二第2阶段选拔工序，根据上述全局比对评分，进行用于扩增上述第2目标区域的引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及
第2引物采用工序，采用在上述第二第1阶段选拔工序及上述第二第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增上述第2目标区域的引物的碱基序列，
其中，上述第1局部比对工序及上述第一第1阶段选拔工序这两个工序在上述第1全局比对工序及上述第一第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与上述第1全局比对工序及上述第一第2阶段选拔工序这两个工序同时进行，且
上述第2局部比对工序及上述第二第1阶段选拔工序这两个工序在上述第2全局比对工序及上述第二第2阶段选拔工序这两个工序之前或之后进行，或与上述第2全局比对工序及上述第二第2阶段选拔工序这两个工序同时进行，
上述目标区域为3处以上时，对所有目标区域反复进行上述第2目标区域选择工序至上述第2引物采用工序的各工序，直至采用用于扩增该目标区域的引物的碱基序列。
(3)一种供聚合酶连锁反应的引物组合，其中，
对各引物的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，求出的局部比对评分小于第1阈值，且
对包含各引物的碱基序列的3’末端的预先设定的碱基数量的碱基序列，以双序列进行全局比对，求出的全局比对评分小于第2阈值。
发明效果
根据本发明，能够提供一种能够选择性且有效地扩增目标基因区域的供聚合酶连锁反应的引物的设计方法。
并且，根据本发明，能够提供一种能够选择性且有效地扩增目标基因区域的供聚合酶连锁反应的引物组合。
附图说明
图1是本发明的引物的设计方法的框图。
图2是表示针对实施例1中的以序列编号1表示的碱基序列与以序列编号2表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图3是表示针对实施例1中的以序列编号1表示的碱基序列与以序列编号3表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图4是表示针对实施例1中的以序列编号1表示的碱基序列与以序列编号4表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图5是表示针对实施例1中的以序列编号1表示的碱基序列与以序列编号5表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图6是表示针对实施例1中的以序列编号1表示的碱基序列与以序列编号6表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图7是表示针对实施例1中的以序列编号1表示的碱基序列与以序列编号7表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图8是表示针对实施例1中的以序列编号1表示的碱基序列与以序列编号8表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图9是表示针对实施例1中的以序列编号2表示的碱基序列与以序列编号3表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图10是表示针对实施例1中的以序列编号2表示的碱基序列与以序列编号4表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图11是表示针对实施例1中的以序列编号2表示的碱基序列与以序列编号5表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图12是表示针对实施例1中的以序列编号2表示的碱基序列与以序列编号6表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图13是表示针对实施例1中的以序列编号2表示的碱基序列与以序列编号7表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图14是表示针对实施例1中的以序列编号2表示的碱基序列与以序列编号8表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图15是表示针对实施例1中的以序列编号3表示的碱基序列与以序列编号4表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图16是表示针对实施例1中的以序列编号3表示的碱基序列与以序列编号5表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图17是表示针对实施例1中的以序列编号3表示的碱基序列与以序列编号6表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图18是表示针对实施例1中的以序列编号3表示的碱基序列与以序列编号7表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图19是表示针对实施例1中的以序列编号3表示的碱基序列与以序列编号8表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图20是表示针对实施例1中的以序列编号4表示的碱基序列与以序列编号5表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图21是表示针对实施例1中的以序列编号4表示的碱基序列与以序列编号6表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图22是表示针对实施例1中的以序列编号4表示的碱基序列与以序列编号7表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图23是表示针对实施例1中的以序列编号4表示的碱基序列与以序列编号8表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图24是表示针对实施例1中的以序列编号5表示的碱基序列与以序列编号6表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图25是表示针对实施例1中的以序列编号5表示的碱基序列与以序列编号7表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图26是表示针对实施例1中的以序列编号5表示的碱基序列与以序列编号8表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图27是表示针对实施例1中的以序列编号6表示的碱基序列与以序列编号7表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图28是表示针对实施例1中的以序列编号6表示的碱基序列与以序列编号8表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图29是表示针对实施例1中的以序列编号7表示的碱基序列与以序列编号8表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图30是表示针对实施例1中的选自以序列编号1～8表示的碱基序列中的任意2个碱基序列的对的3’末端2个碱基的全局比对的图。
图31是表示针对比较例1中的以序列编号9表示的碱基序列与以序列编号10表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图32是表示针对比较例2中的以序列编号11表示的碱基序列与以序列编号12表示的碱基序列的对的局部比对的图。
图33是表示针对比较例2中的以序列编号11表示的碱基序列与以序列编号12表示的碱基序列的对的3’末端2个碱基的全局比对的图。
具体实施方式
首先，对本发明比以往技术有利的点进行说明。
作为本发明相对于专利文献1中记载的以往技术的有利点，可举出以下方面，即，专利文献1中记载的技术是欲通过提供通用引物来对全基因组区域提供无偏移的扩增方法的技术，并不是选择性地扩增特定基因区域的技术，而本发明中，能够选择性且有效地扩增目标基因区域。并且，作为本发明相对于专利文献2中记载的以往技术的有利点，可举出以下方面，即，专利文献2中记载的技术是欲通过对整个引物碱基序列进行局部比对来选择整个序列的互补性较低的引物，由此设计不易形成引物二聚体的引物组合的技术，但仅通过降低整个序列的互补性，无法充分防止引物二聚体的形成，而本发明中，利用局部比对降低包含3’末端的整个序列的互补性，并且利用全局比对，以降低3’末端的例如5个核苷酸长度程度以下的极短的一部分序列的互补性的方式制作引物组，因此能够选择性且有效地扩增目标基因区域。
以下，对本发明进行详细说明。
[供聚合酶连锁反应的引物的设计方法(第1方式)]
本发明的供聚合酶连锁反应的引物的设计方法的第1方式为一种供聚合酶连锁反应的引物的设计方法，其具备：
(a)目标区域选择工序，从基因组上的区域选择通过上述聚合酶连锁反应扩增的目标区域；
(b)引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的上述目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增上述目标区域的引物候选的碱基序列；
(c)局部比对工序，对上述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
(d)第1阶段选拔工序，根据在上述(c)局部比对工序中求出的局部比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
(e)全局比对工序，对包含上述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
(f)第2阶段选拔工序，根据在上述(e)全局比对工序中求出的全局比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及
(g)引物采用工序，采用在上述(d)第1阶段选拔工序及上述(f)第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增上述目标区域的引物的碱基序列，
其中，上述局部比对工序及上述第1阶段选拔工序这两个工序在上述全局比对工序及上述第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与上述全局比对工序及上述第2阶段选拔工序这两个工序同时进行。
对本发明的供聚合酶连锁反应的引物的设计方法的第1方式的各工序进行详细说明。
(a)目标区域选择工序
在图1的框图中示为“(第1)目标区域选择工序”。
目标区域选择工序为从基因组上的区域选择通过聚合酶连锁反应扩增的目标区域的工序。
(基因组上的区域)
本发明中，“基因组上的区域”是指存在与基因多态性、单基因疾病、多因子疾病、癌症等相关的部位的基因组DNA上的区域。其中，区域的长度并无特别限定，只要为1个碱基以上即可。
选择目标区域的基因组上的区域可存在于基因区域及非基因区域中的任一区域。其中，基因区域包含存在对蛋白质进行编码的基因、核糖体RNA(Ribonucleic acid：核糖核酸)基因及转移RNA基因等的编码区域、以及分断基因的内含子、转印调节区域、存在5’-前导序列及3’-尾随序列等的非编码区域。并且，非基因区域包含假基因、间隔物、响应元件及复制起点等非重复序列、以及串联重复序列及分散重复序列等重复序列。
基因多态性例如为SNP(Single Nucleotide Polymorphism：单核苷酸多态性)、SNV(Single Nucleotide Variant：单核苷酸变异)、STRP(Short Tandem RepeatPolymorphism：短串联重复序列多态性)、变异、以及插入和/或缺失(indel)等。
单基因疾病为单一基因的异常成为原因而发病的疾病。作为异常，可举出基因本身的缺失或者重复和/或基因内的碱基的取代、插入和/或缺失等。将成为单基因疾病的原因的单基因称作“疾病基因”。
多因子疾病为多个基因干预发病的疾病，有时与SNP的特定组合等相关。从对疾病具有易感性的含义考虑，将这些基因称作“易感性基因”。
癌症为由于基因发生变异而产生的疾病。与其他疾病相同，癌症中也存在遗传性(家族性)癌症，被称作遗传性肿瘤(家族性肿瘤)等。
基因组上的区域的数量并无特别限定。这是因为，基因组上的区域为选择目标区域时的候选目录，即使有数量庞大的目录，也并非必需对其所有目录设计引物。
(目标区域)
目标区域为从上述基因组上的区域作为通过聚合酶连锁反应扩增的对象来选择的区域。其中，选择的目的并不限定于检测与各区域相关的基因多态性、疾病、癌症等，也可以是检测染色体的非整倍性等。并且，选择的目的并不限定于1个，可具有2个以上的目的。
作为目标区域而选择的基因组上的区域的数量根据目的而不同，但只要为1处以上，则并无特别限定，通常优选为3处以上，更优选为5处以上，进一步优选为10处以上。
(聚合酶连锁反应)
本发明中，聚合酶连锁反应(PCR)为利用DNA聚合酶，从模板DNA合成DNA的反应。与细胞内的DNA合成不同，PCR中，为了合成DNA，需要1种以上的被称作引物的寡核苷酸，通常需要2种以上。有时将在1个PCR反应系统中同时使用的引物的组合称作引物组合。
PCR能够轻松地从利用1对引物组合扩增1个区域的简单的系统扩展至利用多对引物组合同时扩增多个区域的复杂的系统(多重PCR)。
PCR的优点在于，能够从如人类的基因组(30亿碱基对)那样的非常庞大的DNA分子中选择性地仅扩增所希望的区域。而且，能够使用极微量的基因组DNA作为模板来获得充分量的所希望的区域的扩增产物。
并且，作为PCR的优点，虽然根据协议而有所不同，但还可举出扩增所需的时间大致为2小时左右，较短这一点。
而且，作为PCR的优点，还可举出工艺简单且能够以全自动的桌面设备进行扩增这一点。
(b)引物候选碱基序列制作工序
图1的框图中示为“(第1)引物候选碱基序列制作工序”。
引物候选碱基序列制作工序为根据基因组上的目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增目标区域的引物候选的碱基序列的工序。
目标区域的附近区域是从目标区域的5’端靠外侧的区域及从目标区域的3’端靠外侧的区域的总称。目标区域的内侧不包含在附近区域中。
附近区域的长度并无特别限定，但优选为能够通过PCR扩展的长度以下，更优选为希望扩增的DNA片段长度的上限以下。尤其，优选为易实施集中选择和/或序列读段的长度。可根据PCR中使用的酶(DNA聚合酶)的种类等适当变更。具体的附近区域的长度优选为20～500个碱基左右，更优选为20～300个碱基左右，进一步优选为20～200个碱基左右，更进一步优选为50～200个碱基左右。
并且，制作引物候选的碱基序列时，与在通常的引物的设计方法中注意的方面相同，如引物的长度、GC含量(指所有核酸碱基中的鸟嘌呤(G)及胞嘧啶(C)的合计摩尔百分比。)、Tm值(是双链DNA的50％解离而成为单链DNA的温度。Tm来源于meltingtemperature。)及序列的偏移等。
引物的长度(核苷酸数)并无特别限定，但优选为15mer～45mer，更优选为15mer～35mer，进一步优选为15mer～25mer，更进一步优选为15mer～20mer。若引物的长度在该范围内，则易设计特性及扩增效率优异的引物。
GC含量并无特别限定，但优选为40摩尔％～60摩尔％，更优选为45摩尔％～55摩尔％。若GC含量在该范围内，则不易产生由高级结构引起的特性及扩增效率的下降的问题。
Tm值并无特别限定，但优选在50℃～65℃的范围内，更优选在55℃～65℃的范围内。
Tm值能够利用OLIGO Primer Analysis Software(Molecular Biology Insights公司制造)或Primer3(http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/)等软件计算。
并且，还能够由引物的碱基序列中的A、T、G及C的数量(分别设为nA、nT、nG及nC)，根据下述式通过计算来求出。
Tm值(℃)＝2(nA+nT)+4(nC+nG)
Tm值的计算方法并不限定于此，能够通过以往公知的各种方法计算Tm值。
引物候选的碱基序列优选设为整体上碱基无偏移的序列。例如，优选避免局部富GC的序列及局部富AT的序列。
并且，优选还避免T和/或C的连续(聚嘧啶)以及A和/或G的连续(聚嘌呤)。
而且，优选3’末端碱基序列避免富GC的序列或富AT的序列。优选3’末端碱基为G或C，但并不限定于此。
(特性检查工序)
可根据需要，实施特性检查工序，其根据在上述(b)引物候选碱基序列制作工序中制作的各引物候选的碱基序列相对于各基因组DNA的序列互补性，评价引物候选的碱基序列的特性。
特性的检查中，进行基因组DNA的碱基序列与引物候选的碱基序列的局部比对，局部比对评分小于预先设定的值时，能够评价为该引物候选的碱基序列相对于基因组DNA的互补性较低，特性较高。其中，优选对基因组DNA的互补链也进行局部比对。这是因为引物为单链DNA，而基因组DNA为双链。并且，可代替引物候选的碱基序列，利用与此互补的碱基序列。能够认为互补性是相对于互补链的同源性。
并且，也可将引物候选的碱基序列作为查询序列，对基因组DNA碱基序列数据库进行同源性搜索。作为同源性搜索工具，例如可举出BLAST(Basic Local Alignment SearchTool：基本局部比对搜索工具)(Altschul,S.A.、外4名、“Basic Local Alignment SearchTool”、Journal of Molecular Biology、1990年、10月、第215卷、p.403-410)及FASTA(Pearson,W.R.、外1名、“Improved tools for biological sequence comparison”、美国科学院纪要、美国科学院、1988年、4月、第85卷、p.2444-2448)等。作为进行同源性搜索而得的结果，能够获得局部比对。
评分系统及局部比对评分的阈值均无特别限定，能够根据引物候选的碱基序列的长度和/或PCR条件等适当设定。使用同源性搜索工具时，可使用该同源性搜索工具的默认值。
例如，可考虑作为评分系统，采用互补碱基(匹配)＝+1、非互补碱基(不匹配)＝-1、插入和/或缺失(间隙罚分)＝-3，将阈值设定为+15。
引物候选的碱基序列与基因组DNA上的预想外的位置的碱基序列具有互补性，且特性较低的情况下，利用该碱基序列的引物进行PCR时，有时扩增伪影而非目标区域，因此排除。
(c)局部比对工序
图1的框图中示为“(第1)局部比对工序”。
局部比对工序为如下工序：对包含从在上述(b)引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增目标区域的引物候选的碱基序列提取的2个碱基序列的所有对，在所比较的一部分序列包含所述碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分。
进行局部比对的碱基序列的对的组合可以是允许重复而选择的组合，也可以是不允许重复而选择的组合，但还未评价同一碱基序列的引物之间的引物二聚体形成性时，优选为允许重复而选择的组合。
关于组合的总数量，将在上述(b)引物候选碱基序列制作工序中制作的碱基序列的数量设为m个，允许重复而选择时，为“mH2＝m+1C2＝(m+1)！/2(m-1)！”，不允许重复而选择时，为“mC2＝m(m-1)/2”。
另外，先进行后述的(e)全局比对工序及(f)第2阶段选拔工序这两个工序时，可对在(f)第2阶段选拔工序中选拔的引物候选进行本工序及后述的(d)第1阶段选拔工序。
局部比对为对一部分序列进行的比对，能够局部性地检查互补性较高的部分。
但是，本发明中，与通常对碱基序列进行的局部比对不同，在“所比较的一部分序列包含碱基序列的3’末端”这样的条件下，进行局部比对，以使所比较的一部分序列包含双方的碱基序列的3’末端。而且，本发明中优选如下方式：在“所比较的一部分序列包含碱基序列的3’末端”这样的条件即“仅考虑所比较的一部分序列从其中一个序列的3’末端开始并在另一个序列的3’末端结束的比对”这样的条件下，进行局部比对，以使所比较的一部分序列包含双方的碱基序列的3’末端。
另外，局部比对可插入间隙。间隙表示碱基的插入和/或缺失(indel)。
并且，局部比对中，将在碱基序列对之间碱基为互补性的情况作为一致(匹配)，将非互补性的情况作为不一致(不匹配)。
比对以对匹配、不匹配及插入和/或缺失分别赋予评分，并使合计评分成为最大的方式进行。评分适当设定即可。例如，可如下述表1那样设定评分系统。另外，表1中“-”表示间隙(插入和/或缺失(indel))。
[表1]
表1
Figure BDA0001420562140000141
例如，考虑对以下的表2所示的序列编号1及2的碱基序列进行局部比对。其中，评分系统如表1所示。
[表2]
表2
Figure BDA0001420562140000142
根据序列编号1及2的碱基序列制作表3所示的点阵(Dot matrix)。具体而言，将序列编号1的碱基序列从左至右以从5’至3’的方向排列，将序列编号2的碱基序列从下至上以从5’至3’的方向排列，对碱基为互补性的栅格记入“·”，由此获得表3所示的点阵。
[表3]
表3
Figure BDA0001420562140000151
根据从表3所示的点阵获得以下的表4所示的一部分序列的比对(双序列比对)(参考表3的斜线部分)。
[表4]
表4
Figure BDA0001420562140000152
由于匹配(+1)×2、不匹配(-1)×6、插入和/或缺失(-3)×0，因此局部比对评分为“-4”。
另外，比对(双序列比对)并不仅限于在此例示的点阵法，能够通过动态规划法、词法或其他各种方法获得。
(d)第1阶段选拔工序
在图1的框图中示为“(第一)第1阶段选拔工序”。
第1阶段选拔工序为根据在上述(c)局部比对工序中求出的局部比对评分，进行在上述(b)引物候选碱基序列制作工序中制作的引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔的工序。
预先设定局部比对评分的阈值(第1阈值)。
若局部比对评分小于第1阈值，则判断为这2个碱基序列的对的二聚体形成性较低，进行之后的工序。另一方面，若局部比对评分为第1阈值以上，则判断为这2个碱基序列的对的二聚体形成性较高，对该对不进行之后的工序。
第1阈值并无特别限定，能够适当设定。例如，可根据成为聚合酶连锁反应的模板的基因组DNA的量等PCR条件设定第1阈值。
在此，考虑在上述(c)局部比对工序中示出的例子中将第1阈值设定为“3”的情况。
上面的例子中，局部比对评分为“-3”，小于作为第1阈值的“3”，因此能够判断序列编号1及2的碱基序列的对的二聚体形成性较低。
另外，对在上述(c)局部比对工序中计算出评分的所有对进行本工序。
(e)全局比对工序
在图1的框图中示为“(第1)全局比对工序”。
全局比对工序为如下工序，即，对包含从在上述(b)引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增目标区域的引物候选的碱基序列中提取的2个碱基序列的所有对，对包含引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分。
进行全局比对的碱基序列的对的组合可以是允许重复而选择的组合，也可以是不允许重复而选择的组合，但还未评价在同一碱基序列的引物之间的引物二聚体形成性时，优选为允许重复而选择的组合。
关于组合的总数量，将在上述(b)引物候选碱基序列制作工序中制作的碱基序列的数量设为m个，允许重复而选择时，为“mH2＝m+1C2＝(m+1)！/2(m-1)！”，不允许重复而选择时，为“mC2＝m(m-1)/2”。
另外，先进行上述的(c)局部比对工序及(d)第1阶段选拔工序这两个工序时，可对在(d)第1阶段选拔工序中选拔的引物候选进行本工序及后述的(f)第2阶段选拔工序。
全局比对为对“整个序列”进行的比对，能够检查整个序列的互补性。
但是，在此，“整个序列”为包含引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的整个碱基序列。
另外，全局比对可插入间隙。间隙表示碱基的插入和/或缺失(indel)。
并且，全局比对中，将在碱基序列对之间碱基为互补性的情况作为一致(匹配)，将非互补性的情况作为不一致(不匹配)。
比对以对匹配、不匹配及插入和/或缺失分别赋予评分，并使合计评分成为最大的方式进行。评分适当设定即可。例如，可如上述表1那样设定评分系统。另外，表1中，“-”表示间隙(插入和/或缺失(indel))。
例如，考虑对以下的表5所示的序列编号1及2的碱基序列，对各3’末端的3碱基(大写字母部分。相当于“包含3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列”。)进行全局比对。其中，评分系统如表1所示。
[表5]
表5
Figure BDA0001420562140000171
若以评分成为最大的方式，对序列编号1的碱基序列的3’末端的3个碱基(大写字母部位)及序列编号2的3’末端的3个碱基(大写字母部位)的碱基序列进行全局比对，则能够获得以下的表6所示的比对(双序列比对)。
[表6]
表6
Figure BDA0001420562140000172
由于匹配(+1)×0、不匹配(-1)×3、插入和/或缺失(-3)×0，因此全局比对评分为“-3”。
另外，比对(双序列比对)能够通过点阵法、动态规划法、词法或其他各种方法获得。
(f)第2阶段选拔工序
图1的框图中示为“(第一)第2阶段选拔工序”。
第2阶段选拔工序为根据在上述(e)全局比对工序中求出的全局比对评分，进行在上述(b)引物候选碱基序列制作工序中制作的引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔的工序。
预先设定全局比对评分的阈值(第2阈值)。
若全局比对评分小于第2阈值，则判断为这2个碱基序列的对的二聚体形成性较低，进行之后的工序。另一方面，若全局比对评分为第2阈值以上，则判断为这2个碱基序列的对的二聚体形成性较高，对该对不进行之后的工序。
第2阈值并无特别限定，能够适当设定。例如，可根据成为聚合酶连锁反应的模板的基因组DNA的量等PCR条件设定第2阈值。
另外，能够通过将引物的3’末端至数个碱基的碱基序列设为同一碱基序列，将对包含各引物的碱基序列的3’末端的预先设定的碱基数量的碱基序列，以双序列进行全局比对来求出的全局比对评分设为小于第2阈值。
在此，考虑在上述(e)全局比对工序中示出的例子中将第2阈值设定为“3”的情况。
上面的例子中，全局比对评分为“-3”，小于作为第2阈值的“3”，因此能够判断为序列编号1及2的碱基序列的对的二聚体形成性较低。
另外，对在上述(e)全局比对工序中计算出评分的所有对进行本工序。
上述(c)局部比对工序及上述(d)第1阶段选拔工序这两个工序可在上述(e)全局比对工序及上述(f)第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后实施，或与上述(e)全局比对工序及上述(f)第2阶段选拔工序这两个工序同时进行。
并且，为了减少计算量，优选先实施上述(e)全局比对工序及上述(f)第2阶段选拔工序这两个工序，对通过上述(f)第2阶段选拔工序的组合实施上述(c)局部比对工序及上述(d)第1阶段选拔工序这两个工序。尤其，目标区域的数量越增加，引物候选的碱基序列数量越增加，减少计算量的效果越大，能够实现整个处理的快速化。
这是因为，在上述(e)全局比对工序中对“预先设定的序列长度”这样的较短长度的碱基序列进行全局比对，因此计算量少于在包含3’末端这样的条件下从整个碱基序列发现互补性较高的一部分序列的局部比对评分，能够快速进行处理。另外，通常已知的算法中，已知若为针对相同长度的序列的比对，则全局比对的速度比局部比对快。
(扩增序列长度检查工序)
可根据需要，实施扩增序列长度检查工序，其对在上述(d)第1阶段选拔工序及上述(f)第2阶段选拔工序中判断为引物二聚体形成性较低的引物候选的碱基序列的对，计算基因组DNA或染色体DNA上的引物候选的碱基序列的端部之间的距离，并判断该距离是否在预先设定的范围内。
若碱基序列的端部之间的距离在预先设定的范围内，则能够判断为该引物候选的碱基序列的对能够适当扩增目标区域的可能性较高。引物候选的碱基序列的端部之间的距离并无特别限定，能够根据酶(DNA聚合酶)的种类等PCR条件适当设定。例如，能够设定为100～200个碱基(对)的范围内、120～180个碱基(对)的范围内、140～180个碱基(对)的范围内、140～160个碱基(对)的范围内、160～180个碱基(对)的范围内等各种范围。
(g)引物采用工序
图1的框图中示为“(第1)引物采用工序”。
引物采用工序为采用在上述(d)第1阶段选拔工序及上述(f)第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增上述目标区域的引物的碱基序列的工序。
即，本工序中，采用如下引物候选的碱基序列作为用于扩增目标区域的引物的碱基序列，即，对各引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含该碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对来求出的局部比对评分小于第1阈值，且对包含各引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的碱基数量的碱基序列，以双序列进行全局比对来求出的全局比对评分小于第2阈值。
例如，考虑采用表7所示的序列编号1及2的碱基序列作为用于扩增目标区域的引物的碱基序列。
[表7]
表7
Figure BDA0001420562140000191
如已记载，局部比对评分为“-3”，小于作为第1阈值的“3”。并且，全局比对评分为“-3”，小于作为第2阈值的“3”。
因此，能够采用以序列编号1表示的引物候选的碱基序列及以序列编号2表示的引物候选的碱基序列作为用于扩增目标区域的引物的碱基序列。
[供聚合酶连锁反应的引物的设计方法(第2方式)]
本发明的供聚合酶连锁反应的引物的设计方法的第2方式具备以下工序。
(a1)第1目标区域选择工序，从基因组上的区域选择通过聚合酶连锁反应扩增的第1目标区域；
(b1)第1引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的上述第1目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增上述第1目标区域的引物候选的碱基序列；
(c1)第1局部比对工序，对上述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
(d1)第一第1阶段选拔工序，根据在上述(c1)第1局部比对工序中求出的局部比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
(e1)第1全局比对工序，对包含上述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
(f1)第一第2阶段选拔工序，根据在上述(e1)第1全局比对工序中求出的全局比对评分，进行上述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；
(g1)第1引物采用工序，采用在上述(d1)第一第1阶段选拔工序及上述(f1)第一第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增上述第1目标区域的引物的碱基序列，
且还具备：
(an)第n目标区域选择工序，从基因组上的区域选择通过聚合酶连锁反应扩增的第n目标区域；
(bn)第n引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的上述第n目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增上述第n目标区域的引物候选的碱基序列；
(cn)第n局部比对工序，对用于扩增上述第n目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述引物候选的碱基序列及上述已采用的引物的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
(dn)第n第1阶段选拔工序，根据在上述(cn)第n局部比对工序中求出的局部比对评分，进行用于扩增上述第n目标区域的引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
(en)第n全局比对工序，对包含用于扩增上述第n目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
(fn)第n第2阶段选拔工序，根据在上述(en)第n全局比对工序中求出的全局比对评分，进行用于扩增上述第n目标区域的引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及
(gn)第n引物采用工序，采用在上述(dn)第n第1阶段选拔工序及上述(fn)第n第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增上述第n目标区域的引物的碱基序列。
其中，n为2以上的整数，直至n达到在目的区域选择工序中选择的目的区域的数量，对所有目标区域，反复进行上述(an)第n目标区域选择工序至上述(gn)第n引物采用工序的各工序，直至采用用于扩增其目标区域的引物的碱基序列。
其中，上述(c1)第1局部比对工序及上述(d1)第一第1阶段选拔工序这两个工序可在上述(e1)第1全局比对工序及上述(f1)第一第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与上述(e1)第1全局比对工序及上述(f1)第一第2阶段选拔工序这两个工序同时进行，且上述(cn)第n局部比对工序及上述(dn)第n第1阶段选拔工序这两个工序可在上述(en)第n全局比对工序及上述(fn)第n第2阶段选拔工序这两个工序之前或者之后进行，或与上述(en)第n全局比对工序及上述(fn)第n第2阶段选拔工序这两个工序同时进行。
对本发明的引物的设计方法的第2方式的各工序进行详细说明。
(a1)第1目标区域选择工序
图1的框图中示为“(第1)目标区域选择工序”。
从基因组上的区域选择1个基因区域作为第1目标区域，除此以外与前述的第1方式的“(a)目标区域选择工序”相同。
(b1)第1引物候选碱基序列制作工序
图1的框图中示为“(第1)引物候选碱基序列制作工序”。
制作用于扩增在上述(a1)第1目标区域选择工序中选择的第1目标区域的引物候选的碱基序列，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(b)引物候选碱基序列制作工序”相同。
(特性检查工序)
与本发明的设计方法的第1方式的“特性检查工序”相同。本工序为任意工序，可实施，也可不实施。
(c1)第1局部比对工序
图1的框图中示为“(第1)局部比对工序”。
对在上述(b1)第1引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第1目标区域的引物候选的碱基序列进行局部比对，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(c)局部比对工序”相同。
(d1)第一第1阶段选拔工序
图1的框图中示为“(第一)第1阶段选拔工序”。
根据在上述(c1)第1局部比对工序中求出的局部比对评分，以在上述(b1)第1引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第1目标区域的引物候选的碱基序列作为对象来进行选拔，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(d)第1阶段选拔工序”相同。
(e1)第1全局比对工序
图1的框图中示为“(第1)全局比对工序”。
对在上述(b1)第1引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第1目标区域的引物候选的碱基序列进行全局比对，除此以外与本发明的设计方法的第1方式“(e)全局比对工序”相同。
(f1)第一第2阶段选拔工序
图1的框图中示为“(第一)第2阶段选拔工序”。
根据在上述(e1)第1全局比对工序中求出的全局比对评分，以在上述(b1)第1引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第1目标区域的引物候选的碱基序列作为对象来进行选拔，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(f)第2阶段选拔工序”相同。
与本发明的设计方法的第1方式相同，上述(c1)第1局部比对工序及上述(d1)第一第1阶段选拔工序这两个工序可在上述(e1)第1全局比对工序及上述(f1)第一第2阶段选拔工序这两个工序之前或之后实施，也可与上述(e1)第1全局比对工序及(f1)第一第2阶段选拔工序这两个工序同时实施。
并且，与第1方式相同，为了减少计算量，优选先实施“(e1)第1全局比对工序”及“(f1)第一第2阶段选拔工序”，对通过第一第2阶段选拔工序的组合实施“(c1)第1局部比对工序”及“(d1)第一第1阶段选拔工序”。
(扩增序列长度检查工序)
与第1方式中的“扩增序列长度检查工序”相同。本工序为任意工序，可实施，也可不实施。
(g1)第1引物采用工序
图1的框图中示为“(第1)引物采用工序”。
从在上述(b1)第1引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第1目标区域的引物候选的碱基序列中进行采用，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(g)引物采用工序”相同。
本发明的第2方式中，在设计用于扩增第1目标区域的引物之后，设计用于扩增第n(n为2以上的整数)目标区域的引物。
(an)第n目标区域选择工序
图1的框图中示为“第n目标区域选择工序”。
从基因组上的区域中直到第(n-1)目标区域选择工序还未被选择的区域选择1个基因区域作为第n目标区域，除此以外与前述的第1方式的“(a)目标区域选择工序”相同。
另外，第n目标区域的选择能够与第(n-1)的目标区域的选择同时进行或在之后进行。其中，n为2以上的整数。
(bn)第n引物候选碱基序列制作工序
图1的框图中示为“第n引物候选碱基序列制作工序”。
制作用于扩增在上述(an)第n目标区域选择工序中选择的第n目标区域的引物候选的碱基序列，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(b)引物候选碱基序列制作工序”相同。
(特性检查工序)
与本发明的设计方法的第1方式的“特性检查工序”相同。本工序为任意工序，可实施，也可不实施。
(cn)第n局部比对工序
图1的框图中示为“第n局部比对工序”。
对在上述(bn)第n引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第n目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列进行局部比对，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(c)局部比对工序”相同。
其中，已采用的引物的碱基序列为作为用于扩增第1目标区域至第(n-1)目标区域的各目标区域的引物的碱基序列而采用的所有碱基序列(以下相同)。
(dn)第n第1阶段选拔工序
图1的框图中示为“第n第1阶段选拔工序”。
根据在上述(cn)第n局部比对工序中求出的局部比对评分，以在上述(bn)第n引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第n目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列作为对象来进行选拔，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(d)第1阶段选拔工序”相同。
(en)第n全局比对工序
图1的框图中示为“第n全局比对工序”。
对在上述(bn)第n引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第n目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列进行全局比对，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(e)全局比对工序”相同。
(fn)第n第2阶段选拔工序
图1的框图中示为“第n第2阶段选拔工序”。
根据在上述(en)第n全局比对工序中求出的全局比对评分，以在上述(bn)第n引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第n目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列作为对象来进行选拔，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(f)第2阶段选拔工序”相同。
另外，与本发明的设计方法的第1方式相同，上述(cn)第n局部比对工序及上述(dn)第n第1阶段选拔工序这两个工序可在上述(en)第n全局比对工序及上述(fn)第n第2阶段选拔工序这两个工序之前或之后实施，也可与上述(en)第n全局比对工序及(fn)第n第2阶段选拔工序这两个工序同时进行。
并且，为了减少计算量，优选先实施上述(en)第n全局比对工序及上述(fn)第n第2阶段选拔工序这两个工序，对通过上述(fn)第n第2阶段选拔工序的组合实施上述(cn)第n局部比对工序及上述(dn)第n第1阶段选拔工序这两个工序。尤其，目标区域的数量越增加，引物候选的碱基序列数量越增加，减少计算量的效果越大，能够实现整个处理的快速化。
(扩增序列长度检查工序)
与本发明的设计方法的第1方式的“扩增序列长度检查工序”相同。本工序为任意的工序，可实施，也可不实施。
(gn)第n引物采用工序
图1的框图中示为“第n引物采用工序”。
从在上述(bn)第n引物候选碱基序列制作工序中制作的用于扩增第n目标区域的引物候选的碱基序列中进行采用，除此以外与本发明的设计方法的第1方式的“(g)引物采用工序”相同。
[供聚合酶连锁反应的引物组合]
本发明的供聚合酶连锁反应的引物组合为通过上述的供聚合酶连锁反应的引物的设计方法设计的引物的组合。
即，对各引物的碱基序列，在所比较的一部分序列包含上述碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对来求出的局部比对评分小于第1阈值，且对包含各引物的碱基序列的3’末端的预先设定的碱基数量的碱基序列，以双序列进行全局比对来求出的全局比对评分小于第2阈值。
另外，能够通过将引物的3’末端至数个碱基的碱基序列设为同一碱基序列，使对包含各引物的碱基序列的3’末端的预先设定的碱基数量的碱基序列，以双序列进行全局比对来求出的全局比对评分小于第2阈值。
通过使用本发明，能够进行针对极微量DNA的SNP判定和/或SNV判定。而且，通过将目标区域设定在特定染色体内的任意部位，能够得知每个特定染色体的定量比。由此能够进行产前诊断等的根据单细胞或极微量DNA进行的基因组异常检查。
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例
[实施例1]
(1)目标区域的选择
选择了表8所示的SNP位置作为目标区域。另外，SNP D为由NCBI(National Centerfor Biotechnology Information：美国国家生物信息中心)管理的dbSNP(SingleNucleotide Polymorphism Database：单核苷酸多态性数据库)中使用的识别编号。
[表8]
表8
SNP ID 染色体编号 坐标 烯丙基
rs7981616 13 25265103 A/G
rs2230233 18 29104698 C/T
rs2073370 21 35260481 T/C
rs2379206 X 6995315 C/T
(2)引物候选碱基序列的制作
对所选择的各目标区域，分别制作了表9所示的引物候选碱基序列(序列编号1～8)。其中，“正向引物”是指根据SNP位置的5’侧区域(坐标较小侧的区域)的碱基序列制作的引物，“逆向引物”是指根据SNP位置的3’侧区域(坐标较大侧的区域)的碱基序列(染色体DNA互补链的碱基序列)制作的引物。
[表9]
表9
Figure BDA0001420562140000261
(3)二聚体形成性的评价
为了排除易形成引物二聚体的引物候选碱基序列，进行基于局部比对评分的二聚体形成性的评价，对由此评价为二聚体形成性较低的引物候选碱基序列，进一步进行基于全局比对评分的二聚体形成性的评价，从而获得了二聚体形成性较低的引物候选碱基序列的组合。
a)基于局部比对评分的评价
对以序列编号1～8表示的引物候选碱基序列的所有对(28组)，在所比较的一部分碱基序列包含引物候选碱基序列的3’末端这样的条件(约束条件)下，以双序列进行了局部比对。关于局部比对，利用表10所示的评分系统，在上述约束条件下，使比对评分成为最大。另外，表10中，“-”表示间隙(indel、插入/缺失)。
将局部比对评分的阈值设定为3，使小于3的对通过。
[表10]
表10
Figure BDA0001420562140000271
将所获得的比对示于图2至图29的图中。关于所有组合，局部比对评分小于“3”，评价为二聚体形成性较低。
b)基于全局比对评分的评价
对以序列编号1～8表示的引物候选碱基序列的所有对(28组)，提取自引物候选碱基序列的3’末端的3个碱基，对包含该3个碱基的碱基序列(全部为5’-TGG-3’)进行了全局比对。关于全局比对，利用表10所示的评分矩阵，使比对评分成为最大。将评分的阈值设定为3，使小于3的对通过。另外，表10中，“-”表示间隙(indel、插入/缺失)。
将所获得的比对示于图30。关于所有对，全局比对评分小于“3”，评价为二聚体形成性较低。
(4)引物间距离的评价
根据通过上述“(3)二聚体形成性的评价”获得的二聚体形成性较低的引物候选碱基序列的组合，对用于对各目标区域进行PCR扩增的引物候选的对(序列编号1及2的对、序列编号3及4的对、序列编号5及6的对、以及序列编号7及8的对)的每一个，计算出引物间距离(扩增开始位置至扩增结束位置的长度)。
使引物间距离在160～180个碱基的范围内的对通过。
如表9所示，所有引物候选的对的引物间距离在160～180个碱基的范围内。
(5)引物组合的确定
作为用于通过多重PCR对表1所示的4处SNP位置进行扩增的引物组合，获得了包含以序列编号1～8表示的碱基序列的引物的组合(引物组合)。
该引物组合在将引物二聚体形成性较低且从单细胞提取的极微量的基因组DNA作为模板DNA时，也能够通过多重PCR同时选择性且有效地扩增目标区域。
[比较例1]
(1)引物候选碱基序列的制作
作为引物候选碱基序列，制作了以序列编号9表示的碱基序列及以序列编号10表示的碱基序列的对。
(2)二聚体形成性的评价
将局部比对评分的阈值设定为“3”，“3”以上的对作为二聚体形成性较高的对，不进一步进行二聚体形成性的评价而排除。
对以序列编号9、10表示的碱基序列的对，以与实施例1相同的方法进行了局部比对。
将所获得的比对示于图31。以序列编号9、10表示的碱基序列的对的局部比对评分为“7”，为作为阈值的“3”以上，因此该对作为二聚体形成性较高的对而被排除。
另外，若利用以序列编号9的碱基序列表示的引物与以序列编号10的碱基序列表示的引物，实际进行PCR(Polymerase Chain Reaction：聚合酶连锁反应)，则可形成引物二聚体。通过第1阶段选拔工序，能够防止根据这种高评分的比对获得的二聚体。
[表11]
表11
Figure BDA0001420562140000281
[比较例2]
(1)引物候选碱基序列的制作
作为引物候选碱基序列，制作了以序列编号11表示的碱基序列及以序列编号12表示的碱基序列的对。
(2)二聚体形成性的评价
a)基于局部比对评分的评价
将局部比对评分的阈值设定为“3”，使小于“3”的对通过，进一步进行二聚体形成性的评价。
对以序列编号11、12表示的碱基序列的对，以与实施例1相同的方法进行了局部比对。
将所获得的比对示于图32。以序列编号11、12表示的碱基序列的对的局部比对评分为“-4”，小于作为阈值的“3”，因此对该对进一步进行二聚体形成性的评价。
b)基于全局比对评分的评价
将全局比对评分的阈值设定为“2”，“2”以上的对作为二聚体形成性较高的对，不进一步进行引物的评价而排除。
对以序列编号11、12表示的碱基序列的对，以与实施例1相同的方法进行了全局比对。
将所获得的比对示于图33。针对以序列编号11、12表示的碱基序列的对的3’末端2个碱基的全局比对评分为“2”，为作为阈值的“2”以上，因此该对作为二聚体形成性较高的对而被排除。
如此，有时仅通过引物的3’末端部数个碱基也形成引物二聚体，因此通过除了实施第1阶段选拔工序以外，还实施第2阶段选拔工序，从整个序列来观察时，比对评分较低，但能够防止由仅通过3’末端部数个碱基的退火引起的二聚体形成。
产业上的可利用性
本发明能够提供一种不论在所扩增的基因区域的数量比较少时，还是比较多时，也能够选择性且有效地扩增目标区域的引物组合，而且，在如从单细胞的PCR(PolymeraseChain Reaction：聚合酶连锁反应)扩增那样的将极微量的基因组DNA(Deoxyribonucleicacid：脱氧核糖核酸)作为模板DNA时的PCR中有用，因此能够适用于以基因诊断用途为首的各种利用PCR法的用途中。
序列表
<110> 富士胶片株式会社
<120> 供聚合酶连锁反应的引物的设计方法及引物组合
<130> W-5617PCT
<150> 2015-074299
<151> 2015-03-31
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs7981616
<400> 1
gcttggcctt gggaatgtgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs7981616
<400> 2
ggcaatatgg ccaatgatgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2230233
<400> 3
tttgcagctt gaagggatgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2230233
<400> 4
gagcatctgt ttctatgtgg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2073370
<400> 5
gcctcgaaga gagggaatgg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2073370
<400> 6
gaccacaatc tctcccgtgg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2379206
<400> 7
aggaagatgt ccgggtctgg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SNP id: rs2379206
<400> 8
atccacctgc ggaaacatgg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Comparative example 1
<400> 9
tgcagtcatc ttgctctaca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Comparative example 1
<400> 10
acttgtggga ctgtagagga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Comparative example 2
<400> 11
cccagtcaat ctaagcctcg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Comparative example 2
<400> 12
ggatctcttt ggcaagttcg 20

Claims (2)

1.一种供聚合酶连锁反应的引物的设计方法，其具备：
目标区域选择工序，从基因组上的区域选择通过所述聚合酶连锁反应扩增的目标区域；
引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的所述目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增所述目标区域的引物候选的碱基序列；
局部比对工序，对所述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含所述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
第1阶段选拔工序，根据在所述局部比对工序中求出的局部比对评分，进行所述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
全局比对工序，对包含所述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
第2阶段选拔工序，根据在所述全局比对工序中求出的全局比对评分，进行所述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及
引物采用工序，采用在所述第1阶段选拔工序及所述第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增所述目标区域的引物的碱基序列，
其中，所述局部比对工序及所述第1阶段选拔工序这两个工序在所述全局比对工序及所述第2阶段选拔工序这两个工序之后进行。
2.根据权利要求1所述的供聚合酶连锁反应的引物的设计方法，其具备：
第1目标区域选择工序，从基因组上的区域选择通过所述聚合酶连锁反应扩增的第1目标区域；
第1引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的所述第1目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，分别制作至少各1个用于扩增所述第1目标区域的引物候选的碱基序列；
第1局部比对工序，对所述引物候选的碱基序列，在所比较的一部分序列包含所述引物候选的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
第一第1阶段选拔工序，根据在所述局部比对工序中求出的局部比对评分，进行所述引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
第1全局比对工序，对包含所述引物候选的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
第一第2阶段选拔工序，根据在所述全局比对工序中求出的全局比对评分，进行所述引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；
第1引物采用工序，采用在所述第一第1阶段选拔工序及所述第一第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增所述第1目标区域的引物的碱基序列；
第2目标区域选择工序，从基因组上的区域选择通过所述聚合酶连锁反应扩增的第2目标区域；
第2引物候选碱基序列制作工序，根据基因组上的所述第2目标区域的两端的各附近区域的碱基序列，制作至少各1个用于扩增所述第2目标区域的引物候选的碱基序列；
第2局部比对工序，对用于扩增所述第2目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列，在所比较的一部分序列包含所述引物候选的碱基序列及所述已采用的引物的碱基序列的3’末端这样的条件下，以双序列进行局部比对，从而求出局部比对评分；
第二第1阶段选拔工序，根据所述局部比对评分，进行用于扩增所述第2目标区域的引物候选的碱基序列的第1阶段的选拔；
第2全局比对工序，对包含用于扩增所述第2目标区域的引物候选的碱基序列及已采用的引物的碱基序列的3’末端的预先设定的序列长度的碱基序列，以双序列进行全局比对，从而求出全局比对评分；
第二第2阶段选拔工序，根据所述全局比对评分，进行用于扩增所述第2目标区域的引物候选的碱基序列的第2阶段的选拔；及
第2引物采用工序，采用在所述第二第1阶段选拔工序及所述第二第2阶段选拔工序的任一工序中均被选拔的引物候选的碱基序列作为用于扩增所述第2目标区域的引物的碱基序列，
其中，所述第1局部比对工序及所述第一第1阶段选拔工序这两个工序在所述第1全局比对工序及所述第一第2阶段选拔工序这两个工序之后进行，且
所述第2局部比对工序及所述第二第1阶段选拔工序这两个工序在所述第2全局比对工序及所述第二第2阶段选拔工序这两个工序之后进行，
所述目标区域为3处以上时，对所有目标区域反复进行所述第2目标区域选择工序至所述第2引物采用工序的各工序，直至采用用于扩增该目标区域的引物的碱基序列。
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