JPWO2016159132A1 - ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法およびプライマーセット - Google Patents
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Abstract
Description
(1)ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法であって、
ゲノム上の領域から、上記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
上記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
上記ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う第1段階選抜工程と、
上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
上記グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う第2段階選抜工程と、
上記第1段階選抜工程および上記第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と
を備え、
ここで、上記ローカルアラインメント工程および上記第1段階選抜工程の両工程は、上記グローバルアラインメント工程および上記第2段階選抜工程の両工程よりも先もしくは後に、または上記グローバルアラインメント工程および上記第2段階選抜工程の両工程と並行して行われる、
ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法。
(2)ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法であって、
ゲノム上の領域から、上記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する第1の標的領域を選択する、第1の標的領域選択工程と、
上記第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第1の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第1のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第1のローカルアラインメント工程と、
上記ローカルアラインメント工程において求められたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第1の第1段階選抜工程と、
上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第1のグローバルアラインメント工程と、
上記グローバルアラインメント工程において求められたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第1の第2段階選抜工程と、
上記第1の第1段階選抜工程および上記第1の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第1の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第1のプライマー採用工程と、
ゲノム上の領域から、上記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する第2の標的領域を選択する、第2の標的領域選択工程と、
上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第2の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、少なくとも1つずつ作成する、第2のプライマー候補塩基配列作成工程と、
上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第2のローカルアラインメント工程と、
上記ローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第2の第1段階選抜工程と、
上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第2のグローバルアラインメント工程と、
上記グローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第2の第2段階選抜工程と、
上記第2の第1段階選抜工程および上記第2の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第2のプライマー採用工程と
を備え、
ここで、上記第1のローカルアラインメント工程および上記第1の第1段階選抜工程の両工程は、上記第1のグローバルアラインメント工程および上記第1の第2段階選抜工程の両工程よりも先もしくは後に、または上記第1のグローバルアラインメント工程および上記第1の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、
上記第2のローカルアラインメント工程および上記第2の第1段階選抜工程の両工程は、上記第2のグローバルアラインメント工程および上記第2の第2段階選抜工程の両工程よりも先もしくは後に、または上記第2のグローバルアラインメント工程および上記第2の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、
上記標的領域が3箇所以上である場合は、上記第2の標的領域選択工程から上記第2のプライマー採用工程までの各工程を、すべての標的領域に対して、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す、上記(1)に記載のプライマーの設計方法。
(3)ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットであって、
それぞれのプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメントスコアが第1の閾値未満であり、かつ
それぞれのプライマーの塩基配列の3’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアが第2の閾値未満である、
ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセット。
本発明の特許文献1に記載された従来技術に対する有利な点として、特許文献1に記載の技術は、ユニバーサルなプライマーを提供することで、全ゲノム領域に対して偏りのない増幅手段を提供しようとするものであり、特定の遺伝子領域を選択的に増幅するものではないのに対して、本発明では、目的の遺伝子領域を選択的かつ効率的に増幅することができる点が挙げられる。また、本発明の特許文献2に記載された従来技術に対する有利な点として、特許文献2に記載の技術は、プライマー塩基配列全体についてローカルアライメントを行って、配列全体の相補性が低いプライマーを選択することにより、プライマーダイマーが形成されにくいプライマーセットを設計しようとするものであるが、配列全体の相補性を低くするだけではプライマーダイマーの形成を十分に防止できないのに対して、本発明では、ローカルアライメントを用いて3’末端を含む配列全体の相補性が低くなるようにするとともに、グローバルアライメントを用いて3’末端の、例えば5ヌクレオチド長程度以下のごく短い部分配列の相補性が低くなるようにプライマー群を作成するので、目的の遺伝子領域を選択的かつ効率的に増幅することができる点が挙げられる。
本発明のポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法の第1の態様は、
(a)ゲノム上の領域から、上記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
(b)上記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
(c)上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
(d)上記(c)ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う第1段階選抜工程と、
(e)上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
(f)上記(e)グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う第2段階選抜工程と、
(g)上記(d)第1段階選抜工程および上記(f)第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と
を備え、
ここで、上記ローカルアラインメント工程および上記第1段階選抜工程の両工程は、上記グローバルアラインメント工程および上記第2段階選抜工程の両工程よりも先もしくは後に、または上記グローバルアラインメント工程および上記第2段階選抜工程の両工程と並行して行われる、
ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)標的領域選択工程」として示す。
標的領域選択工程は、ゲノム上の領域から、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する標的領域を選択する工程である。
本発明において「ゲノム上の領域」とは、遺伝子多型、単一遺伝子疾患、多因子疾患、がん等に関係する部位が存在するゲノムDNA上の領域をいう。ここで、領域の長さは特に限定されず、1塩基以上であればよい。
標的領域が選択されるゲノム上の領域は、遺伝子領域および非遺伝子領域のいずれに存在していてもよい。ここで、遺伝子領域は、タンパク質をコードする遺伝子、リボソームRNA(Ribonucleic acid:リボ核酸)遺伝子およびトランスファーRNA遺伝子等が存在するコード領域、ならびに遺伝子を分断するイントロン、転写調節領域、5’−リーダー配列および3’−トレーラー配列等が存在する非コード領域を含む。また、非遺伝子領域は、偽遺伝子、スペーサー、応答エレメントおよび複製開始点などの非繰返し配列、ならびに縦列型反復配列および分散型反復配列などの繰返し配列を含む。
単一遺伝子疾患は、単一の遺伝子の異常が原因となって発症する疾患である。異常としては、遺伝子そのものの欠失もしくは重複、ならびに/または、遺伝子内の塩基の置換、挿入および/もしくは欠失などが挙げられる。単一遺伝子疾患の原因となる単一遺伝子を「責任遺伝子」という。
多因子疾患は、複数の遺伝子が発症に関与する疾患であり、SNPの特定の組合せ等が関係する場合がある。これらの遺伝子を病気に感受性があるという意味で「感受性遺伝子」という。
がんは遺伝子が変異することによって起こる疾患である。他の疾患と同様、がんにも遺伝性(家族性)のがんが存在し、遺伝子腫瘍(家族性腫瘍)などと称される。
標的領域は、上記ゲノム上の領域から、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する対象として選択された領域である。ここで、選択の目的は、各領域に関連する遺伝子多型、疾患、がん等を検出することに限定されるものではなく、染色体の異数性を検出すること等であってもよい。また、選択の目的は1つに限定されず、2以上の目的を有していてもよい。
本発明において、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、DNAポリメラーゼを用いて、鋳型DNAからDNAを合成する反応である。細胞内でのDNA合成とは異なり、PCRでは、DNAを合成するために、プライマーと呼ばれるオリゴヌクレオチドが1種類以上、通常は2種類以上、必要となる。1つのPCR反応系で同時に使用されるプライマーの組合せをプライマーセットという場合がある。
PCRは、1ペアのプライマーセットを用いて1つの領域を増幅する単純な系から、複数ペアのプライマーセットを用いて複数の領域を同時に増幅する複雑な系(マルチプレックスPCR)まで、容易に拡張することができる。
PCRの利点は、ヒトのゲノム(30億塩基対)のような非常に長大なDNA分子の中から、所望の領域だけを選択的に増幅させることができる点にある。しかも、極めて微量のゲノムDNAを鋳型として用いて、所望の領域の増幅産物を十分量得ることができる。
また、PCRの利点としては、プロトコルにもよるが、概ね、増幅に要する時間が2時間程度と短い点も挙げられる。
さらに、PCRの利点としては、プロセスが単純で、全自動の卓上用装置で増幅できる点も挙げられる。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
プライマー候補塩基配列作成工程は、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する工程である。
近傍領域の長さは特に限定されないが、PCRによって伸張可能な長さ以下であることが好ましく、増幅を所望するDNAフラグメント長の上限以下であることがより好ましい。特に、濃縮選択および/またはシーケンスリードがかかりやすい長さであることが好ましい。PCRにおいて用いる酵素(DNAポリメラーゼ)の種類等によって、適宜変更してもよい。具体的な近傍領域の長さは、好ましくは20〜500塩基程度、より好ましくは20〜300塩基程度、さらに好ましくは20〜200塩基程度、いっそう好ましくは50〜200塩基程度である。
Tm値は、OLIGO Primer Analysis Software (Molecular Biology Insights社製)、または Primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/)等のソフトウエアを用いて計算することができる。
また、プライマーの塩基配列中のA、T、GおよびCの数(それぞれ、nA、nT、nGおよびnCとする)から、下記式によって計算により求めることもできる。
Tm値(℃)=2(nA+nT)+4(nC+nG)
Tm値の算出方法はこれらに限定されず、従来公知の種々の方法によってTm値を算出することができる。
また、Tおよび/またはCの連続(ポリピリミジン)、ならびにAおよび/またはGの連続(ポリプリン)も避けることが望ましい。
所望により、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した各プライマー候補の塩基配列のそれぞれのゲノムDNAに対する配列相補性に基づいて、プライマー候補の塩基配列の特異性を評価する特異性チェック工程を実施してもよい。
特異性のチェックは、ゲノムDNAの塩基配列とプライマー候補の塩基配列とのローカルアラインメントを行い、ローカルアラインメントスコアが予め設定した値未満である場合には、そのプライマー候補の塩基配列はゲノムDNAに対する相補性が低く、特異性が高いと評価することができる。ここで、ローカルアラインメントは、ゲノムDNAの相補鎖についても行うことが望ましい。プライマーが1本鎖DNAであるのに対して、ゲノムDNAは2本鎖だからである。また、プライマー候補の塩基配列の代わりに、これと相補的な塩基配列を用いてもよい。相補性は相補鎖に対する相同性と考えることができる。
例えば、スコアリング・システムとして、相補塩基(マッチ)=+1、非相補塩基(ミスマッチ)=−1、挿入および/または欠失(ギャップペナルティ)=−3を採用し、閾値を+15に設定することが考えられる。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)ローカルアラインメント工程」として示す。
ローカルアラインメント工程は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から抽出した2つの塩基配列からなるペアのすべてについて、比較する部分配列が前記塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める工程である。
組合せの総数は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をm個として、重複を許して選択した場合は、「mH2=m+1C2=(m+1)!/2(m−1)!」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「mC2=m(m−1)/2」通りである。
ただし、本発明においては、通常、塩基配列に対して行われているローカルアラインメントとは異なり、「比較する部分配列が塩基配列の3’末端を含む」という条件の下で、ローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の3’末端を含むようにした。さらに、本発明においては、「比較する部分配列が、塩基配列の3’末端を含む」という条件、すなわち、「比較する部分配列が、一方の配列の3’末端から始まり他方の配列の3’末端で終わるアライメントのみを考慮する」という条件、の下でローカルアラインメントを行うこととして、比較する部分配列が両方の塩基配列の3’末端を含むようにする態様が好ましい。
なお、ローカルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および/または欠失(インデル)を意味する。
また、ローカルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致(マッチ)とし、相補的でない場合を不一致(ミスマッチ)とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、下記表1のようにスコアリング・システムを設定してもよい。なお、表1中「−」はギャップ(挿入および/または欠失(インデル))を表す。
なお、アラインメント(ペアワイズアラインメント)は、ここに例示したドットマトリクス法のみならず、動的計画法、ワード法、またはその他種々の方法により得ることができる。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第1段階選抜工程」として示す。
第1段階選抜工程は、上記(c)ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成したプライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う工程である。
ローカルアラインメントスコアが第1の閾値未満であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、ローカルアラインメントスコアが第1の閾値以上であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第1の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムDNAの量などのPCR条件によって、第1の閾値を設定してもよい。
上の例では、ローカルアラインメントスコアは「−3」であり、第1の閾値である「3」未満であったから、配列番号1および2の塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断することができる。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)グローバルアラインメント工程」として示す。
グローバルアラインメント工程は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した、標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から抽出した2つの塩基配列からなるペアのすべてについて、プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める工程である。
組合せの総数は、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成した塩基配列の数をm個として、重複を許して選択した場合は、「mH2=m+1C2=(m+1)!/2(m−1)!」通りであり、重複を許さず選択した場合は、「mC2=m(m−1)/2」通りである。
ただし、ここで、「配列全体」は、プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列の全体である。
なお、グローバルアラインメントは、ギャップを挿入してもよい。ギャップは塩基の挿入および/または欠失(インデル)を意味する。
また、グローバルアラインメントは、塩基配列ペア間で塩基が相補的である場合を一致(マッチ)とし、相補的でない場合を不一致(ミスマッチ)とする。
アラインメントは、マッチ、ミスマッチおよびインデルのそれぞれにスコアを与え、合計スコアが最大となるように行う。スコアは適宜設定すればよい。例えば、上記表1のようにスコアリング・システムを設定してもよい。なお、表1中「−」はギャップ(挿入および/または欠失(インデル))を表す。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第2段階選抜工程」として示す。
第2段階選抜工程は、上記(e)グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記(b)プライマー候補塩基配列作成工程において作成したプライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う工程である。
グローバルアラインメントスコアが第2の閾値未満であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断し、以降の工程を行う。一方、グローバルアラインメントスコアが第2の閾値以上であれば、これらの2つの塩基配列のペアはダイマー形成性が高いと判断し、そのペアについては以降の工程を行わない。
第2の閾値は、特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型となるゲノムDNAの量などのPCR条件によって、第2の閾値を設定してもよい。
上の例では、グローバルアラインメントスコアは「−3」であり、第2の閾値である「3」未満であるから、配列番号1および2の塩基配列のペアはダイマー形成性が低いと判断することができる。
所望により、上記(d)第1段階選抜工程および上記(f)第2段階選抜工程においてプライマーダイマー形成性が低いと判断されたプライマー候補の塩基配列のペアに対して、ゲノムDNAまたは染色体DNA上でのプライマー候補の塩基配列の端部間の距離を計算し、その距離が予め設定した範囲内であるか否かを判断する増幅配列長チェック工程を実施してもよい。
塩基配列の端部間の距離が予め設定した範囲内であれば、そのプライマー候補の塩基配列のペアは、標的領域を適切に増幅できる可能性が高いと判断することができる。プライマー候補の塩基配列の端部間の距離は、特に限定されず、酵素(DNAポリメラーゼ)の種類等のPCR条件によって、適宜設定することができる。例えば、100〜200塩基(対)の範囲内、120〜180塩基(対)の範囲内、140〜180塩基(対)の範囲内、140〜160塩基(対)の範囲内、160〜180塩基(対)の範囲内など、様々な範囲に設定することができる。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー採用工程」として示す。
プライマー採用工程は、上記(d)第1段階選抜工程および上記(f)第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する工程である。
すなわち、本工程では、それぞれのプライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列がその塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメントスコアが第1の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマー候補の塩基配列の3’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアが第2の閾値未満であるプライマー候補の塩基配列を、標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する。
したがって、配列番号1で示されるプライマー候補の塩基配列および配列番号2で示されるプライマー候補の塩基配列を、標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用することができる。
本発明のポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法の第2の態様は、以下の工程を備える。
(a1)ゲノム上の領域から、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する第1の標的領域を選択する、第1の標的領域選択工程と、
(b1)上記第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第1の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第1のプライマー候補塩基配列作成工程と、
(c1)上記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第1のローカルアラインメント工程と、
(d1)上記(c1)第1のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第1の第1段階選抜工程と、
(e1)上記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第1のグローバルアラインメント工程と、
(f1)上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第1の第2段階選抜工程と、
(g1)上記(d1)第1の第1段階選抜工程および上記(f1)第1の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第1の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第1のプライマー採用工程と、
さらに、
(an)ゲノム上の領域から、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する第nの標的領域を選択する第nの標的領域選択工程と、
(bn)上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における上記第nの標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第nのプライマー候補塩基配列作成工程と、
(cn)上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記プライマー候補の塩基配列および上記既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第nのローカルアラインメント工程と、
(dn)上記(cn)第nのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第nの第1段階選抜工程と、
(en)上記第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第nのグローバルアラインメント工程と、
(fn)上記(en)第nのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第nの第2段階選抜工程と、
(gn)上記(dn)第nの第1段階選抜工程および上記(fn)第nの第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、上記第nの標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第nのプライマー採用工程。
ただし、nは2以上の整数であり、nが目的領域選択工程で選択した目的領域の数に到達するまで、上記(an)第nの標的領域選択工程から上記(gn)第nのプライマー採用工程までの各工程をすべての標的領域について、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す。
ここで、上記(c1)第1のローカルアラインメント工程および上記(d1)第1の第1段階選抜工程の両工程は、上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程および上記(f1)第1の第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程および上記(f1)第1の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、上記(cn)第nのローカルアラインメント工程および上記(dn)第nの第1段階選抜工程の両工程は、上記(en)第nのグローバルアラインメント工程および上記(fn)第nの第2段階選抜工程の両工程よりも前もしくは後に、または上記(en)第nのグローバルアラインメント工程および上記(fn)第nの第2段階選抜工程の両工程と並行して行われる。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)標的領域選択工程」として示す。
ゲノム上の領域から1つの遺伝子領域を第1の標的領域として選択する点を除いて、前述した第1の態様の「(a)標的領域選択工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
上記(a1)第1の標的領域選択工程において選択した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(b)プライマー候補塩基配列作成工程」と同様である。
本発明の設計方法の第1の態様の「特異性チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)ローカルアラインメント工程」として示す。
上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてローカルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(c)ローカルアラインメント工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第1段階選抜工程」として示す。
上記(c1)第1のローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(d)第1段階選抜工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)グローバルアラインメント工程」として示す。
上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列についてグローバルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(e)グローバルアラインメント工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)第2段階選抜工程」として示す。
上記(e1)第1のグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(f)第2段階選抜工程」と同様である。
第1の態様における「増幅配列長チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
図1のブロックダイアグラムに「(第1の)プライマー採用工程」として示す。
上記(b1)第1のプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から採用する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(g)プライマー採用工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「第nの標的領域選択工程」として示す。
ゲノム上の領域のうち第(n−1)標的領域選択工程までに選択されていないものから1つの遺伝子領域を第nの標的領域として選択する点を除いて、前述した第1の態様の「(a)標的領域選択工程」と同様である。
なお、第nの標的領域の選択は、第(n−1)の標的領域の選択と同時に、またはその後に、することができる。ここで、nは2以上の整数である。
図1のブロックダイアグラムに「第nのプライマー候補塩基配列作成工程」として示す。
上記(an)第nの標的領域選択工程において選択した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を作成する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(b)プライマー候補塩基配列作成工程」と同様である。
本発明の設計方法の第1の態様の「特異性チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
図1のブロックダイアグラムに「第nのローカルアラインメント工程」として示す。
上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてローカルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(c)ローカルアラインメント工程」と同様である。
ここで、既に採用されたプライマーの塩基配列とは、第1の標的領域から第(n−1)の標的領域までのそれぞれの標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用されたすべての塩基配列である(以下同じ)。
図1のブロックダイアグラムに「第nの第1段階選抜工程」として示す。
上記(cn)第nのローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(d)第1段階選抜工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「第nのグローバルアラインメント工程」として示す。
上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列についてグローバルアラインメントを行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(e)グローバルアラインメント工程」と同様である。
図1のブロックダイアグラムに「第nの第2段階選抜工程」として示す。
上記(en)第nのグローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列を対象に選抜を行う点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(f)第2段階選抜工程」と同様である。
本発明の設計方法の第1の態様の「増幅配列長チェック工程」と同様である。本工程は任意の工程であり、実施してもよいし、実施しなくてもよい。
図1のブロックダイアグラムに「第nのプライマー採用工程」として示す。
上記(bn)第nのプライマー候補塩基配列作成工程において作成した第nの標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列から採用する点を除いて、本発明の設計方法の第1の態様の「(g)プライマー採用工程」と同様である。
本発明のポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットは、上述したポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法によって設計されたプライマーのセットである。
すなわち、それぞれのプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が上記塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメントスコアが第1の閾値未満であり、かつ、それぞれのプライマーの塩基配列の3’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアが第2の閾値未満である。
(1)標的領域の選択
表8に示すSNP位置を標的領域として選択した。なお、SNP IDは、NCBI(National Center for Biotechnology Information:国立生物工学情報センター)が運営するdbSNP(Single Nucleotide Polymorphism Database:一塩基多型データベース)で使用されている識別番号である。
選択した各標的領域に対して、それぞれ、表9に示すプライマー候補塩基配列(配列番号1〜8)を作成した。ここで、「フォワードプライマー」とは、SNP位置の5’側領域(座標が小さい側の領域)の塩基配列に基づいて作成したプライマーをいい、「リバースプライマー」とは、SNP位置の3’側領域(座標が大きい側の領域)の塩基配列(染色体DNA相補鎖の塩基配列)に基づいて作成したプライマーをいう。
プライマーダイマーを形成しやすいプライマー候補塩基配列を排除するため、ローカルアラインメントスコアによるダイマー形成性の評価を行い、それによりダイマー形成性が低いと評価されたプライマー候補塩基配列について、さらに、グローバルアラインメントスコアによるダイマー形成性の評価を行って、ダイマー形成性の低いプライマー候補塩基配列の組合せを得た。
a)ローカルアラインメントスコアによる評価
配列番号1〜8で示されるプライマー候補塩基配列のすべてのペア(28組)について、比較する部分塩基配列が、プライマー候補塩基配列の3’末端を含むという条件(拘束条件)の下にペアワイズでローカルアラインメントを行った。ローカルアラインメントは、表10に示すスコアリング・システムを用いて、上記拘束条件の下でアラインメントスコアが最大となるようにした。なお、表10において、「-」はギャップ(インデル、挿入/欠失)を示す。
ローカルアラインメントスコアの閾値を3に設定し、3未満であるペアをパスさせることとした。
配列番号1〜8で示されるプライマー候補塩基配列のすべてのペア(28組)について、プライマー候補塩基配列の3’末端からの3塩基を抜き出し、その3塩基からなる塩基配列(すべて、5’−TGG−3’)についてグローバルアラインメントを行った。グローバルアラインメントは、表10に示すスコアリング・マトリックスを用いて、アラインメントスコアが最大となるようにした。スコアの閾値を3に設定し、3未満をパスさせることとした。なお、表10において、「-」はギャップ(インデル、挿入/欠失)を示す。
得られたアラインメントを図30に示す。すべてのペアについて、グローバルアラインメントスコアが「3」未満であり、ダイマー形成性が低いと評価された。
上記「(3)ダイマー形成性の評価」によって得られたダイマー形成性の低いプライマー候補塩基配列の組合せから、各標的領域をPCR増幅するためのプライマー候補のペア(配列番号1および2のペア、配列番号3および4のペア、配列番号5および6のペア、ならびに配列番号7および8のペア)のそれぞれについて、プライマー間距離(増幅開始位置から増幅終了位置までの長さ)を算出した。
プライマー間距離が160〜180塩基の範囲内にあるものをパスさせることとした。
表2に示すとおり、すべてのプライマー候補のペアのプライマー間距離は、160〜180塩基の範囲内であった。
表1に示す4箇所のSNP位置をマルチプレックスPCRにより増幅するためのプライマーセットとして、配列番号1〜8で示される塩基配列からなるプライマーのセット(プライマーセット)を得た。
このプライマーセットは、プライマーダイマー形成性が低く、単一細胞から抽出したごく微量のゲノムDNAを鋳型DNAとした場合であっても、マルチプレックスPCRにより、同時に、標的領域を選択的かつ効率的に増幅することができる。
(1)プライマー候補塩基配列の作成
プライマー候補塩基配列として、配列番号9で示される塩基配列および配列番号10で示される塩基配列のペアを作成した。
(2)ダイマー形成性の評価
ローカルアラインメントスコアの閾値を「3」に設定し、「3」以上であるペアはダイマー形成性が高いものとして、さらにダイマー形成性の評価を行わず、排除することとした。
配列番号9、10で示される塩基配列のペアについて、実施例1と同様にして、ローカルアラインメントを行った。
得られたアラインメントを、図31に示す。配列番号9、10で示される塩基配列のペアのローカルアラインメントスコアは「7」であり、閾値である「3」以上であったため、このペアはダイマー形成性が高いものとして排除された。
なお、配列番号9の塩基配列で示されるプライマーと配列番号10の塩基配列で示されるプライマーとを用いて実際にPCR(Polymerase Chain Reaction:ポリメラーゼ連鎖反応)を行うと、プライマーダイマーが形成される。第1段階選抜工程により、こういったハイスコアなアライメントから得られるダイマーを防ぐことができる。
(1)プライマー候補塩基配列の作成
プライマー候補塩基配列として、配列番号11で示される塩基配列および配列番号12で示される塩基配列のペアを作成した。
(2)ダイマー形成性の評価
a)ローカルアラインメントスコアによる評価
ローカルアラインメントスコアの閾値を「3」に設定し、「3」未満であるペアをパスさせ、さらにダイマー形成性の評価を行うこととした。
配列番号11、12で示される塩基配列のペアについて、実施例1と同様にして、ローカルアラインメントを行った。
得られたアラインメントを、図32に示す。配列番号11、12で示される塩基配列のペアのローカルアラインメントスコアは「−4」であり、閾値である「3」未満であったため、このペアには、さらにダイマー形成性の評価を行うこととした。
b)グローバルアラインメントスコアによる評価
グローバルアラインメントスコアの閾値を「2」に設定し、「2」以上であるペアはダイマー形成性が高いものとして、さらにプライマーの評価を行わず、排除することとした。
配列番号11、12で示される塩基配列のペアについて、実施例1と同様にして、グローバルアラインメントを行った。
得られたアラインメントを、図33に示す。配列番号11、12で示される塩基配列のペアの3’末端2塩基についてのグローバルアラインメントスコアは「2」であり、閾値である「2」以上であったため、このペアはダイマー形成性が高いものとして排除された。
このように,プライマーの3’末端部数塩基のみでプライマーダイマーを形成してしまうこともあるため、第1段階選抜工程に加えて、第2段階選抜工程を実施することにより、配列全体から見るとアライメントスコアが低いが、3’末端部数塩基のみでのアニーリングによるダイマー形成を防ぐことができる。
Claims (3)
- ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法であって、
ゲノム上の領域から、前記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する標的領域を選択する標的領域選択工程と、
前記標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における前記標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成するプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が前記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求めるローカルアラインメント工程と、
前記ローカルアラインメント工程において求めたローカルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う第1段階選抜工程と、
前記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求めるグローバルアラインメント工程と、
前記グローバルアラインメント工程において求めたグローバルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う第2段階選抜工程と、
前記第1段階選抜工程および前記第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用するプライマー採用工程と
を備え、
ここで、前記ローカルアラインメント工程および前記第1段階選抜工程の両工程は、前記グローバルアラインメント工程および前記第2段階選抜工程の両工程よりも先もしくは後に、または前記グローバルアラインメント工程および前記第2段階選抜工程の両工程と並行して行われる、
ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法。 - ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーの設計方法であって、
ゲノム上の領域から、前記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する第1の標的領域を選択する、第1の標的領域選択工程と、
前記第1の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における前記第1の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、それぞれ、少なくとも1つずつ作成する、第1のプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記プライマー候補の塩基配列について、比較する部分配列が前記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第1のローカルアラインメント工程と、
前記ローカルアラインメント工程において求められたローカルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第1の第1段階選抜工程と、
前記プライマー候補の塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第1のグローバルアラインメント工程と、
前記グローバルアラインメント工程において求められたグローバルアラインメントスコアに基づいて、前記プライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第1の第2段階選抜工程と、
前記第1の第1段階選抜工程および前記第1の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第1の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第1のプライマー採用工程と、
ゲノム上の領域から、前記ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する第2の標的領域を選択する、第2の標的領域選択工程と、
前記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列を、ゲノム上における前記第2の標的領域の両端のそれぞれの近傍領域の塩基配列に基づいて、少なくとも1つずつ作成する、第2のプライマー候補塩基配列作成工程と、
前記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が前記プライマー候補の塩基配列および前記既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズにローカルアラインメントを行って、ローカルアラインメントスコアを求める、第2のローカルアラインメント工程と、
前記ローカルアラインメントスコアに基づいて、前記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第1段階の選抜を行う、第2の第1段階選抜工程と、
前記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列および既に採用されたプライマーの塩基配列の3’末端を含む、予め設定した配列長の塩基配列について、ペアワイズにグローバルアラインメントを行って、グローバルアラインメントスコアを求める、第2のグローバルアラインメント工程と、
前記グローバルアラインメントスコアに基づいて、前記第2の標的領域を増幅するためのプライマー候補の塩基配列の第2段階の選抜を行う、第2の第2段階選抜工程と、
前記第2の第1段階選抜工程および前記第2の第2段階選抜工程のいずれにおいても選抜されたプライマー候補の塩基配列を、前記第2の標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列として採用する、第2のプライマー採用工程と
を備え、
ここで、前記第1のローカルアラインメント工程および前記第1の第1段階選抜工程の両工程は、前記第1のグローバルアラインメント工程および前記第1の第2段階選抜工程の両工程よりも先もしくは後に、または前記第1のグローバルアラインメント工程および前記第1の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、かつ、
前記第2のローカルアラインメント工程および前記第2の第1段階選抜工程の両工程は、前記第2のグローバルアラインメント工程および前記第2の第2段階選抜工程の両工程よりも先もしくは後に、または前記第2のグローバルアラインメント工程および前記第2の第2段階選抜工程の両工程と並行して行われ、
前記標的領域が3箇所以上である場合は、前記第2の標的領域選択工程から前記第2のプライマー採用工程までの各工程を、すべての標的領域に対して、その標的領域を増幅するためのプライマーの塩基配列が採用されるまで繰り返す、請求項1に記載のプライマーの設計方法。 - ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセットであって、
それぞれのプライマーの塩基配列について、比較する部分配列が前記塩基配列の3’末端を含むという条件の下に、ペアワイズでローカルアラインメントを行って求めたローカルアラインメントスコアが第1の閾値未満であり、かつ
それぞれのプライマーの塩基配列の3’末端を含む予め設定した塩基数の塩基配列について、ペアワイズでグローバルアラインメントを行って求めたグローバルアラインメントスコアが第2の閾値未満である、
ポリメラーゼ連鎖反応に供するプライマーセット。
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