CN1665938B - 检测序列差异的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析核酸样品中单核苷酸差异基因型的方法。更具体地说，本发明提供了鉴别基因组DNA样品中多态性位点或多态性位点组处的核苷酸的方法。该方法使用标签引物延伸，其中一组标签序列对应于多态性位点处的核苷酸。引物延伸产物使用通用的一组标签特异性引物进行PCR扩增，其中下游引物带有可区分标记物。根据大小和/或电荷分离后，在预期大小的产物中检测可区分标记物可以确定多态性位点处的核苷酸。该方法非常适于分析一系列反应物中多处单核苷酸差异的基因型。

Description

检测序列差异的方法
本申请要求享有2002年6月28日提交的、美国临时申请No.60/392,331的优先权，其整体内容包括附图通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及鉴定个体基因组中相对于个体所在群体序列的序列差异的分子遗传学方法。更具体地说，本发明涉及鉴定基因组序列中单核苷酸差异的方法。
发明背景
包含生物有机体基因组的核酸携带有该生物有机体的遗传信息。个体间基因序列的变异导致多种明显表型差异(如头发、皮肤等的颜色)和多种不明显差异(如药物耐受性和疾病敏感性)。即使核苷酸序列中细微的改变，包括单碱基对替换也对蛋白质的质量或数量有显著的影响。单核苷酸改变指单核苷酸多态性或简称SNP，发生SNP的位点在本文中称为多态性位点。DNA多态性定位于整个基因组中，定位在基因之中和基因之间，各种形式会导致或不导致不同的基因功能(通过比较同一序列的两种替代形式的功能而确定)。大多数多态性不改变基因功能，称为“中性”多态性。其他的多态性例如通过改变蛋白质的氨基酸序列，或改变诸如启动子或RNA剪切或降解信号的控制序列而改变基因功能，更通常地称为突变。与SNP相关的疾病包括：镰刀形红细胞贫血病、β-地中海贫血症、糖尿病、囊肿性纤维化、高脂蛋白血症、各种自身免疫性疾病和一些癌症的形成，例如由突变的p53所致的癌症。除了导致或影响疾病状态，点突变还改变对疾病的致病性或易感性，并导致对治疗的耐受性。
检测DNA序列中特定核苷酸改变或突变的能力可用于许多医疗和非医疗目的。鉴定核苷酸改变的方法使得能够筛选并诊断和SNP相关的疾病。在鉴定疾病相关基因的遗传学研究中多态性也是有用的。如果一种多态性改变一个或多个基因的功能，使疾病易感性增加，则与未患病的个体相比，该多态性将更经常存在于患病的个体中。统计学方法可以用来评价患病群体相对于正常群体来说出现多态性的频率，并促进多态性和疾病表型之间因果关系的建立。
能够快速鉴定与疾病相关的序列改变的方法在批准预防措施、评估发病可能性和评价疾病的诊断中是有价值的。例如，SNP的非医疗应用包括微生物或其具体菌株的检测，以及法医检定。
SNP有用性的中心在于根据已知的SNP鉴定个体基因型的能力。已经采取了许多方法来解决该问题。例如，一些多态性意外地导致限制性内切酶切割位点的改变，从而对切割的基因组DNA样品进行电泳分离时可以发现片段模式改变。这是限制性片段长度多态性分析或RFLP分析的基础。RFLP分析的缺点是它只能检测影响限制性内切酶切割位点的改变，且该方法依赖于凝胶电泳和染色，该特点限制其检测量。
还可以使用单链构象多态性(SSCP)分析来检测扩增DNA片段中的SNP。在该方法中，将扩增的片段变性，然后使之在电泳时的非变性聚丙烯酰胺凝胶中重新退火。单核苷酸序列变化的存在会导致相对于野生型序列的构象和电泳迁移率方面的可检测变化。该方法的缺点是依赖于聚丙烯酰胺凝胶电泳。
基于杂交的方法采用等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针(例如参见欧洲专利申请EP-237362和EP-329311)。例如，基于杂交的方法包括在探针RNA：样品DNA双链体中的错配位点进行核糖核酸酶A切割，或对探针DNA：样品DNA双链体中的错配位点进行变性梯度凝胶电泳(在Landegren et.，Science242∶229-237，1988；Rossiter et al.，J.Biol.Chem.265∶12753-12756，1990中作有评论)。
分析SNP基因型的其他方法采用等位基因特异性扩增(例如参见美国专利No.5,521,301；5,639,611和5,981,176)、微测序(mini-sequencing)方法、定量RT-PCT方法(例如所谓的“TaqMan分析”；例如参见授权给Gelfand的美国专利No.5,210,015；授权给Livak等人的美国专利No.5,538,848；和授权给Haaland的美国专利No.5,863,736；以及Heid，C.A.，et al.，Genome Research，6∶986-994(1996)；Gibson，U.E.M，et al.，Genome Research6∶995-1001(1996)；Holland，PM.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88∶7276-7280，(1991)；和Livak，K.J.，et al.，PCR Methods andApplications357-362(1995))和单核苷酸引物延伸(SnuPE)分析(例如美国专利No.5,846,710)及相关的延伸分析(例如美国专利No.6,004,744；5,888,819；5,856,092；5,710,028和6,013,431)。在本领域中需要有改进的SNP基因型分析方法。
大多数SNP基因型分析方法都一定程度上依赖于PCR扩增，以产生用于分析的足够材料(如SSCP分析)，或使一种形式相对于另一种形式差异扩增，以检测差异(如引物延伸分析)。为了增加基于PCR方法的检测量，正致力于放大反应体系，以便在一次反应中可以检测到多种SNP。通过简单地加入对包含多种SNP的片段特异的引物对来放大面临一个问题，导致该问题的原因是引物的相互作用致使靶片段不足量扩增并产生假阳性片段。在本领域中需要有改进的放大SNP基因型分析方法。
已经使用毛细电泳(CE)来验证SNP。一项研究使用了CE对单核苷酸聚合酶延伸分析的结果进行分析(Piggee et al.，1997，J.ChromatographyA.781∶367-375)。在该项研究中，PCR扩增的、含有已知SNP的DNA按照下述方法进行分析：使引物紧靠多态性位点杂交，用单荧光标记的链终止子对引物进行延伸，然后对掺入的探针进行CE分离并检测。在另一项研究中，PCR扩增的、含有已知SNP的DNA用一种或两种相同荧光标记的链终止子进行延伸，然后进行掺入标记物的CE分离和检测。根据寡核苷酸的CE迁移率的序列特异性差异确定掺入的终止子。McClay等(2002，Anal.Biochem.301∶200-206)描述了一种SNP基因型分析方法，包括：使用3’-端碱基不同、具有通用上游引物的一组两种不同荧光标记物的引物进行PCR，然后进行CE和荧光检测。通过将不同大小和电泳特征的扩增产物混合在一起而增加了检测量。
美国专利No.6,074,831教导了根据图论技术同时将分子分离成亚组的CE的用途，和该方法在SNP基因型分析上的应用。
美国专利No.6,322,980描述了在利用聚合酶的外切酶活性使荧光标记物从与多态性位点杂交的引物中释放的SNP检测方法中CE的用途。美国专利No.6,270,973也描述了在涉及核酸探针解聚活性的SNP基因型分析方法中CE的用途。
美国专利No.6,312,893描述了产生带有有机标签的片段的测序方法，其中所述标签和特定的核苷酸相关。所述片段通过CE分离，然后从片段切除标签，通过非荧光分光光度法或电势测定法检测切下的标签。
美国专利No.6,156,178描述了在利用解聚活性从与多态性位点杂交的引物中释放识别性核苷酸的SNP检测方法中CE的用途。
上述方法都没有在引物延伸或扩增步骤中使用核酸序列标签，使用不同的引物进行延伸和扩增，使用通用扩增引物组或进行实时扩增监测和检测。
发明内容
本发明提供了用于分析核酸样品中序列差异基因型的方法。在优选的方面中，该方法可用于确定单核苷酸差异，如单核苷酸多态性。本发明方法包括：对包含异源序列标签的引物延伸产物进行PCR扩增，然后进行毛细电泳大小分离并检测扩增的延伸产物。在一个方面中，实时进行大小分离和产物检测。因为CE分离和检测技术提供包括扩增片段大小和任何给定扩增产物上标记物特性在内的信息，公开的方法非常适于同时分析样品基因型的多种已知SNP。通过扩增带有可区分标记序列标签的截然不同大小的扩增片段，可以检测到每种已知SNP，其中所述序列标签与多态性位点处特定核苷酸的存在特异地相关。根据本发明的方法还具有以下优点，即需要一组扩增引物来检测多种SNP，从而减小与使用多个不同的扩增引物相关的问题所产生的影响。
本发明包括一种鉴别给定核酸样品中已知多态性位点处的核苷酸的方法，该方法包括：a)使从核酸样品产生的引物延伸产物群经历扩增过程，每个引物延伸产物包含一个标签序列，所述标签序列特异对应于已知多态性位点处一个特定核苷酸的存在，其中扩增过程使用一个上游扩增引物和一组可区分标记的下游扩增引物进行，所述下游扩增引物组的每个成员包含引物延伸产物群成员所带有的标签序列和可区分标记物，其中每种可区分标记物特异对应于多态性位点处特定核苷酸的存在；和b)检测可区分标记物向核酸分子中的掺入，从而鉴别多态性位点处的核苷酸。
在一个实施方案中，可区分标记物是荧光标记物。
在另一个实施方案中，步骤(b)包括根据大小和/或电荷分离在扩增过程中生成的核酸分子。在一个优选的实施方案中，分离包括毛细电泳。
在另一个实施方案中，扩增过程包括至少两个扩增反应循环，其中每个循环包括下列步骤：1)核酸链分离；2)寡核苷酸引物退火；和3)退火引物的聚合酶延伸。在一个优选的实施方案中，该方法在扩增过程中和至少一个反应循环之后还包括下列步骤：取出扩增反应的部分样品，根据大小和/或电荷分离核酸分子，并检测可区分标记物的掺入，其中所述检测鉴别多态性位点处的核苷酸。在另一个优选的实施方案中，在扩增过程中的每个循环之后进行取出、分离和检测。在另一个优选实施方案中，分离包括毛细电泳。
在另一个实施方案中，步骤(a)和(b)在包括热循环仪、取样装置、毛细电泳装置和荧光检测仪的模块化设备(modular apparatu)中进行。
在另一个实施方案中，标签序列包含15-40个核苷酸。
在另一个实施方案中，可区分标记的下游扩增引物组由下述引物组成：包含特异对应于多态性位点处A的存在的标签序列的引物；包含特异对应于多态性位点处C的存在的标签序列的引物；包含特异对应于多态性位点处G的存在的标签序列的引物；和包含特异对应于多态性位点处T的存在的标签序列的引物。
在另一个实施方案中，可区分标记的下游扩增引物组由一对寡核苷酸组成，其中一个寡核苷酸包括特异对应于多态性位点处第一个等位基因的标签序列，另一个寡核苷酸包括特异对应于多态性位点处第二个等位基因的标签序列。
另一个实施方案在步骤(a)之前还包括将生成引物延伸产物群时未掺入的引物除去的步骤。在另一个优选的实施方案中，除去引物的步骤包括将生成引物延伸产物群时未掺入的引物降解。在另一个优选的实施方案中，使用热不稳定的外切酶进行降解。在另一个优选的实施方案中，热不稳定的外切酶选自外切酶I和外切酶VII。在另一个优选的实施方案中，热不稳定的外切酶在进行步骤(a)之前热灭活。
本发明还包括一种鉴别给定核酸样品中待测的一组已知多态性位点处的核苷酸的方法，该方法包括：a)使从核酸样品产生的引物延伸产物群经历扩增过程，每个引物延伸产物包含标签序列组的一个成员，所述标签序列特异对应于已知多态性位点处一个特定核苷酸的存在，其中扩增过程使用一个上游扩增引物和一组可区分标记的下游扩增引物进行，所述上游扩增引物用于每个包含待测的已知多态性位点的序列，所述下游扩增引物组的每个成员包含引物延伸产物群成员所带有的标签序列和特异对应于多态性位点处特定核苷酸存在的可区分标记物，其中上游扩增引物的选择应使待测的已知多态性位点组的每个多态性位点对应于截然不同大小的扩增产物；和b)检测可区分标记物向截然不同大小的扩增产物中的掺入，从而鉴别每个多态性位点处的核苷酸。
在一个实施方案中，可区分标记物是荧光标记物。
在另一个实施方案中，步骤(b)包括根据大小和/或电荷分离在扩增过程中生成的核酸分子。在一个优选的实施方案中，分离包括毛细电泳。
在另一个实施方案中，扩增过程包括至少两个扩增反应循环，其中每个循环包括下列步骤：1)核酸链分离；2)寡核苷酸引物退火；和3)退火引物的聚合酶延伸。
一个优选的实施方案在扩增过程中和至少一个反应循环之后还包括下列步骤：取出扩增反应的部分样品，根据大小和/或电荷分离核酸分子，并检测可区分标记物的掺入，其中所述检测鉴别多态性位点处的核苷酸。在另一个优选的实施方案中，在扩增过程中的每个循环之后进行取出、分离和检测。在另一个优选实施方案中，分离包括毛细电泳。
在另一个实施方案中，步骤(a)和(b)在包括热循环仪、取样装置、毛细电泳装置和荧光检测仪的模块化设备中进行。
在另一个实施方案中，标签序列包含15-40个核苷酸。
在另一个实施方案中，可区分标记的下游扩增引物组由下述亚组组成：包含特异对应于多态性位点处A的存在的标签序列的亚组；包含特异对应于多态性位点处C的存在的标签序列的亚组；包含特异对应于多态性位点处G的存在的标签序列的亚组；和包含特异对应于多态性位点处T的存在的标签序列的亚组。
另一个实施方案在步骤(a)之前还包括将生成引物延伸产物群时未掺入的引物除去的步骤。在一个优选的实施方案中，除去引物的步骤包括将生成引物延伸产物群时未掺入的引物降解。在另一个优选的实施方案中，使用热不稳定的外切酶进行降解。在一个优选的实施方案中，热不稳定的外切酶选自外切酶I和外切酶VII。在另一个优选的实施方案中，热不稳定的外切酶在进行步骤(a)之前热灭活。
本发明进一步包括一种鉴别给定核酸样品中待测的一组已知多态性位点处的核苷酸的方法，该方法包括：a)使从核酸样品产生的引物延伸产物群经历扩增过程，每个引物延伸产物包括第一标签序列或其互补物和一组第二标签序列或其互补物的一个成员，第二标签序列或其互补物的存在特异对应于已知多态性位点处一个特定核苷酸的存在，其中对于多态性位点组中的每个多态性位点来说，相对于第一标签序列到包含其他多态性位点的样品分子中一个多态性位点的距离，第一标签序列位于多态性位点5’端的距离处，其中扩增过程使用一个包含第一标签序列的上游扩增引物和一组可区分标记的下游扩增引物进行，下游扩增引物组的每个成员包含引物延伸产物群成员所带有的标签序列和特异对应于多态性位点处特定核苷酸存在的可区分标记物，其中上游扩增引物的选择应使待测的已知多态性位点组中的每个多态性位点对应于截然不同大小的扩增产物；和b)检测可区分标记物向截然不同大小的扩增产物中的掺入，从而确定每个多态性位点处的核苷酸。
在一个实施方案中，可区分标记物是荧光标记物。
在另一个实施方案中，步骤(b)包括根据大小和/或电荷分离在扩增过程中生成的核酸分子。在一个优选的实施方案中，分离包括毛细电泳。
在另一个实施方案中，扩增过程包括至少两个扩增反应循环，其中每个循环包括下列步骤：1)核酸链分离；2)寡核苷酸引物退火；和3)退火引物的聚合酶延伸。一个优选的实施方案在扩增过程中和至少一个反应循环之后还包括下列步骤：取出扩增反应的部分样品，根据大小和/或电荷分离核酸分子，并检测可区分标记物的掺入，其中所述检测鉴别多态性位点处的核苷酸。在另一个优选的实施方案中，在扩增过程中的每个循环之后进行取出、分离和检测。在另一个优选实施方案中，分离包括毛细电泳。
在另一个实施方案中，步骤(a)和(b)在包括热循环仪、取样装置、毛细电泳装置和荧光检测仪的模块化设备中进行。
在另一个实施方案中，标签序列包含15-40个核苷酸。
在另一个实施方案中，可区分标记的下游扩增引物组由下述亚组组成：包含特异对应于多态性位点处A的存在的标签序列的亚组；包含特异对应于多态性位点处C的存在的标签序列的亚组；包含特异对应于多态性位点处G的存在的标签序列的亚组；和包含特异对应于多态性位点处T的存在的标签序列的亚组。
另一个实施方案在步骤(a)之前还包括将生成引物延伸产物群时未掺入的引物除去的步骤。在一个优选的实施方案中，除去引物的步骤包括将生成引物延伸产物群时未掺入的引物降解。在另一个优选的实施方案中，使用热不稳定的外切酶进行降解。在另一个优选的实施方案中，热不稳定的外切酶选自外切酶I和外切酶VII。在另一个优选的实施方案中，热不稳定的外切酶在进行步骤(a)之前热灭活。
本发明还包括一种鉴别已知多态性位点处的单核苷酸的方法，该方法包括：I)提供包含多态性位点的核酸样品；II)分离核酸样品的链，在下列引物的存在下进行重新退火：a)第一寡核苷酸引物，包含与已知多态性位点上游已知距离的序列杂交的3’区域，第一寡核苷酸引物包含位于3’区域5’端的第一序列标签；和b)一组第二寡核苷酸引物，其中所述组的每个成员包含：i)与多态性位点的3’端和附近杂交的区域；ii)可变的3’末端核苷酸，其中当所述成员与已知序列杂交时，3’末端核苷酸和多态性位点相对，并且其中，当且只有当3’末端核苷酸与多态性位点处的核苷酸互补时，3’末端核苷酸才与多态性位点处的核苷酸进行碱基配对；和iii)与(ii)中的可变3’末端核苷酸对应的标签序列，所述标签序列位于所述成员上区域(i)的5’端；III)使步骤(II)所得的退火寡核苷酸在一定条件下和核酸聚合酶接触，所述条件使退火的寡核苷酸延伸，从而生成延伸产物，其中从第一寡核苷酸引物生成的引物延伸产物和其互补物分离时，可以作为模板，用于合成第二寡核苷酸引物组的成员的延伸产物，反之亦然；IV)重复链分离和接触步骤(II)和(III)两次，从而产生核酸分子群，其包含与第一寡核苷酸相同或互补的序列，以及与第二寡核苷酸组的一个成员相同或互补的序列；V)将步骤(IV)中产生的核酸分子群在使未退火的寡核苷酸引物降解的条件下和热不稳定的外切酶接触，使引物降解；VI)热灭活热不稳定的外切酶；VII)使核酸分子群经历扩增过程，其中扩增过程使用包含第一寡核苷酸引物所带有的第一序列标签的上游扩增引物和一组下游扩增引物进行，下游扩增引物组的每个成员包含第二寡核苷酸引物组成员所带有的标签和可区分标记物；和VIII)检测至少一种可区分标记物的掺入，从而鉴别已知多态性位点处的核苷酸。
在一个实施方案中，可区分标记物是荧光标记物。
在另一个实施方案中，步骤(VIII)包括根据大小和/或电荷分离在扩增过程中所生成的核酸分子。在一个优选的实施方案中，分离包括毛细电泳。
在另一个实施方案中，扩增过程包括至少两个扩增反应循环，其中每个循环包括下列步骤：1)核酸链分离；2)寡核苷酸引物退火；和3)退火引物的聚合酶延伸。一个优选的实施方案在扩增过程中和至少一个反应循环之后还包括下列步骤：取出扩增反应的部分样品，根据大小和/或电荷分离核酸分子，并检测可区分标记物的掺入，其中所述检测鉴别多态性位点处的核苷酸。在另一个优选的实施方案中，在扩增过程中的每个循环之后进行取出、分离和检测。
在另一个实施方案中，步骤I-VIII在包括热循环仪、取样装置、毛细电泳装置和荧光检测仪的模块化设备中进行。
在另一个实施方案中，每个标签序列包含15-40个核苷酸。
在另一个实施方案中，与已知多态性位点上游的已知距离序列杂交的3’区域包含10-30个核苷酸。
在另一个实施方案中，与多态性位点的3’端和附近杂交的区域包含10-30个核苷酸。
在另一个实施方案中，可区分标记的下游扩增引物组由下述亚组组成：包含特异对应于多态性位点处A的存在的标签序列的亚组；包含特异对应于多态性位点处C的存在的标签序列的亚组；包含特异对应于多态性位点处G的存在的标签序列的亚组；和包含特异对应于多态性位点处T的存在的标签序列的亚组。
本发明还包括一种鉴别存在于一组已知多态性位点处的单核苷酸的方法，该方法包括：I)提供包含多态性位点组的核酸样品；II)分离核酸样品的链，在下列引物的存在下进行重新退火：a)第一寡核苷酸引物组，每个引物包含与已知多态性位点上游的已知距离序列杂交的3’区域，第一寡核苷酸引物组的每个成员包含位于3’区域5’端的通用序列标签，第一寡核苷酸引物组的每个成员的选择应使对于已知多态性位点组中的每个多态性位点来说产生截然不同大小的扩增产物；和b)下游扩增引物组，以5’至3’的顺序包含：i)序列标签，选自特异对应于引物的3’末端核苷酸G的标签；特异对应于引物的3’末端核苷酸A的标签；特异对应于引物的3’末端核苷酸T的标签；和特异对应于引物的3’末端核苷酸C的标签；ii)与多态性位点组中一个多态性位点附近和3’端的序列特异性杂交的区域，其中下游扩增引物组包含引物亚组，引物亚组包含与多态性位点组中的每个多态性位点附近特异性杂交的区域；和iii)选自G、A、T或C的3’末端核苷酸，其中末端核苷酸特异对应于(i)中所述在下游扩增引物上的序列标签，其中当下游扩增引物与多态性位点附近和3’端的序列杂交时，3’末端核苷酸和多态性位点相对；III)使步骤(II)所得的退火寡核苷酸在一定条件下和核酸聚合酶接触，所述条件使退火的寡核苷酸延伸，从而生成延伸产物，其中从第一寡核苷酸引物生成的引物延伸产物和其互补物分离时，可以作为模板，用于合成第二寡核苷酸引物组的成员的延伸产物，反之亦然；IV)重复链分离和接触步骤(II)和(III)两次，从而产生包含核酸分子群的反应混合物，包含与第一寡核苷酸相同或互补的序列，以及与下游扩增引物组的一个成员相同或互补的序列；V)将步骤(IV)中产生的核酸分子群在使未退火的寡核苷酸引物降解的条件下和热不稳定的外切酶接触，使未退火的引物降解；VI)热灭活热不稳定的外切酶；VII)使核酸分子群经历扩增过程，其中扩增过程使用包含第一寡核苷酸引物所带有的通用序列标签的上游扩增引物和一组下游扩增引物进行，下游扩增引物组的每个成员包含第二寡核苷酸引物组成员所带有的标签和可区分标记物；和VIII)检测至少一个可区分标记物的掺入，从而鉴别已知多态性位点处存在的核苷酸。
在一个实施方案中，可区分标记物是荧光标记物。
在一个实施方案中，步骤(VIII)包括根据大小和/或电荷分离在扩增过程中所生成的核酸分子。在一个优选的实施方案中，分离包括毛细电泳。
在另一个实施方案中，扩增过程包括至少两个扩增反应循环，其中每个循环包括下列步骤：1)核酸链分离；2)寡核苷酸引物退火；和3)退火引物的聚合酶延伸。一个优选的实施方案在扩增过程中和至少一个反应循环之后还包括下列步骤：取出扩增反应的部分样品，根据大小和/或电荷分离核酸分子，并检测可区分标记物的掺入，其中所述检测鉴别多态性位点处的核苷酸。在另一个优选的实施方案中，在扩增过程中的每个循环之后进行取出、分离和检测。
在另一个实施方案中，步骤I-VIII在包括热循环仪、取样装置、毛细电泳装置和荧光检测仪的模块化设备中进行。
在另一个实施方案中，标签序列包含15-40个核苷酸。
在另一个实施方案中，与已知多态性位点上游的已知距离序列杂交的3’区域包含10-30个核苷酸。
在另一个实施方案中，与多态性位点的3’端和附近杂交的区域包含10-30个核苷酸。
在另一个实施方案中，可区分标记的下游扩增引物组由下述亚组组成：包含特异对应于多态性位点处A的存在的标签序列的亚组；包含特异对应于多态性位点处C的存在的标签序列的亚组；包含特异对应于多态性位点处G的存在的标签序列的亚组；和包含特异对应于多态性位点处T的存在的标签序列的亚组。
本发明还包括一种鉴别核酸样品上多态性位点处存在的核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包括一组上游引物，包括：a)第一引物，包含5’标签序列和足以与已知多态性位点上游的已知距离序列特异性杂交的3’序列；和b)4个下游第二引物组成的一组引物，以5’至3’的顺序包含：i)序列标签，选自特异对应于引物的3’末端核苷酸G的标签；特异对应于引物的3’末端核苷酸A的标签；特异对应于引物的3’末端核苷酸T的标签；和特异对应于所述的3’末端核苷酸C的标签；ii)与多态性位点组中一个多态性位点附近和3’端的序列特异性杂交的区域，其中下游扩增引物组包含引物亚组，所述引物亚组包含与多态性位点组中的每个多态性位点附近特异性杂交的区域；和iii)选自G、A、T或C的3’末端核苷酸，其中所述末端核苷酸特异对应于(i)中在下游扩增引物上的序列标签，其中当下游扩增引物与多态性位点附近和3’端的序列杂交时，3’末端核苷酸和多态性位点相对。
一个实施方案还包括5个引物组成的引物组，所述引物缺少对待验证多态性的生物有机体基因组中的基因特异的序列，所述引物包括：含有第一引物的标签序列的一个引物，和四个可区分标记的引物组成的组，其中含有四个下游第二引物组成的组中的标签序列。
本文所用的术语“样品”指从其天然环境中分离、包含多聚核苷酸的生物材料。根据本发明的“样品”可以由纯的或分离的多聚核苷酸组成，或可以包含生物样品如含有多聚核苷酸的组织样品、生物流体样品或细胞样品。生物流体包括血液、血浆、唾液、尿液、脑脊液、灌洗液和leukophoresis样品。本发明的样品可以是包含多聚核苷酸的任何植物、动物、细菌或病毒材料。
本文所用的术语“多态性”指核酸序列变异。当和天然发生的序列相比时，多态性在群体中存在的频率大于0.01％、0.1％、1％或更大。本文所用的多态性可以是插入、缺失、重复或重排。本文所用的“单核苷酸多态性”或“SNP”指单核苷酸残基上的核酸序列变异，包括单核苷酸缺失、插入或碱基改变。多态性，包括SNP，可以是表型上中性的，或者具有和该基因座上显性(predominant)序列所表现的表型相区别的不同表型。本文所用的“中性多态性”指序列变异不改变基因功能的多态性，“突变”或“功能多态性”指改变基因功能并具有相关表型的序列变异。
当指个体的SNP基因型时，“显性等位基因“是在受试群体中最常出现的等位基因(即，当有两个等位基因时，出现超过群体的50％的等位基因是显性等位基因；当有两个以上等位基因时，“显性等位基因”是在受试群体中与该位点的其他等位基因相比以最高频率出现的等位基因，例如频率至少高出5％)。术语“变体等位基因”用来指群体中发生频率比显性等位基因低的一个或多个等位基因(例如，有两个等位基因时，变体等位基因是发生少于受试群体的50％的等位基因；有两个以上的等位基因时，变体等位基因是其发生频率比显性等位基因低，例如至少低5％的等位基因)。
本文所用的术语“多态性位点”指多态性核苷酸序列中在个体间发生变异的核苷酸位置。
本文所用的“寡核苷酸引物”指能够与多聚核苷酸模板退火、提供3’端以生成与多聚核苷酸模板互补的延伸产物的多聚核苷酸分子(即DNA或RNA)。起始和延伸条件通常包括合适缓冲液(“缓冲液”包括作为辅助因子或影响pH、离子强度等的组分(substituent))中四种不同脱氧核苷酸三磷酸和聚合诱导试剂如DNA聚合酶或逆转录酶的存在，以及合适的温度。根据本发明的引物可以是单链或双链的。引物是单链可进行最大效率的扩增，引物和其互补物形成双链多聚核苷酸。本发明中有用的“引物”长度小于或等于100个核苷酸，例如长度小于或等于90、或80、或70、或60、或50、或40、或30、或20、或15个核苷酸，或等于10个核苷酸。
本文所用的术语“聚合酶延伸”指通过核酸聚合酶的、至少一个互补核苷酸向退火引物3’端的依赖于模板的掺入。聚合酶延伸优选加入一个以上的核苷酸，优选最多并包括对应于全长模板的核苷酸。聚合酶延伸的条件随聚合酶的特性而变动。聚合酶延伸的温度根据酶的已知活性特性而定。一般来说，虽然在低于其最佳延伸温度的条件下该酶保留有至少部分的活性，大多数常用的热稳定性聚合酶(如Taq聚合酶和其变体)引发的聚合酶延伸在65℃-75℃进行，优选在约68-72℃进行。
本文所用的术语“引物延伸产物”指由聚合酶延伸方法产生的核酸分子。
本文所用的术语“标签序列”或简称“标签”指通过标准的磷酸二酯键(即标签的3’OH和寡核苷酸的5’磷酸之间的磷酸二酯键)结合到寡核苷酸引物上、使得能够鉴定或跟踪掺入(例如，通过引物延伸的掺入或引物延伸产物的扩增掺入)“标签”的多聚核苷酸的核苷酸序列，优选异源或人工核苷酸序列。根据本发明的“标签”序列将包含至少15个核苷酸，优选20-30个核苷酸，并优选在引物延伸条件下不和进行基因型分析的生物有机体基因组中的序列杂交。根据本发明的标签序列可以但不必须是随机的。
本文所用的术语“特异对应于”指寡核苷酸上的给定核酸标签仅配合给定的3’末端核苷酸使用，从而使该标签序列的存在成为3’末端核苷酸存在的标志。例如，标签序列“1”仅配合3’末端A用在寡核苷酸上，标签序列“2”仅配合3’末端C用在寡核苷酸上，标签序列“3”仅配合3’末端G用在寡核苷酸上，标签序列“4”仅配合3’末端T用在寡核苷酸上。因此，在根据本发明的方法中，如果一个片段用对标签2特异的引物扩增，已知原始引物延伸引物中的3’末端核苷酸为C，则样品中的多态性核苷酸为G。
本文所用的术语“扩增过程”指特异扩增，即增加目的核酸序列的过程。根据本发明的扩增过程包括至少两个，优选至少5、10、15、20、25、30、35个或更多反复循环，其中循环包括下列步骤：1)链分离(如热变性)；2)寡核苷酸引物与模板分子退火；和3)退火引物的核酸聚合酶延伸。这些步骤中的每一个步骤所需的温度和时间是本领域中公知的。使用扩增过程所实现的扩增优选是指数性的，也可以是线性的。根据本发明的一个扩增过程优选在热循环仪中进行，许多热循环仪都是可以购买得到的。
本文所用的术语“组”指核酸样品、引物或其他实体的组。一组将包括已知数目的、至少两个的这种实体。
本文所用的术语“亚组”指包括在本文所限定的组中的组，其中亚组少于组中的每一个成员。本文所用的亚组可以由单个实体组成。
本文所用的术语“上游”和“下游”用来指相对于多态性位点的多聚核苷酸的位置。一般来说，“上游”指多态性位点的5’端，“下游”指多态性位点的3’端。应该理解双链DNA中“上游”和“下游”的选择是非常随意的，这是因为人们可以把注意力集中在任意一条链上，多态性位点“上游”或“下游”的方向随所选择的“参照”链而变化。为了避免任何的不明确性，本文中描述给定方法用到的、用来选择术语“上游”和“下游”的“参照”链在所述方法中始终是相同的。
本文所用的术语“可区分标记的”指一种标记的寡核苷酸引物或其掺入的核酸分子的信号可以和另一种标记引物或核酸分子的信号相区分。例如，可检测标记物可以包括光吸收染料、荧光染料或放射性标记物。荧光染料是优选的。一般来说，如果一种荧光信号和另一种荧光信号的峰发射波长分开有至少20nm，则是可区分的。更大的发射峰间隔是优选的，尤其是当给定反应物中荧光团的发射峰宽、而非窄或更陡峭的峰时更是如此。
本文所用的术语“分离核酸分子”指在大小和/或电荷的基础上物理分离样品或部分样品中核酸分子的过程。电泳分离是优选的，毛细电泳分离是最优选的。
本文所用的“检测掺入”指检测给定的标记寡核苷酸引物是否已经得以延伸并将标记物掺入到引物延伸或扩增产物中的过程。检测可以通过与可检测标记物相容的任何方法进行，但是优选涉及荧光标记物的检测。检测包括确定引物延伸或扩增产物中标记物的存在和量。荧光检测仪是本领域中所熟知的。
本文所用的术语“特异杂交”是指在给定的杂交条件下探针或引物仅和包含靶序列的样品中的靶序列杂交。给定的杂交条件包括在扩增过程中退火步骤的条件，即在预测的Tm的基础上选择的退火温度和适于所选聚合酶的盐条件。
本文所用的术语“链分离”或“分离链”指处理核酸样品，使互补的双链分子分离成可以和寡核苷酸引物退火的两条单链。根据本发明的链分离通过将核酸样品加热到其Tm以上实现。一般来说，对于在适于核酸聚合酶的缓冲液中包含核酸分子的样品来说，加热到94℃足以实现根据本发明的链分离。示例性的缓冲液包含50mMKCl、10mM Tric-HCl(pH8.825℃)、0.5-3mM MgCl2和0.1％BSA。
本文所用的术语“引物退火”或“重新退火”指将寡核苷酸引物与模板核酸链杂交。引物退火的条件随引物的长度和序列而变动，以计算的引物Tm为基础。一般来说，扩增过程中的退火步骤涉及在链分离步骤之后将温度降至以根据引物序列计算的Tm为基础的温度，持续足以实现退火的一段时间。本领域的技术人员可以使用各种现有的算法(例如OligoTM，PrimerDesign和互联网上可获得的程序，包括Primer3和OligoCalculator)容易地预测Tm。对于大多数扩增过程来说，退火温度选择为比预测Tm低约5℃，虽然可以使用Tm附近或之上的温度(例如比预测Tm低1℃-5℃，或比预测Tm高1℃-5℃)，也可以使用比预测Tm低或高5℃以上的温度(例如低6℃、8℃、10℃和高6℃、8℃或10℃)。一般来说，退火温度越接近Tm，退火就越特异。引物退火的时间很大程度上依赖于反应体积，较大的体积需要较长的时间，另外还取决于引物和模板浓度，引物与模板的较高相对浓度与较低的相对浓度相比需要较少的时间。根据体积和相对引物/模板浓度，扩增过程中的引物退火步骤可以是1秒至5分钟，但是通常为10秒至2分钟之间，优选为30秒至2分钟。
本文所用的术语“与已知多态性位点上游的已知距离序列杂交的3’区域”指位于寡核苷酸的3’端、与核酸样品中进行基因型分析的已知多态性位点上游(即5’)的序列特异杂交的核苷酸序列。所述“杂交的3’区域”长度至少为12个核苷酸，优选至少为15、18、21、24、27、30个核苷酸或更多。所述“杂交的区域”选择距离多态性位点已知的距离，从而在根据本发明的方法中产生相对于其他扩增产物的截然不同大小的扩增产物。“已知距离”可以是50-1000个核苷酸，优选50-500个核苷酸，或50-250个核苷酸。
本文所用的术语“与多态性位点的3’端和附近杂交的区域”是长度通常为10至约25个核苷酸、与多态性位点的3’端特异杂交从而使该区域的倒数第二个3’端核苷酸与多态性位点下游的一个核苷酸杂交的寡核苷酸序列。本发明使用包含这种区域的4个引物组成的组，所述组包括具有四个不同3’末端核苷酸G、A、T或C的寡核苷酸，只有其中一个会与多态性位点处的核苷酸杂交，通过核酸聚合酶进行引物延伸。
本文所用的术语“可变的3’末端核苷酸”指寡核苷酸中的3’末端核苷酸，可以是G、A、T或C。
本文所用的术语“和多态性位点相对”指如果3’末端核苷酸与多态性位点处的核苷酸互补的话，核苷酸，即与包含多态性的核酸链杂交的寡核苷酸引物上的3’末端核苷酸的定位将和多态性位置上的核苷酸形成Watson-Crisk氢键碱基对。
本文所用的术语“互补”指四个脱氧核苷酸G、A、T和C之间氢键碱基对形成倾向的层次，A与T配对，G与C配对。
本文所用的术语“核酸聚合酶”指催化依赖于模板的核苷酸三磷酸聚合、形成与模板核酸序列的一个核酸链互补的引物延伸产物的酶。核酸聚合酶在退火引物的3’端启动合成，并向模板5’端的方向继续合成。许多核酸聚合酶是本领域中公知的，可以通过商业途径得到。一组优选的核酸聚合酶是热稳定性的，即它们在经受足以使互补的退火核酸链变性的温度后仍保留有功能。
本文所用的术语“部分样品(aliquot)“指在循环过程中取出的扩增反应物样品。部分样品小于总反应体积，优选为0.1-30％的体积。在本发明的一个实施方案中，对于取出的各部分样品来说，加入包含反应所必需试剂(如缓冲液、盐、核苷酸和聚合酶)的等体积反应缓冲液。
本文所用的术语“使得退火寡核苷酸延伸从而生成延伸产物的条件”指一组条件，例如包括核酸聚合酶能够催化引物延伸的温度、盐与辅助因子浓度、pH和酶浓度。这种条件随所用核酸聚合酶的特性而变动，但是多数有用聚合酶的条件是本领域技术人员所熟知的。示例性的一组条件是50mM KCl、10mM Tric-HCl(pH8.825℃)，0.5-3mM MgCl2、200μM每种dNTP和0.1％BSA，72℃，Taq聚合酶在上述条件下催化引物延伸。
本文所用的术语“实时”指核酸扩增反应中产物积累的测定至少在扩增过程的过程中开始或至少同时开始，优选完成。因此，对于“实时”测定方法来说，至少每部分样品中扩增产物测定或检测的启动是和扩增过程同时进行的。“启动”指部分样品取出并置于分离装置中并开始分离，所述分离装置如毛细电泳毛细管。测定的完成是在从部分样品分离的核酸中检测到标记物质。因为分离和检测时间会超过扩增过程的每个循环时间，扩增产物的检测相对于扩增过程的完成来说会有最长120分钟的滞后。优选这种滞后或延迟少于30分钟，例如25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟或更少，包括无滞后或延迟。
本文所用的术语“毛细电泳”指扩增反应物的部分样品中核酸分子的电泳分离，其中分离在毛细管中进行。可获得的毛细管内径为约10-300μm，长度为约0.2cm-约3m，较优选为0.5cm-20cm，更较优选为0.5cm-10cm。另外，使用微量液体的微毛细管(例如得自Caliper或Agilent Technologies)尤其包括在“毛细电泳”的含义之内。
本文所用的术语“模块化设备”指包括个体单元的设备，其中进行根据本发明的方法中的某些过程。模块化设备的个体单元可以但并非必须物理相连，但优选的是个体单元受中央控制器如计算机的控制。根据本发明有用的模块化设备的实例具有热循环单元、取样器单元和带有荧光检测仪的毛细电泳单元。根据本发明有用的模块化设备包括将样品从循环反应物转移到电泳单元的机器手(robotic arm)。
本文所用的术语“取样装置”指在扩增过程中从扩增产物中取出部分样品的机械装置。根据本发明有用的取样装置优选能尽可能减小循环反应物的污染，例如使用一次取样后就除掉的移液tip头或针，或在每次取样后引入一个或多个洗涤针或tip头的步骤。作为替代方案，取样装置可以使用于毛细电泳的毛细管直接接触扩增反应物，以将部分样品加到毛细管中。作为替代方案，取样装置可以包括与控制阀相连的液体线(fluidic line)(如管)，其中所述控制阀在特定的循环时打开。例如，本领域中公知的取样装置包括多用Robbins Scientific Hydra96移液器，其适于向或从96孔板中取样。这种和其他取样装置易于根据本发明方法使用。
本文所用的术语“机器手”指将样品、包含样品的管或板从一个位置机械转移到另一个位置的装置，优选由微处理器控制。每个位置可以是根据本发明有用的模块设备中的一个单元。根据本发明有用的机器手的一个例子是Mitsubishi RV-E2Robotic Arm。控制机器手的软件通常可从机器手厂商获得。
本文所用的术语“扩增产物”指部分特定多聚核苷酸序列和/或其互补序列的多拷贝多聚核苷酸，核苷酸序列对应于模板多聚核苷酸序列和其互补序列。根据本发明的“扩增产物”可以是DNA或RNA，可以是双链或单链。
本文所用的术语“截然不同大小的扩增产物”指不同大小的扩增产物中可分辨的扩增产物。“不同大小”指长度至少有一个核苷酸差异的核酸分子。一般来说，用于本发明的截然不同大小的扩增产物的差异大于或等于比用在本发明给定方法的分离方法中的分辨限度更多的核苷酸。例如，当分离的分辨限度是一个碱基时，截然不同大小的扩增产物长度至少有一个碱基的不同，但是也可以有2个碱基、5个碱基、10个碱基、20个碱基、50个碱基、100个碱基或更多个碱基的不同。例如，当分辨限度是10个碱基时，截然不同大小的扩增产物将至少有10个碱基的差异，但是也可以有11个碱基、15个碱基、20个碱基、30个碱基、50个碱基、100个碱基或更多个碱基的不同。
本文所用的术语“图谱”或等同术语“扩增曲线”和“扩增图”指所作的数学曲线，其中说明扩增过程的两个或多个步骤中掺入到目的核酸序列中的检测标记信号是所取样品循环数的函数。该图谱优选在毛细电泳分离各反应样品中的核酸后对所检测到的每条带的荧光进行作图而成。大多数商业来源的荧光检测仪都有软件界面，使得根据所检测的信号生成曲线。
能够在一次反应中分析的基因数可以根据产物大小的可测差异(1-2个碱基)和PCR产物的可分离大小(500-1000bp)来估计，可以多达1000，但优选100-200。
本文所用的术语“热不稳定的外切酶“指降解单链核酸分子或特定双链核酸分子上的突出单链、在较高温度下孵育而不可逆灭活的酶。灭活的温度随酶和例如缓冲液条件与酶浓度的不同而变化。酶灭活的条件是本领域的技术人员所公知的。根据本发明有用的热不稳定外切酶的一个非限制性例子是大肠杆菌(E.coli)的外切酶I(ExoI)(例如，可购自New England Biolabs，Beverly MA)。ExoI在80℃孵育20分钟而灭活。
本文所用的术语“基本缺少对生物有机体基因组中基因特异的序列”指当给定引物在引物延伸条件下和待鉴定多态性的生物有机体基因组DNA孵育时不产生引物延伸产物。
附图说明
图1所示为在本发明的一个实施方案中有用的引物延伸反应的示意图。S1和S5是不同的序列标签。
图2所示为在本发明的一个实施方案中有用的扩增过程和检测的示意图。S1和S5是彼此不同、但与图1中的S1至S5相同的标签序列引物。
具体实施方式
本发明提供了根据已知单核苷酸多态性确定核酸样品基因型的方法。本发明的方法采用通过掺入序列标签而同时鉴定SNP群处存在的特定核苷酸的引物延伸反应，然后使用对标签特异的、其中下游引物加以标记的引物组扩增带有标签的片段。在扩增过程中，取出反应物的部分样品，对扩增片段进行大小分离和检测。多态性位点处存在的核苷酸根据结合在扩增片段上的标记物的大小和特性进行鉴定。因为检测扩增物大小和掺入的标记物，该系统非常适于放大。另外，在扩增反应过程中进行分离和检测，扩增反应图实时生成。实时特征提供了快速的分析以及与扩增过程相关的信息，其在例如由引物间的相互作用所致的假阳性信号的鉴定和消除中是有用的。
生成带有序列标签的引物延伸产物
作为第一步骤，本发明需要生成带有序列的引物延伸产物。该步骤的关键点是任何特定延伸产物上的标签特异对应于多态性位点处的核苷酸。在该步骤中，标签通过具有下述通用结构的引物的延伸掺入：
5’-Tagc-靶互补物-Vc-3’
其中“Tagc”是对应于引物3’末端核苷酸的标签序列，“靶互补物”是与已知SNP附近特异杂交的引物3’区域，“Vc”是对应于Tagc序列的3’末端核苷酸。Tagc序列长度优选为20-30个核苷酸，优选在引物延伸条件下不与待分析基因型的生物有机体基因组序列杂交，或不与给定反应中所用的任何其他引物杂交。“靶互补物”足够长，以提供引物和已知SNP附近序列之间的特异杂交，通常长度为约10-25个核苷酸。Vc选自dG、dA、dT和dC，当引物与待测核酸样品杂交时，Vc位置和已知的多态性位点相对。只有当Vc和多态性位点处的核苷酸互补时，Vc才和该位点处的核苷酸进行碱基配对。只有3’末端核苷酸与模板链上的临近核苷酸进行碱基配对时，核酸聚合酶如Taq聚合酶才会使引物延伸，带有与多态性位点相对的已知3’末端核苷酸的引物的延伸鉴别存在于多态性位点处的核苷酸，其为3’末端核苷酸的互补物。
用于鉴定SNP的一组下游引物延伸引物将包括四个不同的标签序列，每个对应于3’末端dG、dA、dT或dC。因此，举例来说，如果标签为标签1-4，标签1将用在终止于3’dG的引物上，标签2将用在终止于3’dA的引物上，标签3将用在终止于3’dT的引物上，标签4将用在终止于3’dC的引物上。本文所公开方法的主要优点是多处SNP的分析中可以使用相同的一组四个下游Tagc序列，因为所得的扩增产物大小不同。这限制了扩增步骤中影响放大扩增的非模板指导的引物间相互作用。
使用带有序列标签的上游引物来生成含给定SNP序列的相对链。这些引物将具有下述通用结构：
5’-Tag-靶互补物-3
其中“Tag”是与下游引物延伸引物组中所用的序列标签不同的序列标签，“靶互补物”指与已知SNP的上游区域互补的序列。上游引物上“Tag”序列长度优选为20-30个核苷酸，优选在引物延伸条件下不与待分析基因型的生物有机体基因组序列杂交，或不与给定反应中所用的任何其他引物杂交。“靶互补物”足够长，以提供引物和已知SNP上游序列之间的特异杂交，通常长度为约10-25个核苷酸。远距离上游通常位于多态性位点上游至少50个核苷酸，但是可以是50-1000个核苷酸或更多，优选50-500，或50-250个核苷酸。上游引物序列到多态性位点的距离决定最终扩增产物的大小或长度。最终扩增产物大小的选择必须超过用于大小分离的系统的分辨限度。因此，如果分离的分辨限度是一个碱基，则扩增产物的大小应该在长度上至少有一个碱基的差异，优选更多(例如，至少5、10、15个碱基或更多)。例如，当分辨限度为10个碱基时，扩增产物的大小应该至少有10个碱基的差异，优选更多(例如，至少15、20、25、30个碱基或更多)。
本文中使用术语“上游”和“下游”以便于说明本发明。但是，应该认识到：由于DNA的双链特征，使用任何一侧，即上游或下游的SNP特异性引物，通过引物和与之相对的一条链的杂交都可以获得多态性。本发明具体考虑了基因组DNA任一链上的SNP问题。
为了根据本发明生成带有序列标签的引物延伸产物，使核酸样品变性，优选通过加热，例如95℃2分钟或更长时间，并在上游延伸引物和针对反应中待测的每个SNP的一组下游延伸引物存在下重新退火。变性和退火最好在与引物延伸反应所用的核酸聚合酶相容的缓冲液中进行，例如在1×Taq聚合酶缓冲液中进行。重新退火在低于引物Tm的温度下进行，通常在约20℃-60℃进行，虽然对于某些引物来说适合使用更低或更高的温度。引物的存在量应是每个引物约15-500nM。本领域的技术人员可以根据经验通过最少的实验来确定最佳引物浓度，例如进行引物在15-500nM范围内变动的测试反应，根据延伸或扩增反应的相对分辨率、产量和特异性对结果进行分析。
在引物的存在下退火后，使用核酸聚合酶进行聚合。能够用于该步骤的各种聚合酶是公知的，可以由本领域的技术人员进行选择。最常用的酶是热稳定的Taq酶和其他热稳定的聚合酶，例如Pfu聚合酶。引物延伸在所选用酶的标准条件下进行，例如50mM KCl、10mM Tric-HCl(pH8.825℃)，0.5-3mM MgCl2、0.1％BSA和100μM每种dNTP，72℃2分钟。
第一轮引物延伸产生一个群体，其中一条链具有上游引物和掺入的标签序列，其他链具有下游引物和掺入的标签序列。对于每种SNP来说，掺入的下游引物3’末端核苷酸与靶DNA上多态性位点处的核苷酸互补。下游引物的掺入必须包括与3’末端核苷酸相关或对应的标签序列。为了生成其中代表每条链的分子都具有上游标签或其互补物与下游标签或其互补物的一个群体，第一引物延伸反应的产物进行另一轮变性、在同样引物的存在下重新退火和那些引物的聚合酶延伸。
第二轮引物延伸之后，除去未延伸的引物。可以使用除去引物的任何方法，例如电泳或柱层析，但是优选使用对单链DNA特异的热不稳定的外切酶。使用热不稳定的外切酶避免对耗时的分离和纯化步骤的需要，以及污染或样品损失的可能性。例如，根据本发明的热不稳定的外切酶通常包括：大肠杆菌外切酶I(ExoI)和外切酶VII(ExoVII)。例如，ExoI在37℃有活性，但是80℃孵育20分钟后失活。
除去用于引物延伸的引物，以便可以使用与掺入的上游和下游标签序列对应的新引物来扩增引物延伸产物。除去第一引物后，加入包括上游标签序列引物和四个下游标签序列引物组成的一组引物。四个下游标签序列引物的每一个都用荧光燃料进行可区分标记(如末端标记)。使加有新引物的混合物经历扩增过程，包括热变性、重新退火和聚合酶延伸的循环。扩增过程应包括至少两个循环，但优选包括2-35个循环，较优选10-30个循环，更优选15-25个循环。
在本发明的这一方面中，循环过程中，变性、引物退火和引物延伸的至少一个循环之后，从管或反应容器中取出反应物样品或部分样品，对部分样品中的核酸进行分离和检测。分离和检测和循环过程同时进行，使在循环发生时生成表示产物量为循环数函数的曲线。本文所用的术语“同时”指分离至少在进行循环过程的时候启动。根据所用的分离技术(例如毛细电泳)和给定反应物中要分离物质的数目和大小，每部分样品的分离最常需要1-120分钟。因此，当分离步骤长于每个循环过程时，例如每个循环之后取出样品时，分离步骤将在全部循环过程结束后完成。但是，如本文所用的，只要每个样品的分离是在循环过程过程中启动的，这种情况仍认为是“同时”分离。同时分离最优选的是使用自动取样器进行，在样品从循环反应物取出后，所述自动取样器立即将样品置于分离装置中。
以上述的方式，通过检测大小分离的扩增产物上的荧光信号来鉴别多态性位点处的核苷酸。因为四个下游标签引物中的每一个都标记有可区分的荧光标记物，且给定引物上的标签对应于原始下游引物延伸引物的3’末端核苷酸，荧光标记的标签的掺入和检测可鉴别多态性位点处的核苷酸。
在优选的方面中，原始的引物延伸反应物包括识别多个SNP的引物组。在该方面中，每个不同多态性将表现为截然不同大小的扩增产物。例如，人们可以加入其他上游引物，每个引物包含同样的标签序列，在另一个已知SNP的截然不同距离的上游杂交的3’区域是变化的。和其他的上游引物相一致的是，待测的其他每个SNP需要四个下游引物延伸引物组成的组，该组的每个成员以5’到3’的顺序包括：a)对应于引物的3’末端核苷酸的标签序列，其中所述标签序列和与用于同系列反应中的其他待测SNP的下游引物上3’末端核苷酸对应的标签序列相同；b)足以指导引物与已知SNP下游或附近特异性杂交的区域；和c)对应于引物上标签序列的可变3’末端核苷酸，其中引物与其基因组中的靶序列杂交，3’末端核苷酸与多态性位点相对，如果其互补的话则与该位点的核苷酸进行碱基配对。如上所述两次引物延伸反应和除去未掺入的引物之后，使用与测定单SNP时所用相同的单扩增引物组。也就是说，扩增引物组将包括含有上游标签的上游引物，和含有引物延伸引物上四个上游标签的四个可区分标记的引物组成的引物组，其中所述标记物对应于标签，其对应于和多态性位点相对的核苷酸。对于每个待测SNP来说可以使用相同的扩增引物组，这是因为掺入的标签在组间是通用的。也就是说，所有的上游引物都具有相同的标签序列，且所有的下游引物延伸引物组都具有与相同的3’末端核苷酸相对应的相同标签序列。当分离时待测定的每个SNP都具有截然不同的大小，掺入到所述大小分子中的标记物的识别能够明确地鉴别多态性位点处存在的核苷酸。用由五个扩增引物组成的一组引物扩增和检测多处SNP的能力具有一个优点，即可以避免与使用大量引物相关的引物相互作用的问题。另外，还将大大降低引物退火效率差异的影响，因为用一个给定的扩增引物组测定的所有SNP都同等程度地受这种差异的影响。
使用更多个由五个标签序列组成的组可以进一步进行放大。其他组将包含与同时使用的其他标签截然不同的标签。应注意避免同时使用与其他标签互补的标签。如上所述，每一组将包含上游标签和下游标签，所述上游标签的选择应使扩增产物的大小截然不同，所述下游标签中的各标签对应于引物延伸引物的3’末端核苷酸。对于扩增来说，下游引物可以标记有与其他组相同的相应荧光标记物，或优选标记有不同的可区分荧光标记物组。大小分离后，如上所述根据大小对扩增的、含SNP的片段进行鉴定，通过掺入的标记物鉴别多态性位点处的核苷酸。
引物设计的通常考虑事项
寡核苷酸引物长度通常为5-100个核苷酸，优选17-45个核苷酸，虽然也可以使用不同长度的引物。用于引物延伸反应的引物长度优选为10-60个核苷酸，但用于扩增的引物长度优选为17-25个核苷酸。通过溶解温度估算法，根据本发明有用的引物可以设计为具有特定的溶解温度(Tm)。可以使用商业化程序，包括OligoTM、Primer Design和从互联网上获得的程序，包括Primer3和Oligo Calculator来计算根据本发明有用的多聚核苷酸序列的Tm。优选的是，例如通过Oligo Calculator计算的、根据本发明有用的扩增引物的Tm为约45℃-65℃，更优选为约50℃-60℃。
多聚核苷酸的Tm影响其与另一种多聚核苷酸的杂交(例如，寡核苷酸引物与模板多聚核苷酸的退火)。在本发明的方法中，优选各步骤中所用的寡核苷酸选择性地与靶模板或来源于靶模板的多聚核苷酸杂交。典型地，当两个多聚核苷酸序列基本上互补(至少14-25个核苷酸的长度中至少约65％互补，优选至少约75％，更优选至少约90％互补)时发生选择性地杂交。参见Kanehisa，M.，1984，Polynucleotide Res.12∶203，通过引用并入本文。结果是，需要耐受引物位点处某种程度的错配。这种错配可以是少的，如一个、两个或三个核苷酸。作为替代方案，错配区域可以包括环，该环定义为在连续系列中存在有四个或更多个核苷酸错配的区域。
许多因素影响引物与第二多聚核苷酸分子杂交的效率和选择性。这些因素，包括引物长度、核苷酸序列和/或组成、杂交温度、缓冲液组分和引物需要与之杂交的区域中空间位阻都是根据本发明设计寡核苷酸引物时应考虑的。
在引物长度和引物与靶序列退火的效率及准确性之间存在有正相关。具体地说，较长的序列比较短的序列具有更高的溶解温度(Tm)，更不可能在给定的靶序列内重复，因此最大限度地减少杂乱的杂交。具有较高G-C含量或包含回文序列的引物序列倾向于自身杂交，其目标性的靶位点也是如此，这是因为单分子，而非双分子的杂交动力学通常在溶液中是有利的。但是，设计包含足够数目G-C核苷酸对的引物也是重要的，因为G-C对由三个氢键来结合靶序列，从而形成更紧而强的键，而非A和T碱基对中的两个氢键所束缚。杂交温度随引物退火效率反向变化，包括在引发反应或杂交混合物中的有机溶剂，如甲酰胺的浓度也是如此，而盐浓度增加促进结合。在严格的退火条件下，较长的杂交探针或合成引物比更随意的条件下足够用的较短探针或引物更有效地结合。优选的是，严格的杂交在合适的缓冲液(例如1×Taq聚合酶缓冲液或适用于引物延伸和扩增中所用酶的其他缓冲液)中、在使多聚核苷酸序列与寡核苷酸引物杂交的条件下进行。可以根据长度和/或多聚核苷酸组分或寡核苷酸引物来改变严格的杂交条件(例如，从低于约1M的盐浓度，更通常低于约500mM，优选低于200mM)和改变杂交温度(例如，从0℃低温到高于22℃，高于约30℃，(最经常)超过37℃)。较长的片段会需要更高的杂交温度以进行特异性杂交。由于多种因素影响杂交的严格性，参数的组合比单一因素的绝对度量更为重要。
和识别给定基因上任意部位序列的引物设计不同，设计用来在已知SNP附近杂交的引物受到对其修改以操纵Tm的限制。例如，正常情况下人们能够在序列的上游或下游移动以寻找具有更有利GC含量的区域，当引物设计用来和SNP附近杂交时，人们不能够将引物移动到另一个位置。因此在这种情况下，操纵Tm的主要含义是改变引物中互补序列的长度。
根据本发明有用的序列标签
根据本发明有用的标签优选是异源的或人工合成的核苷酸序列，长度至少为15个核苷酸，优选20-30个核苷酸。在PCR退火条件下，标签优选不与待分析基因型的生物有机体基因组序列杂交。根据本发明的标签序列可以是但不必须是随机的。可以使用标签标签序列作为引物延伸反应中的标记引物、使用目标生物有机体的基因组DNA作为模板，确定PCR退火条件下潜在的标签序列是否与生物有机体的基因组序列杂交。在用于本发明方法的扩增步骤的退火温度下，标记引物与基因组DNA杂交，然后在延伸条件下和热稳定性的聚合酶孵育。将反应产物和单独的标记探针并排进行电泳分离。如果标记的标签出现在比标签引物大的一个或多个条带中，则在PCR退火条件下标签引物与待分析基因型的生物有机体的基因组序列杂交了。应该注意避免在相同的反应中使用与要用的其他标签互补的标签。
标记寡核苷酸引物
根据本发明有用的寡核苷酸引物可以如下所述掺入可通过分光光度法、光化学法、生物化学法、免疫化学法、酶法或化学法检测的部分(moiety)进行标记。将标记物与寡核苷酸连接或偶联的方法理所当然取决于所用标记物的类型和标记物在引物上的位置(即，3’-末端、5’末端或整体标记)。
优选荧光染料，适用于本发明的各种标记物和其掺入引物的方法是本领域所公知的，包括但不局限于酶(如碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶)和酶底物、放射性原子、生色团、荧光淬灭剂、化学发光标记物和电化学发光标记物，如OrigenTM(Igen)，其彼此相互作用以增强、改变或减弱信号。当然，如果标记的分子用在涉及热循环的基于PCR的扩增分析中，标记物必须能够耐受该自动化过程中所需的温度循环。理想的是，优选能够使用相同的技术、方法和/或底物检测的四种可区分标记物。本发明中用在标记引物的构建中标记物的生色团包括但不局限于若丹明和其衍生物(如Texas Red)、荧光素和其衍生物(如5-溴甲基荧光素)、Cy5、Cy3、JOE、FAM、Oregon GreenTM、Lucifer Yellow、IAEDANS、7-Me2N-香豆素-4-乙酸酯、7-OH-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯、7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯(AMCA)、monobromobimane、三磺酸芘，如Cascade Blue和monobromorimethy-amminobimane。一般来说，优选具有宽斯托克司频移的生色团，使得可以使用带有滤光片的荧光计而非单色计，并提高检测效率。
可以通过各种技术将标记物直接或间接结合到寡核苷酸上。根据所用标记物或标签的精确类型，标记物可以位于引物的5’端，或位于引物内部，或结合于各种大小的间隔臂和组分以促进信号的相互作用。优选5’端标记。利用商业来源的phosphoramidite试剂，人们可以通过适当保护的phosphoramidite生成在5’末端包含官能团(例如硫醇或伯胺)的寡聚物，可以使用例如描述在PCRprotocols：AGuide to Methods and Applications，Innis et al.，eds.Academic Press，Ind.，1990中的方案对它们进行标记。
美国专利No.4,914,210中描述了引入寡核苷酸功能化试剂以将一个或多个硫氢基、氨基或羟基部分引入到寡核苷酸序列中，通常在5’端的方法。通过使用多聚核苷酸激酶和γ-32P-ATP或γ-33P-ATP提供受体基团，往5’磷酸基团中引入同位素。可以使在合成过程中引入的氨基胸苷或6-氨基己基残基与生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯，将生物素加到5’端。
扩增
PCR方法是本领域的技术人员所熟知的，如Mullis and Faloona，1987，MethodsEnzymol.，155∶335，Saiki et al.，1985，Science230∶1350和美国专利No.4,683,202、4,683,195与4,800,159中所描述的方法，每个通过引用并入本文。在其最简单的形式中，PCR是使用与相对链杂交并位于靶DNA中目的区域旁侧的两个寡核苷酸引物、酶法合成特定DNA序列的体外方法。涉及模板变性、引物退火和退火的引物通过DNA聚合酶延伸的重复系列的反应步骤导致末端限定为5’端引物的特定片段的指数积累。据报道，PCR能够生成特定DNA序列的、因数为109的选择性富集。
PCR循环中每个步骤的长度和温度，以及循环数根据实际所需的严格性加以调整。退火温度和时间通过引物与模板退火所需的效率和要耐受错配的程度加以确定。优化引物退火条件严格性的能力是本领域的技术人员所熟知的。20℃-72℃的退火温度是最常用的。模板分子的初始变性正常情况下通过于92℃-99℃孵育4分钟进行，然后进行20-40个循环，包括变性(94℃15秒至1分钟)、退火(基于上述Tm的温度，通常比反应中具有最低Tm的寡核苷酸Tm低约5℃；通常1-2分钟)和延伸(通常92℃1-3分钟)。
取样
扩增过程中的取样可以以所需的任何频率或任何模式进行。优选的取样发生在扩增过程中每个循环之后，虽然也可以以更低的频率取样，例如每隔一个循环、每三个循环、每四个循环进行取样等。虽然最常需要的是均一的取样间隔，但也不要求取样必须以均一的间隔进行。举一个例子来说，取样程序可以涉及在开始五个循环的每个循环之后取样，然后每个一个循环进行取样。
取样可以简单地从反应物中手动移出部分样品，但是优选自动化取样，以使部分样品以预定的取样间隔自动取出。优选的是反应混合物在每次取样时都补充等体积的新鲜组分，如dNTPs、引物和DNA聚合酶。对于本发明的该方面和其他方面来说，优选但非必须的是循环以微滴定板或微孔板形式进行。由于板的模块特征和板上孔的均一格局，使用包括多个反应孔的板的这种形式不仅增加分析方法的检测量，还适合于自动化取样步骤。举例来说，根据本发明有用的常见微滴定板样式具有12、24、48、96、384或更多个孔，但根据本发明可以使用能够有形匹配在板上且容纳所需反应体积(通常10-100μl)的任何数目的孔。通常优选96孔板或384孔板。
自动化取样方法可以容易地实施为程序化步骤，避免取样中的人为误差(即，样品大小和跟踪样品特性的误差)和人为取样污染的可能性。能够从热循环仪中取出部分样品的自动取样器是本领域中可获得的。例如，Mitsubishi RV-E2RoboticArm可以和SciCloneTM Liquid Handler或Robbins Scientific Hydra96Piptettor联用。
根据本发明有用的自动取样器可以和热循环仪整合在一起，或者取样器和循环仪可以为模块化设计。当循环仪和取样器整合时，热循环和取样发生在同一位置，样品以程序化的间隔由自动取样器取出。当循环仪和取样器为模块化设计时，循环仪和取样器是分离的模块。在一个实施方案中，举例来说，分析板通过机器手从循环仪向取样器再向循环仪有形移动。
例如，取样步骤中取出部分样品的体积依赖于扩增反应的总体积、产物检测的敏感性和所用分离类型而变动。扩增体积可以从几微升到几百微升不等(例如5μl、10μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl、120μl、150μl或200μl或更多)，优选为10-150μl，更优选为10-100μl。部分样品体积可以在反应混合物的0.1-30％之间变动。
核酸的分离
根据本发明的核酸的分离可以通过适于分离核酸的任何方法实现，例如这些方法包括电泳、HPLC或质谱。由于毛细电泳(CE)的速度和分辨率，分离优选通过毛细电泳(CE)进行。
CE是用于分析微量样品的有效分析性分离技术。CE分离在填充有所谓“载体电解质”的导电介质的窄径毛细管中进行。在毛细管的两端之间施加电场，样品中的物质以一定的速度从一个电极移向另一个电极，所述速度依赖于每种物质的电泳迁移率，以及管中液体流动的速度。可以在毛细管中使用凝胶或液体，如缓冲液进行CE。在一个称作“游离区带(free-zone)电泳”的液体模式中，分离依赖于样品物质游离溶液迁移率的差异。在另一个液体模式中，使用胶束实现基于疏水性差异的分离。其称作胶束动电毛细层析(Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography，MECC)。
CE基于电荷分离核酸分子，有效导致核酸分子根据大小或核苷酸数的分离。当许多片段生成时，它们将以大小逐渐增加的顺序通过靠近毛细管末端的荧光检测仪。也就是说，较小的片段将迁移在较大片段的前面，首先得以检测。
CE主要在分离速度、小量所需样品(在1-50nl等级上)和高分辨率方面提供超出传统电泳的显著优点。例如，使用CE的分离速度可以比传统的凝胶电泳快10-20倍，并不必进行跑胶后的染色。CE提供高分辨率，分离差异少至一个碱基的约10-1,000个碱基对的分子。高分辨率可能部分由于毛细管的大表面积有效地散热，从而可以使用高电压。另外，由于毛细管的窄内径，条带宽度降至最小。在游离区带电泳中，发生电渗或电渗性流动(EOF)现象。这是影响所有样品分子的大量液体流动，与电荷无关。在某些条件下，EOF有助于提高游离区带CE中分辨率和分离速度。
CE可以通过本领域所熟知的方法进行，例如公开于美国专利No.6,217,731、6,001,230和5,963,456中的方法，这些文献通过引用并入本文。高通量CE仪器可以通过商业途径获得，例如Spectrumedix Corporation(State College，PA)的HTS9610HighThroughput Analysis System和SCE9610全自动96-毛细电泳遗传分析系统。其他的包括Backman Instruments Inc(Fullerton，CA)的P/ACE5000系列和ABIPRISM3100遗传分析仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)。其中每个仪器都在靠近CE柱的一端包括监测样品分子光发射的荧光检测仪。标准的荧光检测仪能够区别多种不同波长的荧光发射，检测扩增样品进行的一次CE中的多种荧光标记物质。
增加CE分离通量的另一种方法是使用多个毛细管，或优选使用毛细管阵列。已经开发了具有96个毛细管容量的Capillary Array Electrophoresis(CAE)仪(如Molecular Dynamics的MegaBACE仪)和更大，直至并包括1000个毛细管容量的仪器。为了避免检测到由紧密并置的毛细管间的光散射所致DNA荧光的问题，可以使用共聚焦荧光扫描仪(Quesada et al.，1991，Biotechniques10∶616-25)。
分离(和检测)装置可以和用于热循环和取样的装置分离或整合。因为根据本发明分离步骤是和循环方案同时开始的，优选将样品直接从扩增反应物中取出并置于分离装置中，从而使分离和扩增同时进行。因此，虽然不是必需的，但优选将分离装置和热循环与取样装置整合。在一个实施方案中，这些装置是模块化的，包括热循环模块和分离/检测模块，带有将样品从热循环反应物中取出并置于分离/检测装置中的自动取样器。
检测
根据本发明有用的扩增产物检测方法测定标记的引物用荧光标记物激发光谱范围内的光照射时所发射的荧光强度。荧光检测技术高度发达且非常灵敏，在某些情况下甚至能检测到一个分子。高灵敏性荧光检测是多数商业来源的读板仪(platereader)、微阵列检测仪和CE装置的标准。对于CE设备来说，经常采用激发和发射信号的纤维光学传输。Spectrumedix、Applied Biosystems，Beckman Coulter和Agilent都销售带有荧光检测仪的CE设备，足以进行本文所述方法所需的荧光检测。
如果两种或多种不同荧光标记物荧光信号的发射峰波长的频谱(spectrum)相隔20nm或更多，则它们可以得以区分。医师通常会选择峰波长间相隔更大的生色团，尤其是所选的生色团具有宽的发射波长峰时。由此得出结论：希望同时在样品中包含和检测的生色团越不同，其发射峰就应越窄。
实施例
实施例1.单核苷酸差异的检测
Leber’s遗传性视神经症(LHON)和线粒体DNA中3460、11778和14459处的几个点突变相关。
突变：     SNP区(多态性位点以粗体、下划线表示)
3460       5’-CGG GCT ACT ACA ACC CTT CGC TGA CGC CAT AAA-3’
           (SEQ ID NO：1)
11778      5’-TCA AAC TAC GAA CGC ACT CAC AGT CGC ATC ATA-3’
           (SEQ ID NO：2)
14459      5’-CTC AGG ATA CTC CTC AAT AGC CAT CGC TGT AGT-3’
           (SEQ ID NO：3)
人线粒体DNA中与Leber’s遗传性视神经症(LHON)相关的个体SNP基因型可以如下述进行测定。
引物延伸
引物：
a)上游引物
上游引物如下所示：
突变        上游引物(标鉴序列以小写字母表示)
3460        5’-gttacaagat tctcacacgc taagg-TTC ATA GTA GAA GAG CGA TGG-3’
            (SEQ ID NO：4)
11778       5’-gttacaagat tctcacacgc taagg-AAA AAG CTA TTA GTG GGA GTA-3’
            (SEQ ID NO：5)
14459       5’-gttacaagat tctcacacgc taagg-TCG GGT GTG TTA TTA TTC TGA-3’
            (SEQ ID NO：6)
b)下游引物
下游引物如下所示：
突变          下游引物
3460  G-引物：5’-agttggcgaa gcagtcgcta gaagaCGG GCT ACT ACA ACC CTT CGC TGA
                  CG-3’(SEQ ID NO：7)
      A-引物：5’-gatgctggtg tggctggtgt tcccgCGG GCT ACT ACA ACC CTT CGC TGA
                  CA-3’(SEQ ID NO：8)
      T-引物：5’-ggttggttgc acactggaga tattggCGG GCT ACT ACA ACC CTT CGC TGA
                  CT-3’(SEQ ID NO：9)
      C-引物：5’-ctggagcatc tggaaaagta gtaccCGG GCT ACT ACA ACC CTT CGC TGA
                  CC-3’(SEQ ID NO：10)
11778 G-引物：5’-agttggcgaa gcagtcgcta gaagaTCA AAC TAC GAA CGC ACT CAC AGT
                  CG-3’(SEQ ID NO：11)
      A-引物：5’-gatgctggtg tggctggtgt tcccgTCA AAC TAC GAA CGC ACT CAC AGT
                  CA-3’(SEQ ID NO：12)
      T-引物：5’-ggttggttgc acactggaga tattggTCA AAC TAC GAA CGC ACT CAC AGT
                  CT-3’(SEQ ID NO：13)
      C-引物：5’-ctggagcatc tggaaaagta gtaccTCA AAC TAC GAA CGC ACT CAC AGT
                  CC-3’(SEQ ID NO：14)
14459 G-引物：5’-agttggcgaa gcagtcgcta gaagaCTC AGG ATA CTC CTC AAT AGC CAT
                  CG-3’(SEQ ID NO：15)
      A-引物：5’-gatgctggtg tggctggtgt tcccgCTC AGG ATA CTC CTC AAT AGC CAT
                  CA-3’(SEQ ID NO：16)
      T-引物：5’-ggttggttgc acactggaga tattggCTC AGG ATA CTC CTC AAT AGC CAT
                  CT-3’(SEQ ID NO：17)
      C-引物：5’-ctggagcatc tggaaaagta gtaccCTC AGG ATA CTC CTC AAT AGC CAT
                  CC-3’(SEQ ID NO：18)
用于每个多态性位点的5个引物延伸引物组成的全套引物(每个40pmol，共15个引物)和1μg受试个体的模板基因组DNA混合在1×Pfu缓冲液中(20mMTris-HCl，pH8.8，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton-X-100和0.1mg/ml无核酸酶的BSA)，总体积为50μl。混合物于94℃加热2分钟，缓慢冷却至室温，使引物退火。加入1μl克隆的Pfu聚合酶和1.25μl每种dNTP(终浓度为200μM)，样品于72℃孵育3分钟。然后使样品进行94℃2分钟、50℃1分钟和72℃3分钟的循环，以产生带有上游引物或其互补物与下游引物或其互补物的引物延伸产物群。
加入20U的大肠杆菌外切酶I(ExoI；New England Biolabs)并于37℃孵育20分钟除去引物延伸引物。ExoI于80℃孵育20分钟而灭活。
扩增：
除去引物延伸引物之后，加入下列5个扩增引物(每个引物40pmol，1×Pfu缓冲液中，终体积75μl)：
a)上游引物：5’-gttacaagat tctcacacgc taagg-3’(SEQ ID NO：19
b)下游引物：(可区分标记)
G-引物：5’-R6G-agttggcgaa gcagtcgcta gaaga-3’(SEQ ID NO：20)
A-引物：5’-FAM-gatgctggtg tggctggtgt tcccg-3’(SEQ ID NO：21)
T-引物：5’-ROX-ggttggttgc acactggaga tattgg-3’(SEQ ID NO：22)
C-引物：5’-JOE ctggagcatc tggaaaagta gtacc-3’(SEQ ID NO：23)
加入1μl新鲜的克隆Pfu聚合酶进行扩增，循环反应如下：94℃45sec、50℃45sec和72℃2分钟，共35个循环。每个循环之后，或以任意选定间隔，取出部分样品(0.5μl)加到准备好的毛细电泳装置中。在扩增过程中开始并进行分离。在一定长度的毛细管上分离后，根据荧光检测扩增的引物延伸产物。可以对每个循环进行每个片段信号强度的作图，产生扩增图谱。
扩增产物是：
突变      产物大小         野生型多态性核苷酸       突变型多态性核苷酸
3460      249                       G          A(249bp产物上用ROX染料检测)
11778     350                       G          A(350bp产物上用ROX染料检测)
14459     456                       G          A(456bp产物上用ROX染料检测)
可以通过加入其他每个SNP的其他上游引物延伸引物来进一步放大该实施例中详述的方法，所述这些引物具有与已加入的那些引物相同的上游标签和对截然不同大小的含不同SNP片段特异的3’区域。待测的其他每个SNP也必须具有其自己的、由4个下游引物组成的组，其带有相同的由4个下游引物标签组成的组、与SNP附近特异杂交的3’区域和对应于标签序列的可变3’末端。
还可以如上文所述加入具有不同组上游和下游标签的新引物组进行进一步放大。
其他实施方案
这里引用的所有专利、专利申请和发表文献的整体内容都通过引用并入本文。虽然本发明参考其优选的实施方案进行了具体说明和描述，但本领域的技术人员将理解：可以在不背离所附权利要求书的本发明范围的条件下进行形式和细节上的各种改变。
Figure IYZ000004152907300021
Figure IYZ000004152907300031
Figure IYZ000004152907300051
Figure IYZ000004152907300061

Claims (65)

1.鉴别给定核酸样品中已知多态性位点处核苷酸的方法，该方法包括：
a)使从核酸样品产生的引物延伸产物群经历PCR扩增过程，其中已经将生成引物延伸产物群时未掺入的引物除去，每个引物延伸产物包含一个标签序列，所述标签序列特异对应于已知多态性位点处一个特定核苷酸的存在，其中所述的PCR扩增过程使用一个上游扩增引物和一组可区分标记的下游扩增引物进行，所述下游扩增引物组的每个成员包含所述引物延伸产物群成员所带有的所述标签序列和可区分标记物，其中每种可区分标记物特异对应于多态性位点处特定核苷酸的存在；和
b)检测可区分标记物向核酸分子中的掺入，从而鉴别所述多态性位点处的核苷酸。
2.权利要求1的方法，其中所述的可区分标记物是荧光标记物。
3.权利要求2的方法，其中所述的步骤(b)包括根据大小和/或电荷分离在所述的PCR扩增过程中生成的核酸分子。
4.权利要求3的方法，其中所述的分离包括毛细电泳。
5.权利要求1的方法，其在所述PCR扩增过程中、至少一个所述反应循环之后还包括下列步骤：取出所述扩增反应物的部分样品，根据大小和/或电荷分离核酸分子，并检测所述可区分标记物的掺入，其中所述的检测鉴别所述多态性位点处的核苷酸。
6.权利要求5的方法，其中所述的取出、分离和检测在所述PCR扩增过程的每个循环之后进行。
7.权利要求5的方法，其中所述的分离包括毛细电泳。
8.权利要求1的方法，其中步骤(a)和(b)在包括热循环仪、取样装置、毛细电泳装置和荧光检测仪的模块化设备中进行。
9.权利要求1的方法，其中所述的标签序列包含15-40个核苷酸。
10.权利要求1的方法，其中所述的可区分标记的下游扩增引物由下列引物组成：包含特异对应于多态性位点处A的存在的序列标签的引物；包含特异对应于多态性位点处C的存在的序列标签的引物；包含特异对应于多态性位点处G的存在的序列标签的引物；和包含特异对应于多态性位点处T的存在的序列标签的引物。
11.权利要求1的方法，其中所述的区分标记的下游扩增引物由一对寡核苷酸组成，一个寡核苷酸包含特异对应于多态性位点的第一等位基因的标签序列；一个寡核苷酸包含对应于多态性位点的第二等位基因的标签序列。
12.权利要求1的方法，其中所述的除去步骤包括将生成引物延伸产物群时未掺入的引物降解。
13.权利要求12的方法，其中所述的降解使用热不稳定的外切酶进行。
14.权利要求13的方法，其中所述热不稳定的外切酶选自外切酶I和外切酶VII。
15.权利要求14的方法，其中所述热不稳定的外切酶在进行步骤(a)之间热灭活。
16.鉴别给定的核酸样品中待测的一组已知多态性位点处核苷酸的方法，该方法包括：
a)使从核酸样品产生的引物延伸产物群经历PCR扩增过程，其中已经将生成引物延伸产物群时未掺入的引物除去，每个引物延伸产物包含标签序列组的一个成员，所述标签序列特异对应于已知多态性位点处一个特定核苷酸的存在，其中所述的PCR扩增过程使用一个用于每个包含待测的已知多态性位点的序列的上游扩增引物和一组可区分标记的下游扩增引物进行，所述下游扩增引物组的每个成员包含所述引物延伸产物群成员所带有的标签序列和对应于多态性位点处特定核苷酸存在的可区分标记物，其中所述上游扩增引物的选择应使待测的已知多态性位点组的每个多态性位点对应于截然不同大小的扩增产物；和
b)检测截然不同大小的扩增产物中的可区分标记物，从而鉴别每个所述多态性位点处的核苷酸。
17.权利要求16的方法，其中所述的可区分标记物是荧光标记物。
18.权利要求16的方法，其中所述的步骤(b)包括根据大小和/或电荷分离在所述的PCR扩增过程中生成的核酸分子。
19.权利要求18的方法，其中所述的分离包括毛细电泳。
20.权利要求16的方法，其在所述PCR扩增过程中、至少一个所述反应循环之后还包括下列步骤：取出所述扩增反应物的部分样品，根据大小和/或电荷分离核酸分子，并检测所述可区分标记物的掺入，其中所述的检测鉴别所述多态性位点处的核苷酸。
21.权利要求20的方法，其中所述的取出、分离和检测在所述PCR扩增过程的每个循环之后进行。
22.权利要求20的方法，其中所述的分离包括毛细电泳。
23.权利要求16的方法，其中步骤(a)和(b)在包括热循环仪、取样装置、毛细电泳装置和荧光检测仪的模块化设备中进行。
24.权利要求16的方法，其中所述的标签序列包含15-40个核苷酸。
25.权利要求16的方法，其中所述的可区分标记的下游扩增引物组由下列亚组组成：包含特异对应于多态性位点处A的存在的序列标签的亚组；包含特异对应于多态性位点处C的存在的序列标签的亚组；包含特异对应于多态性位点处G的存在的序列标签的亚组；和包含特异对应于多态性位点处T的存在的序列标签的亚组。
26.权利要求16的方法，其中所述的除去步骤包括将生成引物延伸产物群时未掺入的引物降解。
27.权利要求26的方法，其中所述的降解使用热不稳定的外切酶进行。
28.权利要求27的方法，其中所述热不稳定的外切酶选自外切酶I和外切酶VII。
29.权利要求28的方法，其中所述热不稳定的外切酶在进行步骤(a)之间热灭活。
30.鉴别给定的核酸样品中一组待测的已知多态性位点处核苷酸的方法，该方法包括：
a)使由核酸样品生成的引物延伸产物群经历PCR扩增过程，其中已经将生成引物延伸产物群时未掺入的引物除去，每个引物延伸产物包括第一标签序列或其互补物和一组第二标签序列或其互补物的一个成员，所述第二标签序列或其互补物的存在特异对应于已知多态性位点处一个特定核苷酸的存在，其中对于所述多态性位点组中的每个多态性位点来说，相对于第一标签序列到包含其他多态性位点的样品分子中一个多态性位点的距离，所述的第一标签序列位于多态性位点5’端截然不同的距离处，其中所述的PCR扩增过程使用包含第一标签序列的一个上游扩增引物和一组可区分标记物的下游扩增引物进行，所述下游扩增引物组的每个成员包含引物延伸产物群成员所带有的所述标签序列和特异对应于多态性位点处特定核苷酸存在的可区分标记物，其中所述上游扩增引物的选择应使待测的已知多态性位点组中的每个多态性位点对应于截然不同大小的扩增产物；和
b)检测截然不同大小的扩增产物中可区分标记物的掺入，从而确定每个所述多态性位点处的核苷酸。
31.权利要求30的方法，其中所述的可区分标记物是荧光标记物。
32.权利要求30的方法，其中所述的步骤(b)包括根据大小和/或电荷分离在所述的PCR扩增过程中生成的核酸分子。
33.权利要求32的方法，其中所述的分离包括毛细电泳。
34.权利要求30的方法，其在所述PCR扩增过程中、至少一个所述反应循环之后还包括下列步骤：取出所述扩增反应物的部分样品，根据大小和/或电荷分离核酸分子，并检测所述可区分标记物的掺入，其中所述的检测鉴别所述多态性位点处的核苷酸。
35.权利要求34的方法，其中所述的取出、分离和检测在所述PCR扩增的每个循环之后进行。
36.权利要求34的方法，其中所述的分离包括毛细电泳。
37.权利要求30的方法，其中步骤(a)和(b)在包括热循环仪、取样装置、毛细电泳装置和荧光检测仪的模块化设备中进行。
38.权利要求30的方法，其中所述的标签序列包含15-40个核苷酸。
39.权利要求30的方法，其中所述的可区分标记的下游扩增引物组由下列亚组组成：包含特异对应于多态性位点处A的存在的序列标签的亚组；包含特异对应于多态性位点处C的存在的序列标签的亚组；包含特异对应于多态性位点处G的存在的序列标签的亚组；和包含特异对应于多态性位点处T的存在的序列标签的亚组。
40.权利要求30的方法，其中所述的除去步骤包括将生成引物延伸产物群时未掺入的引物降解。
41.权利要求40的方法，其中所述的降解使用热不稳定的外切酶进行。
42.权利要求41的方法，其中所述热不稳定的外切酶选自外切酶I和外切酶VII。
43.权利要求42的方法，其中所述热不稳定的外切酶在进行步骤(a)之间热灭活。
44.鉴别已知多态性位点处的单核苷酸的方法，该方法包括：
I)提供包含所述多态性位点的核酸样品；
II)分离所述核酸样品的链，在下列引物的存在下进行重新退火：
a)第一寡核苷酸引物，包含与所述已知多态性位点的已知距离上游的序列杂交的3’区域，所述第一寡核苷酸引物包含位于3’区域5’端的第一序列标签；和
b)一组第二寡核苷酸引物，其中所述组的每个成员包含：
i)与所述多态性位点的3’端和附近杂交的区域；
ii)可变的3’末端核苷酸，其中所述的成员与所述的已知序列杂交时，所述的3’末端核苷酸和所述的多态性位点相对，其中，当且只有当所述3’端核苷酸与所述多态性位点处的核苷酸互补时，所述3’末端核苷酸才与所述多态性位点处的所述核苷酸进行碱基配对；和
iii)与(ii)中的所述可变3’末端核苷酸对应的标签序列，所述的标签序列位于所述成员上区域(i)的5’端；
III)使步骤(II)所得的退火寡核苷酸在一定的条件下和核酸聚合酶接触，使退火的寡核苷酸延伸，从而生成延伸产物，其中从第一寡核苷酸引物生成的引物延伸产物和其互补物分离时，可以作为模板，合成第二寡核苷酸引物组成员的延伸产物，反之亦然；
IV)重复分离和接触步骤(II)和(III)两次，从而产生核酸分子群，其包含与所述第一寡核苷酸相同或互补的序列，以及与所述第二寡核苷酸组的一个成员相同或互补的序列；
V)使步骤(IV)中产生的核酸分子群在使未退火的寡核苷酸引物降解的条件下和热不稳定的外切酶接触，使所述的引物降解；
VI)热灭活所述的热不稳定的外切酶；
VII)使所述的核酸分子群经历PCR扩增过程，其中所述的PCR扩增过程使用包含所述第一寡核苷酸引物所带有的第一序列标签的上游扩增引物和下游扩增引物组进行，所述下游扩增引物组的每个成员包含所述第二寡核苷酸引物组成员所带有的标签和可区分标记物；和
VIII)检测至少一种可区分标记物的掺入，从而鉴别所述的已知多态性位点处的核苷酸。
45.权利要求44的方法，其中所述的可区分标记物是荧光标记物。
46.权利要求44的方法，其中所述的步骤(VIII)包括根据大小和/或电荷分离在所述的PCR扩增过程中生成的核酸分子。
47.权利要求44的方法，其中所述的分离包括毛细电泳。
48.权利要求44的方法，其在所述PCR扩增过程中、至少一个所述反应循环之后还包括下列步骤：取出所述扩增反应物的部分样品，根据大小和/或电荷分离核酸分子，并检测所述可区分标记物的掺入，其中所述的检测鉴别所述多态性位点处的核苷酸。
49.权利要求48的方法，其中所述的取出、分离和检测在所述PCR扩增过程的每个循环之后进行。
50.权利要求44的方法，其中步骤I-VIII在包括热循环仪、取样装置、毛细电泳装置和荧光检测仪的模块化设备中进行。
51.权利要求44的方法，其中所述的标签序列包含15-40个核苷酸。
52.权利要求44的方法，其中与所述的已知多态性位点的已知距离上游的序列杂交的所述3’区域包含10-30个核苷酸。
53.权利要求44的方法，其中与所述的多态性位点3’端和附近杂交的区域包含10-30个核苷酸。
54.权利要求44的方法，其中所述的可区分标记的下游扩增引物组由下列亚组组成：包含特异对应于多态性位点处A的存在的序列标签的亚组；包含特异对应于多态性位点处C的存在的序列标签的亚组；包含特异对应于多态性位点处G的存在的序列标签的亚组；和包含特异对应于多态性位点处T的存在的序列标签的亚组。
55.鉴别存在于已知多态性位点组处的单核苷酸的方法，该方法包括：
I)提供包含所述多态性位点组的核酸样品；
II)分离核酸样品的链，在下列引物的存在下进行重新退火：
a)一组寡核苷酸引物，每个引物包含与已知多态性位点的已知距离上游的序列杂交的3’区域，所述第一寡核苷酸引物组的每个成员包含位于3’区域5’端的通用序列标签，所述第一寡核苷酸引物组的每个成员的选择应使对于所述已知多态性位点组中的每个多态性位点来说产生截然不同大小的扩增片段；和
b)第二寡核苷酸引物组，以5’至3’的顺序包含：
i)序列标签，选自特异对应于所述引物的3’末端核苷酸G的标签；特异对应于所述引物的3’末端核苷酸A的标签；特异对应于所述引物的3’末端核苷酸T的标签；和特异对应于所述引物的3’末端核苷酸C的标签；
ii)与所述多态性位点组中多态性位点的附近和3’端特异性杂交的区域，其中所述下游扩增引物组包含具有与所述多态性位点组中的每个多态性位点的所述多态性位点附近特异性杂交的区域的引物亚组；和
iii)选自G、A、T或C的3’末端核苷酸，其中所述的末端核苷酸特异地对应于(i)中所述的下游扩增引物上的序列标签，其中所述的下游扩增引物与多态性位点的附近和3’端序列杂交时，3’末端核苷酸和多态性位点相对；
III)使步骤(II)所得的退火寡核苷酸在一定的条件下和核酸聚合酶接触，使退火的寡核苷酸延伸，从而生成延伸产物，其中从第一寡核苷酸引物生成的引物延伸产物和其互补物分离时，可以作为模板，合成第二寡核苷酸引物组成员的延伸产物，反之亦然；
IV)重复分离和接触步骤(II)和(III)两次，从而产生包含核酸分子群的反应混合物，包含与所述第一寡核苷酸相同或互补的序列，以及与下游扩增引物组的一个成员相同或互补的序列；
V)使步骤(IV)中产生的核酸分子群在使未退火的寡核苷酸引物降解的条件下和热不稳定的外切酶接触，使引物降解；
VI)热灭活热不稳定的外切酶；
VII)使核酸分子群经历PCR扩增过程，其中所述的PCR扩增过程使用包含所述第一寡核苷酸引物所带有的通用序列标签的上游扩增引物和下游扩增引物组进行，所述下游扩增引物组的每个成员包含所述第二寡核苷酸引物组成员所带有的标签和可区分标记物；和
VIII)检测至少一个可区分标记物的掺入，从而鉴别所述已知多态性位点处的核苷酸。
56.权利要求55的方法，其中所述的可区分标记物是荧光标记物。
57.权利要求55的方法，其中所述的步骤(VIII)包括根据大小和/或电荷分离在所述的PCR扩增过程中生成的核酸分子。
58.权利要求57的方法，其中所述的分离包括毛细电泳。
59.权利要求55的方法，其在所述PCR扩增过程中、至少一个所述反应循环之后还包括下列步骤：取出所述扩增反应物的部分样品，根据大小和/或电荷分离核酸分子，并检测所述可区分标记物的掺入，其中所述的检测鉴别所述多态性位点处的核苷酸。
60.权利要求59的方法，其中所述的取出、分离和检测在所述PCR扩增过程的每个循环之后进行。
61.权利要求55的方法，其中步骤I-VIII在包括热循环仪、取样装置、毛细电泳装置和荧光检测仪的模块化设备中进行。
62.权利要求55的方法，其中所述的标签序列包含15-40个核苷酸。
63.权利要求55的方法，其中与所述的已知多态性位点的已知距离上游的序列杂交的所述3’区域包含10-30个核苷酸。
64.权利要求55的方法，其中与所述的多态性位点3’端和附近杂交的区域包含10-30个核苷酸。
65.权利要求55的方法，其中所述的可区分标记的下游扩增引物组由下列亚组组成：包含特异对应于多态性位点处A的存在的序列标签的亚组；包含特异对应于多态性位点处C的存在的序列标签的亚组；包含特异对应于多态性位点处G的存在的序列标签的亚组；和包含特异对应于多态性位点处T的存在的序列标签的亚组。
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