JP2006512094A5

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Publication number: JP2006512094A5
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Filing date: 2003-12-19
Publication date: 2010-09-09
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Description

目的の核酸配列の増幅のための組成物および方法が開示される。本方法はプライマーによる核酸配列の鎖置換複製を基礎とする。本開示の方法は、ゲノム核酸試料および他の高度に複雑な核酸試料を増幅するために有用な、複数置換増幅（ＭＤＡ）の一形式である。本開示の方法は、１または限られた数のプライマーだけを用いてそのような高度に複雑な核酸試料を増幅するのに用いることができる。１または少数のプライマーが、全ゲノムおよび他の高度な配列複雑性を有する核酸試料を効果的に増幅することができることが見出されている。そのプライマーは、プライマー中に表現されるプライマー配列の限られた量にもかかわらず、高度に複雑な核酸試料中に存在する幅広い範囲の配列のプライマーとなりおよび効率的に増幅することができるように特別に選択または設計されている。本開示の方法は一般的に、特異的核酸配列を有する１、少数、またはより多くのプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸試料を接触させ、および、核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で核酸試料をインキュベートすることを含む。核酸分子の複製の結果として、複製された鎖が複製中にもう一つの複製された鎖の鎖置換複製によって核酸分子から置換されるように、複製された鎖を生じる。複製は結果として核酸試料中の核酸分子のすべてまたは相当な部分の増幅を生じうる。全ゲノム鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）の一形式である、本開示の方法の一形式では、１、少数、またはより多くのプライマーを用いて、ゲノム核酸の試料（または別の高度に複雑な核酸の試料）のプライマーとする。

高度に複雑な核酸試料を、特異的核酸配列を有する１または少数のプライマーだけを用いて効率的に増幅することができることが見出された。その１または少数のプライマーは、試料中の核酸分子全体にわたって分布する核酸配列と相補的である。たとえば、単一の６塩基プライマーは平均して４０９６ヌクレオチド毎に１個の配列と相補的になり、および２種類の６塩基プライマーは合計で、平均して２０４８ヌクレオチド毎に１回の配列と相補的になる。プライマー結合部位のそのような分布は、効率的な複数置換増幅を可能にするのに十分であったことが見出された。また、プライマー結合部位のそのような分布は、核酸試料中の配列の広いカバー率を有する核酸試料の増幅、および高い配列および遺伝子座表現および低い増幅偏りを有する増幅産物を結果として生じることも見出された。したがって、本開示の方法は、核酸試料中の核酸分子のすべてまたは相当な部分の複製を結果として生じうる。

本開示の方法は、高度に複雑な核酸試料中のさまざまな配列を正確におよび均一に増幅することができる。この結果は、たとえば配列表現、遺伝子座表現および増幅偏りを基準として定量化することができる。たとえば、本開示の方法で生じた増幅された核酸分子は、少なくとも１０個の異なる標的配列について少なくとも５０％の配列表現を有しうる。増幅偏りは少なくとも１０個の異なる標的配列について１０％未満でありうる。

アルカリ性条件への核酸の曝露、アルカリ性条件へ曝露された核酸のｐＨの低下、および結果として生じた、閾量のまたはそれを上回る量のおよび／または閾濃度のまたはそれを下回る濃度の核酸のインキュベートによって、低い増幅偏りを有する増幅産物を作製することができることもまた見出されている。そのようなアルカリ性／中性化手順は、増幅産物の品質を改善することができる。増幅産物の品質は、増幅偏り、対立遺伝子偏り、遺伝子座表現、配列表現、対立遺伝子表現、遺伝子座表現偏り、配列表現偏り、パーセント表現、パーセント遺伝子座表現、パーセント配列表現、およびインプット核酸の偏りのないおよび／または完全な増幅を示す指標を含むがそれらに限定されない種々の方法によって測定することができる。

損傷ＤＮＡを増幅および修復するための方法もまた開示される。この方法は、たとえば、分解されたゲノムＤＮＡを増幅するのに有用である。本方法は、損傷ＤＮＡ試料を実質的に変性すること（一般的に熱およびアルカリ性条件への曝露によって）、変性条件の除去または低減（たとえば変性したＤＮＡ試料のｐＨおよび温度の低下によって）、およびそのＤＮＡを複製することを含む。損傷ＤＮＡの平均長を増大することによって、損傷ＤＮＡは複製中に修復される。たとえば、ＤＮＡ断片の平均長は、たとえば、損傷ＤＮＡ試料中の２ｋｂから、たとえば、増幅されたＤＮＡについての１０ｋｂ以上へ増加することができる。この修復方法は、すべて損傷ＤＮＡを他の方法によって増幅した場合と比較して、産物の平均長を増加し、増幅産物の品質を３倍に高め（たとえば、試料中のマーカー表現を増加することによって）、および対立遺伝子欠落の頻度を低下させることによって増幅産物の遺伝子型分析を改善することによって、損傷ＤＮＡの増幅における全体的な改善を結果として生じうる。変性条件の除去は、損傷ＤＮＡの変性した鎖が、他の変性した損傷ＤＮＡとハイブリダイズすることを可能にする。複製は複数置換増幅であることができる。ＤＮＡ試料の実質的な変性および一時的な変性は一般的に、ＤＮＡがさらに損傷されないように実施される。この方法は一般的に、開示された増幅法のうち任意のものと組み合わせるかまたは共に使用することができる。

プライマーまたはランダムまたは縮重配列を用いるもの（すなわち、さまざまな配列を有するプライマーの集合の使用）といった、本開示の方法の一部の形式に関しては、プライマーハイブリダイゼーションは特異的である必要が無い。そのような場合には、プライマーは、合成をプライミングすることに有効でありさえすればよい。たとえば、全ゲノム増幅では、一般的に目的はすべての配列を等しく増幅することであるため、プライミングの特異性は必須ではない。ランダムまたは縮重プライマーの組は、長さ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および／または２０ヌクレオチドまたはそれ以上のプライマーから成ることができる。長さ６ヌクレオチドのプライマーを六量体プライマーと呼ぶ。全ゲノム増幅のための好ましいプライマーは、ａｒｅランダム六量体プライマー、たとえば、すべての可能な６ヌクレオチド配列がそのプライマーの組の中に表現されているランダム六量体プライマーである。同様に、他の特定の長さのまたは長さの混合物のランダムプライマーの組は、好ましくはそのプライマーの長さのすべての可能な配列、または、特に、そのプライマーの相補的部分の長さを含む。ランダムプライマーの使用は米国特許第５，０４３，２７２号明細書および米国特許第６，２１４，５８７号明細書に記載されている。

本開示の方法において用いられるプライマーは、特定の望ましい性質および機能上の特性を持つように、選択および／または設計することができる。プライマー選択およびプライマー設計の目的は、より良い増幅結果を得ることでありうる。たとえば、最高の増幅収率（すなわち、核酸の量における最高の増加量）、増幅された核酸における最良の遺伝子座または配列表現（すなわち、目的の遺伝子座および配列に関して、１００％に最も近い遺伝子座または配列表現）、および／または最低の増幅偏りを結果として生じる、特定のプライマーを選択することができる。これは、特定のプライマーを増幅反応において、目的の核酸試料を用いて試験することによって決定できる。異なるプライマーが、異なる核酸試料について最適の結果を生じうる。しかし、ここに記載のプライマー数およびプライマー組成の原則は、ほとんどすべての核酸試料について良好な増幅結果を一般的に生じる。本開示のプライマーおよび方法のこの広範囲の有用性は、本開示のプライマーおよび方法の有用な特性である。

希望の品質の増幅産物を生じるプライマーを、ここでは広カバー率プライマーと呼ぶ。一般的に、広カバー率プライマー（または、一緒に使用する場合は、プライマー）は、少なくとも１０％の遺伝子座表現を少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも１０％の配列表現を少なくとも５個の異なる標的配列に関して、５０倍未満の増幅偏りを、５０倍未満の増幅偏りを少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、および／または５０倍未満の増幅偏りを少なくとも５個の異なる標的配列に関して、生じることができる。プライマーはまた、たとえば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の遺伝子座表現を、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して生じることができる。プライマーはまた、たとえば、少なくとも１０％の遺伝子座表現を、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じることができる。

プライマーはまた、たとえば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の配列表現を、少なくとも５個の異なる標的配列に関して生じることができる。プライマーはまた、たとえば、少なくとも１０％の遺伝子座表現を、少なくとも６個の異なる標的配列、少なくとも７個の異なる標的配列、少なくとも８個の異なる標的配列、少なくとも９個の異なる標的配列、少なくとも１０個の異なる標的配列、少なくとも１１個の異なる標的配列、少なくとも１２個の異なる標的配列、少なくとも１３個の異なる標的配列、少なくとも１４個の異なる標的配列、少なくとも１５個の異なる標的配列、少なくとも１６個の異なる標的配列、少なくとも１７個の異なる標的配列、少なくとも１８個の異なる標的配列、少なくとも１９個の異なる標的配列、少なくとも２０個の異なる標的配列、少なくとも２５個の異なる標的配列、少なくとも３０個の異なる標的配列、少なくとも４０個の異なる標的配列、少なくとも５０個の異なる標的配列、少なくとも７５個の異なる標的配列、または少なくとも１００個の異なる標的配列に関して生じることができる。

Ｉ．核酸フィンガープリント
本開示の方法は、核酸の複雑な試料の核酸フィンガープリントの役割を果たす複製された鎖を作成するのに用いることができる。そのような核酸フィンガープリントは、他の、同様に調製された、他の核酸試料の核酸フィンガープリントと比較して、試料間の差の便利な検出を可能にするために用いることができる。核酸フィンガープリントは、関連する核酸試料の検出、および、核酸試料の比較の両方に用いることができる。たとえば、特定の生物の存在または同定は、その被験生物の核酸フィンガープリントを作製し、および結果として生じる核酸フィンガープリントを、既知の生物から調製された参照核酸フィンガープリントと比較することによって検出できる。遺伝子発現パターンにおける変化および差異はまた、異なる細胞試料に由来するｍＲＮＡの核酸フィンガープリントを調製し、および、その核酸フィンガープリントを比較することによって検出できる。複製された鎖はまた核酸試料の起源に特異的である一組のプローブまたはプライマーを作製するのに用いることができる。複製された鎖はまた、試料中に存在する核酸配列のライブラリとして用いることができる。核酸フィンガープリントは、試料の関係する核酸内容全体が実質的に表現するように、試料の全ゲノム増幅から成るかまたはそれに由来するか、または、試料中の選択された標的配列の複数鎖置換増幅に由来することができる。

基材上に固定化されたアドレスプローブは、本開示の増幅法の産物の、固相検出器上への捕捉を可能にする。そのような捕捉は、以降の検出段階に干渉しうる反応成分を洗浄除去する便利な方法を提供する。異なるアドレスプローブを固相検出器の異なる領域に結合させることによって、異なる増幅産物を、固相検出器上の異なる、およびしたがって診断用の位置に捕捉することができる。たとえば、多重測定法では、多数の異なる増幅核酸（それぞれが、異なるプライマーの組によって増幅された異なる標的配列を表現する）に特異的なアドレスプローブを、それぞれ異なる位置でアレイに固定化することができる。捕捉および検出は、対応する標的配列が試料中に存在した増幅核酸に対応するアレイ位置だけで起こる。

オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は一般的に、オリゴヌクレオチド鎖へ合成中にサブユニットブロックのサブユニットを付加する順序によって決定される。付加の各回は、異なる特定のヌクレオチド前駆体、または１種類以上の異なるヌクレオチド前駆体の混合物を含むことができる。特定配列の本開示のプライマーのためには、特定のヌクレオチド前駆体を連続的に付加する。一般的に、オリゴヌクレオチド中の縮重またはランダム位置は、その位置に存在しうる範囲のヌクレオチドを表現したヌクレオチド前駆体の混合物を用いることによって作製することができる。したがって、オリゴヌクレオチド中の特定位置についての反応に、その位置がＡおよびＴについて縮重すべきである場合、ＡおよびＴの前駆体を含めることができる。完全な縮重またはランダム位置については、４種類すべてのヌクレオチドの前駆体を含めることができる。完全にランダムなオリゴヌクレオチドは、４種類すべてのヌクレオチド前駆体を合成のすべての回に含めることによって作製できる。異なるヌクレオチドの異なる割合を持つ縮重オリゴヌクレオチドもまた作製することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、たとえば、異なるヌクレオチド前駆体を、希望の割合で、反応において用いることによって作製することができる。

本開示の方法は、正確におよび均一に、高度に複雑な核酸試料中のさまざまな配列を増幅することができる。この結果は、たとえば、パーセント表現、配列表現、配列表現偏り、パーセント配列表現、遺伝子座表現、遺伝子座表現偏り、パーセント遺伝子座表現、および／または増幅偏りを参照することによって定量化することができる。たとえば、本開示の方法で作製された増幅された核酸分子は、少なくとも５０％の配列表現または配列表現偏りを少なくとも１０個の異なる標的配列に関して有することができる。増幅偏りは、少なくとも１０個の異なる標的配列に関して１０％未満でありうる。

ＤＮＡ増幅手順の効率は、個々の遺伝子座に関してパーセント表現として記載することができ、ここで細胞から精製された通りのゲノムＤＮＡ中の遺伝子座に関してパーセント表現は１００％である。１０，０００倍増幅については、平均表現頻度は、テンプレートの熱変性無しで増幅したＤＮＡ中の８遺伝子座に関して１４１％、およびテンプレートの熱変性ありで増幅したＤＮＡ中の８遺伝子座に関して３７％であった。熱変性段階の削除の結果として、増幅された遺伝子座に関して表現頻度に３．８倍の増加を生じた。増幅偏りは、増幅されたＤＮＡの２つの試料間で、または、増幅されたＤＮＡの試料とそれが増幅された元のテンプレートＤＮＡとの間で計算することができる。偏りは、特定の遺伝子座に関するパーセント表現（または遺伝子座表現）の値の間の比率である。最大偏りは、最高に表現された遺伝子座の、最低に表現された遺伝子座に対する比率である。１０，０００倍増幅については、最大増幅偏りは、テンプレートの熱変性無しで増幅したＤＮＡに関して２．８、およびテンプレートの熱変性ありで増幅したＤＮＡに関して５０．７であった。熱変性段階の削除の結果として、増幅された遺伝子座に関して最大偏りに１８倍の減少を生じた。パーセント表現は、表現偏りの一種である。したがって、パーセント遺伝子座表現は、遺伝子座表現偏りの一種である。

本開示の方法は、高品質の増幅産物を生じることができる。たとえば、本開示の方法は、少なくとも１０％の遺伝子座表現または遺伝子座表現偏りを少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも１０％の配列表現または配列表現偏りを少なくとも５個の異なる標的配列に関して、５０倍未満の増幅偏りを、５０倍未満の増幅偏りを少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、および／または５０倍未満の増幅偏りを少なくとも５個の異なる標的配列に関して生じることができる。本開示の方法はまた、たとえば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の遺伝子座表現または遺伝子座表現偏りを、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して生じることができる。本開示の方法はまた、たとえば、少なくとも１０％の遺伝子座表現または遺伝子座表現偏りを、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じることができる。

本開示の方法はまた、たとえば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の配列表現または配列表現偏りを、少なくとも５個の異なる標的配列に関して生じることができる。本開示の方法の一部の形式はまた、たとえば、少なくとも１０％の配列表現または配列表現偏りを、少なくとも６個の異なる標的配列、少なくとも７個の異なる標的配列、少なくとも８個の異なる標的配列、少なくとも９個の異なる標的配列、少なくとも１０個の異なる標的配列、少なくとも１１個の異なる標的配列、少なくとも１２個の異なる標的配列、少なくとも１３個の異なる標的配列、少なくとも１４個の異なる標的配列、少なくとも１５個の異なる標的配列、少なくとも１６個の異なる標的配列、少なくとも１７個の異なる標的配列、少なくとも１８個の異なる標的配列、少なくとも１９個の異なる標的配列、少なくとも２０個の異なる標的配列、少なくとも２５個の異なる標的配列、少なくとも３０個の異なる標的配列、少なくとも４０個の異なる標的配列、少なくとも５０個の異なる標的配列、少なくとも７５個の異なる標的配列、または少なくとも１００個の異なる標的配列に関して生じることができる。

ここでは、低い増幅偏りは、少なくとも５配列または遺伝子座に関して１０倍未満、少なくとも６配列または遺伝子座に関して１２倍未満、少なくとも７配列または遺伝子座に関して１４倍未満、少なくとも８配列または遺伝子座に関して１６倍未満、少なくとも９配列または遺伝子座に関して１８倍未満、少なくとも１０配列または遺伝子座に関して２０倍未満、少なくとも１１配列または遺伝子座に関して２２倍未満、少なくとも１２配列または遺伝子座に関して２４倍未満、少なくとも１３配列または遺伝子座に関して２６倍未満、少なくとも１４配列または遺伝子座に関して２８倍未満、少なくとも１５配列または遺伝子座に関して３０倍未満、少なくとも１６配列または遺伝子座に関して３２倍未満、少なくとも１７配列または遺伝子座に関して３４倍未満、少なくとも１８配列または遺伝子座に関して３６倍未満、少なくとも１９配列または遺伝子座に関して３８倍未満、少なくとも２０配列または遺伝子座に関して４０倍未満、少なくとも２１配列または遺伝子座に関して４２倍未満、少なくとも２２配列または遺伝子座に関して４４倍未満、少なくとも２３配列または遺伝子座に関して４６倍未満、少なくとも２４配列または遺伝子座に関して４８倍未満、および少なくとも２５配列または遺伝子座に関して５０倍未満の増幅偏りを含む。一般化すると、低い増幅偏りは、２ｘ倍の増幅偏りを含み、ここでｘは、それに対して増幅偏りを計算するかまたは観察する配列または遺伝子座の数である。低い増幅偏りは、対立遺伝子偏り、遺伝子座表現、配列表現、対立遺伝子表現、遺伝子座表現偏り、配列表現偏り、パーセント表現、パーセント遺伝子座表現、パーセント配列表現、およびインプット核酸の低い偏りおよび／または完全な増幅を示す他の指標によって、といった他の方法で表すことができる。低い増幅偏りを構成するそのような他の指標の値は一般的に、本文書に別に記載する、増幅偏りと偏りの他の指標との間の関係を考慮して、上記の定義および式を参照して計算することができる。

より幅広くは、本開示の方法は、必要なＤＮＡの量が供給量よりも大きい用途に有用である。たとえば、チップハイブリダイゼーション技術によってＤＮＡを分析する手順は、典型的な量の血液試料から精製されうるＤＮＡの量によって制限される。結果として、多数のチップハイブリダイゼーション手順は、その高処理量手順用に十分な供給量の材料を作製するために、ＰＣＲを利用する。本開示の方法は、開始材料の遺伝子座表現頻度を忠実に再現する増幅されたＤＮＡの豊富な量の作製に有用な技術を提示する。

精製されたヒトゲノムＤＮＡがテンプレートの熱処理無しのＭＤＡによって増幅される、本開示の方法の特定の一形式が実施例８に記載される。その実施例に示される通り、本開示の方法は、定量的ＰＣＲ分析の基質として用いる場合、テンプレートの熱処理ありで増幅したＤＮＡと比較して、遺伝子座表現の損失の無いＤＮＡ増幅産物を生じる。

精製されたヒトゲノムＤＮＡがテンプレートの熱処理無しのＭＤＡによって増幅される、本開示の方法の別の特定の一形式が実施例９に記載される。その実施例に示される通り、本開示の方法は、８個の異なる遺伝子座間の表現のばらつきが３．０未満で変動する低い増幅偏りを有するＤＮＡ増幅産物を生じる。対照的に、２種類のＰＣＲを基礎とする増幅法、ＰＥＰおよびＤＯＰ−ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ産物の増幅偏りは、２ないし６桁の間で変動する。

熱処理段階の非存在下で、全血からまたは組織培養細胞から直接に、精製されたＤＮＡからと同一の効率で、ヒトゲノムＤＮＡが増幅される、本開示の方法の別の特定の一形式が実施例１１に記載される。血液または細胞から直接に増幅されたＤＮＡは、精製されたヒトＤＮＡテンプレートから増幅されたＤＮＡと実質的に同一の遺伝子座表現値を有する。全血中のヘムのような成分はＰＣＲを阻害し、および血液由来のＤＮＡがＰＣＲテンプレートとして使用可能になる前に精製段階の必要を生じさせるため、このことは、ＰＣＲといった他の増幅手順に対する長所を表す。

損傷ＤＮＡを増幅および修復するための方法もまた開示される。この方法は、たとえば、分解されたゲノムＤＮＡを増幅するために有用である。本方法は、損傷ＤＮＡ試料を実質的に変性させること（一般的に熱およびアルカリ性条件への曝露によって）、変性条件の除去または低減（たとえば変性したＤＮＡ試料のｐＨおよび温度の低下によって）、およびそのＤＮＡを複製することを含む。損傷ＤＮＡは複製中に修復され、およびＤＮＡの平均長が増大する。たとえば、ＤＮＡ断片の平均長は、たとえば、損傷ＤＮＡ試料中の２ｋｂから、たとえば、増幅されたＤＮＡについての１０ｋｂ以上へ増加することができる。増幅および修復されたＤＮＡは、損傷ＤＮＡ試料よりも、分析および試験のためによい条件にある。たとえば、この技術は、損傷ＤＮＡ試料に由来する対立遺伝子表現に一貫した改善を与えることができる。この修復方法は、すべて損傷ＤＮＡを他の方法によって増幅した場合と比較して、産物の平均長を増加し、増幅産物の品質を３倍に高め（たとえば、試料中のマーカー表現を増加することによって）、および対立遺伝子欠落の頻度を低下させることによって増幅産物の遺伝子型分析を改善することによって、損傷ＤＮＡの増幅における全体的な改善を結果として生じうる。複製は複数置換増幅であることができる。ＤＮＡ試料の変性は一般的に、ＤＮＡがさらに損傷されないように実施される。この方法は一般的に、本開示の増幅法のうち任意のものと組み合わせるかまたは共に使用することができる。この方法の別の一形式は、損傷ＤＮＡ試料を実質的に変性させること（一般的に熱およびアルカリ性条件への曝露によって）、変性したＤＮＡ試料のｐＨの低下、変性したＤＮＡ試料を同一起源に由来する未変性のＤＮＡ試料と混合して未変性ＤＮＡ試料中のＤＮＡの末端が一時的に変性するようにすること、ＤＮＡ試料の混合物をゆっくり冷却して一時的に変性した末端を変性したＤＮＡとアニーリングさせること、およびアニーリングしたＤＮＡを複製することを含みうる。

本開示の方法の一部の形式は、１種類、少数、またはより多くのプライマーによる核酸配列の鎖置換複製に基づく。本方法は核酸試料を増幅するために用いることができ、およびゲノム全体のような高い配列複雑性を有する核酸試料を増幅するために特に有用である。本開示の方法は、１または限られた数のプライマーだけを用いてそのような高度に複雑な核酸試料を増幅するのに用いることができる。１または少数のプライマーが、全ゲノムおよび他の高度な配列複雑性を有する核酸試料を効果的に増幅することができることが見出されている。そのプライマーは、プライマー中に表現されるプライマー配列の限られた量にもかかわらず、高度に複雑な核酸試料中に存在する幅広い範囲の配列をプライミングしおよび効率的に増幅することができるように特別に選択または設計されている。本開示の方法は一般的に、特異的核酸配列を有する１、少数、またはより多くのプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸試料を接触させ、および、核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で核酸試料をインキュベートすることを含む。核酸分子の複製の結果として、複製された鎖が複製中に別の複製された鎖の鎖置換複製によって核酸分子から置換されるように、複製された鎖を生じる。複製は結果として核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の増幅を生じうる。ここでは、複製された鎖とは、核酸分子または核酸配列と、または別の複製された鎖とハイブリダイズしたプライマーの伸長の結果として生じる核酸鎖である。鎖置換複製とは、鎖置換複製とは、複製された鎖の伸長する末端が、テンプレート鎖からの（または別の複製鎖からの）別の鎖に遭遇しおよびそれを置換するＤＮＡ複製をいう。別の複製された鎖による複製鎖の置換は、本開示の方法の顕著な特徴であり、核酸分子または核酸配列の複数コピーを単一の等温反応において作製することを可能にする。

Ｂ．プライマー選択
本開示の方法における使用のためのプライマーは、高品質の増幅産物を生じる能力に関して選択することができる。そのようなプライマーは、本開示の方法において特に有用である。本開示の方法で１種類以上のプライマーが用いられる場合、プライマーの全部が選択プライマーでありうるかまたは、プライマーの一部が選択プライマーでありうる。プライマー選択には任意の有用な基準を用いることができる。有用な基準は、遺伝子座表現、配列表現および増幅偏りといった増幅産物の品質、および、増幅アーティファクトの産生の欠如または最小化といった、負の性質が無いことを含む。所定の複数の選択基準（または１つの選択基準）を満たすプライマーを、ここでは（それらの選択基準についての）選択プライマーという。所定の複数の選択基準（または１つの選択基準）を満たさないプライマーを、ここでは（それらの選択基準についての）非選択プライマーという。選択プライマーの使用が好ましいが、選択および非選択プライマーの両方を、本開示の方法において一緒に使用することができる。

プライマーは、配列表現の、ある一定のレベルまたは範囲を生じることに基づいて選択することができる。任意の配列表現を用いることができる。たとえば、本文書に別に記載する配列表現のうち任意のものを選択基準として用いることができる。選択プライマーは、たとえば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の配列表現を生じることができる。選択プライマーは、たとえば、５００％未満、４００％未満、３００％未満、２５０％未満、２００％未満、１９０％未満、１８０％未満、１７０％未満、１６０％未満、１５０％未満、１４０％未満、１３０％未満、１２０％未満、または１１０％未満の配列表現を生じることができる。これらの配列表現は、たとえば、本文書に別に記載するいくつかの標的配列といった、任意の数の標的配列に関することができる。

プライマーは、遺伝子座表現の、ある一定のレベルまたは範囲を生じることに基づいて選択することができる。任意の遺伝子座表現を用いることができる。たとえば、本文書に別に記載する遺伝子座表現のうち任意のものを選択基準として用いることができる。選択プライマーは、たとえば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の遺伝子座表現を生じることができる。選択プライマーは、たとえば、５００％未満、４００％未満、３００％未満、２５０％未満、２００％未満、１９０％未満、１８０％未満、１７０％未満、１６０％未満、１５０％未満、１４０％未満、１３０％未満、１２０％未満、または１１０％未満の遺伝子座表現を生じることができる。これらの遺伝子座表現は、たとえば、本文書に別に記載するいくつかの遺伝子座といった、任意の数の遺伝子座に関することができる。

非選択プライマーは、配列表現の、ある一定のレベルまたは範囲を生じることに基づいて特定することができる。任意の配列表現を標準として用いることができる。たとえば、本文書に別に記載する配列表現のうち任意のものを非選択基準として用いることができる。非選択プライマーは、０．１％未満、１％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、または１００％未満の配列表現を生じることができる。選択プライマーは、５００％より大、４００％より大、３００％より大、２５０％より大、２００％より大、１９０％より大、１８０％より大、１７０％より大、１６０％より大、１５０％より大、１４０％より大、１３０％より大、１２０％より大、または１１０％より大の配列表現を生じることができる。これらの配列表現は、たとえば、本文書に別に記載するいくつかの標的配列といった、任意の数の標的配列に関することができる。

非選択プライマーは、遺伝子座表現の、ある一定のレベルまたは範囲を生じることに基づいて特定することができる。任意の遺伝子座表現を標準として用いることができる。たとえば、本文書に別に記載する遺伝子座表現のうち任意のものを非選択基準として用いることができる。非選択プライマーは、たとえば、０．１％未満、１％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、または１００％未満の遺伝子座表現を生じることができる。選択プライマーは、たとえば、５００％より大、４００％より大、３００％より大、２５０％より大、２００％より大、１９０％より大、１８０％より大、１７０％より大、１６０％より大、１５０％より大、１４０％より大、１３０％より大、１２０％より大、または１１０％より大の遺伝子座表現を生じることができる。これらの遺伝子座表現は、たとえば、本文書に別に記載するいくつかの遺伝子座といった、任意の数の遺伝子座に関することができる。

本方法は一般的に、損傷ＤＮＡ試料を実質的に変性させること（一般的に熱およびアルカリ性条件への曝露によって）、変性条件の除去または低減（たとえば変性したＤＮＡ試料のｐＨおよび温度の低下によって）、およびそのＤＮＡを複製することを含む。損傷ＤＮＡは複製中に修復され、およびＤＮＡ断片の平均長が増大するたとえば、ＤＮＡ断片の平均長は、たとえば、損傷ＤＮＡ試料中の２ｋｂから、たとえば、増幅されたＤＮＡについての１０ｋｂ以上へ増加することができる。増幅および修復されたＤＮＡは、損傷ＤＮＡ試料よりも、分析および試験のためによい条件にある。たとえば、この技術は、損傷ＤＮＡ試料に由来する対立遺伝子表現に一貫した改善を与えることができる。この修復方法は、すべて損傷ＤＮＡを他の方法によって増幅した場合と比較して、産物の平均長を増加し、増幅産物の品質を３倍に高め（たとえば、試料中のマーカー表現を増加することによって）、および対立遺伝子欠落の頻度を低下させることによって増幅産物の遺伝子型分析を改善することによって、損傷ＤＮＡの増幅における全体的な改善を結果として生じうる。複製は複数置換増幅であることができる。ＤＮＡ試料の変性は一般的に、ＤＮＡがさらに損傷されないように実施される。この方法は一般的に、本開示の増幅法のうち任意のものと組み合わせるかまたは共に使用することができる。

本開示の方法の一部の形式は、複製されたＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列分布に、インプットＤＮＡのヌクレオチド配列分布から変化がもし生じれば最小であるように、試料ＤＮＡの正確でおよび再現性のある複製を提供する。多数の以前の核酸増幅法は、少なくともいくらか重要な程度のアーティファクト変異を、増幅されたＤＮＡの配列中に導入し、増幅された核酸中の異なる配列の表現における、開始核酸中のそれらの配列の表現と比較した偏りに繋がる。そのような偏りは、配列偏りまたは対立遺伝子偏りということができる。

一部の場合では、対立遺伝子偏りに繋がるヌクレオチド組み込みエラーは、増幅されている核酸テンプレートの性質が原因である可能性がある。たとえば、単一のまたは少数のヌクレオチドの反復または複数の反復箇所を含むＤＮＡの領域は、時々ポリメラーゼの滑り（スリッページ）に繋がり、結果として１種類以上のヌクレオチドアーティファクト挿入または欠失を生じうる。このため、反復領域におけるＤＮＡの忠実な増幅は達成が困難になりうる。これらの領域は、ジ、トリ、およびテトラヌクレオチド反復、テロメア領域、長い散在反復を含む領域、ＳＴＲおよび文献に記載された他の種類の反復を含む。大きい二次構造を含むＤＮＡの領域はしばしば、その領域を横切るポリメラーゼの横断を妨げる可能性があり、および複製された鎖の集団内でそのような配列が低表現となることおよび対立遺伝子偏りの導入を結果として生じうる。

対立遺伝子偏りはまた、対立遺伝子表現を評価することによって定量化することもできる。所定の対立遺伝子が表現する、すべての対立遺伝子のうちの割合が、その対立遺伝子に関する対立遺伝子表現である。１つの遺伝子座の２つの対立遺伝子がそれぞれ全体の半分を表現するならば（ヘテロ接合遺伝子座に関して通常の場合）、各対立遺伝子は対立遺伝子表現５０％または０．５を有するということができる。どちらかの対立遺伝子が５０％とは異なる表現を有するならば、対立遺伝子偏りが存在する。インプット核酸における対立遺伝子表現と増幅されたＤＮＡにおける対立遺伝子表現との間に差が無ければ、対立遺伝子偏りは存在せず、対立遺伝子偏り１または１００％と表すことができる。対立遺伝子表現の場合は、対立遺伝子偏りは、比較すべき２つの試料（たとえば、増幅されたＤＮＡに対する増幅されていない試料）における対立遺伝子表現の比として計算することができる。したがって、５０％表現÷５０％表現は１に等しい。対立遺伝子偏りはまた、対立遺伝子表現５０％からの（または通常のまたは予測される対立遺伝子表現からの）標準偏差として表すことができる。インプットＤＮＡ試料および増幅されたＤＮＡ試料の対立遺伝子比が同一であるならば、増幅されたＤＮＡは対立遺伝子偏りを有しないということができる。

本開示の方法は一般的に、低い対立遺伝子偏りを有する増幅されたＤＮＡを生じる。本開示の方法は、増幅された核酸における対立遺伝子偏りおよび他の増幅偏りを測定するのに用いることができる。たとえば、選択された１つの遺伝子座に関してヘテロ接合である個体の場合を考える。この個体に由来するゲノムＤＮＡの、この遺伝子座に関する対立遺伝子比は１である。この個体に由来するゲノムＤＮＡの部分標本を、本開示の方法を用いることによって、全ゲノム増幅に供することができる。対立遺伝子偏りが全ゲノム増幅中に起こったならば、増幅されたＤＮＡは、親対立遺伝子の一方のＤＮＡコピーの、親対立遺伝子の他方と比較してより多い表現を含む。親対立遺伝子のどちらかを含むＤＮＡ断片が、増幅されたＤＮＡ集団において大幅に優位を占めるならば、遺伝子型分析試験はそのＤＮＡ試料を、その親対立遺伝子に関してホモ接合であると採点する可能性があり、ホモ接合正常とする誤診断に繋がる。この、核酸増幅の結果としてヘテロ接合遺伝子型を検出するのに失敗することは、ヘテロ接合欠落または対立遺伝子欠落（ＡＤＯ）ということができる。親対立遺伝子の両方が同一であるホモ接合体の場合は、ＡＤＯは検出がより容易である。本開示の方法は、ホモ接合遺伝子座でのＡＤＯを測定することにも等しく適用可能である。

増幅された核酸の品質の１つの指標は、増幅された核酸におけるパーセント表現、配列表現、配列表現偏り、パーセント配列表現、遺伝子座表現、遺伝子座表現偏り、および／またはパーセント遺伝子座表現であることができる。起源核酸試料における遺伝子座または配列表現と同一かまたは近い遺伝子座表現または配列表現は、最高品質の増幅された核酸を示す。遺伝子座表現偏りは、増幅された核酸中の所定の遺伝子座の量の、増幅されていない核酸試料中の同一の遺伝子座の量に対する比（通常はパーセントで表される）をいうことができる。この計算を行う際には、増幅された核酸試料中の遺伝子座の実測量および増幅されていない核酸試料中の遺伝子座の実測量は一般的に、それぞれ増幅された核酸および増幅されていない核酸試料中に存在する核酸の総量に対して正規化することができる。（通常は参照遺伝子座表現の）パーセンテージとして表した遺伝子座表現または遺伝子座表現偏りは、パーセント遺伝子座表現（パーセント表現の一形式である）ということができる。遺伝子座表現偏りはまた、増幅された試料中の遺伝子座表現の、増幅されていない試料中の遺伝子座表現試料（または他の参照遺伝子座表現）からの標準偏差として表すことができる。遺伝子座表現偏りは、増幅偏りの一形式でありうる。遺伝子座表現は、所定の遺伝子座（または遺伝子座の群）の量またはレベルをいうことができる。遺伝子座表現は、別の、参照遺伝子座表現と比較した遺伝子座表現として表すことができる。したがって、たとえば、パーセント遺伝子座表現は遺伝子座表現の一形式である。

配列表現偏りは、増幅された核酸中の所定の配列の量の、増幅されていない核酸試料中の同一の配列の量に対する比（通常はパーセントで表される）をいうことができる。この計算を行う際には、増幅された核酸試料中の配列の実測量および増幅されていない核酸試料中の配列の実測量は一般的に、それぞれ増幅された核酸および増幅されていない核酸試料中に存在する核酸の総量に対して正規化することができる。（通常は参照配列表現の）パーセンテージとして表した配列表現または配列表現偏り）は、パーセント配列表現（パーセント表現の一形式である）ということができる。配列表現偏りはまた、増幅された試料中の配列表現の、増幅されていない試料中の配列表現試料（または他の参照遺伝子座表現）からの標準偏差として表すことができる。配列表現偏りは、増幅偏りの一形式でありうる。配列表現は、所定の配列（または配列の群）の量またはレベルをいうことができる。配列表現は、別の、参照配列表現と比較した配列表現として表すことができる。したがって、たとえば、パーセント配列表現は配列表現の一形式である。

遺伝子座または配列表現または遺伝子座または配列表現偏りは、測定した１つの、いくつかの、またはすべての遺伝子座または配列に関して、たとえば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％であることができる。遺伝子座または配列表現または遺伝子座または配列表現偏りは、測定した１つの、いくつかの、またはすべての遺伝子座または配列に関して、たとえば、１０％より大、２０％より大、３０％より大、４０％より大、５０％より大、６０％より大、７０％より大、８０％より大、９０％より大、１００％より大、１１０％より大、１２０％より大、１３０％より大、１４０％より大、１５０％より大、１６０％より大、１７０％より大、１８０％より大、１９０％より大、２００％より大、２２５％より大、２５０％より大、２７５％より大、３００％より大、３５０％より大、４００％より大、４５０％より大、５００％より大、６００％より大、７００％より大、８００％より大、９００％より大、または１０００％より大であることができる。遺伝子座または配列表現または遺伝子座または配列表現偏りは、測定した１つの、いくつかの、またはすべての遺伝子座または配列に関して、たとえば、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、１００％未満、１１０％未満、１２０％未満、１３０％未満、１４０％未満、１５０％未満、１６０％未満、１７０％未満、１８０％未満、１９０％未満、２００％未満、２２５％未満、２５０％未満、２７５％未満、３００％未満、３５０％未満、４００％未満、４５０％未満、５００％未満、６００％未満、７００％未満、８００％未満、９００％未満、または１０００％未満であることができる。

遺伝子座または配列表現または遺伝子座または配列表現偏りは、測定した１つの、いくつかの、またはすべての遺伝子座または配列に関して、たとえば、１０％ないし１０００％、１０％ないし９００％、１０％ないし８００％、１０％ないし７００％、１０％ないし６００％、１０％ないし５００％、１０％ないし４００％、１０％ないし３００％、１０％ないし２５０％、１０％ないし２００％、１０％ないし１５０％、１０％ないし１２５％、１０％ないし１００％、２０％ないし１０００％、２０％ないし９００％、２０％ないし８００％、２０％ないし７００％、２０％ないし６００％、２０％ないし５００％、２０％ないし４００％、２０％ないし３００％、２０％ないし２５０％、２０％ないし２００％、２０％ないし１５０％、２０％ないし１２５％、２０％ないし１００％、３０％ないし１０００％、３０％ないし９００％、３０％ないし８００％、３０％ないし７００％、３０％ないし６００％、３０％ないし５００％、３０％ないし４００％、３０％ないし３００％、３０％ないし２５０％、３０％ないし２００％、３０％ないし１５０％、３０％ないし１２５％、３０％ないし１００％、４０％ないし１０００％、４０％ないし９００％、４０％ないし８００％、４０％ないし７００％、４０％ないし６００％、４０％ないし５００％、４０％ないし４００％、４０％ないし３００％、４０％ないし２５０％、４０％ないし２００％、４０％ないし１５０％、４０％ないし１２５％、４０％ないし１００％、５０％ないし１０００％、５０％ないし９００％、５０％ないし８００％、５０％ないし７００％、５０％ないし６００％、５０％ないし５００％、５０％ないし４００％、５０％ないし３００％、５０％ないし２５０％、５０％ないし２００％、５０％ないし１５０％、５０％ないし１２５％、５０％ないし１００％、６０％ないし１０００％、６０％ないし９００％、６０％ないし８００％、６０％ないし７００％、６０％ないし６００％、６０％ないし５００％、６０％ないし４００％、６０％ないし３００％、６０％ないし２５０％、６０％ないし２００％、６０％ないし１５０％、６０％ないし１２５％、６０％ないし１００％、７０％ないし１０００％、７０％ないし９００％、７０％ないし８００％、７０％ないし７００％、７０％ないし６００％、７０％ないし５００％、７０％ないし４００％、７０％ないし３００％、７０％ないし２５０％、７０％ないし２００％、７０％ないし１５０％、７０％ないし１２５％、７０％ないし１００％、８０％ないし１０００％、８０％ないし９００％、８０％ないし８００％、８０％ないし７００％、８０％ないし６００％、８０％ないし５００％、８０％ないし４００％、８０％ないし３００％、８０％ないし２５０％、８０％ないし２００％、８０％ないし１５０％、８０％ないし１２５％、８０％ないし１００％、９０％ないし１０００％、９０％ないし９００％、９０％ないし８００％、９０％ないし７００％、９０％ないし６００％、９０％ないし５００％、９０％ないし４００％、９０％ないし３００％、９０％ないし２５０％、９０％ないし２００％、９０％ないし１５０％、９０％ないし１２５％、９０％ないし１００％、１００％ないし１０００％、１００％ないし９００％、１００％ないし８００％、１００％ないし７００％、１００％ないし６００％、１００％ないし５００％、１００％ないし４００％、１００％ないし３００％、１００％ないし２５０％、１００％ないし２００％、１００％ないし１５０％、または１００％ないし１２５％であることができる。

上記および本文書に別に記載するさまざまな遺伝子座表現および遺伝子座表現偏りは、たとえば、１遺伝子座、２遺伝子座、３遺伝子座、４遺伝子座、５遺伝子座、６遺伝子座、７遺伝子座、８遺伝子座、９遺伝子座、１０遺伝子座、１１遺伝子座、１２遺伝子座、１３遺伝子座、１４遺伝子座、１５遺伝子座、１６遺伝子座、１７遺伝子座、１８遺伝子座、１９遺伝子座、２０遺伝子座、２５遺伝子座、３０遺伝子座、４０遺伝子座、５０遺伝子座、７５遺伝子座、または１００遺伝子座に関することができる。遺伝子座表現または遺伝子座表現偏りは、たとえば、少なくとも１遺伝子座、少なくとも２遺伝子座、少なくとも３遺伝子座、少なくとも４遺伝子座、少なくとも５遺伝子座、少なくとも６遺伝子座、少なくとも７遺伝子座、少なくとも８遺伝子座、少なくとも９遺伝子座、少なくとも１０遺伝子座、少なくとも１１遺伝子座、少なくとも１２遺伝子座、少なくとも１３遺伝子座、少なくとも１４遺伝子座、少なくとも１５遺伝子座、少なくとも１６遺伝子座、少なくとも１７遺伝子座、少なくとも１８遺伝子座、少なくとも１９遺伝子座、少なくとも２０遺伝子座、少なくとも２５遺伝子座、少なくとも３０遺伝子座、少なくとも４０遺伝子座、少なくとも５０遺伝子座、少なくとも７５遺伝子座、または少なくとも１００遺伝子座に関することができる。

遺伝子座表現または遺伝子座表現偏りは、たとえば、１遺伝子座、２個の異なる遺伝子座、３個の異なる遺伝子座、４個の異なる遺伝子座、５個の異なる遺伝子座、６個の異なる遺伝子座、７個の異なる遺伝子座、８個の異なる遺伝子座、９個の異なる遺伝子座、１０個の異なる遺伝子座、１１個の異なる遺伝子座、１２個の異なる遺伝子座、１３個の異なる遺伝子座、１４個の異なる遺伝子座、１５個の異なる遺伝子座、１６個の異なる遺伝子座、１７個の異なる遺伝子座、１８個の異なる遺伝子座、１９個の異なる遺伝子座、２０個の異なる遺伝子座、２５個の異なる遺伝子座、３０個の異なる遺伝子座、４０個の異なる遺伝子座、５０個の異なる遺伝子座、７５個の異なる遺伝子座、または１００個の異なる遺伝子座に関することができる。遺伝子座表現または遺伝子座表現偏りは、たとえば、少なくとも１遺伝子座、少なくとも２個の異なる遺伝子座、少なくとも３個の異なる遺伝子座、少なくとも４個の異なる遺伝子座、少なくとも５個の異なる遺伝子座、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関することができる。

上記および本文書に別に記載するさまざまな配列表現および配列表現偏りは、たとえば、１標的配列、２標的配列、３標的配列、４標的配列、５標的配列、６標的配列、７標的配列、８標的配列、９標的配列、１０標的配列、１１標的配列、１２標的配列、１３標的配列、１４標的配列、１５標的配列、１６標的配列、１７標的配列、１８標的配列、１９標的配列、２０標的配列、２５標的配列、３０標的配列、４０標的配列、５０標的配列、７５標的配列、または１００標的配列に関することができる。配列表現または配列表現偏りは、たとえば、少なくとも１標的配列、少なくとも２標的配列、少なくとも３標的配列、少なくとも４標的配列、少なくとも５標的配列、少なくとも６標的配列、少なくとも７標的配列、少なくとも８標的配列、少なくとも９標的配列、少なくとも１０標的配列、少なくとも１１標的配列、少なくとも１２標的配列、少なくとも１３標的配列、少なくとも１４標的配列、少なくとも１５標的配列、少なくとも１６標的配列、少なくとも１７標的配列、少なくとも１８標的配列、少なくとも１９標的配列、少なくとも２０標的配列、少なくとも２５標的配列、少なくとも３０標的配列、少なくとも４０標的配列、少なくとも５０標的配列、少なくとも７５標的配列、または少なくとも１００標的配列に関することができる。

配列表現または配列表現偏りは、たとえば、１標的配列、２個の異なる標的配列、３個の異なる標的配列、４個の異なる標的配列、５個の異なる標的配列、６個の異なる標的配列、７個の異なる標的配列、８個の異なる標的配列、９個の異なる標的配列、１０個の異なる標的配列、１１個の異なる標的配列、１２個の異なる標的配列、１３個の異なる標的配列、１４個の異なる標的配列、１５個の異なる標的配列、１６個の異なる標的配列、１７個の異なる標的配列、１８個の異なる標的配列、１９個の異なる標的配列、２０個の異なる標的配列、２５個の異なる標的配列、３０個の異なる標的配列、４０個の異なる標的配列、５０個の異なる標的配列、７５個の異なる標的配列、または１００個の異なる標的配列に関することができる。配列表現または配列表現偏りは、たとえば、少なくとも１標的配列、少なくとも２個の異なる標的配列、少なくとも３個の異なる標的配列、少なくとも４個の異なる標的配列、少なくとも５個の異なる標的配列、少なくとも６個の異なる標的配列、少なくとも７個の異なる標的配列、少なくとも８個の異なる標的配列、少なくとも９個の異なる標的配列、少なくとも１０個の異なる標的配列、少なくとも１１個の異なる標的配列、少なくとも１２個の異なる標的配列、少なくとも１３個の異なる標的配列、少なくとも１４個の異なる標的配列、少なくとも１５個の異なる標的配列、少なくとも１６個の異なる標的配列、少なくとも１７個の異なる標的配列、少なくとも１８個の異なる標的配列、少なくとも１９個の異なる標的配列、少なくとも２０個の異なる標的配列、少なくとも２５個の異なる標的配列、少なくとも３０個の異なる標的配列、少なくとも４０個の異なる標的配列、少なくとも５０個の異なる標的配列、少なくとも７５個の異なる標的配列、または少なくとも１００個の異なる標的配列に関することができる。

増幅された核酸の品質のもう１つの指標は、増幅された核酸における増幅偏りであることができる。増幅偏りとは、核酸試料中の異なる配列の増幅のレベルにおける差である。低い増幅偏りは、最高品質の増幅された核酸を示す。増幅偏りの１つの表現は、増幅された核酸における、最高の遺伝子座表現偏りを有する遺伝子座の遺伝子座表現偏りの、最低の遺伝子座表現偏りを有する遺伝子座表現偏りに対する比（通常は差の倍数またはパーセント差として表される）として計算することができる。増幅偏りのもう１つの表現は、増幅された核酸における、最高の遺伝子座表現を有する遺伝子座の遺伝子座表現の、最低の遺伝子座表現を有する遺伝子座表現に対する比（通常は差の倍数またはパーセント差として表される）として計算することができる。配列表現偏りが測定されるならば、増幅偏りを、増幅された核酸における、最高の配列表現偏りを有する配列の配列表現偏りの、最低の配列表現偏りを有する配列表現偏りに対する比（通常は差の倍数として表される）として計算することができる。増幅偏りは、増幅された核酸における、最高の配列表現を有する配列の配列表現の、最低の配列表現を有する配列表現に対する比（通常は差の倍数として表される）として計算することができる。上記の計算は、評価したすべての遺伝子座または配列に関する増幅偏りの指標であるが、評価した遺伝子座または配列の部分集合を用いて増幅偏りを計算することができる。実際、増幅偏りを、個々の遺伝子座、配列または対立遺伝子に関して計算することができる。したがって、たとえば、増幅偏りはまた、増幅された核酸における、１つ以上の遺伝子座の遺伝子座表現偏りの、１つ以上の別の遺伝子座の遺伝子座表現偏りに対する比（通常は差の倍数またはパーセント差として表される）として計算することができる。別の一例として、増幅偏りはまた、１つ以上の遺伝子座の増幅されていない試料における遺伝子座表現の、同一の遺伝子座の増幅された試料における遺伝子座表現に対する比（通常は差の倍数またはパーセント差として表される）として計算することができる。

ＤＮＡ増幅手順の効率は、個々の遺伝子座に関してその遺伝子座のパーセント表現（すなわち、遺伝子座表現）として記載することができ、ここで細胞から精製された通りのゲノムＤＮＡ中の遺伝子座に関して遺伝子座表現は１００％である。１０，０００倍増幅については、平均表現頻度は、テンプレートの熱変性無しで増幅したＤＮＡ中の８遺伝子座に関して１４１％、およびテンプレートの熱変性ありで増幅したＤＮＡ中の８遺伝子座に関して３７％であった。熱変性段階の削除の結果として、増幅された遺伝子座に関して表現頻度に３．８倍の増加を生じた。増幅偏りは、増幅されたＤＮＡの２つの試料間で、または、増幅されたＤＮＡの試料とそれが増幅された元のテンプレートＤＮＡとの間で計算することができる。偏りは、特定の遺伝子座に関するパーセント表現（遺伝子座表現）の値の間の比率である。最大偏りは、最高に表現された遺伝子座の、最低に表現された遺伝子座に対する比率である。１０，０００倍増幅については、最大増幅偏りは、テンプレートの熱変性無しで増幅したＤＮＡに関して２．８、およびテンプレートの熱変性ありで増幅したＤＮＡに関して５０．７であった。熱変性段階の削除の結果として、増幅された遺伝子座に関して最大偏りに１８倍の減少を生じた。

本開示の方法は、テンプレートＤＮＡの熱処理ありで実施される増幅と比較して遺伝子分析における性能が向上したＤＮＡ増幅産物を生じることができる。テンプレートの熱処理無しで生じた、より長いＤＮＡ産物は、サザンブロッティング、およびＲＦＬＰを用いた遺伝子分析で、より大きなＤＮＡ断片を与える。本開示の方法は、定量的ＰＣＲ分析の基質として用いる場合、テンプレートの熱処理ありで増幅したＤＮＡと比較して、遺伝子座表現の損失の無いＤＮＡ増幅産物を生じる。本開示の方法は、８個の異なる遺伝子座間の表現のばらつきが３．０未満で変動する低い増幅偏りを有するＤＮＡ増幅産物を生じる。対照的に、２種類のＰＣＲを基礎とする増幅法、ＰＥＰおよびＤＯＰ−ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ産物の増幅偏りは、２ないし６桁の間で変動する。

本開示の方法の別の具体的な一形式は、熱処理段階の非存在下で、全血からまたは組織培養細胞から直接の、ゲノムＤＮＡの増幅を含む。そのような増幅は、精製されたＤＮＡからと同一の効率で達成することができる。血液または細胞から直接に増幅されたＤＮＡは、精製されたヒトＤＮＡテンプレートから増幅されたＤＮＡと実質的に同一の遺伝子座表現値を有しうる。全血中のヘムのような成分はＰＣＲを阻害し、および血液由来のＤＮＡがＰＣＲテンプレートとして使用可能になる前に精製段階の必要を生じさせるため、このことは、ＰＣＲといった他の増幅手順に対する長所を表す。

プライマーは、ゲノム核酸試料のＧ＋Ｃ比率の２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、または１％以内のＧ＋Ｃ比率を有することができる。プライマーは、使用した種類のゲノム核酸試料について、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも１０％の遺伝子座表現を生じる。プライマーは、使用した種類のゲノム核酸試料について、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の遺伝子座表現を生じる。プライマーは、使用した種類のゲノム核酸試料について、少なくとも１０％の遺伝子座表現を、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じる。

ゲノムを増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させ、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でゲノム核酸試料をインキュベートすることを含み、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの全部または相当な部分を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果として少なくとも１０％の遺伝子座表現を、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して生じる方法もまた開示される。そのゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は、結果として少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の遺伝子座表現を、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して生じる。

ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は、結果として少なくとも１０％の遺伝子座表現を、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じる。

高い配列複雑性の核酸試料を増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸試料を接触させ、および核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で核酸試料をインキュベートすることを含み、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、核酸試料が少なくとも１×１０³ヌクレオチドの配列複雑性を有し、核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、核酸試料中の核酸分子の複製が結果として少なくとも１０％の配列表現を、少なくとも５個の異なる標的配列に関して生じる方法もまた開示される。

核酸試料中の核酸分子の複製は、結果として少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の配列表現を、少なくとも５個の異なる標的配列に関して生じる。

核酸試料中の核酸分子の複製は、結果として少なくとも１０％の配列表現を、少なくとも６個の異なる標的配列、少なくとも７個の異なる標的配列、少なくとも８個の異なる標的配列、少なくとも９個の異なる標的配列、少なくとも１０個の異なる標的配列、少なくとも１１個の異なる標的配列、少なくとも１２個の異なる標的配列、少なくとも１３個の異なる標的配列、少なくとも１４個の異なる標的配列、少なくとも１５個の異なる標的配列、少なくとも１６個の異なる標的配列、少なくとも１７個の異なる標的配列、少なくとも１８個の異なる標的配列、少なくとも１９個の異なる標的配列、少なくとも２０個の異なる標的配列、少なくとも２５個の異なる標的配列、少なくとも３０個の異なる標的配列、少なくとも４０個の異なる標的配列、少なくとも５０個の異なる標的配列、少なくとも７５個の異なる標的配列、または少なくとも１００個の異なる標的配列に関して生じる。

ゲノムを増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させ、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でゲノム核酸試料をインキュベートすることを含み、そのプライマーの組が１種類以上の選択プライマーを含み、各選択プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの全部または相当な部分を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の複製を生じ、その組に含まれる各選択プライマーが、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および選択核酸試料を接触させ選択核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でインキュベートする際に、少なくとも１０％の配列表現を、選択核酸試料中の少なくとも１０個の核酸配列に関して生じることができ、選択核酸試料が少なくとも１×１０⁸ヌクレオチドの配列複雑性を有する方法もまた開示される。

核酸を増幅する方法であって、一組のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸試料を接触させ、および核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で核酸試料をインキュベートすることを含み、そのプライマーの組が１種類以上の選択プライマーを含み、各選択プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、核酸試料中の核酸分子の複製が結果として核酸試料中の核酸分子の全部または相当な部分の複製を生じ、その組に含まれる各選択プライマーが、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および選択核酸試料を接触させ選択核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下でインキュベートする際に、少なくとも１０％の配列表現を、選択核酸試料中の少なくとも１０個の核酸配列に関して生じることができ、選択核酸試料が少なくとも１×１０⁸ヌクレオチドの配列複雑性を有する方法もまた開示される。

複製された鎖の増幅偏りは、試料中の少なくとも１０個の標的配列に関して２０倍未満であることができる。複製された鎖の増幅偏りは、試料中の少なくとも１０個の標的配列に関して１０倍未満であることができる。複製された鎖の遺伝子座表現は、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して少なくとも１０％であることができる。複製された鎖の遺伝子座表現は、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％であることができる。複製された鎖の遺伝子座表現は、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して少なくとも１０％であることができる。

増幅産物中の遺伝子座表現の定量化。特定の遺伝子座の定量化は、アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）によって開発されたＴａｑＭａｎ（登録商標）測定系を用いて実施することができる。ＴａｑＭａｎ測定は、特定のゲノムＤＮＡ配列の収率を測定することができる。ｃ−ＪＵＮ（アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、品番４３１８２９９ＦまたはＴ）およびヒトＲＦＬＰＯ（大リボソームタンパク質）（アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、品番４３１０８７９Ｅ）を測定する２つの代表的なＴａｑＭａｎ測定法が、増幅性能の評価に用いられている。ＲＦＬＰＯおよびｃ−ＪＵＮに関しては、テンプレートｇＤＮＡに対する増幅されたｇＤＮＡ中のある特定の遺伝子座のコピー数間の比として定義される、遺伝子座表現は、開始テンプレートヒトｇＤＮＡの品質に応じて、４０ないし２００％の間にあるべきである。

２．増幅産物の定量的ＰＣＲ分析
増幅されたＤＮＡの品質はＴａｑＭａｎ分析を用いて評価した。ＴａｑＭａｎ分析はＡＢＩ７７００および７０００配列検出系の両方を用いて取扱説明書（アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ））に従って実施した。ＴａｑＭａｎ反応は５０μｌの１ｘプラチナＴａｑポリメラーゼ緩衝液、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、１μｌのＲＯＸリファレンス色素（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））、１ユニットのプラチナＴａｑポリメラーゼ（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）））、各０．３μＭの順方向および逆方向ＰＣＲプライマー、０．２５μＭのＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ蛍光／消光プローブ、および１μｇのＭＤＡ増幅されたＤＮＡから成る。精製されたヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））を用いて０、０．００１、０．０１、０．１、および１μｇのｇＤＮＡの標準曲線を作成し、ＭＤＡ増幅されたＤＮＡを定量化した。遺伝子座表現（ＭＤＡ／ｇＤＮＡ）はパーセントとして記録し、および１００（遺伝子座コピー数／μｇＭＤＡ産物）／（遺伝子座コピー数／μｇｇＤＮＡ）として導いた。１００％の値は、増幅されたＤＮＡに関する遺伝子座コピー数が、増幅されていないゲノムＤＮＡに関する遺伝子座コピー数と等しいことを示す。

３．単一プライマー
ヒトゲノムＤＮＡを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ遺伝子座分析を行った。単一の６ヌクレオチドＡｌｕ特異的プライマー（すなわち、その配列はＡｌｕ反復配列に由来した）であるＡｌｕＲ１１（ＡＧＣＧＡＧ）をＭＤＡ反応に使用した。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図１に示す通り、ＡｌｕＲ１１は遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。

４．２プライマー
２種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ遺伝子座分析を行った。２種類のプライマー配列はＡＧＴＧＧＧおよびＡＧＡＧＡＧであった。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図２に示す通り、２種類の６ヌクレオチドプライマーは遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。

５．３プライマー
３種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ遺伝子座分析を行った。プライマーは、配列ＡＧＣＣＧＧ、ＡＧＴＡＧＧ、およびＡＧＴＴＧＧ．を有する６ヌクレオチド非Ａｌｕプライマー（すなわち、その配列はＡｌｕ反復配列に由来しなかった）であった。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図３に示す通り、３種類のプライマーは遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。

６．４プライマー
４種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ遺伝子座分析を行った。プライマーは配列ＡＧＧＣＧＧ、ＡＧＴＧＧＧ、ＡＧＧＧＡＧ、およびＡＧＴＧＡＧ．を有する６ヌクレオチドプライマーであった。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図４に示す通り、４種類のプライマーは遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。

７．５プライマー
５種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ遺伝子座分析を行った。最初の例では、プライマーは配列ＡＧＴＧＧＧ、ＡＧＣＣＡＧ、ＡＧＴＴＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、およびＡＧＡＣＡＧを有する６ヌクレオチドプライマーであった。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図５に示す通り、これらの５種類のプライマーは遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。

第２の例では、プライマーは配列ＡＧＡＧＧＧ、ＡＧＧＣＡＧ、ＡＧＣＣＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、およびＡＧＡＣＡＧ．を有する６ヌクレオチドプライマーであった。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図６に示す通り、これらの５種類のプライマーは遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。

第３の例では、プライマーは配列ＡＧＴＡＧＧ、ＡＧＧＴＧＧ、ＡＧＧＣＡＧ、ＡＧＡＣＡＧ、およびＡＧＴＧＡＧ．を有する６ヌクレオチドプライマーであった。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図７に示す通り、これらの５種類のプライマーは遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。

第４の例では、プライマーは配列ＡＧＣＧＡＧ，ＡＧＧＡＧＧ，ＡＧＡＧＧＧ，ＡＧＧＧＡＧ，およびＡＧＴＧＡＧを有する６ヌクレオチドプライマーであった。プライマーのうちの１種類（ＡＧＣＧＡＧ）はＡｌｕ配列に特異的であった。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図８に示す通り、これらの５種類のプライマーは遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。

８．９プライマー
９種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ遺伝子座分析を行った。プライマーは、ＡｌｕＲ９Ｈと呼ばれる６ヌクレオチドＡｌｕ特異的プライマーであった。９種類すべてのＡｌｕ特異的プライマーの名称および配列を表２に示す。星印はホスホチオエート結合を示す。計１０遺伝子座を分析した。図９に示す通り、９種類のプライマーは遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。

９．１２プライマー
１２種類の特異的プライマーを用いて、ヒトゲノムＤＮＡを、上記の通り、複数置換増幅によって増幅し、次いでＴａｑＭａｎ遺伝子座分析を行った。プライマーは、ＡｌｕＲ１２Ｈと呼ばれる６ヌクレオチドＡｌｕ特異的プライマーであった。１２種類すべてのＡｌｕ特異的プライマーの名称および配列を表３に示す。星印はホスホチオエート結合を示す。計４７遺伝子座を分析した（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）。図１０に示す通り、１２種類のプライマーは遺伝子座表現によって示す通り効率的にヒト全ゲノムを増幅した。

ｖ．縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）によるヒトゲノムＤＮＡの増幅。
ヒトゲノムＤＮＡ（３００ｎｇないし０．０３ｎｇの範囲にわたる）を記載の通り増幅した（テレニウス（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ）他，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１３：７１８−７２５（１９９２））。放射性標識したα−［³²Ｐ］ｄＣＴＰ、約６０ｃｐｍ／ｐｍｏｌの総ｄＮＴＰを、ＰＣＲ産物収率の定量のために反応へ加えた。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼはインビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）からであった。ＤＯＰ−ＰＣＲ増幅はＧｅｎｅＡｍｐ９７００ＰＣＲシステムズサーモサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ））を用いて実施した。ＤＯＰ−ＰＣＲ産物中の遺伝子座表現を、ＴａｑＭａｎ測定法（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））を用いて定量的に分析した。

ｖｉ．プライマー伸長プレ増幅（ＰＥＰ）によるヒトゲノムＤＮＡの増幅。
ヒトゲノムＤＮＡ（３００ｎｇないし０．０３ｎｇの範囲にわたる）を総容量６０μｌで０．２ｍｌチューブに入れ、終濃度３３μＭのＰＥＰランダムプライマー（５'−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−３'）を記載の通りに（チャン（Ｚｈａｎｇ）他，単一の細胞からの全ゲノム増幅：遺伝子分析への示唆（Ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒｏｍａｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ．）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．８９：５８４７−５８５１（１９９２））与えた。放射性標識したα−［³²Ｐ］ｄＣＴＰ、約６０ｃｐｍ／ｐｍｏｌの総ｄＮＴＰを、ＰＣＲ産物収率の定量のために反応へ加えた。ＰＥＰ反応はＧｅｎｅＡｍｐ９７００ＰＣＲシステムズサーモサイクラー（アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ））を用いて実施した。ＰＥＰ産物中の遺伝子座表現を、ＴａｑＭａｎ測定法（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ））を用いて定量的に分析した。

２．結果
本開示の方法の実施形態を用いて、３０ｐｇ（約９ゲノムコピー）のヒトゲノムＤＮＡが約３０μｇへ４時間以内に増幅された。平均断片長は１０ｋｂより大であった。増幅されたヒトＤＮＡは１０個の一塩基多型（ＳＮＰ）に関して正常の表現を示した。８染色体遺伝子座中の最大偏りは、ＰＣＲを基礎とするＷＧＡ法についての４から６桁と対照的に、３倍未満であった。本開示の方法を用いて増幅されたヒトＤＮＡは、一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型分析、染色体染色、サザンブロッティングおよびＲＦＬＰ分析、サブクローニング、およびＤＮＡ配列決定を含む遺伝子分析の一般的な方法について有用である。

配列偏りが、増幅法において生じる可能性があり、および、プライミング効率、テンプレート接触可能性、ＧＣ含量、およびテロメアおよびセントロメアへの近接といった因子の結果として起こりうる。本開示のＭＤＡ法の増幅偏りを、染色体１のセントロメアに近い遺伝子（コネキシン４０）および染色体６のテロメアに隣接する遺伝子（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体６）を含む８遺伝子に関するＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲによって検討した。熱変性無しの１００、１，０００、および１０，０００倍ＭＤＡについて、最大増幅偏りは、最も高表現された遺伝子の最も低表現された遺伝子に対する比として表して、それぞれ２．７、２．３、および２．８だけであった。対照的に、ＰＣＲを基礎とする２つのＷＧＡ法であるＤＯＰ−ＰＣＲ（テレニウス（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ）他，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１３：７１８−７２５（１９９２）；チューン（Ｃｈｅｕｎｇ）およびネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ），ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．９３：１４６７６−１４６７９（１９９６））およびＰＥＰ（チャン（Ｚｈａｎｇ）他，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．８９：５８４７−５８５１（１９９２））は、４〜６桁の増幅偏りを示した。これらの値は、ＰＣＲ媒介ＷＧＡ法の偏りの文献値と合致した；ＰＥＰは、同一の遺伝子の２対立遺伝子間でさえ最大５０倍の増幅偏りを生じることが報告されている（ポーニオ（Ｐａｕｎｉｏ）他，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：１３８２−１３９０（１９９６））。注目すべきことに、ＭＤＡの３倍増幅偏りは１００ないし１００，０００倍増幅でほぼ一定に留まった。ＭＤＡを基礎とするＷＧＡで観察された、顕著な配列偏りの無いことは、φ２９ＤＮＡポリメラーゼの非常な連続性によって説明されうる（ブランコ（Ｂｌａｎｃｏ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８９３５−８９４０（１９８９））。ポリメラーゼのテンプレートへの固い結合は、ＤＮＡ一次または二次構造によって引き起こされる障害を通じての複製を確実にする。

驚くべきことに、ＴａｑＭａｎ定量化は、増幅されたＤＮＡにおいて一部の遺伝子座がＭＤＡによって豊富になったことを示した；遺伝子座表現が、ゲノムＤＮＡにおける表現の１００％より大であった。ミトコンドリアＤＮＡの表現は、開始ｇＤＮＡと増幅されたＤＮＡとの間で同一であった。サザンブロットおよび染色体染色実験は、反復配列がＭＤＡ産物中で低表現され、遺伝子の有効な増加を与えたことを示した。このように、増幅されたＤＮＡは、ゲノムＤＮＡと比較して、８遺伝子の１００〜３００％の間のコピー数を含んだ。反復配列低表現の程度および種類を特定するためには追加の試験が必要となる。；この観察についての１つの仮説は、高度に反復する配列に対応するプライマーがＭＤＡ中に枯渇するというものである。しかし、ＰＣＲを基礎とするＷＧＡ産物は、最大７０％の増幅アーティファクトを含む（チューン（Ｃｈｅｕｎｇ）およびネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ），縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いる全ゲノム増幅は１ナノグラム未満のゲノムＤＮＡについて数百の遺伝子型分析を実施することを可能にする（ＷｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｕｓｉｎｇａｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒａｌｌｏｗｓｈｕｎｄｒｅｄｓｏｆｇｅｎｏｔｙｐｅｓｔｏｂｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎｌｅｓｓｔｈａｎｏｎｅｎａｎｏｇｒａｍｏｆｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ．）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．９３：１４６７６−１４６７９（１９９６））が、これとは対照的に、ＭＤＡを基礎とするＷＧＡ産物は完全にゲノム配列に由来するように見える。

要約すると、ＭＤＡを基礎とするＷＧＡの有用性が、定量的ＰＣＲ、ＳＮＰ遺伝子型分析、制限断片のサザンブロット分析、および染色体染色を含むいくつかの用途について実証された。ＭＤＡがＷＧＡのための最適な方法に相当しうるいくつかの状況を考えることができる：第１に、ＷＧＡ中の忠実な複製が必要である用途、たとえば分子クローニング、または単一細胞分析；第２に、ＷＧＡ中の適当なゲノム表現が決定的である用途、たとえばゲノム全体のＳＮＰ遺伝子型分析試験；および第３に、ＷＧＡ中の偏りの最小化が重要である場合、特に出生前診断（ハーパー（Ｈａｒｐｅｒ）およびウェルズ（Ｗｅｌｌｓ），ＰＧＤにおける近年の進歩および将来の開発（ＲｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓａｎｄｆｕｔｕｒｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎＰＧＤ）ＰｒｅｎａｔＤｉａｇｉｌ．１９：１１９３−１１９９（１９９９））、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）およびデルハンティ（Ｄｅｌｈａｎｔｙ），全ゲノム増幅および単一細胞比較ゲノムハイブリダイゼーションを用いるヒト着床前胚の比較染色体分析（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｅｍｂｒｙｏｓｕｓｉｎｇｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．）ＭｏｌＨｕｍＲｅｐｒｏｄ．６：１０５５１０６２（２０００））、およびヘテロ接合性の消失の評価（パールソン（Ｐａｕｌｓｏｎ）他，全ゲノム増幅、細胞ソーティング、および蛍光を基礎とするＰＣＲを用いるヘテロ接合性の消失分析（Ｌｏｓｓｏｆｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇ，ａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｂａｓｅｄＰＣＲ．）ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．９：４８２−４９１（１９９９））といった細胞遺伝学試験。ＷＧＡへの顕著な必要性がある別の状況は、顕微解剖組織に由来するＤＮＡの増幅（キム（Ｋｉｍ）他，パラフィン包埋前立腺腺がん腫瘍組織由来のＤＮＡの全ゲノム増幅および分子遺伝的分析（ＷｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＤＮＡｆｒｏｍｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄｐｒｏｓｔａｔｅａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅ．）ＪＵｒｏｌ．１６２：１５１２−１５１８（１９９９）、頬側塗抹標本（ギレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）他，全ゲノム増幅した口腔スワブＤＮＡのＨＬＡクラスＩＩ分類（ＨＬＡｃｌａｓｓＩＩｔｙｐｉｎｇｏｆｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｍｏｕｔｈｓｗａｂＤＮＡ．）ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ．５６：５３０−５３８（２０００））、および保管された人類学試料（ブキャナン（Ｂｕｃｈａｎａｎ）他，稀な保存された人類学試料の長ＤＯＰ−ＰＣＲ（ＬｏｎｇＤＯＰ−ＰＣＲｏｆｒａｒｅａｒｃｈｉｖａｌａｎｔｈｒｏｐｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓ．）ＨｕｍＢｉｏｌ．７２：９１１−９２５（２０００））を含む。最後に、分類された個々の染色体から増幅されたＤＮＡを、全染色体特異的染色プローブの作製に用いることができる（ギリアー・ゲンシック（Ｇｕｉｌｌｉｅｒ−Ｇｅｎｃｉｋ）他，ニワトリ巨大染色体のそれぞれに特異的な全染色体染色プローブの作製（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｗｈｏｌｅ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｐａｉｎｔｉｎｇｐｒｏｂｅｓｓｐｅｃｉｆｉｃｔｏｅａｃｈｃｈｉｃｋｅｎｍａｃｒｏｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．）ＣｙｔｏｇｅｎｅｔＣｅｌｌＧｅｎｅｔ．８７：２８２−２８５（１９９９））。

Ｈ．実施例８：９５℃でのＤＮＡテンプレートインキュベートの省略はＭＤＡによって増幅されたＤＮＡ産物における遺伝子座表現の増加を結果として生じる。
本実施例は、９５℃（典型的な増幅反応においてＤＮＡを変性させるために用いられる）でのテンプレートＤＮＡインキュベートの省略が、ＭＤＡによって増幅されたＤＮＡ産物における８個のランダムに選択された遺伝子座の表現の損失を結果として生じなかったことを実証する。９５℃でのＤＮＡテンプレートインキュベートの省略は実際、テンプレートゲノムＤＮＡと比較してＤＮＡ増幅産物の遺伝子座表現における増加を結果として生じる。

ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量ＰＣＲ分析を、ＡＢＩ７７００を取扱説明書（アプライド・バイオシステムズ社（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ））に従って用いて、１μｇのＭＤＡ増幅されたＤＮＡをテンプレートとして用いて実施した。試験した８遺伝子座に対するＴａｑＭａｎ（登録商標）測定試薬はＡＢＩから入手した。８遺伝子座およびそれらの染色体位置は、酸性リボソームタンパク質（１ｐ３６．１３）；コネキシン４０（１ｑ２１．１）；ｃ−Ｊｕｎ（１ｐ３２−ｐ３１）；ＭＫＰ１二重特異性ホスファターゼ１（５ｑ３４）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体７（１７ｑ２１）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体１（３ｐ２１）；ＣＸＣＲ５バーキットリンパ腫受容体１（ｃｈｒ．１１）；およびケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体６（６ｑ２７）であった。コネキシン４０はセントロメアの近くに位置し、およびケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体６はテロメアの近くに位置する。インプットテンプレートについての標準曲線を、ゲノムＤＮＡ中の遺伝子座コピー数と比較した、増幅されたＤＮＡ中の遺伝子座コピー数を決定するために作製した。標準曲線は０、０．００１、０．０１、０．１、０．５、および１μｇのゲノムＤＮＡから作製した。遺伝子座表現は、インプットゲノムＤＮＡ中の遺伝子座表現と比較したパーセントとして表し（そのような遺伝子座表現を遺伝子座表現偏りということができる）、および、１μｇの増幅されたＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算した。結果を図１７に示す。

図に示す通り、９５℃での熱処理無しのテンプレートＤＮＡに由来する増幅されたＤＮＡにおける遺伝子座表現の低下は無い。しかし、遺伝子座表現の顕著な損失が、３分間９５℃にて熱変性したテンプレートＤＮＡから観察された。

１．実施例９：ＭＤＡによって増幅された遺伝子座の増幅偏りはＰＥＰまたはＤＯＰ−ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの増幅偏りよりも顕著に低い。
本実施例は、１００、１，０００、および１０，０００倍にＭＤＡ増幅されたＤＮＡについて、９５℃（典型的な増幅反応においてＤＮＡを変性させるために用いられる）でのテンプレートＤＮＡインキュベートの省略が、ＤＮＡ産物における８個のランダムに選択された遺伝子座の表現の低い偏りを結果として生じることを実証する。対照的に、ＰＣＲを基礎とする２種類の全ゲノム増幅（ＷＧＡ）法であるＤＯＰ−ＰＣＲおよびＰＥＰは２〜６桁の増幅偏りを示す。

ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＰＣＲ分析は実施例８に記載の通りに実施し、および遺伝子座間の最大増幅偏りは、増幅倍数の各レベルについて、高い遺伝子座表現値を低い値で割ることによって計算した。結果を図１８に示す。

８遺伝子座の相対表現を図１８に、３種類の異なるＷＧＡ手順によって実施した増幅反応について示す。Ｘ軸は、定量的ＰＣＲのためのテンプレートとして使用した、増幅されたＤＮＡにおける増幅倍数を表す；Ｙ軸は、インプットゲノムＤＮＡと比較したパーセントで表した遺伝子座表現であり（そのような遺伝子座表現を遺伝子座表現偏りということができる）、１μｇの増幅されたＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算される。８遺伝子座についての結果を下記の通り示す；ＣＸＣＲ５、白菱形；コネキシン４０、白三角；ＭＫＰ１、白四角；ＣＣＲ６、白丸；酸性リボソームタンパク質、黒菱形；ＣＣＲ１、黒三角；ｃＪＵＮ、黒四角；ＣＣＲ７、黒丸。図１８ＡはＭＤＡ増幅されたＤＮＡに由来する８遺伝子座に関するパーセント表現を表す。図１８ＢはＤＯＰ−ＰＣＲを用いて増幅されたＤＮＡ中に存在する８遺伝子座に関するパーセント表現を表す。図１８ＣはＰＥＰ増幅されたＤＮＡ中に存在する８遺伝子座に関するパーセント表現を表す。

図に示す通り、１００、１，０００、および１０，０００倍に増幅されたＭＤＡについて、最大増幅偏りは、最も高表現された遺伝子の最も低表現された遺伝子に対する比として表して、それぞれ２．７、２．３、および２．８だけであった。注目すべきことに、ＭＤＡの３倍増幅偏りは１００ないし１００，０００倍増幅でほぼ一定に留まった（図１８Ａ）。対照的に、ＤＯＰ−ＰＣＲ法による増幅は、４ないし６桁にわたる増幅偏りを示した（図１８Ｂ）。加えて、ＰＥＰ法は２〜４桁にわたる増幅偏りを示した（図１８Ｃ）。

Ｙ軸は、インプットゲノムＤＮＡと比較したパーセントで表した遺伝子座表現である（そのような遺伝子座表現を遺伝子座表現偏りということができる）。それは１μｇの増幅されたＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算され、パーセントで表される。

図に示す通り、９５℃に加熱されたＤＮＡに由来するランダム六量体を用いて増幅されたｃ−ｊｕｎ配列の表現は６９％であった（ＲＨ（加熱あり）の棒グラフを参照）。９５℃に加熱されたＤＮＡに由来するネステッドプライマーを用いて増幅されたｃ−ｊｕｎ配列の表現は３％だけであった（ＮＰ（加熱あり）の棒グラフを参照）。テンプレートＤＮＡ熱処理無しのランダム六量体を用いて増幅されたＤＮＡ中のｃ−ｊｕｎ配列の表現は２１１％であった（ＲＨ（加熱なし）の棒グラフを参照）。テンプレートＤＮＡ熱処理無しのネステッドプライマーを用いて増幅されたＤＮＡ中のｃ−ｊｕｎ配列の表現は２８２８％であった（ＮＰ（加熱なし）の棒グラフを参照）。

Ｋ．実施例１１：ＭＤＡによって全血から増幅された遺伝子座の増幅偏り
本実施例は、ゲノムＤＮＡをＭＤＡを用いて直接に全血からまたは組織培養細胞から増幅できること、および、その遺伝子座表現は精製されたゲノムＤＮＡテンプレートから増幅されたＤＮＡについてと実質的に同じであることを実証する。本実施例は、アルカリ性条件へ供することによる（溶解溶液の添加による）熱による溶解を伴わない溶解、細胞溶解物の安定化（安定化溶液の添加による）、および安定化された細胞溶解物中のゲノムＤＮＡの複数置換増幅を説明する。安定化された細胞溶解物は、ゲノムＤＮＡの精製無しの増幅に用いられる。対照として、添加テンプレートの非存在下で増幅されたＤＮＡを試験し、およびこれらの遺伝子座に関して検出可能な配列表現を含まなかった。

ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＰＣＲ分析を増幅されたＤＮＡ試料について実施例８に記載の通り実施し、および結果を図２０に示す。５種類の異なる増幅反応に由来するＤＮＡについての８遺伝子座の相対表現を図２０に示す。Ｙ軸は、インプットゲノムＤＮＡと比較したパーセントで表した遺伝子座表現であり（そのような遺伝子座表現を遺伝子座表現偏りということができる）、１μｇの増幅されたＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算する。下り斜線の棒グラフは全血から増幅されたＤＮＡについての遺伝子座表現を示す。灰色塗りつぶしの棒グラフは３０ｎｇの精製されたゲノムＤＮＡ（９，０００ゲノムコピー）から増幅されたＤＮＡについての遺伝子座表現を示す。白塗りつぶしの棒グラフは３００ｎｇの精製されたゲノムＤＮＡ（９０，０００ゲノムコピー）から増幅されたＤＮＡについての遺伝子座表現を示す。上り斜線の棒グラフは組織培養細胞（ＤＮＡの１０細胞同等物）から増幅されたＤＮＡについての遺伝子座表現を示す。黒塗りつぶしの棒グラフは添加テンプレート無しの反応から増幅されたＤＮＡについての遺伝子座表現を示す（そのデータについての黒棒で表される値は小さすぎてグラフ上で棒は見えない）。

図に示す通り、直接に全血からまたは組織培養細胞から精製無しに増幅されたＤＮＡは、遺伝子座表現について、精製されたゲノムＤＮＡテンプレートから増幅されたＤＮＡと実質的に同じ値を有する。

Ｌ．実施例１２：ＭＤＡによってＡＡｄＵＴＰを含む反応で増幅された遺伝子座の増幅偏りは１００％ｄＴＴＰを含む反応で増幅されたＤＮＡの増幅偏りと等しい。
本実施例は、ゲノムＤＮＡをＭＤＡを用いてＡＡｄＵＴＰ（５−（３−アミノアリル）−２'−デオキシウリジン５'−三リン酸、シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏ．））を含む反応で増幅できること、およびその遺伝子座表現はｄＴＴＰだけを含む反応で増幅されたＤＮＡについてと実質的に同一であることを実証する。

ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＰＣＲ分析を増幅されたＤＮＡ試料について実施例８に記載の通り実施し、および２種類の増幅反応に由来するＤＮＡについての８遺伝子座の相対表現を図２１に示す。Ｙ軸は、インプットゲノムＤＮＡと比較したパーセントで表した遺伝子座表現であり（そのような遺伝子座表現を遺伝子座表現偏りということができる）、１μｇの増幅されたＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算する。黒棒グラフは１００％ｄＴＴＰを含む反応で増幅されたＤＮＡについての遺伝子座表現を示す。白棒グラフは３０％ｄＴＴＰ／７０％ＡＡｄＵＴＰを含む反応で増幅されたＤＮＡについての遺伝子座表現を示す。

図に示す通り、３０％ｄＴＴＰ／７０％ＡＡｄＵＴＰを含む反応で増幅されたＤＮＡは、１００％ｄＴＴＰを含む反応で増幅されたＤＮＡと、遺伝子座表現について実質的に同一の値を有する。

４種類の反応を下記の条件下で実施した。ヒトゲノムＤＮＡ（５ｇ、コリエル研究所細胞バンク（ＣｏｒｉｅｌｌＣｅｌｌＲｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ））を１００ユニットのＥｃｏＲＩで３時間、５０μｌ中で取扱説明書に従って消化した。ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼを６５℃にて３０分間のインキュベートによって不活性化した。消化したＤＮＡ断片（０．５μｇ）を容量８４０μｌ中で１．７ユニット（ワイス（Ｗｅｉｓｓ）ユニット）のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて環状化した。反応を１６時間４℃にてインキュベートした。ブランクライゲーションを、ＤＮＡリガーゼの省略以外は同一の条件下で実施した。ライゲーションした混合物の一部をテンプレート（１６．８μｌ；１０ｎｇＤＮＡ）として利用した２種類の増幅反応を実施し、一方は各２．５μＭの濃度の配列特異的プライマーを用い、他方は各０．５μＭの濃度のプライマーを用いた。さらに２種類の増幅反応を、ブランクライゲーションしたＤＮＡをテンプレートとして利用し、２．５μＭおよび０．５μＭの配列特異的プライマー濃度を用いて実施した。放射性標識したα−［³²Ｐ］ｄＣＴＰ、約６０ｃｐｍ／ｐｍｏｌの総ｄＮＴＰ、をＤＮＡ合成の定量化のために、並行反応に加えた。反応を１８時間３７℃にてインキュベートした。α−［³²Ｐ］ｄＣＴＰを含まなかった反応を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＰＣＲ分析によって実施例８に記載の通りに分析した。インプットテンプレートについての標準曲線を、ゲノムＤＮＡ中の遺伝子座コピー数と比較した、増幅されたＤＮＡ中の遺伝子座コピー数を決定するために作製した。標準曲線は０、０．００１、０．０１、０．１、０．５、および１μｇのゲノムＤＮＡから作製した。結果を図２２に示す。Ｙ軸は、インプットゲノムＤＮＡと比較した遺伝子座表現であるそのような遺伝子座表現を遺伝子座表現偏りということができる）。それは１μｇの増幅されたＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算され、パーセントで表される。

図に示す通り、ライゲーションされたＤＮＡに由来する２．５μＭの遺伝子特異的プライマーを用いて増幅されたｃ−ｊｕｎ配列の表現は検出を下回った（ＧＳ２．５＋Ｌ棒グラフを参照）。ブランクライゲーションされたＤＮＡに由来する２．５μＭの遺伝子特異的プライマーを用いて増幅されたｃ−ｊｕｎ配列の表現もまた検出されなかった（ＧＳ２．５−Ｌ棒グラフを参照）。ライゲーションされたＤＮＡに由来する０．５μＭの遺伝子特異的プライマーを用いて増幅されたＤＮＡ中のｃ−ｊｕｎ配列の表現は３２０００％であった（ＧＳ０．５＋Ｌ棒グラフを参照）。ブランクライゲーションされたＤＮＡに由来する０．５μＭの遺伝子特異的プライマーを用いて増幅されたＤＮＡ中のｃ−ｊｕｎ配列の表現もまた検出されなかった（ＧＳ０．５−Ｌ棒グラフを参照）。これらの結果は、遺伝子特異的プライマーおよび環状化されたテンプレートＤＮＡを用いたｃ−ｊｕｎ配列の３２０倍増幅を実証する。ライゲーションされなかった消化されたＤＮＡは感知可能な増幅を示さなかった。０．５μＭのプライマーを用いて増幅された、ライゲーションされたＤＮＡだけが増幅された一方、２．５μＭのプライマーは増幅を与えなかった。

２．５μＭ遺伝子特異的プライマーおよび環状化されたＤＮＡテンプレートを用いて実施されたＤＮＡ増幅反応の特異性を、それを７個の他の遺伝子座で観察されたＤＮＡ増幅の量と比較することによって試験した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＰＣＲ分析を実施例８に記載の通り実施し、および結果を図２３に示す。ｃ−ｊｕｎ遺伝子座および７個の他の遺伝子座の相対表現を示し、および、７個の遺伝子座は低レベルの増幅だけを示し、ｃ−ｊｕｎ配列がｃ−ｊｕｎ特異的プライマーを用いて特異的に増幅されたことを示す。

Ｎ．実施例１４：分解されたゲノムＤＮＡの複数置換増幅の品質を、損傷試料を修復することによって高める。
本実施例は、損傷ゲノムＤＮＡを、１５ｍＭＮａＯＨの存在下で７０℃加熱を用いて変性し、トリス−ＨＣｌｐＨ４．０および元の試料を変性した試料に加えて戻し，その後ゆっくり冷却して損傷ＤＮＡをハイブリダイズさせることによる修復法で前処理した場合、ＷＧＡにおいて増幅されたＤＮＡの品質が向上することを実証する。損傷ｇＤＮＡは、未変性ゲノムＤＮＡを超音波処理して平均長１ｋｂとすることによって作製した。この分解試料を次いで修復法を用いて前処理し、および複数置換増幅反応に用いた。増幅産物の品質は、１μｇの増幅産物の染色体上の特定の遺伝子座の表現を、１μｇの増幅されていない標準ゲノムＤＮＡと比較する、Ｔａｑｍａｎ測定法によって評価した。本実施例は、修復処理ありの損傷ゲノムＤＮＡは、修復法無しの損傷ゲノムＤＮＡの増幅産物と比較して、増幅産物の遺伝子座表現に３倍の改善を有することを実証する。

損傷ＤＮＡを塩の存在下で加熱することがこの基質の増幅を改善しうるかどうかを判定するため、損傷ＤＮＡ（２５ｎｇ）を７０℃へ塩（トリス−ＥＤＴＡ（１０ｍＭトリスｐＨ８．０および１ｍＭＥＤＴＡ））の存在下で３分間加熱し、２５ｎｇの未変性の損傷試料を加えて戻し、および次いで試料を冷却した。この方法は、損傷ＤＮＡの修復にいくらかの改善を示した。終濃度２５ｍＭのＮａＯＨを熱段階の前に反応に加えた場合、これは修復法を改善し、損傷ＤＮＡの一貫した修復を与えた。これは、損傷ＤＮＡをトリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）で５ｎｇ／μｌに希釈し、２５ｎｇのＤＮＡをＮａＯＨ終濃度２５ｍＭに加え、試料を７０℃へ３分間加熱し、トリス−ＨＣｌｐＨ４．０を加えてｐＨを８．０へ低下させ、２５ｎｇの元の未変性の損傷ＤＮＡ試料を加えて戻し、および混合物を室温に戻したことによって行われた。熱、トリス、およびＮａＯＨを用いる修復は、修復無しおよび熱およびトリスだけの処理を用いた修復よりも良好な遺伝子座表現を与えた。

Ｑ．実施例１７：修復法の中性化段階は損傷ＤＮＡ試料の増幅を改善する。
本実施例は、修復法の中性化が増幅産物の品質の向上に重要であることを実証する。損傷ＤＮＡ試料を下記の通り調製した：ＤＮＡ試料をｄＨ₂Ｏで１０ｎｇ／μＭに希釈し、および７０℃へ５分間加熱して損傷ＤＮＡ試料を作製した。加熱したＤＮＡ試料を５ｎｇ／μｌにＴＥで希釈し、２５ｎｇの損傷ＤＮＡを終濃度２５ｍＭＮａＯＨへ加え、７０℃へ３分間加熱し、および、トリス−ＨＣｌｐＨ４．０を用いてｐＨ８．０へ中性化しおよびゆっくり冷却したか、または、中性化無しでゆっくり冷却した。これらの試料の増幅反応を実施し、および産物の品質をＴａｑｍａｎ分析によって分析した。中性化を用いる修復は、修復無しおよび中性化処理無しの修復よりも良好な遺伝子座表現を与えた。

図１は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の単一の６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座表現（パーセントで）のグラフである。図２は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の２種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座表現（パーセントで）のグラフである。図３は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の３種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座表現（パーセントで）のグラフである。図４は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の４種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座表現（パーセントで）のグラフである。図５は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の５種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座表現（パーセントで）のグラフである。図６は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の５種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座表現（パーセントで）のグラフである。図７は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の５種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座表現（パーセントで）のグラフである。図８は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の５種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座表現（パーセントで）のグラフである。図９は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の９種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の１０遺伝子座についての遺伝子座表現（パーセントで）のグラフである。図１０は、本開示の方法の一実施形態において特異的ヌクレオチド配列の１２種類の異なる６ヌクレオチドプライマーを用いて増幅したヒトゲノムＤＮＡ中の４７遺伝子座（染色体当たり２遺伝子座、およびＹ染色体から１遺伝子座）についての遺伝子座表現（パーセントで）のグラフである。図１１は、未変性ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）または８５℃にて１０分間加熱することによって分解されたゲノムＤＮＡ（分解ｇＤＮＡ）のさまざまな量（０、０．３ｎｇ、３ｎｇおよび３０ｎｇ）をインプットテンプレートとして用い、１６時間実施したＭＤＡ反応によるＤＮＡ合成のグラフである。ＭＤＡ反応は、３０℃にて０．３Ｍトレハロースの非存在下、または４０℃にて０．３Ｍトレハロースの存在下のどちらかで実施した。図１２は、未変性ゲノムＤＮＡのさまざまな量（０から３０ｎｇ）をインプットテンプレートとして用い、４０℃にて各種の糖の存在下で１６時間実施したＭＤＡ反応によるＤＮＡ合成のグラフである。ＭＤＡ反応は、添加剤無しで、または０．３Ｍトレハロースまたは０．４Ｍスクロースまたは０．４Ｍグルコースの存在下のどちらかで実施した。図１３は、本開示の方法における増幅について異なる量の核酸を用いた、時間（時間で）に対するＤＮＡ合成（μｇで）のグラフである。図１４は、テンプレートＤＮＡ長に及ぼす９５℃でのインキュベート時間の作用のグラフである。図１５は、ＭＤＡの速度および収率に及ぼす９５℃でのテンプレートインキュベートの作用のグラフである。図１６は、ＤＮＡ産物鎖の平均サイズに及ぼす９５℃でのテンプレートインキュベートの作用のグラフである。図１７は、ＭＤＡによって増幅されたＤＮＡにおける遺伝子座表現に及ぼす、９５℃でのインキュベート無しに対する９５℃でのテンプレートインキュベートの作用の比較を示すグラフである。図１８Ａ、１８Ｂ、および１８Ｃは、３つの異なる増幅手順、ＭＤＡ、ＤＯＰ−ＰＣＲ、およびＰＥＰについての、遺伝子表現偏りに及ぼす増幅の作用を示すグラフである。図１９は、ネステッドプライマーを用いたｃ−ｊｕｎ配列の増幅を示すグラフである。図２０は、５つの異なる増幅反応に由来するＤＮＡについての８遺伝子座の相対表現のグラフである。Ｙ軸はインプットゲノムＤＮＡとの相対比でパーセントとして表した遺伝子座表現であり、１μｇの増幅ＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算される。図２１は、１００％ｄＴＴＰを含む反応で増幅されたＤＮＡ、３０％ｄＴＴＰ／７０％ＡＡｄＵＴＰを含む反応で増幅されたＤＮＡに関して、８遺伝子座についてのパーセント表現の比較を示すグラフである。図２２は、環状化されたゲノムテンプレートを用いたｃ−ｊｕｎ配列の増幅を示すグラフである。Ｙ軸はインプットゲノムＤＮＡとの相対比でパーセントとして表した遺伝子座表現であり、１μｇの増幅ＤＮＡからの定量的ＰＣＲ産物の収率を１μｇのゲノムＤＮＡ対照からの収率で割って計算される。図２３は、ｃ−ｊｕｎ特異的プライマーおよび環状化されたＤＮＡ標的を用いて増幅されたＤＮＡにおける、８遺伝子座についてのパーセント表現の比較を示すグラフである。図２４は、異なる処理（対照または修復処理）に曝露された異なるＤＮＡ試料のパーセント遺伝子座表現のグラフである。図２５は、修復処理ありまたは無しの４０試料の、パーセント遺伝子座表現のグラフである。図２６は、本開示の方法の一形式（アルカリ性処理あり；下図）またはアルカリ性処理なしの同じ方法（上図）を用いて増幅したゲノム核酸試料中に見出される５つの一塩基多型のそれぞれでの対立遺伝子の量を比較するグラフである。アルカリ性処理が用いられる場合に、対立遺伝子の増幅偏りはより低い。１６８コリエル（Ｃｏｒｉｅｌｌ）ｇＤＮＡを含む１００ｕＬの反応。遺伝子型分析はＴａｑＭａｎ分析により実施した。図２７は、本開示の方法の一形式（アルカリ性処理あり；下図）またはアルカリ性処理なしの同じ方法（上図）を用いて増幅したゲノム核酸試料中に見出される５つの一塩基多型のそれぞれでの対立遺伝子の量を比較するグラフである。アルカリ性処理が用いられる場合に、対立遺伝子の増幅偏りはより低い。１６８コリエル（Ｃｏｒｉｅｌｌ）ｇＤＮＡを含む１００ｕＬの反応。遺伝子型分析はＴａｑＭａｎ分析により実施した。

Claims

ゲノムを増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させて混合物を形成すること、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で前記混合物をインキュベートすることを含み、
プライマーが前記ゲノム核酸試料中の核酸分子とハイブリダイズし、
プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの９０％以上を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸分子の９０％以上の複製を生じることを特徴とする方法。
ゲノムが真核ゲノムであることを特徴とする請求項１の方法。
ゲノムが植物ゲノムであることを特徴とする請求項２の方法。
ゲノムが動物ゲノムであることを特徴とする請求項２の方法。
ゲノムが脊椎動物ゲノムであることを特徴とする請求項４の方法。
ゲノムが魚類ゲノムであることを特徴とする請求項５の方法。
ゲノムが哺乳類ゲノムであることを特徴とする請求項５の方法。
ゲノムがヒトゲノムであることを特徴とする請求項７の方法。
ゲノムが微生物ゲノムまたはウイルスゲノムであることを特徴とする請求項１の方法。
ゲノム核酸試料中の少なくとも１０の核酸配列について増幅偏りが２０倍未満であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項の方法。
ゲノム核酸試料中の少なくとも１０の核酸配列について増幅偏りが１０倍未満であることを特徴とする請求項１０の方法。
プライマーが３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、または３０ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項の方法。
プライマーが４ヌクレオチド未満、５ヌクレオチド未満、６ヌクレオチド未満、７ヌクレオチド未満、８ヌクレオチド未満、９ヌクレオチド未満、１０ヌクレオチド未満、１１ヌクレオチド未満、１２ヌクレオチド未満、１３ヌクレオチド未満、１４ヌクレオチド未満、１５ヌクレオチド未満、１６ヌクレオチド未満、１７ヌクレオチド未満、１８ヌクレオチド未満、１９ヌクレオチド未満、２０ヌクレオチド未満、２１ヌクレオチド未満、２２ヌクレオチド未満、２３ヌクレオチド未満、２４ヌクレオチド未満、２５ヌクレオチド未満、２６ヌクレオチド未満、２７ヌクレオチド未満、２８ヌクレオチド未満、２９ヌクレオチド未満、３０ヌクレオチド未満、または３１ヌクレオチド未満の長さを有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項の方法。
ゲノム核酸試料を、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、または８０℃にてインキュベートすることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
ゲノム核酸試料を、２１℃未満、２２℃未満、２３℃未満、２４℃未満、２５℃未満、２６℃未満、２７℃未満、２８℃未満、２９℃未満、３０℃未満、３１℃未満、３２℃未満、３３℃未満、３４℃未満、３５℃未満、３６℃未満、３７℃未満、３８℃未満、３９℃未満、４０℃未満、４１℃未満、４２℃未満、４３℃未満、４４℃未満、４５℃未満、４６℃未満、４７℃未満、４８℃未満、４９℃未満、５０℃未満、５１℃未満、５２℃未満、５３℃未満、５４℃未満、５５℃未満、５６℃未満、５７℃未満、５８℃未満、５９℃未満、６０℃未満、６１℃未満、６２℃未満、６３℃未満、６４℃未満、６５℃未満、６６℃未満、６７℃未満、６８℃未満、６９℃未満、７０℃未満、７１℃未満、７２℃未満、７３℃未満、７４℃未満、７５℃未満、７６℃未満、７７℃未満、７８℃未満、７９℃未満、または８０℃未満にてインキュベートすることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項の方法。
ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０³ヌクレオチドの配列複雑性を有するか、ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０⁴ヌクレオチドの配列複雑性を有するか、ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０⁵ヌクレオチドの配列複雑性を有するか、ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０⁶ヌクレオチドの配列複雑性を有するか、ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０⁷ヌクレオチドの配列複雑性を有するか、ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０⁸ヌクレオチドの配列複雑性を有するか、またはゲノム核酸試料が少なくとも１×１０⁹ヌクレオチドの配列複雑性を有することを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項の方法。
プライマーが配列ＡＧＴＧＧＧまたはＡＧＡＧＡＧのうち１つを有することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項の方法。
プライマーが配列ＡＧＣＣＧＧ、ＡＧＴＡＧＧ、またはＡＧＴＴＧＧのうち１つを有することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項の方法。
プライマーが配列ＡＧＧＣＧＧ、ＡＧＴＧＧＧ、ＡＧＧＧＡＧ、またはＡＧＴＧＡＧのうち１つを有することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項の方法。
プライマーが配列ＡＧＴＧＧＧ、ＡＧＣＣＡＧ、ＡＧＴＴＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、またはＡＧＡＣＡＧのうち１つを有することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項の方法。
プライマーが配列ＡＧＡＧＧＧ、ＡＧＧＣＡＧ、ＡＧＣＣＡＧ、ＡＧＴＣＡＧ、またはＡＧＡＣＡＧのうち１つを有することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項の方法。
プライマーが配列ＣＧＧＴＧＧ、ＴＣＡＣＧＣ、ＣＧＡＧＣＧ、ＧＣＧＴＧＧ、ＡＣＴＣＧＧ、ＡＡＴＣＧＣ、ＣＧＧＡＧＧ、ＣＣＧＡＧＡ、ＧＡＴＣＧＣ、ＡＧＡＧＣＧ、ＡＧＣＧＡＧ、またはＡＣＴＣＣＧのうち１つを有することを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項の方法。
プライマーが反復配列中の配列と相補的であることを特徴とする請求項１〜２２のいずれか一項の方法。
反復配列がマイクロサテライト配列、ミニサテライト配列、サテライト配列、トランスポゾン配列、リボソームＲＮＡ配列、短い核散在配列（ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄｎｕｃｌｅａｒｅｌｅｍｅｎｔ（ＳＩＮＥ））、または長い核散在配列（ｌｏｎｇｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄｎｕｃｌｅａｒｅｌｅｍｅｎｔ）（ＬＩＮＥ）であることを特徴とする請求項２３の方法。
プライマーが機能共通配列中の配列と相補的であることを特徴とする請求項１〜２２のいずれか一項の方法。
機能共通配列がプロモーター配列、エンハンサー配列、サイレンサー配列、上流調節配列、転写終止部位配列、トランスポゾン調節配列、リボソームＲＮＡ調節配列、またはポリアデニル化部位配列であることを特徴とする請求項２５の方法。
機能共通配列が微生物プロモーター配列、微生物エンハンサー配列、微生物サイレンサー配列、微生物上流調節配列、微生物転写終止部位配列、微生物トランスポゾン調節配列、微生物リボソームＲＮＡ調節配列、または微生物ポリアデニル化部位配列であることを特徴とする請求項２６の方法。
プライマーが広カバー率プライマーであることを特徴とする請求項１〜２２のいずれか一項の方法。
プライマーが、平均して、５，０００ヌクレオチド以下毎、４，０００ヌクレオチド以下毎、３，０００ヌクレオチド以下毎、２，５００ヌクレオチド以下毎、２，０００ヌクレオチド以下毎、１，５００ヌクレオチド以下毎、１，０００ヌクレオチド以下毎、９００ヌクレオチド以下毎、８００ヌクレオチド以下毎、７００ヌクレオチド以下毎、６００ヌクレオチド以下毎、５００ヌクレオチド以下毎、４００ヌクレオチド以下毎、３００ヌクレオチド以下毎、２００ヌクレオチド以下毎、１００ヌクレオチド以下毎、または５０ヌクレオチド以下毎に、ゲノム核酸試料の核酸分子中に存在する配列と相補的であることを特徴とする請求項２８の方法。
プライマーが、ゲノム核酸試料のＧ＋Ｃ比率の２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％、または１％以内のＧ＋Ｃ比率を有することを特徴とする請求項２８または２９の方法。
プライマーが、使用した種類のゲノム核酸試料について、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも１０％の遺伝子座表現を生じることを特徴とする請求項２８〜３０のいずれか一項の方法。
プライマーが、使用した種類のゲノム核酸試料について、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の遺伝子座表現を生じることを特徴とする請求項３１の方法。
プライマーが、使用した種類のゲノム核酸試料について、少なくとも１０％の遺伝子座表現を、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じることを特徴とする請求項３１または３２の方法。
プライマーが、使用した種類のゲノム核酸試料について、５０倍未満の増幅偏りを生じることを特徴とする請求項１〜３３のいずれか一項の方法。
プライマーが、使用した種類のゲノム核酸試料について、４５倍未満、４０倍未満、３５倍未満、３０倍未満、２５倍未満、２０倍未満、１９倍未満、１８倍未満、１７倍未満、１６倍未満、１５倍未満、１４倍未満、１３倍未満、１２倍未満、１１倍未満、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、または４倍未満の増幅偏りを生じることを特徴とする請求項３４の方法。
プライマーが、使用した種類のゲノム核酸試料について、５０倍未満の増幅偏りを、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じることを特徴とする請求項３４または３５の方法。
プライマーが内部相補的３'末端を有しないことを特徴とする請求項１〜３６のいずれか一項の方法。
プライマーが核酸試料の非存在下で顕著な複製産物を生じないことを特徴とする請求項１〜３７のいずれか一項の方法。
ＤＮＡポリメラーゼがφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１〜３８のいずれか一項の方法。
ゲノム核酸試料が変性条件に供されないことを特徴とする請求項１〜３９のいずれか一項の方法。
ゲノム核酸試料が熱変性条件に供されないことを特徴とする請求項４０の方法。
ゲノム核酸試料がアルカリ性変性条件に供されないことを特徴とする請求項４０の方法。
ゲノム核酸試料が変性条件に供されることを特徴とする請求項１〜３９のいずれか一項の方法。
ゲノム核酸試料が熱変性条件に供されることを特徴とする請求項４３の方法。
ゲノム核酸試料がアルカリ性変性条件に供されることを特徴とする請求項４３の方法。
ゲノム核酸試料中の核酸がゲノム核酸試料中の他の物質から分離されないことを特徴とする請求項１〜３９のいずれか一項の方法。
ゲノム核酸試料が、細胞をアルカリ性条件に曝露して細胞溶解物を生じ、細胞溶解物が全ゲノムを含み、および細胞溶解物のｐＨを低下させて安定化した細胞溶解物を生じることによって調製されることを特徴とする請求項１〜３９のいずれか一項の方法。
細胞を溶解溶液と混合することによって細胞がアルカリ性条件に曝露されることを特徴とする請求項４７の方法。
溶解溶液が塩基を含むことを特徴とする請求項４８の方法。
細胞溶解物を安定化溶液と混合することによって細胞溶解物のｐＨを低下させることを特徴とする請求項４７〜４９のいずれか一項の方法。
安定化溶液が緩衝剤を含むことを特徴とする請求項５０の方法。
安定化溶液が酸を含むことを特徴とする請求項５０の方法。
細胞溶解物および安定化された細胞溶解物中の核酸が細胞溶解物中の他の物質から分離されないことを特徴とする請求項４７〜５２のいずれか一項の方法。
細胞溶解物および安定化された細胞溶解物が、インキュベート前に精製に供されないことを特徴とする請求項４７〜５３のいずれか一項の方法。
細胞溶解物、安定化された細胞溶解物、または両方が、インキュベート前に部分精製に供されることを特徴とする請求項４７〜５３のいずれか一項の方法。
細胞溶解物および安定化された細胞溶解物が、インキュベート前に相当な精製に供されないことを特徴とする請求項４７〜５３のいずれか一項の方法。
インキュベートが実質的に等温であることを特徴とする請求項４７〜５６のいずれか一項の方法。
細胞溶解物も安定化された細胞溶解物もインキュベートの温度を実質的に上回って加熱されないことを特徴とする請求項５７の方法。
細胞溶解物も安定化された細胞溶解物もインキュベートの温度を上回る実質的な加熱に供されないことを特徴とする請求項５７の方法。
細胞がインキュベートの温度を実質的に上回って加熱されないことを特徴とする請求項５７の方法。
細胞がインキュベートの温度を上回る実質的な加熱に供されないことを特徴とする請求項５７の方法。
細胞が、その細胞が増殖する温度を実質的に上回って加熱されないことを特徴とする請求項５７の方法。
細胞が、その細胞が増殖する温度を上回る実質的な加熱に供されないことを特徴とする請求項５７の方法。
細胞溶解物も安定化された細胞溶解物も、ゲノムの明らかな変性を引き起こしうる温度を上回っておよびそのような時間にわたって加熱されないことを特徴とする請求項４７〜６３のいずれか一項の方法。
細胞溶解物も安定化された細胞溶解物も、ゲノムの明らかな変性を引き起こしうる温度を上回るおよびそのような時間にわたる加熱に供されないことを特徴とする請求項４７〜６３のいずれか一項の方法。
細胞が熱によって溶解されないことを特徴とする請求項４７〜６５のいずれか一項の方法。
アルカリ性条件の非存在下で相当な細胞溶解を引き起こす温度を上回っておよびそのような時間にわたって細胞が加熱されないことを特徴とする請求項４７〜６５のいずれか一項の方法。
アルカリ性条件の非存在下で相当な細胞溶解を引き起こす温度を上回るおよびそのような時間にわたる加熱に細胞が供されないことを特徴とする請求項４７〜６５のいずれか一項の方法。
プライマー、ゲノム核酸試料およびＤＮＡポリメラーゼを接触させる前に、
ゲノム核酸試料中の核酸分子の相当な変性を促進する条件にゲノム核酸試料を曝露し、それによって変性したゲノム核酸試料を生じ、および条件をゲノム核酸試料中の核酸分子の相当な変性を促進しない条件に変えて変性したゲノム核酸試料を生じることをさらに含む請求項１〜３９のいずれか一項の方法。
ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が、増幅された核酸分子について、ゲノム核酸試料における平均断片長よりも長い平均断片長を結果として生じることを特徴とする請求項６９の方法。
ゲノム核酸試料、変性したゲノム核酸試料、または両方がイオン条件に曝露されることを特徴とする請求項６９または７０の方法。
ゲノム核酸試料を変性溶液と混合することによっておよびゲノム核酸試料中の核酸分子を相当に変性させる温度におよびそのような時間ゲノム核酸試料を加熱することによって、ゲノム核酸試料が相当な変性を促進する条件に曝露されることを特徴とする請求項６９〜７１のいずれか一項の方法。
プライマーが３'−５'エキソヌクレアーゼに耐性となるようにプライマーが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１〜７２のいずれか一項の方法。
プライマーが長さ６ヌクレオチドであって、プライマーがヌクレアーゼ耐性となるようにプライマーが少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含み、およびＤＮＡポリメラーゼがφ２９ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１〜７３のいずれか一項の方法。
核酸分子の複製を促進する条件が実質的に等温であることを特徴とする請求項１〜７４のいずれか一項の方法。
核酸分子の複製を促進する条件が熱サイクル反応に関係しないことを特徴とする請求項１〜７４のいずれか一項の方法。
プライマーがヌクレオチドを含み、そのヌクレオチドの１種類以上がリボヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜７６のいずれか一項の方法。
ヌクレオチドの１０％ないし５０％がリボヌクレオチドであることを特徴とする請求項７７の方法。
ヌクレオチドの５０％以上がリボヌクレオチドであることを特徴とする請求項７７の方法。
ヌクレオチドの全部がリボヌクレオチドであることを特徴とする請求項７７の方法。
プライマーがヌクレオチドを含み、そのヌクレオチドの１種類以上が２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜７６のいずれか一項の方法。
ヌクレオチドの１０％ないし５０％が２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする請求項８１の方法。
ヌクレオチドの５０％以上が２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする請求項８１の方法。
ヌクレオチドの全部が２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする請求項８１の方法。
プライマーがヌクレオチドを含み、そのヌクレオチドがリボヌクレオチドおよび２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であることを特徴とする請求項１〜７６のいずれか一項の方法。
プライマーがヌクレオチドを含み、そのヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドおよび２'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの混合物であることを特徴とする請求項１〜７６のいずれか一項の方法。
ゲノム核酸試料が血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針吸引生検試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、粗細胞溶解物試料、法医学試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、製品試料、医薬調製物試料、生物学的分子製品試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、糖質調製物試料、またはその組み合わせであることを特徴とする請求項１〜８６のいずれか一項の方法。
ゲノム核酸試料が粗細胞溶解物であることを特徴とする請求項１〜８７のいずれか一項の方法。
ゲノム核酸試料が細胞溶解を超えて処理されないことを特徴とする請求項１〜８８のいずれか一項の方法。
増幅された核酸分子が分析されることを特徴とする請求項１〜８９のいずれか一項の方法。
増幅された核酸分子が１種類以上のＤＮＡチップを用いて分析されることを特徴とする請求項９０の方法。
増幅された核酸分子がハイブリダイゼーションによって分析されることを特徴とする請求項９０または９１の方法。
増幅された核酸分子が核酸配列決定によって分析されることを特徴とする請求項９０〜９２のいずれか一項の方法。
増幅された核酸分子がその分析の前、後、または前および後の両方に保存されることを特徴とする請求項９０〜９３のいずれか一項の方法。
プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および第２のゲノム核酸試料を接触させて混合物を形成すること、および第２のゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で前記混合物をインキュベートすることをさらに含み、
第２のゲノム核酸試料はゲノムの９０％以上を含み、第２のゲノム核酸試料中の核酸分子の複製は鎖置換複製によって進行し、第２のゲノム核酸試料中の核酸分子の複製の結果として第２のゲノム核酸試料中の核酸分子の９０％以上の複製が生じることを特徴とする請求項１〜９４のいずれか一項の方法。
第２のゲノム核酸試料が第１のゲノム核酸試料と同一の種類の生物に由来する試料であることを特徴とする請求項９５の方法。
第２のゲノム核酸試料が第１のゲノム核酸試料と同一の種類の組織に由来する試料であることを特徴とする請求項９５の方法。
第２のゲノム核酸試料が第１のゲノム核酸試料と同一の生物に由来する試料であることを特徴とする請求項９５の方法。
第２のゲノム核酸試料が第１のゲノム核酸試料とは異なる時に得られることを特徴とする請求項９８の方法。
第２のゲノム核酸試料が第１のゲノム核酸試料とは異なる生物に由来する試料であることを特徴とする請求項９５の方法。
第２のゲノム核酸試料が第１のゲノム核酸試料とは異なる種類の組織に由来する試料であることを特徴とする請求項９５の方法。
第２のゲノム核酸試料が第１のゲノム核酸試料とは異なる種の生物に由来する試料であることを特徴とする請求項９５の方法。
第２のゲノム核酸試料が第１のゲノム核酸試料とは異なる系統の生物に由来する試料であることを特徴とする請求項９５の方法。
第２のゲノム核酸試料が第１のゲノム核酸試料とは異なる細胞区画に由来する試料であることを特徴とする請求項９５の方法。
明らかな配列複雑性を有する核酸試料を増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸試料を接触させて混合物を形成すること、および核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で前記混合物をインキュベートすることを含み、
プライマーが明らかな配列複雑性を有する核酸試料とハイブリダイズし、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、核酸試料が少なくとも１×１０⁴ヌクレオチドの配列複雑性を有し、核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、核酸試料中の核酸分子の複製が結果として核酸試料中の核酸分子の９０％以上の複製を生じることを特徴とする方法。
核酸試料が少なくとも１×１０⁵ヌクレオチドの配列複雑性を有するか、核酸試料が少なくとも１×１０⁶ヌクレオチドの配列複雑性を有するか、核酸試料が少なくとも１×１０⁷ヌクレオチドの配列複雑性を有するか、核酸試料が少なくとも１×１０⁸ヌクレオチドの配列複雑性を有するか、または核酸試料が少なくとも１×１０⁹ヌクレオチドの配列複雑性を有することを特徴とする請求項１０５の方法。
核酸試料がゲノム、染色体、染色体断片、人工染色体、酵母人工染色体、細菌人工染色体、コスミド、または組み合わせであるかまたはそれに由来することを特徴とする請求項１０５または１０６の方法。
核酸試料が血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、羊水試料、生検試料、針吸引生検試料、がん試料、腫瘍試料、組織試料、細胞試料、細胞溶解物試料、粗細胞溶解物試料、法医学試料、考古学的試料、感染試料、院内感染試料、製品試料、医薬調製物試料、生物学的分子製品試料、タンパク質調製物試料、脂質調製物試料、糖質調製物試料、またはその組み合わせであるかまたはそれに由来することを特徴とする請求項１０５または１０６の方法。
核酸試料が真核生物、植物、および動物、海産動物、脊椎動物、哺乳類、またはヒトであるかまたはそれに由来することを特徴とする請求項１０５または１０６の方法。
ゲノムを増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させて混合物を形成すること、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で前記混合物をインキュベートすることを含み、
プライマーが前記ゲノム核酸試料中の核酸分子とハイブリダイズし、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの９０％以上を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０⁹ヌクレオチドの配列複雑性を有し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．０１％の複製を生じることを特徴とする方法。
ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が、結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．１％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも１％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも１０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも２０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも３０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも４０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも５０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも６０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも７０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９６％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９７％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９８％、またはゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９９％の複製を生じることを特徴とする請求項１１０の方法。
ゲノムを増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させて混合物を形成すること、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で前記混合物をインキュベートすることを含み、
プライマーが前記ゲノム核酸試料中の核酸分子とハイブリダイズし、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの９０％以上を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０⁸ヌクレオチドの配列複雑性を有し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも０．１％の複製を生じることを特徴とする方法。
ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が、結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも１％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも１０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも２０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも３０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも４０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも５０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも６０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも７０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９６％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９７％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９８％、またはゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９９％の複製を生じることを特徴とする請求項１１２の方法。
ゲノムを増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させて混合物を形成すること、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で前記混合物をインキュベートすることを含み、
プライマーが前記ゲノム核酸試料中の核酸分子とハイブリダイズし、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの９０％以上を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０⁷ヌクレオチドの配列複雑性を有し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも１％の複製を生じることを特徴とする方法。
ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が、結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも１０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも２０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも３０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも４０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも５０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも６０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも７０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９６％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９７％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９８％、またはゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９９％の複製を生じることを特徴とする請求項１１４の方法。
ゲノムを増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させて混合物を形成すること、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で前記混合物をインキュベートすることを含み、
プライマーが前記ゲノム核酸試料中の核酸分子とハイブリダイズし、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの９０％以上を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０⁶ヌクレオチドの配列複雑性を有し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも１０％の複製を生じることを特徴とする方法。
ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が、結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも２０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも３０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも４０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも５０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも６０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも７０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９６％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９７％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９８％、またはゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９９％の複製を生じることを特徴とする請求項１１６の方法。
ゲノムを増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させて混合物を形成すること、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で前記混合物をインキュベートすることを含み、
プライマーが前記ゲノム核酸試料中の核酸分子とハイブリダイズし、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの９０％以上を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料が少なくとも１×１０⁵ヌクレオチドの配列複雑性を有し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも８０％の複製を生じることを特徴とする方法。
ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が、結果としてゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９０％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９５％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９６％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９７％、ゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９８％、またはゲノム核酸試料中の核酸配列の少なくとも９９％の複製を生じることを特徴とする請求項１１８の方法。
ゲノムを増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびゲノム核酸試料を接触させて混合物を形成すること、およびゲノム核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で前記混合物をインキュベートすることを含み、
プライマーが前記ゲノム核酸試料中の核酸分子とハイブリダイズし、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、ゲノム核酸試料がゲノムの９０％以上を含み、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が結果として少なくとも１０％の遺伝子座表現を、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して生じることを特徴とする方法。
ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が、結果として少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の遺伝子座表現を、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して生じることを特徴とする請求項１２０の方法。
ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が、結果として少なくとも１０％の遺伝子座表現を、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じることを特徴とする請求項１２０または１２１の方法。
ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が、結果として５０倍未満の増幅偏りを生じることを特徴とする請求項１２０〜１２２のいずれか一項の方法。
ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が、結果として４５倍未満、４０倍未満、３５倍未満、３０倍未満、２５倍未満、２０倍未満、１９倍未満、１８倍未満、１７倍未満、１６倍未満、１５倍未満、１４倍未満、１３倍未満、１２倍未満、１１倍未満、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、または４倍未満の増幅偏りを生じることを特徴とする請求項１２３の方法。
ゲノム核酸試料中の核酸分子の複製が、結果として５０倍未満の増幅偏りを、少なくとも５個の異なる遺伝子座に関して、少なくとも６個の異なる遺伝子座、少なくとも７個の異なる遺伝子座、少なくとも８個の異なる遺伝子座、少なくとも９個の異なる遺伝子座、少なくとも１０個の異なる遺伝子座、少なくとも１１個の異なる遺伝子座、少なくとも１２個の異なる遺伝子座、少なくとも１３個の異なる遺伝子座、少なくとも１４個の異なる遺伝子座、少なくとも１５個の異なる遺伝子座、少なくとも１６個の異なる遺伝子座、少なくとも１７個の異なる遺伝子座、少なくとも１８個の異なる遺伝子座、少なくとも１９個の異なる遺伝子座、少なくとも２０個の異なる遺伝子座、少なくとも２５個の異なる遺伝子座、少なくとも３０個の異なる遺伝子座、少なくとも４０個の異なる遺伝子座、少なくとも５０個の異なる遺伝子座、少なくとも７５個の異なる遺伝子座、または少なくとも１００個の異なる遺伝子座に関して生じることを特徴とする請求項１２３または１２４の方法。
高い配列複雑性の核酸試料を増幅する方法であって、単一のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸試料を接触させて混合物を形成すること、および核酸試料中の核酸分子の複製を促進する条件下で前記混合物をインキュベートすることを含み、
プライマーが高い配列複雑性の核酸試料とハイブリダイズし、プライマーが特異的ヌクレオチド配列を有し、核酸試料が少なくとも１×１０³ヌクレオチドの配列複雑性を有し、核酸試料中の核酸分子の複製が鎖置換複製によって進行し、核酸試料中の核酸分子の複製が結果として少なくとも１０％の配列表現を、少なくとも５個の異なる標的配列に関して生じることを特徴とする方法。
核酸試料中の核酸分子の複製が、結果として少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の配列表現を、少なくとも５個の異なる標的配列に関して生じることを特徴とする請求項１２６の方法。
核酸試料中の核酸分子の複製が、結果として少なくとも１０％の配列表現を、少なくとも６個の異なる標的配列、少なくとも７個の異なる標的配列、少なくとも８個の異なる標的配列、少なくとも９個の異なる標的配列、少なくとも１０個の異なる標的配列、少なくとも１１個の異なる標的配列、少なくとも１２個の異なる標的配列、少なくとも１３個の異なる標的配列、少なくとも１４個の異なる標的配列、少なくとも１５個の異なる標的配列、少なくとも１６個の異なる標的配列、少なくとも１７個の異なる標的配列、少なくとも１８個の異なる標的配列、少なくとも１９個の異なる標的配列、少なくとも２０個の異なる標的配列、少なくとも２５個の異なる標的配列、少なくとも３０個の異なる標的配列、少なくとも４０個の異なる標的配列、少なくとも５０個の異なる標的配列、少なくとも７５個の異なる標的配列、または少なくとも１００個の異なる標的配列に関して生じることを特徴とする請求項１２６または１２７の方法。
核酸試料中の核酸分子の複製が、結果として５０倍未満の増幅偏りを生じることを特徴とする請求項１２６〜１２８のいずれか一項の方法。
核酸試料中の核酸分子の複製が、結果として４５倍未満、４０倍未満、３５倍未満、３０倍未満、２５倍未満、２０倍未満、１９倍未満、１８倍未満、１７倍未満、１６倍未満、１５倍未満、１４倍未満、１３倍未満、１２倍未満、１１倍未満、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、または４倍未満の増幅偏りを生じることを特徴とする請求項１２９の方法。
核酸試料中の核酸分子の複製が、結果として５０倍未満の増幅偏りを、少なくとも５個の異なる標的配列に関して、少なくとも６個の異なる標的配列、少なくとも７個の異なる標的配列、少なくとも８個の異なる標的配列、少なくとも９個の異なる標的配列、少なくとも１０個の異なる標的配列、少なくとも１１個の異なる標的配列、少なくとも１２個の異なる標的配列、少なくとも１３個の異なる標的配列、少なくとも１４個の異なる標的配列、少なくとも１５個の異なる標的配列、少なくとも１６個の異なる標的配列、少なくとも１７個の異なる標的配列、少なくとも１８個の異なる標的配列、少なくとも１９個の異なる標的配列、少なくとも２０個の異なる標的配列、少なくとも２５個の異なる標的配列、少なくとも３０個の異なる標的配列、少なくとも４０個の異なる標的配列、少なくとも５０個の異なる標的配列、少なくとも７５個の異なる標的配列、または少なくとも１００個の異なる標的配列に関して生じることを特徴とする請求項１２９または１３０の方法。