JP2010172323A5

JP2010172323A5 -

Info

Publication number: JP2010172323A5
Application number: JP2009021801A
Authority: JP
Filing date: 2009-02-02
Publication date: 2011-12-08

Claims

核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
該所定の一塩基多型が、第１の塩基および第２の塩基の２種類の塩基を有し、
該核酸試料が、該所定の一塩基多型による第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）および該所定の一塩基多型による第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）のいずれか１または両方を含み、
（ａ）該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｂ）該所定の一塩基多型の第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と該所定の一塩基多型の第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；および
（ｃ）該核酸試料について、該工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１およびＦ２）の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含み、
該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高く；そして
該第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも高い、
方法。
前記第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）が、前記第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、そして前記第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）が、前記第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する、請求項１に記載の方法。
前記第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）が、前記第２の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有し、そして前記第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）が、前記第１の塩基に相補的な塩基を３’末端側に有する、請求項２に記載の方法。
前記第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）と前記第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とが、前記所定の一塩基多型が存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
前記第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）と前記第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とが、前記所定の一塩基多型が存在する位置の塩基以外が同一の塩基配列からなる、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
前記工程（ｃ）において、
前記工程（ａ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが前記工程（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
前記工程（ａ）および（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）がともに存在する場合は遺伝子型が第１／第２型であり、そして
前記工程（ａ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在しないが前記工程（ｂ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在する場合は遺伝子型が第２／第２型であると判定する、
請求項１から５のいずれかの項に記載の方法。
核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
該所定の一塩基多型が、第１の塩基、第２の塩基、および第３の塩基の３種類の塩基を有し、
該核酸試料が、該所定の一塩基多型による第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）、該所定の一塩基多型による第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）、および該所定の一塩基多型による第３の塩基を有するＤＮＡ鎖（第３のＤＮＡ鎖）からなる群より選択される１または２種を含み、
（ｄ）該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｅ）該所定の一塩基多型の第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と該所定の一塩基多型に対応する第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；
（ｆ）該所定の一塩基多型の第３の塩基検出用プライマー対（第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）および第３の対プライマー（Ｐｃ３））と該所定の一塩基多型に対応する第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ３）を検出する工程；および
（ｇ）該核酸試料について、該工程（ｄ）〜（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２およびＦ３）の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含み、
該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第３の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高く；
該第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、該第１のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも高く；そして
該第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、該第１のＤＮＡ鎖および該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖および該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも高い、
方法。
前記工程（ｇ）において、
前記工程（ｄ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが前記工程（ｅ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
前記工程（ｄ）および（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在するが前記工程（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第２型であり、
前記工程（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在するが前記工程（ｄ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第２型であり、
前記工程（ｅ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在するが前記工程（ｄ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第３型であり、
前記工程（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在するが前記工程（ｄ）および（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第３型であり、そして
前記工程（ｄ）および（ｆ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在するが前記工程（ｅ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第３型であると判定する、
請求項７に記載の方法。
核酸試料中の所定の一塩基多型を核酸増幅反応を利用して検出する方法であって、
該所定の一塩基多型が、第１の塩基、第２の塩基、第３の塩基、および第４の塩基の４種類の塩基を有し、
該核酸試料が、該所定の一塩基多型による第１の塩基を有するＤＮＡ鎖（第１のＤＮＡ鎖）、該所定の一塩基多型による第２の塩基を有するＤＮＡ鎖（第２のＤＮＡ鎖）、該所定の一塩基多型による第３の塩基を有するＤＮＡ鎖（第３のＤＮＡ鎖）、および該所定の一塩基多型による第４の塩基を有するＤＮＡ鎖（第４のＤＮＡ鎖）からなる群より選択される１または２種を含み、
（ｈ）第１の塩基検出用プライマー対（第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）および第１の対プライマー（Ｐｃ１））と該所定の一塩基多型の第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ１）を検出する工程；
（ｉ）第２の塩基検出用プライマー対（第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）および第２の対プライマー（Ｐｃ２））と該所定の一塩基多型に対応する第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ２）を検出する工程；
（ｊ）第３の塩基検出用プライマー対（第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）および第３の対プライマー（Ｐｃ３））と該所定の一塩基多型に対応する第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ３）を検出する工程；
（ｋ）第４の塩基検出用プライマー対（第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）および第４の対プライマー（Ｐｃ４））と該所定の一塩基多型に対応する第４の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ４）とを、該核酸試料に添加して、核酸増幅反応を行い、該核酸増幅反応により増幅されるＤＮＡ断片（Ｆ４）を検出する工程；および
（ｌ）該核酸試料について、該工程（ｈ）〜（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（それぞれＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）の存在により、該一塩基多型の遺伝子型を判定する工程；
を含み、
該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）は、該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ１）は、該第１のＤＮＡ鎖の第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第２の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ２）は、該第２のＤＮＡ鎖の第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第３の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ３）は、該第３のＤＮＡ鎖の第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第４の塩基検出用の対プライマー（Ｐｃ４）は、該第４のＤＮＡ鎖の第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）がハイブリダイズする領域とは異なる任意の領域にハイブリダイズし；
該第１の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ１）は、該第２のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第１のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも低いが、該第２のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第１の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ１）よりも高く；
該第２の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ２）は、該第１のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第２のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖、該第３のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型含む領域に対するＴｍ値が、該第２の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ２）よりも高く；
該第３の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ３）は、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第３の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ３）よりも高く；そして
該第４の塩基検出用ブロッキング剤（Ｂ４）は、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域にハイブリダイズし、３’末端にジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を有するポリヌクレオチドであり、そして該第４のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）よりも低いが、該第１のＤＮＡ鎖、該第２のＤＮＡ鎖および該第３のＤＮＡ鎖の該所定の一塩基多型を含む領域に対するＴｍ値が、該第４の一塩基多型対応プライマー（Ｐｓ４）よりも高い、
方法。
前記工程（ｌ）において、
前記工程（ｈ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１）が存在するが前記工程（ｉ）、（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２、Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第１型であり、
前記工程（ｈ）および（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在するが前記工程（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第２型であり、
前記工程（ｈ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在するが前記工程（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第３型であり、
前記工程（ｈ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ４）が存在するが前記工程（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第１／第４型であり、
前記工程（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２）が存在するが前記工程（ｈ）、（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ３およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第２型であり、
前記工程（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ３）が存在するが前記工程（ｈ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第３型であり、
前記工程（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ２およびＦ４）が存在するが前記工程（ｈ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第２／第４型であり、
前記工程（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３）が存在するが前記工程（ｈ）、（ｉ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ２およびＦ４）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第３型であり、
前記工程（ｊ）および（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ３およびＦ４）が存在するが前記工程（ｈ）および（ｉ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１およびＦ２）が存在しない場合は遺伝子型が第３／第４型であり、そして
前記工程（ｋ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ４）が存在するが前記工程（ｈ）、（ｉ）および（ｊ）により検出されるＤＮＡ断片（Ｆ１、Ｆ２およびＦ３）が存在しない場合は遺伝子型が第４／第４型であると判定する、
請求項９に記載の方法。