JP2009278922A - チトクロームｐ４５０２ｃ９及び２ｃ１９の一塩基変異多型の塩基を検出するプライマ、プローブ、当該プライマ及びプローブを備えるキット、当該キットを備える検出装置、並びに、検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９及び２Ｃ１９の一塩基変異多型の塩基を迅速に検出するのに好適なキット等を提供する。
【解決手段】チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９又は２Ｃ１９遺伝子の所定の領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有するプローブと、当該遺伝子の所定の領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするＤＮＡを有するプローブと、からなるキットにより、当該遺伝子の一塩基変異多型の塩基配列を検出する。
【選択図】図１

Description

本発明は、チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９及び２Ｃ１９の一塩基変異多型の塩基を迅速に検出するのに好適なプライマ及びプローブを備えるキット、及び、検出方法等に関する。

ヒトゲノムの塩基配列を比較すると、個人毎に異なる箇所が存在することが知られている。これは、一塩基変異多型（SNP; Single Nucleotide Polymorphism）と呼ばれる。

ＳＮＰ部位は、ヒトゲノム中に数百万箇所あると考えられている。これらのＳＮＰには、タンパク質の発現調節又は機能等に影響を与えるものがあり、体質や疾病に対する易罹患性等の個人差に関与しているものがあると知られている。したがって、ＳＮＰに関する情報を得ることによって、個人の体質に応じた医療、いわゆるオーダーメイド医療を行うことができる。

チトクロームＰ４５０（以下、ＣＹＰ）は、肝臓に存在する薬物代謝酵素である。ＣＹＰは、ＣＹＰ１、ＣＹＰ２等の複数のファミリを含んでいる。また、ＣＹＰ２のサブファミリとしてＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９等が存在する。

ＣＹＰに存在するＳＮＰは、薬物排出、薬物取り込みなどの薬物の体内での動態（薬物動態）に関与し、例えば、抗てんかん薬であるフェニトインの効果や副作用に影響を及ぼすことが知られている。

ＣＹＰに存在するＳＮＰを検出する方法として、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism）法が知られている（例えば、特許文献１参照）。このＰＣＲ−ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲ増幅後、制限酵素処理を行い電気泳動することによってＳＮＰを検出している。
特開平１０−１４５８５号公報

しかしながら、臨床では多数の検体について限られた時間内に検査を行う必要がある。従って、ＳＮＰを迅速に検出する技術が求められている。

本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、ＣＹＰ ２Ｃ９及び２Ｃ１９のＳＮＰを迅速に検出するのに好適なプライマ、プローブ、当該プライマ及びプローブを備えるキット、当該キットを備える検出装置、並びに、検出方法を提供することを目的とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第１の観点に係るフォワードプライマは、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の３３８３から３４０３領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第２の観点に係るリバースプライマは、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の３６７６から３６９７領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第３の観点に係るプローブは、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の３５６０から３５９４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の３５９６から３６１４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするＤＮＡを有することを特徴とする。

前記３５６０から３５９４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、３’末端がＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎで標識され、前記３５９６から３６１４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、５’末端がＬＣＲｅｄ６４０で標識され、３’末端がＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎで標識される、ことも可能である。

チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の３６０８領域に示す一塩基変異多型の塩基がシトシンであるときに、当該一塩基変異多型の塩基を検出する、ことも可能である。

上記の目的を達成するため、本発明の第４の観点に係るキットは、
前記プライマ、並びに、前記プローブを備えることを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第５の観点に係るフォワードプライマは、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の４２５１０から４２５３０領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第６の観点に係るリバースプライマは、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の４２７２６から４２７４６領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第７の観点に係るプローブは、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の４２６０２から４２６２５領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の４２６２７から４２６４９領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするＤＮＡを有することを特徴とする。

前記４２６０２から４２６２５領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、３’末端がＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎで標識され、前記４２６２７から４２６４９領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、５’末端がＬＣＲｅｄ６４０で標識され、３’末端がＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎで標識される、ことも可能である。

チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の４２６１４領域に示す一塩基変異多型の塩基がシトシンであるときに、当該一塩基変異多型の塩基を検出する、ことも可能である。

上記の目的を達成するため、本発明の第８の観点に係るキットは、
前記プライマ、並びに、前記プローブを備えることを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第９の観点に係るフォワードプライマは、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１９１１５から１９１３４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第１０の観点に係るリバースプライマは、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１９３５３から１９３７３領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第１１の観点に係るプローブは、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１９１４６から１９１６３領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の１９１６５から１９２０４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするＤＮＡを有することを特徴とする。

前記１９１４６から１９１６３領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、３’末端がＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎで標識され、前記１９１６５から１９２０４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、５’末端がＬＣＲｅｄ６４０で標識され、３’末端がＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎで標識される、ことも可能である。

チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１９１５４領域に示す一塩基変異多型の塩基がグアニンであるときに、当該一塩基変異多型の塩基を検出する、ことも可能である。

ストランドから構成される、ことも可能である。

上記の目的を達成するため、本発明の第１２の観点に係るキットは、
前記プライマ、並びに、前記プローブを備えることを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第１３の観点に係るフォワードプライマは、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１７８４８から１７８６９領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第１４の観点に係るリバースプライマは、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１８１５０から１８１６９領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第１５の観点に係るプローブは、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１７９３４から１７９５１領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の１７９５３から１７９８８領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするＤＮＡを有することを特徴とする。

前記１７９３４から１７９５１領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、３’末端がＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎで標識され、前記１７９５３から１７９８８領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、５’末端がＬＣＲｅｄ６４０で標識され、３’末端がＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎで標識される、ことも可能である。

チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１７９４８領域に示す一塩基変異多型の塩基がグアニンであるときに、当該一塩基変異多型の塩基を検出する、ことも可能である。

ストランドから構成される、ことも可能である。

上記の目的を達成するため、本発明の第１６の観点に係るキットは、
前記プライマ、並びに、前記プローブを備えることを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第１７の観点に係る検出装置は、
前記キットのうち少なくともいずれかの１つのキットを備えることを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第１８の観点に係る検出方法は、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の３３８３から３４０３領域と当該遺伝子の３６７６から３６９７領域との間でＤＮＡを伸長する伸長工程と、
当該遺伝子の３５６０から３５９４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の３５９６から３６１４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするハイブリダイゼーション工程と、
当該遺伝子の３６０８領域に示す一塩基変異多型の塩基を検出する検出工程と、を有する、
ことを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第１９の観点に係る検出方法は、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の４２５１０から４２５３０領域と当該遺伝子の４２７２６から４２７４６領域との間でＤＮＡを伸長する伸長工程と、
当該遺伝子の４２６０２から４２６２５領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の４２６２７から４２６４９領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするハイブリダイゼーション工程と、
当該遺伝子の４２６１４領域に示す一塩基変異多型の塩基を検出する検出工程と、を有する、
ことを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第２０の観点に係る検出方法は、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１９１１５から１９１３４領域と当該遺伝子の１９３５３から１９３７３領域との間でＤＮＡを伸長する伸長工程と、
当該遺伝子の１９１４６から１９１６３領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の１９１６５から１９２０４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするハイブリダイゼーション工程と、
当該遺伝子の１９１５４領域に示す一塩基変異多型の塩基を検出する検出工程と、を有する、
ことを特徴とする。

上記の目的を達成するため、本発明の第２１の観点に係る検出方法は、
チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１７８４８から１７８６９領域と当該遺伝子の１８１５０から１８１６９領域との間でＤＮＡを伸長する伸長工程と、
当該遺伝子の１７９３４から１７９５１領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の１７９５３から１７９８８領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするハイブリダイゼーション工程と、
当該遺伝子の１７９４８領域に示す一塩基変異多型の塩基を検出する検出工程と、を有する、
ことを特徴とする。

前記検出工程は、薬の副作用を検出する、ことも可能である。

前記薬は、抗てんかん薬である、ことも可能である。

前記抗てんかん薬は、フェニトインである、ことも可能である。

本発明によれば、ＣＹＰ ２Ｃ９及び２Ｃ１９の一塩基変異多型の塩基を迅速に検出することができる。

（プライマ及びプローブ）
本実施形態に係るフォワードプライマ、リバースプライマ及びプローブは、チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）のファミリであるＣＹＰ ２Ｃ９及び２Ｃ１９に存在する一塩基変異多型の塩基（ＳＮＰ）をスクリーニング（検出）する。

図１及び図２は、ＣＹＰ ２Ｃ９遺伝子の塩基配列である。また、図３及び図４は、ＣＹＰ ２Ｃ１９遺伝子の塩基配列である。これらの塩基配列は、米国ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）より引用したものである。

遺伝子ＤＮＡにおいて、フォワード側とは、図１から図４の遺伝子ＤＮＡの上流側をいい、リバース側とは、図１から図４の遺伝子ＤＮＡの下流側をいう。当該遺伝子ＤＮＡは、左から右に向かって５’から３’の配列となっている。

ここで、配列表の配列番号１に示す塩基配列をフォワードプライマ１とする。フォワードプライマ１は、図１に示すフォワードプライマの塩基配列と、同一、相補的、又は逆相補的な配列を有する。
配列表の配列番号２に示す塩基配列をリバースプライマ１とする。リバースプライマ１は、図１に示すリバースプライマの塩基配列と、同一、相補的、又は逆相補的な配列を有する。
配列表の配列番号３及び４に示す塩基配列をプローブ１とする。プローブ１は、図１に示すプローブの塩基配列と、同一、相補的、又は逆相補的な配列を有する。

配列表の配列番号５に示す塩基配列をフォワードプライマ２とする。フォワードプライマ２は、図２に示すフォワードプライマの塩基配列と、同一、相補的、又は逆相補的な配列を有する。
配列表の配列番号６に示す塩基配列をリバースプライマ２とする。リバースプライマ２は、図２に示すリバースプライマの塩基配列と、同一、相補的、又は逆相補的な配列を有する。
配列表の配列番号７及び８に示す塩基配列をプローブ２とする。プローブ２は、図２に示すリプローブの塩基配列と、同一、相補的、又は逆相補的な配列を有する。

配列表の配列番号９に示す塩基配列をフォワードプライマ３とする。フォワードプライマ３は、図３に示すフォワードプライマの塩基配列と、同一、相補的、又は逆相補的な配列を有する。
配列表の配列番号１０に示す塩基配列をリバースプライマ３とする。リバースプライマ３は、図３に示すリバースプライマの塩基配列と、同一、相補的、又は逆相補的な配列を有する。
配列表の配列番号１１及び１２に示す塩基配列をプローブ３とする。プローブ３は、図３に示すリプローブの塩基配列と、同一、相補的、又は逆相補的な配列を有する。

配列表の配列番号１３に示す塩基配列をフォワードプライマ４とする。フォワードプライマ４は、図４に示すフォワードプライマの塩基配列と、同一、相補的、又は逆相補的な配列を有する。
配列表の配列番号１４に示す塩基配列をリバースプライマ４とする。リバースプライマ４は、図４に示すリバースプライマの塩基配列と、同一、相補的、又は逆相補的な配列を有する。
配列表の配列番号１５及び１６に示す塩基配列をプローブ４とする。プローブ４は、図４に示すリプローブの塩基配列と、同一、相補的、又は逆相補的な配列を有する。

ここで、相補的とは、各塩基のａ（アデニン）とｔ（チミン）とを、ｇ（グアニン）とｃ（シトシン）とを入れ換えた状態をいう。また、逆相補的とは、塩基配列の５’末端と３’末端とを入れ換えた状態をいう。

本フォワードプライマ及びリバースプライマは、配列番号１、２、５、６、９、１０、１３及び１４に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の塩基配列を有する核酸、又は該核酸の１０％以下の塩基が置換された核酸を有することもできる。プライマのサイズは、１５塩基以上４３塩基以下であるが、１８塩基から３０塩基程度が好ましい。
なお、塩基の置換は、できるだけ少ない方が好ましく、置換がないことが最も好ましく、置換がある場合でも１塩基、とりわけ、５’末端又はその近傍に置換があることが比較的好ましい。

通常、プライマは３’末端にリン酸を経由して５’末端が付き、５’末端から３’末端の方向に伸びる。しかし、５’末端から少し離れた箇所で５’末端から３’末端の方向に伸び、さらにここから少し離れた箇所でまた５’末端から３’末端の方向に伸びることも可能である。つまり、後ずさりするようにして、３’末端から５’末端の方向に伸びる。このような後ずさりによって、相補的又は逆相補的なプライマでも対象遺伝子を複製・増幅することができる。

したがって、本フォワードプライマ、リバースプライマ及びプローブは、同一な塩基配列に限られず、相補的又は逆相補的に置き換えることもできる。

本プライマは、キャピラリチューブ（内径が０．５ｍｍから１ｍｍ程度、内容積が１０μｌから２０μｌ程度の毛管）内でＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を行うために使用される。
なお、本プライマは、キャピラリチューブ内で行うＰＣＲに限定されず、他のＰＣＲにも適用できる。

なお、「領域」、「区域」、「断片」の語は、直鎖型デオキシ又はリボ核酸分子、すなわちＤＮＡ又はＲＮＡ上の少なくとも一つの連続した部分を意味する。ＤＮＡ又はＲＮＡは、この分子のヌクレオチドの数で測定して、その分子の特定の数のヌクレオチドの、特定の位置の、読み下流及び・又は上流の５’末端から３’末端方向に好ましくはその分子の２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３又は２個のヌクレオチドからなる。

次に、本実施形態に係るプローブについて説明する。

本プローブは、図１から図４に示すプローブ領域の塩基配列又は相補鎖に、１塩基から５塩基の間隔を空けてハイブリダイズする。本プローブは、配列番号３、４、７、８、１１、１２、１５及び１６に示す塩基配列のうち連続する１５塩基以上の一組の核酸を有する。プローブのサイズは、１５塩基以上であるが、１８塩基から３５塩基程度が好ましい。

プローブ１及び２のいずれか一方の核酸（塩基配列が短い核酸）は、図１及び２に示すように、ＣＹＰ ２Ｃ９遺伝子のＳＮＰ部位を含む領域とハイブリダイズする。また、プローブ３及び４のいずれか一方の核酸（塩基配列が短い核酸）は、図３及び４に示すように、ＣＹＰ ２Ｃ１９遺伝子のＳＮＰ部位を含む領域とハイブリダイズする。

また、本プローブには、ハイブリダイズした状態において各核酸の互いに近接する末端領域に、共働して、ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）効果を生じる蛍光色素がそれぞれ結合される。

各蛍光色素は、増幅産物とハイブリダイズした状態において、各核酸の互いに近接する末端領域、好ましくは、末端のヌクレオチドに結合される。
例えば、プローブがアンチセンス鎖（対象となる核酸をセンス鎖とした場合の逆側の鎖）とハイブリダイズする場合、センス鎖を基準として上流の領域にハイブリダイズするプローブの３’末端にドナー色素（又はアクセプタ色素）を結合する。下流の領域にハイブリダイズするプローブの５’末端にアクセプタ色素（又はドナー色素）を結合する。一組のプローブが増幅産物にハイブリダイズした状態では、ドナー色素とアクセプタ色素とが近接して存在するため、これらが協働してＦＲＥＴ効果が起こる。従って、増幅産物の測定が可能になる。

ここで、ドナー蛍光色素は、例えば、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎである。また、アクセプタ蛍光色素は、例えば、ＬＣＲｅｄ６４０、ＬＣＲｅｄ７０５である。

本プローブには、ＦＲＥＴ効果のための蛍光色素・発光酵素などの発色成分が予め又は事前に、若しくは後で又は事後に混合され、この発色成分は本プローブに結合・標識される。

なお、プローブ３及び４は、ストランドからなる。ここで、ストランドとは、二重螺旋構造の片側部分を示す。

フォワードプライマ１、リバースプライマ１及びプローブ１は、ＣＹＰ ２Ｃ９遺伝子の３６０８番目の塩基がｃ（シトシン）かｔ（チミン）であるかを検出する。つまり、当該プライマ及びプローブは、ＣＹＰ ２Ｃ９＊２をスクリーニングすることができる。

フォワードプライマ２、リバースプライマ２及びプローブ２は、ＣＹＰ ２Ｃ９遺伝子の４２６１４番目の塩基がａ（アデニン）かｃ（シトシン）であるかを検出する。つまり、当該プライマ及びプローブは、ＣＹＰ ２Ｃ９＊３をスクリーニングすることができる。

フォワードプライマ３、リバースプライマ３及びプローブ３は、ＣＹＰ ２Ｃ１９遺伝子の１９１５４番目の塩基がｇ（グアニン）かａ（アデニン）であるかを検出する。つまり、当該プライマ及びプローブは、ＣＹＰ ２Ｃ１９＊２をスクリーニングすることができる。

フォワードプライマ４、リバースプライマ４及びプローブ４は、ＣＹＰ ２Ｃ１９遺伝子の１９７４８番目の塩基がｇ（グアニン）かａ（アデニン）であるかを検出する。つまり、当該プライマ及びプローブは、ＣＹＰ ２Ｃ１９＊２をスクリーニングすることができる。

（キット及び検出装置）
次に、本実施形態に係るプライマ及びプローブを備えるキット及びキットを備える検出装置について説明する。

本実施形態に係るキットは、フォワードプライマ１、リバースプライマ１、及びプローブ１を備える。フォワードプライマ、リバースプライマ及びプローブを備えるものを一つのキット（以下、キット１）とする。

フォワードプライマ２、リバースプライマ２、及びプローブ２を備えるものを一つのキット（以下、キット２）とする。また、フォワードプライマ３、リバースプライマ３、及びプローブ３を備えるものを一つのキット（以下、キット３）とする。さらに、フォワードプライマ４、リバースプライマ４、及びプローブ４を備えるものを一つのキット（以下、キット４）とする。

キット１により、ＣＹＰ ２Ｃ９＊２をスクリーニングすることができる。また、キット２により、ＣＹＰ ２Ｃ９＊３をスクリーニングすることができる。

キット３により、ＣＹＰ ２Ｃ１９＊２をスクリーニングすることができる。また、キット４により、ＣＹＰ ２Ｃ１９＊３をスクリーニングすることができる。

本実施形態に係る検出装置は、本キットのうち少なくともいずれかの一つのキットを備える。

（検出方法）
次に、本実施形態に係るＳＮＰの検出方法について説明する。本プライマ及びプローブを用いて、核酸増幅法により被検核酸を増幅するとともに得られたそれぞれの増幅産物に、当該プローブをハイブリダイズさせ、その融解温度を測定することにより、ＳＮＰを検出することができる。

本フォワードプライマ及びリバースプライマは、核酸増幅法におけるプライマとして用いられる。ここで、核酸増幅法は、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、リアルタイムＰＣＲ法がある。

リアルタイムＰＣＲ法は、例えば、インタカレータ法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法、サイクリングプローブ法、ハイブリダイゼーションプローブ法がある。

本プライマは、これらのいずれにも用いることができ、好ましくはハイブリダイゼーションプローブ法で用いられる。
なお、ＰＣＲ反応は、マイクロチューブ、キャピラリチューブの内部で行われる。

リアルタイムＰＣＲ法を行う装置として、例えば、ライトサイクラー（登録商標）がある。

本検出方法は、本プローブとハイブリダイズさせ、得られたハイブリッドの融解温度を測定する。一組のプローブの一方は、ＳＮＰ部位を含み、野生型の遺伝子領域と同一の塩基配列を有する。

本プローブに結合した蛍光色素にレーザ光線又は青色光線が照射されると、対象遺伝子に結合したプローブからは蛍光が発光される。加熱されて本プローブが対象遺伝子から順次はがれると、ＦＲＥＴ効果による励起光（蛍光）は減少又は消える。

このため、野生型の遺伝子とのハイブリッドの融解温度は、当該プローブとのミスマッチを含む、変異型の遺伝子（ここでは、ＳＮＰ）とのハイブリッドの融解温度よりも高くなる。従って、融解温度を測定することにより、ＳＮＰの検出を行うことができる。

なお、プローブのアクセプタ蛍光色素として、識別な可能な異なる色素を用いれば、ＳＮＰを区別して検出することもできる。

さらに、遺伝子が、野生型と変異型のヘテロ接合になっている場合には、二つの融解温度が測定されるため、ヘテロ接合かホモ接合かの区別ができる。従って、本検出方法によれば、ジェノタイプも調べることができる。

温度を横軸、蛍光強度の変化率を縦軸とした融解強度を測定して、当該融解強度をプロットするとピークが描かれる。そのピークの温度が融解温度である。ヘテロ接合の場合には、増幅産物とのハイブリッドの融解温度を測定することにより、点突然変異（ＳＮＰ）を検出する。当該検出は、ライトサイクラー（登録商標）のような市販の装置を用いて容易に行うことができる。

なお、本検出方法には、本フォワードプライマ、リバースプライマ及びプローブが共働して、核酸増幅法により被検核酸を増幅することも含まれる。また、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により、又はダイレクトシークエンスにより、当該増幅産物からＳＮＰを検出することも可能である。

また、本発明の検出方法は、プライマ及びプローブに特徴があり、核酸増幅法自体は、市販のキット及び装置を用いて周知の方法により行うことができる。キャピラリチューブ内でＰＣＲを行う方法が、迅速で好ましい。この方法は、ライトサイクラーのような市販のキット及び装置を用いて容易に行うことができる。

さらに。ＣＹＰ遺伝子は、種々の細胞に普遍的に存在するので、被検試料は、ヒトの任意の細胞由来のＤＮＡであってよい。

（他の実施形態）
本発明は、上記実施形態に限定されず、種々変更が可能である。例えば、同一、相補的又は逆相補的なプライマ、及び、同一、相補的又は逆相補的なプローブ、並びに、同一、相補的又は逆相補的でないプライマ、及び、同一、相補的又は逆相補的でないプローブは、両方が共に加えられ使用されてもよい。これにより、対象遺伝子ＤＮＡのＳＮＰ検出のための検査時間、実験時間、反応時間は短くなる。

また、プライマのセット、プローブのセットは、これらのプライマ又はプローブの塩基配列と同一、相補的又は逆相補的なものとしてもよい。対象遺伝子ＤＮＡの事前複製、事前増幅、変異検出、差異検出を行うことができる。

ＰＣＲ法によって検出される対象遺伝子ＤＮＡの変異は、塩基の欠損、挿入、置換、ＳＮＰなど、遺伝子ＤＮＡの異常と正常との違い又は正常であっても個人差による違いであってもよい。

ＰＣＲ法によって検出される遺伝子ＤＮＡはヒトのものであるが、家畜その他の動物、植物、菌、微生物におけるものであってもよい。さらに、本発明の遺伝子検査方法又はＰＣＲ法によって検出される対象遺伝子ＤＮＡは、対象遺伝子ＤＮＡの情報が写し取られたｍＲＮＡでもよいし、ＲＮＡであってもよい。

以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
フォワードプライマ１、リバースプライマ１及びプローブ１（つまり、キット１）を用いて、ＣＹＰ ２Ｃ９＊２のスクリーニングを行った。

ヒトゲノムをテンプレートとして、上記プライマで増幅したＰＣＲ増幅産物をベクタ（pT7Blue-2 Vector: Novagen（登録商標））に組み込んだ。その後、シークエンスにより野生型か変異型かを確認して、ＳＮＰ部位に変異導入を行うことにより、初めに作成した型と異なる型を作成した。野生型のプラスミドと変異型のプラスミドとを混合させることにより、ヘテロサンプルとした。当該ヘテロサンプルを希釈したものをポジティブコントロールとした。

ハイブリダイゼーション法によるリアルタイムＰＣＲを行い、さらにプローブの増幅産物とのハイブリッドの融解温度を測定した。被検試料は、ヘテロ接合体であるヒトＤＮＡである。

スクリーニングには、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社のライトサイクラー（登録商標）１．２を用い、プログラムとしてライトサイクラーソフトウェアＶｅｒ３．５を用いた。また、ライトサイクラーファストスタートＤＮＡマスターハイブリダイゼーションプローブ（製品番号３００３２４８、９６リアクション）を使用して、調整済みライトサイクラーファストスタート反応ミックスを作成した。

ライトサイクラー（登録商標）に付属するキャピラリに、ポジティブコントロール２．０μｌを入れた。また、ネガティブコントロールとして水を加えた。キャピラリチューブに栓をし、ライトサイクラー（登録商標）にセットして、表３に示す条件の変性工程、表４に示す条件の増幅工程、表５に示す条件の融解分析工程、表６に示す条件の冷却工程を繰り返した。増幅反応中、蛍光強度をリアルタイムで測定した。

図５は、温度を横軸、蛍光強度の変化率を縦軸とした融解強度の曲線である。ポジティブコントロールは、野生型と変異型とが混合されたテロサンプルであるため、二つのピークが出現した。なお、ピークのない線は水を示す。

以上、図５の結果から、フォワードプライマ１、リバースプライマ１及びプローブ１を用いて、ＣＹＰ ２Ｃ９＊２をスクリーニングできることが判明した。

反応プロトコル

表１に対応するピペッティングスキームの例

テンプレート変性の条件

ターゲットＤＮＡの増幅条件

ターゲットＤＮＡの融解分析条件

ロータ及びチャンバの冷却条件

（実施例２）
フォワードプライマ２、リバースプライマ２及びプローブ２（つまり、キット２）を用いて、ＣＹＰ ２Ｃ９＊３のスクリーニングを行った。

実施例１と同様に、ポジティブコントロールを作成した。スクリーニングは、ポジティブコントロール２．０μｌ、表７及び表８に示す反応液、及び、表３から表６に示す反応条件で実行した。

図６は、温度を横軸、蛍光強度の変化率を縦軸とした融解強度の曲線である。ポジティブコントロールは、野生型と変異型とが混合されたテロサンプルであるため、二つのピークが出現した。なお、ピークのない線は水を示す。

以上、図６の結果から、フォワードプライマ２、リバースプライマ２及びプローブ２を用いて、ＣＹＰ ２Ｃ９＊３をスクリーニングできることが判明した。

反応プロトコル

表７に対応するピペッティングスキームの例

（実施例３）
フォワードプライマ３、リバースプライマ３及びプローブ３（つまり、キット３）を用いて、ＣＹＰ ２Ｃ１９＊２のスクリーニングを行った。

実施例１と同様に、ポジティブコントロールを作成した。スクリーニングは、ポジティブコントロール２．０μｌ、表９及び表１０に示す反応液、及び、表３から表６に示す反応条件で実行した。

図７は、温度を横軸、蛍光強度の変化率を縦軸とした融解強度の曲線である。ポジティブコントロールは、野生型と変異型とが混合されたテロサンプルであるため、二つのピークが出現した。なお、ピークのない線は水を示す。

以上、図７の結果から、フォワードプライマ３、リバースプライマ３及びプローブ３を用いて、ＣＹＰ ２Ｃ１９＊２をスクリーニングできることが判明した。

反応プロトコル

表９に対応するピペッティングスキームの例

（実施例４）
フォワードプライマ４、リバースプライマ４及びプローブ４（つまり、キット４）を用いて、ＣＹＰ ２Ｃ１９＊３のスクリーニングを行った。

実施例１と同様に、ポジティブコントロールを作成した。スクリーニングは、ポジティブコントロール２．０μｌ、表１１及び表１２に示す反応液、及び、表３から表６に示す反応条件で実行した。

図８は、温度を横軸、蛍光強度の変化率を縦軸とした融解強度の曲線である。ポジティブコントロールは、野生型と変異型とが混合されたテロサンプルであるため、二つのピークが出現した。なお、ピークのない線は水を示す。

以上、図８の結果から、フォワードプライマ４、リバースプライマ４及びプローブ４を用いて、ＣＹＰ ２Ｃ１９＊３をスクリーニングできることが判明した。

反応プロトコル

表１１に対応するピペッティングスキームの例

ＣＹＰ ２Ｃ９遺伝子の塩基配列を示す図である。 ＣＹＰ ２Ｃ９遺伝子の塩基配列を示す図である。 ＣＹＰ ２Ｃ１９遺伝子の塩基配列を示す図である。 ＣＹＰ ２Ｃ１９遺伝子の塩基配列を示す図である。 ＣＹＰ ２Ｃ９＊２の検出結果を示す図である。 ＣＹＰ ２Ｃ９＊３の検出結果を示す図である。 ＣＹＰ ２Ｃ１９＊２の検出結果を示す図である。 ＣＹＰ ２Ｃ１９＊３の検出結果を示す図である。

Claims (34)

1. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の３３８３から３４０３領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とするフォワードプライマ。
2. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の３６７６から３６９７領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とするリバースプライマ。
3. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の３５６０から３５９４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の３５９６から３６１４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするＤＮＡを有することを特徴とするプローブ。
4. 前記３５６０から３５９４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、３’末端がＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎで標識され、前記３５９６から３６１４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、５’末端がＬＣＲｅｄ６４０で標識され、３’末端がＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎで標識されることを特徴とする請求項３に記載のプローブ。
5. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の３６０８領域に示す一塩基変異多型の塩基がシトシンであるときに、当該一塩基変異多型の塩基を検出することを特徴とする請求項３又は４に記載のプローブ。
6. 請求項１及び２に記載のプライマ、並びに、請求項３乃至５のいずれか１項に記載のプローブを備えることを特徴とするキット。
7. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の４２５１０から４２５３０領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とするフォワードプライマ。
8. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の４２７２６から４２７４６領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とするリバースプライマ。
9. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の４２６０２から４２６２５領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の４２６２７から４２６４９領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするＤＮＡを有することを特徴とするプローブ。
10. 前記４２６０２から４２６２５領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、３’末端がＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎで標識され、前記４２６２７から４２６４９領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、５’末端がＬＣＲｅｄ６４０で標識され、３’末端がＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎで標識されることを特徴とする請求項９に記載のプローブ。
11. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の４２６１４領域に示す一塩基変異多型の塩基がシトシンであるときに、当該一塩基変異多型の塩基を検出することを特徴とする請求項９又は１０に記載のプローブ。
12. 請求項７及び８に記載のプライマ、並びに、請求項９乃至１１のいずれか１項に記載のプローブを備えることを特徴とするキット。
13. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１９１１５から１９１３４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とするフォワードプライマ。
14. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１９３５３から１９３７３領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とするリバースプライマ。
15. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１９１４６から１９１６３領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の１９１６５から１９２０４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするＤＮＡを有することを特徴とするプローブ。
16. 前記１９１４６から１９１６３領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、３’末端がＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎで標識され、前記１９１６５から１９２０４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、５’末端がＬＣＲｅｄ６４０で標識され、３’末端がＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎで標識されることを特徴とする請求項１５に記載のプローブ。
17. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１９１５４領域に示す一塩基変異多型の塩基がグアニンであるときに、当該一塩基変異多型の塩基を検出することを特徴とする請求項１５又は１６に記載のプローブ。
18. ストランドから構成されることを特徴とする請求項１５乃至１７のいずれか１項に記載のプローブ。
19. 請求項１３及び１４に記載のプライマ、並びに、請求項１５乃至１８のいずれか１項に記載のプローブを備えることを特徴とするキット。
20. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１７８４８から１７８６９領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とするフォワードプライマ。
21. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１８１５０から１８１６９領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とするリバースプライマ。
22. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１７９３４から１７９５１領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の１７９５３から１７９８８領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするＤＮＡを有することを特徴とするプローブ。
23. 前記１７９３４から１７９５１領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、３’末端がＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎで標識され、前記１７９５３から１７９８８領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列は、５’末端がＬＣＲｅｄ６４０で標識され、３’末端がＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎで標識されることを特徴とする請求項２２に記載のプローブ。
24. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１７９４８領域に示す一塩基変異多型の塩基がグアニンであるときに、当該一塩基変異多型の塩基を検出することを特徴とする請求項２２又は２３に記載のプローブ。
25. ストランドから構成されることを特徴とする請求項２２乃至２４のいずれか１項に記載のプローブ。
26. 請求項２０及び２１に記載のプライマ、並びに、請求項２２乃至２５のいずれか１項に記載のプローブを備えることを特徴とするキット。
27. 請求項６、１２、１９、又は、２６に記載のキットのうち少なくともいずれかの１つのキットを備えることを特徴とする検出装置。
28. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の３３８３から３４０３領域と当該遺伝子の３６７６から３６９７領域との間でＤＮＡを伸長する伸長工程と、
    当該遺伝子の３５６０から３５９４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の３５９６から３６１４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするハイブリダイゼーション工程と、
    当該遺伝子の３６０８領域に示す一塩基変異多型の塩基を検出する検出工程と、を有する、
    ことを特徴とする検出方法。
29. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ９遺伝子の４２５１０から４２５３０領域と当該遺伝子の４２７２６から４２７４６領域との間でＤＮＡを伸長する伸長工程と、
    当該遺伝子の４２６０２から４２６２５領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の４２６２７から４２６４９領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするハイブリダイゼーション工程と、
    当該遺伝子の４２６１４領域に示す一塩基変異多型の塩基を検出する検出工程と、を有する、
    ことを特徴とする検出方法。
30. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１９１１５から１９１３４領域と当該遺伝子の１９３５３から１９３７３領域との間でＤＮＡを伸長する伸長工程と、
    当該遺伝子の１９１４６から１９１６３領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の１９１６５から１９２０４領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするハイブリダイゼーション工程と、
    当該遺伝子の１９１５４領域に示す一塩基変異多型の塩基を検出する検出工程と、を有する、
    ことを特徴とする検出方法。
31. チトクロームＰ４５０ ２Ｃ１９遺伝子の１７８４８から１７８６９領域と当該遺伝子の１８１５０から１８１６９領域との間でＤＮＡを伸長する伸長工程と、
    当該遺伝子の１７９３４から１７９５１領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列、及び、当該遺伝子の１７９５３から１７９８８領域に示す塩基配列と同一、相補的又は逆相補的な塩基配列にハイブリダイズするハイブリダイゼーション工程と、
    当該遺伝子の１７９４８領域に示す一塩基変異多型の塩基を検出する検出工程と、を有する、
    ことを特徴とする検出方法。
32. 前記検出工程は、薬の副作用を検出することを特徴とする請求項２８乃至３１のいずれか１項に記載の検出方法。
33. 前記薬は、抗てんかん薬であることを特徴とする請求項３２に記載の検出方法。
34. 前記抗てんかん薬は、フェニトインであることを特徴とする請求項３３に記載の検出方法。

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