CN109072221A - 变异引物的设计方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供不易发生由引物二聚体或环结构导致的非特异性扩增的变异引物的新的设计方法。一种引入了变异的引物的设计方法，其中，具备选择基础引物序列所含的、符合选自以下的(1)～(4)的1个或2个以上的条件的1个或2个以上的核苷酸残基作为变异引入部位的变异引入部位选择工序：(1)可能会有助于引物二聚体的形成的核苷酸残基；(2)可能会有助于1分子引物内的环结构的形成的核苷酸残基；(3)预测由所述基础引物序列形成的引物形成引物二聚体的情况下，位于引物互补或非互补杂交的区域以外的区域的核苷酸残基；(4)预测由所述基础引物序列形成的引物在1分子内形成环结构的情况下，位于构成环结构的区域以外的区域的核苷酸残基。

Description

变异引物的设计方法
技术领域
本发明涉及引入了变异的引物的设计方法。
背景技术
现在，核酸扩增法不仅在基础研究领域，在包括流行病学检查、医学诊断、法医学和基因分析的各种领域也是必不可少的方法。核酸扩增法可特异性扩增目标核酸序列，所以作为用于检测目标核酸的存在的高敏感性手段非常有用。
作为实施核酸扩增法时的问题之一，可例举非特异性扩增产物的生成。另外，已知引物二聚体的形成和1分子引物内的环结构的形成是产生非特异性扩增的主要原因。引物二聚体或环结构的形成导致的非特异性扩增可能会在例如引物的3'末端区域具有与其本身或其他引物的一定程度的互补性的情况下发生。
如定量PCR或等温扩增法这样用于判别有无目标序列的核酸扩增体系中，如果发生这样的非特异性扩增，则产生S/N比下降、出现伪阳性等问题，可能会无法检出目标序列。
这样的状况下，提出有抑制作为非特异性扩增反应的原因之一的引物二聚体的产生的方法。
专利文献1中揭示了通过使用标记的引物应用FRET的原理，使引物二聚物产生的信号不被检出而提高S/N比的方法。
此外，专利文献2中揭示了在3'末端侧的序列内包含选自2'-氟-核苷酸类、2'-氨基核苷酸类和阿拉伯糖核苷酸类的经修饰的核苷酸的引物。
作为同样的技术，专利文献3中揭示了在3'末端侧的序列内包含经改变的嘧啶核酸碱基的引物。
专利文献2和3中记载了如果使用这些引物，则可抑制引物二聚体的形成。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利特表2005-528121号公报
专利文献2:日本专利特开2002-291490号公报
专利文献3:日本专利特表2008-535518号公报
发明内容
发明所要解决的技术问题
专利文献1中记载的方法在通过读取由扩增产物发出的荧光来检测目标核酸的存在的有无或存在量的定量PCR中是有效的手段，但无法应用于通过嵌入剂检测扩增核酸的体系。此外，由于无法抑制引物二聚体本身的产生，因此无法防止引物二聚体导致非特异性扩增产物的生成引发的引物耗尽。
专利文献2和3中记载的方法抑制作为非特异性扩增的原因的引物二聚体的产生本身。但是，这些文献中对引入修饰或改变核苷酸的位置仅有“3个3'末端核苷酸位置内”或“自3'末端起4个核苷酸内”等抽象的记载，对可更有效地抑制非特异性扩增的修饰引物的设计方法没有揭示。
这样的状况下，本发明要解决的课题在于提供不易发生由引物二聚体或环结构导致的非特异性扩增的变异引物的新的设计方法。
解决技术问题所采用的技术方案
解决上述课题的本发明是一种设计方法，它是用于核酸扩增法的引入了变异的引物的设计方法，其中，具备
设计与模板DNA完全互补的碱基序列作为基础引物序列的基础序列设计工序，以及
选择该基础引物序列所含的、符合选自以下的(1)～(4)的1个或2个以上的条件的1个或2个以上的核苷酸残基作为变异引入部位的变异引入部位选择工序：
(1)可能会有助于引物二聚体的形成的核苷酸残基；
(2)可能会有助于1分子引物内的环结构的形成的核苷酸残基；
(3)预测由所述基础引物序列形成的引物形成引物二聚体的情况下，位于引物互补或非互补杂交的区域以外的区域的核苷酸残基；
(4)预测由所述基础引物序列形成的引物在1分子内形成环结构的情况下，位于构成环结构的区域以外的区域的核苷酸残基。
如果采用本发明的设计方法，可容易地设计不易发生由引物二聚体或环结构导致的非特异性扩增的变异引物。
本发明中，较好是对引入至变异引物的变异采用DNA聚合酶不会识别为核苷酸残基的变异。
通过采用这样的形态，可设计更不易发生非特异性扩增的引物。
本发明的优选形态中，变异为选自以下的(A)～(D)的1种或2种以上：
(A)与位于所述变异引入部位的前后的核苷酸残基的5'末端及3'末端分别结合5'末端及3'末端而成的核苷酸残基或聚核苷酸；
(B)由碳链或PEG链形成的间隔物链；
(C)由以通式1表示的四氢呋喃衍生物形成的间隔物链，
通式1
[化1]
通式1中，R表示H或羟基，n表示自然数；
(D)经光分解性修饰的间隔物链。
通过将引入至变异引物的变异采用(A)～(D)，可设计进一步不易发生非特异性扩增的引物。
此外，本发明还涉及通过上述的设计方法设计的引物和使用该引物的核酸扩增法。
如果采用本发明的引物和核酸扩增方法，可减少核酸扩增中的非特异性扩增。
本发明的核酸扩增方法特别好是适用于等温扩增法。
等温扩增法与PCR法不同，不包含双链DNA的变性工序而容易发生非特异性扩增，因此特别好是适用本发明的核酸扩增法。
此外，本发明还涉及用于将上述的设计方法的各工序作为步骤由计算机实施的程序。
如果采用本发明的程序，可简便地设计不易发生非特异性扩增的变异引物。
发明的效果
如果采用本发明，可提供不易发生非特异性扩增的变异引物和核酸扩增法。
附图说明
图1是表示通常的核酸的结构的图。
图2是表示引入了(A)的变异的引物的结构的图。
图3是表示作为(B)的变异引入了碳链的引物的结构的图。
图4是表示作为(B)的变异引入了PEG链的引物的结构的图。
图5是表示作为(C)的变异引入了由以通式1表示的四氢呋喃衍生物形成的间隔物链的引物的结构的图。
图6是表示作为(D)的变异引入了经光分解性修饰的间隔物链的引物的结构的图。
图7是引物二聚体的模式图。涂黑的箭头表示变异引入部位。左右方向的箭头表示进行核酸合成的方向。2个引物之间的纵向线表示氢键。
图8是引入了变异的引物的模式图。m表示变异。×标记表示不进行核酸合成。2个引物之间的纵向线表示氢键。
图9是环结构的模式图。涂黑的箭头表示变异引入部位。左向的箭头表示进行核酸合成的方向。纵向线表示氢键。
图10是引入了变异的引物的模式图。m表示变异。×标记表示不进行核酸合成。2个引物之间的纵向线表示氢键。
图11是引物二聚体的模式图。涂黑的箭头表示变异引入部位。左右方向的箭头表示进行核酸合成的方向。2个引物之间的纵向线表示氢键。
图12是引入了变异的引物的模式图。m表示变异。×标记和左右方向的箭头表示箭头方向的核酸合成在×标记的位置停止。2个引物之间的纵向线表示氢键。
图13是表示非特异性扩增产物作为新的非特异性扩增的引物发挥作用而非特异性扩增连锁的情况的模式图。涂黑的箭头表示变异引入部位。左右方向的箭头表示进行核酸合成的方向。2个引物之间的纵向线表示氢键。
图14是表示通过变异的引入而抑制由引物的形成导致的非特异性扩增的连锁的模式图。m表示变异。
图15是环结构的模式图。涂黑的箭头表示变异引入部位。左向的箭头表示进行核酸合成的方向。纵向线表示氢键。
图16是表示通过变异的引入而抑制由环结构的形成导致的非特异性扩增的连锁的模式图。m表示变异。
图17表示试验例1的扩增曲线。
图18表示放大了时间轴的试验例1的扩增曲线。
图19表示试验例2的扩增曲线。
图20表示放大了时间轴的试验例2的扩增曲线。
图21是表示通过2个F引物的引物二聚体发生非特异性扩增，形成作为非特异性扩增产物的P1的情况的图。
图22是表示作为非特异性扩增产物的P1作为引物，R引物作为模板发生非特异性扩增，形成作为非特异性扩增产物的P2的情况的图。
图23是说明通过引物组2抑制非特异性扩增反应的机理的图。表示通过引入了变异的2个F引物的引物二聚体发生非特异性扩增，形成作为非特异性扩增产物的P1'的情况。
图24是说明通过引物组2抑制非特异性扩增反应的机理的图。表示作为非特异性扩增产物的P1'作为引物，R引物作为模板发生非特异性扩增，形成作为非特异性扩增产物的P2'的情况。
图25是说明通过引物组3抑制非特异性扩增反应的机理的图。表示通过引入了变异的2个F引物的引物二聚体发生非特异性扩增，形成作为非特异性扩增产物的P1"的情况。
图26是说明通过引物组3抑制非特异性扩增反应的机理的图。表示作为非特异性扩增产物的P1"作为引物，R引物作为模板发生非特异性扩增，形成作为非特异性扩增产物的P2"的情况。
图27表示试验例3的扩增曲线。
图28表示放大了时间轴的试验例3的扩增曲线。
图29表示试验例4的扩增曲线。
图30表示放大了时间轴的试验例4的扩增曲线。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式加以详细说明。另外，本发明的技术范围并不仅限于以下的实施方式。
本发明中，核酸扩增法包括扩增核酸的所有方法，包括PCR法、由PCR法派生的逆转录PCR法、实时PCR法、DNA测序法、LAMP法、SmartAmp法、以及如日本专利再表2012/124681号公报中记载的核酸扩增法(TRIAmp扩增法)等等温扩增法。
本发明的设计方法特别好是适用于用于等温扩增法的引物的设计。
本发明中，引物是指核酸扩增反应中DNA聚合酶合成核酸时具有供给3'-OH的作用的短核酸片段，包括DNA和RNA。以下的说明中，无特别说明的情况下，引物是指DNA引物。
本发明是引入了变异的引物的设计方法。本发明中，“引入变异”是指将构成通常的核酸的核苷酸残基(腺嘌呤核苷酸残基、鸟嘌呤核苷酸残基、胸腺嘧啶核苷酸残基、胞嘧啶核苷酸残基、尿嘧啶核苷酸残基)置换为施以修饰的核苷酸残基、经改变的核苷酸残基、除核苷酸残基以外的化学结构、或与通常不同的结合情况的核苷酸残基等，“变异”是指上述的化学结构。
作为本发明中的变异，可利用以往用作间隔物的化学结构。
作为特别好的变异，可例举DNA聚合酶不会识别为核苷酸残基的化学结构。作为这样的变异，具体可例举以下的(A)～(D)的化学结构：
(A)与位于所述变异引入部位的前后的核苷酸残基的5'末端及3'末端分别结合5'末端及3'末端而成的核苷酸残基或聚核苷酸；
(B)由碳链或PEG链形成的间隔物链；
(C)由以通式1表示的四氢呋喃衍生物形成的间隔物链，
(D)经光分解性修饰的间隔物链。
通常，构成核酸的核苷酸残基在其3'末端与其他核苷酸残基的5'末端结合，而在其5'末端与其他核苷酸残基的3'末端结合(图1)。
引入了(A)的变异的引物由通常的核苷酸残基构成，但变异引入部位中的核苷酸残基或聚核苷酸的结合方式与通常反转，因此DNA聚合酶无法将其识别为核苷酸残基，无法继续核酸合成反应(图2)。此外，引入了该变异的引物与互补链杂交时，该变异与互补链侧的碱基不形成氢键。
(B)的变异的结构与核苷酸残基完全不同，因此DNA聚合酶无法将其识别为核苷酸残基，无法继续核酸合成反应(图3和4)。此外，引入了该变异的引物与互补链杂交时，该变异与互补链侧的碱基形成氢键。
引入的变异采用碳链的情况下，每1个置换的核苷酸残基对应的该碳链的碳链长度可优选设为3～9。
此外，将引入的变异采用PEG链的情况下，每1个置换的核苷酸残基对应的该PEG链的聚合度可优选设为1～3。
作为(B)的变异，可示例由3-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)丙基-1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)衍生的结构(通称Spacer C3)、由8-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-三乙二醇，1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(8-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-triethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)衍生的结构(通称Spacer 9)等。
(C)的变异不具有碱基，因此DNA聚合酶无法将其识别为核苷酸残基，无法继续核酸合成反应(图5)。此外，引入了该变异的引物与互补链杂交时，该变异与互补链侧的碱基不形成氢键。
作为(C)的变异，可示例由5'-O-二甲氧基三苯甲基-1',2'-二脱氧核糖-3'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(5'-O-Dimethoxytrityl-1',2'-Dideoxyribose-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)衍生的结构(通称dSpacer)、由5-O-二甲氧基三苯甲基-1-O-叔丁基二甲基硅烷基-2-脱氧核糖-3-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(5-O-Dimethoxytrityl-1-O-tert-butyldimethylsilyl-2-deoxyribose-3-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)衍生的结构(通称Abasic)等。
另外，Abasic的TBDMS保护基(叔丁基二甲基硅烷基)在引物合成时被脱保护。因此，引入Abasic后的引物的结构在图5中是R采用OH的结构。
另外，引入的变异采用由以通式1表示的四氢呋喃衍生物形成的间隔物链的情况下，每1个置换的核苷酸残基对应的n的值可优选设为1。
(D)的变异的结构与核苷酸残基完全不同，因此DNA聚合酶无法将其识别为核苷酸残基，无法继续核酸合成反应(图6)。此外，引入了该变异的引物与互补链杂交时，该变异与互补链侧的碱基不形成氢键。
另外，经光分解性修饰的间隔物链是指经具有通过暴露于UV或可见光而分解的性质的化合物修饰的间隔物链，本说明书中是指将具有硝基苯骨架作为特征之一的化合物群(参照日本专利特许第4870791号)。
作为(D)的变异，可示例由1-[2-硝基-5-(6-三氟乙酰基己酰氨基甲基)苯基]-乙基[2-氰基-乙基(N,N-二异丙基)]亚磷酰胺(1-[2-Nitro-5-(6trifluoroacetylcaproamidomethyl)phenyl]-ethyl-[2-cyano-ethyl(N,N-diisopropyl)]phosphoramidite)衍生的结构(通称5'-氨基修饰物)、由1-[2-硝基-5-(6-(N-(4,4'-二甲氧基三苯甲基))生物素酰氨基己酰氨基甲基)苯基]-乙基[2-氰基乙基(N,N-二异丙基)]亚磷酰胺(1-[2-Nitro-5-(6-(N-(4,4'dimethoxytrityl))biotinamidocaproamidomethyl)phenyl]-ethyl-[2cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)]phosphoramidite)衍生的结构(通称PC 5'-生物素)、由3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇-[2-氰基乙基(N,N-二异丙基)]亚磷酰胺(3-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1-(2nitrophenyl)-propane-1,3-diol-[2cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)]phosphoramidite)衍生的结构(通称PC连接物)、由[4-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)丁酰氨基甲基)-1-(2-硝基苯基)-乙基]-2-氰基乙基(N,N-二异丙基)亚磷酰胺([4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyramidomethyl)-1-(2-nitrophenyl)-ethyl]-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite)衍生的结构(PC Spacer)等。
引入1个引物的变异的数量可在不失去引物的特异性的范围内适当设定。引物的特异性可通过一般的引物设计工具算出。
以下，对本发明的设计方法的各工序进行说明。
本发明的引物的设计方法包括基础序列设计工序。基础序列设计工序是设计与模板DNA完全互补的碱基序列作为基础引物序列的工序，可与通常的核酸扩增法中的引物的设计同样地进行。即，从作为目标的碱基序列中选择从特异性、GC含量、Tm值等观点来看适合于引物的15～50碱基左右的碱基序列。特异性和GC含量、Tm值等的计算方法无限制，可以手工计算，也可使用一般所采用的计算工具等。
1个体系中设计的基础引物序列的数量根据作为目标的核酸扩增法的体系适当改变。即，作为目标的核酸扩增法为通常的PCR法的情况下，设计F引物和R引物这2种基础引物序列，作为目标的核酸扩增法为如Lamp法等需要3种以上的引物的体系的情况下，设计3种以上的基础引物序列。
基础序列设计工序中的基础引物序列的设计后，实施变异引入部位选择工序。变异引入部位选择工序是从基础引物序列中选择符合选自以下的(1)～(4)的1个或2个以上的条件的核苷酸残基作为变异引入部位的工序：
(1)可能会有助于引物二聚体的形成的核苷酸残基；
(2)可能会有助于1分子引物内的环结构的形成的核苷酸残基；
(3)预测由所述基础引物序列形成的引物形成引物二聚体的情况下，位于引物互补或非互补杂交的区域以外的区域的核苷酸残基；
(4)预测由所述基础引物序列形成的引物在1分子内形成环结构的情况下，位于构成环结构的区域以外的区域的核苷酸残基。
对由基础引物序列形成的引物是否形成引物二聚体或环结构、或者形成的情况下哪个核苷酸序列有贡献进行预测的手段无特别限定，可使用一般所采用的计算工具等。
首先，符合(1)的条件的核苷酸残基是例如图7所示的核苷酸残基(F引物的TAA、R引物的TTA)等可能会有助于引物二聚体的形成、即与互补链的碱基形成氢键的核苷酸残基。如果形成引物二聚体，则如图7所示引物本身成为模板，发生非特异性扩增。
通过选择符合(1)的条件的核苷酸残基作为变异引入部位(图7中涂黑箭头)引入变异，可抑制引物二聚体的形成，抑制非特异性扩增的发生(图8)。
图7和8中示出抑制F引物和R引物这些互不相同的引物之间的引物二聚体的形成的情况的概要，当然有助于同一引物之间的引物二聚体的形成的核苷酸残基也符合(1)的条件。
符合(2)的条件的核苷酸残基是例如图9所示的核苷酸残基(5'侧的TAA、3'侧的TTA)等可能会有助于环结构的形成的核苷酸残基。如果形成环结构，则如图9所示引物本身成为模板，发生非特异性扩增。
通过选择符合(2)的条件的核苷酸残基作为变异引入部位(图9中涂黑箭头)引入变异，可抑制环结构的形成，抑制非特异性扩增的发生(图10)。
符合(3)的条件的核苷酸残基是例如图11所示的核苷酸残基(F引物的C、R引物的G)等，能够预测由基础引物序列形成的引物形成引物二聚体的情况下，其为位于引物互补或非互补杂交的区域以外的区域的核苷酸残基。
如果形成引物二聚体，则如图11所示引物本身成为模板，发生非特异性扩增至DNA聚合酶可最大限度合成的链长。通过选择符合(3)的条件的核苷酸残基作为变异引入部位(图11中涂黑箭头)引入变异，可在变异引入部位阻碍DNA聚合酶的DNA合成反应，将非特异性扩增产物抑制为较短的链长(图12)。
选择符合(3)的条件的核苷酸残基作为变异引入部位时，对例如图13所示的非特异性扩增产物可作为新的非特异性扩增的引物发挥作用的情况特别有效。图13所示的作为由引物产生的非特异性扩增产物的P1和P2变性而形成单链后，再次相互杂交，引发新的非特异性扩增。该新的非特异性扩增的产物还可作为发生别的非特异性扩增的引物发挥作用，因此非特异性扩增的连锁不会停止。
该情况下，如果向符合(3)的条件的核苷酸残基引入变异，则如图14所示，非特异性扩增产物P1'及P2'不会作为新的非特异性扩增的引物发挥作用，可防止非特异性扩增的连锁。
图13和14中示出抑制F引物和R引物这些互不相同的引物之间的引物二聚体的形成的情况的概要，当然有助于同一引物之间的二聚体的形成的核苷酸残基也符合(3)的条件。
符合(4)的条件的核苷酸残基是例如图15所示的核苷酸残基(C)等，预测由基础引物序列形成的引物在1分子内形成环结构的情况下，位于构成环结构的区域以外的区域的核苷酸残基。在此，“构成环结构的区域”是指形成环状的序列区域以及引物互补或非互补杂交的区域。
如果形成环结构，则如图15所示引物本身成为模板，发生非特异性扩增至DNA聚合酶可最大限度合成的链长。通过选择符合(4)的条件的核苷酸残基作为变异引入部位(图15中涂黑箭头)引入变异，可在变异引入部位阻碍DNA聚合酶的DNA合成反应，将非特异性扩增产物抑制为较短的链长(图16)。
基于与参照图13及图14说明的情况同样的原理，选择符合(4)的条件的核苷酸残基作为变异引入部位对非特异性扩增产物可作为新的非特异性扩增的引物发挥作用的情况特别有效。通过向符合(4)的条件的核苷酸残基引入变异，可防止非特异性扩增的连锁。
对于通过本发明的设计方法设计的引物，可为了抑制非特异性扩增以外的目的而进行各种修饰。
实施例
＜试验例1＞
为了通过日本专利再表2012/124681号公报中记载的核酸扩增法(TRIAmp扩增法)扩增牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)BCG str.Tokyo 172(东京172)株的基因组DNA中的同向重复(Direct repeat)序列，制备该公报中作为DRa-21及DRb-19记载的引物组。将这些引物的序列作为引物1F及引物1R示于表1上段。另外，无特别指定的情况下，本试验例的引物的溶剂为1×TE缓冲液。
使用可在网络上使用或可通过下载来使用的一般的计算程序，从引物1F及1R的序列中选出可能会有助于发卡环、同源二聚体、异源二聚体的形成的核苷酸残基。
选择由此选出的核苷酸残基作为变异引入部位，设计表1所示的引物组2和3的引物并制备。
此外，制备由引物组2和3中相对变异引入部位接近3'末端侧的序列形成的引物(引物组4和5，表1)。
使用表1所示的F引物及R引物的引物组，制备表2所示的反应溶液，实施TRIAmp扩增法。TRIAmp扩增反应使用Thermal Cycler Dice Real Time System Lite TP710在68℃进行2小时，通过FAM检测模式追踪反应。由此算出的扩增曲线和Ct值分别示于图17、18和表3。另外，TRIAmp扩增反应对于各引物的组合制备2组反应溶液(以下将各样品分别称为样品1和样品2)，对于它们分别算出扩增曲线和Ct值。
[表1]
引物组 1：未修饰的引物
引物组 2，3 ：引入了变异的引物。右上带*的核苷酸残基表示与前后的核苷酸残基的3′末端及5′末端分别以3′末端及5′末端结合而成的核苷酸残基。
引物组 4 ：由引物组2的自变异引入部位起3′末端侧的序列形成的引物
引物组 5：由引物组3的自变异引入部位起3′末端侧的序列形成的引物
[表2]
成分 最终浓度
Tris-HCl(pH8.8) 20mM
KCl 10mM
MgSO<sub>4</sub> 7.2mM
F引物 2μM
R引物 2μM
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 30mM
BSA 3.2μg/μL
dNTPmix 1.4mM
Bst Polymerase 3.0 0.32U/μL
荧光试剂※1 0.04μL/μL
模板DNA※2 0.2pg/μL
水 至25μL
※1 1mL HNB(2-羟基-1-(2-羟基-4-磺基-1-萘基偶氮)-3，6-萘二磺酸三钠盐)3mM溶液中添加3.5μL GelGreenTM(10,000×浓度DMSO溶液，Biotium公司)制备。
※2模板DNA：牛分枝杆菌BCG str.Tokyo 172株基因组DNA
[表3]
如图17、18和表3所示，使用引物长度极短的引物组5以外的引物的情况下，虽然最终的亮度可能稍有差异，但其扩增速度均为同等程度。
这些结果显示，通过本发明的方法引入了变异的引物的功能与同一引物的自变异引入部位5'末端侧单纯缺损而得的引物不同。
＜试验例2＞
使用表1所示的F引物及R引物的引物组，制备表2所示的组成中将模板DNA换成水的反应溶液，以与试验例1同样的条件进行TRIAmp扩增反应并算出扩增曲线和Ct值。结果示于表4及图19、20。
另外，TRIAmp扩散反应对于各引物的组合制备4组反应溶液(以下将各样品分别称为非特异性样品1～4)，对于它们分别算出扩增曲线和Ct值。
[表4]
如图19、20及表4所示，可知关于不含模板DNA的体系中的核酸扩增、即非特异性扩增速度，与使用未引入变异的引物组1的情况相比，使用引入了变异的引物组2、3的情况显著更慢。特别是使用引物组3的情况下，4个样品中3个样品未发生核酸的非特异性扩增。
该结果显示，通过向引物引入变异，非特异性扩增被有力地抑制。
引物组4具有引物组2中相对变异引入部位接近3'末端侧的序列。如表4所示，使用引物组4进行TRIAmp扩增反应的情况下，非特异性扩增速度比使用引物组1的情况慢。但是，与引物组4相比，使用引物组2时更强地表现出非特异性扩增速度的抑制效果(表4)。
此外，引物组5具有引物组3中相对变异引入部位接近3'末端侧的序列，但使用引物5的情况下，即使反应溶液中包含模板DNA，也不会发生核酸扩增反应。
这些结果显示，通过本发明的方法引入了变异的引物的功能与同一引物的自变异引入部位5'末端侧单纯缺损而得的引物不同。
使用引物组1进行TRIAmp扩增反应时发生非特异性扩增的原因被预测为由图21及22所示的机理导致。即，F引物与其他F引物形成引物二聚体(图21上段)，藉由DNA合成反应的推进而产生作为非特异性扩增产物的P1(图21下段)。接着，变性而形成单链的P1与R引物形成引物二聚体(图22上段)，藉由DNA合成反应的推进而产生作为非特异性扩增产物的P2(图22下段)。然后，P1和P2中存在与P2的3'末端的三核苷酸(GGG)互补的序列(CCC)，因此不断发生非特异性扩增。
另一方面，使用引物组2的情况下，F引物与其他F引物形成引物二聚体(图23上段)，即使DNA合成反应推进，其延伸在成为模板的F引物的自5'末端起第3个核苷酸残基(G)停止(图23下段)。因此，由该非特异性扩增产生的P1'难以在其3'末端与R引物形成二聚体，不会发生非特异性扩增的连锁。假如P1'与R引物形成二聚体(图24上段)，即使发生DNA合成反应，其延伸在成为模板的R引物的自5'末端起第3个核苷酸残基(C)停止(图24下段)，因此由该非特异性扩增产生的P2'发生进一步的非特异性扩增的连锁的可能性低。
此外，引物组3的F引物中，有助于2个F引物形成引物二聚体的核苷酸残基引入有变异，因此不易形成引物，非常不容易发生DNA合成反应(图25上段)。假如发生DNA合成反应而生成作为扩增产物的P1"(图25下段)，即使其与R引物形成引物二聚体而发生DNA合成反应(图26上段)，该反应在R引物的变异引入部位停止(图26下段)，因此作为其扩增产物的P2"发生进一步的非特异性扩增的连锁的可能性低。
根据以上的理由，认为由引入了变异的引物形成的引物组2和3具有非特异性扩增反应速度的抑制效果。
＜试验例3＞
制备表5所示的序列中在m表示的位置引入有由Spacer C3、dSpacer、Spacer 9、Abasic或PC Spacer衍生的结构的F引物和R引物的引物组。
[表5]
使用表5所示的F引物及R引物的引物组以及表1所示的F引物及R引物的引物组1～3，在表2所示的组成下以与试验例1同样的条件进行TRIAmp扩增反应并算出扩增曲线和Ct值。结果示于表6及图27、28。
另外，引物组3Abasic的溶剂为将0.2M三乙胺-乙酸溶液用灭菌水稀释10μM而得的溶剂。
[表6]
如表6及图27、28所示，虽然扩增速度比引物组1～3稍慢，但使用引入了SpacerC3、dSpacer、Spacer 9、Abasic或PC Spacer中的任一种变异的引物组的情况下，均可顺利地进行DNA的扩增。
＜试验例4＞
此外，使用表5所示的F引物及R引物的引物组以及表1所示的F引物及R引物的引物组1～3，制备表2所示的组成中将模板DNA换成水的反应溶液，以与试验例1同样的条件进行TRIAmp扩增反应并算出扩增曲线和Ct值。结果示于表7及图29、30。
另外，TRIAmp扩散反应对于各引物的组合制备4组反应溶液(以下将各样品分别称为非特异性样品1～4)，对于它们分别算出扩增曲线和Ct值。
[表7]
如图27～30及表6、7所示，可知即使在使用引入了由碳链或PEG链形成的间隔物链、由以通式1表示的四氢呋喃衍生物形成的间隔物链、经光分解性修饰的间隔物链的变异的情况下，与未引入变异的引物组1相比，不含模板DNA的体系中的核酸扩增、即非特异性扩增速度也显著更慢。
该结果显示，通过用本发明的方法向引物引入变异，非特异性扩增被有力地抑制。
工业上利用的可能性
本发明可应用于核酸扩增法中的非特异性扩增的减少方法。
序列表
&lt;110&gt; 大研医器株式会社
&lt;120&gt; 变异引物的设计方法
&lt;130&gt; P00661
&lt;160&gt; 4
&lt;170&gt; PatentIn 3.5版本
&lt;210&gt; 1
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 牛分枝杆菌
&lt;400&gt; 1
cggggttttg ggtctgacga c 21
&lt;210&gt; 2
&lt;211&gt; 19
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 牛分枝杆菌
&lt;400&gt; 2
cccgagaggg gacggaaac 19
&lt;210&gt; 3
&lt;211&gt; 19
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 牛分枝杆菌
&lt;400&gt; 3
gggttttggg tctgacgac 19
&lt;210&gt; 4
&lt;211&gt; 17
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 牛分枝杆菌
&lt;400&gt; 4
cgagagggga cggaaac 17

Claims (7)

1.一种设计方法，它是用于核酸扩增法的引入了变异的引物的设计方法，其中，具备
设计与模板DNA完全互补的碱基序列作为基础引物序列的基础序列设计工序，以及
选择该基础引物序列所含的、符合选自以下的(1)～(4)的1个或2个以上的条件的1个或2个以上的核苷酸残基作为变异引入部位的变异引入部位选择工序：
(1)可能会有助于引物二聚体的形成的核苷酸残基；
(2)可能会有助于1分子引物内的环结构的形成的核苷酸残基；
(3)预测由所述基础引物序列形成的引物形成引物二聚体的情况下，位于引物互补或非互补杂交的区域以外的区域的核苷酸残基；
(4)预测由所述基础引物序列形成的引物在1分子内形成环结构的情况下，位于构成环结构的区域以外的区域的核苷酸残基。
2.如权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述变异是DNA聚合酶不会识别为核苷酸残基的变异。
3.如权利要求1或2所述的设计方法，其特征在于，所述变异为选自以下的(A)～(D)的1种或2种以上：
(A)与位于所述变异引入部位的前后的核苷酸残基的5'末端及3'末端分别结合5'末端及3'末端而成的核苷酸残基或聚核苷酸；
(B)由碳链或PEG链形成的间隔物链；
(C)由以通式1表示的四氢呋喃衍生物形成的间隔物链，
通式1
[化1]
通式1中，R表示H或羟基，n表示自然数；
(D)经光分解性修饰的间隔物链。
4.一种引物，其中，该引物通过权利要求1～3中的任一项所述的设计方法设计。
5.一种核酸扩增法，其特征在于，使用权利要求4所述的引物。
6.如权利要求5所述的核酸扩增法，其特征在于，该方法是等温扩增法。
7.一种程序，其中，该程序用于将权利要求1～3中的任一项所述的设计方法的各工序作为步骤由计算机实施。
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