KR20180129806A - 변이 프라이머의 설계 방법 - Google Patents
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Abstract
프라이머 다이머 또는 루프 구조에 기인하는 비특이적 증폭이 생기기 어려운 변이 프라이머의 새로운 설계 방법을 제공한다. 기초 프라이머 서열에 포함되는 1 또는 2 이상의 뉴클레오티드 잔기이며, 다음 (1) ~ (4)로 이루어진 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 조건에 부합하는 뉴클레오티드 잔기를 변이 도입 부위로 선택하는 변이 도입 부위 선택 공정을 구비하는, 변이가 도입 된 프라이머의 설계 방법.
(1) 프라이머 다이머의 형성에 기여할 수 있는 뉴클레오티드 잔기.
(2) 프라이머 1 분자 내에서의 루프 구조의 형성에 기여할 수 있는 뉴클레오티드 잔기.
(3) 상기 기초 프라이머 서열로 이루어진 프라이머가 프라이머 다이머를 형성 할 것으로 예상되는 경우에는 프라이머가 상보적 또는 비상보적으로 하이브리다이즈하는 영역 이외의 영역에 위치하는 뉴클레오티드 잔기.
(4) 상기 기초 프라이머 서열로 이루어진 프라이머가 1 분자 내에서 루프 구조를 형성할 것으로 예상되는 경우, 루프 구조를 구성하는 영역 이외의 영역에 위치하는 뉴클레오티드 잔기.
(1) 프라이머 다이머의 형성에 기여할 수 있는 뉴클레오티드 잔기.
(2) 프라이머 1 분자 내에서의 루프 구조의 형성에 기여할 수 있는 뉴클레오티드 잔기.
(3) 상기 기초 프라이머 서열로 이루어진 프라이머가 프라이머 다이머를 형성 할 것으로 예상되는 경우에는 프라이머가 상보적 또는 비상보적으로 하이브리다이즈하는 영역 이외의 영역에 위치하는 뉴클레오티드 잔기.
(4) 상기 기초 프라이머 서열로 이루어진 프라이머가 1 분자 내에서 루프 구조를 형성할 것으로 예상되는 경우, 루프 구조를 구성하는 영역 이외의 영역에 위치하는 뉴클레오티드 잔기.
Description
본 발명은 변이가 도입된 프라이머의 설계 방법에 관한 것이다.
현재 핵산 증폭법은 기초 연구 분야뿐만 아니라 역학적 검사, 의학적 진단, 법의학 및 유전자 분석을 포함하는 다양한 분야에서 필요불가결한 기술이 되고 있다. 핵산 증폭법은 표적 핵산 서열을 특이적으로 증폭할 수 있기 때문에, 표적 핵산의 존재를 검출하기 위한 높은 감도의 기술로 매우 유용하다.
핵산 증폭법을 수행할 때의 문제의 하나로서 비특이적 증폭 산물의 생성을 들 수 있다. 그리고 프라이머 다이머 형성이나 프라이머 1 분자 내에서의 루프 구조의 형성이 비특이적 증폭이 발생하는 요인이 되는 것으로 알려져 있다. 프라이머 다이머 또는 루프 구조의 형성으로 인한 비특이적 증폭은, 예를 들어, 프라이머의 3' 말단 영역이 그 자체 또는 다른 프라이머와 어느 정도의 상보성을 갖는 경우에 발생할 수 있다.
정량적 PCR 및 등온 증폭법처럼 표적 서열의 유무를 판별하기 위한 핵산 증폭계에 있어서, 이러한 비특이적 증폭이 발생하면 S / N 비의 저하, 위양성의 발생 등의 문제가 생기고, 표적 서열의 검출이 불가능하게 되는 경우가 있다.
이러한 상황 하에서, 비특이적 증폭 반응의 원인 중 하나인 프라이머 다이머의 발생을 억제하는 방법이 제안되어 있다.
특허문헌 1에는 표지된 프라이머를 이용한 FRET의 원리를 응용하는 것으로, 프라이머 다이머에 기인하는 신호가 감지되지 않도록 하고, S / N 비를 향상시키는 방법이 개시되어 있다.
또한, 특허문헌 2에는 2'- 플루오로 - 뉴클레오티드류, 2'- 아미노 뉴클레오티드류 및 아라비노스 뉴클레오티드류로 이루어진 군에서 선택되는 변형된 뉴클레오티드를 3' 말단측의 배열 내에 포함한 프라이머가 개시되어 있다.
유사한 기술로 특허문헌 3에는 변경된 피리미딘 핵산 염기를 3' 말단의 배열 내에 포함한 프라이머가 개시되어있다.
특허 문헌 2 및 3에는 이러한 프라이머를 이용하면 프라이머 다이머의 형성을 억제할 수 있음이 기재되어 있다.
특허문헌 1에 기재된 방법은 증폭 산물로부터 나오는 형광을 읽어서 표적 핵산의 존재 유무 또는 존재량을 검출하는 정량 PCR에서는 유효한 수단이지만, 인터칼레이터(Intercalater)에 의해 증폭핵산을 검출하는 계에는 적용할 수 없다. 또한, 프라이머 다이머 자체의 발생은 억제할 수 없기 때문에 프라이머 다이머에 기인하는 비특이적 증폭 산물의 생성에 의한 프라이머의 고갈을 막을 수 없다.
특허 문헌 2 및 3에 기재된 방법은 비특이적 증폭의 원인인 프라이머 다이머의 발생 자체를 억제하는 것이다. 그러나 이러한 문헌에는 수정 또는 변경 뉴클레오티드를 도입하는 위치에 대해 "3 개의 3' 말단 뉴클레오티드 위치내" 또는 "3' 말단으로부터 4 뉴클레오티드 이내" 등의 추상적인 설명 밖에없고, 보다 효과적으로 비특이적 증폭을 억제할 수 있는 변형 프라이머의 설계방법에 대한 개시는 없다.
이러한 상황하에서, 본 발명의 해결하고자 하는 과제는 프라이머 다이머 또는 루프 구조에 기인하는 비특이적 증폭이 생기기 어려운 변이 프라이머의 새로운 설계 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하는 본 발명은 핵산 증폭법에 이용하는, 변이가 도입된 프라이머의 설계 방법에 있어서, 주형 DNA에 완전하게 상보적인 염기 서열을 기초 프라이머 배열로 설계하는 기초 서열 설계 공정과, 해당 기초 프라이머 배열에 포함되는 1 또는 2 이상의 뉴클레오티드 잔기로서, 이하의 (1) ~ (4)로 이루어진 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 조건에 부합하는 뉴클레오티드 잔기를 변이 도입 부위로 선택하는 변이 도입 부위 선택 공정을 구비하는 설계 방법이다.
(1) 프라이머 다이머의 형성에 기여할 수 있는 뉴클레오티드 잔기.
(2) 프라이머 1 분자 내에서의 루프 구조의 형성에 기여할 수 있는 뉴클레오티드 잔기.
(3) 상기 기초 프라이머 서열로 이루어진 프라이머가 프라이머 다이머를 형성할 것으로 예상되는 경우, 프라이머가 상보적 또는 비상보적으로 하이브리다이즈하는(hybridize) 영역 이외의 영역에 위치하는 뉴클레오티드 잔기.
(4) 상기 기초 프라이머 서열로 이루어진 프라이머가 1 분자 내에서 루프 구조를 형성할 것으로 예상되는 경우, 루프 구조를 구성하는 영역 이외의 영역에 위치하는 뉴클레오티드 잔기.
본 발명의 설계 방법에 의하면, 프라이머 다이머 또는 루프 구조에 기인하는 비특이적 증폭이 생기기 어려운 변이 프라이머를 쉽게 설계할 수 있다.
본 발명에서는 변이 프라이머에 도입된 변이를 DNA 중합 효소가 뉴클레오티드 잔기로 인식하지 않는 것으로 하는 것이 바람직하다.
이러한 형태로 함으로써 보다 비특이적 증폭이 생기기 어려운 프라이머를 설계할 수 있다.
본 발명의 바람직한 형태는 변이가 이하의 (A) ~ (D)로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상이다.
(A) 상기 변이 도입 부위의 전후에 위치하는 뉴클레오티드 잔기의 5' 말단과 3' 말단과, 각각의 5' 말단과 3' 말단을 결합하여 이루어진 뉴클레오티드 잔기 또는 폴리뉴클레오티드.
(B) 탄소 사슬 또는 PEG 사슬로 이루어진 스페이서 사슬.
(C) 화학식 1로 표시되는 테트라 하이드로퓨란 유도체로 이루어진 스페이서 사슬.
(화학식 1 중, R은 H 또는 수산기, n은 자연수를 나타낸다)
(D) 광분해변형된 스페이서 사슬.
변이 프라이머에 도입하는 변이 (A) ~ (D)로 함으로써, 더욱 비특이적 증폭을 생기기 어렵게하는 프라이머를 설계할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 설계 방법에 의해 설계된 프라이머 및 해당 프라이머를 이용하는 핵산 증폭 방법에 관한 것이다.
본 발명의 프라이머 및 핵산 증폭 방법에 의하면, 핵산 증폭의 비특이적 증폭을 줄일 수 있다.
본 발명의 핵산 증폭 보충법은 등온 증폭법에 적용하는 것이 특히 바람직하다.
등온 증폭법은 PCR 법과 달리 두 가닥 DNA의 변성 공정을 포함하지 않고 비특이적 증폭이 발생하기 쉽기 때문에, 본 발명의 핵산 증폭법을 적용하는 것이 특히 바람직하다.
또한, 본 발명은 전술한 설계 방법의 각 공정을 순서대로 컴퓨터에 실행시키기 위한 프로그램에 관한 것이다.
본 발명의 프로그램에 의하면, 비특이적 증폭이 생기기 어려운 변이 프라이머를 간편하게 설계할 수 있다.
본 발명에 의하면, 비특이적 증폭이 생기기 어려운 변이 프라이머 및 핵산 증폭 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 통상 핵산의 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 (A)의 변이가 도입된 프라이머의 구조를 나타내는 도면이다.
도 3은 (B)의 변이로 탄소 사슬이 도입된 프라이머의 구조를 나타내는 도면이다.
도 4는 (B)의 변이로 PEG 사슬이 도입된 프라이머의 구조를 나타내는 도면이다.
도 5는 (C)의 변이로 화학식 1로 표시되는 테트라 하이드로 퓨란 유도체로 이루어진 스페이서 사슬이 도입된 프라이머의 구조를 나타내는 도면이다.
도 6은 (D)의 변이로 광분해성수식의 스페이서 사슬이 도입된 프라이머의 구조를 나타내는 도면이다.
도 7은 프라이머 다이머의 모식도이다. 검은 화살표는 변이 도입 부위를 나타낸다. 좌우 방향의 화살표는 핵산 합성이 이루어지는 방향을 나타낸다. 두 프라이머 사이의 세로선은 수소 결합을 나타낸다.
도 8은 변이가 도입된 프라이머의 모식도이다. m은 변이를 나타낸다. Х 표시는 핵산 합성이 되지 않는 것을 나타낸다. 두 프라이머 사이의 세로선은 수소 결합을 나타낸다.
도 9는 루프 구조의 모식도이다. 검은 화살표는 변이 도입 부위를 나타낸다. 왼쪽 화살표는 핵산 합성이 이루어지는 방향을 나타낸다. 세로선은 수소 결합을 나타낸다.
도 10은 변이가 도입된 프라이머의 모식도이다. m은 변이를 나타낸다. Х 표시는 핵산 합성이 되지 않는 것을 나타낸다. 두 프라이머 사이의 세로선은 수소 결합을 나타낸다.
도 11은 프라이머 다이머의 모식도이다. 검은 화살표는 변이 도입 부위를 나타낸다. 좌우 방향의 화살표는 핵산 합성이 이루어지는 방향을 나타낸다. 두 프라이머 사이의 세로선은 수소 결합을 나타낸다.
도 12는 변이가 도입된 프라이머의 모식도이다. m은 변이를 나타낸다. Х 표와 좌우 방향의 화살표는 Х 표 위치에서 화살표 방향의 핵산 합성이 정지하는 것을 나타낸다. 두 프라이머 사이의 세로선은 수소 결합을 나타낸다.
도 13은 비특이적 증폭 산물이 새로운 비특이적 증폭 프라이머 역할을 비특이적 증폭이 연쇄하는 모습을 나타내는 모식도이다. 검은 화살표는 변이 도입 부위를 나타낸다. 좌우 방향의 화살표는 핵산 합성이 이루어지는 방향을 나타낸다. 두 프라이머 사이의 세로선은 수소 결합을 나타낸다.
도 14는 변이의 도입에 의해 프라이머의 형성으로 인한 비특이적 증폭의 연쇄가 억제되는 것을 나타내는 모식도이다. m은 변이를 나타낸다.
도 15는 루프 구조의 모식도이다. 검은 화살표는 변이 도입 부위를 나타낸다. 왼쪽 화살표는 핵산 합성이 이루어지는 방향을 나타낸다. 수직선은 수소 결합을 나타낸다.
도 16는 변이의 도입에 의한 루프 구조의 형성으로 인한 비특이적 증폭의 연쇄가 억제되는 것을 나타내는 모식도이다. m은 변이를 나타낸다.
도 17은 시험예 1의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 18은 시간축을 확대한 시험예 1의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 19는 시험예 2의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 20은 시간축을 확대한 시험예 2의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 21은 2 개의 F 프라이머의 프라이머 다이머에 의해 비특이적 증폭이 발생하고, 비특이적 증폭 산물인 P1이 형성되는 모습을 나타내는 도면이다.
도 22는 비특이적 증폭 산물인 P1은 프라이머, R 프라이머가 주형으로 비특이적 증폭이 발생하고, 비특이적 증폭 산물인 P2가 형성되는 모습을 나타내는 도면이다.
도 23은 프라이머 세트 2에 의해 비특이적 증폭 반응이 억제되는 메커니즘을 설명하는 도면이다. 변이가 도입된 2 개의 F 프라이머의 프라이머 다이머에 의해 비특이적 증폭이 발생하고, 비특이적 증폭 산물인 P1'가 형성되는 모습을 나타낸다.
도 24는 프라이머 세트 2에 의해 비특이적 증폭 반응이 억제되는 메커니즘을 설명하는 도면이다. 비특이적 증폭 산물인 P1'이 프라이머, R 프라이머가 주형으로 비특이적 증폭이 발생하고 비특이적 증폭 산물인 P2'가 형성되는 모습을 나타낸다.
도 25는 프라이머 세트 3에 의해 비특이적 증폭 반응이 억제되는 메커니즘을 설명하는 도면이다. 변이가 도입된 2 개의 F 프라이머의 프라이머 다이머에 의해 비특이적 증폭이 발생하고 비특이적 증폭 산물인 P1''가 형성되는 모습을 나타낸다.
도 26은 프라이머 세트 3에 의해 비특이적 증폭 반응이 억제되는 메커니즘을 설명하는 도면이다. 비특이적 증폭 산물인 P1''이 프라이머, R 프라이머가 주형으로 비특이적 증폭이 발생하고 비특이적 증폭 산물인 P2''가 형성되는 모습을 나타낸다.
도 27은 시험예 3의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 28은 시간축을 확대한 시험예 3의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 29는 시험예 4의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 30은 시간축을 확대한 시험예 4의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 2는 (A)의 변이가 도입된 프라이머의 구조를 나타내는 도면이다.
도 3은 (B)의 변이로 탄소 사슬이 도입된 프라이머의 구조를 나타내는 도면이다.
도 4는 (B)의 변이로 PEG 사슬이 도입된 프라이머의 구조를 나타내는 도면이다.
도 5는 (C)의 변이로 화학식 1로 표시되는 테트라 하이드로 퓨란 유도체로 이루어진 스페이서 사슬이 도입된 프라이머의 구조를 나타내는 도면이다.
도 6은 (D)의 변이로 광분해성수식의 스페이서 사슬이 도입된 프라이머의 구조를 나타내는 도면이다.
도 7은 프라이머 다이머의 모식도이다. 검은 화살표는 변이 도입 부위를 나타낸다. 좌우 방향의 화살표는 핵산 합성이 이루어지는 방향을 나타낸다. 두 프라이머 사이의 세로선은 수소 결합을 나타낸다.
도 8은 변이가 도입된 프라이머의 모식도이다. m은 변이를 나타낸다. Х 표시는 핵산 합성이 되지 않는 것을 나타낸다. 두 프라이머 사이의 세로선은 수소 결합을 나타낸다.
도 9는 루프 구조의 모식도이다. 검은 화살표는 변이 도입 부위를 나타낸다. 왼쪽 화살표는 핵산 합성이 이루어지는 방향을 나타낸다. 세로선은 수소 결합을 나타낸다.
도 10은 변이가 도입된 프라이머의 모식도이다. m은 변이를 나타낸다. Х 표시는 핵산 합성이 되지 않는 것을 나타낸다. 두 프라이머 사이의 세로선은 수소 결합을 나타낸다.
도 11은 프라이머 다이머의 모식도이다. 검은 화살표는 변이 도입 부위를 나타낸다. 좌우 방향의 화살표는 핵산 합성이 이루어지는 방향을 나타낸다. 두 프라이머 사이의 세로선은 수소 결합을 나타낸다.
도 12는 변이가 도입된 프라이머의 모식도이다. m은 변이를 나타낸다. Х 표와 좌우 방향의 화살표는 Х 표 위치에서 화살표 방향의 핵산 합성이 정지하는 것을 나타낸다. 두 프라이머 사이의 세로선은 수소 결합을 나타낸다.
도 13은 비특이적 증폭 산물이 새로운 비특이적 증폭 프라이머 역할을 비특이적 증폭이 연쇄하는 모습을 나타내는 모식도이다. 검은 화살표는 변이 도입 부위를 나타낸다. 좌우 방향의 화살표는 핵산 합성이 이루어지는 방향을 나타낸다. 두 프라이머 사이의 세로선은 수소 결합을 나타낸다.
도 14는 변이의 도입에 의해 프라이머의 형성으로 인한 비특이적 증폭의 연쇄가 억제되는 것을 나타내는 모식도이다. m은 변이를 나타낸다.
도 15는 루프 구조의 모식도이다. 검은 화살표는 변이 도입 부위를 나타낸다. 왼쪽 화살표는 핵산 합성이 이루어지는 방향을 나타낸다. 수직선은 수소 결합을 나타낸다.
도 16는 변이의 도입에 의한 루프 구조의 형성으로 인한 비특이적 증폭의 연쇄가 억제되는 것을 나타내는 모식도이다. m은 변이를 나타낸다.
도 17은 시험예 1의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 18은 시간축을 확대한 시험예 1의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 19는 시험예 2의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 20은 시간축을 확대한 시험예 2의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 21은 2 개의 F 프라이머의 프라이머 다이머에 의해 비특이적 증폭이 발생하고, 비특이적 증폭 산물인 P1이 형성되는 모습을 나타내는 도면이다.
도 22는 비특이적 증폭 산물인 P1은 프라이머, R 프라이머가 주형으로 비특이적 증폭이 발생하고, 비특이적 증폭 산물인 P2가 형성되는 모습을 나타내는 도면이다.
도 23은 프라이머 세트 2에 의해 비특이적 증폭 반응이 억제되는 메커니즘을 설명하는 도면이다. 변이가 도입된 2 개의 F 프라이머의 프라이머 다이머에 의해 비특이적 증폭이 발생하고, 비특이적 증폭 산물인 P1'가 형성되는 모습을 나타낸다.
도 24는 프라이머 세트 2에 의해 비특이적 증폭 반응이 억제되는 메커니즘을 설명하는 도면이다. 비특이적 증폭 산물인 P1'이 프라이머, R 프라이머가 주형으로 비특이적 증폭이 발생하고 비특이적 증폭 산물인 P2'가 형성되는 모습을 나타낸다.
도 25는 프라이머 세트 3에 의해 비특이적 증폭 반응이 억제되는 메커니즘을 설명하는 도면이다. 변이가 도입된 2 개의 F 프라이머의 프라이머 다이머에 의해 비특이적 증폭이 발생하고 비특이적 증폭 산물인 P1''가 형성되는 모습을 나타낸다.
도 26은 프라이머 세트 3에 의해 비특이적 증폭 반응이 억제되는 메커니즘을 설명하는 도면이다. 비특이적 증폭 산물인 P1''이 프라이머, R 프라이머가 주형으로 비특이적 증폭이 발생하고 비특이적 증폭 산물인 P2''가 형성되는 모습을 나타낸다.
도 27은 시험예 3의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 28은 시간축을 확대한 시험예 3의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 29는 시험예 4의 증폭 곡선을 나타낸다.
도 30은 시간축을 확대한 시험예 4의 증폭 곡선을 나타낸다.
이하, 본 발명의 실시예에 대해 자세히 설명을 추가한다. 또한, 본 발명의 기술적 범위는 다음의 실시의 형태에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 핵산 증폭법은 핵산을 증폭하는 모든 방법을 포함하고, PCR 법; PCR 법에서 파생된 역전사 PCR 법, 실시간 PCR 법, DNA 시퀀싱법; LAMP 법, SmartAmp 법, 또한 재공표 2012 / 124681 호 공보에 기재된 핵산 증폭법(TRIAmp 증폭법)과 같은 등온 증폭법을 포함한다.
본 발명의 설계 방법은 특히 등온 증폭법에 이용하기 위한 프라이머의 설계를 위해 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 프라이머는 핵산 증폭 반응에서 DNA 중합 효소가 핵산을 합성할 때 3'OH을 공급하는 역할을 하는 짧은 핵산 단편을 말하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 다음의 설명에서 특별히 언급이 없는 경우에는 프라이머는 DNA 프라이머를 가리킨다.
본 발명은 변이가 도입된 프라이머의 설계 방법이다. 본 발명에서 "변이를 도입한다"는 일반적인 핵산을 구성하는 뉴클레오티드 잔기 (아데닌 뉴클레오티드 잔기, 구아닌 뉴클레오티드 잔기, 티민 뉴클레오티드 잔기, 시토신 뉴클레오티드 잔기, 우라실 뉴클레오티드 잔기)를, 변경이 가해진 뉴클레오티드 잔기, 개변된 뉴클레오티드 잔기, 뉴클레오티드 잔기 이외의 화학 구조, 또는 통상적인 것과는 상이한 결합 형태의 뉴클레오티드 잔기 등으로 치환하는 것을 말하며, "변이"는 위의 화학 구조의 것을 말한다.
본 발명의 변이로는 기존 스페이서로 사용되는 화학 구조를 이용할 수 있다.
특히 바람직한 변이로는 DNA 중합 효소가 뉴클레오티드 잔기로 인식하지 않는 화학 구조를 들 수 있다. 이러한 변이로 구체적으로는 다음의 (A) ~ (D)의 화학 구조를 들 수 있다.
(A) 상기 변이 도입 부위의 전후에 위치하는 뉴클레오티드 잔기의 5' 말단 및 3' 말단과, 각각의 5' 말단 및 3' 말단을 결합하여 이루어진 뉴클레오티드 잔기 또는 폴리 뉴클레오티드.
(B) 탄소 사슬 또는 PEG 사슬로 이루어진 스페이서 사슬.
(C) 화학식 1로 표시되는 테트라 하이드로 퓨란 유도체로 이루어진 스페이서 사슬.
(D) 광분해성수식의 스페이서 사슬.
일반적으로 핵산을 구성하는 뉴클레오티드 잔기는 3' 말단에서 다른 뉴클레오티드 잔기의 5' 말단과 결합하고, 다른 한편, 그 5' 말단에서 다른 뉴클레오티드 잔기의 3' 말단과 결합하고 있다 (도 1).
(A)의 변이가 도입된 프라이머는 통상의 뉴클레오티드 잔기로 구성되어 있지만, 변이 도입 부위의 뉴클레오티드 잔기 또는 폴리 뉴클레오티드의 결합 방식이 통상의 경우와는 역전되어 있기 때문에 DNA 중합 효소가 이를 뉴클레오티드 잔기로 인식하지 못하고, 핵산 합성 반응을 계속할 수 없다 (도 2). 또한 당해 변이가 도입된 프라이머가 상보 사슬과 하이브리다이제이션하는 경우, 해당 변이는 상보 사슬 측의 염기와 수소 결합을 형성하지 않는다.
(B)의 변이는 뉴클레오티드 잔기와는 전혀 구조가 다르기 때문에 DNA 중합 효소가 이것을 뉴클레오티드 잔기로 인식하지 못하고, 핵산 합성 반응을 계속할 수 없다 (도 3 및 4). 또한 당해 변이가 도입된 프라이머가 상보 사슬과 하이브리다이제이션하는 경우, 해당 변이는 상보 사슬 측의 염기와 수소 결합을 형성하지 않는다.
도입하는 변이를 탄소 사슬로 하는 경우에는 대체하는 뉴클레오티드 잔기 1 개당 해당 탄소 사슬의 탄소 사슬 길이는 바람직하게는 3 ~ 9로 할 수 있다.
또한 도입하는 변이를 PEG 사슬로 하는 경우에는 대체하는 뉴클레오티드 잔기 1 개당 해당 PEG 사슬의 중합도는 바람직하게는 1 ~ 3으로 할 수 있다.
(B)의 변이로는 3- (4,4'-Dimethoxytrityloxy) propyl-1 - [(2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl) - phosphoramidite로부터 유도되는 구조 (통칭 Spacer C3), 8-O- (4,4'-Dimethoxytrityl) -triethyleneglycol, 1 - [(2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl) - phosphoramidite로부터 유도되는 구조 (통칭 Spacer 9) 등이 예시될 수 있다.
(C)의 변이는 염기를 가지지 않기 때문에, DNA 중합 효소가 이것을 뉴클레오티드 잔기로 인식하지 못하고, 핵산 합성 반응을 계속할 수 없다 (도 5). 또한 당해 변이가 도입된 프라이머가 상보 사슬과 하이브리다이제이션하는 경우, 해당 변이는 상보 사슬 측의 염기와 수소 결합을 형성하지 않는다.
(C)의 변이로는 5'-O-Dimethoxytrityl-1 ', 2'-Dideoxyribose-3'- [(2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl) - phosphoramidite로부터 유도되는 구조 (통칭 dSpacer), 5-O-Dimethoxytrityl-1-O-tert-butyldimethylsilyl-2-deoxyribose-3 - [(2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl)] - phosphoramidite (통칭 Abasic)로부터 유도되는 구조 등이 예시될 수 있다.
또한 Abasic의 TBDMS 보호기 (tert-butyldimethylsily 기)은 프라이머 합성시 탈보호된다. 따라서 Abasic를 도입한 후 프라이머의 구조는 도 5에서 R을 OH로 한 구조이다.
또한 도입하는 변이를 화학식 1로 표시되는 테트라 하이드로 퓨란 유도체로 이루어진 스페이서 사슬 경우에는 대체하는 뉴클레오티드 잔기 1 개당 n 값은 바람직하게는 1로 할 수 있다.
(D)의 변이는 뉴클레오티드 잔기와는 전혀 구조가 다르기 때문에 DNA 중합 효소가 이것을 뉴클레오티드 잔기로 인식하지 못하고, 핵산 합성 반응을 계속할 수 없다 (도 6). 또한 당해 변이가 도입된 프라이머가 상보 사슬과 하이브리다이제이션하는 경우, 해당 변이는 상보 사슬 측의 염기와 수소 결합을 형성하지 않는다.
또한, 광분해성수식의 스페이서 사슬은 UV 또는 가시 광선 노출에 의해 분해되는 성질을 가지는 화합물로 변형된 스페이서 사슬이며, 본 명세서에서는 니트로 벤젠 골격을 갖는 것을 특징의 하나 하나로서 가지고 있는 화합물군 (특허 제 4870791호 참조)을 가리킨다.
(D)의 변이로는 1- [2-Nitro-5-(6trifluoroacetylcaproamidomethyl) phenyl] -ethyl-[2-cyano-ethyl (N,N-diisopropyl)] phosphoramidite로부터 유도되는 구조 (통칭 PC 5'-Amino-Modifier),1-[2-Nitro-5-(6-(N-(4,4'dimethoxytrityl)) biotinamidocaproamidomethyl)phenyl]-ethyl-[2cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)] phosphoramidite에서 유도되는 구조 (통칭 PC 5'-Biotin), 3-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1-(2nitrophenyl)-propane-1,3-diol-[2cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)] phosphoramidite로부터 유도되는 구조 (통칭 PC Linker), [4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy) butyramidomethyl)-1-(2-nitrophenyl) -ethyl]-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite로부터 유도되는 구조 (통칭 PC Spacer) 등이 예시될 수 있다.
하나의 프라이머에 도입하는 변이의 수는 프라이머의 특이성을 잃지 않는 범위에서 적절하게 설정할 수 있다. 프라이머의 특이성은 일반적인 프라이머 설계 도구에 의해 산출할 수 있다.
다음으로, 본 발명의 설계 방법의 각 공정에 대해 설명한다. 본 발명의 프라이머의 설계 방법은 기초 서열 설계 공정을 포함한다. 기초 서열 설계 공정은 주형 DNA에 완전하게 상보적인 염기 서열을 기초 프라이머 서열로 설계하는 공정이며, 일반적으로 핵산 증폭법의 프라이머의 설계와 마찬가지로 할 수 있다. 즉, 특이성, GC 함량, Tm 값 등의 관점에서 프라이머에 적합한 15 ~ 50 염기 정도의 염기 서열을, 표적으로 하는 염기 서열 중에서 선택한다. 특이성이나 GC 함량, Tm 값 등의 산출 방법은 제한되지 않고, 손 계산으로도 좋고 일반적으로 사용되는 계산 도구 등을 사용하여도 좋다.
1 개의 계에서 설계하는 기초 프라이머 서열의 수는 목적으로 하는 핵산 증폭법의 계에 의해 적절하게 변경한다. 즉, 목적으로 하는 핵산 증폭법이 일반적으로 PCR 법인 경우에는 F 프라이머와 R 프라이머 2 종, Lamp 법과 같은 3 종 이상의 프라이머를 필요로하는 계인 경우에는 3종 이상의 기초 프라이머 서열을 설계한다.
기초 서열 설계 공정의 기초 프라이머 서열 설계 후, 변이 도입 부위 선택 공정을 행한다. 변이 도입 부위 선택 공정은 이하의 (1) ~ (4)로 이루어진 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 조건에 부합하는 뉴클레오티드 잔기를 기초 프라이머 서열에서 선택하고 변이 도입 부위로 하는 공정이다 .
(1) 프라이머 다이머의 형성에 기여하는 가능성이 있는 뉴클레오티드 잔기.
(2) 프라이머 1 분자 내에서의 루프 구조의 형성에 기여하는 가능성이 있는 뉴클레오티드 잔기.
(3) 상기 기초 프라이머 서열로 이루어진 프라이머가 프라이머 다이머를 형성할 것으로 예상되는 경우에는 프라이머가 상보적 또는 비상보적으로 하이브리다이즈하는 영역 이외의 영역에 위치하는 뉴클레오티드 잔기.
(4) 상기 기초 프라이머 서열로 이루어진 프라이머가 1 분자 내에서 루프 구조를 형성할 것으로 예상되는 경우, 루프 구조를 구성하는 영역 이외의 영역에 위치하는 뉴클레오티드 잔기.
기초 프라이머 서열로 이루어진 프라이머는 프라이머 다이머 또는 루프 구조를 형성하는지 여부, 또한 형성하는 경우에는 어떤 뉴클레오티드 잔기가 기여하는지 예측하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 일반적으로 이용되고 있는 계산 도구 등을 사용하여도 좋다.
먼저 (1)의 조건을 만족하는 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어 도 7에 도시된 뉴클레오티드 잔기 (F 프라이머의 TAA, R 프라이머의 TTA)과 같은 프라이머 다이머의 형성에 기여하고, 즉 상보 가닥 염기와 수소 결합을 형성하는 가능성이 있는 뉴클레오티드 잔기이다. 프라이머 다이머가 형성되면 도 7에 도시한 바와 같이 프라이머 자체가 주형이 되고 비특이적 증폭이 생겨 버린다.
(1)의 조건을 만족하는 뉴클레오티드 잔기를 변이 도입 부위로 선택하고 (도 7 중 검은 화살표), 변이를 도입하여 프라이머 다이머의 형성을 억제하고 비특이적 증폭의 발생을 억제할 수 있다 (도 8).
도 7 및 8은 F 프라이머 및 R 프라이머의 서로 다른 프라이머끼리의 프라이머 다이머의 형성을 억제하는 경우의 개요를 나타냈지만, 동일한 프라이머끼리의 프라이머 다이머 형성에 기여하는 뉴클레오티드 잔기도 (1 )의 조건에 부합되는 것은 물론이다.
(2)의 조건을 만족하는 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어 도 9에 도시하는 뉴클레오티드 잔기 (5' 측의 TAA, 3' 측의 TTA)과 같은 루프 구조의 형성에 기여할 수 있는 뉴클레오티드 잔기이다. 루프 구조가 형성되면 도 9에 도시한 바와 같이 프라이머 자체가 주형이 되고 비특이적 증폭이 생겨 버린다.
(2)의 조건을 만족하는 뉴클레오티드 잔기를 변이 도입 부위로 선택하고(도 9 중 검은 화살표), 변이를 도입하여 루프 구조의 형성을 억제하고 비특이적 증폭의 발생을 억제할 수 있다 (도 10).
(3)의 조건을 만족하는 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어 도 11에 도시하는 뉴클레오티드 잔기 (F 프라이머의 C, R 프라이머의 G)와 같은 기초 프라이머 서열로 이루어진 프라이머가 프라이머 다이머를 형성하는 것이 예측되는 경우에는, 프라이머가 상보적 또는 비상보적으로 하이브리다이즈하는 영역 이외의 영역에 위치하는 뉴클레오티드 잔기이다.
프라이머 다이머가 형성되면, 도 11과 같이 프라이머 자체가 주형이 되고, DNA 중합 효소가 최대한 합성 가능한 사슬 길이까지 비특이적 증폭이 생겨 버린다. (3)의 조건을 만족하는 뉴클레오티드 잔기를 변이 도입 부위로 선택하고 (도 11 중 검은 화살표), 변이를 도입하여 변이 도입 부위에서 DNA 중합 효소의 DNA 합성 반응을 억제하고 비특이적으로 증폭 산물의 사슬 길이를 짧게 억제할 수 있다 (도 12).
(3)의 조건을 만족하는 뉴클레오티드 잔기를 변이 도입 부위로 선택하는 것은, 예를 들어 도 13과 같은 비특이적 증폭 산물이 새로운 비특이적 증폭 프라이머로서 기능할 수 있는 경우에 특히 효과적이다. 도 13에 나타낸 프라이머에 의해 생긴 비특이적 증폭 산물인 P1과 P2는 변성하여 하나의 사슬이 된 후, 다시 서로 하이브리다이즈하고, 새로운 비특이적 증폭을 일으킨다. 이 새로운 비특이적 증폭 산물은 나아가 별개의 비특이적 증폭을 일으키는 프라이머로서 기능하기 때문에 비특이적 증폭의 연쇄는 멈추지 않게 된다.
이 경우 (3)의 조건을 만족하는 뉴클레오티드 잔기에 변이를 도입하면 도 14과 같이 비특이적 증폭 산물 P1' 및 P2'가 새로운 비특이적 증폭 프라이머로 기능하지 않기 때문에, 비특이적 증폭의 연쇄를 멈추는 것이 가능하다.
도 13 및 14는 F 프라이머와 R 프라이머의 서로 다른 프라이머끼리의 프라이머 다이머의 형성을 억제하는 경우의 개요를 나타냈지만, 동일한 프라이머끼리의 프라이머의 형성에 기여하는 뉴클레오티드 잔기도 (3) 조건에 부합하는 것은 물론이다.
(4)의 조건을 만족하는 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어 도 15에 나타내는 뉴클레오티드 잔기 (C)와 같은 기초 프라이머 서열로 이루어진 프라이머가 1 분자 내에서 루프 구조를 형성할 것으로 예상되는 경우, 루프 구조를 구성하는 영역 이외의 영역에 위치하는 뉴클레오티드 잔기이다. 여기에서 "루프 구조를 구성하는 영역"은 루프 상태로 되어있는 서열 영역 및 프라이머가 상보적 또는 비상 적으로 하이브리다이즈하는 영역을 말한다.
루프 구조가 형성되면, 도 15에 나타낸 바와 같이 프라이머 자체가 주형이 되고, DNA 중합 효소가 최대한 합성 가능한 사슬 길이까지 비특이적 증폭이 생겨 버린다. (4)의 조건을 만족하는 뉴클레오티드 잔기를 변이 도입 부위로 선택하고 (도 15 중 검은 화살표), 변이를 도입하여 변이 도입 부위에서 DNA 중합 효소의 DNA 합성 반응을 억제하고 비특이적으로 증폭 산물의 사슬 길이를 짧게 억제할 수 있다 (도 16).
(4)의 조건을 만족하는 뉴클레오티드 잔기를 변이 도입 부위로 선택하는 것은 도 13 및 14을 참조하여 설명한 것과 같은 원리에 의해 비특이적 증폭 산물이 새로운 비특이적 증폭 프라이머로서 기능할 수 있는 경우에 특히 효과적이다. (4)의 조건에 부합되는 뉴클레오티드 잔기에 변이를 도입하여 비특이적 증폭의 연쇄를 방지할 수 있다.
본 발명의 설계 방법에 따라 설계하는 프라이머는 비특이적 증폭의 억제 이외의 목적을 가지고 각종 변경을 실시해도 좋다.
실시예
<시험예 1>
Mycobacterium bovis BCG str. Tokyo 172주의 게놈 DNA에 있어서 Direct Repeat 서열을, 재공표 2012/124681호 공보에 기재된 핵산 증폭법(TRIAmp 증폭법)에 의해 증폭하기 위해, 동 공보에 DRa-21 및 DRb-19 로 기재된 프라이머 세트를 준비했다. 이러한 프라이머의 서열을 표 1 상단에 프라이머 1F 및 프라이머 1R로 나타낸다. 또한, 특히 지정이 없는 경우에는 본 시험예에 기재된 프라이머 용매는 1 Х TE buffer이다.
웹 상에서 사용할 수 있는, 또한 다운로드하여 사용할 수 있는 일반적인 계산 프로그램을 이용하여 프라이머 1F 및 1R 서열 중 헤어핀 루프, 호모 다이머, 헤테로 다이머의 형성에 기여할 수 있는 뉴클레오티드 잔기를 선별하였다.
이에 따라 선별된 뉴클레오티드 잔기를 변이 도입 부위로서 선택하고, 표 1에 나타낸 프라이머 세트 2 및 3의 프라이머를 설계하고 이를 제조하였다.
또한 프라이머 세트 2 및 3의 변이 도입 부위에서 3' 말단측의 서열로 이루어진 프라이머를 준비하였다 (프라이머 세트 4 및 5, 표 1).
표 1에 나타내는 F 프라이머 및 R 프라이머의 프라이머 세트를 이용하여 표 2에 나타내는 반응 용액을 조제하고, TRIAmp 증폭법을 실시했다. TRIAmp 증폭 반응은 Thermal Cycler Dice Real Time System Lite TP710를 사용하여 68℃에서 2 시간 행하고 FAM 검출 모드에 의해 반응을 추적했다. 그 결과 산출된 증폭 곡선과 Ct 값을 도 17, 18 및 표 3에 각각 나타낸다. 또한 TRIAmp 증폭 반응은 각각의 프라이머의 조합에 대해 반응 용액을 2 세트 제조하고 (이하, 각각의 샘플을 샘플 1 및 샘플 2라고 한다), 각각에 대한 증폭 곡선과 Ct 값을 산출했다.
도 17, 18. 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 극히 프라이머 길이가 짧은 프라이머 세트 5 이외의 프라이머를 사용한 경우에는 최종적인 휘도에 다소 차이가 있지만, 그 증폭 속도는 모두 동일한 정도였다.
이러한 결과는 본 발명의 방법으로 변이가 도입된 프라이머는, 동 프라이머의 변이 도입 부위에서 5' 말단측을 단순히 결손시킨 프라이머와는 기능이 다르다는 것을 보여주고 있다.
<시험예 2>
표 1에 나타내는 F 프라이머 및 R 프라이머의 프라이머 세트를 이용하여 표 2에 나타낸 조성에서 템플릿 DNA를 물 대신 반응 용액을 조제하고, 시험예 1과 동일한 조건에서 TRIAmp 증폭 반응을 수행하여 증폭 곡선 및 Ct 값을 산출했다. 결과를 표 4 및 도 19, 20에 나타낸다.
또한 TRIAmp 증폭 반응은 각각의 프라이머의 조합에 대하여 반응 용액을 4 세트 준비하고 (이하, 각각의 샘플을 비특이적 샘플 1 ~ 4라고 함), 각각에 대한 증폭 곡선과 Ct 값을 산출했다.
도 19, 20 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 템플릿 DNA를 포함하지 않는 계에서의 핵산 증폭, 즉 비특이적 증폭 속도는 변이가 도입되지 않은 프라이머 세트 1을 사용한 경우와 비교하여 변이를 도입한 프라이머 세트 2, 3를 사용한 경우가 더 현저하게 느려지는 것을 알 수 있다. 특히 프라이머 세트 3을 사용한 경우에는 4 샘플 중 3 샘플에서 핵산의 비특이적 증폭이 일어나지 않았다.
이 결과는 프라이머로의 변이의 도입으로 비특이적 증폭이 강하게 억제되고 있음을 보여주고 있다.
프라이머 세트 4는 프라이머 세트 2의 변이 도입 부위에서 3' 말단측의 서열을 가진다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 프라이머 세트 4를 이용하여 TRIAmp 증폭 반응을 실시했을 경우, 프라이머 세트 1을 이용한 경우에 비해 비특이적 증폭 속도는 느려지게 되었다. 하지만 프라이머 세트 4보다는, 프라이머 세트 2를 사용했을 때의 것이 비특이적 증폭 속도의 억제 효과가 강하게 나타나고 있다 (표 4).
또한 프라이머 세트 5는 프라이머 세트 3에 있어서 변이 도입 부위에서 3' 말단측의 서열을 가지지만, 프라이머 5를 이용한 경우는 반응 용액에 템플릿 DNA가 포함되어 있었다고 해도 핵산 증폭 반응이 일어나지 않는다.
이러한 결과는 본 발명의 방법으로 변이가 도입된 프라이머는 동 프라이머의 변이 도입 부위에서 5' 말단측을 단순히 결손시킨 프라이머와는 기능이 다르다는 것을 보여주고 있다.
프라이머 세트 1을 이용하여 TRIAmp 증폭 반응을 수행할 때 비특이적 증폭이 생겨 버리는 원인은 도 21및 22에 나타내는 메커니즘에 의한 것이라고 예상된다. 즉, F 프라이머가 다른 F 프라이머 및 프라이머 다이머를 형성하고 (도 21 상단), DNA 합성 반응이 진행되어 비특이적 증폭 산물인 P1이 생긴다(도 21 하단). 이어 변성되어 단일가닥이 된 P1은 R 프라이머와 다이머를 형성하고 (도 22 상단), DNA 합성 반응이 진행하여 비특이적 증폭 산물인 P2가 생성된다(도 22 하단). 그리고 P2의 3' 말단의 3 뉴클레오티드 (GGG)와 상보적인 서열 (CCC)이 P1과 P2 중에 존재하기 때문에, 잇따라 비특이적 증폭이 진행된다.
한편, 프라이머 세트 2를 이용한 경우에는 F 프라이머가 다른 F 프라이머 및 프라이머 다이머를 형성하고 (도 23 상단), DNA 합성 반응이 진행되었다 하더라도 그 신장은 주형이 된 F 프라이머의 5' 말단에서 3 번째 뉴클레오티드 잔기 (G)에서 정지한다 (도 23 하단). 따라서 이 비특이적 증폭으로 인해 발생한 P1'이 그 3' 말단에서 R 프라이머와 다이머를 형성하는 것이 곤란하게 되어 비특이적 증폭 연쇄는 일어나지 않는다. 만일 P1' 및 R 프라이머가 다이머를 형성하고 (도 24 상단), DNA 합성 반응이 일어났다 하더라도 그 신장은 주형이 된 R 프라이머의 5' 말단에서 3 번째 뉴클레오티드 잔기 (C)에서 멈추기 때문에(도 24 하단), 이 비특이적 증폭으로 인한 P2'가 더 비특이적 증폭의 연쇄를 생기게 하는 가능성은 낮다.
또한 프라이머 세트 3의 F 프라이머에는 두 개의 F 프라이머에 의한 프라이머 다이머 형성에 기여하는 뉴클레오티드 잔기에 변이가 도입되어 있기 때문에 프라이머가 형성되기 어렵고, DNA 합성 반응이 매우 생기기 어렵다( 도 25 상단). 만일 DNA 합성 반응이 일어나 증폭 산물인 P1''이 발생하고 (도 25 하단), 이 R 프라이머 및 프라이머 다이머를 형성하여 DNA 합성 반응이 일어났다 해도 (도 26 상단), 그 반응은 R 프라이머의 변이 도입 부위에서 정지하기 때문에(도 26 하단), 그 증폭 산물인 P2''가 더 비특이적 증폭의 연쇄를 생기게 할 가능성은 낮다.
이러한 이유로, 변이가 도입된 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 2 및 3은 비특이적 증폭 반응 속도의 억제 효과가 있는 것으로 생각된다.
<시험예 3>
표 5에 나타낸 서열 중 m로 표시되는 위치에 Spacer C3, dSpacer, Spacer 9 Abasic 또는 PC Spacer로부터 유도되는 구조가 도입된 F 프라이머 및 R 프라이머의 프라이머 세트를 준비하였다.
표 5에 나타내는 F 프라이머 및 R 프라이머의 프라이머 세트 및 표 1에 나타내는 F 프라이머 및 R 프라이머의 프라이머 세트 1 ~ 3을 이용하여 표 2에 나타낸 조성에서 시험예 1과 동일한 조건에서 TRIAmp 증폭 반응을 실시하여 증폭 곡선 및 Ct 값을 산출했다. 결과를 표 6 및 도 27, 28에 나타낸다.
또한, 프라이머 세트 3 Abasic의 용매는 0.2M 트리에틸 아민 - 초산 용액을 멸균수로 10μM로 희석한 것이다.
표 6 및 도 27, 28에 나타낸 바와 같이, 프라이머 세트 1 ~ 3보다 다소 증폭 속도가 느리지만, Spacer C3, dSpacer, Spacer 9, Abasic 또는 PC Spacer의 어느 변이가 도입된 프라이머 세트를 이용한 경우에도 문제없이 DNA증폭을 실시할 수 있었다.
<시험예 4>
또한 표 5에 나타내는 F 프라이머 및 R 프라이머의 프라이머 세트 및 표 1에 나타내는 F 프라이머 및 R 프라이머의 프라이머 세트 1 ~ 3을 이용하여 표 2에 나타낸 조성에서 템플릿 DNA를 물 대신 반응 용액을 준비하고, 시험예 1과 동일한 조건에서 TRIAmp 증폭 반응을 수행하여 증폭 곡선 및 Ct 값을 산출했다. 결과를 표 7 및 도 29, 30에 나타낸다.
또한 TRIAmp 증폭 반응은 각각의 프라이머의 조합에 대하여 반응 용액을 4 세트 준비하고 (이하, 각각의 샘플을 비특이적 샘플 1 ~ 4이라 함), 각각에 대한 증폭 곡선과 Ct 값을 산출했다.
도 27 ~ 30 및 표 6, 7에 나타낸 바와 같이, 템플릿 DNA를 포함하지 않는 계에서의 핵산 증폭, 즉 비특이적 증폭 속도는 탄소 사슬 또는 PEG 사슬로 이루어진 스페이서 사슬, 화학식 1로 표시되는 테트라 하이드로 퓨란 유도체로 이루어진 스페이서 사슬, 광분해성수식의 스페이서 사슬의 변이를 도입한 프라이머 세트를 이용한 경우에도, 변이를 도입하지 않은 프라이머 세트 1과 비교하여 현저하게 느려지게 되는 것을 알 수 있다.
이 결과는 본 발명의 방법에 의한 프라이머의 변이의 도입으로 비특이적 증폭이 강하게 억제되고 있음을 보여주고 있다.
본 발명은 핵산 증폭법의 비특이적 증폭의 저감 방법에 응용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Daikeniki Kabushiki Kaisha
<120> The Design Method of the Mutated Primer.
<130> P00661
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Mycobacterium bovis
<400> 1
cggggttttg ggtctgacga c 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Mycobacterium bovis
<400> 2
cccgagaggg gacggaaac 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Mycobacterium bovis
<400> 3
gggttttggg tctgacgac 19
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Mycobacterium bovis
<400> 4
cgagagggga cggaaac 17
Claims (7)
- 핵산 증폭법에 사용하는, 변이가 도입된 프라이머의 설계 방법에 있어서,
주형 DNA에 완전하게 상보적인 염기 서열을 기초 프라이머 서열로 설계하는 기초 서열 설계 공정과,
상기 기초 프라이머 서열에 포함되는 1 또는 2 이상의 뉴클레오티드 잔기로서, 이하 (1) ~ (4)로 이루어진 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 조건에 부합하는 뉴클레오티드 잔기를 변이 도입 부위로 선택하는 변이 도입 부위 선택 공정을 구비한 설계 방법.
(1) 프라이머 다이머의 형성에 기여할 수 있는 뉴클레오티드 잔기.
(2) 프라이머 1 분자 내에서의 루프 구조의 형성에 기여할 수 있는 뉴클레오티드 잔기.
(3) 상기 기초 프라이머 서열로 이루어진 프라이머가 프라이머 다이머를 형성할 것으로 예상되는 경우에는 프라이머가 상보적 또는 비상보적으로 하이브리다이즈하는 영역 이외의 영역에 위치하는 뉴클레오티드 잔기.
(4) 상기 기초 프라이머 서열로 이루어진 프라이머가 1 분자 내에서 루프 구조를 형성할 것으로 예상되는 경우, 루프 구조를 구성하는 영역 이외의 영역에 위치하는 뉴클레오티드 잔기. - 제1항에 있어서, 상기 변이가 DNA 중합 효소가 뉴클레오티드 잔기로 인식하지 않는 것을 특징으로 하는 설계 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변이가 다음의 (A) ~ (D)로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상인 것을 특징으로 하는 설계 방법.
(A) 상기 변이 도입 부위의 전후에 위치하는 뉴클레오티드 잔기의 5' 말단 및 3' 말단과, 각각의 5' 말단 및 3' 말단을 결합하여 이루어진 뉴클레오티드 잔기 또는 폴리 뉴클레오티드.
(B) 탄소 사슬 또는 PEG 사슬로 이루어진 스페이서 사슬.
(C) 화학식 1로 표시되는 테트라하이드로 퓨란 유도체로 이루어진 스페이서 사슬.
[화학식 1]
(일반식 1 중, R은 H 또는 수산기, n은 자연수를 나타낸다)
(D) 광분해변형된 스페이서 사슬. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 설계 방법에 의해 설계된 프라이머.
- 제4항에 기재된 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭법.
- 제5항에 있어서, 등온 증폭법인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 설계방법의 각 공정을 순서대로 컴퓨터에 실행시키기 위한 프로그램.
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