CN109055524A

CN109055524A - 一种基于DNA组装的恒温条件下同时检测多种microRNA的探针和方法

Info

Publication number: CN109055524A
Application number: CN201810819681.2A
Authority: CN
Inventors: 戴宗; 陈俊; 吕品田; 邹小勇
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2018-07-24
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2038-07-24
Also published as: CN109055524B

Abstract

本发明公开了一种基于DNA组装的恒温条件下同时检测多种microRNA的探针和方法；本发明探针包括3条探针组；3条探针组和目标microRNA能够自组装形成稳定的“工”字形结构；再结合限制性内切酶的高特异性和对单链DNA切割特性，实现具有非序列依赖性的核酸酶功能的DNA模块，应用于恒温条件下多种miRNA的同时荧光检测。解决常规恒温扩增方法体系复杂问题，为多种miRNA同时灵敏检测提供新方法。本方法仅需添加限制性内切酶和设计简单的探针在不需添加dNTPs条件下即可实现恒温信号扩增检测核酸，且具有良好精确性，重复性和稳定性，适宜发展为试剂盒并向市场推广。

Description

一种基于DNA组装的恒温条件下同时检测多种microRNA的探针和方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于DNA组装的恒温条件下多种microRNA同时荧光检测方法。

背景技术

microRNA(miRNA)是一类对基因表达具有调控作用的非编码小分子RNA，在动植物生长、发育、分化和生殖等过程中发挥重要作用。人类约30％的基因受miRNA调控，且miRNA的表达水平与人类重大疾病密切相关。对miRNA的定量检测有助于深入理解其作用机制，对疾病的诊断与治疗以及相关基因药物的开发等具有重要意义。研究表明，一种miRNA表达水平通常与多种疾病相关。例如，miR-373在乳腺癌、前列腺癌、食道癌以及肝癌中表达增加。Let-7a在肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌以及卵巢癌中表达降低。因此，对疾病的精确诊断不能仅通过一种miRNA的表达水平，而通常需要根据多种miRNA的表达水平进行综合判断。由于miRNA的序列短(18-24碱基)，在细胞或者体液内的表达水平非常低，易降解，同源miRNA之间仅相差1-2个碱基，对检测方法的灵敏度和特异性要求极高。Northern印迹技术是当前分析miRNA的常用方法，但方法操作繁琐、耗时长、灵敏度低，需大量样品及分离富集步骤，对RNase污染非常敏感，分析结果误差大。Microarray方法可实现高通量、多组分同时检测miRNA，但方法的特异性和灵敏度较低，芯片制备困难，检测成本高。反转录定量PCR(RT-qPCR)是检测miRNA的金标方法，但由于miRNA序列短，需要先反转录成cDNA才能PCR扩增，方法操作复杂，耗时长，且需要精确的控温仪器，花费高，难于多miRNAs同时检测。

近年来发展的核酸恒温扩增技术，其特点是反应过程始终维持在恒定温度，通过添加不同的酶和引物来达到快速扩增目的。但大多数恒温扩增方法依赖复杂的引物设计、聚合酶、切口酶和dNTPs的共同参与。复杂的扩增体系在一定程度上限制了方法的应用范围。发展简单高效恒温扩增方法实现多种miRNA表达水平的同时检测意义重大。

发明内容

通过设计三条探针组，并结合限制性内切酶的高特异性和对单链DNA切割特性，实现具有非序列依赖性的核酸酶功能的DNA模块，应用于恒温条件下多种miRNA的同时荧光检测。解决常规恒温扩增方法体系复杂问题，为多种miRNA同时灵敏检测提供新方法。

本发明的目的之一在于提供一种检测microRNA的探针组。

本发明的另一目的在于提供一种检测同时检测多种microRNA的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种检测microRNA的探针组，所述探针组包括Y-1n、Y-2n和荧光探针LP；探针Y-1n、Y-2n、LP和目标microRNA能够自组装形成稳定的“工”字形结构；

探针Y-1n中间的部分碱基与Y-2n中间的部分碱基反向互补配对，形成“工”字形中间部分的茎部序列；

探针Y-1n、Y-2n的另一部分碱基序列与目标microRNA的两端序列分别反向互补配对，形成“工”字形一端的“一”字形头部；

探针Y-1n、Y-2n中还存在能与荧光探针LP两端序列分别发生反向互补配对的碱基序列，形成“工”字形另一端的“一”字形头部；

荧光探针LP与目标microRNA不能配对结合；

荧光探针LP能被切刻内切酶切割；

荧光探针LP两端分别连有报告荧光基团、淬灭荧光基团。

进一步的，所述茎部序列的长度为7～9bp。

进一步的，所述茎部序列中含有切刻内切酶的识别位点。

进一步的，荧光探针LP的序列长度为10～18nt。

进一步的，荧光探针LP被切刻内切酶切割后能从“工”字形结构中脱落。

进一步的，所述切刻内切酶包括Nt.BstNBI、Nt.BsmAI、Nt.AlwI。

一种检测microRNA的方法，根据所有待检测目标microRNA的序列，对所有目标microRNA分别设计、合成上述任一项所述的探针组，将设计、合成的所有探针组、切刻内切酶与待检测样品混合，于35～50℃反应，然后测定各探针组中所带荧光基团的荧光强度，根据荧光强度值以及相应标准曲线，计算样品中各目标microRNA浓度。

进一步的，于35～50℃反应的时间为30～70min。

进一步的，切刻内切酶在整个反应体系中的浓度为0.36～0.7U/μL。

进一步的，当目标microRNA为miR-373、let-7a和miR-27a时，设计、合成的探针组如SEQ ID NO:2～4、SEQ ID NO:10～12、SEQ ID NO:14～16所示。

本发明的有益效果是：

1、本发明扩增体系简单。本方法仅需添加限制性内切酶和设计简单的探针在不需添加dNTPs条件下即可实现恒温信号扩增检测核酸。

2、本发明探针和方法非序列依赖。目标miRNA无需含有限制性内切酶识别序列，拓展了限制性内切酶在核酸检测中的应用范围。

3、本发明探针和方法可用于多目标同时检测。针对多种miRNA，设计相应DNA探针和荧光探针，应用单一限制性内切酶，即可实现检测信号放大，对多种miRNA同时检测。

4、本发明探针和方法以均相恒温检测为条件。为均相反应，且在恒温条件下无需精确热循环仪器，方法表现出良好精确性，重复性和稳定性，适宜发展为试剂盒并向市场推广。

附图说明

图1.基于DNA组装的恒温条件下多种miRNA同时荧光检测原理图；

图2.各组检测目标miRNA(miR-373)的荧光强度曲线；

图3.反应温度对本发明方法荧光强度的影响；

图4.酶用量对体系荧光强度的影响；

图5.不同反应时间对体系荧光强度的影响；

图6.本发明的特异性检测；

图7.多种miRNA的检测结果；(1)miR-373；(2)miR-27a；(3)let-7a；(4)miR-373+miR-27a；(5)miR-373+let-7a；(6)miR-27a+let-7a；(7)miR-373+miR-27a+let-7a；(8)为各种情况的统计；Y探针为0.2mM，LP探针为0.5mM；LP1、LP2、LP3发射波长分别在520、580、663nm(FAM、TAMRA、Cy5)；

图8.检测不同miRNA的荧光曲线(a)和标准曲线(b)；

图9.不同细胞裂解液内不同miRNA含量。

具体实施方式

荧光探针LP与目标microRNA不能配对结合；

荧光探针LP能被切刻内切酶切割，切割后的荧光探针LP能从“工”字形结构中脱落下来；

荧光探针LP两端分别连有报告荧光基团、淬灭荧光基团。

优选的，所述茎部序列的长度为7～9bp。

优选的，所述茎部序列中含有切刻内切酶的识别位点。

优选的，荧光探针LP的序列长度为10～18nt。

优选的，荧光探针LP被切刻内切酶切割后形成的2个片段均不大于9nt。

优选的，所述切刻内切酶包括Nt.BstNBI、Nt.BsmAI、Nt.AlwI。

优选的，不同目标microRNA的荧光探针LP连有的报告荧光基团不同。

优选的，35～50℃反应的时间为30～70min，更优先的反应时间为60min。

更优选的，反应温度为40～50℃，最佳反应温度为45℃。

优选的，切刻内切酶在整个反应体系中的浓度为0.36～0.7U/μL，优选的酶浓度为0.4～0.7U/μL，最佳酶浓度为0.6U/μL。

优选的，所述待检测样品包括细胞裂解液。

优选的，当目标microRNA为miR-373、let-7a和miR-27a时，设计、合成的探针组如SEQID NO:2～4、SEQ ID NO:10～12、SEQ ID NO:14～16所示。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1一种检测microRNA的探针组

检测microRNA的探针组包括Y-1n、Y-2n和荧光探针LP；探针Y-1n、Y-2n、LP和目标microRNA能够自组装形成稳定的“工”字形结构；

探针Y-1n中间的部分碱基与Y-2n中间的部分碱基反向互补配对，形成“工”字形中间部分的茎部序列；所述茎部序列的长度为7～9bp；所述茎部序列中含有切刻内切酶的识别位点。

荧光探针LP与目标microRNA不能配对结合；

荧光探针LP能被切刻内切酶切割，荧光探针LP被切刻内切酶切割后形成的2个片段均不大于9nt；

荧光探针LP两端分别连有报告荧光基团、淬灭荧光基团；不同目标microRNA的荧光探针LP连有的报告荧光基团不同。

下面对本发明检测microRNA的探针组的检测原理作进一步说明，本发明探针组的检测原理图如图1所示。本发明基于限制性内切酶的特异性识别特性，并结合DNA自组装原理，构建DNA组装模块非序列依赖性酶工具并用于miRNA检测。针对每种目标miRNA序列，分别设计两条DNA探针(Y-1n、Y-2n)，Y-1n与Y-2n中间有7～9nt的互补序列，两端分别与目标miRNA和荧光探针(LP)部分互补；在不存在目标miRNA的条件下，Y-1n、Y-2n和LP几乎不能自组装形成稳定的杂交复合物，此时LP上标记的荧光基团F和淬灭基团Q由于距离近而发生荧光淬灭；当存在目标miRNA时，miRNA、Y-1n、Y-2n和LP自组装形成较稳定的“工”字形桥联结构，限制性内切酶特异性识别桥联结构的茎部序列，并在特定位点切割LP；被切割的LP从“工”字形桥联结构脱落，释放出荧光基团，产生荧光；miRNA、Y-1n和Y-2n桥联结构继续与其他LP杂交；在恒温条件下，杂交-酶切反应不断重复，使得一个miRNA可不断释放荧光基团，荧光信号不断增强，实现对目标miRNA的灵敏检测。通过设计不同Y-1n和Y-2n探针，并在LP上标记不同荧光基团，可实现多miRNAs的同时检测。

实施例2一种检测microRNA的方法

方法：

选取一目标miRNA(miR-373)并通过NUPACK软件设计探针，并合成了与之序列部分互补的DNA探针Y-11、Y-21和荧光探针LP，各探针具体序列如表1所示。

将Y-11、Y-21、LP、Nt.BstNBI、Nt.BstNBI缓冲液和目标miRNA混合，在45℃的条件下反应30min；同时检测荧光强度变化情况。

同时，设立3组对照实验：

Y-11+Y-21+LP1组：该对照组反应体系中仅存在Y-11、Y-21和LP时，不含切刻内切酶Nt.BstNBI和目标miRNA(miR-373)，其他条件均同上述实验组。

Y-11+Y-21+LP1+NEase组：该对照组反应体系不含目标miRNA(miR-373)，其他条件均同上述实验组。

Y-11+Y-21+LP1+miRNA组：该对照组反应体系不含切刻内切酶Nt.BstNBI，其他条件均同上述实验组。

通过比较每组荧光强度变化验证本发明方法可行性。

表1本发明所用的寡核苷酸序列

注：加粗字区域代表茎的序列，斜体字区域与荧光探针序列互补，下划线区域与miR-373序列互补。

结果：

实验检测结果如图2所示。当体系中仅存在Y-11、Y-21和LP1时，背景信号最低但仍有一点强度，说明Y-11、Y-21的存在会对LP1本身的荧光淬灭产生影响。与之对比，当体系中加入miR-373后荧光强度略微增加，说明形成的半“工”形桥联结构也会对LP产生影响；当加入限制性内切酶Nt.BstNBI而无miR-373时，体系荧光强度也有一点程度地增加，说明在没有目标物的条件下，Y-11、Y-21和LP1可能也会形成少量的T型结构，并且在Nt.BstNBI存在时导致LP被切割产生荧光信号。然而，在Y-11、Y-21、LP1、Nt.BstNBI和miR-373同时存在的条件下，杂交形成的桥联结构在限制性内切酶的作用下能循环切割荧光探针，释放出FAM基团，使体系的荧光信号得到了显著放大，产生的荧光信号远远高于仅存在Nt.BstNBI或miR-373时的信号。这一结果充分证明了目标物miR-373能与探针顺利杂交并使荧光探针被成功切割，释放出荧光基团。因此，实验结果表明该实验方案可行，能够灵敏检测目标miRNA。

实施例3反应温度的考察

方法：

根据限制性内切酶Nt.BstNBI的物化性质，其在55℃左右催化活性较高，反应温度过高或过低都会明显降低其活性。另外，体系中“工”字形桥联结构的解链温度也对反应有极大影响，当反应温度过高时将难以形成该结构，从而影响酶切循环放大过程。在本体系中，固定其他条件不变，选取35，40，45，50，55和60℃作为反应温度，考察温度对反应体系荧光强度的影响。具体操作方法为：将Y-11、Y-21、LP、Nt.BstNBI、Nt.BstNBI缓冲液和目标miRNA(miR-373)混合，分别在35，40，45，50，55和60℃的条件下反应60min；检测各组荧光强度，各组反应除了反应温度不同，其他条件均相同。

结果：

检测结果如图3所示。当反应温度低于45℃时，“工”字形桥联结构容易形成，随着反应温度的升高，内切酶的效率有所提高，荧光信号明显增强。当反应温度高于45℃时，可能由于桥联结构不稳定，体系荧光信号强度逐渐下降并趋于稳定。因此选定最佳反应温度为45℃。但在35～50℃的范围内，能够检测出显著的荧光强度，能够实现对目标miRNA(miR-373)的检测，优选的反应温度为40～50℃，最佳反应温度为45℃。

实施例4酶用量的考察

方法：

酶切循环放大过程的效率与酶用量也有较大关系。考察目标miRNA浓度为固定量时，不同用量的内切酶Nt.BstNBI对体系荧光信号强度的影响，同时以不加目标miRNA的体系作为空白对照。随着酶用量的增加，观察体系荧光信号强度变化，样品和空白信号强度差值达到最大，选定为最佳酶用量。本实验考察了miR-373浓度为500nM时，不同用量(5U、10U、15U、20U、25U、30U、35U、40U)的内切酶Nt.BstNBI对体系荧光信号强度的影响，同时以不加miR-373的体系作为空白对照，各组实验的总反应体系均为50μL，各组实验除了酶用量不同，其他条件均相同。

结果：

由图4可以看出，随着酶用量的增加，体系荧光信号强度逐渐增加，但酶用量达到一定量后继续增加时信号强度开始下降。空白对照的荧光信号则变化不大。由图可知，本体系中内切酶用量为30U(即浓度为0.6U/μL)时，样品和空白信号强度差值达到最大，因此本体系选定最佳酶用量为30U(即浓度为0.6U/μL)。但在18～35U(即浓度为0.36～0.7U/μL)范围内的酶用量，能够检测出显著的荧光强度，能够实现对目标miRNA(miR-373)的检测，优选的酶用量为20～35U(即浓度为0.4～0.7U/μL)，最佳酶用量为30U(即浓度为0.6U/μL)。

实施例5反应时间的考察

方法：

为了探究本体系的反应效率，有必要对反应时间进行考察，实时检测反应过程中荧光强度随时间的变化。随着反应的进行，观察体系的荧光强度随时间变化。

具体操作方法为：将Y-11、Y-21、LP、Nt.BstNBI、Nt.BstNBI缓冲液和目标miRNA(miR-373)混合，在45℃的条件下检测荧光强度随时间变化情况。

结果：

如图5所示。随着反应的进行，体系的荧光强度逐渐增加，然后达到平台不再变化。体系荧光强度在3000s左右达到最大值，说明体系的反应效率较高。为了保证反应效率，优选反应时间为30～70min，最佳反应时间为60min。

实施例6特异性检测

方法：

为了对本方法的特异性进行验证，考察了非目标物miRNA的检测情况下方法特异性。在miRNA浓度均为固定的条件下，检测每组实验荧光强度值。

为了对本方法的特异性进行验证，以检测miR-373为模型，考察了m1-373、m2-373、m3-373、m4-373、miR-27a和let-7a分别对miR-373检测的影响，各miRs的具体序列如表1所示。

结果：

如图6所示，来自于同浓度检测miR-373的信号(F/F₀-1)明显高于检测m1-373、m2-373、m3-373、m4-373的信号。另检测miR-27a和let-7a的信号几乎没有，表明该方法的特异性好能够用于多种miRNA的同时检测。

实施例7一种同时检测多种miRNAs的方法

方法：

根据miR-27a、let-7a序列设计对应的Y-12、Y-22、Y-13、Y-23、LP2和LP3探针(各探针的具体序列如表1所示)，检测本发明方法同时检测多种miRNA的能力。将待检测的多目标miRNAs对应的固定浓度Y-12、Y-22、Y-13、Y-23探针，LP探针，Nt.BstNBI和Nt.BstNBI缓冲液中混合，用DEPC水定容至50μL，置于基因扩增仪中反应一段时间，随即进行荧光光谱扫描测定荧光强度。具体操作方法如下：

miR-373+miR-27a+let-7a组：将同时含有miR-373、miR-27a、let-7a的待测样品中加入、Nt.BstNBI缓冲液、Y探针(Y11、Y21、Y12、Y22、Y13、Y23)以及LP探针(LP1、LP2、LP3)和Nt.BstNBI，用DEPC水定容至50μL。其中Nt.BstNBI的浓度为0.6U/μL，于45℃条件下反应1h，检测每个荧光通道荧光增长情况。

miR-373+miR-27a组：除了待测样品只含有miR-373、miR-27a，其他操作均同miR-373+miR-27a+let-7a组。

miR-27a+let-7a组：除了待测样品只含有miR-27a、let-7a，其他操作均同miR-373+miR-27a+let-7a组。

miR-373+let-7a组：除了待测样品只含有miR-373、let-7a，其他操作均同miR-373+miR-27a+let-7a组。

miR-373组：除了待测样品只含有miR-373，其他操作均同miR-373+miR-27a+let-7a组。

miR-27a组：除了待测样品只含有miR-27a，其他操作均同miR-373+miR-27a+let-7a组。

let-7a组：除了待测样品只含有let-7a，其他操作均同miR-373+miR-27a+let-7a组。

空白组：不加入任何一种miRNA，以空白组荧光强度为参比。

结果：

如图7所示，当只存在一种目标miRNA时，溶液中仅仅只有单个通道产生荧光响应；当溶液中三种miRNA同时存在时，三个通道的荧光均产生荧光响应。三种通道的荧光互不产生影响，证明本发明方法可以用于同时检测多种miRNA。

实施例8标准曲线的制备

方法：

对不同浓度的目标miRNA进行检测。根据体系的荧光信号强度随miRNA浓度的增加变化情况。制作体系的荧光信号强度变化比值与miRNA浓度在一定浓度范围之间线性关系，并计算方法检出限。利用本发明方法将Y探针、LP探针、Nt.BstNBI和Nt.BstNBI缓冲液混合，分别加入不同浓度的miR-373、miR-27a或let-7a，用DEPC水定容至50μL，置于基因扩增仪中反应一段时间，随即在相应通道进行荧光光谱扫描测定荧光强度。根据体系的荧光信号强度随miRNA浓度的增加变化情况。制作体系的荧光信号强度变化比值与miRNA浓度在一定浓度范围之间线性关系，并计算方法检出限。

结果：

每种通道下相应目标miRNA标准曲线如图8所示，从中可以看出本发明方法对miRNA具有很好的检测效果，其中对miR-373、miR-27a、let-7a的最低检测限均可达1pM。

实施例9准确度检测

方法：

利用本发明方法将固定浓度Y-1、Y-2探针，LP(荧光探针)，Nt.BstNBI以及3份不同浓度的细胞裂解液样品加入到Nt.BstNBI反应缓冲液中，用DEPC水定容至50μL，置于基因扩增仪中反应一段时间，随即进行荧光光谱扫描测定荧光强度，同时做加标回收实验。以检测miR-373为模型，评估方法准确度。将Y-11、Y-21、LP1、Nt.BstNBI以及3份不同浓度的细胞裂解液样品加入到Nt.BstNBI反应缓冲液中，用DEPC水定容至50μL，置于基因扩增仪中反应一段时间，随即进行荧光光谱扫描测定荧光强度，同时做加标回收实验。

结果：

检测结果如表2所示，检测细胞裂解液中检测miR-373的回收率在95.5％～106.6％，说明本发明方法具有很好的准确度。

表2.检测细胞裂解液样品中miR-373分析结果(n＝6)

实施例10一种同时检测细胞中多种miRNA的方法

方法：

将待检测的多目标miRNAs对应的固定浓度Y系列探针，LP系列探针，Nt.BstNBI和Nt.BstNBI缓冲液中混合，然后分别加入不同浓度的细胞裂解液样品，用DEPC水定容至50μL，置于基因扩增仪中反应一段时间，随即进行荧光光谱扫描测定荧光强度，根据荧光强度值以及相应标准曲线，计算每种细胞内多种目标miRNA浓度。

本实施例的具体操作：

1)分别取5mL悬浮的A549、MCF-7、HLF细胞，通过反复冻融方法(细胞样品在液氮保存3min，迅速放入90℃水浴5min使样品融化，然后再放入液氮保存3min，循环往复3次，细胞即可裂解，制得细胞裂解液)制成细胞裂解液样品。

2)分别将5μL细胞裂解液、Nt.BstNBI缓冲液、Y探针(Y11、Y21、Y12、Y22、Y13、Y23)以及LP探针(LP1、LP2、LP3)和Nt.BstNBI，用DEPC水定容至50μL。每种细胞裂解液样品做3个平行。其中Nt.BstNBI的浓度为0.6U/μL，于45℃条件下反应1h，检测每个荧光通道荧光增长情况，带入相应的标准曲线(见实施例8)计算相应miRNA含量。

结果：

多种miRNA在每种细胞裂解液的浓度的检测结果如图9所示，可见本发明能够实现对细胞中各miRNA含量的定量检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种基于DNA组装的恒温条件下同时检测多种microRNA的探针和方法

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaagugcuuc gauuuugggg ugu 23

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacaccccaa aagggagtca ccaatcaag 29

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaccctacct gactccctcg aagcacttcc 30

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgattgggg tagggt 16

<210> 5

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaagugcuuc guuuuugggg ugu 23

<210> 6

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaagugcuuc gaauuuuggg gugu 24

<210> 7

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaagugcuuc gauuuuuggg ugu 23

<210> 8

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaagugcuuc guuuuugcgg ugu 23

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<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aactatacaa cgagagtcaa tatatc 26

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gccaagctga ctctcctact acctca 26

<210> 12

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gatatataga gagt 14

<210> 13

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

agggcuuagc ugcuugugag ca 22

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgctcacaag ccggagtcag gccagcc 27

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gccaagctga ctccgagcta agccct 26

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggctggccgc ttggc 15

Claims

1.一种检测microRNA的探针组，所述探针组包括Y-1n、Y-2n和荧光探针LP；探针Y-1n、Y-2n、LP和目标microRNA能够自组装形成稳定的“工”字形结构；

荧光探针LP与目标microRNA不能配对结合；

荧光探针LP能被切刻内切酶切割；

荧光探针LP两端分别连有报告荧光基团、淬灭荧光基团。

2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述茎部序列的长度为7～9bp。

3.根据权利要求1或2所述的探针组，其特征在于，所述茎部序列中含有切刻内切酶的识别位点。

4.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，荧光探针LP的序列长度为10～18nt。

5.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，荧光探针LP被切刻内切酶切割后能从“工”字形结构中脱落。

6.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述切刻内切酶包括Nt.BstNBI、Nt.BsmAI、Nt.AlwI。

7.一种检测microRNA的方法，其特征在于，根据所有待检测目标microRNA的序列，对所有目标microRNA分别设计、合成权利要求1～6任一项所述的探针组，将设计、合成的所有探针组、切刻内切酶与待检测样品混合，于35～50℃反应，然后测定各探针组中所带荧光基团的荧光强度，根据荧光强度值以及相应标准曲线，计算样品中各目标microRNA浓度。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，于35～50℃反应的时间为30～70min。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，切刻内切酶在整个反应体系中的浓度为0.36～0.7U/μL。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当目标microRNA为miR-373、let-7a和miR-27a时，设计、合成的探针组如SEQ ID NO:2～4、SEQ ID NO:10～12、SEQ ID NO:14～16所示。