WO2023127918A1 - オリゴ核酸化合物の製造方法 - Google Patents

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WO2023127918A1
WO2023127918A1 PCT/JP2022/048385 JP2022048385W WO2023127918A1 WO 2023127918 A1 WO2023127918 A1 WO 2023127918A1 JP 2022048385 W JP2022048385 W JP 2022048385W WO 2023127918 A1 WO2023127918 A1 WO 2023127918A1
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WO
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formula
compound
defined above
nucleic acid
solution containing
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/048385
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English (en)
French (fr)
Inventor
真樹 野形
佳伸 柴
巧弥 下岡
健斗 横井
Original Assignee
日本新薬株式会社
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6527—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6533—Six-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a novel oligonucleic acid compound.
  • a solid-phase method and a liquid-phase method are known as methods for producing an oligonucleic acid compound.
  • the solid-phase method is a heterogeneous reaction method in which a nucleic acid is extended while a substrate supported on a solid-phase carrier and a solution containing a reaction reagent are brought into contact with each other.
  • a so-called batch method is used in which a reaction vessel with a filter is used and the reaction is carried out in the vessel (see, for example, Non-Patent Document 1 and Patent Document 1).
  • the liquid phase method is a homogeneous reaction method in which nucleic acids are elongated by reaction in a solution containing both substrates and reaction reagents.
  • the liquid phase method also uses a batch method in which the reaction is carried out in a container (see, for example, Patent Documents 2 and 3).
  • oligonucleic acid compounds In any of the solid-phase, liquid-phase, batch, and pseudo-flow synthesis methods, the chemical synthesis of oligonucleic acid compounds involves the removal of protective groups for oxygen atoms or amino groups on nucleic acid compounds. Nucleic acid is elongated by repeating the "deprotection” reaction and the “condensation” reaction that forms a bond between the deprotected oxygen or nitrogen atom and the phosphorus atom.
  • oligonucleic acid compounds When oligonucleic acid compounds are used as raw materials for pharmaceuticals, oligonucleic acid compounds must be of high purity. Therefore, it is necessary to improve the reaction efficiency and reaction rate while suppressing the formation of by-products in each step of the extension reaction. However, it was difficult because the solvents and reagents that can be used are limited.
  • An object of the present invention is to identify impurities that affect the purity of oligonucleic acid compounds and to provide a novel production method for controlling the generation of such impurities.
  • the present inventors In the elongation reaction of an oligonucleic acid compound, the present inventors have found that the deprotection reaction and the condensation reaction proceed efficiently and that the pretreatment of the condensation reaction proceeds efficiently by extensively studying the treatment of reaction raw materials and intermediates before condensation. The present inventors have completed the present invention by discovering that impurities produced by the method affect the purity of oligonucleic acid compounds.
  • the present invention relates to the following.
  • BP is independently an optionally protected nucleobase
  • R 1 is trityl, monomethoxytrityl, or dimethoxytrityl
  • X is O or S
  • Y is dialkylamino or alkoxy
  • n is any integer within the range of 1 to 99, preferably any integer within the range of 15 to 30, more preferably any integer within the range of 18 to 28 can be
  • L is hydrogen, acyl, or formula (IV): is a group represented by]
  • Formula (III) [Wherein, L, B P , X, Y, and n are as defined above]
  • halogen e.g., chloro, bromo, iodo
  • BP is independently an optionally protected nucleobase
  • R 1 is trityl, monomethoxytrityl, or dimethoxytrityl
  • X is O or S
  • Y is dialkylamino or alkoxy
  • n is any integer within the range of 1 to 99, preferably any integer within the range of 15 to 30, more preferably any integer within the range of 18 to 28.
  • L is hydrogen, acyl, or formula (IV): is a group represented by], Formula (II): [Wherein, L, B P , X, Y, R 1 and n are as defined above] a compound of removing R 1 from a compound of formula (II) by treatment with a solution containing an acid and a scavenger; Formula (III): [Wherein, L, B P , X, Y, and n are as defined above] a step of forming a compound of Formula (III): [Wherein, L, B P , X, Y, and n are as defined above] a compound of treating with a solution comprising an organic amine and an aprotic polar solvent, and formula (VIII): [Wherein, B P , X, Y, Z, and R 1 are as defined above] a compound of A method for producing a morpholino nucleic acid oligomer, comprising the step of treating with a solution containing an organic amine
  • BP is independently an optionally protected nucleobase
  • R 1 is trityl, monomethoxytrityl, or dimethoxytrityl
  • X is O or S
  • Y is dialkylamino or alkoxy
  • n is any integer within the range of 1 to 99, preferably any integer within the range of 15 to 30, more preferably any integer within the range of 18 to 28 can be
  • L is hydrogen, acyl, or formula (IV): is a group represented by]
  • ⁇ 9> The method for producing a morpholino nucleic acid oligomer according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the solution containing an acid and a scavenger is a solution containing trifluoroacetic acid and triisopropylsilane.
  • ⁇ 10> The solution according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, wherein the solution containing the acid and scavenger is a solution containing trifluoroacetic acid, triethylamine, triisopropylsilane, 2,2,2-trifluoroethanol, and dichloromethane.
  • the solution containing the acid and scavenger is a solution containing trifluoroacetic acid, triethylamine, triisopropylsilane, 2,2,2-trifluoroethanol, and dichloromethane.
  • ⁇ 11> The morpholino nucleic acid oligomer according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, wherein the solution containing an organic amine and an aprotic polar solvent is N-ethylmorpholine and 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone. Production method.
  • the solid support is swelling polystyrene, non-swelling polystyrene, PEG chain-linked polystyrene, fixed pore glass, oxalylated - fixed pore glass, TentaGel support - aminopolyethylene glycol derivatized support, or Poros - polystyrene/divinyl
  • the linker is short-chain alkylene, long-chain alkylene, amino-short-chain alkylene, amino-long-chain alkylene, diacyl-short-chain alkylene (e.g., succinyl), diacyl-long-chain alkylene, or dialkylenesulfonyl, ⁇ 1>-
  • the present invention enables economical, high-yield, high-purity production of morpholino nucleic acid oligomers.
  • the morpholino nucleic acid oligomer has the formula: [Wherein, Base represents a nucleic acid base, and X and Y are as described above] It is an oligomer having a group represented by as a constituent unit.
  • nucleobase can include, for example, adenine, guanine, hypoxanthine, cytosine, thymine, uracil, or modified bases thereof.
  • Such modified bases include, for example, pseudouracil, 3-methyluracil, dihydrouracil, 5-alkylcytosine (eg, 5-methylcytosine), 5-alkyluracil (eg, 5-ethyluracil), 5-halouracil (eg, , 5-bromouracil, 5-fluorouracil), 6-azapyrimidine, 6-alkylpyrimidine (e.g., 6-methyluracil), 2-thiouracil, 4-thiouracil, 4-acetylcytosine, 5-(carboxyhydroxymethyl)uracil , 5′-carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-carboxymethylaminomethyluracil, 1-methyladenine, 1-methylhypoxanthine, 2,2-dimethylguanine, 3-methylcytosine, 2-methyladenine, 2 -methylguanine, N 6 -methyladenine, 7-methylguanine, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, 5-methyl
  • One aspect of the invention is a compound of formula (I): [In the formula, Base, X, Y are as defined above; n is any integer within the range of 1-99, preferably any integer within the range of 15-30, more preferably any integer within the range of 18-28 ] is a method for producing a morpholino nucleic acid oligomer (hereinafter referred to as a morpholino nucleic acid oligomer (I)).
  • One aspect of the invention is a morpholino nucleic acid oligomer extension reaction wherein a compound of formula (II) is reacted with a compound of formula (VIII) to give a compound of formula (II'):
  • BP is independently an optionally protected nucleobase
  • R 1 is trityl, monomethoxytrityl, or dimethoxytrityl
  • X is O or S
  • Y is OH, lower alkoxy, mono-lower alkylamino, or di-lower alkylamino
  • Z is halogen (e.g.
  • n is any integer within the range of 1 to 99, preferably any integer within the range of 15 to 30, more preferably any integer within the range of 18 to 28 can be;
  • L is hydrogen, acyl, or formula (IV): is a group represented by], a method for producing a morpholino nucleic acid oligomer.
  • optionally protected nucleobases include, for example, both unprotected “nucleobases” and protected “nucleobases”, such as amino and/or hydroxyl are unprotected or protected, adenine, guanine, hypoxanthine, cytosine, thymine, uracil, and the like.
  • the amino group-protecting group is not particularly limited as long as it is used as a nucleic acid-protecting group, and specific examples include benzoyl, 4-methoxybenzoyl, acetyl, propionyl, and butyryl. , isobutyryl, phenylacetyl, phenoxyacetyl, 4-tert-butylphenoxyacetyl, 4-isopropylphenoxyacetyl, (dimethylamino)methylene. Benzoyl, acetyl, phenoxyacetyl, and 4-tert-butylphenoxyacetyl are preferred as amino-protecting groups.
  • hydroxyl-protecting groups include 2-cyanoethyl, 4-nitrophenethyl, phenylsulfonylethyl, methylsulfonylethyl, trimethylsilylethyl, and substituents substituted with 1 to 5 electron-withdrawing groups at any substitutable position.
  • phenyl diphenylcarbamoyl, dimethylcarbamoyl, diethylcarbamoyl, methylphenylcarbamoyl, 1-pyrrolidinylcarbamoyl, morpholinocarbamoyl, 4-(tert-butylcarboxy)benzyl, 4-[(dimethylamino)carboxy]benzyl, 4-( phenylcarboxy)benzyl (see, eg, WO 2009/064471 A1).
  • Preferred hydroxyl-protecting groups are 2-cyanoethyl, 4-nitrophenethyl and 4-(tert-butylcarboxy)benzyl. 2-cyanoethyl is preferable as the protective group for the hydroxyl group at the 6-position of guanine.
  • the protected nucleobase has, for example, the formula: [Wherein, Pg represents a protecting group] group.
  • the protected nucleobases are, for example, adenine with a benzoyl-protected amino group (A Bz ), cytosine with a benzoyl-protected amino group (C Bz ), 2-cyanoethyl and the amino group is protected with phenoxyacetyl (G CE ), and the like, but are not limited to these.
  • the solid-phase carrier is not particularly limited as long as it can be used for solid-phase reaction of nucleic acids.
  • the solid phase carrier is, for example, swelling polystyrene (for example, aminomethyl polystyrene resin 1% divinylbenzene crosslinked (200-400 mesh) (2.4-3.0 mmol/g) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • swelling polystyrene for example, aminomethyl polystyrene resin 1% divinylbenzene crosslinked (200-400 mesh) (2.4-3.0 mmol/g) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • AMINOMETHYLATED Polystyrene Resin / HCL [1 % of dibinyl venzene, 100 to 200 mesh], AMINOMETHYL RESIN [Polystyrene 1 % DIVINYLB ENZENE COPOLYMER, 200-400 MESH] (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.)
  • Non-swelling polystyrene e.g., Primer Support (manufactured by GE Healthcare)
  • PEG chain-bonded polystyrene e.g., NH2-PEG resin (manufactured by Watanabe Chemical Industry Co., Ltd.)
  • TentaGel resin controlled pore glass (CPG)
  • CPG controlled pore glass
  • oxalylated-constant pore glass see, for example, Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, 1527 (1991)
  • the linker can be a known linker used for linking nucleic acids or morpholino nucleic acid derivatives, such as short-chain alkylene, long-chain alkylene, amino-short-chain alkylene, amino - long chain alkylene, diacyl short chain alkylene (e.g. succinyl), diacyl long chain alkylene, dialkylenesulfonyl, preferably 3-aminopropyl, succinyl, 2,2'-diethanolsulfonyl, long chain alkylamino (LCAA) can be mentioned.
  • LCAA long chain alkylamino
  • L is represented by formula (IV): A group represented by the formula (IV-1): or a group represented by formula (IV-2): It may be a group represented by
  • Formula (II): [Wherein, L, B P , X, Y, R 1 and n are as defined above] can be prepared by methods known in the art (see, eg, WO2012/043730).
  • a step of producing a compound of formula (VI) (hereinafter referred to as compound (VI)) by reacting a compound of formula (V) with an acylating agent:
  • an acylating agent e.g., succinyl
  • diacyl long-chain alkylene e.g., succinyl
  • diacyl long-chain alkylene e.g., short-chain alkylene, long-chain alkylene, or dialkylenesulfonyl
  • R 6 is hydroxyl, halogen, or amino
  • This step can be carried out by introducing a known linker using compound (V) as a starting material.
  • formula (VIa): [Wherein, B P and R 1 are as defined above] can be prepared by carrying out a method known as an esterification reaction using compound (V) and succinic anhydride.
  • a condensing agent or the like can include
  • compound (VI) and a solid phase carrier can be used for production by a method known as condensation reaction.
  • the compound of formula (VIII) includes, for example, compounds listed in Table 1 below.
  • washing step before deprotection step> ⁇ (2) deprotection step>, ⁇ (3) Neutralization step>, ⁇ (4) Washing step after neutralization step>, ⁇ (5) Washing step before condensation>, ⁇ (6) condensation step>, ⁇ (7) Washing step 1 after condensation step> and ⁇ (8) Washing step 2 after condensation step>
  • a method for producing a morpholino nucleic acid oligomer comprising at least one step selected from the group consisting of
  • This step comprises formula (II): [wherein L, B P , X, Y, R 1 and n are as defined above], (1) Including treatment with a solution containing alcohols and/or halogen solvents.
  • the solution in step (1) is not particularly limited as long as it contains alcohols and/or halogen solvents, such as 2,2,2-trifluoroethanol, difluoroethanol, chloroform, and dichloromethane. At least one selected from the group consisting of can be used, preferably 2,2,2-trifluoroethanol and dichloromethane can be used.
  • alcohols and/or halogen solvents such as 2,2,2-trifluoroethanol, difluoroethanol, chloroform, and dichloromethane.
  • At least one selected from the group consisting of can be used, preferably 2,2,2-trifluoroethanol and dichloromethane can be used.
  • the solution of step (1) contains an alcohol relative to the halogen solvent, for example, 0.01 to 100 times by volume, preferably 0.1 to 2 times (v/v ) can be used in
  • the amount of the solution used in step (1) is not particularly limited. and preferably within the range of 2 to 100 times the amount.
  • the time of step (1) is not particularly limited, and is, for example, 0.1 minute to 24 hours, preferably 1 minute to 5 hours, more preferably 3 minutes to 1 hour.
  • the temperature in step (1) is not particularly limited, and is, for example, 0°C to 40°C, preferably 10°C to 35°C, more preferably 15°C to 30°C.
  • the number of times of step (1) is not particularly limited, and is, for example, 1 to 10 times, preferably 1 to 5 times.
  • This step comprises formula (II): [wherein L, B P , X, Y, R 1 and n are as defined above], (2) removing R 1 from the compound of formula (II) by treatment with a solution containing an acid and a scavenger; Formula (III): wherein L, B P , X, Y, and n are as defined above.
  • the acid can be, for example, hydrochloric acid, trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid, or trichloroacetic acid, preferably trifluoroacetic acid.
  • the amount of the acid used in (2) is, for example, in the range of 1 to 500-fold, preferably 2 to 100-fold, in terms of molar ratio relative to 1 mol of compound (II). is within.
  • the acid can be diluted with a suitable solvent to a concentration within the range of 0.1% to 30%.
  • the solvent to be used is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction. , or mixtures thereof.
  • organic amine can be used with the acid.
  • organic amine include, but are not limited to, triethylamine, N,N-diisopropylethylamine, N-ethylmorpholine, pyridine and the like, preferably triethylamine.
  • the amount of the organic amine used in (2) is, for example, 0.01 to 10 times, preferably 0.1 to 2 times, the molar ratio of 1 mol of the acid. within the range.
  • ⁇ Ratio of acid to organic amine in (2)> when a salt or mixture of an acid and an organic amine is used, it can include, for example, a salt or mixture of trifluoroacetic acid and triethylamine, for example, to 1.2 equivalents of trifluoroacetic acid A mixture of 1 equivalent of triethylamine can be mentioned.
  • scavengers are, for example, alcohols (including, for example, methanol, ethanol, 2,2,2-trifluoroethanol), thiols (mercaptoethanol, dithiothreitol, mercaptosuccinic acid), organosilicon selected from the group consisting of compounds (including, for example, triisopropylsilane, triethylsilane, trimethylsilane), and aromatic compounds (including, for example, 1-hydroxybenzotriazole, pyrrole, indole, anisole, and thioanisole) is at least one, preferably an organosilicon compound.
  • alcohols including, for example, methanol, ethanol, 2,2,2-trifluoroethanol
  • thiols mercaptoethanol, dithiothreitol, mercaptosuccinic acid
  • organosilicon selected from the group consisting of compounds (including, for example, triisopropylsilane, triethylsilane, tri
  • scavengers are, for example, methanol, ethanol, mercaptoethanol, 2,2,2-trifluoroethanol, triisopropylsilane, triethylsilane, trimethylsilane, 1-hydroxybenzotriazole, pyrrole, indole, anisole, and It is at least one selected from the group consisting of thioanisole, preferably one selected from the group consisting of triisopropylsilane and ethanol, more preferably triisopropylsilane.
  • the amount of the scavenger to be used is, for example, in a molar ratio of 0.1 to 1000 times, preferably 0.5 times, relative to 1 mol of compound (II). It is in the range of 1 to 100 times the amount, more preferably in the range of 1 to 20 times the amount.
  • reaction time is, for example, within the range of 0.1 minutes to 24 hours, preferably within the range of 1 minute to 3 hours.
  • reaction temperature is, for example, preferably within the range of 0°C to 40°C, more preferably within the range of 10°C to 35°C, and even more preferably within the range of 15°C to 30°C. be.
  • the number of times of step (2) is not particularly limited, and is, for example, 1 to 10 times, preferably 1 to 8 times.
  • Formula (II) [wherein L, B P , X, Y, R 1 and n are as defined above], (1) treatment with a solution containing alcohols and/or halogen solvents, followed by (2) treatment with a solution containing an acid and a scavenger to remove R1
  • Formula (III) [wherein L, B P , X, Y, and n are as defined above]. Steps (1) and (2) are as described above and can be combined as appropriate.
  • This process is Formula (III): [wherein L, B P , X, Y, and n are as defined above], (3) Including treatment with a solution containing a base and a solvent (alcohols and halogen solvents).
  • the base is not particularly limited as long as it does not affect the protecting group, and examples thereof include triethylamine, N,N-diisopropylethylamine, pyridine and the like, preferably N,N-diisopropylethylamine.
  • the amount of base used in (3) can be diluted with an appropriate solvent so as to have a concentration within the range of 0.1% (v/v) to 30% (v/v).
  • the amount of the solution used in step (3) is not particularly limited. and preferably within the range of 2 to 100 times the amount.
  • the solvent is at least one selected from the group consisting of alcohols, halogen solvents, polar solvents, ether solvents, and mixtures thereof, preferably mixtures of alcohols and halogen solvents.
  • alcohols are ethanol, isopropyl alcohol, 2,2,2-trifluoroethanol, etc., preferably isopropyl alcohol.
  • the halogen solvent is chloroform, dichloromethane, tetrachloroethane, tetrachloroethylene, and the like, preferably dichloromethane.
  • the polar solvent is acetonitrile, dimethylsulfoxide, and the like.
  • ether solvents are tetrahydrofuran, cyclopentyl methyl ether, and the like.
  • reaction time varies depending on the type of base used and the reaction temperature, but is, for example, within the range of 0.1 minute to 24 hours, preferably within the range of 1 minute to 5 hours.
  • reaction temperature is, for example, preferably in the range of 0° C. to 40° C., more preferably in the range of 1° C. to 35° C., still more preferably in the range of 3° C. to 20° C. be.
  • the number of times of step (3) is not particularly limited, and is, for example, 1 to 10 times, preferably 1 to 5 times.
  • It can be treated with a solution containing a base and a solvent (alcohols and halogen solvents). Steps (2) and (3) are as described above and can be combined as appropriate.
  • This step comprises formula (III): [wherein L, B P , X, Y, and n are as defined above], (4) including treatment with a solution containing a halogen solvent;
  • the solution in step (4) is not particularly limited as long as it contains a halogen solvent, for example, at least one selected from the group consisting of chloroform, dichloromethane, tetrachloroethane, and tetrachloroethylene. and is preferably dichloromethane.
  • a halogen solvent for example, at least one selected from the group consisting of chloroform, dichloromethane, tetrachloroethane, and tetrachloroethylene. and is preferably dichloromethane.
  • the amount of the solution used in step (4) is not particularly limited, and is, for example, in the range of 1 to 1000 times the weight of 1 g of compound (III). , preferably in the range of 2 to 100 times the amount.
  • the time of step (4) is not particularly limited, and is, for example, 0.1 minute to 2 hours, preferably 1 minute to 60 minutes, more preferably 3 minutes to 30 minutes.
  • the temperature in step (4) is not particularly limited, and is, for example, 0°C to 35°C, preferably 10°C to 30°C, more preferably 15°C to 25°C.
  • the number of times of step (4) is not particularly limited, and is, for example, 1 to 10 times, preferably 1 to 5 times.
  • Formula (II) [wherein L, B P , X, Y, R 1 and n are as defined above], (2) removing R 1 from the compound of formula (II) by treatment with a solution containing an acid and a scavenger;
  • Steps (1), (2), and (3) are as described above, and can be combined as appropriate.
  • This step comprises formula (III): [wherein L, B P , X, Y, and n are as defined above], (5) treatment with a solution containing an organic amine and an aprotic polar solvent;
  • the organic amine is, for example, at least one selected from the group consisting of N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, and N-ethylmorpholine, preferably N-ethylmorpholine.
  • the amount of the organic amine used in (5) is, for example, in the range of 1 to 1000 times, preferably 1 to 100 times the molar ratio of the compound of the formula (III) to 1 mol. It is within the double dose range.
  • the aprotic polar solvent is selected from the group consisting of, for example, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, N-methylpyrrolidone, N,N-dimethylformamide, tetrahydrofuran, or mixtures thereof. and preferably 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone.
  • the amount of the aprotic polar solvent used in (5) is, for example, in the range of 1 to 1000 times (v/v), preferably 3 times the volume of the organic amine. It is in the range of ⁇ 100 times the amount.
  • the amount of the solution used in step (5) is not particularly limited. within the range, preferably within the range of 1 to 50 times the amount.
  • the reaction time varies depending on the type of organic amine used and the reaction temperature, but is usually within the range of 0.1 minute to 2 hours, preferably within the range of 1 minute to 60 minutes.
  • reaction temperature is, for example, preferably in the range of 0°C to 100°C, more preferably in the range of 10°C to 50°C.
  • the number of times of step (5) is not particularly limited, and is, for example, 1 to 10 times, preferably 1 to 5 times.
  • This step is represented by formula (VIII): [wherein B P , X, Y, Z, and R 1 are as defined above], (6) treatment with a solution containing an organic amine and an aprotic polar solvent, for example dissolving in a mixed solution containing an organic amine and an aprotic polar solvent;
  • the organic amine is, for example, at least one selected from the group consisting of N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, and N-ethylmorpholine, preferably N-ethylmorpholine.
  • the amount of the organic amine to be used is, for example, in the range of 0.1 to 1000 times the molar ratio, preferably 1 time, relative to 1 mol of the compound of the formula (VIII). amount to 100 times the amount.
  • the aprotic polar solvent is selected from the group consisting of, for example, 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone, N-methylpyrrolidone, N,N-dimethylformamide, tetrahydrofuran, or mixtures thereof. and preferably 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone.
  • the amount of the aprotic polar solvent used in (6) is, for example, in the range of 1 to 1000 times (v/v), preferably 3 times the volume of the organic amine. It is in the range of ⁇ 100 times the amount.
  • the treatment time varies depending on the type of organic amine used and the reaction temperature, but it is usually in the range of 0.1 minute to 48 hours, preferably in the range of 1 minute to 24 hours.
  • the treatment temperature is, for example, preferably in the range of 0°C to 50°C, more preferably in the range of 10°C to 40°C. be.
  • This step further comprises formula (III): [Wherein, L, B P , X, Y, and n are as defined above] and in the presence of an organic amine, Formula (VIII): reacting a compound of [wherein X, Y, Z, B P and R 1 are as defined above], Formula (II''): wherein L, B P , X, Y, R 1 , and n are as defined above.
  • the compound of formula (VIII) is, for example, in a molar ratio of 1 to 10 times, preferably 1 time, relative to 1 mol of the compound of formula (III). It is within the range of the amount to 5 times the amount.
  • the organic amine is, for example, at least one selected from the group consisting of N,N-diisopropylethylamine, triethylamine, and N-ethylmorpholine, preferably N-ethylmorpholine.
  • the amount of the organic amine to be used is, for example, in the range of 0.1 to 1000-fold, preferably 1-fold, relative to 1 mol of the compound of the formula (VIII). It is in the range of ⁇ 100 times the amount.
  • the reaction time varies depending on the type of organic amine used and the reaction temperature, but it is usually within the range of 10 minutes to 48 hours, preferably within the range of 30 minutes to 24 hours.
  • the reaction temperature is, for example, preferably within the range of 0°C to 100°C, more preferably within the range of 10°C to 50°C.
  • the number of times of step (6) is not particularly limited, and is, for example, 1 to 3 times, preferably 1 time.
  • Formula (III) [wherein L, B P , X, Y, and n are as defined above], (5) treated with a solution containing an organic amine and an aprotic polar solvent, and formula (VIII): [wherein B P , X, Y, Z, and R 1 are as defined above], (6) after treatment with a solution containing an organic amine and an aprotic polar solvent, Formula (III): In the presence of a compound of [wherein L, B P , X, Y, and n are as defined above] and an organic amine, Formula (VIII): [wherein X, Y, Z, B P and R 1 are as defined above], Formula (II'): [wherein L, B P , X, Y, R 1 and n are as defined above]. Steps (5) and (6) are as described above and can be combined as appropriate.
  • This step is represented by the formula (II'): (7) treating the compound of wherein L, B P , X, Y, R 1 , and n are as defined above with a solution comprising a halogen solvent;
  • the cleaning agent in step (7) is not particularly limited as long as it contains a halogen solvent, for example, at least one selected from the group consisting of chloroform, dichloromethane, tetrachloroethane, and tetrachloroethylene. can be used, preferably dichloromethane.
  • the amount of the detergent to be used in the step (7) is not particularly limited. and preferably within the range of 2 to 100 times the amount.
  • the time of step (7) is not particularly limited, and is, for example, 0.1 minute to 24 hours, preferably 1 minute to 5 hours, more preferably 3 minutes to 1 hour.
  • the temperature in step (7) is not particularly limited, and is, for example, 0°C to 40°C, preferably 10°C to 35°C, more preferably 15°C to 30°C.
  • This step is represented by the formula (II'): (8) treating the compound of [wherein L, B P , X, Y, R 1 and n are as defined above] with a solution comprising an alcohol and/or a halogen solvent;
  • the solution in step (8) is not particularly limited as long as it contains alcohols and/or halogen solvents, such as 2,2,2-trifluoroethanol, difluoroethanol, chloroform, and dichloromethane. At least one selected from the group consisting of can be used, preferably 2,2,2-trifluoroethanol and dichloromethane can be used.
  • alcohols and/or halogen solvents such as 2,2,2-trifluoroethanol, difluoroethanol, chloroform, and dichloromethane.
  • At least one selected from the group consisting of can be used, preferably 2,2,2-trifluoroethanol and dichloromethane can be used.
  • the solution of the step (8) uses an alcohol at a ratio of, for example, 0.01-fold to 100-fold, preferably 0.1-fold to 2-fold (v/v) with respect to the halogen solvent. can do.
  • the amount of the solution used in step (8) is not particularly limited. within the range of 2 to 100 times the amount.
  • the time of step (8) is not particularly limited, and is, for example, 0.1 minute to 24 hours, preferably 1 minute to 5 hours, more preferably 3 minutes to 1 hour.
  • the temperature in step (8) is not particularly limited, and is, for example, 0°C to 40°C, preferably 10°C to 35°C, more preferably 15°C to 30°C.
  • the number of times of step (8) is not particularly limited, and is, for example, 1 to 10 times, preferably 1 to 5 times.
  • One aspect of the present invention is the extension reaction: Followinged by, ⁇ (A) protecting group removal step>, ⁇ (B) Step of removing protecting group of morpholino nitrogen> and ⁇ (C) Purification step>
  • a method for producing a morpholino nucleic acid oligomer comprising at least one step selected from
  • this step is a step of obtaining a compound of formula (I'') from a compound of formula (II''): [Wherein, Base, B P , R 1 , L, n, X and Y are as defined above] including.
  • this step is a step of obtaining a compound of formula (I) from a compound of formula (II''): [Wherein, Base, B P , R 1 , L, n, X and Y are as defined above] including.
  • this step is a step of obtaining a compound of formula (I'''') from a compound of formula (II''): [Wherein, B P , R 1 , L, n, X, and Y are as defined above] including.
  • this step is a step of obtaining a compound of formula (I'''') from a compound of formula (II''): [Wherein, B P , R 1 , L, n, X, and Y are as defined above] including.
  • L in the compound of formula (II'') and the optionally protected nucleobase protecting group in the compound of formula (II''); and L in the compound of formula (II''') and the formula ( The protecting group of the nucleobase which may be protected in the compound of II'') is deprotected according to the type or property of the solid phase carrier, linker, and protecting group to obtain the desired compound. can be manufactured. For example, according to the deprotection method described in "Green's PROTECTIVE GROUPS in ORGANIC SYNTHESIS, 4th Edition, 2006", all protecting groups possessed by the compound can be removed. If desired, the compound of interest can be subjected to further chemical structural transformations.
  • L in the compound of formula (II''); and L in the compound of formula (II''') can produce the desired compound by carrying out deprotection treatment depending on the type or property of the solid phase support and linker.
  • the target compound can be produced according to the method described herein or the deprotection method described in "Green's PROTECTIVE GROUPS in ORGANIC SYNTHESIS, 4th Edition, 2006", all protecting groups possessed by the compound can be removed. .
  • the compound of interest can be subjected to further chemical structural transformations.
  • the amount of (1) ammonia water, (2) ammonia water/ethanol or (3) methylamine-methanol solution/water mixed solution is, for example, 1 g of the compound of formula (II'') or
  • the weight ratio is in the range of 1 to 1000 times, preferably in the range of 3 to 100 times the weight of 1 g of the compound of formula (II''').
  • the reaction time varies depending on the reaction temperature and the like, but is in the range of 10 minutes to 120 hours, preferably in the range of 30 minutes to 72 hours, more preferably in the range of 5 hours to 48 hours. is within.
  • the reaction temperature is, for example, within the range of 5°C to 100°C, preferably within the range of 10°C to 70°C, and more preferably within the range of 15°C to 50°C.
  • this step comprises removing R 1 in the compound of formula (II') from the compound of formula (II') to obtain a compound of formula (II'''): [wherein, B P , L, n, R 1 , X and Y are as defined above. ] including.
  • this step comprises removing R 1 in the compound of formula (I') from the compound of formula (I') to obtain the compound of formula (I): [In the formula, Base, X, Y, n, and R 1 are as defined above. ] including.
  • the step of removing R 1 in the compound of I′) to obtain the compound of formula (I); and the conditions used in steps (1) to (4) above can be applied.
  • this step separates the morpholino nucleic acid oligomer (I) from the reaction mixture by conventional separation and purification means such as extraction, concentration, neutralization, filtration, centrifugation, precipitation, recrystallization, C1 to C18 . Isolated by using means such as reversed phase column chromatography, cation exchange column chromatography, anion exchange column chromatography, gel filtration column chromatography, high performance liquid chromatography, dialysis, ultrafiltration, etc. alone or in combination (see, eg, WO 1991/09033 A1).
  • a mixed solution of, for example, 20 mM triethylamine/acetic acid buffer and acetonitrile can be used as an elution solvent.
  • a mixed solution of 1 M saline and 10 mM sodium hydroxide aqueous solution or 0.3 M of 50 mM phosphate buffer Saline can be used.
  • the production method of the present invention includes ⁇ (2) deprotection step>.
  • the production method of the present invention includes ⁇ (2) deprotection step> and ⁇ (3) neutralization step>. including.
  • the production method of the present invention includes ⁇ (2) deprotection step>, ⁇ (3) neutralization step>, and ⁇ (4) washing step after neutralization step>. including.
  • the production method of the present invention includes ⁇ (5) washing step before condensation> and ⁇ (6) condensation step>.
  • the production method of the present invention includes ⁇ (5) washing step before condensation>, ⁇ (6) condensation step>, and ⁇ (7) washing step 1 after condensation step> and/or ⁇ (8) Washing step 2> after the condensation step.
  • the production method of the present invention includes ⁇ (2) Deprotection step>, ⁇ (5) Washing step before condensation>, and ⁇ (6) Condensation step>.
  • the production method of the present invention includes ⁇ (2) deprotection step>, ⁇ (3) neutralization step>, ⁇ (5) washing step before condensation>, and ⁇ (6) condensation step >.
  • the production method of the present invention comprises ⁇ (1) Washing step before deprotection step>, ⁇ (2) deprotection step>, ⁇ (3) Neutralization step>, ⁇ (4) Washing step after neutralization step>, ⁇ (5) Washing step before condensation>, ⁇ (6) condensation step>, ⁇ (7) Washing step 1 after condensation step> and ⁇ (8) Washing step 2 after condensation step> including.
  • the production method of the present invention does not include ⁇ (5) washing step before condensation>.
  • the production method of the present invention comprises ⁇ (1) Washing step before deprotection step>, ⁇ (2) deprotection step>, ⁇ (3) Neutralization step>, ⁇ (4) Washing step after neutralization step>, ⁇ (6) condensation step>, ⁇ (7) Washing step 1 after condensation step> and ⁇ (8) Washing step 2 after condensation step> including.
  • the production method of the present invention optionally does not include a ⁇ capping step>.
  • formula (I) The morpholino nucleic acid oligomer of [wherein Base, X, Y, and n are as defined above] is disclosed in, for example, , WO2021/132591, WO2021/172498, etc.) or a phosphorodiamidate mopholino oligomer (PMO) that can be recognized by a person skilled in the art based on the description in the international publication, preferably human dystrophin gene 51, 53 , 45th, 55th, 44th, and 50th exons. No.: 2055732-84-6).
  • formula (I-1) Morpholino nucleic acid oligomers [wherein Base, X, Y, and n are as defined above] are disclosed, for example, in International 057350, WO2014/144978, WO2014/153240, etc.) or a phosphorodiamidate mopholino oligomer (PMO) that can be recognized by a person skilled in the art based on the description in the international publication, preferably 51 of the human dystrophin gene, A phosphorodiamidate mopholino oligomer (PMO) capable of skipping at least one selected from the group consisting of 53rd, 45th, 55th, 44th and 50th exons, specifically Eteplirsen (WO2006/000057, WO2010/050801 , see WO2014/144978; CAS Registry Number: 1173755-55-9), Golodirsen (see WO2001/083740, WO2006/000057; CAS Registry Number:
  • the morpholino nucleic acid oligomer obtained by the production method of the present invention has the formula (I-2): [wherein Base, X, Y and n are as defined above].
  • Reference Example 1 Morpholino Monomer Compounds Table 2 shows structural formulas and abbreviations of morpholino monomer compounds.
  • a p , C p , and T p were either commercially available or prepared by methods commonly used in the art (see WO2008/008113).
  • G CE and G POB were prepared by methods commonly used in the art (see WO2012/043730, WO2009/064471).
  • UV measurement conditions Equipment: U-2910 (Hitachi, Ltd.) Solvent: methanesulfonic acid Wavelength: 409 nm ⁇ value: 45000
  • the number of extension reaction synthesis cycles was defined as the number corresponding to the chain length to be synthesized.
  • the amount of the morpholino monomer compound is 1.3 to 2.2 relative to the oligomer obtained in the immediately preceding extension reaction synthesis cycle so that the base sequence of the morpholino nucleic acid oligomer is 5′-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3′. Used in molar equivalents.
  • wash solution 1 30% 2,2,2-trifluoroethanol (TFE)/dichloromethane (DCM) (30% TFE in DCM) was used.
  • wash solution 2 DCM was used.
  • washing solution 3 the pretreatment solution 1 described later was used.
  • Deprotection solution 1 was a mixture of trifluoroacetic acid (1.2 eq) and triethylamine (1 eq) to 5% (w/v) with 1% (v/v) triisopropylsilane (TIPS). and dissolved in a DCM solution containing 20% (v/v) TFE.
  • IPA isopropyl alcohol
  • DIPEA N,N-diisopropylethylamine
  • DCM 353:75:1065 (v/v) ratio
  • pretreatment liquid 1 a mixture of 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (DMI) containing N-ethylmorpholine (NEM) was used (5-6% NEM solution (v/v) in DMI). .
  • DMI 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone
  • NEM N-ethylmorpholine
  • a p , C p , T p , and G CE listed in Table 1 were used as morpholino monomer compounds.
  • a morpholino monomer compound was dissolved in pretreatment liquid 1 to prepare a 0.10 to 0.14 M morpholino monomer compound solution (condensation solution 1) in pretreatment liquid 1, which was used as condensation solution 1.
  • step 5 After step 4, wash solution 3 (5.3% NEM solution in DMI (v/ v)) was added, stirred for 5 minutes and the solution in the reaction vessel was drained. 25 mL of Wash Solution 3 was then added to the reaction vessel, stirred for 5 minutes, and the solution was drained.
  • step 6 After step 5, 25 mL of condensation solution 1 (0.12 M G CE solution in pretreatment solution 1) was added to the reaction vessel and stirred for 18 hours.
  • step 7 After step 6, the solution in the reaction vessel was drained. Subsequently, 50 mL of Wash Solution 2 was added to the reaction vessel, stirred for 5 minutes, and the solution in the reaction vessel was drained.
  • Example 2 1. Extension reaction 4- ⁇ [(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oxopyrimidin-1-yl)-4-tritylmorpholin-2-yl]methoxy ⁇ -4 supported on aminomethyl polystyrene resin - 3.0 g (1.5 mmol) of oxobutanoic acid (synthesized in the same manner as in Reference Example 3) was transferred to the reactor, and the synthesis cycle of Table 4 was started. The number of extension reaction synthesis cycles was defined as the number corresponding to the chain length to be synthesized.
  • the amount of the morpholino monomer compound is 1.3 to 2.2 relative to the oligomer obtained in the immediately preceding extension reaction synthesis cycle so that the base sequence of the morpholino nucleic acid oligomer is 5′-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3′.
  • the reactor was purged with nitrogen gas. Specifically, after step 4, after the liquid was drained, a nitrogen balloon was attached to the lower part of the filter of the filter reactor, the cock was opened, and nitrogen gas was introduced twice.
  • wash solution 1 30% 2,2,2-trifluoroethanol (TFE)/dichloromethane (DCM) (30% TFE in DCM) was used.
  • DCM diichloromethane
  • Deprotection solution 1 was a mixture of trifluoroacetic acid (1.2 eq) and triethylamine (1 eq) to 5% (w/v) with 1% (v/v) triisopropylsilane (TIPS). and dissolved in a DCM solution containing 20% (v/v) TFE.
  • IPA isopropyl alcohol
  • DIPEA N,N-diisopropylethylamine
  • DCM 353:75:1065 (v/v) ratio
  • a p , C p , T p , and G CE listed in Table 1 were used as morpholino monomer compounds.
  • the morpholino monomer compound was dissolved in a 5-6% DIPEA solution (v/v) in DMI to prepare a 0.10-0.13 M morpholino monomer compound solution (condensation solution 2) and used as condensation solution 2.
  • capping solution 1 a mixture of acetic anhydride/DIPEA/DCM (ratio 0.5:1.25:98.25 (v/v)) was used.
  • step 2 After step 1, 45 mL of deprotection solution 1 was added to an aminomethyl polystyrene resin supporting a 17-mer oligomer whose base sequence was 5′-CCTCCGGTTCTGAAGGT-3′ and whose ends were protected with a trityl group. Add, stir for 5 minutes, and drain the solution in the reaction vessel. This process was repeated 5 more times.
  • step 3 After Step 2, 50 mL of Neutralization Solution 1 was added to the reaction vessel, stirred for 5 minutes, and the solution in the reaction vessel was drained. This process was repeated two more times.
  • step 4 After step 3, 50 mL of Wash Solution 2 was added to the reaction vessel, stirred for 5 minutes, and the solution in the reaction vessel was drained. This process was repeated one more time.
  • step 5 After step 4, after purging the reaction vessel with nitrogen, 25 mL of condensation solution 2 (0.12 M G CE solution in 5.3% DIPEA solution (v/v) in DMI) was added, and 6 Stirred for an hour.
  • step 6 After step 5, the solution in the reaction vessel was drained. 50 mL of Wash Solution 2 was then added to the reaction vessel, stirred for 5 minutes, and the solution was drained.
  • step 7 After step 6, the solution in the reaction vessel was drained. 50 mL of Capping Solution 1 was then added to the reaction vessel, stirred for 10 minutes, and the solution was drained.
  • each condensation step 2.0 to 3.0 of the morpholino monomer compound is added to the oligomer obtained in the immediately preceding extension reaction synthesis cycle so that the base sequence of the morpholino nucleic acid oligomer is 5′-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3′. Used in molar equivalents.
  • wash solution 2 DCM was used.
  • cleaning solution 4 a pretreatment solution 2, which will be described later, was used.
  • Deprotection solution 2 was a mixture of trifluoroacetic acid (2 eq.) and triethylamine (1 eq.) to 3% (w/v), 1% (v/v) ethanol and 10% (v/v ) dissolved in a DCM solution containing TFE.
  • IPA/DIPEA/DCM 25:5:70 (v/v) ratio
  • a DIPEA/DMI mixture (10:90 (v/v) ratio) was used as the pretreatment liquid 2.
  • a p , C p , T p , and G CE listed in Table 1 were used as morpholino monomer compounds.
  • a morpholino monomer compound was dissolved in pretreatment liquid 2 to prepare a 0.16 M morpholino monomer compound solution (condensation solution 2) in pretreatment liquid 2 and used as condensation solution 2.
  • Test Example 1 Comparison of the Morpholino Nucleic Acid Oligomers Prepared in Examples 1 and 2 and the Morpholino Nucleic Acid Oligomer Prepared in Comparative Example 1
  • a morpholino nucleic acid oligomer having a nucleotide sequence of 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC-3' was synthesized by extension reaction.
  • Approximately 30 mg of each of the aminomethyl polystyrene resins supporting morpholino nucleic acid oligomers of Example 1 and Comparative Example 1 obtained by drying was placed in a reaction vessel, 0.75 mL of deprotection solution 1 was added, and the mixture was heated at room temperature. React for 40 minutes.
  • Deprotection Solution 1 was removed and the resin was washed with Neutralization Solution 1 and dichloromethane and dried under vacuum at room temperature. 28% aqueous ammonia-ethanol (4/1) was added to the dried resin and stirred at room temperature for 17 hours. The supernatant was diluted and subjected to HPLC (C18 ion pair analysis) to determine the purity of morpholino nucleic acid oligomers in the crude mixture. By comparing the morpholino nucleic acid oligomer prepared in Examples 1 and 2 with the morpholino nucleic acid oligomer prepared in Comparative Example 1, it was confirmed that the purity of the morpholino nucleic acid oligomer was improved by the production methods of Examples 1 and 2. bottom.
  • Test Example 2 Comparison of condensation reaction yields of the morpholino nucleic acid oligomer prepared in Example 1 and the morpholino nucleic acid oligomer prepared in Comparative Example 1 Example 1-1. After each elongation cycle of the elongation reaction, a small amount of the morpholino nucleic acid oligomer-supported aminomethylpolystyrene resin was collected, a 40% methylamine-methanol solution/water mixture was added, and the resin was reacted at 65°C for 10 minutes. cut out from Similarly, 1. of Comparative Example 1.
  • Condensation reaction yield (%) 100 - peak area value of raw material * / (peak area value of raw material + main peak area value after condensation reaction)
  • the raw material refers to a morpholino nucleic acid oligomer having no trityl group at the end and having a chain length shorter by one residue than the chain length obtained by the condensation reaction.
  • TFE 2,2,2-trifluoroethanol
  • DCM dichloromethane
  • TFA trifluoroacetic acid
  • TEA triethylamine
  • TIPS triisopropylsilane
  • IPA isopropyl alcohol
  • DIPEA N,N-diisopropylethylamine
  • NEM N-ethylmorpholine
  • DMI 1,3 -dimethyl-2-imidazolidinone

Abstract

本発明は、次式で示されるモルホリノ核酸オリゴマーの伸長反応において、式（ＩＩ）の化合物を、酸及びスカベンジャーを含む溶液で処理し、式（ＩＩ）の化合物よりＲ１を除去して式（ＩＩＩ）の化合物とする工程を含む、モルホリノ核酸オリゴマーの製造方法（式中の各記号は明細中で定義したとおりである）に関する。

Description

オリゴ核酸化合物の製造方法
　本発明は、新規なオリゴ核酸化合物の製造方法に関する。
　オリゴ核酸化合物の製造方法として、固相法と液相法が知られている。固相法は固相担体に担持された基質と反応試薬を含む溶液とを接触させながら核酸を伸長する不均一系の反応方法である。固相法ではフィルター付きの反応容器を使用して、容器内で反応を行う、いわゆるバッチ法が使用される（例えば、非特許文献１、特許文献１を参照。）。また、核酸自動合成機（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡシンセサイザー）のように、固相担体をカラムに入れて、そのカラムに反応試薬を含む溶液を流すことで反応させる擬似的なフロー合成法も知られている。
　一方、液相法は基質と反応試薬の両方を含む溶液中で反応させることによって核酸を伸長する均一系の反応方法である。液相法も容器内で反応を行うバッチ法が使用される（例えば、特許文献２、特許文献３を参照。）。
　固相法、液相法、バッチ法、擬似的なフロー合成法のいずれの場合であっても、オリゴ核酸化合物の化学的合成法では、核酸化合物上の酸素原子またはアミノ基の保護基を除去する「脱保護」反応と、脱保護されて反応できるようになった酸素原子または窒素原子とリン原子との結合形成を行う「縮合」反応を何度も繰り返すことで核酸を伸長していく。
　オリゴ核酸化合物を医薬品原料として使用する場合、オリゴ核酸化合物は高い純度が要求されるため、伸長反応の各工程において、副生成物の生成を抑制しつつ、反応効率および反応速度を向上する必要があるものの、使用することができる溶媒や試薬が限定されているため困難であった。
国際公開公報第１９９１／０９０３３Ａ１ 国際公開公報第２０１４／０７７２９２Ａ１ 国際公開公報第２０１３／１２２２３６Ａ１
Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２４，２７８－２８４，１９９１
　オリゴ核酸化合物の伸長反応は、脱保護反応と縮合反応とを繰り返すため、複雑な不純物が生じる。本発明の目的は、オリゴ核酸化合物の純度に影響を与える不純物を特定し、その不純物の生成を制御する新規な製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、オリゴ核酸化合物の伸長反応において、縮合前の反応原料及び中間体の処理を鋭意検討することによって、効率よく脱保護反応及び縮合反応が進行すること、更に縮合反応の前処理により生じる不純物が、オリゴ核酸化合物の純度に影響を与えることを見出して、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下に関する。
＜１＞
　モルホリノ核酸オリゴマーの伸長反応：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 ［式中、
　ＢＰは、独立して、保護されていてもよい核酸塩基であり；
　Ｒ１は、トリチル、モノメトキシトリチル、又はジメトキシトリチルであり；
　Ｘは、Ｏ又はＳであり；
　Ｙは、ジアルキルアミノ、又はアルコキシであり；
　ｎは、１～９９の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、１５～３０の範囲内にある任意の整数であり、更に好ましくは、１８～２８の範囲内にある任意の整数であり；
　Ｌは、水素、アシル、又は式（ＩＶ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 で表される基である］において、
　式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］
の化合物を、
　酸及びスカベンジャーを含む溶液で処理して、式（ＩＩ）の化合物よりＲ１を除去して、
　式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
の化合物にする工程を含む、モルホリノ核酸オリゴマーの製造方法である。
＜２＞
　更に、式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
の化合物を、
　塩基、アルコール類、及びハロゲン溶媒を含む溶液で処理する工程を含む、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞
　更に、式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
の化合物を、
　有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液で処理する工程を含む、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞
　更に、式（ＶＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 ［式中、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びＲ１は、前記の通りであり、Ｚは、ハロゲン（例えば、クロロ、ブロモ、ヨード）である］
の化合物を、
　有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液で処理する工程を含む、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の製造方法。
＜５＞
　更に、式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
の化合物と、有機アミンの存在下、
　式（ＶＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 ［式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＢＰ及びＲ１は、前記の通りである］の化合物を反応させて、
　式（ＩＩ’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］
の化合物とする工程を含む、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の製造方法。
＜６＞
　更に、式（ＩＩ’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］
の化合物を
　アルコール類及び／又はハロゲン溶媒を含む溶液で処理する工程を含む、
＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の製造方法。
＜７＞
　モルホリノ核酸オリゴマーの伸長反応：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 ［式中、
　ＢＰは、独立して、保護されていてもよい核酸塩基であり；
　Ｒ１は、トリチル、モノメトキシトリチル、又はジメトキシトリチルであり；
　Ｘは、Ｏ又はＳであり；
　Ｙは、ジアルキルアミノ、又はアルコキシであり；
　ｎは、１～９９の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、１５～３０の範囲にある任意の整数であり、更に好ましくは、１８～２８の範囲内にある任意の整数であり；
　Ｌは、水素、アシル、又は式（ＩＶ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 で表される基である］において、
　式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］
の化合物を、
　酸及びスカベンジャーを含む溶液で処理して、式（ＩＩ）の化合物よりＲ１を除去して、
　式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
の化合物にする工程、
　式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
の化合物を、
　有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液で処理する工程、そして
式（ＶＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 ［式中、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、及びＲ１は、前記の通りである］
の化合物を、
　有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液で処理する工程
を含む、モルホリノ核酸オリゴマーの製造方法。
＜８＞
　モルホリノ核酸オリゴマーの伸長反応：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 ［式中、
　ＢＰは、独立して、保護されていてもよい核酸塩基であり；
　Ｒ１は、トリチル、モノメトキシトリチル、又はジメトキシトリチルであり；
　Ｘは、Ｏ又はＳであり；
　Ｙは、ジアルキルアミノ、又はアルコキシであり；
　ｎは、１～９９の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、１５～３０の範囲内にある任意の整数であり、更に好ましくは、１８～２８の範囲内にある任意の整数であり；
　Ｌは、水素、アシル、又は式（ＩＶ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 で表される基である］において、
　式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］
の化合物を、
　酸及びスカベンジャーを含む溶液で処理して、式（ＩＩ）の化合物よりＲ１を除去して、
　式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
の化合物にする工程、
　式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
の化合物を、
式（ＶＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 ［式中、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、及びＲ１は、前記の通りである］
の化合物を、
　有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液で処理する工程
を含む、モルホリノ核酸オリゴマーの製造方法。
＜９＞
　前記酸及びスカベンジャーを含む溶液が、トリフルオロ酢酸及びトリイソプロピルシランを含む溶液である、＜１＞～＜８＞のいずれかに記載のモルホリノ核酸オリゴマーの製造方法。
＜１０＞
　前記酸及びスカベンジャーを含む溶液が、トリフルオロ酢酸、トリエチルアミン、トリイソプロピルシラン、２，２，２－トリフルオロエタノール、及びジクロロメタンを含む溶液である、＜１＞～＜９＞のいずれかに記載のモルホリノ核酸オリゴマーの製造方法。
＜１１＞
　前記有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液が、Ｎ－エチルモルホリン及び１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンである、＜１＞～＜９＞のいずれかに記載のモルホリノ核酸オリゴマーの製造方法。
＜１２＞
　前記固相担体が、膨潤性ポリスチレン、非膨潤性ポリスチレン、ＰＥＧ鎖結合型ポリスチレン、定孔ガラス、オキサリル化－定孔ガラス、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体－アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体、又はＰｏｒｏｓ－ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーである、＜１＞～＜１１＞のいずれかに記載の製造方法。
＜１３＞
　前記リンカーが、短鎖アルキレン、長鎖アルキレン、アミノ－短鎖アルキレン、アミノ－長鎖アルキレン、ジアシル短鎖アルキレン（例えば、スクシニル）、ジアシル長鎖アルキレン、又はジアルキレンスルホニルである、＜１＞～＜１２＞のいずれかに記載の製造方法。
　本発明は、経済的で、収率よく、高純度で、モルホリノ核酸オリゴマーを製造することができる。
　以下に、本発明の詳細を説明する。
＜モルホリノ核酸オリゴマー＞
　本発明の一態様として、モルホリノ核酸オリゴマーは、式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 ［式中、Ｂａｓｅは、核酸塩基を表し、Ｘ、Ｙは、前記の通りである］
で表わされる基を構成単位とするオリゴマーである。
＜核酸塩基＞
　本発明の一態様において、「核酸塩基」は、例えば、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、チミン、ウラシルまたはそれらの修飾塩基を挙げることができる。係る修飾塩基としては、例えば、シュードウラシル、３－メチルウラシル，ジヒドロウラシル、５－アルキルシトシン（例えば、５－メチルシトシン）、５－アルキルウラシル（例えば、５－エチルウラシル）、５－ハロウラシル（例えば、５－ブロモウラシル、５－フルオロウラシル）、６－アザピリミジン、６－アルキルピリミジン（例えば、６－メチルウラシル）、２－チオウラシル、４－チオウラシル、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５’－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、１－メチルアデニン、１－メチルヒポキサンチン、２，２－ジメチルグアニン、３－メチルシトシン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メチルカルボニルメチルウラシル、５－メチルオキシウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸、２－チオシトシン、プリン、２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。但し、Ｂａｓｅに係る核酸塩基のアミノ基または水酸基は保護されていてもよい。
＜モルホリノ核酸オリゴマーの製造方法＞
　本発明の一態様は、式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 ［式中、
　　Ｂａｓｅ、Ｘ、Ｙは、前記と同義であり；
　　ｎは、１～９９の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、１５～３０の範囲にある任意の整数であり、更に好ましくは、１８～２８の範囲内にある任意の整数である］のモルホリノ核酸オリゴマー（以下、モルホリノ核酸オリゴマー（Ｉ）という。）の製造方法である。
　本発明の一態様は、式（ＩＩ）の化合物と式（ＶＩＩＩ）の化合物とを反応させて、式（ＩＩ’）の化合物を得る、モルホリノ核酸オリゴマーの伸長反応：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 ［式中、
　ＢＰは、独立して、保護されていてもよい核酸塩基であり；
　Ｒ１は、トリチル、モノメトキシトリチル、又はジメトキシトリチルであり；
　Ｘは、Ｏ又はＳであり；
　Ｙは、ＯＨ、低級アルコキシ、モノ低級アルキルアミノ、又はジ低級アルキルアミノであり；
　Ｚは、ハロゲン（例えば、クロロ、ブロモ、ヨード）であり；
　ｎは、１～９９の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、１５～３０の範囲内にある任意の整数であり、更に好ましくは、１８～２８の範囲内にある任意の整数であり；
　Ｌは、水素、アシル、又は式（ＩＶ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 で表される基である］を含む、モルホリノ核酸オリゴマーの製造方法である。
　本発明の一態様において、保護されていてもよい核酸塩基は、例えば、保護されていない「核酸塩基」および保護されている「核酸塩基」の両方を包含し、例えば、アミノ基および／または水酸基が保護されていないか、または保護されている、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、チミン、ウラシルなどが挙げられる。
　本発明の一態様において、アミノ基の保護基は、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、４－メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル、４－イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。アミノ基の保護基としては、ベンゾイル、アセチル、フェノキシアセチル、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチルが好ましい。水酸基の保護基としては、例えば、２－シアノエチル、４－ニトロフェネチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチル、トリメチルシリルエチル、置換可能な任意の位置で１～５個の電子吸引性基で置換されていてもよいフェニル、ジフェニルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、メチルフェニルカルバモイル、１－ピロリジニルカルバモイル、モルホリノカルバモイル、４－（ｔｅｒｔ－ブチルカルボキシ）ベンジル、４－［（ジメチルアミノ）カルボキシ］ベンジル、４－（フェニルカルボキシ）ベンジルを挙げることができる（例えば、国際公開公報第２００９／０６４４７１Ａ１を参照。）。水酸基の保護基としては、２－シアノエチル、４－ニトロフェネチル、４－（ｔｅｒｔ－ブチルカルボキシ）ベンジルが好ましい。グアニンの６位水酸基の保護基は、２－シアノエチルが好ましい。
　本発明の一態様において、保護されている核酸塩基は、例えば、下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 ［式中、Ｐｇは保護基を示す］
の基が挙げられる。
　本発明の一態様において、保護されている核酸塩基は、例えば、アミノ基がベンゾイルで保護されたアデニン（ＡＢｚ）、アミノ基がベンゾイルで保護されたシトシン（ＣＢｚ）、水酸基が２－シアノエチルで保護され、そしてアミノ基がフェノキシアセチルで保護されたグアニン（ＧＣＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の一態様において、固相担体は、例えば、核酸の固相反応に使用しうる担体であれば特に制限されないが、例えば、（ｉ）モルホリノ核酸オリゴマーの合成に使用しうる試薬（例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、Ｎ－エチルモルホリン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－メチルイミダゾール、ピリジン、無水酢酸、２，６－ルチジン、２，４－ルチジン、トリフルオロ酢酸）にほとんど溶解せず、（ｉｉ）モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬に対して化学的に安定であり、（ｉｉｉ）化学修飾ができ、（ｉｖ）望ましいモルホリノ核酸誘導体の装填ができ、（ｖ）処理中にかかる高圧に耐える十分な強度をもち、（ｖｉ）一定の粒径範囲と分布であるものが望ましい。
　本発明の一態様において、固相担体は、例えば、膨潤性ポリスチレン（例えば、アミノメチルポリスチレン樹脂  １％ジビニルベンゼン架橋（２００～４００メッシュ）（２．４～３．０ｍｍｏｌ／ｇ）（東京化成社製）、Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  Ｒｅｓｉｎ・ＨＣｌ［ジビニルベンゼン１％，１００～２００メッシュ］（ペプチド研究所社製）、Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ　Ｒｅｓｉｎ［Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　１％　Ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ　ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ，２００－４００　ｍｅｓｈ］（渡辺化学工業社製））、非膨潤性ポリスチレン（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｕｐｐｏｒｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製））、ＰＥＧ鎖結合型ポリスチレン（例えば、ＮＨ２－ＰＥＧ  ｒｅｓｉｎ（渡辺化学工業社製）、ＴｅｎｔａＧｅｌ  ｒｅｓｉｎ）、定孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ；ＣＰＧ）（例えば、ＣＰＧ社製）、オキサリル化－定孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１９，１５２７（１９９１）を参照）、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体－アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈｔら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３４，３３７３（１９９３）を参照）、Ｐｏｒｏｓ－ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーを挙げることができる。
　本発明の一態様において、リンカーは、核酸やモルホリノ核酸誘導体を連結するために使用される公知のものを用いることができるが、例えば、短鎖アルキレン、長鎖アルキレン、アミノ－短鎖アルキレン、アミノ－長鎖アルキレン、ジアシル短鎖アルキレン（例えば、スクシニル）、ジアシル長鎖アルキレン、ジアルキレンスルホニル、好ましくは、３－アミノプロピル、スクシニル、２，２’－ジエタノールスルホニル、長鎖アルキルアミノ（ＬＣＡＡ）を挙げることができる。
　本発明の一態様において、Ｌが、式（ＩＶ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 で表される基であって、式（ＩＶ－１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 で表される基であるか、又は式（ＩＶ－２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 で表される基であってもよい。
　本発明の一態様において、
　式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］
の化合物は、当該技術分野において公知の方法で調製することができる（例えば、ＷＯ２０１２／０４３７３０を参照）。
＜固相、リンカーへの結合＞
　本発明の一態様として、化合物（ＩＩ）において、ｎが１であり、Ｌが式（ＩＶ）で表される基である、式（ＩＩａ）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 ［式中、ＢＰ、Ｒ１、リンカー、固相担体は、前記の通りである］
の化合物（以下、化合物（ＩＩａ）という。）の製造工程を含むことができる。
　本発明の一態様として、式（Ｖ）の化合物にアシル化剤を作用させることによって、式（ＶＩ）の化合物（以下、化合物（ＶＩ）という。）を製造する工程：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 ［式中、
　ＢＰ及びＲ１、は、前記と同義であり、リンカーは、ジアシル短鎖アルキレン（例えば、スクシニル）、ジアシル長鎖アルキレン、短鎖アルキレン、長鎖アルキレン、又はジアルキレンスルホニルであり、；
　Ｒ６は、水酸基、ハロゲン、又は、アミノである］
を含むことができる。
　本工程は、化合物（Ｖ）を出発原料として、公知のリンカーの導入反応により実施することができる。
　本発明の一態様として、式（ＶＩａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 ［式中、ＢＰ、Ｒ１は、前記の通りである］
の化合物は、化合物（Ｖ）と無水コハク酸とを用いてエステル化反応として知られた方法を実施することにより製造する工程を含むことができる。
　本発明の一態様として、化合物（ＶＩ）に縮合剤等を作用させることによって、固相担体と反応させ、化合物（ＩＩａ）を製造する工程：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
 ［式中、ＢＰ、Ｒ６、Ｒ１、リンカー、固相担体は、前記の通りである］
を含むことができる。
　本工程は、化合物（ＶＩ）と固相担体とを用いて縮合反応として知られた方法により製造することができる。
＜原料＞
　本発明の一態様において、式（ＶＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 ［式中、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、及びＲ１は、前記の通りである］
の化合物は、市販されているか、当該技術分野において公知の方法で調製して使用することができる。
　本発明の一態様において、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、例えば、下記の表１に記載の化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000061
　本発明の一態様は、前記伸長反応において、
＜（１）脱保護工程前の洗浄工程＞、
＜（２）脱保護工程＞、
＜（３）中和工程＞、
＜（４）中和工程後の洗浄工程＞、
＜（５）縮合前の洗浄工程＞、
＜（６）縮合工程＞、
＜（７）縮合工程後の洗浄工程１＞、及び
＜（８）縮合工程後の洗浄工程２＞
からなる群より選択される少なくとも一つの工程を含む、モルホリノ核酸オリゴマーの製造方法である。
　以下に、（１）～（８）の工程を説明する。
＜（１）脱保護工程前の洗浄工程＞
　本工程は、式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］の化合物を、
（１）アルコール類及び／又はハロゲン溶媒を含む溶液で処理することを含む。
＜（１）の溶液＞
　一実施形態において、前記工程（１）の溶液は、アルコール類及び／又はハロゲン溶媒を含有すれば特に限定されることなく、例えば、２，２，２－トリフルオロエタノール、ジフルオロエタノール、クロロホルム、ジクロロメタンからなる群より選択される少なくとも一つを使用することができ、好ましくは２，２，２－トリフルオロエタノール及びジクロロメタンを使用することができる。
＜（１）の溶液＞
　一実施形態において、前記工程（１）の溶液は、アルコール類をハロゲン溶媒に対して、例えば、体積比で０．０１倍～１００倍、好ましくは、０．１倍～２倍（ｖ／ｖ）で使用することができる。
＜（１）の溶液の使用量＞
　一実施形態において、前記工程（１）の溶液の使用量は、特に限定されることなく、例えば、化合物（ＩＩ）１ｇに対して、重量比で、例えば１倍量～１０００倍量の範囲内であり、好ましくは、２倍量～１００倍量の範囲内である。
＜（１）の処理時間＞
　一実施形態において、前記工程（１）の時間は、特に限定されることなく、例えば、０．１分～２４時間、好ましくは１分～５時間、更に好ましくは３分～１時間である。
＜（１）の処理温度＞
　一実施形態において、前記工程（１）の温度は、特に限定されることなく、例えば、０℃～４０℃、好ましくは１０℃～３５℃、更に好ましくは１５℃～３０℃である。
＜工程（１）の回数＞
　一実施形態において、前記工程（１）の回数は、特に限定されることなく、例えば、１～１０回であり、好ましくは１～５回である。
＜（２）脱保護工程＞
　本工程は、式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］の化合物を、
（２）酸及びスカベンジャーを含む溶液で処理して、式（ＩＩ）の化合物よりＲ１を除去して、
　式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］の化合物にすることを含む。
＜（２）の酸＞
　一実施形態において、酸は、例えば、塩酸、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、又はトリクロロ酢酸を挙げることができ、好ましくはトリフルオロ酢酸である。
＜（２）の酸の使用量＞
　一実施形態において、酸の使用量は、例えば、化合物（ＩＩ）１モルに対して、モル比で１倍量～５００倍量の範囲内であり、好ましくは２倍量～１００倍量の範囲内である。
＜（２）の酸の濃度＞
　一実施形態において、酸は０．１％～３０％の範囲内の濃度になるように適切な溶媒で希釈して使用することもできる。
＜（２）の酸を希釈する溶媒＞
　一実施形態において、使用する溶媒は、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、トルエン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロピルアルコール、２，２，２－トリフルオロエタノールなど）、水、又はこれらの混合物を挙げることができる。
＜（２）の有機アミン＞
　一実施形態において、前記酸と一緒に、「有機アミン」を使用することができる。有機アミンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ－エチルモルホリン、ピリジンなどを挙げることができ、好ましくは、トリエチルアミンである。
＜（２）の有機アミンの使用量＞
　一実施形態において、有機アミンの使用量は、例えば、酸１モルに対して、モル比で０．０１倍量～１０倍量の範囲内であり、好ましくは、０．１倍量～２倍量の範囲内である。
＜（２）の酸と有機アミンの比＞
　一実施形態において、酸と有機アミンとの塩又は混合物を使用する場合には、例えば、トリフルオロ酢酸とトリエチルアミンの塩又は混合物を挙げることができ、例えば、トリフルオロ酢酸１．２当量に対してトリエチルアミン１当量を混合したものを挙げることができる。
＜（２）のスカベンジャー＞
　一実施形態において、スカベンジャーは、例えば、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、２，２，２－トリフルオロエタノールが挙げられる）、チオール類（メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、メルカプトコハク酸）、有機ケイ素化合物（例えば、トリイソプロピルシラン、トリエチルシラン、トリメチルシランが挙げられる）、及び芳香族化合物（例えば、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール、ピロール、インドール、アニソール、及びチオアニソールが挙げられる）からなる群より選択される少なくとも一つであり、好ましくは有機ケイ素化合物である。
＜（２）のスカベンジャー＞
　一実施形態において、スカベンジャーは、例えば、メタノール、エタノール、メルカプトエタノール、２，２，２－トリフルオロエタノール、トリイソプロピルシラン、トリエチルシラン、トリメチルシラン、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール、ピロール、インドール、アニソール、及びチオアニソールからなる群より選択される少なくとも一つであり、好ましくは、トリイソプロピルシラン及びエタノールからなる群より選択される一つであり、更に好ましくは、トリイソプロピルシランである。
＜（２）のスカベンジャーの使用量＞
　一実施形態において、スカベンジャーの使用量は、例えば、化合物（ＩＩ）１モルに対して、モル比で、例えば０．１倍量～１０００倍量の範囲内であり、好ましくは０．５倍量～１００倍量の範囲内であり、更に好ましくは１倍～２０倍量の範囲内である。
＜（２）の反応時間＞
　一実施形態において、反応時間は、例えば、０．１分～２４時間の範囲内であり、好ましくは、１分～３時間の範囲内である。
＜（２）の反応温度＞
　一実施形態において、反応温度は、例えば、０℃～４０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、１０℃～３５℃の範囲内であり、さらに好ましくは、１５℃～３０℃の範囲内である。
＜工程（２）の回数＞
　一実施形態において、前記工程（２）の回数は、特に限定されることなく、例えば、１～１０回であり、好ましくは１～８回である。
＜（１）脱保護前の洗浄と（２）脱保護の連続反応＞
　本発明の一実施形態では、式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］の化合物を、
（１）アルコール類及び／又はハロゲン溶媒を含む溶液で処理して、続いて、
（２）酸及びスカベンジャーを含む溶液で処理して、Ｒ１を除去して、
　式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］の化合物にすることができる。
　工程（１）及び（２）は、前記の記載の通りであり、適宜組み合わせることができる。
＜（３）中和工程＞
　本工程は、
　式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067

［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］の化合物を、
（３）塩基及び溶媒（アルコール類及びハロゲン溶媒）を含む溶液で処理することを含む。
＜（３）の塩基＞
　一実施形態において、塩基は、保護基に影響を与えなければ特に限定されないが、例えば、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ピリジンなどが挙げられ、好ましくはＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである。
＜（３）の塩基の使用量＞
　一実施形態において、塩基の使用量は、０．１％（ｖ／ｖ）～３０％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度になるように適切な溶媒で希釈して使用することもできる。
＜（３）の溶液の使用量＞
　一実施形態において、前記工程（３）の溶液の使用量は、特に限定されることなく、例えば、化合物（ＩＩＩ）１ｇに対して、重量比で、例えば１倍量～１０００倍量の範囲内であり、好ましくは、２倍量～１００倍量の範囲内である。
＜（３）の溶媒＞
　一実施形態において、溶媒は、アルコール類、ハロゲン溶媒、極性溶媒、エーテル系溶媒、及びこれらの混合物からなる群より選択される少なくとも一つであり、好ましくはアルコール類及びハロゲン溶媒の混合物である。
　一実施形態において、アルコール類は、エタノール、イソプロピルアルコール、２，２，２－トリフルオロエタノールなどであり、好ましくは、イソプロピルアルコールである。
　一実施形態において、ハロゲン溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラクロロエタン、及びテトラクロロエチレンなどであり、好ましくは、ジクロロメタンである。
　一実施形態において、極性溶媒は、アセトニトリル、ジメチルスルホキシドなどである。
　一実施形態において、エーテル系溶媒は、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテルなどである。
＜（３）の反応時間＞
　一実施形態において、反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、例えば、０．１分～２４時間の範囲内であり、好ましくは、１分～５時間の範囲内である。
＜（３）の反応温度＞
　一実施形態において、反応温度は、例えば、０℃～４０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、１℃～３５℃の範囲内であり、さらに好ましくは、３℃～２０℃の範囲内である。
＜工程（３）の回数＞
　一実施形態において、前記工程（３）の回数は、特に限定されることなく、例えば、１～１０回であり、好ましくは１～５回である。
＜（２）脱保護と（３）中和の連続反応＞
　本発明の一実施形態では、式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］の化合物を、
（２）酸及びスカベンジャーを含む溶液で処理して、Ｒ１を除去して、
　式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］の化合物とし、続いて
　式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］の化合物を、
（３）塩基及び溶媒（アルコール類及びハロゲン溶媒）を含む溶液で処理することができる。
　工程（２）及び（３）は、前記の記載の通りであり、適宜組み合わせることができる。
＜（４）中和工程後の洗浄工程＞
　本工程は、式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］の化合物を、
（４）ハロゲン溶媒を含む溶液で処理することを含む。
＜（４）の溶液＞
　一実施形態において、前記工程（４）の溶液は、ハロゲン溶媒を含有すれば特に限定されることなく、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラクロロエタン、及びテトラクロロエチレンからなる群より選択される少なくとも一つを使用することができ、好ましくはジクロロメタンである。
＜（４）の溶液の使用量＞
　一実施形態において、前記工程（４）の溶液の使用量は、特に限定されることなく、例えば、化合物（ＩＩＩ）１ｇに対して、重量比で１倍量～１０００倍量の範囲内であり、好ましくは、２倍量～１００倍量の範囲内である。
＜（４）の処理時間＞
　一実施形態において、前記工程（４）の時間は、特に限定されることなく、例えば、０．１分～２時間、好ましくは１分～６０分、更に好ましくは３分～３０分である。
＜（４）の処理温度＞
　一実施形態において、前記工程（４）の温度は、特に限定されることなく、例えば、０℃～３５℃、好ましくは１０℃～３０℃、更に好ましくは１５℃～２５℃である。
＜工程（４）の回数＞
　一実施形態において、前記工程（４）の回数は、特に限定されることなく、例えば、１～１０回であり、好ましくは１～５回である。
＜（２）脱保護、（３）中和、（４）中和後の洗浄の連続反応＞
　本発明の一実施形態では、式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］の化合物を、
　（２）酸及びスカベンジャーを含む溶液で処理して、式（ＩＩ）の化合物よりＲ１を除去して、
　式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］の化合物とし、続いて
　式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１及びｎは、前記の通りである］の化合物を、
（３）塩基及び溶媒（アルコール類及びハロゲン溶媒）を含む溶液で処理し、更に
（４）ハロゲン溶媒を含む溶液で処理することができる。
　工程（１）、（２）、（３）は、前記の記載の通りであり、適宜組み合わせることができる。
＜（５）縮合前の洗浄工程＞
　本工程は、式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］の化合物を、
（５）有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液で処理することを含む。
＜（５）の有機アミン＞
　一実施形態として、有機アミンは、例えば、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、及びＮ－エチルモルホリンからなる群より選択される少なくとも一つであり、好ましくはＮ－エチルモルホリンである。
＜（５）の有機アミンの使用量＞
　一実施形態として、有機アミンの使用量としては、前記式（ＩＩＩ）化合物１モルに対して、モル比で、例えば１倍量～１０００倍量の範囲内であり、好ましくは１倍量～１００倍量の範囲内である。
＜（５）の非プロトン性極性溶媒＞
　一実施形態として、非プロトン性極性溶媒は、例えば、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、又はこれらの混合物からなる群より選択される少なくとも一つであり、好ましくは１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンである。
＜（５）の非プロトン性極性溶媒の使用量＞
　一実施形態として、非プロトン性極性溶媒の使用量としては、例えば、有機アミンに対して、体積比で１倍量～１０００倍量（ｖ／ｖ）の範囲内であり、好ましくは３倍量～１００倍量の範囲内である。
＜（５）の溶液の使用量＞
　一実施形態において、前記工程（５）の溶液の使用量は、特に限定されることなく、例えば、化合物（ＩＩ）１ｇに対して、重量比で、例えば０．５倍量～１００倍量の範囲内であり、好ましくは、１倍量～５０倍量の範囲内である。
＜（５）の処理時間＞
　一実施形態として、反応時間は、使用する有機アミンの種類、反応温度によって異なるが、通常０．１分～２時間の範囲内であり、好ましくは、１分～６０分の範囲内である。
＜（５）の処理温度＞
　一実施形態として、反応温度は、例えば、０℃～１００℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、１０℃～５０℃の範囲内である。
＜工程（５）の回数＞
　一実施形態において、前記工程（５）の回数は、特に限定されることなく、例えば、１～１０回であり、好ましくは１～５回である。
＜（６）縮合工程＞
　本工程は、式（ＶＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
 ［式中、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、及びＲ１は、前記の通りである］の化合物を、
（６）有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液で処理すること、例えば有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む混合溶液に溶解させることを含む。
＜（６）の有機アミン＞
　一実施形態として、有機アミンは、例えば、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、及びＮ－エチルモルホリンからなる群より選択される少なくとも一つであり、好ましくはＮ－エチルモルホリンである。
＜（６）の有機アミンの使用量＞
　一実施形態として、有機アミンの使用量としては、例えば、前記式（ＶＩＩＩ）化合物１モルに対して、モル比で０．１倍量～１０００倍量の範囲内であり、好ましくは、１倍量～１００倍量の範囲内である。
＜（６）の非プロトン性極性溶媒＞
　一実施形態として、非プロトン性極性溶媒は、例えば、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、又はこれらの混合物からなる群より選択される少なくとも一つであり、好ましくは１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノンである。
＜（６）の非プロトン性極性溶媒の使用量＞
　一実施形態として、非プロトン性極性溶媒の使用量としては、例えば、有機アミンに対して、体積比で１倍量～１０００倍量（ｖ／ｖ）の範囲内であり、好ましくは３倍量～１００倍量の範囲内である。
＜（６）の処理時間＞
　一実施形態として、処理時間は、使用する有機アミンの種類、反応温度によって異なるが、通常０．１分～４８時間の範囲内であり、好ましくは、１分～２４時間の範囲内である。
＜（６）の処理温度＞
　一実施形態として、処理温度は、例えば、０℃～５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、１０℃～４０℃の範囲内である。
ある。
　本工程は、さらに式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
の化合物と、有機アミンの存在下、
　式（ＶＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
 ［式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＢＰ及びＲ１は、前記の通りである］の化合物を反応させて、
　式（ＩＩ’’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］の化合物とすることを含む。
　一実施形態として、前記式（ＶＩＩＩ）の化合物は、例えば、前記式（ＩＩＩ）の化合物１モルに対して、モル比で、１倍量～１０倍量の範囲内であり、好ましくは１倍量～５倍量の範囲内である。
　一実施形態として、有機アミンは、例えば、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、及びＮ－エチルモルホリンからなる群より選択される少なくとも一つであり、好ましくはＮ－エチルモルホリンである。
　一実施形態として、有機アミンの使用量としては、例えば、前記式（ＶＩＩＩ）化合物１モルに対して、モル比で０．１倍量～１０００倍量の範囲内であり、好ましくは１倍量～１００倍量の範囲内である。
　一実施形態として、反応時間は、使用する有機アミンの種類、反応温度によって異なるが、通常１０分～４８時間の範囲内であり、好ましくは、３０分～２４時間の範囲内である。
　一実施形態として、反応温度は、例えば、０℃～１００℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、１０℃～５０℃の範囲内である。
＜工程（６）の回数＞
　一実施形態において、前記工程（６）の回数は、特に限定されることなく、例えば、１～３回であり、好ましくは１回である。
＜洗浄、前処理、縮合の連続反応＞
　本発明の一実施形態では、式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］の化合物を、
（５）有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液で処理し、そして
　式（ＶＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
 ［式中、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、及びＲ１は、前記の通りである］の化合物を、
（６）有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液で処理した後、
　式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］の化合物と、有機アミンの存在下、
　式（ＶＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
 ［式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＢＰ及びＲ１は、前記の通りである］の化合物とを反応させて、
　式（ＩＩ’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］の化合物とすることができる。
　工程（５）、（６）は、前記の通りであり、適宜組み合わせることができる。
＜（７）縮合工程後の洗浄工程１＞
　本工程は、式（ＩＩ’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］の化合物を
（７）ハロゲン溶媒を含む溶液で処理することを含む。
＜（７）の溶液＞
　一実施形態において、前記工程（７）の洗浄剤は、ハロゲン溶媒を含有すれば特に限定されることなく、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラクロロエタン、及びテトラクロロエチレンからなる群より選択される少なくとも一つを使用することができ、好ましくはジクロロメタンである。
＜（７）の溶液の使用量＞
　一実施形態において、前記工程（７）の洗浄剤の使用量は、特に限定されることなく、例えば、化合物（ＩＩ’）１ｇに対して、重量比で、例えば、１倍量～１０００倍量の範囲内であり、好ましくは、２倍量～１００倍量の範囲内である。
＜（７）の処理時間＞
　一実施形態において、前記工程（７）の時間は、特に限定されることなく、例えば、０．１分～２４時間、好ましくは１分～５時間、更に好ましくは３分～１時間である。
＜（７）の処理温度＞
　一実施形態において、前記工程（７）の温度は、特に限定されることなく、例えば、０℃～４０℃、好ましくは１０℃～３５℃、更に好ましくは１５℃～３０℃である。
＜縮合、縮合後の洗浄の連続反応＞
　本発明の一実施形態では、（６）式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
の化合物と、有機アミンの存在下、
　式（ＶＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
 ［式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＢＰ及びＲ１は、前記の通りである］
の化合物を、反応させて、
　式（ＩＩ’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］の化合物とし、続いて、
（７）ハロゲン溶媒を含む溶液で処理することができる。
　工程（６）、（７）は、前記の通りであり、適宜組み合わせることができる。
＜（８）縮合工程後の洗浄工程２＞
　本工程は、式（ＩＩ’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］の化合物を
（８）アルコール類及び／又はハロゲン溶媒を含む溶液で処理することを含む。
＜（８）の溶液＞
　一実施形態において、前記工程（８）の溶液は、アルコール類及び／又はハロゲン溶媒を含有すれば特に限定されることなく、例えば、２，２，２－トリフルオロエタノール、ジフルオロエタノール、クロロホルム、ジクロロメタンからなる群より選択される少なくとも一つを使用することができ、好ましくは２，２，２－トリフルオロエタノール及びジクロロメタンを使用することができる。
＜（１）の溶液＞
　一実施形態において、前記工程（８）の溶液は、アルコール類をハロゲン溶媒に対して、例えば、０．０１倍～１００倍、好ましくは、０．１倍～２倍（ｖ／ｖ）で使用することができる。
＜（１）の溶液の使用量＞
　一実施形態において、前記工程（８）の溶液の使用量は、特に限定されることなく、例えば、化合物（ＩＩ’）１ｇに対して、重量比で、例えば１倍量～１０００倍量の範囲内であり、好ましくは、２倍量～１００倍量の範囲内である。
＜（８）の処理時間＞
　一実施形態において、前記工程（８）の時間は、特に限定されることなく、例えば、０．１分～２４時間、好ましくは１分～５時間、更に好ましくは３分～１時間である。
＜（８）の処理温度＞
　一実施形態において、前記工程（８）の温度は、特に限定されることなく、例えば、０℃～４０℃、好ましくは１０℃～３５℃、更に好ましくは１５℃～３０℃である。
＜工程（８）の回数＞
　一実施形態において、前記工程（８）の回数は、特に限定されることなく、例えば、１～１０回であり、好ましくは１～５回である。
＜縮合、縮合後の洗浄、連続反応＞
本発明の一実施形態では、（６）式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
の化合物と、
　式（ＶＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
 ［式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＢＰ及びＲ１は、前記の通りである］
の化合物とを、反応させて、
　式（ＩＩ’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
 ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］
の化合物とし、続いて、
（７）ハロゲン溶媒を含む溶液で処理し、更に
（８）アルコール類及び／又はハロゲン溶媒を含む溶液で処理することができる。
　工程（６）、（７）、（８）は、前記通りであり、適宜組み合わせることができる。
　本発明の一態様は、前記伸長反応：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
 に続いて、
＜（Ａ）保護基の除去工程＞、
＜（Ｂ）モルホリノ窒素の保護基の除去工程＞、及び
＜（Ｃ）精製工程＞
から選択される少なくも一つの工程を含む、モルホリノ核酸オリゴマーの製造方法である。
　以下に、工程（Ａ）～（Ｃ）について説明する。
＜（Ａ－１）保護基の除去工程＞
　一実施形態として、本工程は、式（ＩＩ’’）の化合物より、式（Ｉ’’）の化合物を得る工程：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
 ［式中、Ｂａｓｅ、ＢＰ、Ｒ１、Ｌ、ｎ、Ｘ、Ｙは、前記の通りである］
を含む。
＜（Ａ－２）保護基の除去工程＞
　一実施形態として、本工程は、式（ＩＩ’’’）の化合物より、式（Ｉ）の化合物を得る工程：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
 ［式中、Ｂａｓｅ、ＢＰ、Ｒ１、Ｌ、ｎ、Ｘ、Ｙは、前記の通りである］
を含む。
＜（Ａ－３）保護基の除去工程＞
　一実施形態として、本工程は、式（ＩＩ’’）の化合物より、式（Ｉ’’’’）の化合物を得る工程：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
 ［式中、ＢＰ、Ｒ１、Ｌ、ｎ、Ｘ、Ｙは、前記の通りである］
を含む。
＜（Ａ－４）保護基の除去工程＞
　一実施形態として、本工程は、式（ＩＩ’’’）の化合物より、式（Ｉ’’’’’）の化合物を得る工程：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097
 ［式中、ＢＰ、Ｒ１、Ｌ、ｎ、Ｘ、Ｙは、前記の通りである］
を含む。
　一実施形態として、
　式（ＩＩ’’）の化合物中のＬ及び式（ＩＩ’’）の化合物中の保護されていても良い核酸塩基の保護基；並びに
　式（ＩＩ’’’）の化合物中のＬ及び式（ＩＩ’’’）の化合物中の保護されていても良い核酸塩基の保護基
は、固相担体、リンカー、保護基の種類または性質に応じた脱保護処理を実施することにより、目的の化合物を製造することができる。例えば、「Ｇｒｅｅｎ’ｓ　ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ　ＧＲＯＵＰＳ　ｉｎ　ＯＲＧＡＮＩＣ　ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，第４版、２００６年」に記載されている脱保護方法に従い、化合物が有する全ての保護基を除去することができる。必要に応じて、該目的の化合物は更なる化学構造変換に付すことができる。
　一実施形態として、
　式（ＩＩ’’）の化合物中のＬ；並びに
　式（ＩＩ’’’）の化合物中のＬ
は、固相担体、リンカーの種類または性質に応じた脱保護処理を実施することにより、目的の化合物を製造することができる。
　更に、式（Ｉ’’’’）の化合物中のＢＰ及びＲ１；並びに
　式（Ｉ’’’’’）の化合物中のＢＰは、保護基の種類または性質に応じた脱保護処理を実施することにより、目的の化合物を製造することができる。
　例えば、本明細書の記載の方法や「Ｇｒｅｅｎ’ｓ　ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ　ＧＲＯＵＰＳ　ｉｎ　ＯＲＧＡＮＩＣ　ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，第４版、２００６年」に記載されている脱保護方法に従い、化合物が有する全ての保護基を除去することができる。必要に応じて、該目的の化合物は更なる化学構造変換に付すことができる。
　一実施形態として、例えば、（１）アンモニア水、（２）アンモニア水／エタノールまたは（３）メチルアミン－メタノール溶液／水の混合溶液で処理することにより、好ましくは（２）アンモニア水／エタノールの混合溶液で処理することにより、
　式（ＩＩ’’）の化合物中のＬ及び式（ＩＩ’’）の化合物中の保護されていても良い核酸塩基の保護基；並びに
　式（ＩＩ’’’）の化合物中のＬ及び式（ＩＩ’’’）の化合物中の保護されていても良い核酸塩基の保護基
を除去することができる。
　一実施形態として、（１）アンモニア水、（２）アンモニア水／エタノールまたは（３）メチルアミン－メタノール溶液／水の混合溶液の使用量としては、例えば、式（ＩＩ’’）の化合物１ｇ又は式（ＩＩ’’’）の化合物１ｇに対して、例えば、重量比で１倍量～１０００倍量の範囲内であり、好ましくは３倍量～１００の範囲内である。
　一実施形態として、反応時間は、反応温度等によって異なるが、１０分～１２０時間の範囲内であり、好ましくは３０分～７２時間の範囲内であり、より好ましくは５時間～４８時間の範囲内である。
　一実施形態として、反応温度は、例えば、５℃～１００℃の範囲内であり、好ましくは１０℃～７０℃の範囲内であり、より好ましくは１５℃～５０℃の範囲内である。
＜（Ｂ－１）モルホリノ窒素の保護基の除去工程＞
　一実施形態として、本工程は、式（ＩＩ’）の化合物より、式（ＩＩ’）の化合物中のＲ１を除去して、式（ＩＩ’’’）の化合物を得る工程：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000098
 ［式中、ＢＰ、Ｌ、ｎ、Ｒ１、Ｘ、Ｙは、前記の通りである。］
を含む。
＜（Ｂ－２）モルホリノ窒素の保護基の除去工程＞
　一実施形態として、本工程は、式（Ｉ’）の化合物より、式（Ｉ’）の化合物中のＲ１を除去して、式（Ｉ）の化合物を得る工程：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000099
 ［式中、Ｂａｓｅ、Ｘ、Ｙ、ｎ、Ｒ１は、前記の通りである。］
を含む。
　一実施形態として、
　式（ＩＩ’）の化合物より、式（ＩＩ’）の化合物中のＲ１を除去して、式（ＩＩ’’’）の化合物を得る工程；及び
　式（Ｉ’）の化合物より、式（Ｉ’）の化合物中のＲ１を除去して、式（Ｉ）の化合物を得る工程；及び
は、前記（１）～（４）の工程において使用した条件を適用することができる。
＜（１１）精製工程＞
　一実施形態として、本工程は、モルホリノ核酸オリゴマー（Ｉ）を反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、沈殿化、再結晶、Ｃ１からＣ１８の逆相カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析、限外ろ過などの手段を単独または組み合わせて用いることによって単離することを含む（例えば、国際公開公報第１９９１／０９０３３Ａ１を参照。）。
　一実施形態として、逆相クロマトグラフィーを用いて所望の化合物を精製する場合には、溶出溶媒として、例えば２０ｍＭのトリエチルアミン／酢酸緩衝液とアセトニトリルの混合溶液を使用することができる。
　一実施形態として、イオン交換クロマトグラフィーを用いて所望の化合物を精製する場合には、例えば、１Ｍの食塩水と１０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液の混合溶液または５０ｍＭのリン酸緩衝液の０．３Ｍの食塩水を使用することができる。
　本発明の一態様では、本発明の製造方法は、＜（２）脱保護工程＞を含む。
　本発明の一態様では、本発明の製造方法は、＜（２）脱保護工程＞及び＜（３）中和工程＞を含む。
を含む。
　本発明の一態様では、本発明の製造方法は、＜（２）脱保護工程＞、＜（３）中和工程＞、及び＜（４）中和工程後の洗浄工程＞を含む。
を含む。
　本発明の一態様では、本発明の製造方法は、＜（５）縮合前の洗浄工程＞及び＜（６）縮合工程＞を含む。
　本発明の一態様では、本発明の製造方法は、＜（５）縮合前の洗浄工程＞、＜（６）縮合工程＞、並びに＜（７）縮合工程後の洗浄工程１＞及び／又は＜（８）縮合工程後の洗浄工程２＞を含む。
　本発明の一態様では、本発明の製造方法は、＜（２）脱保護工程＞、＜（５）縮合前の洗浄工程＞、及び＜（６）縮合工程＞を含む。
　本発明の一態様では、本発明の製造方法は、＜（２）脱保護工程＞、＜（３）中和工程＞、＜（５）縮合前の洗浄工程＞、及び＜（６）縮合工程＞を含む。
　本発明の一態様では、本発明の製造方法は、
＜（１）脱保護工程前の洗浄工程＞、
＜（２）脱保護工程＞、
＜（３）中和工程＞、
＜（４）中和工程後の洗浄工程＞、
＜（５）縮合前の洗浄工程＞、
＜（６）縮合工程＞、
＜（７）縮合工程後の洗浄工程１＞、及び
＜（８）縮合工程後の洗浄工程２＞
を含む。
　本発明の一態様では、本発明の製造方法は、＜（５）縮合前の洗浄工程＞を含まない。
　本発明の一態様では、本発明の製造方法は、
＜（１）脱保護工程前の洗浄工程＞、
＜（２）脱保護工程＞、
＜（３）中和工程＞、
＜（４）中和工程後の洗浄工程＞、
＜（６）縮合工程＞、
＜（７）縮合工程後の洗浄工程１＞、及び
＜（８）縮合工程後の洗浄工程２＞
を含む。
　本発明の一態様では、本発明の製造方法は、場合により＜キャッピング工程＞を含まない。
　本発明のモルホリノ核酸オリゴマーの製造方法によれば、式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
 ［式中、Ｂａｓｅ、Ｘ、Ｙ、ｎは、前記の通りである］のモルホリノ核酸オリゴマー、式（Ｉ－１）:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
 ［式中、Ｂａｓｅ、Ｘ、Ｙ、ｎは、前記の通りである］のモルホリノ核酸オリゴマー、例えば、或いは、式（Ｉ－２）:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000102
 ［式中、Ｂａｓｅ、Ｘ、Ｙ、ｎは、前記の通りである］のモルホリノ核酸オリゴマー
を得ることができる。
　本発明の一態様において、式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
 ［式中、Ｂａｓｅ、Ｘ、Ｙ、ｎは、前記の通りである］のモルホリノ核酸オリゴマーは、例えば、国際公開公報（ＷＯ２０１２／０２９９８６、ＷＯ２０１３／１００１９０、ＷＯ２０１５／１３７４０９、ＷＯ２０１５／１９４５２０、ＷＯ２０１７／０４７７０７、ＷＯ２０２１／１３２５９１、ＷＯ２０２１／１７２４９８等）に記載されているか、または当該国際公開公報の記載に基づいて当業者が認識し得るｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ　ｍｏｐｈｏｌｉｎｏ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　（ＰＭＯ）であり、好ましくはヒトジストロフィン遺伝子の５１、５３、４５、５５、４４、及び５０番目のエクソンからなる群より選択される少なくとも一つをスキッピングし得るｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ　ｍｏｐｈｏｌｉｎｏ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　（ＰＭＯ）であり、具体的には、Ｖｉｌｔｅｐｓｏ（ＷＯ２０１２／０２９９８６を参照；ＣＡＳ登録番号：２０５５７３２－８４－６）が挙げられる。
　本発明の一態様において、式（Ｉ－１）:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000104
 ［式中、Ｂａｓｅ、Ｘ、Ｙ、ｎは、前記の通りである］のモルホリノ核酸オリゴマーは、例えば、国際公開公報（ＷＯ２００１／０８３７４０、ＷＯ２００６／００００５７、ＷＯ　２０１０／０４８５８６、ＷＯ２０１０／０５０８０１、ＷＯ２０１１／０５７３５０、ＷＯ２０１４／１４４９７８、ＷＯ２０１４／１５３２４０等）に記載されているか、または当該国際公開公報の記載に基づいて当業者が認識し得るｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ　ｍｏｐｈｏｌｉｎｏ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　（ＰＭＯ）であり、好ましくはヒトジストロフィン遺伝子の５１、５３、４５、５５、４４、及び５０番目のエクソンからなる群より選択される少なくとも一つをスキッピングし得るｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ　ｍｏｐｈｏｌｉｎｏ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　（ＰＭＯ）であり、具体的には、Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ（ＷＯ２００６／００００５７、ＷＯ２０１０／０５０８０１、ＷＯ２０１４／１４４９７８を参照；ＣＡＳ登録番号：１１７３７５５－５５－９）、Ｇｏｌｏｄｉｒｓｅｎ（ＷＯ２００１／０８３７４０、ＷＯ２００６／００００５７を参照；ＣＡＳ登録番号：１４２２９５９－９１－８）、Ｃａｓｉｍｅｒｓｅｎ（ＷＯ２００１／０８３７４０、ＷＯ２００６／００００５７、ＷＯ２０１１／０５７３５０を参照；ＣＡＳ登録番号：１４２２９５８－１９－７）が挙げられる。
　本発明の一態様において、本発明の製造方法により得られるモルホリノ核酸オリゴマーとしては、式（Ｉ－２）:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000105
 ［式中、Ｂａｓｅ、Ｘ、Ｙ、ｎは、前記の通りである］のモルホリノ核酸オリゴマーが挙げられる。
参考例１：モルホリノモノマー化合物
　モルホリノモノマー化合物の構造式と略称を表２に示す。Ａｐ、Ｃｐ、Ｔｐは、市販品を使用するか、または当該技術分野において通常使用される方法で調製した（ＷＯ２００８／００８１１３を参照）。ＧＣＥ及びＧＰＯＢは、当該技術分野において通常使用される方法で調製した（ＷＯ２０１２／０４３７３０、ＷＯ２００９／０６４４７１を参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000106
参考例２：４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（４－ベンズアミド－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸の調製
　４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（４－ベンズアミド－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸は、当該技術分野において通常使用される方法で調製した（ＷＯ２０１２／０４３７３０を参照）。
参考例３：アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（４－ベンズアミド－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸の調製
　アミノメチルポリスチレン樹脂（渡辺化学工業社製）１０．０ｇをピリジン１３０ｍＬに入れ、参考例２で調製した４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（４－ベンズアミド－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸１２．１ｇ、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１７．３ｇ、および４－ＤＭＡＰ２．７ｇを加え、ピリジン１０ｍＬで洗いこんだ。次いで、トリエチルアミン１５．３ｍＬ、およびピリジン２０ｍＬを加え、室温で１日間撹拌した。反応後、樹脂をろ取した。得られた樹脂をピリジン、ジクロロメタン、メタノール、テトラヒドロフランの順で洗浄した。得られた樹脂にテトラヒドロフラン１２５ｍＬ、２，６－ルチジン１５．６ｍＬ、ベンゾイルクロリド１２．７ｇを加え、室温で１時間撹拌した。樹脂をろ取し、テトラヒドロフラン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥し、１３．６ｇの標記化合物を得た。
　当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂１ｇ当たりのトリチルのモル量を４０９ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、５５０μｍｏｌ／ｇであった。
　ＵＶ測定条件
　機器：Ｕ－２９１０（日立製作所）
　溶媒：メタンスルホン酸
　波長：４０９ｎｍ
　ε値：４５０００
実施例１：オリゴマーの調製
　塩基配列が５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’である、モルホリノ核酸オリゴマーの合成
１．伸長反応
　アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（４－ベンズアミド－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸（参考例３）３．０ｇ（１．７ｍｍｏｌ）を反応槽に移し入れ、表３の合成サイクルを開始した。なお、伸長反応合成サイクル数は合成する鎖長に対応する数と定義した。モルホリノ核酸オリゴマーの塩基配列が５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’になるように、各縮合工程において、直前の伸長反応合成サイクルで得られたオリゴマーに対して、モルホリノモノマー化合物を１．３～２．２モル当量で使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000107
　洗浄溶液１として、３０％２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）／ジクロロメタン（ＤＣＭ）（ＤＣＭ中に３０％でＴＦＥを含有する）を使用した。
　洗浄溶液２として、ＤＣＭを使用した。
　洗浄溶液３として、後に述べる前処理液１を使用した。
　脱保護溶液１として、トリフルオロ酢酸（１．２当量）とトリエチルアミン（１当量）の混合物を５％（ｗ／ｖ）になるように、１％（ｖ／ｖ）のトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）と２０％（ｖ／ｖ）のＴＦＥを含有するＤＣＭ溶液で溶解したものを使用した。
　中和溶液１として、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）／Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）／ＤＣＭ（３５３：７５：１０６５（ｖ／ｖ）の比）を使用した。
　前処理液１として、Ｎ－エチルモルホリン（ＮＥＭ）を含む１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＩ）の混合物を使用した（ＤＭＩ中の５～６％ＮＥＭ溶液（ｖ／ｖ））。
　モルホリノモノマー化合物として、表１に記載のＡｐ、Ｃｐ、Ｔｐ、及びＧＣＥを用いた。モルホリノモノマー化合物を前処理液１に溶解し、前処理液１中の０．１０～０．１４Ｍモルホリノモノマー化合物溶液（縮合溶液１）を調製し、縮合溶液１として使用した。
＜塩基配列が５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧ－３’である１８ｍｅｒの調製におけるステップ５～７＞
ステップ５
　ステップ４の後、反応容器中の塩基配列が５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴ－３’である１７ｍｅｒのオリゴマーが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂に、洗浄溶液３（ＤＭＩ中の５．３％ＮＥＭ溶液（ｖ／ｖ））を２５ｍＬ加え、５分間撹拌し、そして反応容器中の溶液を排液した。続いて反応容器に洗浄溶液３を２５ｍＬ加え、５分間撹拌し、溶液を排液した。
　ステップ６
　ステップ５の後、反応容器に、縮合溶液１（前処理液１中の０．１２Ｍ　ＧＣＥ溶液）を２５ｍＬ加え、そして１８時間撹拌した。
　ステップ７
　ステップ６の後、反応容器中の溶液を排液した。続いて反応容器に洗浄溶液２を５０ｍＬ加え、５分間撹拌し、そして反応容器中の溶液を排液した。
２．乾燥工程
　上記で合成したモルホリノ核酸オリゴマーが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂をＤＣＭで２回洗浄して反応容器から回収し、６時間６０℃で減圧乾燥した。モルホリノ核酸オリゴマーが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂を１４．６ｇ得た。
実施例２
１．伸長反応
　アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（４－ベンズアミド－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸（参考例３と同様の方法で合成）３．０ｇ（１．５ｍｍｏｌ）を反応槽に移し入れ、表４の合成サイクルを開始した。なお、伸長反応合成サイクル数は合成する鎖長に対応する数と定義した。モルホリノ核酸オリゴマーの塩基配列が５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’になるように、各縮合工程において、直前の伸長反応合成サイクルで得られたオリゴマーに対して、モルホリノモノマー化合物を１．３～２．２モル当量で使用した。
　実施例２では、実施例１のステップ５に換えて窒素ガスで反応器を置換した。具体的には、ステップ４の後、排液を行った後に、フィルターリアクターのフィルター下部に窒素バルーンを装着し、コックを開き、窒素通気を２回実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000108
　洗浄溶液１として、３０％２，２，２－トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）／ジクロロメタン（ＤＣＭ）（ＤＣＭ中に３０％でＴＦＥを含有する）を使用した。
　洗浄溶液２として、ＤＣＭを使用した。
　脱保護溶液１として、トリフルオロ酢酸（１．２当量）とトリエチルアミン（１当量）の混合物を５％（ｗ／ｖ）になるように、１％（ｖ／ｖ）のトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）と２０％（ｖ／ｖ）のＴＦＥを含有するＤＣＭ溶液で溶解したものを使用した。
　中和溶液１として、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）／Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）／ＤＣＭ（３５３：７５：１０６５（ｖ／ｖ）の比）を使用した。
　モルホリノモノマー化合物として、表１に記載のＡｐ、Ｃｐ、Ｔｐ、及びＧＣＥを用いた。モルホリノモノマー化合物をＤＭＩ中の５～６％ＤＩＰＥＡ溶液（ｖ／ｖ）に溶解し、０．１０～０．１３Ｍモルホリノモノマー化合物溶液（縮合溶液２）を調製し、縮合溶液２として使用した。
　キャッピング溶液１として、無水酢酸／ＤＩＰＥＡ／ＤＣＭの混合物（０．５：１．２５：９８．２５（ｖ／ｖ）の比）を使用した。
＜塩基配列が５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧ－３’である１８ｍｅｒの調製におけるステップ２～７＞
　ステップ２
　ステップ１の後、反応容器中の塩基配列が５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴ－３’であり末端がトリチル基で保護されている、１７ｍｅｒのオリゴマーが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂に、脱保護溶液１を４５ｍＬ加え、５分間撹拌し、そして反応容器中の溶液を排液した。この工程をさらに５回繰り返した。
　ステップ３
　ステップ２の後、反応容器に、中和溶液１を５０ｍＬ加え、５分間撹拌し、そして反応容器中の溶液を排液した。この工程をさらに２回繰り返した。
　ステップ４
　ステップ３の後、反応容器に、洗浄溶液２を５０ｍＬ加え、５分間撹拌し、そして反応容器中の溶液を排液した。この工程をさらに１回繰り返した。
　ステップ５
　ステップ４の後、反応容器を窒素置換で置換した後、し、縮合溶液２（ＤＭＩ中の５．３％ＤＩＰＥＡ溶液（ｖ／ｖ）中の０．１２Ｍ　ＧＣＥ溶液）を２５ｍＬ加え、そして６時間撹拌した。
　ステップ６
　ステップ５の後、反応容器中の溶液を排液した。続いて反応容器に洗浄溶液２を５０ｍＬ加え、５分間撹拌し、そして溶液を排液した。
　ステップ７
　ステップ６の後、反応容器中の溶液を排液した。続いて反応容器にキャッピング溶液１を５０ｍＬ加え、１０分間撹拌し、そして溶液を排液した。
２．乾燥工程
　上記で合成したモルホリノ核酸オリゴマーが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂をＤＣＭで３回洗浄して反応容器から回収し、６時間６０℃で減圧乾燥した。モルホリノ核酸オリゴマーが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂を１１．７ｇ得た。
比較例１：オリゴマーの調製
　塩基配列が５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’であるモルホリノ核酸オリゴマーの合成
１．伸長反応
　参考例２と同様の方法にて調製した、アミノメチルポリスチレン樹脂に担持された４－｛［（２Ｓ，６Ｒ）－６－（４－ベンズアミド－２－オキソピリミジン－１－イル）－４－トリチルモルホリン－２－イル］メトキシ｝－４－オキソブタン酸（樹脂のローディング量は、４５８μｍｏｌ／ｇ）５０ｇ（２３ｍｍｏｌ）を反応槽に移し入れ、表５の合成サイクルを開始した。モルホリノ核酸オリゴマーの塩基配列が５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’になるように、各縮合工程において、直前の伸長反応合成サイクルで得られたオリゴマーに対して、モルホリノモノマー化合物を２．０～３．０モル当量で使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000109
　洗浄溶液２として、ＤＣＭを使用した。
洗浄溶液４として、後に述べる前処理液２を使用した。
　脱保護溶液２として、トリフルオロ酢酸（２当量）とトリエチルアミン（１当量）の混合物を３％（ｗ／ｖ）になるように、１％（ｖ／ｖ）のエタノールと１０％（ｖ／ｖ）のＴＦＥを含有するＤＣＭ溶液で溶解したものを使用した。
　中和溶液２として、ＩＰＡ／ＤＩＰＥＡ／ＤＣＭ（２５：５：７０（ｖ／ｖ）の比）を使用した。
　前処理液２として、ＤＩＰＥＡ／ＤＭＩの混合物（１０：９０（ｖ／ｖ）の比）を使用した。
　モルホリノモノマー化合物として、表１に記載のＡｐ、Ｃｐ、Ｔｐ、及びＧＣＥを用いた。モルホリノモノマー化合物を前処理液２に溶解し、前処理液２中の０．１６Ｍモルホリノモノマー化合物溶液（縮合溶液２）を調製し、そして縮合溶液２として使用した。
　キャッピング溶液として、無水酢酸／２，６－ルチジン／ＤＣＭの混合物（２０：３０：５０（ｖ／ｖ）の比）を使用した。
２．乾燥工程
　上記で合成したモルホリノ核酸オリゴマーが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂を反応容器から回収し、２日間室温で減圧乾燥した。モルホリノ核酸オリゴマーが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂を２５８．０ｇ得た。
試験例１　　実施例１及び実施例２で調製したモルホリノ核酸オリゴマーと、比較例１で調製したモルホリノ核酸オリゴマーとの比較
　塩基配列が５’－ＣＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＣ－３’であるモルホリノ核酸オリゴマーを伸長反応で合成し、乾燥して得られた実施例１及び比較例１のモルホリノ核酸オリゴマーが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂を、それぞれおよそ３０ｍｇずつ反応容器に入れ、脱保護溶液１を０．７５ｍＬ加えて室温で４０分間反応した。脱保護溶液１を除去し、樹脂を中和溶液１およびジクロロメタンで洗浄し、室温で減圧乾燥した。乾燥後の樹脂に２８％アンモニア水－エタノール（４／１）を加え、室温で１７時間撹拌した。上澄み液を希釈してＨＰＬＣ（Ｃ１８イオンペア分析）に供し、当該未精製の混合物中のモルホリノ核酸オリゴマーの純度を測定した。
　実施例１及び実施例２で調製したモルホリノ核酸オリゴマーと、比較例１で調製したモルホリノ核酸オリゴマーとの比較により、実施例１及び２の製造方法によって、モルホリノ核酸オリゴマーの純度が向上することを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000110
試験例２  実施例１で調製したモルホリノ核酸オリゴマーと、比較例１で調製したモルホリノ核酸オリゴマーとの縮合反応収率の比較
　実施例１の１．伸長反応の各伸長サイクル実施後に、モルホリノ核酸オリゴマーが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂を少量採取し、４０％メチルアミン－メタノール溶液／水混合液を添加して、６５℃で１０分間反応して樹脂から切り出した。同様に、比較例１の１．伸長反応の各伸長サイクル実施後に、モルホリノ核酸オリゴマーが担持されたアミノメチルポリスチレン樹脂を少量採取し、２８％アンモニア水－エタノール混合液を添加して５５℃で終夜反応して樹脂から切り出した。それぞれの上澄み液を希釈してＨＰＬＣ（Ｃ１８イオンペア分析）に供し、縮合反応収率を以下の式に従い算出した。
縮合反応収率（％）＝１００－原材料＊のピーク面積値÷（原材料のピーク面積値＋縮合反応後の主ピーク面積値）
＊原材料とは、末端にトリチル基を持たず、縮合反応により得られる鎖長よりも１残基短い鎖長のモルホリノ核酸オリゴマーをいう。
　実施例１は比較例１より、縮合反応収率が改善された。
＜略語＞
　ＴＦＥ：２，２，２－トリフルオロエタノール
　ＤＣＭ：ジクロロメタン
　ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
　ＴＥＡ：トリエチルアミン
　ＴＩＰＳ：トリイソプロピルシラン
　ＩＰＡ：イソプロピルアルコール
　ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
　ＮＥＭ：Ｎ－エチルモルホリン
　ＤＭＩ：１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン

Claims (13)

  1. 　モルホリノ核酸オリゴマーの伸長反応：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、
    　ＢＰは、独立して、保護されていてもよい核酸塩基であり；
    　Ｒ１は、トリチル、モノメトキシトリチル、又はジメトキシトリチルであり；
    　Ｘは、Ｏ又はＳであり；
    　Ｙは、ジアルキルアミノ、又はアルコキシであり；
    　ｎは、１～９９の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、１５～３０の範囲内にある任意の整数であり、更に好ましくは、１８～２８の範囲内にある任意の整数であり；
    　Ｌは、水素、アシル、又は式（ＩＶ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     で表される基である］において、
    　式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］
    の化合物を、
    　酸及びスカベンジャーを含む溶液で処理して、式（ＩＩ）の化合物よりＲ１を除去して、
    　式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
    の化合物にする工程を含む、モルホリノ核酸オリゴマーの製造方法。
  2. 　更に、式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
    の化合物を、
    　塩基、アルコール類、及びハロゲン溶媒を含む溶液で処理する工程を含む、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　更に、式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
    の化合物を、
    　有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液で処理する工程を含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　更に、式（ＶＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     ［式中、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びＲ１は、前記の通りであり、Ｚは、ハロゲンである］
    の化合物を、
    　有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液で処理する工程を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　更に、式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
    の化合物と、有機アミンの存在下、
    　式（ＶＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     ［式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＢＰ及びＲ１は、前記の通りである］の化合物を反応させて、
    　式（ＩＩ’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］
    の化合物とする工程を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　更に、式（ＩＩ’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］
    の化合物を
    　アルコール類及び／又はハロゲン溶媒を含む溶液で処理する工程を含む、
    請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　モルホリノ核酸オリゴマーの伸長反応：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     ［式中、
    　ＢＰは、独立して、保護されていてもよい核酸塩基であり；
    　Ｒ１は、トリチル、モノメトキシトリチル、又はジメトキシトリチルであり；
    　Ｘは、Ｏ又はＳであり；
    　Ｙは、ジアルキルアミノ、又はアルコキシであり；
    　ｎは、１～９９の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、１５～３０の範囲内にある任意の整数であり、更に好ましくは、１８～２８の範囲内にある任意の整数であり；
    　Ｌは、水素、アシル、又は式（ＩＶ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     で表される基である］において、
    　式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］
    の化合物を、
    　酸及びスカベンジャーを含む溶液で処理して、式（ＩＩ）の化合物よりＲ１を除去して、
    　式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
    の化合物にする工程、
    　式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
    の化合物を、
    　有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液で処理する工程、そして
    式（ＶＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     ［式中、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、及びＲ１は、前記の通りである］
    の化合物を、
    　有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液で処理する工程
    を含む、モルホリノ核酸オリゴマーの製造方法。
  8. 　モルホリノ核酸オリゴマーの伸長反応：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     ［式中、
    　ＢＰは、独立して、保護されていてもよい核酸塩基であり；
    　Ｒ１は、トリチル、モノメトキシトリチル、又はジメトキシトリチルであり；
    　Ｘは、Ｏ又はＳであり；
    　Ｙは、ジアルキルアミノ、又はアルコキシであり；
    　ｎは、１～９９の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、１５～３０の範囲内にある任意の整数であり、更に好ましくは、１８～２８の範囲内にある任意の整数であり；
    　Ｌは、水素、アシル、又は式（ＩＶ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     で表される基である］において、
    　式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
     ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、及びｎは、前記の通りである］
    の化合物を、
    　酸及びスカベンジャーを含む溶液で処理して、式（ＩＩ）の化合物よりＲ１を除去して、
    　式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
     ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
    の化合物にする工程、
    　式（ＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
     ［式中、Ｌ、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、及びｎは、前記の通りである］
    の化合物を、
    式（ＶＩＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
     ［式中、ＢＰ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、及びＲ１は、前記の通りである］
    の化合物を、
    　有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液で処理する工程
    を含む、モルホリノ核酸オリゴマーの製造方法。
  9. 　前記酸及びスカベンジャーを含む溶液が、トリフルオロ酢酸及びトリイソプロピルシランを含む溶液である、請求項１～８のいずれか一項に記載のモルホリノ核酸オリゴマーの製造方法。
  10. 　前記酸及びスカベンジャーを含む溶液が、トリフルオロ酢酸、トリエチルアミン、トリイソプロピルシラン、２，２，２－トリフルオロエタノール、及びジクロロメタンを含む溶液である、請求項１～９のいずれか一項に記載のモルホリノ核酸オリゴマーの製造方法。
  11. 　前記有機アミン及び非プロトン性極性溶媒を含む溶液が、Ｎ－エチルモルホリン及び１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、請求項１～９のいずれか一項に記載のモルホリノ核酸オリゴマーの製造方法。
  12. 　前記固相担体が、膨潤性ポリスチレン、非膨潤性ポリスチレン、ＰＥＧ鎖結合型ポリスチレン、定孔ガラス、オキサリル化－定孔ガラス、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体－アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体、又はＰｏｒｏｓ－ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のモルホリノ核酸オリゴマーの製造方法。
  13. 　前記リンカーが、短鎖アルキレン、長鎖アルキレン、アミノ－短鎖アルキレン、アミノ－長鎖アルキレン、ジアシル短鎖アルキレン（例えば、スクシニル）、ジアシル長鎖アルキレン、又はジアルキレンスルホニルである、請求項１～１２のいずれか一項に記載のモルホリノ核酸オリゴマーの製造方法。
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