ES2842527T3

ES2842527T3 - Métodos para crear y analizar bibliotecas codificadas por ADN

Info

Publication number: ES2842527T3
Application number: ES17163865T
Authority: ES
Inventors: Richard W Wagner
Original assignee: X Chem Inc
Current assignee: X Chem Inc
Priority date: 2009-02-13
Filing date: 2010-02-16
Publication date: 2021-07-14
Anticipated expiration: 2030-02-16
Also published as: US9359601B2; WO2010094036A1; SG2014011381A; EP3653763A1; JP2015213509A; IL214399A0; AP2011005847A0; DK2396459T3; EA202090636A2; KR102231531B1; CN102317513B; KR20190077614A; EA201791990A3; JP7010875B2; US11168321B2; SG173627A1; JP2016182148A; IL283572A; EA201791990A2; CN102317513A

Abstract

Un método de identificación de uno o más compuestos que se unen a una diana biológica, comprendiendo el método: (a) poner en contacto una biblioteca de compuestos, o una parte de la misma, con la diana biológica en condiciones adecuadas para que al menos un miembro de la biblioteca de compuestos se une a dicha diana, en donde los compuestos contienen un resto funcional que tiene una o más posiciones de diversidad, en donde los compuestos contienen un casco que incluye un oligonucleótido iniciador que identifica la estructura del resto funcional, en donde el resto funcional de los compuestos está operativamente enlazado mediante un enlazador al oligonucleótido iniciador, y en donde el oligonucleótido iniciador forma una estructura de horquilla; (b) eliminar miembros de la biblioteca que no se unen a dicha diana; y (c) analizar la región o regiones de identificación; en donde la combinación de casco y conector está diseñada para tener residuos apropiados en donde el coeficiente octanol:agua es de 1,0 a 2,5.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para crear y analizar bibliotecas codificadas por ADN

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0001] El coste creciente de descubrimiento de fármacos ha conducido a la búsqueda continua de nuevos procedimientos de cribado de mayor espacio químico tan económicamente como sea posible para encontrar moléculas con mayor potencia y poca o ninguna toxicidad. Los enfoques de la química combinatoria en la década de 1980 se anunciaron originalmente como métodos para trascender el paradigma del descubrimiento de fármacos, pero fracasaron en gran medida debido al tamaño insuficiente de las bibliotecas y los métodos inadecuados de deconvolución. Recientemente, el uso de bibliotecas combinatorias de moléculas pequeñas exhibidas en ADN ha creado un nuevo cambio de paradigma para el cribado de compuestos líderes terapéuticos.

[0002] Morgan et al. (Publicación de solicitud de patente de EE. UU. N° 2007/0224607) identifica los principales desafíos en el uso de enfoques combinatorios de a Dn en el descubrimiento de fármacos: (1) la síntesis de bibliotecas de suficiente complejidad y (2) la identificación de moléculas que están activas en los cribados utilizados. Además, Morgan et al. establece que cuanto mayor es el grado de complejidad de una biblioteca, es decir, el número de estructuras distintas presentes en la biblioteca, mayor es la probabilidad de que la biblioteca contenga moléculas con la actividad de interés. Por tanto, la química empleada en la síntesis de bibliotecas debe ser capaz de producir un gran número de compuestos en un plazo de tiempo razonable. Este enfoque generalmente ha tenido éxito en la identificación de moléculas con diversos quimiotipos y alta afinidad. Sin embargo, han surgido varios problemas con respecto a la generación de bibliotecas de enorme complejidad y la evaluación del resultado de la secuenciación en la escala que se ha descrito. Por ejemplo, la purificación de una biblioteca después de múltiples transformaciones químicas (p. ej., generalmente 3 o 4 pasos) y transformaciones biológicas (p. ej., ligación enzimática de etiquetas de ADN) es engorrosa y genera una cantidad significativa de "ruido" en la biblioteca debido a síntesis incompleta de moléculas o etiquetado incorrecto durante el paso de ligadura. Además, la cantidad de secuenciación que se requiere para interrogar a poblaciones seleccionadas es sorprendente, por lo general requiere métodos de secuenciación de "próxima generación". Este último se debe al hecho de que se requieren sofisticados esquemas de marcado genético incrustados en la porción de ADN de la biblioteca, junto con algoritmos bioinformáticos para analizar la salida de secuenciación de la "próxima generación", para filtrar el ruido e identificar coincidencias en la biblioteca. Como resultado, incluso con estas metodologías, la secuenciación todavía no está lo suficientemente avanzada como para capturar completamente la diversidad de secuencias (que representan tanto los impactos reales como el "ruido") de un cribado determinado.

[0003] La visualización de ADN de las bibliotecas combinatorias de pequeñas moléculas se basa en múltiples pasos, la síntesis de división y el grupo de la biblioteca, acoplado a la adición enzimática de etiquetas de ADN que codifican tanto el paso de síntesis y el bloque de construcción utilizados. Varios (p. ej., 3 o 4) pasos sintéticos se llevan a cabo y codifican típicamente, y estos incluyen posiciones de diversidad (descritas aquí como A, B y C (Fig.1)), como las formadas por el acoplamiento de bloques de construcción con, p. ej., grupos funcionales amina o carboxilato en un andamio químico que muestra los bloques de construcción adjuntos en orientaciones definidas. Un ejemplo de un andamio (S) que se usa a menudo en bibliotecas combinatorias es un resto de triazina, que puede dividirse ortogonalmente en tres posiciones alrededor de su estructura de anillo.

[0004] El proceso de formación de la biblioteca puede llevar mucho tiempo, los productos se purificaron a menudo ineficaz, y el resultado es que las reacciones desconocidas pueden ocurrir que crean moléculas no deseadas y/o desconocidos unidos al ADN. Además, la purificación incompleta de la biblioteca puede dar como resultado que las etiquetas se contaminen de forma cruzada durante los pasos de ligadura, lo que da como resultado un error. El resultado final del cribado y secuenciación de los aciertos de la biblioteca es que debe emplearse una secuenciación paralela masiva debido al "ruido" inherente de ambos ADN que están unidos a moléculas que no son intencionadas (p. ej., productos secundarios o sin reaccionar) o que son etiquetadas incorrectamente. Por tanto, se pierde la eficacia de la secuenciación.

[0005] En algunos casos, un oligonucleótido iniciador, a partir del cual se construye la biblioteca de moléculas pequeñas, contiene una región de unión a cebadores para la amplificación de la polimerasa (p. ej., PCR) en forma de un oligonucleótido covalentemente cerrado, de doble hebra. Esta construcción es muy problemática para realizar reacciones de polimerasa, debido a la dificultad de fundir el dúplex y permitir que un oligonucleótido cebador se una e inicie la polimerización, lo que da como resultado una reacción ineficaz, reduciendo el rendimiento de 10 a 1000 veces o más.

[0006] Existe una necesidad de un enfoque más gradual a la detección y la identificación de pequeñas moléculas que tienen una mayor potencia y poca o ninguna toxicidad.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0007] La presente invención proporciona un método de identificación de uno o más compuestos que se unen a una diana biológica, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto una biblioteca de compuestos, o una porción de la misma, con la diana biológica bajo condiciones adecuadas para que al menos un miembro de la biblioteca de compuestos se una a dicha diana, en donde los compuestos contienen un resto funcional que tiene una o más posiciones de diversidad, en donde los compuestos contienen un casco que incluye un oligonucleótido iniciador que identifica la estructura del resto funcional, donde el resto funcional de los compuestos se enlaza operativamente mediante un enlazador al oligonucleótido iniciador, y en donde el oligonucleótido iniciador forma una estructura de horquilla;

(b) eliminar miembros de la biblioteca que no se unen a dicha diana; y

(c) analizar la región o regiones de identificación;

en donde la combinación de casco y conector está diseñada para tener residuos apropiados en donde el coeficiente octanol: agua es de 1,0 a 2,5.

[0008] La presente invención presenta un método como se define en las reivindicaciones para la creación y el cribado de bibliotecas codificadas por ADN simplificadas, debido a un menor número de pasos sintéticos (p. ej., no ligación enzimática o iniciador no covalentemente cerrado de doble cadena oligonucleótidos) y, por lo tanto, sustancialmente menos "ruido" durante el análisis de los oligómeros codificados (denominados en el presente documento "regiones de identificación"). Por lo tanto, la secuenciación se vuelve mucho más eficiente o, alternativamente, el análisis de micromatrices se vuelve posible, teniendo en cuenta los sesgos inherentes que pueden confundir la interpretación de los datos que pueden introducirse mediante la amplificación de la región de codificación. También hemos identificado métodos para crear una mayor diversidad de reacciones químicas en lugar de aquellas simplemente limitadas a condiciones acuosas para hacer que la biblioteca codificada por ADN sea más hidrófoba y soluble en disolventes orgánicos para los pasos posteriores de la síntesis de la biblioteca. De esta manera, las reacciones químicas se pueden llevar a cabo con un rendimiento potencialmente mayor, una mayor diversidad de componentes básicos y una fidelidad mejorada de las reacciones químicas.

[0009] Por consiguiente, la presente invención presenta un método como se define en las reivindicaciones que comprende adicionalmente marcar bibliotecas químicas codificadas por ADN uniendo un primer grupo funcional de un enlazador bifuncional a un oligonucleótido iniciador en el extremo 5' del oligonucleótido iniciador, en donde el oligonucleótido iniciador forma una estructura de horquilla y une un segundo grupo funcional del enlazador bifuncional a un componente de la biblioteca química. El oligonucleótido iniciador puede incluir una primera región de identificador y una segunda región de identificador, de modo que la segunda región de identificador hibrida con la primera región de identificador del oligonucleótido de iniciador. La segunda región identificadora puede incluir una etiqueta fluorescente (p. ej., un fluoróforo o GFP) o una etiqueta de biotina. Además, la segunda región de identificación no se amplifica antes del análisis que sigue a un paso de selección.

[0010] En otra realización, la invención presenta un método como se define en las reivindicaciones que comprende adicionalmente la creación de bibliotecas de ADN-codificada por (a) la creación de un primer nodo de la diversidad, (b) que codifica el primer nodo de la diversidad en recipientes separados, (c) agrupar el primer nodo de diversidad, y (d) dividir el primer nodo de diversidad agrupado en un segundo conjunto de recipientes separados, en donde el primer nodo de diversidad reacciona para formar un segundo nodo de diversidad. En determinadas formas de realización, el segundo nodo de diversidad no está codificado ni agrupado.

[0011] En otra realización, la presente invención presenta un método como se describe en las reivindicaciones, que comprende adicionalmente la creación de bibliotecas utilizando reacciones químicas (p. ej., orgánicas) semi o no acuosas con un mayor rendimiento, una mayor diversidad de bloques de construcción, y un mayor número de reacciones químicas que se pueden utilizar para crear más bibliotecas combinatorias etiquetadas con ADN que las que se lograron anteriormente.

[0012] En general, los métodos de la presente invención como se define en las reivindicaciones proporcionan un conjunto de bibliotecas que contienen, por ejemplo, una o dos posiciones de diversidad en un andamio químico que se puede generar de manera eficiente con un alto rendimiento, proyectado para identificar bloques de construcción individuales preferidos o combinaciones de bloques de construcción que residen en, por ejemplo, una o dos posiciones de diversidad, y se diversifican iterativamente en, por ejemplo, una segunda, tercera y/o cuarta posición de diversidad para crear moléculas con propiedades mejoradas. Además, los métodos descritos en este documento permiten un análisis expansivo y extenso de los compuestos seleccionados que tienen una propiedad biológica deseada, lo que, a su vez, permite identificar compuestos relacionados con relaciones estructurales familiares (p. ej., relaciones estructura-actividad).

[0013] Por "andamio" se entiende un resto químico que muestra nodo(s) de diversidad en una geometría especial particular. El (los) nodo(s) de diversidad se adjuntan típicamente al andamio durante la síntesis de la biblioteca, pero en algunos casos se puede unir un nodo de diversidad al andamio antes de la síntesis de la biblioteca (p. ej., adición de regiones de identificación). En algunas realizaciones, el andamio se deriva de manera que se puede desproteger ortogonalmente durante la síntesis de la biblioteca y posteriormente reaccionar con diferentes nodos de diversidad (p.

ej., usando etiquetado de identificador en cada paso).

[0014] Por "identificador de región" se entiende la parte de la etiqueta de ADN de la biblioteca que codifica el bloque de construcción de adición a la biblioteca.

[0015] Por "oligonucleótido iniciador" se entiende que el oligonucleótido de partida para la síntesis de la biblioteca que también contiene un enlazador unido covalentemente y resto funcional para la adición de un nodo de la diversidad o andamio. El oligonucleótido puede ser monocatenario o bicatenario. El oligonucleótido puede consistir en bases naturales o modificadas.

[0016] Por "resto funcional" se entiende un resto químico que comprende uno o más bloques de construcción que se pueden seleccionar de cualquier molécula pequeña o diseñarse y construirse sobre la base de las características deseadas de, por ejemplo, la solubilidad, la disponibilidad de donantes de enlaces de hidrógeno y aceptores, grados de libertad de rotación de los enlaces, carga positiva, carga negativa y similares. El resto funcional debe ser compatible con la modificación química de modo que reaccione con el casco. En determinadas realizaciones, el resto funcional se puede hacer reaccionar además como una entidad bifuncional o trifuncional (o mayor). Los restos funcionales también pueden incluir bloques de construcción que se utilizan en cualquiera de los nodos o posiciones de diversidad. En las Tablas 1 y 2 se encuentran ejemplos de bloques de construcción y etiquetas de ADN codificantes. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N° 2007/0224607.

[0017] Por "bloque de construcción" se entiende una unidad estructural química que está vinculada a otras unidades estructurales químicas o puede estar vinculada a otras unidades. Cuando el resto funcional es polimérico u oligomérico, los componentes básicos son las unidades monoméricas del polímero u oligómero. Los bloques de construcción también pueden incluir una estructura de andamio (p. ej., un bloque de construcción de andamio) a la que se adjunta, o puede estar, una o más estructuras adicionales (p. ej., bloques de construcción periféricos). Los bloques de construcción pueden ser cualquier compuesto químico que sea complementario (es decir, los bloques de construcción deben poder reaccionar juntos para formar una estructura que comprenda dos o más bloques de construcción). Por lo general, todos los componentes básicos utilizados tendrán al menos dos grupos reactivos, aunque algunos de los componentes básicos utilizados tendrán solo un grupo reactivo cada uno. Los grupos reactivos en dos bloques de construcción diferentes deben ser complementarios, es decir, capaces de reaccionar juntos para formar un enlace covalente.

[0018] Por "enlazador" se entiende una molécula que une la porción de ácido nucleico de la biblioteca a las especies mostradas funcionales. Dichos enlazadores son conocidos en la técnica, y los que pueden usarse durante la síntesis de bibliotecas incluyen, pero no se limitan a 5'-O-dimetoxitritilo-1',2'-didesoxirribosa-3'-[(2-cianoetilo)-(N,N-diisopropilo)]-fosforamidita; 9-O-dimetoxitritilo-trietilenglicol, 1-[(2-cianoetilo)-(N,N-diisopropilo)]-fosforamidita; 3-(4,4'-dimetoxitritiloxi)propilo-1-[(2-cianoetilo)-(N,N-diisopropilo)]-fosforamidita; y 18-O-dimetoxitritilhexaetilenglicol, 1-[(2-cianoetilo)-(N,N-diisopropilo)]-fosforamidita. Dichos enlazadores se pueden añadir en tándem entre sí en diferentes combinaciones para generar enlazadores de diferentes longitudes deseadas. Por "enlazador ramificado" se entiende una molécula que une la posición del ácido nucleico de la biblioteca a 2 o más especies funcionales idénticas de la biblioteca. Los enlazadores ramificados son bien conocidos en la técnica y los ejemplos pueden consistir en duplicadores simétricos o asimétricos (1) y (2) o un agudo simétrico (3). Véase, por ejemplo, Newcome y col, Dendritic Molecules: Concepts, Synthesis, Perspectives, VCH Publishers (1996); Boussif y col, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU.

92: 7297 - 7301 (1995); y Jansen y col, Science 266: 1226 (1994).

[0019] Como se usa en este documento, el término "oligonucleótido" se refiere a un polímero de nucleótidos. El oligonucleótido puede incluir ADN o cualquier derivado del mismo conocido en la técnica que se puede sintetizar y usar para el reconocimiento de pares de bases. El oligonucleótido no tiene que tener bases contiguas, pero se puede intercalar con restos enlazadores. El oligonucleótido polímero puede incluir nucleósidos naturales (p. ej., adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina), análogos de nucleósidos (p. ej., 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metilo adenosina, C5-propinilcitidina, C5-propiniluridina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-metilcitidina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina) y 2-tiocitidina), bases químicamente modificadas, bases biológicamente modificadas (p. ej., bases metiladas), bases intercaladas, azúcares modificados (p. ej., 2'-fluororibosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa) y/o grupos fosfato modificados (p. ej., fosforotioatos y enlaces 5'-N-fosforamidita).

[0020] Por "unido operativamente" se quiere decir que dos estructuras químicas están unidas entre sí de una manera tal como para permanecer unidas a través de las diversas manipulaciones que se espera que experimentan. Normalmente, el resto funcional y el oligonucleótido codificante se unen covalentemente mediante un grupo de enlace apropiado. Por ejemplo, el grupo de enlace puede ser un resto bifuncional con un sitio de unión para el oligonucleótido codificante y un sitio de unión para el resto funcional.

[0021] Por "molécula pequeña" se quiere decir una molécula que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 1000 Daltons. Las moléculas pequeñas pueden ser orgánicas o inorgánicas, y pueden aislarse de, por ejemplo, bibliotecas de compuestos o fuentes naturales, o pueden obtenerse mediante derivatización de compuestos conocidos.

[0022] Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos, los ejemplos, y las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0023]

La figura 1 es un esquema que ilustra las posiciones de diversidad A, B y C.

La figura 2 es un esquema de un miembro de biblioteca química codificada por ADN del Modo 1, que muestra, en parte, el oligonucleótido iniciador, que incluye una estructura de horquilla complementaria en la región del identificador, que ha reaccionado con los nodos de diversidad A y B. Se está agregando la región del identificador para B. En esta figura, el nodo de diversidad "C" es la posición potencial para que se agregue una posición de diversidad adicional después de la adición de la región de identificación B.

La figura 3 es un esquema de un miembro de biblioteca química codificada por ADN del Modo 1, que muestra, en parte, el oligonucleótido iniciador, que incluye una secuencia en la región de bucle de la estructura de horquilla que puede servir como región de unión del cebador para la amplificación.

La figura 4 es un esquema de un miembro de biblioteca química codificada por ADN del Modo 1, que muestra, en parte, el oligonucleótido iniciador, que incluye una secuencia no complementaria en el extremo 3' de la molécula que puede servir para unir una segunda región de identificador para polimerización o para ligación enzimática.

La figura 5 es un esquema de un miembro de la biblioteca química codificada por ADN del Modo 1, que muestra, en parte, el oligonucleótido iniciador, en donde la región del bucle del oligonucleótido iniciador y al menos la región del identificador en el lado 3' de la región del bucle pueden servir para hibridar con un oligonucleótido complementario que también contiene una segunda región identificadora.

La figura 6 es un esquema de la amplificación por PCR del modelo de horquilla, como se presenta en la figura 5.

La figura 7 es un esquema de un miembro de biblioteca química codificada por ADN del Modo 2, que muestra un oligonucleótido en horquilla que está cerrado covalentemente (p. ej., mediante una horquilla o químicamente) en el extremo distal del enlazador.

La figura 8 es un esquema de un miembro de biblioteca química codificada por ADN del Modo 2, que muestra la inclusión de nodos de diversidad adicionales.

La figura 9 es un esquema de un miembro de biblioteca química codificada por ADN del Modo 2, que muestra los pasos para el cribado de bibliotecas y los métodos para desconvocar las regiones de identificación. La figura 10 es un esquema que muestra los oligonucleótidos usados en la síntesis de bibliotecas. El casco (HP) se sintetizó mediante IDT ADN y se purificó por HPLC. Las flechas indican el sitio para la restricción de BbvCI (subrayado) o la digestión de mellas Nb.BbvCI o Nt.BbvCI. También se muestran las secuencias de las etiquetas de ADN A1, B1 y C1 (hebras superior e inferior), los cebadores de PCR 5' y 3' y el extremo 3' de HP.

La figura 11 es un gel electroforético (electroforesis en gel de TBE-urea (15%); sombreado UV en una placa de TLC) del casco en diferentes pasos de su síntesis. El casco HP (IDT DNA) fue acilado por Fmoc-amino-PEG2000-NHS (JenKem Technology USA). El carril 1 es el oligonucleótido HP (IDT ADN) (42 nts). El carril 2 está acilado por HP con Fmoc-aminoPEG2000-NHS. Después de la adición de Tris-HCl, se observa cierta desprotección de Fmoc. El carril 3 es la reacción bruta con piperidina, que muestra la desprotección completa de Fmoc. El carril 4 es el mismo que el carril 3 después de desalar en una columna NAP-5 y liofilizar. (XC: xileno cianol (migra como ADN de 60 nt); BPB: azul de bromofenol (migra como ADN de 15 nt).

La figura 12 es un esquema que muestra los pasos en la síntesis de la biblioteca modelo. El DTAF se conjugó con el casco modificado con amino-PEG (HP-1) en el primer paso. Después de este paso, una porción de HP-1-DTAF se aciló adicionalmente con pentilaminobiotina.

La figura 13A es un esquema de ligación de las etiquetas de ADN. La figura 13B ilustra un gel de agarosa al 4% de HP- Biblioteca de 1-DTAF-biotina en diferentes pasos de la ligadura de la etiqueta de ADN. M: marcador; Carril 1: HP-1-DTAF-biotina; Carril 2: 1+ Etiqueta A solamente; Carril 3:1 Etiquetas A, B y C, así como el oligo del extremo 3' ligado. La flecha indica fluorescencia verde brillante (DTAF). No se observa una separación sustancial en el gel. La figura 13C ilustra la amplificación por PCR (24 ciclos) de las reacciones de ligación. M: marcador (más bajo mano es 100); Carril 1: amplificación por PCR de la banda fluorescente verde del carril 1 de la figura 14B (HP-1-DTAF-biotina etiqueta A); Carril 2: amplificación por PCR de la banda fluorescente verde del carril 2 de figura 13B (HP-1-DTAF-biotina las 3 etiquetas y el oligo del extremo 3'); Carril 3: amplificación por PCR de la reacción de ligación bruta HP -1-DTAF-biotina las 3 etiquetas; Carril 4: sin control de planti-Lla.

La figura 14 es un conjunto de geles electroforéticos que muestran la purificación del compuesto modelo XChem y la selección del modelo (mediante una interacción de unión entre el resto de biotina del compuesto modelo XChem y la estreptavidina). Los geles son geles SDS NuPage al 4-12% con tampón de ejecución MES. Los geles se escanearon en busca de fluorescencia verde usando un láser de 450 nm. La figura 14A es un gel que muestra las pasos de síntesis y purificación. Las muestras se mezclaron con tampón de carga y se hirvieron. M: marcador; Carril 1: HP-1 DTAF; Carriles 2 y 2a: HP-1-DTAF biotina (dos reacciones independientes); Carriles 3-6 (pasos de purificación/selección del modelo usando perlas de estreptavidina Dynal): Carril 3: flujo continuo; Carril 4: último lavado (lavado con agua a 80°C durante 10 minutos); Carriles 5 y 5': elución con EDTA 25 mM a 90°C (1° y 2°); Los carriles 6 y 6': elución con EDTA 25 mM y NaOH 5 mM a 90°C (1° y 2°). La figura 14B es un gel que muestra la unión de HP-1-DTAF-biotina ("biblioteca de 1") a estreptavidina. Las muestras se mezclaron con tampón de carga de gel y se cargaron directamente sobre el gel sin hervir. Las muestras, como en el gel de la Fig. 14A, se incubaron con un exceso de estreptavidina en NaCl 50 mM/Tris HCl 10 mM, pH 7,0, durante 10 minutos. "S" indica la adición de estreptavidina. Las muestras 5 y 6 se combinaron. Carril 1: Hp -1-DTAF; Carril 1S: HP-1-DTAF estreptavidina; Carril 2: HP-1-DTAF-biotina (desalada); Carril 2S: HP-1-DTAF-biotina estreptavidina; Carril 4: último lavado (lavado con agua a 80°C durante 10 minutos); Carril 4S: última muestra de lavado estreptavidina; Carril 5 6: muestras agrupadas 5, 5', 6 y 6' (fracciones de elución de perlas de estreptavidina, Hp-1-DTAF-biotina purificada y seleccionada; Carril 5 6S': HP-1-DTAF-biotina purificada y seleccionada estreptavidina. Tenga en cuenta que no hay una diferencia notable en la migración entre los diferentes pasos de la síntesis de la "biblioteca de 1". La figura 14C es un gel de agarosa al 4% de casco (Trilink) HP-T, que reaccionó con DTAF. Carril 1: Marcador; Carril 2: DTAF; Carril 3 HP-T-DTAF. Panel izquierdo: visualización UV del gel (tinción con bromuro de etidio); Panel derecho: mismo gel escaneado para fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 450 nm (verde, fluoresceína). La figura 14D es un gel de SDS NuPage al 4-12% con tampón de ejecución MES, que muestra la unión de HP-T-DTAF-biotina a estreptavidina. Las muestras se mezclaron con tampón de carga de gel y se cargaron directamente en el gel sin hervir. Las muestras, como en el gel de la Fig. 14A, se incubaron con un exceso de estreptavidina en NaCl 50 mM/Tris HCl 10 mM, pH 7,0, durante 10 minutos. Carril 1: DTAF; Carril 2: HP-T-DTAF; Carril 3: HP-T-DTAF estreptococo tavidina; Carril 4: HP-T-DTAF-biotina (desalada); Carril 5: HP-T-DTAF-biotina estreptavidina; Carril 6: muestras agrupadas 5, 5', 6 y 6' (fracciones de elución de perlas de estreptavidina, HP-1-DTAF-biotina purificada y seleccionada; Carril 7: HP-1-DTAF-biotina estreptavidina purificada y seleccionada.

Fig. 15A es un esquema de la síntesis de la construcción para el experimento de administración intracelular de RNAP de T7. El clon de ADNdc de Vh se amplificó por PCR para agregar un sitio Bsml en el extremo 5' corriente arriba del promotor de T7. Después de la digestión de restricción y la purificación, la construcción se ligó a HP-1-DTAF-R7 (casco modificado con DTAF y péptido (-Arg-£Ahx)⁶-Arg). La Fig. 15B es un gel electroforético de la reacción de ligación. Los carriles 1 y 2 muestran diferentes muestras HP-1 ligadas a Vh; el carril 3 muestra el producto de PCR de Vh no ligado; y M es el marcador. La figura 15C es un gel forético que muestra la validación para la actividad T7 promotora. El gel muestra una reacción T7 Megascript (Ambion, Inc.) usando muestras de los carriles 1-3 de la Fig. 15B.

La Fig. 16 es una electroforesis en gel de agarosa S de los pasos en la síntesis de la biblioteca 10X10 La Fig. 16A es un gel de agarosa al 4% de casco (Trilink) HP-T ligado con la etiqueta A. Carril 1: Marcador; Carril 2: HP-T; Carril 3: Etiqueta A recocida; Carril 4: HP-T ligado con etiqueta A; Carril 5: HP-T ligado con etiqueta A y desalado en columna Zeba. La Fig. 16B es un gel de agarosa al 2% de ligación HP-TA con 12 etiquetas diferentes B. Carril M: Marcador, Carriles 1 y 9: HP-TA; Carriles 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15 y 16: Ligadura HP-TA con etiquetas B1-B12. La figura 16C es un gel de agarosa al 4% de la biblioteca combinada (biblioteca B), con las etiquetas A y B1-B12 ligadas, después de la reacción con cloruro cianúrico y aminas B1-B12. Carril 1: marcador; Carril 2: HPT-A; Carril 3: Biblioteca-B agrupada y desalada en columnas Zeba.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0024] La presente invención presenta un número de métodos tal como se definen en las reivindicaciones para la identificación de uno o más compuestos que se unen a una diana biológica. Los métodos incluyen sintetizar una biblioteca de compuestos, en donde los compuestos contienen un resto funcional que tiene una o más posiciones de diversidad. El resto funcional de los compuestos está operativamente unido a un oligonucleótido iniciador que identifica la estructura del resto funcional. En resumen, el Modo 1 proporciona una serie de métodos para preservar el carácter bicatenario del dsADN durante la síntesis de la biblioteca, lo cual es importante durante el paso de reacción química, y puede usarse (como se muestra en las Figs. 2-6) para generar a dos nodos de diversidad. El Modo 2 (figuras 7-9) anticipa un nodo de diversidad y usa un oligonucleótido en horquilla que está cerrado covalentemente (p. ej., mediante una horquilla o químicamente) en el extremo distal del enlazador. El modo 3 proporciona métodos para crear bibliotecas con uno, dos, tres o más nodos de diversidad. Los modos 1,2 y 3 se describen en detalle a continuación.

Modo 1

[0025] La presente invención presenta un método como se define en las reivindicaciones para la identificación de uno o más compuestos que se unen a una diana biológica. El método incluye sintetizar una biblioteca de compuestos, en donde los compuestos contienen un resto funcional que no tiene más de dos posiciones de diversidad. El resto funcional de los compuestos está operativamente unido a un oligonucleótido iniciador que identifica la estructura del resto funcional proporcionando una solución que contiene compuestos iniciadores A.

[0026] El oligonucleótido iniciador incluye un enlazador L (p. ej., polietilenglicol) con un número entero de uno o más, en donde los oligonucleótidos iniciadores contienen un resto funcional que incluye bloques de construcción A unidos a L y separados en recipientes de reacción A, en donde A es un número entero de dos o más, que está operativamente ligado a un oligonucleótido iniciador que identifica los componentes básicos A.

[0027] En algunas realizaciones, los bloques de construcción A se pueden derivatizar adicionalmente a través de un nodo común S. En otras realizaciones, A se transforma posteriormente con S, siendo S una molécula de soporte que permite que otros nodos de introducción de diversidad. En algunas realizaciones, A-S se puede cribar directamente, representando un solo nodo de diversidad. En otras realizaciones, los recipientes de reacción de A-S (p. ej., que pueden incluir primero una purificación de A-S a partir de materiales de partida) se mezclan y se colocan en alícuotas en recipientes de reacción B, en los que B es un número entero de uno o más, y se hacen reaccionar con uno de los componentes bloques B. A-S-B, todavía en los recipientes de reacción B, en algunos casos se hace reaccionar con un bloque de construcción C, donde C es un número entero de uno, se purifica y se somete a una reacción de polimerización o ligación utilizando cebadores B, en los que los cebadores B difieren en secuencia. e identificar los bloques de construcción B.

[0028] En determinadas formas de realización, A-S puede ser un número entero de uno. En una realización, el A-S puede unirse directamente a los oligonucleótidos iniciadores B y, tras la reacción de los componentes básicos B, las reacciones B se mezclan. En ciertas realizaciones, la mezcla de A-S-B, donde B representa el único nodo de diversidad, se selecciona directamente, lo que representa un único nodo de diversidad. En otras realizaciones, la mezcla de A-S-B, donde B representa el único nodo de diversidad, se divide posteriormente en alícuotas en recipientes de reacción C, se hace reaccionar con bloques de construcción C y se somete a una reacción de polimerización o ligación de la segunda hebra usando cebadores C , en los que los cebadores C difieren en secuenciar e identificar los bloques de construcción C.

[0029] En ciertas realizaciones, B puede ser un número entero de uno y A-S ya es mayor que uno, en cuyo caso A-S, ahora derivatizado con B, se dividió en alícuotas en recipientes de reacción C, se hace reaccionar con bloques de construcción C, y se somete a la segunda reacción de cadena de polimerización usando cebadores C , en los que los cebadores C difieren en secuencia e identifican los bloques de construcción C. Esta estrategia general puede expandirse para incluir nodos de diversidad adicionales (p. ej., D, E, F, etc.) de modo que el primer nodo de diversidad reaccione con bloques de construcción y/o S y sea codificado por un oligonucleótido inicial, mezclado, re-alícuotas en recipientes y luego el nodo de diversidad subsiguiente se deriva mediante bloques de construcción, que está codificado por el cebador utilizado para la reacción de polimerización o ligación.

[0030] En ciertas realizaciones, A puede ser un número entero de uno, B puede ser un número entero de uno, y los oligonucleótidos C iniciadores se utilizan. El A-S-B, unido a los oligonucleótidos iniciadores C, se forma en los recipientes de reacción C, reacciona con los componentes básicos C y se analiza directamente.

[0031] En ciertas realizaciones, S se hace reaccionar primero con el oligonucleótido iniciador, y A, B y/o C (p. ej., o D, E, F, y así sucesivamente) se hacen reaccionar posteriormente.

[0032] En ciertas realizaciones, A, B, o C (p. ej., o D, E, F, y así sucesivamente) puede contener sitios para los nodos de diversidad adicionales. Si este es el caso, entonces S puede o no usarse o necesitarse para introducir nodos de diversidad adicionales.

[0033] En una realización, el oligonucleótido iniciador complementario incluye una estructura de horquilla en la región de identificador (Fig. 2). La región de identificación puede tener, por ejemplo, de 2 a 100 pares de bases de longitud, preferiblemente de 5 a 20 pares de bases de longitud y lo más preferiblemente de 6 a 12 pares de bases de longitud. El oligonucleótido iniciador incluye además una secuencia en la región del bucle de la estructura de horquilla que puede servir como región de unión del cebador para la amplificación (Fig. 3), de modo que la región de unión del cebador tiene una temperatura de fusión más alta para su cebador complementario (p. ej., que puede incluir regiones de identificación flanqueantes) que la región de identificación sola.

[0034] En una realización, la región de bucle puede incluir bases modificadas que pueden formar formaciones dúplex de mayor afinidad que bases no modificadas, tales bases modificadas se conocen en la técnica (Fig. 3). El oligonucleótido iniciador puede incluir además una secuencia no complementaria en el extremo 3' de la molécula que puede servir para unir una segunda región identificadora para polimerización o para ligación enzimática (Fig. 4). En una realización, las hebras se pueden reticular posteriormente, por ejemplo, usando psoraleno.

[0035] En otra realización, la región de bucle y al menos la región identificadora en el lado 3' de la región de bucle pueden servir para hibridarse con un oligonucleótido complementario que también contiene una segunda región identificadora (Fig. 5). En los casos en los que se utilizan muchos bloques de construcción y etiquetas correspondientes (p. ej., 100 etiquetas), se puede emplear una estrategia de mezcla y división durante el paso de síntesis de oligonucleótidos para crear el número necesario de etiquetas. Tales estrategias de mezcla y división para la síntesis de ADN son conocidas en la técnica. En una realización, las hebras se pueden reticular posteriormente, por ejemplo, usando psoraleno. Los miembros de la biblioteca resultantes pueden amplificarse mediante PCR después de la selección de entidades de unión frente a una(s) diana(s) de interés (Fig. 6).

[0036] Por ejemplo, un casco, que incluye un oligonucleótido iniciador, se puede hacer reaccionar con un enlazador y A, que incluye, por ejemplo, 1000 variantes diferentes. Para cada bloque de construcción A, se puede ligar una etiqueta A de ADN o extender un cebador al casco. Estas reacciones pueden realizarse, por ejemplo, en una placa de 1000 pocilios o en placas de 10 x 100 pocillos. Todas las reacciones pueden agruparse, opcionalmente purificarse y dividirse en un segundo conjunto de placas. A continuación, se puede realizar el mismo procedimiento con bloques de construcción B, que también incluyen, por ejemplo, 1000 variantes diferentes. Se puede ligar una etiqueta B de ADN al casco y se pueden combinar todas las reacciones. Una biblioteca de 1000 x 1000 combinaciones de A a B (es decir, 1.000.000 compuestos), etiquetadas por 1.000.000 de combinaciones diferentes de etiquetas. El mismo enfoque puede extenderse para agregar variantes C, D, E, etc. La biblioteca generada puede usarse luego para identificar compuestos que se unen a la diana. La composición de los compuestos que se unen a la biblioteca se puede evaluar mediante PCR y secuenciación de las etiquetas de ADN para identificar los compuestos que se enriquecieron.

Modo 2

[0037] En otra forma de realización (Fig. 7), el método incluye la síntesis de una biblioteca de compuestos, en donde los compuestos contienen un resto funcional que tiene no más de dos posiciones de diversidad. La fracción funcional de los compuestos está operativamente ligada a un oligonucleótido iniciador, que contiene una secuencia genética única que identifica la estructura de la fracción funcional al proporcionar una solución que comprende compuestos iniciadores A, donde L es un número entero de uno o más, donde los compuestos iniciadores incluyen un resto funcional que tiene bloques de construcción A separados en recipientes de reacción A, donde, por ejemplo, A es un número entero de dos o más, que está operativamente unido a un oligonucleótido inicial que identifica los bloques de construcción A. En algunas realizaciones, los bloques de construcción A se pre-derivatizan con una S común. En otras realizaciones, A se transforma posteriormente con S, siendo S una molécula de andamio que permite la introducción de nodos adicionales de diversidad. A continuación, los recipientes de reacción de A-S (que pueden incluir primero una purificación de A-S a partir de materiales de partida) se mezclan y se colocan en alícuotas en recipientes de reacción B, en los que B es un número entero de uno o más, y se hacen reaccionar con uno de los bloques de construcción B. A-S-B, todavía en los recipientes de reacción B, en algunas realizaciones, se hace reaccionar con un bloque de construcción C, donde C es un número entero de uno, se purifica y se mantiene separado en los recipientes B para el cribado. En algunas realizaciones, A-S es un número entero de uno. En una realización, A-S se puede unir directamente a los oligonucleótidos iniciadores B y, después de la reacción de los componentes básicos B, las reacciones B se mezclan y se colocan en alícuotas en recipientes de reacción C, reaccionan con los componentes básicos C y se mantienen separados en recipientes C para el cribado. En otras realizaciones, B puede ser un número entero de uno y A-S es mayor que uno, en cuyo caso A-S, ahora derivatizado con B, se divide en alícuotas en recipientes de reacción C que reaccionan con bloques de construcción C y se mantienen separados en recipientes C para cribado. Esta estrategia general se puede ampliar para incluir nodos de diversidad adicionales (p. ej., D, E, F, etc.) de modo que el primer nodo de diversidad reaccione con bloques de construcción y/o S y sea codificado por un oligonucleótido iniciador, mezclado, re-alicuotado en vasos, y luego el nodo de diversidad subsiguiente es derivatizado por bloques de construcción y guardado en sus respectivos vasos para cribado (Fig. 8).

[0038] Por ejemplo, como se describe en el modo 1, un casco, que incluye un oligonucleótido iniciador, se puede hacer reaccionar con un enlazador y bloques de construcción A, que incluyen, por ejemplo, 1000 variantes diferentes. Para cada bloque de construcción A, se puede ligar una etiqueta A de ADN o extender un cebador al casco. Las reacciones pueden agruparse. A continuación, se puede realizar el mismo procedimiento con los bloques de construcción B, pero no se agrega una etiqueta B de ADN . Como B no está codificado, todas las reacciones "B" pueden agruparse (p. ej., 1000 reacciones) y puede realizarse un paso de selección para identificar todos los bloques de construcción A que producen el efecto de unión deseado con los bloques de construcción B desconocidos. Una biblioteca de bloques de construcción A identificados en el paso de selección (p. ej., 10 bloques de construcción A) puede entonces reaccionar con los mismos 1000 bloques de construcción B, lo que da como resultado un cribado de 10.000 compuestos o menos. En esta ronda, se pueden agregar etiquetas de ADN para B y se pueden identificar los bloques de construcción B que producen el efecto de unión deseado en combinación con, por ejemplo, los 10 bloques de construcción A, lo que resulta en una convolución escalonada de una biblioteca inicial de, por ejemplo, 1.000.000 compuestos. Un conjunto de estos compuestos finales puede probarse individualmente para identificar los mejores, por ejemplo, aglutinantes, activadores o inhibidores.

[0039] Para evitar la puesta en común de todas las reacciones después de la síntesis B, un lector de BIND (SRU Biosystems), por ejemplo, puede ser usado para monitorear la unión en una superficie de sensor en formato de alto rendimiento (p. ej., placas de 384 pocillos y placas de 1536 pocillos). Por ejemplo, los bloques de construcción A pueden estar codificados con etiquetas de a DN y los bloques de construcción B pueden estar codificados por posición. Los aglutinantes se pueden identificar usando un sensor BIND, secuenciación y análisis de microarrays o análisis de digestión de restricción de las etiquetas A. Este análisis permite la identificación de combinaciones de componentes básicos A y B que producen las moléculas deseadas. Pueden usarse otros métodos para controlar la unión conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ELISA.

Modos 1 y 2

[0040] El oligonucleótido iniciador de los Modos 1 y 2 pueden contener una estructura de horquilla, complementario en el identificador de región. El oligonucleótido iniciador contiene además una secuencia en la región del bucle de la estructura de horquilla que puede servir como una región de unión del cebador para la amplificación, de modo que la región de unión del cebador tiene una temperatura de fusión más alta para su cebador complementario (que puede incluir regiones de identificación flanqueantes) que la región del identificador sola.

[0041] En una realización, el oligonucleótido iniciador incluye una molécula de enlace capaz de hacerse reaccionar funcionalmente con la construcción de bloques. La molécula enlazadora se puede unir directamente al extremo 5' del oligonucleótido mediante métodos conocidos en la técnica o se puede incrustar dentro de la molécula, por ejemplo, a partir de una base derivatizada (p. ej., la posición C5 de la uridina), o el enlazador puede colocarse en el medio del oligonucleótido usando técnicas estándar conocidas en la técnica.

[0042] El oligonucleótido iniciador puede ser de cadena sencilla o de doble cadena. La formación de un oligonucleótido bicatenario se puede lograr mediante la formación de horquilla del oligonucleótido o mediante reticulación usando, por ejemplo, un resto de psoraleno, como se conoce en la técnica.

[0043] El oligonucleótido iniciador puede contener dos regiones de unión a cebador (p. ej., para permitir una reacción de PCR) a cada lado de la región identificadora que codifica el bloque de construcción. Alternativamente, el oligonucleótido iniciador puede contener un sitio de unión al cebador en el extremo 5'. En otras realizaciones, el oligonucleótido iniciador es una horquilla y la región del bucle forma un sitio de unión al cebador o el sitio de unión al cebador se introduce mediante la hibridación de un oligonucleótido a la región del identificador en el lado 3' del bucle. Un oligonucleótido cebador, que contiene una región homóloga al extremo 3' del oligonucleótido iniciador y que lleva una región de unión al cebador en su extremo 5” (p. ej., para permitir una reacción de PCR) puede hibridarse con el oligonucleótido iniciador, y puede contener un identificador región que codifica los bloques de construcción utilizados en una de las posiciones de diversidad. El oligonucleótido cebador puede contener información adicional, como una región de nucleótidos aleatorizados, por ejemplo, de 2 a 16 nucleótidos de longitud, que se incluye para el análisis bioinformático.

[0044] En una realización, el oligonucleótido iniciador no contiene un sitio de unión al cebador de PCR.

[0045] En otra realización, la biblioteca de compuestos, o una porción de la misma, se pone en contacto con una diana biológica en condiciones adecuadas para al menos un miembro de la biblioteca de compuestos que se unen a la diana, seguido de la eliminación de miembros de la biblioteca que no se unen a la diana y analizar la región o regiones del identificador. Los ejemplos de dianas biológicas incluyen, p. ej, enzimas (p. ej., quinasas, fosfatasas, metilasas, demetilasas, proteasas y enzimas reparadoras de ADN), proteínas implicadas en interacciones proteína: proteína (p. ej., ligandos para receptores), dianas de receptor (p. ej., GPCR y RTK), canales iónicos, bacterias, virus, parásitos, ADN, ARN, priones o carbohidratos).

[0046] En una realización, la biblioteca de compuestos, o una porción del mismo, se pone en contacto con una diana biológica bajo condiciones adecuadas para al menos un miembro de la biblioteca de compuestos que se unen a la diana, seguido de la eliminación de miembros de la biblioteca que no se unen a la diana, seguido de la amplificación de la región de identificación por métodos conocidos en la técnica, y posteriormente analizando la región o regiones de identificación por métodos conocidos en la técnica.

[0047] En una realización, el método de amplificación de la región identificadora puede incluir, por ejemplo, reacción de cadena de la polimerasa (PCR), amplificación de cadena lineal (LCR), amplificación por círculo rodante (RCA), o cualquier otro método conocido en la técnica para amplificar secuencias de ácido nucleico.

[0048] En una realización adicional, la biblioteca de compuestos no se agrupó después del paso final de la adición de bloques de construcción y las reservas son cribadas individualmente para identificar el (los) compuesto(s) que se unen a una diana.

[0049] En otra realización, las moléculas que se unen a una diana no están sometidas a la amplificación, pero se analizan directamente. Los métodos de análisis incluyen, p. ej, análisis de microarrays o métodos basados en perlas para deconvolutizar las regiones de identificación (Fig. 9). Las moléculas que se unen durante el paso de selección también pueden detectarse mediante un biosensor de cristal fotónico sin marcaje.

[0050] En una realización, el oligonucleótido iniciador y/o el oligonucleótido cebador contienen un resto funcional que permite su detección por, por ejemplo, etiquetas fluorescentes, puntos Q o biotina.

[0051] En una realización, el análisis de microarrays utiliza una capacidad de detección avanzada, tal como, por ejemplo, cristales fotónicos de resonancia evanescente.

[0052] En una realización, el método de amplificación incluye la formación de una emulsión de agua en aceite para crear una pluralidad de microrreactores acuosos, en donde al menos uno de los microrreactores tiene al menos un miembro de una biblioteca de compuestos que se une a la diana, una sola cuenta capaz de unirse al oligonucleótido codificante del al menos un miembro de la biblioteca de compuestos que se une a la diana, y la solución de reacción de amplificación que contiene los reactivos necesarios para realizar la amplificación del ácido nucleico, amplificando el oligonucleótido codificante en los microrreactores para formar copias amplificadas del oligonucleótido codificante y unión de las copias amplificadas del oligonucleótido codificante a las cuentas en los microrreactores.

[0053] Una vez que los bloques de construcción de la primera biblioteca que se unen a la diana de interés han sido identificados, una segunda biblioteca se puede preparar de manera iterativa, en donde se añaden uno o dos nodos adicionales de la diversidad, y se crea biblioteca y diversidad muestreada como se describe aquí. Este proceso puede repetirse tantas veces como sea necesario para crear moléculas con las propiedades moleculares y farmacéuticas deseadas.

[0054] Los bloques de construcción A ejemplares incluyen, por ejemplo, aminoácidos (no limitados a alfaaminoácidos), reactivos de química de clic (p. ej., cadenas de azida o alcalinas) con una amina, o un reactivo de tiol. La elección del bloque de construcción A depende, por ejemplo, de la naturaleza del grupo reactivo utilizado en el enlazador, la naturaleza de un resto de andamio y el disolvente utilizado para la síntesis química. Ver, por ejemplo, la Tabla 1.

Tabla 1. Bloques de construcción A de posición ejemplar

(Continuación)

[0055] Los bloques de construcción B y C ejemplares se describen en las Tablas 2 y 3, respectivamente. Puede introducirse un sitio de restricción, por ejemplo, en la posición B o C para el análisis del producto final y la selección mediante PCR y digestión de restricción con una de las enzimas de restricción correspondientes.

Tabla 2. Ejemplos de bloques de construcción de la posición B y etiquetas de ADN de codificación

(Continuación)

Tabla 3. Ejemplos de bloques de construcción de la posición C y etiquetas de ADN de codificación

(Continuación)

Modo 3

[0056] En cualquiera de los modos descritos En el presente documento (p. ej., modos 1 y 2), el oligonucleótido del casco puede modificarse para soportar la solubilidad en condiciones semi o no acuosas (p. ej., orgánicas). El casco, en determinadas formas de realización, incluye la región de identificación. En otras realizaciones, e casco con enlazador se puede derivatizar primero con un bloque de construcción (p. ej., un resto funcional) o andamio, y luego se agrega la secuencia de identificación.

[0057] Las bases de nucleótidos del casco pueden volverse más hidrófobas modificando, por ejemplo, las posiciones C5 de las bases T o C con cadenas alifáticas sin alterar significativamente su capacidad de enlace de hidrógeno con sus bases complementarias. Véase, por ejemplo, la Tabla 4 para ejemplos de bases modificadas. Además, el oligonucleótido del casco se puede intercalar con modificaciones que promuevan la solubilidad en disolventes orgánicos. Por ejemplo, la fosforamidita de azobenceno puede introducir un resto hidrófobo en el diseño del casco. Tales inserciones de amiditas hidrófobas en el casco pueden ocurrir en cualquier parte de la molécula. Sin embargo, la inserción no puede interferir con el etiquetado posterior utilizando etiquetas de ADN adicionales durante la síntesis de la biblioteca o las reacciones de PCR subsiguientes una vez que se completa la selección o el análisis de microarrays, si se usa para la deconvolución de etiquetas. Tales adiciones al diseño del casco descrito en este documento harían que el casco sea soluble en, por ejemplo, 15%, 25%, 30%, 50%, 75%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de disolvente orgánico. Por tanto, la adición de residuos hidrófobos en el diseño del casco permite una mejor solubilidad en condiciones semi o no acuosas (p. ej., orgánicas), al tiempo que hace que el casco sea competente para el marcado de ácidos nucleicos. Además, las etiquetas de ADN que se introducen posteriormente en la biblioteca también se pueden modificar en la posición C5 de las bases T o C de modo que también hagan que la biblioteca sea más hidrófoba y soluble en disolventes orgánicos para las pasos posteriores de la síntesis de la biblioteca.

[0058] La molécula de engarce entre la casco y la biblioteca de moléculas pequeñas se puede variar para aumentar la solubilidad del casco en disolvente orgánico. Se encuentra disponible comercialmente una amplia variedad de enlazadores que pueden acoplar el casco con la biblioteca de moléculas pequeñas. Los enlazadores se seleccionan empíricamente para un diseño de biblioteca de moléculas pequeñas dado (andamios y bloques de construcción) de modo que la biblioteca se pueda sintetizar en un disolvente orgánico, por ejemplo, 15%, 25%, 30%, 50%, 75%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de disolvente orgánico. El enlazador se puede variar usando reacciones modelo antes de la síntesis de la biblioteca para seleccionar la longitud de cadena apropiada que solubiliza la casco en solvente orgánico. Dichos enlazadores pueden incluir enlazadores con, por ejemplo, mayor longitud de cadena de alquilo, mayor cantidad de unidades de polietilenglicol, especies ramificadas con cargas positivas (para neutralizar las cargas negativas de fosfato en el casco) o mayores cantidades de hidrofobicidad (p. ej., adición de estructuras de anillo de benceno).

[0059] La molécula de enlace puede proporcionar un espaciador apropiado entre el ADN casco y el miembro de un producto químico de la biblioteca. Por ejemplo, pueden usarse enlazadores bifuncionales. En determinadas realizaciones, los enlazadores bifuncionales pueden incluir, por ejemplo, tres partes. La parte 1 puede ser un grupo reactivo, que forma un enlace covalente con el ADN, como, por ejemplo, un ácido carboxílico, preferiblemente activado por un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) para reaccionar con un grupo amino en el ADN (p. ej., dT aminomodificado), una amidita para modificar el extremo 5' o 3' de un casco de ADN monocatenario (logrado por medio de la química de oligonucleótidos estándar), pares de química de clic (cicloadición de alquino azida en presencia de catalizador de Cu (I)), o grupos reactivos con tiol. La parte 2 también puede ser un grupo reactivo, que forma un enlace covalente con la biblioteca química, ya sea un bloque de construcción en la posición A o un resto de andamio. Tal grupo reactivo podría ser, por ejemplo, una amina, un tiol, una azida o un alquino para reacciones basadas en agua o múltiples otros grupos reactivos para las reacciones orgánicas. La parte 3 puede ser un espaciador químicamente inerte de longitud variable, introducido entre las partes 1 y 2. Dicho espaciador puede ser una cadena de unidades de etilenglicol (p. ej., PEG de diferentes longitudes), un alcano, un alqueno, una cadena de polienos o una cadena de péptido. El enlazador puede contener ramificaciones o inserciones con restos hidrófobos (tales como, por ejemplo, anillos de benceno) para mejorar la solubilidad del casco en disolventes orgánicos, así como restos fluorescentes (p. ej., fluoresceína o Cy-3) usados con fines de detección de bibliotecas.

[0060] Los ejemplos de enlazadores disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, enlazadores aminocarboxílicos (p. ej., péptidos (p. ej., Z-GlyGly-Gly-Osu o Z-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Osu), PEG (p. ej., FmocaminoPEG2000-NHS o amino-PEG (12-24)-NHS), o cadenas de alcanoácidos (p. ej., ácido Boc-£-aminocaproico-Osu)), enlazadores químicos de clic (p. ej., péptidos (p. ej., azidohomalanina). Ejemplos de bases de nucleótidos modificadas Gly-Gly-Gly-OSu o propargilglicina-Gly-Gly-Gly-OSu), PEG (p. ej., azido-PEG-NHS) o cadenas de ácido alcano (p. ej., ácido 5-azidopentanoico, (S/)-2-(azidometilo)-1-Boc-pirrolidina o éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 4-azido-butan-1-oico)), enlazadores reactivos con tiol (p. ej., PEG (p. ej., SM(PEG)ⁿNHS-PEG-maleimida), cadenas de alcanos (p. ej., ácido 3-(piridina-2-ildisulfanilo)-propiónico-Osu o sulfosuccinimidilo 6-(3'-[2-piridilditio]-propionamido)hexanoato))), amiditas para la síntesis de oligonucleótidos (p. ej., modificadores de amino (p. ej., 6-(trifluoroacetilamino)-hexilo-(2-cianoetilo)-(N,N-diisopropilo)-fosforamidita), modificadores de tiol (p. ej., S-tritilo-6-mercaptohexilo-1-[(2-cianoetilo)-(N,N-diisopropilo)]-fosforamidita, o modificadores de la química (p. ej., 6-hexin-1-ilo-(2-cianoetilo)-(N,N-diisopropilo)-fosforamidita, 3-dimetoxitritiloxi-2-(3-(3-propargiloxipropanamido)propanamido)propilo-1-O-succinoilo, alquilamino CPG de cadena larga o ácido 4-azidobutan-1-oico N-hidroxisuccinimida ester)).

[0061] Residuos hidrófobos en el diseño de casco se puede variar con el diseño de engarce para facilitar la síntesis de la biblioteca en disolventes orgánicos. Por ejemplo, la combinación de casco y conector está diseñada para tener residuos apropiados en los que el coeficiente octanol:agua (Poct) es de, por ejemplo, 1,0 a 2,5.

EJEMPLOS

[0062] Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar la invención. No pretenden limitar la invención de ninguna manera.

Ejemplo 1. Preparación del casco (Variante 1)

[0063] Un casco de oligonucleótido fosforilado (oligo HP) que tiene la siguiente secuencia se sintetizó y se purificó por HPLC por el ADN IDT.

[0064] El oligonucleótido se pliega en una horquilla (Fig. 10) con un saliente y contiene un sitio de escisión (CCTCAGC) para la enzima de restricción BbvCI o versiones nicking de esta enzima Nb.BbvCI o Nt.BbvCI, que puede escindir la parte superior o hebra inferior (New England BioLabs). En el medio del bucle de horquilla, se inserta el dT modificado con amino C5 de la cadena lateral (dT-C6-NH; "C6" se refiere a un enlazador de carbono 6), que se utilizó para el acoplamiento del enlazador amino-PEG (PEG2000, aproximadamente 45 unidades de etilenglicol). Las cadenas superior e inferior de las etiquetas de ADN A, B y C se sintetizaron y purificaron mediante ADN de IDT y se purificaron mediante desalación estándar. Se sintetizaron oligonucleótidos más largos, como el extremo 3' y los cebadores de PCR, mediante ADN de IDT y se purificó por HPLC.

[0065] Diez nanomoles del oligo HP se disolvieron en 50 pl de agua. Se disolvió un exceso molar de 20 veces de éster Fmoc-amino-PEG2000-carboxilo-NHS(JenKem Technology USA) en 50 pl de dimetilformamida (DMF) y se añadió a la solución de oligonucleótidos en 2 porciones durante el transcurso de 2 horas a temperatura ambiente. temperatura (composición final del disolvente de 50% DMF/50% agua). Posteriormente, se añadieron 60 pl de 1 M Tris HCl, pH 7,0 (concentración final de 200 mM), para apagar el exceso de ésteres de NHS, y la solución se incubó durante 30 minutos más a temperatura ambiente. La mezcla de reacción resultante se diluyó hasta 500 pl con agua y se desaló pasándola a través de una columna NAP-5 (Scphadex-25, GE Healthcare).

[0066] El material resultante se liofilizó y se disolvió en 100 pl de agua. Se añadieron 20 pl de piperidina (hasta una concentración final del 20%) y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Se formó un precipitado turbio debido a la desprotección de la amina y la liberación del grupo Fmoc insoluble en agua. Después, la reacción se filtró a través de 0,2 pM de filtros de rotación (Millipore) y se precipita utilizando acetato de sodio 300 mM mediante la adición de 3 volúmenes de etanol. Se encontró que la forma protegida con Fmoc del oligonucleótido modificado era soluble en etanol e isopropanol. Debido a la alta eficiencia de acoplamiento, el casco resultante (HP-1) se utilizó sin purificación adicional (Fig. 11).

Ejemplo 2. Preparación del casco (Variante 2)

[0067] Un casco completo (HP-1) que tiene la siguiente secuencia fue preparado por Trilink, Inc, siguiendo un procedimiento similar como se describe anteriormente, y RP-HPLC purificado,

5 ’-(fosfatO)TCCTGGCTGAGGCGAGAGTT(dT-C6-NH)(X)

ITCTCTCGCC_1-CAGCCAGGACC-r (SEQ ID NO: 52)

donde X significa amino-PEG2000.

Ejemplo 3. Síntesis de un miembro de biblioteca modelo

Paso 1: Acoplamiento de DTAF

[0068] Con el fin de preparar una "biblioteca de 1", un compuesto modelo, 5-(4,6-didorotriazinilo-aminofluoresceína) (DTAF; Anaspec) (Fig. 12), se acopló al grupo amino de HP-1. DTAF representa estructuralmente un andamio de triclorotriazina con un compuesto amino acoplado. Para formar una biblioteca, los andamios de triclorotriazina se pueden derivatizar con una diversidad de componentes básicos en cada una de las tres posiciones del cloro. DTAF también proporciona una etiqueta fluorescente a la biblioteca de modelos. La reacción (10 j l ) se preparó como sigue. A 5 j l de HP-1 400 jM disuelto en agua, se agregaron 2 j l de tampón borato 750 mM, pH 9,5 y 1 j l de DMF. Se disolvió DTAF en DMF hasta 50 mM y se añadieron 2 j l a la reacción. Las concentraciones finales de HP-1 y DTAF fueron 200 jM y 10 mM, respectivamente, generando así un exceso de 50 veces de DTAF. La concentración final de DMF fue del 30%. Se notó que HP-1 permanecía soluble en hasta un 90% de DMF, demostrando que era soluble en un disolvente orgánico, por ejemplo, DMF. Se dejó que la reacción transcurriera a 4°C durante 16-20 horas. Después, la mezcla de reacción se diluyó con agua a 30-50 j l y se desaló en una columna de centrifugación Zeba (Pierce). En este punto no se completó ninguna purificación adicional.

Paso 2: Acoplamiento de amino-biotina

[0069] Después de acoplarse DTAF a HP-1, un grupo más reactivo en la molécula de soporte está todavía disponible para su modificación. Elegimos un análogo de aminobiotina, EZ-Link Pentylamine-Biotin (Pierce), para acoplarlo en esta posición con el fin de generar un compuesto de unión modelo (Fig. 12). La reacción se estableció como sigue. 20 j l de la mezcla de reacción contenía aproximadamente 200 pmol de HP-1-DTAF (Paso 1) disuelto en tampón borato 150 mM, pH 9,5, y 10 nmol de pentilamina-biotina. Se dejó que la reacción prosiguiera durante 4-12 horas a 75°C. A continuación, la reacción se purificó desalando en una columna giratoria Zeba, como se describió anteriormente.

Paso 3: Ligación de las etiquetas de ADN para HP-1-DTAF-biotina

[0070] Etiquetas de ADN fosforilado (región final del cebador 3' y cebadores de PCR 5' y 3') se sintetizaron por el ADN IDT. Las secuencias de oligonucleótidos (Fig. 13) son las siguientes.

Etiqueta de ADN A1 (superior): 5-phos-GGAGGACTGT (SEQ ID NO: 53)

Etiqueta de ADN A1 (inferior): 5'-phos-AGTCCTCCGG (SEQ ID NO: 54)

Etiqueta de ADN B1 (superior): 5'-phos -CAGACGACGA (SEQ ID NO: 55)

Etiqueta de ADN B1 (inferior): 5'-phos-GTCGTCTGAC (SEQ ID NO: 56)

Etiqueta de ADN C1 (superior): 5'-phos-CGATGCTCTT (SEQ ID NO: 57)

Etiqueta de ADN C1 (inferior): 5'-phos-GAGCATCGTC (SEQ ID NO: 58)

Extremo 3' (superior): 5'-phos-GCTGTGCAGGTAGAGTGC-3' (SEQ ID NO: 59)

Extremo 3' (inferior): 5'-AACGACACGTCCATCTCACG (SEQ ID NO: 60)

Cebador de PCR 5': 5'-CTCTCGCCTCAGCCAGGA (SEQ ID NO: 61)

Cebador de PCR 3': 5'-GCACTCTACCTGCACAGC (SEQ ID NO: 62)

[0071] Cantidades equivalentes de pares superiores e inferiores de etiquetas y los oligonucleótidos del extremo 3' se disolvieron en agua y se reasociaron calentando a 85°C y disminuyendo gradualmente a 4°C en tampón NaCl 200 mM, Tris HCl 50 mM, pH 7,0.

[0072] En primer lugar, se ligó la etiqueta A1 de doble hebra al casco. La reacción de ligación (20 ml) contenía 2,5 jM de HP-1-DTAF-biotina y 2,5 jM de etiqueta A1 de doble hebra en tampón de ADN ligasa 1x T4 y 60 unidades Weiss de ADN ligasa T4 (New England BioLabs). La reacción se incubó a 16°C durante 16 horas. El producto resultante no se resolvió en ninguno de los geles probados, incluidos diferentes porcentajes de TBE-urea, NativePage, SDS-PAGE o E-gel de agarosa al 2% y 4% (Invitrogen, Inc.). La movilidad del oligonucleótido, modificado con enlazador PEG y DTAF-biotina, se determinó principalmente por la presencia de estos grupos más que por el ADN en sí (datos no mostrados). Para probar la eficacia de la ligadura, ligamos todas las etiquetas y los oligonucleótidos del extremo 3' y realizamos ensayos de PCR de la construcción resultante para confirmar la eficacia de la ligadura. La reacción de ligación (70 ml) contenía: 2,5 jM de HP-1-DTAF-biotina; 2,5 jM de cada una de las etiquetas de ADN de doble hebra hibridadas (A1, B1 y C1), así como la etiqueta del extremo 3'; 1x tampón de ADN ligasa T4; y 210 unidades Weiss de ADN ligasa T4. La reacción se incubó a 16°C durante 20 horas.

[0073] La mezcla de reacción se cargó en un 4% de agarosa gel y la banda fluorescente se extrajo del gel. Este material se utilizó para la amplificación por PCR de 24 ciclos de prueba utilizando los cebadores 5' y 3' como se describió anteriormente. Los resultados se resumen en la Fig 13.

Paso 4: Purificación de HP-1-DTAF-biotina en cuentas de estreptavidina y reacción con estreptavidina

[0074] Purificación de HP-1-DTAF-biotina en estreptavidina (SA) Las perlas magnéticas Dynal M-280 (Invitrogen) sirven como modelo para la selección de afinidad para la biblioteca etiquetada con ADN químico. Las perlas de SA se preequilibraron en tampón PBS 2x que contenía Triton X-100 al 0,05%. Se cargaron 50 pmol de HP-1-DTAF-biotina en 25 |jl de cuentas de SA prelavadas durante 15 minutos a temperatura ambiente con volteo. Se recogió el flujo continuo y las perlas se lavaron 3 veces durante 30 minutos con 1 j l del mismo tampón. Se realizó un lavado final a 80°C durante 10 minutos con 30 ml de agua (recogida). Las perlas se eluyeron con 30 j l de EDTA 25 mM y NaOH 5 mM durante 10 minutos a 90°C, y el eluyente se neutralizó inmediatamente añadiendo 3 j l de Tris HCl 1 M, pH 7,0.

[0075] Para el experimento de unión a estreptavidina, 5 j l de las muestras de elución se incubaron con un exceso de estreptavidina en NaCl 50 mM/Tris HCl 10 mM, pH 7,0, durante 10 minutos. Las muestras se mezclaron con tampón de carga de gel sin hervir y se resolvieron en un gel SDS NuPage al 4-12% (Invitrogen) usando tampón de ejecución MES. Los resultados se resumen en la Fig. 14.

Ejemplo 4. El acoplamiento de péptido H(-Arg-£Ahx)⁶Arg-OH a HP-1-DTAF

[0076] Hemos escogido un péptido rico en arginina R7, H(-Arg-£Ahx)⁶-Arg-OH (Bachem), para usar como otra modificación para el último grupo reactivo en el andamio de triazina. Este es un péptido permeable a la membrana celular de ácido arginina-aminohexanoico utilizado para la administración de compuestos intracelulares. La reacción se estableció de manera similar a las condiciones de reacción descritas anteriormente: 20 ml de reacción contenían aproximadamente 200 pmol de HP-1-DTAF (Paso 1) disueltos en tampón borato 150 mM, pH 9,5 y 10 nmol de péptido R7. En estas condiciones, las cadenas laterales de las argininas no reaccionan y la única amina reactiva en el péptido es el extremo N-terminal. Se dejó que la reacción transcurriera durante 12 horas a 75°C y luego se purificó desalando en una columna de centrifugación Zeba.

Ejemplo 5. Constructo de ADN para experimento de detección de entrega T7 RNAP intracelular

[0077] El constructo de ADN utilizado para el experimento de entrega química "biblioteca de 1" intracelular se preparó a partir de un producto de PCR de un solo clon Vh ADN de -400 pb que ofrece una región promotora T7 en el extremo 5' y una región Cmu constante de anticuerpo corta cerca del extremo 3' de la molécula. Para unir la construcción de ADN al casco modificado de la biblioteca química modelo, se añadió un sitio de restricción Bsml corriente arriba de la región promotora de T7 mediante amplificación por PCR del clon. La digestión de restricción Bsml produjo un saliente 3' GG, que permitió la ligadura al casco (saliente 3' CC). El cebador 5' con sitio Bsml (subrayado) fue sintetizado por IDT DNA, Inc.

5 ’-GGATGCCGAATGCCTAATACGACTCACTATAGGG-

ACAATTACTAT1TACAATTACA (SEQ ID NO: 63)

[0078] Después de la amplificación PCR, la construcción de ADN se purificó utilizando un kit de purificación de PCR (Invitrogen), y el ADN resultante se digirió con 250 U Bsml (New England BioLabs) a 65°C en tampón NEB 4 durante 2 horas. El ADN se purificó en un gel de agarosa al 2%. La reacción de ligación (30 j l) contenía 2 pmol de cada constructo de ADN V^h, digerido con BsmI, así como HP-1-DTAF-R7 (péptido de ácido arginina-aminohexanoico) en tampón de ligasa de ADN 1x T4 y 60 unidades Weiss de ADN ligasa T4 (New England BioLabs). La reacción se incubó a 16°C durante 20 horas. Debido a la alta eficiencia de la ligadura, el material se usó adicionalmente para el experimento de administración intracelular/T7 RNAP sin purificación adicional. Los resultados se resumen en la Fig. 15.

Ejemplo 6. Síntesis de Biblioteca 10X10

Paso 1. Ligación de la etiqueta A al casco HP-T

[0079] En esta biblioteca a modo de ejemplo, sólo se utilizan las posiciones B y C. Una etiqueta A está ligada a HP-T. La etiqueta tiene la siguiente secuencia:

Etiqueta de ADN A1 (superior): 5'-phos-GGAGGACTGT (SEQ ID NO: 64)

Etiqueta de ADN A1 (inferior): 5'-phos-AGTCCTCCGG (SEQ ID NO: 65)

[0080] Se mezclaron 30 nmol de HP-T con 45 nmol de cada oligonucleótido Etiqueta de A1 superior y Etiqueta de A1 inferior en tampón de ligasa de ADN 1x T4 y se hibridaron por calentamiento a 95°C durante 1 minuto, seguido de enfriamiento a 4°C a 0,2°C /segundo. Luego, la muestra se llevó a 16°C. Se añadieron 300 Unidades Weiss de ADN ligasa T4 y se dejaron incubar las muestras durante 16-20 horas a 16°C. Después de la ligación, se desaló HP-TA usando una columna Zeba (Pierce). Véase, por ejemplo, la Fig. 16A.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de identificación de uno o más compuestos que se unen a una diana biológica, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto una biblioteca de compuestos, o una parte de la misma, con la diana biológica en condiciones adecuadas para que al menos un miembro de la biblioteca de compuestos se une a dicha diana, en donde los compuestos contienen un resto funcional que tiene una o más posiciones de diversidad, en donde los compuestos contienen un casco que incluye un oligonucleótido iniciador que identifica la estructura del resto funcional, en donde el resto funcional de los compuestos está operativamente enlazado mediante un enlazador al oligonucleótido iniciador, y en donde el oligonucleótido iniciador forma una estructura de horquilla;

(b) eliminar miembros de la biblioteca que no se unen a dicha diana; y

(c) analizar la región o regiones de identificación;

en donde la combinación de casco y conector está diseñada para tener residuos apropiados en donde el coeficiente octanol:agua es de 1,0 a 2,5.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho enlazador bifuncional se modifica para aumentar la solubilidad de dichos uno o más compuestos en condiciones orgánicas.

3. El método de la reivindicación 1, en donde dicho enlazador bifuncional comprende una cadena de unidades de etilenglicol, un alcano, un alqueno, una cadena polieno o una cadena peptídica.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dicho casco comprende un nucleótido T o C que comprende una cadena alifática en la posición C5.

5. El método de la reivindicación 1, en donde dicha diana biológica es una enzima, una proteína involucrada en una interacción proteína:proteína, una diana receptora, un canal iónico, una bacteria, un virus, un parásito, ADN, ARN, una proteína priónica o un carbohidrato.

6. El método de la reivindicación 1, en donde dicho análisis de la región de identificación o regiones de identificación de dicho al menos un compuesto unido a dicha diana comprende la amplificación de dicha región de identificación o regiones de identificación.

7. El método de la reivindicación 6, en donde dicha amplificación de dicha región de identificación o regiones de identificación comprende la reacción en cadena de la polimerasa, la reacción en cadena lineal o la amplificación por círculo rodante.

8. El método de cualquier reivindicación anterior, que comprende además sintetizar una biblioteca de compuestos antes del paso (a).