JP4969459B2 - 核酸鋳型合成において使用される遊離反応体 - Google Patents
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Description
本出願は、2005年1月21日に出願された米国特許出願第60/646,584号の利益およびその優先権を主張するものであり、その全開示は、本明細書中に参考として援用される。
本願に記載された研究は、一部、米国海軍研究事務所によって契約番号N00014−03−1−0749の下、およびNIH/NIGMSによって助成金R01 GM065865の下に資金援助を受けた。米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
本発明は、一般的に、核酸鋳型合成を行うための方法および組成物に関する。より詳しくは、本発明は、反応中間体を作製するために核酸鋳型合成を行うための方法および組成物に関し、この反応中間体は次いで、この反応中間体と反応して反応生成物を生成させる遊離反応体を用いて、反応生成物に化学的に変換され得る。
核酸鋳型有機合成により、従来の合成形式では可能でない制御反応様式が可能になり、これまでは生体高分子に対してのみ利用可能であった翻訳方法、選択方法および増幅方法を用いて合成分子を操作することが可能になる(非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3;非特許文献4;非特許文献5;非特許文献6;非特許文献7;非特許文献8;非特許文献9;非特許文献10;非特許文献11;非特許文献12)。核酸鋳型合成、特に、DNA鋳型有機合成(すなわち、DTS)によって得られ得る構造は、主に、2つの核酸連結反応体間のカップリング反応の生成物に限定されている。しかしながら、場合によっては、反応体をオリゴヌクレオチドに係留(tether)することが困難または不可能である。したがって、非オリゴヌクレオチド連結低分子試薬を、配列プログラム形式または配列記録化様式で反応させることを可能にするストラテジーの開発により、核酸鋳型合成の合成能力が有意に拡張される。
Gartnerら(2001)J.AM.CHEM.SOC.123:6961−3 Gartnerら(2002)ANGEW.CHEM.,INT.ED.ENGL.123:61796−1800 Gartnerら(2002)J.AM.CHEM.SOC.124:10304−6 Calderoneら(2002)ANGEW.CHEM.,INT.ED.ENGL.41:4104−8 Gartnerら(2003)ANGEW.CHEM.,INT.ED.ENGL.42:1370−5 Liら(2004)J.AM.CHEM.SOC.124:5090−2 Kananら(2004)NATURE 431:545−9 Gartnerら(2004)SCIENCE 305:1601−5 Liら(2004)ANGEW.CHEM.INT.ED.43:4848−70 Brennerら(1992)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 89:5181 Doyonら(2003)J.AM.CHEM.SOC.125:12372−3 Halpinら(2004)PLOS BIOL.2:e174
本発明は、試薬をオリゴヌクレオチドに係留させる必要性に取り組むことによって核酸鋳型有機合成の範囲を拡張するための方法および組成物を提供する。試薬を核酸、例えばDNAに連結させることが可能でも簡便でもない場合、それにもかかわらず、このような変換により、かかる試薬が、核酸配列と生成物の構造との対応性を保持したまま低分子合成に寄与することが可能になる。また、カップリング反応から核酸鋳型工程を切り離すこと(decoupling)によって、このアプローチにより、必ずしも核酸ハイブリダイゼーションが補助されない条件下で結合形成を行うことが可能になる。
用語「コドン」および「アンチコドン」は、本明細書で用いる場合、それぞれ、鋳型および転移(transfer)単位内の相補オリゴヌクレオチド配列であって、核酸鋳型合成中、転移単位が鋳型にアニーリングするのを可能にする相補オリゴヌクレオチド配列をいう。
本発明は、分子(例えば低分子)のライブラリーの合成に有用である。本明細書に記載する官能基変換は、試薬をオリゴヌクレオチドに係留させる必要性に取り組むことにより核酸鋳型有機合成の範囲を拡張するのに特に有用である。オリゴヌクレオチドへの試薬の連結が可能でも簡便でもない場合、それにもかかわらず、このような変換により、かかる試薬が、オリゴヌクレオチド配列と得られる生成物の構造との対応性を保持したまま低分子合成に寄与することが可能になる。
核酸鋳型は、相補オリゴヌクレオチドに連結された反応体を配列特異的に補充することにより、明白な構造的要件なしで、多種多様な化学反応を指図(direct)し得る。合成中、鋳型は、1つ以上の転移単位にハイブリダイズまたはアニーリングして反応中間体の合成を指図し、続いて該反応中間体が、遊離反応体によって反応生成物に変換され得る。次いで、反応生成物を、一定の基準(例えば、予め選択した標的分子に結合する能力など)に基づいて選択またはスクリーニングする。反応生成物が同定されたら、次いで、会合した鋳型を配列決定し、反応中間体および/または反応生成物の合成履歴をデコード(decode)し得る。
鋳型の長さは、想定される核酸鋳型合成の型に応じて大きく異なり得る。例えば、ある特定の実施形態において、鋳型は、10〜10,000ヌクレオチド長、20〜1,000ヌクレオチド長、20〜400ヌクレオチド長、40〜1,000ヌクレオチド長または40〜400ヌクレオチド長であり得る。鋳型の長さは、もちろん、例えば、コドンの長さ、ライブラリーの複雑さ、反応生成物の複雑さおよび/または大きさ、スペーサー配列の使用などに依存する。
鋳型の配列は、多数の方法で設計され得ることが想定される。例えば、コドンの長さは決定されなければならず、コドン配列は設定されなければならない。2という長さのコドンが使用される場合、4種類の天然に存在する塩基を用いて16通りだけの可能な組合せが、ライブラリーをコードする際の使用に利用可能である。コドンの長さを伸ばして3(自然界でタンパク質をコードする際に使用される数)にすると、可能な組合せの数は64に増加する。コドンの長さを伸ばして4にすると、可能な組合せの数は256に増加する。コドンの長さの決定に考慮されるべき他の要素は、ミスマッチ、フレームシフト、ライブラリーの複雑さなどである。コドンの長さをある点まで増やすにつれて、ミスマッチの数は減少する。しかしながら、過度に長いコドンは、ミスマッチした塩基対にもかかわらずハイブリダイズする可能性がある。
鋳型は、当該技術分野で周知の方法論を用いて合成され得る。このような方法としては、インビボ方法およびインビトロ方法の両方、例えば、PCR、プラスミド調製、エンドヌクレアーゼ消化、固相合成(例えば、自動合成装置を使用)、インビトロ転写、鎖の分離(strand separation)などが挙げられる。合成後、所望の場合は、鋳型を目的の反応性単位と、当該技術分野で公知の標準的なカップリング化学を用いて結合(例えば、共有または非共有結合)させ得る。
転移単位は、アンチコドン配列および反応性単位を含有するオリゴヌクレオチドを含む。アンチコドンは、鋳型内に存在するコドンに相補的となるように設計される。したがって、アンチコドンを設計する際は、鋳型に用いられる配列およびコドン長を考慮すべきである。鋳型に用いられるコドンに相補的な任意の分子、例えば、天然または非天然のヌクレオチドが使用され得る。ある特定の実施形態において、コドンは、自然界に見られる1個以上の塩基(すなわち、チミジン、ウラシル、グアニジン、シトシンおよびアデニン)を含む。したがって、アンチコドンとしては、通常自然界に見られ、塩基、糖および必要に応じたリン酸基を有する1個以上のヌクレオチドが挙げられ得る。
多様な化合物および/またはライブラリーが、本明細書に記載の方法を用いて調製され得る。ある特定の実施形態において、核酸でもその類似体でもないか、またはこれらに似ていない化合物が、本発明の方法に従って合成される。ある特定の他の実施形態において、タンパク質、ペプチドまたはその類似体でなないか、またはこれらに似ていない化合物が、本発明の方法に従って合成される。
ある一部の実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて低分子などの化合物を創製することが可能である。このような低分子は、非ポリマー系および/または非オリゴマー系の天然産物などであり得る。低分子における相当な関心は、一部は、多くの医薬調製物の活性成分としてのその使用のためであるが、これらはまた、例えば、触媒、材料または添加剤としても使用され得る。
ある特定の実施形態において、ポリマー(特に、非天然ポリマー)が、本明細書に記載の手法を用いて調製され得る。例示的な非天然ポリマーとしては、限定されないが、ペプチド核酸(PNA)ポリマー、ポリカルバメート、ポリウレア、ポリエステル、ポリアクリレート、ポリアルキレン(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン)、ポリカーボネート、非天然の空間的配置を有するポリペプチド、非天然アミノ酸を有するポリペプチド、およびこれらの組合せが挙げられる。ある特定の実施形態において、該ポリマーは、少なくとも10、25、75、100、125、150個またはそれより多くのモノマー単位を含む。本明細書に記載の方法論を用いて合成される該ポリマーは、例えば、触媒、医薬品、金属キレート化剤、または触媒として使用され得る。
核酸鋳型反応(例えば、反応中間体を作製するための核酸鋳型反応)は、水性もしくは非水性(すなわち有機系)の溶液、または1種類以上の水性および非水性の溶液の混合物中で行われ得ることを理解されたい。水溶液中では、反応は、約2〜約12、または好ましくは約2〜約10、またはより好ましくは約4〜約10のpH範囲で行われ得る。DNA鋳型化学反応に用いられる反応は、好ましくは、非常に塩基性の条件(例えば、pH>12、pH>10)または非常に酸性の条件(例えば、pH<1、pH<2、pH<4)のいずれをも必要とすべきでない。これは、極端な条件により、核酸鋳型および/または合成される分子(例えば、ポリマーもしくは低分子)の分解または修飾がもたらされ得るからである。水溶液は、1種類以上の無機塩(例えば、限定されないが、NaCl、Na2SO4、KCl、Mg+2、Mn+2など)を種々の濃度で含有し得る。
反応中間体を創製するため、および/または反応中間体から反応生成物を創製するために、多種多様な化学反応が使用され得ることを理解されたい。ポリマー、低分子または他の分子を合成するための既知の化学反応が、核酸鋳型反応において使用され得る。したがって、March’s Advanced Organic Chemistry、Organic Reactions、Organic Syntheses、有機化学の教科書、Journal of the American Chemical Society、Journal of Organic Chemistry、Tetrahedronなどの雑誌、およびCarruther’s Some Modern Methods of Organic Chemistryなどに示された反応が使用され得る。選択される反応は、好ましくは、DNAもしくはRNAなどの核酸と適合性であるか、または鋳型として使用する修飾された核酸と適合性である。
(i)選択およびスクリーニングアプローチ
所望の活性(触媒活性、結合親和性または活性アッセイにおける特定の効果など)を有する反応生成物の選択および/またはスクリーニングが、当該技術分野で知られ、使用されている方法論を用いて行われ得る。例えば、親和性選択は、ライブラリー系選択方法、例えば、ファージディスプレイ、ポリソームディスプレイ、およびmRNA−融合タンパク質ディスプレイペプチドなどに使用される原理に従って行われ得る。触媒活性に関する選択は、遷移状態アナログアフィニティーカラムにおける親和性選択(Bacaら(1997)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 94(19):10063−8)、または機能に基づく選択スキーム(Pedersenら(1998)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 95(18):10523−8)によって行われ得る。微量のDNA(約10−20mol)がPCRによって増幅され得るため(Kramerら(1999)CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,F.M.編)15.1−15.3,Wiley)、このような選択は、現行の方法による反応解析に必要とされるものより10桁以上小さい規模で行われ得、経済的かつ効率的で真に広い研究が行われ得る。
一旦すべての回の選択が完了したら、選択された反応生成物に結合しているか、または以前は該反応生成物に結合していた鋳型を、好ましくは、鋳型の配列決定または他の後の操作を容易にする任意の適切な手法を用いて増幅させる。天然オリゴヌクレオチドは、任意の当該技術分野の技術水準の方法によって増幅させ得る。このような方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR);核酸配列に基づく増幅(例えば、Compton(1991)NATURE 350:91−92を参照)、アンチセンスRNAの増幅(例えば、van Gelderら(1988)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 85:77652−77656を参照);自続型配列複製系(Gnatelliら(1990)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 87:1874− 1878);ポリメラーゼ非依存的増幅(例えば、Schmidtら(1997)NUCLEIC ACIDS RES.25:4797−4802を参照)、およびクローン化されたDNA断片を保有するプラスミドのインビボ増幅が挙げられる。PCR法の説明は、例えば、Saikiら(1985)SCIENCE 230:1350−1354;Scharfら(1986)SCIENCE 233:1076−1078;および米国特許第4,683,202号に見られる。リガーゼ連鎖反応(LCR)などのリガーゼ媒介性増幅方法もまた使用され得る。一般に、選択した核酸配列の忠実で効率的な増幅を可能にする任意の手段が、本発明の方法において使用され得る。必要ではないが、増幅後の配列の比例的表示が、増幅前の混合物中の配列の相対的割合を反映することが好ましい。
この実施例では、アジドがアミン、チオールまたはカルボン酸に特異的に変換され得る配列プログラム化官能基変換を記載する。個々の反応スキームおよび結果としてもたらされた反応収率を、図5Aおよび5Bに示す。
(i)アジド酸の合成
図5Bに示す化合物1〜12の合成のためのアジド基質を、対応するカルボン酸前駆物質から以下のようにして調製した:
アジド酢酸(図5Bの鋳型1を作製するために使用)。この試薬を、Lundquistら(2001)ORG LETT.3:781に記載のようにして作製した。生成物は、以下の特性を有することがわかった:1H NMR(300MHz,CDCl3)δ3.96(2H,s)。
この実施例および以下の実施例全体を通して、オリゴヌクレオチドは、Perseptive Biosystems Expedite 8090 DNA合成装置で、標準的なホスホルアミダイトプロトコルを用いて合成し、分取スケール逆相HPLCを用いて精製した。自動化固相オリゴヌクレオチド合成のための試薬を、Glen Researchから購入した。以下に記載するアミン末端DNAオリゴヌクレオチドおよびビオチン化DNAオリゴヌクレオチドでは、5’アミノ修飾体5(Glen Research)を用いて5’アミノ修飾オリゴヌクレオチドを調製し、3’アミノ修飾体C7 CPG(Glen Research)を用いて3’アミノ修飾オリゴヌクレオチドを調製し、ビオチンTEG CPG(Glen Research)を用いて、3’ビオチン標識オリゴヌクレオチドを調製した。官能性付与したDNAオリゴヌクレオチドを、分析スケール逆相HPLCによって精製した。
5’アジド連結DNAオリゴヌクレオチド鋳型(図5Bの鋳型1〜11を作製するために使用)。所望のアジド酸のN−ヒドロキシスクシンイミジル(ΝHS)エステルを、等容量のそれぞれのアジド酸(DMF中900mM)、EDC(DMF中900mM)およびΝHS(DMF中900mM)を25℃で1時間混合することにより調製した。粗製ΝHSエステルを2つに分けて(各50μL)、5’アミノ修飾DΝAオリゴヌクレオチド(50μL、典型的には300μM)を100mM リン酸ナトリウムバッファー(pH7.2、350μL)中に含む溶液に添加した。これらの調製に用いた30量体鋳型は、5’NH2(C2H4O)2−PO3H−GGT ACG AAT TGC ACT CGG GAA ATC CAC CTT(配列番号1)であった。カップリング反応を25℃で1時間行った。得られた反応混合物を、NAP−5サイズ排除カラム(Amersham Biosciences)に直接ローディングし、有機溶媒、塩および過剰の低分子を除去し、アジド連結DNAオリゴヌクレオチドを、分析スケール逆相HPLC(8〜30% MeCN/0.1M TEAA勾配)によってさらに精製した。所望のオリゴヌクレオチド生成物をMALDI−TOF質量分析法によって特徴付けした。
3’トリフェニルホスフィン連結DNA。トリフェニルホスフィン基の結合は、CPG樹脂に連結させた3’アミノ修飾オリゴヌクレオチド上に行った。鋳型に充分相補的な10量体試薬は、5’AAT TCG TAC C−OPO3H−CH2CH(CH2OH)(CH2)4NHCOC6H4PPh2(配列番号2)の構造を有した。鋳型と比べて3塩基ミスマッチを含む10量体試薬は、以下の構造−5’AAT ACA TCC C−OPO3H−CH2CH(CH2OH)(CH2)4NHCOC6H4PPh2(配列番号3)を有した。後者を、これらの実験の対照として使用した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うため、反応生成物を、鋳型にアニーリングする20量体二次試薬(捕捉試薬)を用いて捕捉した。
(i)アジドからアミンへのDNA鋳型変換
30量体DNAオリゴヌクレオチド鋳型の5’末端に連結させた多様な有機アジドを、相補的なDNA10量体の3’末端にコンジュゲートさせたトリフェニルホスフィンと反応させた(図5A参照)。アジドからアミン官能基へのDNA鋳型変換を、30量体5’アジド連結鋳型(12pmol)および10量体3’トリフェニルホスフィン連結試薬(24pmol)を、全容量200μLの100mM CAPSバッファー(pH10)(500mMのNaClを含有する)中で25℃にて16時間混合することにより行った。基質4および5では、1M NaCl、およびホスフィン酸化を抑制するための0.5mM DTTの添加により、収率が増加することがわかった。代表的な反応条件は、1〜7では、60nMアジド、120nMホスフィン、0.1M CAPS pH10、0.5M NaClを含むもの;8〜11では、0.1M MES pH6.0、1M NaCl以外は上記のとおり;および12では、0.1M MOPS pH7.5、1M NaCl以外は上記のとおりとした。
反応の範囲をさらに拡張し、アジドからカルボン酸へ、およびアジドからチオール官能基への変換を行った(図5Aを参照)。両方の場合において、アジド還元によって自発的フラグメンテーションが誘導され、カルボン酸基またはチオール基が脱マスキングされた。これらの反応の効率を評価するため、DNA連結アミンを用い、カルボジイミドの存在下でカルボン酸(基質8〜10から生じた生成物)を捕捉し、一方、DNA連結臭化アルキルを用いてチオール生成物(基質11および基質12から生じた生成物)を捕捉した。
この実施例は、反応生成物を、PAGEではなく質量分析法によって特徴付けしたこと以外は実施例1と同様である。これを容易にするため、より小さい鋳型および異なる捕捉系を、同じまたは同様の条件下で使用した。
(i)アジド酸の合成
図5Bに示す化合物1〜12の合成のためのアジド基質を、実施例1に記載のようにして調製した。
この実施例で用いたオリゴヌクレオチドは、以下の変更を行って、実施例1と同様にして調製した。
鋳型オリゴヌクレオチドを、30量体鋳型を用いるのではなく、以下の10量体鋳型:5’−NH2(C2H4O)2−PO3H−GGT ACG AAT T−OPO3H−CH(CH2OH)CH2(OC2H4)4CH2NHCO−ビオチン(配列番号5)を用いたこと以外、実施例1に記載のようにして調製した。
トリフェニルホスフィン連結試薬を実施例1に記載のようにして調製した。
MALDI−TOF質量分析法をApplied Biosystems Voyager−DE Pro Biospectrometry Workstationにおいて行い、Voyager Data Explorerソフトウエアにより処理した。9部のヒドロキシピコリン酸(HPA,50% MeCN/H2O中50mg/mL)と1部のクエン酸アンモニウム(H2O中50mg/mL)の混合物を、すべての実験でマトリックスとして使用した。
相補DNA連結ホスフィン試薬(24pmol)を、10量体5’−アジド連結3’−ビオチン化鋳型(12pmol)を、100mM CAPSバッファー(pH10)(500mM NaCl含有)中に含む溶液に添加した。混合物を、25℃で0.5時間、次いで37℃で12時間攪拌した。ビオチン化生成物および未反応鋳型を、反応混合物をストレプトアビジン連結磁性粒子(Roche)で処理することにより精製し、製造業者のプロトコルに従って溶出した。溶出物中のDNAを、エタノールおよびグリコーゲンにより沈殿させた。基質11および基質12を、直接、次の質量分析による解析に供した。MALDI−TOF解析のための試料は、マトリックス溶液に溶解したペレットをZipTip Cl 8カラム(Millipore)を用いて脱塩することにより調製した。
DNA鋳型官能基変換により非DNA連結試薬が配列プログラム化合成に関与できる可能性をさらに探究するため、各々が、鋳型の操作および精製を助長するために、5’末端に異なるアジド、4種類の特有の6塩基コドンのうちの1つ、および3’末端にビオチン基を含有する4種類のDNA鋳型(鋳型13〜16、図8)を調製した。次いで、アジド連結鋳型を、TCEP−HClに曝露することによってアミン連結鋳型へと化学的に変換した。次いで、得られたアミンを遊離試薬と反応させ、アミン中間体から最終生成物への変換が起こり得るか否かを調べた。特に、塩化ダンシル(21)、エチルクロロホルメート(22)、4−メトキシフェニルイソシアネート(23)および6−モルホリノピリジニル3−イソチオシアネート(24)はその構造または水との反応性が理由でDNAに容易には結合できないため、これらすべてをアミン反応性薬剤として選択した。出発試薬および理論上の最終生成物を示す簡略化した反応スキームを図9に示す。
鋳型のコード配列を、(i)少なくとも6つの非相補的塩基対が任意の2つの異なるコドン間に存在することを確実にするため、(ii)試薬間の融解温度の差を最小限にするためにコドン1つあたり一定%のGCを維持するため、および(iii)16通りの理論上の低分子カップリング生成物の分子量が異なり、MALDI−TOF質量分析法によって識別可能となるように質量を変化させるために、コンピューテーショナルスクリーニングによって設計した。
一旦アミン連結鋳型13〜16が創製されたら、次いで、これらを可溶性試薬に曝露し、官能基変換が起こり得るか否かを調べた。各変換について、以下に詳細に論考する。
この実施例は、反応体結合鋳型の配列特異的変換を行って反応中間体を生成させ、次いで、これを遊離反応体と反応させて反応生成物を生成させ得ることが可能であることを示す。特に、アジド連結鋳型の単一溶液混合物は、アミン中間体に配列特異的に変換された。次いで、アミン中間体は、DNAに連結されていない塩化スルホニル、クロロホルメート、イソシアネートおよびイソチオシアネート反応体を用い、スルホンアミド、カルバメート、尿素およびチオ尿素生成物に配列特異的に修飾された。
(i)官能性付与したオリゴヌクレオチドの調製
(a)鋳型オリゴヌクレオチド
鋳型13〜16を、実施例3に記載のようにして調製した。
以下のトリフェニルホスフィン連結オリゴヌクレオチドの各々を、実施例1に記載のようにして調製した。
鋳型13〜16の混合物を、配列特異的反応体17と、次いで遊離反応体21と合わせた。得られた溶液を、同様に、配列特異的反応体18、続いて遊離反応体22と合わせ;配列特異的反応体19、続いて遊離反応体23と合わせ;そして配列特異的反応体20、続いて遊離反応体24と合わせた。
本明細書で言及した特許文献および学術論文の各々の全開示は、あらゆる目的のために、本明細書中に参考として援用される。
本発明は、その精神および本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。したがって、前述の実施形態は、あらゆる点において、本明細書に記載の本発明の限定ではなく例示であると考えられるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の記載ではなく、添付の特許請求の範囲によって示されるものであり、特許請求の範囲の均等の意味および範囲に含まれるあらゆる変更は、これに包含されるものとする。
Claims (30)
- 反応生成物の合成方法であって、該方法は、
(a)第1の反応性単位および第2の反応性単位を含む混合物を、該第1の反応性単位と該第2の反応性単位との間での反応が誘導される条件下に提供し、反応中間体を生成させる工程;
(b)該反応中間体に共有結合させた同定用配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する工程;ならびに
(c)該反応性単位のうちの少なくとも1種類と共存する該反応中間体を、該反応中間体に対して選択的反応性である遊離反応体と合わせ、それにより、該同定用配列に連結された反応生成物を合成する工程であって、ここで、該遊離反応体は、(i)工程(a)もしくは(b)のいずれの間にも存在せず;かつ、(ii)工程(a)において提供される混合物からの該反応性単位のうちの少なくとも1種類に対してよりも該反応中間体に対しての方が反応性が高い、工程
を包含する、方法。 - 前記同定用配列は、前記反応中間体を生成させる反応前に前記第1の反応性単位に結合され、該反応中間体に連結された状態で維持されている、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の反応性単位を、前記同定用配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列に結合させる、請求項2に記載の方法。
- 工程(a)が、前記同定用配列を該同定用配列に相補的な配列とハイブリダイズさせ、それにより、前記第1の反応性単位と前記第2の反応性単位とを反応的に近接させることを含む、請求項3に記載の方法。
- 工程(b)が、前記反応中間体の形成後に、前記同定用配列を該反応中間体に酵素的に結合させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 核酸鋳型合成による反応生成物の合成方法であって、該方法は、
(a)(i)コドン配列を含む第1のオリゴヌクレオチドに結合させた第1の反応性単位、および(ii)該コドン配列に相補的なアンチコドン配列を含む第2のオリゴヌクレオチドに結合させた第2の反応性単位、を含む混合物を提供する工程;
(b)該第1のオリゴヌクレオチドのコドン配列を該第2のオリゴヌクレオチドのアンチコドン配列とアニーリングさせて、該第1の反応性単位と該第2の反応性単位との間での反応を誘導して、少なくとも該第1のオリゴヌクレオチドに共有結合した反応中間体を形成させる工程;ならびに
(c)該反応性単位のうちの少なくとも1種類と共存する該反応中間体を、該反応中間体に対して選択的反応性である遊離反応体と合わせ、それにより、該第1のオリゴヌクレオチドに連結された反応生成物を合成する工程であって、ここで、該遊離反応体は、(i)工程(a)もしくは(b)のいずれの間にも存在せず;かつ、(ii)工程(a)において提供される混合物からの該反応性単位のうちの少なくとも1種類に対してよりも該反応中間体に対しての方が反応性が高い、工程
を包含する、方法。 - 反応生成物の合成方法であって、該方法は、
(a)第1の反応性単位の集団と第2の反応性単位との混合物を、該第1の反応性単位のうちの少なくとも1種類と該第2の反応性単位との間での反応を誘導する条件下に提供し、それにより、未反応の第1の反応性単位の残りの集団と共存する反応中間体を形成させる工程;
(b)該反応中間体に共有結合させた同定用配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する工程;
(c)該第1の反応性単位と共存する該反応中間体を、該反応中間体と選択的に反応できる遊離反応体と合わせ、それにより、同定用配列に結合した反応生成物を合成する工程であって、該反応生成物は、該第1の反応性単位の集団と共存し、ここで、該遊離反応体は、(i)工程(a)もしくは(b)のいずれの間にも存在せず;かつ、(ii)該出発混合物中の該反応性単位のうちの少なくとも1種類に対してよりも該反応中間体に対しての方が反応性が高い、工程
を包含する、方法。 - 前記同定用配列は、前記反応中間体を生成させる反応前および該反応中に前記第1の反応性単位のうちの少なくとも1種類に結合され、該反応中間体に連結された状態で維持されている、請求項7に記載の方法。
- 前記第2の反応性単位を、前記同定用配列に相補的な配列に連結させる、請求項8に記載の方法。
- 工程(a)が、前記同定用配列を該同定用配列に相補的な配列とハイブリダイズさせ、それにより、前記第1の反応性単位のうちの少なくとも1種類と前記第2の反応性単位とを反応的に近接させることを含む、請求項9に記載の方法。
- 工程(b)が、前記反応中間体の形成後に、前記同定用配列を該反応中間体に酵素的に結合させることを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記反応生成物が50%以上の収率で合成される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応生成物が75%以上の収率で合成される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応生成物が85%以上の収率で合成される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記反応生成物が98%以上の収率で合成される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 核酸鋳型合成による反応生成物の合成方法であって、該方法は、
(a)コドン配列を含む対応する異なる第1のオリゴヌクレオチドにそれぞれ結合させた複数の異なる第1の反応性単位を含む混合物を提供する工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチド配列は、そこに結合された該第1の反応性単位を示す、工程;
(b)少なくとも1種類の第1の反応性単位のコドン配列に相補的なアンチコドン配列を含む第2のオリゴヌクレオチドに結合させた第2の反応性単位を提供する工程;
(c)該第1のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1種類のコドン配列を、該第2のオリゴヌクレオチドのアンチコドン配列とアニーリングさせて、該第1の反応性単位と該第2の反応性単位との間での反応を誘導して、少なくとも第1のオリゴヌクレオチドに共有結合した第1の反応中間体を形成させる工程;ならびに
(d)該反応性単位のうちの少なくとも1種類と共存する該第1の反応中間体を、該第1の反応中間体と選択的反応性である遊離反応体と合わせ、それにより、該第1のオリゴヌクレオチドに結合した第1の反応生成物を合成する工程であって、ここで、該遊離反応体は、(i)工程(a)もしくは(b)のいずれの間にも存在せず;かつ、(ii)該混合物からの該反応性単位のうちの少なくとも1種類に対してよりも該第1の反応中間体に対しての方が反応性が高い、工程
を包含する、方法。 - (e)少なくとも1種類の第1の反応性単位のコドン配列に相補的なアンチコドン配列を含む第3のオリゴヌクレオチドに結合させた第3の反応性単位を提供する工程;
(f)該第1のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1種類のコドン配列を、前記第3のオリゴヌクレオチドのアンチコドン配列とアニーリングさせて、該第1の反応性単位と該第3の反応性単位との間での反応を誘導して、該第1のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1種類に結合した第2の反応中間体を形成させる工程;ならびに
(g)該第2の反応中間体を、該第2の反応中間体と選択的反応性である遊離反応体と合わせ、それにより、該第1のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも1種類に結合した第2の反応生成物を合成する工程であって、ここで、該遊離反応体は、該混合物中の該反応性単位のうちの少なくとも1種類に対してよりも該第2の反応中間体に対しての方が反応性が高い、工程
をさらに含む、請求項16に記載の方法。 - 核酸鋳型合成をインビトロで行う方法であって、該方法は、
(a)(i)コドン配列を規定する第1のオリゴヌクレオチドに共有結合させた第1の反応性単位をそれぞれ含む複数の異なる鋳型、および(ii)該鋳型のコドン配列に相補的なアンチコドン配列を規定する第2のオリゴヌクレオチドに共有結合させた第2の反応性単位を含む転移単位、を含む混合物を提供する工程;
(b)1つの鋳型の該コドン配列と該転移単位のアンチコドン配列とをアニーリングさせて、該第1の反応性単位と該第2の反応性単位とが互いに反応して反応中間体が生成されるように該第1の反応性単位と該第2の反応性単位とを反応的に近接させる工程;ならびに
(c)未反応の鋳型と共存させながら、該反応中間体を、該反応中間体と化学的に反応して反応生成物を生成させる遊離反応体と接触させる工程であって、ここで、該遊離反応体は、(i)工程(a)もしくは(b)のいずれの間にも存在せず;かつ、(ii)出発混合物中の該反応性単位のうちの少なくとも1種類に対してよりも該反応中間体に対しての方が反応性が高く、そしてここで、該第1のオリゴヌクレオチドは、該反応生成物に連結された状態で維持されている、工程
を包含する、方法。 - 前記第1の反応性単位が低分子骨格である、請求項18に記載の方法。
- 工程(b)において、前記第1の反応性単位の官能基が、前記反応中間体内の異なる化学的部分に変換される、請求項18に記載の方法。
- 前記低分子骨格が保護された官能基を含有している、請求項19に記載の方法。
- 工程(b)において、前記官能基を脱保護して反応中間体を生成させ、ここで、前記低分子骨格が、脱保護された官能基を含有している、請求項21に記載の方法。
- 前記反応生成物が
(a)核酸でないか、または
(b)ヌクレオチドもしくはヌクレオチド類似体のいずれでもないか、または
(c)ヌクレオチド類似体ではない、
請求項19に記載の方法。 - 工程(b)において、リボソームの補助なしで、前記第1の反応性単位と前記第2の反応性単位とが互いに反応して前記反応中間体を生成させる、請求項18に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドに結合した反応生成物を選択する工程をさらに含む、請求項18に記載の方法。
- 前記第1のオリゴヌクレオチドを増幅させる工程をさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 前記反応生成物の正体または合成履歴を決定するために、前記反応生成物に結合した第1のオリゴヌクレオチドの配列を決定するさらなる工程を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記遊離反応体が、出発混合物中の前記反応性単位の全てまたは少なくとも1種類に対してよりも前記反応中間体に対しての方が少なくとも5倍反応性が高い、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遊離反応体が、出発混合物中の前記反応性単位の全てまたは少なくとも1種類に対してよりも前記反応中間体に対しての方が少なくとも50倍反応性が高い、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遊離反応体が、出発混合物中の前記反応性単位の全てまたは少なくとも1種類に対してよりも前記反応中間体に対しての方が少なくとも1000倍反応性が高い、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
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