BRPI1008429A2 - métodos de criação e de triagem de bibliotecas de dna codificado. - Google Patents

Abstract

MÉTODOS DE CRIAÇÃO E DE TRIAGEM DE BIBLIOTECAS DE DNA CODIFICADO. A presente invenção refere-se a uma série de métodos para identificar um ou mais compostos que se ligam a um alvo biológico. Os métodos incluem a síntese de uma biblioteca de compostos, em que os compostos contêm uma porção funcional tendo uma ou mais posições de diversidade. A porção funcional dos compostos é operativamente ligada a um oligonucleotídeo iniciador que identifica a estrutura da molécula funcional.

Description

. 1387 Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS DE CRIAÇÃO E DE TRIAGEM DE BIBLIOTECAS DE DNA CODIFICADO".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O custo crescente do fármaco descoberto levou à busca perma- nente por novos métodos de triagem de maior espaço químico tão econômi- co quanto possível para encontrar moléculas com maior potência e pouca ou nenhuma toxicidade. Abordagens de química combinatória na década de 80 foram originalmente anunciadas como sendo métodos para transcender o paradigma de descoberta de fármacos, mas não tiveram êxito devido a ta- " 10 manhos da biblioteca insuficientes e métodos inadequados de deconvolu- ção. Recentemente, o uso de bibliotecas combinatórias de DNA exibido de ' pequenas moléculas criou uma nova mudança de paradigma para a seleção de compostos de chumbo terapêutico. Morgan et al. (Pedido de Patente norte-americano nº 2007/0224607, incorporado por referência) identifica os principais desafios no uso de abordagens combinatórias de DNA exibido na descoberta do fár- maco: (1) a síntese de bibliotecas de complexidade suficiente e (2) a marca- ção de moléculas que são ativas nas triagens usadas. Além disso, Morgan et al. afirma que quanto maior o grau de complexidade de uma biblioteca, ou seja, o número de estruturas distintas presentes na biblioteca, maior a pro- babilidade de que a biblioteca contenha moléculas com a atividade de inte- resse. Assim, a química utilizada na síntese de biblioteca deve ser capaz de produzir um vasto número de compostos dentro de um prazo razoável. Esta abordagem tem sido geralmente bem-sucedida em identificar moléculas com quimiotipos diversificados e de alta afinidade. No entanto, uma série de questões veio à tona com relação à geração de bibliotecas de enorme com- plexidade e a avaliação da saída de sequenciamento na escala que tem sido descrita. Por exemplo, a purificação de uma biblioteca seguinte a múltiplas transformações químicas (por exemplo, geralmente 3 ou 4 etapas) e trans- formações biológicas (por exemplo, a ligação enzimática de marcações DNA) é inconveniente e resulta em uma quantidade significativa de "ruído" na biblioteca, seja por síntese incompleta de moléculas ou marcação errada

- 2/37 durante a etapa de ligação. Além disso, a quantidade de sequenciamento que é necessária para interrogar populações selecionadas é impressionante, normalmente exigindo métodos de sequenciamento "nextgeneration" ("pró- xima geração"). Este último é devido ao fato de que esquemas de marcação genética sofisticada embutidos na parte de DNA da biblioteca, juntamente com algoritmos de bioinformática para a análise da saída de sequenciamen- to "NextGeneration", são obrigados a filtrar através do ruído e identificar su- cessos na biblioteca. Como resultado, mesmo com essas metodologias, o sequenciamento ainda não é avançado o suficiente para capturar totalmente , 10 a diversidade de sequências (representando tanto êxito real e "ruído") de uma determinada triagem.

' Exibição de DNA de bibliotecas combinatórias de pequena mo- lécula depende de síntese de dividir e agrupar multietapa da biblioteca, aco- plada à adição enzimática de marcações de DNA que codificam tanto a eta- pa sintética quanto o bloco de construção usado. Várias (por exemplo, 3 ou 4) etapas sintéticas são normalmente realizadas e codificadas, e elas inclu- em posições de diversidade (aqui descritas como A, B e C (figura 1)), tal como aquelas formadas acoplando blocos de construção com, por exemplo, grupos funcionais amina ou carboxilato em um arcabouço químico que mos- traos blocos de construção anexados em orientações definidas. Um exem- plo de um arcabouço (S), que é frequentemente usado em bibliotecas com- binatórias é uma molécula de triazina, que pode ser ortogonalmente derivati- zada em três posições sobre a sua estrutura de anel.

O processo de formação da biblioteca pode ser demorado, os produtos são muitas vezes ineficientemente purificados, e o resultado é que as reações não conhecidas podem ocorrer as quais criam moléculas indese- jadas e/ou desconhecidas ligadas ao DNA. Além disso, a purificação incom- pleta da biblioteca pode resultar em contaminação cruzada de marcações durante as etapas de ligação, resultando em marcação errada. O resultado finalparaa seleção e sequenciamento de hits da biblioteca é que o sequen- ciamento massivamente paralelo tem que ser empregado devido ao "ruído" inerente de ambos os DNAs que estão ligados às moléculas que são não

R 3/37 intencionais (por exemplo, produtos não reagidos ou secundários) ou que são marcados errado. Assim, a eficiência do sequenciamento é perdida. Em alguns casos, um oligonucleotídeo iniciador, a partir do qual a biblioteca de pequena molécula é construída, contém uma região de inici- ador de ligação para a amplificação da polimerase (por exemplo, PCR) na forma de um oligonucleotídeo de filamento duplo, covalentemente fechado. Esta construção é muito problemática para a realização de reações de poli- merase, devido à dificuldade de derreter o oligonucleotídeo dúplex e permitir que um iniciador se ligue e inicie a polimerização, que resulta em uma rea- ' 10 çãoineficiente, reduzindo o rendimento em 10 - até 1000 vezes ou mais.

. Existe uma necessidade de uma abordagem mais faseada para triagem e identificação de moléculas pequenas que têm maior potência e pouca ou nenhuma toxicidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção apresenta um método para a criação e tria- gem de bibliotecas simplificadas de DNA codificado, devido ao menor núme- ro de etapas sintéticas (por exemplo, nenhuma ligação enzimática ou ne- nhum oligonucleotídeo iniciador duplo filamentado covalentemente fechado) e, portanto, substancialmente menos "ruído" durante a análise dos oligôme- ros codificados (aqui chamados de "regiões identificadoras"). Assim, o se- quenciamento torna-se muito mais eficiente, ou, alternativamente, a análise de micromatriz torna-se possível, levando em consideração as propensões inerentes que podem confundir a interpretação dos dados que podem ser introduzidos por amplificação da região de codificação. Foram também iden- tificados métodos para a criação de uma maior diversidade de reações quíi- micas em vez de simplesmente limitados a condições aquosas para tornar a biblioteca de DNA codificado mais hidrofóbica e solúvel em solventes orgâ- nicos nas etapas subsequentes da síntese de biblioteca. Desta forma, as reações químicas podem ser realizadas com o rendimento potencialmente maior, uma maior diversidade de blocos de construção, e fidelidade melho- rada das reações químicas. Assim, a presente invenção apresenta um método de marcação

- 4/37 de bibliotecas químicas de DNA codificado ligando um primeiro grupo fun- cional de um ligante bifuncional a um oligonucleotídeo iniciador na extremi- dade 5' do oligonucleotídeo iniciador, em que o oligonucleotídeo iniciador forma uma estrutura em formato de grampo, e ligando um segundo grupo funcional do ligante bifuncional a um componente da biblioteca química.

O oligonucleotídeo iniciador pode incluir uma primeira região identificadora e uma segunda região identificadora, de tal forma que a segunda região identi- ficadora hibridiza para a primeira região identificadora do oligonucleotídeo iniciador.

A segunda região identificadora pode incluir uma marcação fluo- ' 10 rescente (por exemplo, um fluoróforo ou GFP) ou o rótulo biotinilado.

Além : disso, a segunda região identificadora não é amplificada antes da análise após uma etapa de seleção.

Em outra modalidade, a invenção apresenta um método de cria- ção de bibliotecas de DNA codificado pela (a) criação de um primeiro nodo de diversidade, (b) codificação do primeiro nodo de diversidade em vasos separados, (c) agrupamento do primeiro nodo de diversidade, e (d) divisão do primeiro nodo de diversidade agrupado em um segundo conjunto de va- sos separados, em que o primeiro nodo de diversidade reage para formar um segundo nodo de diversidade.

Em certas modalidades, o segundo nodo de diversidade não é codificado e agrupado.

Em outra modalidade, a presente invenção apresenta um méto- do para a criação de bibliotecas usando reações químicas semi ou não a- quosas (por exemplo, orgânicas) com maior rendimento, uma maior diversi- dade de blocos de construção, e um maior número de reações químicas que podem ser usados para criar mais bibliotecas combinatórias de DNA marca- do do que as anteriormente alcançadas.

Em geral, os métodos da presente invenção proveem um con- junto de bibliotecas que contêm, por exemplo, uma ou duas posições de di- versidade em um arcabouço químico que pode ser eficientemente gerado emaltorendimento, selecionado para identificar blocos de construção indivi- duais ps ou combinações de blocos de construção que residem em, por e- xemplo, uma ou duas posições de diversidade, e iterativamente diversificado

. 5/37 em, por exemplo, uma segunda, terceira, e/ou quarta posição de diversidade para criar moléculas com propriedades melhoradas.

Além disso, os métodos aqui descritos permitem uma análise ampla e extensa dos compostos sele- cionados tendo uma propriedade desejada biológica, que, por sua vez, per- miteque compostos relacionados com relações estruturais familiares sejam identificados (por exemplo, relações estrutura-atividade). Por "arcabouço" significa uma porção química que exibe nodo (s) de diversidade em uma geometria especial particular.

Nodo (s) de diver- sidade é tipicamente ligado ao arcabouço durante a síntese da biblioteca, ' 10 mas em alguns casos, um nodo de diversidade pode ser anexado ao arca- : bouço antes da síntese da biblioteca (por exemplo, em adição das regiões de identificador). Em algumas modalidades, o arcabouço é derivatizado de tal forma que ele pode ser ortogonalmente desprotegido durante a síntese da biblioteca e, posteriormente, reagido com nodos de diversidade diferentes (por exemplo, usando a marcação de identificador em cada etapa). Por "região identificadora" significa a porção de marcação de DNA da biblioteca que codifica a adição do bloco de construção à biblioteca.

Por "oligonucleotídeo iniciador" significa os oligonucleotídeos de partida para a síntese de biblioteca que contém também um ligante covalen- temente ligado e uma porção funcional para adição de um nodo de diversi- dade ou arcabouço.

O oligonucleotídeo pode ser simples ou duplo filamen- tado.

O oligonucleotídeo pode consistir em bases naturais ou modificadas.

Por "porção funcional" significa uma porção química compreen- dendo um ou mais blocos de construção que podem ser selecionados a par- tirde qualquer molécula pequena ou projetados e construídos com base em características desejadas, por exemplo, solubilidade, disponibilidade de doa- dores e receptores de ligação de hidrogênio, graus rotacionais de liberdade das ligações, carga positiva, carga negativa, e assim por diante.

A porção funcional deve ser compatível com a modificação química de tal forma que elareajacoma cabeça.

Em certas modalidades, a porção funcional pode ser ainda reagida como uma entidade bifuncional ou trifuncional (ou superior). Porções funcionais também podem incluir blocos de construção que são u-

. 6/37 sados em qualquer um dos nodos de diversidade ou posições. Exemplos de blocos de construção e marcações de DNA de codificação são encontrados nas Tabelas 1 e 2. Ver, por exemplo, publicação do pedido de patente norte- americano nº 2007/0224607, incorporado por referência. Por "bloco de construção" significa uma unidade química estrutu- ral que está ligada a outras unidades químicas estruturais ou pode ser ligada a outras tais unidades. Quando a porção funcional é polimérica ou oligoméri- ca, os blocos de construção são as unidades monoméricas do polímero ou oligômero. Blocos de construção também podem incluir uma estrutura de ' 10 arcabouço (por exemplo, um bloco de construção de arcabouço) à qual são, : ou podem ser anexadas uma ou mais estruturas adicionais (por exemplo, blocos de construção periférica). Os blocos de construção podem ser quais- — quer compostos químicos que são complementares (isto é, os blocos de construção devem ser capazes de reagir para formar uma estrutura que in- cluidois ou mais blocos de construção). Normalmente, todos os blocos de construção usados terão pelo menos dois grupos reativos, embora alguns dos blocos de construção usados terão apenas um grupo reativo cada. Gru- pos reativos em dois blocos de construção diferentes devem ser comple- mentares, ou seja, capazes de reagir para formar uma ligação covalente.

Por "ligante" significa uma molécula que liga a parte de ácido nucleico da biblioteca a espécies funcionais exibidas. Tais ligantes são co- nhecidos na técnica, e aqueles que podem ser usados durante a síntese da biblioteca incluem, mas não estão limitados a, 5'-O-Dimetoxitritil-1',2'- Dideoxirribose-3'-[(2-cianoetil)-(N N-di-isopropil))-fosforamidita; 9-0- Dimetoxitriti-trietileno glicol,1-[(2-cianoetil)-(N N-di-isopropil)]-fosforamidita; 3-(4,4'-Dimetoxitritilóxi)propil-1-[(2-cianoetil)-(N, N-di-isopropil)]-fosforamidita; e 18-O-Dimetoxitritilhexaetilenoglico!, 1-[(2-cianoetil)-(N, N-di-isopropil)]- fosforamíidita. Tais ligantes podem ser adicionados um depois do outro em diferentes combinações para gerar ligantes de diferentes comprimentos de- sejados. Por "ligante ramificado" significa uma molécula que se liga à posi- ção de ácido nucleico da biblioteca em 2 ou mais espécies funcionais idênti- cas da biblioteca. Ligantes ramificados são bem conhecidos na técnica e

. 7137 exemplos podem consistir em duplicadores simétricos ou assimétricos (1) e (2) ou um triplicador simétrico (3). Ver, por exemplo, Newcome et al., Dendri- tic Molecules: Concepts, Synthesis, Perspectives, VCH Publishers (1996); Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7297-7301 (1995); and Jansen etal, Science 266: 1226 (1994).

Como usado aqui, o termo "oligonucleotídeo" se refere a um po- límero de nucleotídeos. O oligonucleotídeo pode incluir DNA ou qualquer derivado do mesmo conhecido na técnica que pode ser sintetizado e utiliza- do para reconhecimento de pares de base. O oligonucleotídeo não tem que ' 10 ter bases contíguas, mas pode ser intercalado com porções de ligante. O R polímero de oligonucleotídeo pode incluir nucleosídeos naturais (por exem- plo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, deso- xitimidina, desoxiguanosina e desoxicitidina), análogos de nucleosídeos (por exemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, C5-propinilcitidina, C5-propiniluridina, C5-bromouridina, C5- fluorouridina, — C5-iodouridina, — C5-metilcitidina, = 7-deazaadenosina, 7- deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, e 2- tiocitidina), bases quimicamente modificadas, bases biologicamente modifi- cadas (por exemplo, bases metiladas), bases intercaladas, açúcares modifi- cados (por exemplo, 2'-fluororribose, ribose, 2'-desoxirribose, arabinose e hexose), e/ou grupos de fosfato modificado (por exemplo, fosforotioatos e ligações 5'-N-fosforamidita).

Por "operativamente ligadas" significa que duas estruturas qui- micas são ligadas entre si de tal forma a manterem-se ligadas através das várias manipulações que espera-se que elas sejam submetidas. Normalmen- te, a porção funcional e o oligonucleotídeo de codificação estão ligados co- valentemente através de um grupo de ligação apropriado. Por exemplo, o grupo de ligação pode ser uma molécula bifuncional com um sítio de fixação para o oligonucleotídeo de codificação e um sítio de fixação para a porção funcional.

Por "pequena molécula" significa uma molécula que tem um pe- so molecular inferior a cerca de 1000 Dáltons. Pequenas moléculas podem

. 8/37 ser orgânicas ou inorgânicas, e podem ser isoladas a partir de, por exemplo, bibliotecas de compostos ou fontes naturais, ou podem ser obtidas por deri- vatização de compostos conhecidos. Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partirda seguinte descrição detalhada, desenhos, exemplos, e reivindica- ções.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1 é um esquema ilustrando as posições de diversidade A, BecC. : 10 Figura 2 é um esquema de um membro da biblioteca química de ' DNA codificado do Modo 1, mostrando, em parte, o oligonucleotídeo inicia- dor, que inclui uma estrutura em formato de grampo complementar na região identificadora, que foi reagida com nodos de diversidade A e B. A região i- dentificadora para B está sendo adicionada. Nesta figura, o nodo de diversi- dade"C"é a posição potencial para uma posição diversidade adicional a ser adicionada após a adição da região identificadora B. i Figura 3 é um esquema de um membro da biblioteca química de DNA codificado do Modo 1, mostrando, em parte, o oligonucleotídeo inicia- dor, que inclui uma sequência na região de laço da estrutura em formato de grampo que pode servir como uma região de ligação de iniciador para ampli- ficação. Figura 4 é um esquema de um membro da biblioteca química de DNA codificado do Modo 1, mostrando, em parte, o oligonucleotídeo inicia- dor, que inclui uma sequência não complementar na extremidade 3' da mo- —léculaque pode servir para ligar uma segunda região identificadora à polime- rização ou à ligação enzimática. Figura 5 é um esquema de um membro da biblioteca química de DNA codificado do Modo 1, mostrando, em parte, o oligonucleotídeo inicia- dor, em que a região de laço do oligonucleotídeo iniciador e pelo menos a região identificadora no lado 3' da região de laço pode servir para hibridizar com um oligonucleotídeo complementar, que também contém uma segunda região identificadora.

- 9/37 Figura 6 é um esquema de amplificação PCR do modelo em formato de grampo, conforme apresentado na Figura 5. Figura 7 é um esquema de um membro da biblioteca química de DNA codificado do Modo 2, mostrando um oligonucleotídeo em formato de grampo que é covalentemente fechado (por exemplo, através de uma estru- tura em formato de grampo ou quimicamente) na extremidade distal ao ligan- te. Figura 8 é um esquema de um membro da biblioteca química de DNA codificado do Modo 2, mostrando a inclusão de nodos de diversidade ' 10 adicionais.

. Figura 9 é um esquema de um membro da biblioteca química de DNA codificado do Modo 2, mostrando as etapas para a triagem de bibliote- cas e métodos para deconvolucionar regiões identificadoras.

Figura 10 é um esquema mostrando oligonucleotídeos usados na biblioteca sintética. Cabeça (HP) foi sintetizada por DNA IDT e HPLC pu- rificada. Setas indicam o sítio para restrição de BbvCI (sublinhado) ou diges- tão denteada de Nb.BbvCI or Nt.BbvCI. Sequências das marcações de DNA A1, B1, e C1 (filamentos superior e inferior), os iniciadores PCR 5 e3, ea extremidade 3' da HP são também conhecidos.

Figura 11 é um gel eletroforético (TBE-ureia (15%) gel de eletro- forese; UV sombreando uma placa de TLC) da cabeça em diferentes etapas desta síntese. Cabeça HP (DNA IDT) foi acilada por Fmoc-amino-PEG2000- NHS (JenKem Technology USA). Rota 1 é a HP (DNA IDT) oligonucleotídeo (42 nts). Rota 2 é HP acilada com Fmoc-amino-PEG2000-NHS. Após adição deTris-HCl, desproteção de Fmoc é observada. rota 3 é a reação bruta com piperidina, mostrando desproteção completa de Fmoc. rota 4 é a mesma que a rota 3 após dessalgar em uma coluna NAP-S5 e liofilização. (XC: xileno cia- nol (migra como 60 nt DNA); BPB: bromofenol azul (migra como 15 nt DNA) Figura 12 é um esquema mostrando as etapas em síntese de bi- blioteca modelo. DTAF foi conjugado com cabeça modificada por amino- PEG (HP-1) na primeira etapa. Após esta etapa, uma porção de HP-1-DTAF foi adicionalmente acitada com pentilamino-biotina.

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Figura 13A é um esquma da ligação das marcações de DNA.

Fig 13B illustrata 4% de gel de agarose de biblioteca HP-1-DTAF-biotina em di- ferentes etapas da ligação de marcação de DNA.

M: marcador; Rota 1: HP- 1-DTAF-biotin; Rota 2: 1+ marcação A apenas; Rota 3: 1 + marcações A, B, ecC,bem como extremidade 3' oligoligada.

Setas indicam fluorescência ver- de brilante (DTAF). Nenhuma separação substancial é observada no gel.

Figura 13C illustrata amplificação PCR (24 ciclos) das reações de ligação.

M: marcador (banda inferior é 100); Rota 1: amplificação PCR da banda fluo- rescente verde a partir da rota 1 da figura 14B (HP-1-DTAF-biotina + marca- Ú 10 çãoA); Rota 2: amplificçaão PCR da banda fluorescente verde a parti da rota 2 da figura 13B (HP-1-DTAF-biotina + todas as 3 marcações e extremi- ' dade 3' oligo); Rota 3: amplificação PCR da reação de ligação bruta HP-1-

DTAF-biotina + todas as 3 marcações; Rota 4: nenhum controle modelo.

Figura14 é um conjunto de géis eletroforéticos mostrando a puri- 15 ficação do composto modelo XChem e seleção modelo (via uma interação de ligação entre a porção de biotina do composto modelo XChem e estrep- tavidina). Os géis são géis 4-12% de SDS NuPage com tampão de execução MES.

Géis foram escaneados por fluorescência verde usando um laser 450- nm.

Figura 14A é um gel mostrando etapas de síntese e purificação.

Amos- 20 tras foram misturadas com tampão de carregamento e fervidas.

M: marca- dor; Rota 1: HP-1 + DTAF; Rotas 2 e 2a: HP-1-DTAF + biotina (duas reações indenpendentes); Rotas 3-6 (etapas de purificação/seleção modelo usandp contas de estreptavidina Dynal): Rota 3: fluxo através; Rota 4: última lava- gem (lavado com água a 80ºC por 10 minutos); Rotas 5 e 5": eluição com 25 25 mMde EDTA a 90ºC (1º e 2º); Rotas 6 e 6": eluição com 25 mM de EDTA e 5 mM de NaOH a 90ºC (1º e 2º). Figura 14B é um gel mostrando ligação de HP-1-DTAF-biotina ("biblioteca de 1") a estreptavidina.

Amostras foram mis- turadas com gel carregando tampão e diretamente carregado no gel sem fervura.

Amostras, como no gel da figura 14A, foram incubadas com um ex- 30 cesso de estreptavidina em 50 mM de NaClI/10 mM de Tris HCI, pH 7.0, por minutos. "S" indica a adição de estreptavidina.

Amostras 5 e 6 foram a- grupadas.

Rota 1: HP-1-DTAF; Rota 18: HP-1-DTAF + estreptavidina; Rota

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2: HP-1-DTAF-biotina (dessalgada); Rota 28: HP-1-DTAF-biotina + estrepta- vidina; Rota 4: última lavagem (lavagem com água a 80ºC por 10 minutos); Rota 48: última lavagem amostra + estreptavidina; Rota 5+6: amostras a- grupadas 5, 5', 6 e 6º (frações de eluição a partir de beads de estreptavidina, HP-1I-DTAF-biotina purificada e selecionada; Rota 5+6S': HP-1-DTAF-biotina + estreptavidinaa purificada e selecionada.

Note que não existe nenhuma diferença notável na migração entre diferentes etapas de "biblioteca de sín- tese 1". Figura 14C é 4% de gel de agarose de cabeça (Trilink) HP-T, reagi- do com DTAF.

Rota 1: Marcador; Rota 2: DTAF; Rota 3 HP-T-DTAF.

Painel ' 10 esquerdo: visualização UV do gel (colorido com brometo de etídio); painel direito: mesmo gel escaneado por fluorescência em comprimento de onda de excitação 450 nm (verde, fluoresceína). Figura 14D é 4-12% de SDS de gel NuPage com tampão de execução MES, mostrando ligação de HP-T-DTAF- biotina a estreptavidina.

Amostras foram misturadas com tampão carregando em gele diretamente carregado no gel sem fervura.

Amostras, como no gel da figura 14A, foram incubadas com um excesso de estreptavidina em 50 mM de NaCl/10 mM de Tris HCl, pH 7.0, por 10 minutos.

Rota 1: DTAF; Rota 2: HP-T-DTAF; Rota 3: HP-T-DTAF + estreptavidina; Rota 4: HP-T-DTAF- biotina (dessalgada); Rota 5: HP-T-DTAF-biotina + estreptavidina; Rota 6: amostras agrupadas 5, 5',6 e 6' (frações de eluição a partir de beads de es- treptavidina, HP-1-DTAF-biotina purificada e selecionada; Rota 7: HP-1-

DTAF-biotina + estreptavidina purificada e selecionada.

Figura 15A é um esquema da síntese do construto para experi- mento de liberação intercelular T7 RNAP.

O clone VH dsDNA foi amplificado porPCR para afixar um sítio Bsml na extremidade 5' a montante do promo- tor T7. Após digestão restrita e purificação, o construto foi ligado a HP-1- DTAF-R7 (cabeça modificada com DTAF e peptídeo (-Arg-eAhx)s-Arg). Figu- ra 15B é um gel eletroforético da reação de ligação.

Rotas 1 e 2 mostram diferentes amostras HP-1 ligadas a VH; Rota 3 mostra produto PCR VH não ligado; eMé o marcador.

Figura 15C é um gel eletroforético mostrando vali- dação pelo promotor T7. O gel mostra uma reação de Megascript T7 (Ambi-

on, Inc.) usando amostras das Rotas 1-3 da figura 15B.

- 12/37 Figura 16 é uma eletroforese em gel de agarose das etapas na síntese 10x10 da biblioteca. Figura 16A é 4% de gel de agarose de cabeça (Trilink) HP-T ligado com marcação A. Rota 1: Marcador; Rota 2: HP-T; Rota 3: marcação A anelada; Rota 4: HP-T ligado com marcação A; Rota 5: HP-T ligado com marcação A e dessalgado em coluna Zeba. Figura 16B é 2% de gel de agarose de ligação HP-T-A com 12 marcações B diferentes. Rota M: Marcador, Rotas 1 e 9: HP-T-A; Rotas 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15e 16: ligação HP-T-A com marcações B1- B12. Figura 16C é 4% de gel de agaro- se da biblioteca agrupada (biblioteca B), com marcações A e B1-B12 liga- ' 10 das,após reação com cloreto cianúrico e aminas B1-B12. Rota 1: Marcador; Rota 2: HP-T-A; Rota 3: Biblioteca-B agrupada e dessalgada em coluna Ze- ba.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção apresenta uma série de métodos para iden- tíficar um ou mais compostos que se ligam a um alvo biológico. Os métodos incluem a síntese de uma biblioteca de compostos, em que os compostos contêm uma porção funcional tendo uma ou mais posições de diversidade. A porção funcional dos compostos é operativamente ligada a um oligonucleotí- deo iniciador que identifica a estrutura da porção funcional. Em resumo, o Modo1 provê uma série de métodos para preservar o caráter duplo filamen- tado do dsDNA durante síntese de biblioteca, o que é importante durante a etapa de reação química, e pode ser usado (como mostrado nas Figuras 2- 6) para a geração de até dois nodos de diversidade. O Modo 2 (Figuras 7-9) antecipa um nodo de diversidade e usa um oligonucleotídeo em formato de grampo que é covalentemente fechado (por exemplo, através de uma estru- tura em formato de grampo ou quimicamente) na extremidade distal ao ligan- te. O Modo 3 provê métodos para criar bibliotecas com um, dois, três ou mais nodos de diversidade. Os Modos 1, 2 e 3 são descritos em detalhes abaixo.

Modo1 A presente invenção apresenta um método para identificar um ou mais compostos que se ligam a um alvo biológico. O método inclui a sin-

- 13/37 tese de uma biblioteca de compostos, em que os compostos contêm uma porção funcional tendo não mais do que duas posições de diversidade. À porção funcional dos compostos é operativamente ligada a um oligonucleotíi- deo iniciador que identifica a estrutura da porção funcional, provendo uma — solução contendo compostos de iniciador A.

O oligonucleotídeo iniciador inclui um ligante L (por exemplo, po- lietileno glicol) com um número inteiro de um ou mais, em que os oligonucle- otídeos iniciadores contêm uma porção funcional que inclui blocos de cons- trução A anexados ao L e separados em vasos de reação A, em que A é um : 10 número inteiro de dois ou maior, que é operativamente ligado a um oligonu- : cleotídeo iniciador que identifica os blocos de construção A.

Em algumas modalidades, os blocos de construção A podem ser adicionalmente derivatizados através de um nodo comum S. Em outras mo- dalidades, A é subsequentemente transformado com S, S sendo uma molé- culade arcabouço que permite nodos adicionais da introdução de diversida- de. Em algumas modalidades, A-S pode ser triado diretamente, represen- tando um único nodo de diversidade. Em outras modalidades, os vasos de reação A-S (por exemplo, que pode primeiro incluir uma purificação de A-S a partir de matérias-primas) são misturados e aliquotados em vasos de reação B, em queBé um número inteiro de um ou maior, e reagidos com um dos blocos de construção B. A-S-B, ainda em vasos de reação B, é em alguns casos reagido com um bloco de construção C, em que C é um número intei- ro de um, é purificado e submetido a uma reação de polimerização ou liga- ção usando iniciadores B, em que os iniciadores B diferem em sequência e identificam os blocos de construção B.

Em certas modalidades, A-S pode ser um número inteiro de um. Em uma modalidade, A-S pode ser ligado diretamente a oligonucleotídeos iniciadores B, e seguinte a reação de blocos de construção B, as reações B são mistas. Em certas modalidades, a mistura A-S-B, em que B representa somente o nodo de diversidade, é exibida diretamente, representando um único nodo de diversidade. Em outras modalidades, a mistura A-S-B, em que B representa somente o nodo de diversidade, é subsequentemente aliquota-

- 14/37 da em vasos de reação C, reagida com blocos de construção C, e submetida a segunda polimerização de filamento ou reação de ligação usando iniciado- res C, na qual os iniciadores C diferem em sequência e identificam os blocos de construção C.

Em certas modalidades, B pode ser um número inteiro de um e A-S é maior que um, caso em que A-S, agora derivatizado com B, é aliquo- tado em vasos de reação C, reagido com blocos de construção C, e subme- tido a segunda reação de polimerização de filamento usando iniciadores C, em que os iniciadores C diferem em sequência e identificam os blocos de ' 10 construção C. Esta estratégia geral pode ser expandida para incluir nodos de : diversidade adicionais (por exemplo, D, E, F, etc.) para que o primeiro nodo de diversidade seja reagido com blocos de construção e/ou S e codificado por um oligonucleotídeo inicial, misturado, realiquotado em vasos e, em se- guida, o nodo de diversidade subsequente é derivatizado por blocos de construção, que são codificados pelo iniciador utilizado para a polimerização ou reação ligação.

Em certas modalidades, A pode ser um número inteiro de um, B pode ser um número inteiro de um, e oligonucleotídeos iniciadores C são usados. A-S-B, ligado a oligonucleotídeos iniciadores C, é formado em vasos dereaçãoC, reagido com blocos de construção C, e exibido diretamente.

Em certas modalidades, S é reagido primeiro com o oligonucleo- tídeo iniciador, e A, B e/ou C (por exemplo, ou D, E, F, e assim por diante) são posteriormente reagidos.

Em certas modalidades, A, B ou C (por exemplo, ou D,/ E F, e assim por diante) podem conter sítios para nodos de diversidade adicionais. Se este for o caso, então S pode ou não pode ser usado ou necessário para introduzir nodos de diversidade adicionais.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo iniciador inclui uma es- trutura em formato de grampo complementar na região identificadora (figura 2).Aregião identificadora pode ser, por exemplo, de 2 a 100 pares de bases de comprimento, de preferência 5 a 20 pares de bases de comprimento, e mais preferivelmente 6 a 12 pares de bases de comprimento. O oligonucleo-

- 15/37 tídeo iniciador adicionalmente inclui uma sequência na região de laço da es- trutura em formato de grampo que pode servir como uma região de ligação do iniciador para amplificação (figura 3), de tal forma que a região de ligação do iniciador tenha uma temperatura de fusão mais elevada para seu iniciador complementar (por exemplo, que pode incluir acompanhar as regiões identi- ficadoras) do que a região identificadora sozinha.

Em uma modalidade, a região de laço pode incluir bases modifi- cadas que podem formar formações dúplex de mais afinidade do que bases não modificadas, tais bases modificadas sendo conhecidas na técnica (figura ' 10 3). O oligonucleotídeo iniciador pode adicionalmente incluir uma sequência : não complementar na extremidade 3' da molécula que pode servir para ligar uma segunda região identificadora tanto para a polimerização ou para liga- ção enzimática (figura 4). Em uma modalidade, os filamentos podem ser posteriormente reticulados, por exemplo, usando psoraleno.

15 Em outra modalidade, a região de laço e pelo menos a região identificadora no lado 3' da região de laço podem servir para hibridizar com um oligonucleotídeo complementar, que também contém uma segunda regi- ão identificadora (figura 5). Nos casos onde muitos blocos de construção e marcações correspondentes são usados (por exemplo, 100 marcações), 20 uma estratégia de misturar e dividir pode ser empregada durante a etapa de síntese de oligonucleotídeos para criar o número necessário de marcações. Tais estratégias de misturar e dividir para a síntese de DNA são conhecidas na técnica. Em uma modalidade, os filamentos podem ser posteriormente reticulados, por exemplo, usando psoraleno. Os membros da biblioteca re- 25 sultante podem ser amplificados por PCR após seleção para entidades de ligação contra um alvo (s) de interesse (figura 6).

Por exemplo, uma cabeça, que inclui um oligonucleotídeo inicia- dor, pode ser reagida com um ligante e A, que inclui, por exemplo, 1000 va- riantes diferentes. Para cada bloco de construção A, uma marcação de DNA 30 A pode ser ligada ou iniciador estendido para a cabeça. Estas reações po- dem ser realizadas em, por exemplo, uma placa de 1000 poços ou placas de x 100 poços. Todas as reações podem ser agrupadas, opcionalmente

- 16/37 purificadas, e divididas em um segundo conjunto de placas. Em seguida, o mesmo procedimento pode ser realizado com blocos de construção B, que também incluem, por exemplo, 1000 variantes diferentes. Uma marcação de DNA B pode ser ligada à cabeça, e todas as reações podem ser agrupadas. Uma biblioteca de 1000 x 1000 combinações de A a B (ou seja, 1.000.000 compostos), marcada por um milhão de diferentes combinações de marca- ções. A mesma abordagem pode ser estendida para adicionar variantes C, D, E, etc. A biblioteca gerada pode então ser usada para identificar compos- tos que se ligam ao alvo. A composição dos compostos que se ligam à bibli- ' 10 oteca pode ser avaliada por PCR e sequenciamento das marcações de DNA : para identificar os compostos que foram enriquecidos.

Modo 2 Em outra modalidade (figura 7), o método inclui sintetizar uma biblioteca de compostos, em que os compostos contêm uma porção funcio- naltendo não mais do que duas posições de diversidade. A porção funcional dos compostos é operativamente ligada a um oligonucleotídeo iniciador, que contém uma sequência genética única que identifica a estrutura da porção funcional provendo uma solução compreendendo compostos iniciadores A, em que L é um número inteiro de um ou mais, onde os compostos iniciado- res incluem uma porção funcional tendo blocos de construção A separados em vasos de reação A, onde, por exemplo, A é um número inteiro de dois ou mais, que é operativamente ligado a um oligonucleotídeo inicial que identifi- ca os blocos de construção A. Em algumas modalidades, os blocos de cons- trução A são pré-derivatizados com um S comum. Em outras modalidades, À é posteriormente transformado com S, sendo S uma molécula de arcabouço que permite nodos adicionais de introdução de diversidade. Em seguida, os vasos de reação A-S (que podem incluir uma primeira purificação de A-S a partir de matérias-primas) são misturados e aliquotados em vasos de reação B, em que B é um número inteiro de um ou maior, e reagido com um dos — blocos de construção B. A-S-B, ainda em vasos de reação B é, em algumas modalidades, reagido com um bloco de construção C, onde C é um número inteiro de um, é purificado, e mantido separado em vasos B para triagem.

- 17/37 Em algumas modalidades, A-S é um número inteiro de um. Em uma modali- dade, A-S pode ser ligado diretamente a oligonucleotídeos iniciadores B e, após a reação de blocos de construção B, as reações B são misturadas e aliquotadas em vasos de reação C, reagidas com blocos de construção C, e mantidas separadas em vasos C para triagem. Em outras modalidades, B pode ser um número inteiro de um e A-S é maior que um, caso em que A-S, agora derivatizado com B, é aliquotado em vasos de reação C reagidos com blocos de construção C, e mantidos separados em vasos C para triagem. Esta estratégia geral pode ser expandida para incluir nodos de diversidade ' 10 adicionais (por exemplo, D, E, F, etc.) para que o primeiro nodo de diversi- . dade seja reagido com blocos de construção e/ou S e codificado por um oli- gonucleotídeo iniciador, misturado, realiquotado em vasos, em seguida, o nodo de diversidade subsequente é derivatizado através de blocos de cons- trução e mantido em seus respectivos vasos para triagem (figura 8).

Por exemplo, como descrito no Modo 1, uma cabeça, que inclui um oligonucleotídeo iniciador, pode ser reagida com um ligante e blocos de construção A, que incluem, por exemplo, 1000 variantes diferentes. Bloco de construção A, uma marcação de DNA A pode ser ligada ou iniciador esten- dido para a cabeça. As reações podem ser agrupadas. Em seguida, o mes- mo procedimento pode ser realizado com blocos de construção B, mas uma marcação de DNA não é adicionada para B. Como B não é codificado para, todas as reações de "B" podem ser agrupadas (por exemplo, 1000 reações) e uma etapa de seleção pode ser realizada para identificar todos os blocos de construção A que produzem o efeito desejado de ligação com blocos de construção B desconhecidos. Uma biblioteca de blocos de construção A i- dentificada na etapa de seleção (por exemplo, blocos de construção 10 A) pode ser então reagido com os mesmos blocos de construção B, resultando em uma seleção de 10.000 compostos ou menos. Nesta rodada, marcações DNA para B podem ser adicionadas e blocos B que produzem o efeito de ligação desejado em combinação com os, por exemplo, blocos de constru- ção 10A podem ser identificados, resultando em uma convolução etapa a etapa de uma biblioteca inicial de, por exemplo, 1.000.000 compostos. Um

- 18/37 conjunto destes compostos finais poderá ser testado individualmente para identificar o melhor, por exemplo, aglutinantes, ativadores ou inibidores.

Para evitar o agrupamento de todas as reações após síntese B, um leitor BIND (SRU Biosystems), por exemplo, pode ser usado para moni- torar ligação sobre uma superfície de sensor em formato de alta taxa de transferência (por exemplo, placas de 384 poços e placas de 1536 poços). Por exemplo, os blocos de construção A podem ser codificados com as mar- cações de DNA e os blocos de construção B podem ser codificados em po- sição.

Aglutinantes podem ser identificados usando um sensor BIND, se- Ú 10 quenciamento e análise de micromatriz ou análise de restrição de digerir das ' marcações A.

Esta análise permite a identificação de combinações de blocos de construção A e B que produzem as moléculas desejadas.

Outros méto- dos para o monitoramento de ligação conhecidos daqueles versados na téc- nica podem ser utilizados, incluindo, por exemplo, ELISA.

Modos1te2 O oligonucleotídeo iniciador dos Modos 1 e 2 pode conter uma estrutura em formato de grampo, complementares na região identificadora.

O oligonucleotídeo iniciador contém ainda uma sequência na região de laço da estrutura em formato de grampo que pode servir como uma região de ligação de iniciador para amplificação, de tal forma que a região de ligação do iniciador tenha uma temperatura de fusão mais elevada por seu iniciador complementar (que pode incluir regiões identificadoras de acompanhamen- to) do que a região identificadora sozinha.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo iniciador inclui uma mo- lécula ligante capaz de ser funcionalmente reagida com blocos de constru- ção.

A molécula ligante pode ser conectada diretamente à extremidade 5' do oligonucleotídeo através de métodos conhecidos na técnica ou pode ser in- corporada dentro da molécula, por exemplo, fora de uma base derivatizada (por exemplo, a posição C5 de uridina), ou o ligante pode ser colocado no —meiodo oligonucleotídeo usando técnicas-padrão conhecida na técnica.

O oligonucleotídeo iniciador pode ser filamento simples ou de fi- lamento duplo.

A formação de um oligonucleotídeo de filamento duplo pode

- 19/37 ser alcançada através da formação de estrutura em formato de grampo do oligonucleotídeo ou através de reticulação cruzada usando, por exemplo, uma porção de psoraleno, como são conhecidas na técnica.

O oligonucleotídeo iniciador pode conter duas regiões de ligação primárias (por exemplo, para permitir uma reação de PCR) em ambos os lados da região que codifica o identificador do bloco de construção.

Alterna- tivamente, o oligonucleotídeo iniciador pode conter um sítio de ligação de iniciador na extremidade 5'. Em outras modalidades, o oligonucleotídeo inici- ador é uma estrutura em formato de grampo e a região do laço forma um ' 10 sítio de ligação de iniciador ou o sítio de ligação do iniciador é introduzido : através de hibridização de um oligonucleotídeo para a região identificadora do lado do 3' do laço.

Um oligonucleotídeo iniciador, que contém uma região homóloga à extremidade 3' do oligonucleotídeo iniciador e carregando uma região de ligação do iniciador em sua extremidade 5' (por exemplo, para permitir uma reação de PCR) pode ser hibridizado com o oligonucleotídeo iniciador, e pode conter uma região identificadora que codifica os blocos de construção utilizados em uma das posições de diversidade.

O oligonucleotí- deo iniciador pode conter informações adicionais, tais como uma região de nucleotídeos aleatorizada, por exemplo, 2 a 16 nucleotídeos de comprimen- to, que está incluída para análise bioinformática.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo iniciador não contém um sítio de ligação do iniciador de PCR.

Em outra modalidade, a biblioteca de compostos, ou uma parte dela, é contatada com um alvo biológico em condições adequadas por pelo menos um membro da biblioteca de compostos para se ligar ao destino, se- guido da remoção de membros da biblioteca que não se ligam ao alvo, e analisam a região ou regiões identificadoras.

Alvos biológicos exemplares incluem, por exemplo, enzimas (por exemplo, quinases, fosfatases, metila- ses, demetilases, proteases e enzimas de reparo do DNA), proteínas envol- vidas nas interações de proteínas : proteína (por exemplo, ligantes para re- ceptores), alvos receptores (por exemplo, GPCRs e RTKs ), canais de íons, bactérias, vírus, parasitas, DNA, RNA, príons, ou hidratos de carbono).

. 20/37 Em uma modalidade, a biblioteca de compostos, ou uma parte dela, é contatada com um alvo biológico em condições adequadas a pelo menos um membro da biblioteca de compostos que se liga ao alvo, seguido da remoção dos membros da biblioteca que não se ligam ao alvo, seguido de amplificação da região identificadora por métodos conhecidos na técnica e, posteriormente, analisam a região identificadora ou regiões por métodos conhecidos na técnica.

Em uma modalidade o método de amplificação da região identi- ficadora pode incluir, por exemplo, a reação em cadeia polimerase (PCR), ] 10 amplificação de cadeia linear (LCR), a amplificação de círculo rolante (RCA), : ou qualquer outro método conhecido na técnica para amplificar sequências de ácidos nucleicos.

Em uma modalidade adicional, a biblioteca de compostos não é agrupada após a última etapa de adição de bloco de construção e os grupos são avaliados individualmente para identificar compostos que se ligam a um alvo.

Em outra modalidade, as moléculas que se ligam a um alvo não são submetidas à amplificação, mas são analisadas diretamente. Métodos de análise incluem, por exemplo, análise de micromatriz ou métodos basea- dosembeads decovolucionar as regiões identificadoras (figura 9). Moléculas que se ligam durante a etapa de triagem também podem ser detectadas por um biossensor de cristal fotônico livre de rótulo.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo iniciador e/ou o oligonu- cleotídeo iniciador contém uma porção funcional que permite a sua detecção por, por exemplo, marcas fluorescentes, pontos Q, ou biotina.

Em uma modalidade, a análise de micromatriz usa capacidade de detecção avançada, tal como, por exemplo, cristais fotônicos de resso- nância evanescente.

Em uma modalidade, o método de amplificação inclui formar uma emulsão de água em óleo para criar uma pluralidade de microrreatores aquosos, em que pelo menos um dos microrreatores tem pelo menos um membro de uma biblioteca de compostos que se liga ao alvo, uma única be-

. 21/37 ad capaz de se ligar ao oligonucleotídeo de codificação do pelo menos um membro da biblioteca de compostos que se liga ao alvo, e uma solução da reação de amplificação contendo os reagentes necessários para realizar a amplificação de ácido nucleico, amplificando o oligonucleotídeo de codifica- çãonos microrreatores para formar cópias ampliadas do oligonucleotídeo de codificação, e ligando as cópias amplificadas do oligonucleotídeo de codifi- cação às contas nos microrreatores. Uma vez que os blocos de construção da primeira biblioteca que se liga ao alvo de interesse foram identificados, uma segundo biblioteca po- ' 10 de ser preparada de forma iterativa, em que um ou dois nodos adicionais de . diversidade são adicionados, e a biblioteca é criada e diversidade amostrada como aqui descritos. Este processo pode ser repetido tantas vezes quantas forem necessárias para criar moléculas com propriedades moleculares e farmacêuticas desejadas.

Um bloco de construção exemplar inclui, por exemplo, aminoáci- dos (não limitados a alfa-aminoácidos), reagentes de clique químico (por exemplo, azida ou cadeias alcalinas) com uma amina ou um reagente tiol. A escolha de um bloco de construção depende, por exemplo, da natureza do grupo reativo utilizado no ligante, a natureza de uma molécula de arcabouço, eosolvente utilizado para a síntese química. Ver, por exemplo, a Tabela 1. Tabela 1. Blocos de Construção de Posição A Exemplares õ q Fmoc —N .. Ds A Ácido 3-(1-Fmoc-piperidina-4-il)- o o propiênico Éster de N-Hidroxisuccinimida de ácido 4-Azido-butan-1-oico NH-Fmoc (COD BA LÓ " COoH X Fmoc-L-propargilglicina Ácido Boc-Lindolina-2-carboxílico

. 22/37 Fmos IH-Boc sn CcooH Boc-D-propargilglicina-DCHA

N

O Fmoc-(4-carboximetil)piperazina cooH 5 A ahi | NH Boo DA Dust " DP ns Ácido Boc-2-amino-1,2,3,4-tetra- 2-Amino-N-(3-azidopropil)-3- mer- hidronaftaleno-2 -carboxílico capsuperiorropionamida - - — « um Ácido (S)-(-)-2-azido-6-(boc- amino)hexanoico ns 2-Amino-3-mercapto-N-(prop-2 - inil)propionamida o No Ns ANA oH Boo—NH Fmos PH no Ácido (S)-5-azido-2-(Fmoc- amino)pentanoico 9 Boc-Lys(N3)-OH oH O. Da AS " (A o N [ Il

N FmocH4-azidoFenilalanina Blocos de construção B e C exemplares estão descritos nas Ta- belas 2 e 3, respectivamente. Um sítio de restrição pode ser introduzido, por

. 23/37 exemplo, na posição B ou C para análise do produto final e seleção através da realização de PCR e restrição de digestão com uma das enzimas de res- trição correspondentes.

Tabela 2. Exemplos de Blocos de Construção de Posição B e marcações de —DNAde Codificação Nome Químico e Estrutura | Sítio de Restri- Filamento Superior ção (Enzima de Filamento Inferior Restrição) INSANA T/ICCGGA (Bs- | 5-Fos-CCTCCGGAGA ) i TO pEI) (SEQ ID NO: 1) ' 6-Aminoquinolina (B1) 5-Fos-TCCGGAGGAC (SEQ ID NO: 2) ' N GGC/GCC (Sfol)| 5-Fos-CCGGCGCCGA 14 (SEQ ID NO: 3) | Hr 5-Fos-GGCGCCGGAC 3-Amino-7-azaindol, 1H- (SEQ ID NO: 4) pirrolo[2,3-b]piridin-3-ilamina (B2) Os 210 GGTAC/C (Kpnl)) 5-Fos-CCGGTACCGA der (SEQ ID NO: 5) Cloridrato de 2-(aminometil) 5-Fos-GGTACCGGAC benzimidazo! (B3) (SEQ ID NO: 6) Ho.

CAC/GTG (Pmll)|! / 5-Fos-CCCACGTGGA OA (SEQ ID NO: 7) 2-Metil-1H-benzimidazol-5- SI ID NOB amina (B4) G 8) 7 NHa *xHO GAGCT/C (Sacl)| 5-Fos-CCGAGCTCGA (Aminometil)ciclopropano (SEQ ID NO: 9) (B5) 5-Fos-GAGCTCGGAC (SEQ ID NO: 10) NHz o G/GATCC (Ba- | 5-Fos-CCGGATCCGA Ox mHI) (SEQ ID NO: 11) $ 5'-Fos-GGATCCGGAC 3-Aminoftalimida (B6) (SEQID NO: 12)

- 24/37 Nome Químico e Estrutura | Sítio de Restri- Filamento Superior ção (Enzima de Filamento Inferior Restrição)

9 ? ATICGAT (Bsp- | 5-Fos-CCATCGATGA

DI) (SEQ ID NO: 13) Ha 5-Fos-ATCGATGGAC

3-Amino-4-metilbenzamida (SEQ ID NO: 14)

(B7)

AN ; Ns IA/AGCTT (Hindl-| 5-Fos-CCAAGCTTGA

E 1) (SEQ ID NO: 15) 8 5-Fos-AAGCTTGGAC

' 4-Azabenzimidazo!l (B8) (SEQ ID NO: 16) O A/GATCT (Bglll)| 5-Fos-CCAGATCTGA

' HN NH) (SEQ ID NO: 17) m-Xililendiamina (B9) 5-Fos-AGATCTGGAC

(SEQ ID NO: 18) O G/AATTC (Eco- | 5-Fos-CCGAATTCGA

NH RI) (SEQ ID NO: 19) 1,2-Fenilenodiamina (B10) 5'-Fos-GAATTCGGAC

(SEQ ID NO: 20) É Ss T/GATCA (Bcll) | 5-Fos-CCTGATCAGA

O NM (SEQ ID NO: 21) N 5'-Fos-TGATCAGGAC

Anabasina (B11) (SEQ ID NO: 22) eme o co co CA/TATG (Ndel)| 5-Fos-CCCATATGGA

OS (SEQ ID NO: 23) Sa 5-Fos-CATATGGGAC

Hidrato de DL-7-azatriptofano (SEQ ID NO: 24)

(B12)

- 25/37 Tabela 3. Exemplos de Blocos de Construção de Posição C de Marcações de DNA de Codificação Nome Químico e Estrutura Filamento Superior Filamento Inferior Ha 5"-Fos-GAACCTGCTT H LO (SEQ ID NO: 25) : as 5-Fos-GCAGGTTCTC 3,4-Dimetoxianilina (C1) (SEQ ID NO: 26) CO 5-Fos-GAAGACGCTT (SEQ ID NO: 27) | DD 5-Fos-GCGTCTTCTC H (SEQ ID NO: 28) 4-(1-Pirrolidinil)piperidina (C2) ' NH 5-Fos-GACCAGACTT Ox (SEQ ID NO: 29) 2-Metoxifenetilamina (C3) sao NO 36) os NH 5-Fos-GACGACTCTT (SEQ ID NO: 31) Ciclo-hexanometilamina (C4) 5-Fos-GAGTCGTCTC (SEQ ID NO: 32) NH; 5-Fos-GACGCTTCTT OX” (SEQ ID NO: 33) 2-(1-Ciclo-hexenil)etilamina (C5) S-Fos-GAAGCGTCTC (SEQ ID NO: 34) HoN N 5'-Fos-GAGCAACCTT Ás (SEQ ID NO: 35) H 5-Fos-GGTTGCTCTC 5-Amino-2-(trifluorometil)benzimidazo! (SEQ ID NO: 36) (C6) —q 5-Fos-GAGCCATCTT ) (SEQ ID NO: 37) rn NS 5-Fos-GATGGCTCTC o (SEQ ID NO: 38) Cloridrato de 5-fluoro-3-(4-piperidinil)- 1,2-benzisoxazol (C7) O NH 5-Fos-GCAACCACTT CH;3 (SEQ ID NO: 39) Isobutilamina (C8) 5-Fos-GTGGTTGCTC (SEQ ID NO: 40)

- 26/37 Nome Químico e Estrutura Filamento Superior Filamento Inferior NH2 85'-Fos-GCACAGACTT (SEQ ID NO: 41) & 5-Fos-GTCTGTGCTC EF O (SEQ ID NO: 42) 4-Fluorobenzilamina (C9) OD 5-Fos-GCGATCACTT N (SEQ ID NO: 43) 5-(Aminometil)indo! (C10) S-Fos-GTGATCGCTC (SEQ ID NO: 44) . q 5-Fos-GCGGTTACTT E (SEQ ID NO: 45) - a 5-Fos-GTAACCGCTC 2-[(2-cloro-6-fluorobenzil)tioJetilamina (SEQ ID NO: 46) (011) HINOS 5-Fos-GCATGACCTT “O (SEQ ID NO: 47) CH 85-Fos-GGTCATGCTC 1-(4-Metilfenil)piperazina (C12) (SEQ ID NO: 48) Ts 5-Fos-GCGTACTCTT te Se, (SEQ ID NO: 49) A | 5-Fos-GAGTACGCTC N,N-Dimetil-N'-etiletilenodiamina (C13) (SEQ ID NO: 50) Modo 3 Em qualquer dos modos aqui descritos (por exemplo, modos 1 e 2), o oligonucleotídeo cabeça pode ser modificado para suportar a solubili- dade em condições semi ou não aquosas (por exemplo, orgânicas). A cabe- 5 ça em certas modalidades, inclui a região identificadora.

Em outras modali- dades, a cabeça com o ligante pode ser primeiro derivatizado com um bloco de construção (por exemplo, uma porção funcional) ou arcabouço, e a se- quência identificadora é então adicionada.

Bases de nucleotídeos do cabeça podem ser tornadas mais hi- drofóbicas, modificando, por exemplo, as posições C5 de bases T ou C com cadeias alifáticas sem significativamente prejudicar sua capacidade de liga- ção de hidrogênio em suas bases complementares.

Ver, por exemplo, a Ta- bela 4 para exemplos de bases modificadas.

Além disso, o oligonucleotídeo

- 27/37 cabeça pode ser intercalado com as modificações que promovam a solubili- dade em solventes orgânicos.

Por exemplo, fosforamidita de azobenzeno pode introduzir uma porção hidrofóbica no projeto cabeça.

Tais inserções de amiditas hidrofóbicas na cabeça podem ocorrer em qualquer parte da molé- cula No entanto, a inserção não pode interferir com a marcação subsequen- te usando marcações DNA adicionais durante a síntese de biblioteca ou as- segurando reações de PCR, uma vez que uma seleção é finalizada e análise de micromatriz, se usada por deconvolução de marcação.

Tais adições ao projeto cabeça aqui descritas tornaria o cabeça solúvel em, por exemplo, i 10 15%, 25%, 30%, 50%, 75%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100% de solventes ' orgânicos.

Assim, a adição de resíduos hidrofóbicos no projeto cabeça per- mite a solubilidade melhorada em condições semi ou não aquosas (por e- xemplo, orgânicas), durante renderização do cabeça competente para a marcação de ácidos nucleicos.

Além disso, marcações de DNA que são pos- teriormente introduzidas na biblioteca também podem ser modificadas na posição C5 de bases T ou C de tal forma que elas também tornam a biblio- teca mais hidrofóbica e solúvel em solventes orgânicos para as etapas sub- sequentes da síntese de biblioteca.

Tabela plar modificado de bases de nucleotídeos o LO mo PO pMTO od DMTO: od &. VW done To deoxiuridina 3-f(2-cianceti-(NN- 5'-Dimetoxitriti-N4-di- di-isopropil)]-fosforamidita isobutilaminometilideno-5-(1- Propinil)-2'-deoxiCitidina,3'-[(2- cianoetil)-(N N-di-isopropil)]- fosforamidita

- 28/37 DT ; Z | dora " 8'-Dimetoxitritil-5-fluoro-2'- deoxiUridina,3'-[(2-cianoetil)-(N,N- oe di-isopropil)]-fosforamidita 5'-Dimetoxitritil-5-(piren-1-il-etinil)-2"- deoxiUridina,3'-[(2-cianoetil)-(N N- di-isopropil)]-fosforamidita ] A molécula ligante entre o cabeça e uma biblioteca de pequena molécula pode ser variada para aumentar a solubilidade do cabeça em sol- ' vente orgânico. Uma grande variedade de ligantes está comercialmente dis- ponível os quais podem acoplar a cabeça com a biblioteca de moléculas pe- quenas. Ligantes são empiricamente selecionados para um projeto de uma determinada biblioteca de pequena molécula (arcabouços e blocos de cons- trução) de tal forma que a biblioteca pode ser sintetizada em solvente orgà- nico, por exemplo, 15%, 25%, 30%, 50%, 75%, 90%, 95 %, 98%, 99%, ou 100% de solvente orgânico. O ligante pode ser variado utilizando reações modelo anterior à síntese de biblioteca para selecionar o comprimento da cadeia apropriado que solubiliza a cabeça em solvente orgânico. Ligantes podem incluir ligantes com, por exemplo, o comprimento aumentado da ca- deia alquila, unidades aumentadas de polietileno glicol, espécies ramificadas com cargas positivas (para neutralizar as cargas de fosfato negativas sobre o cabeça), ou quantidades aumentadas de hidrofobicidade (por exemplo, além de estruturas de anel de benzeno).

A molécula ligante pode fornecer um espaçador adequado entre o DNA de cabeça e o membro de uma biblioteca de química. Por exemplo, ligantes bifuncionais podem ser usados. Em certas modalidades, ligantes bifuncionais podem incluir, por exemplo, três partes. Parte 1 pode ser um grupo reativo, que forma uma ligação covalente com o DNA, tal como, por exemplo, um ácido carboxílico, de preferência ativado por um éster de N- hidróxi succinimida (NHS) para reagir com um grupo amino sobre o DNA

. 29/37

(por exemplo, dT de amino modificado), uma amidita para modificar a extre- midade 5' ou 3' de uma cabeça de DNA de filamento único (obtido por meios da química de oligonucleotídeos-padrão), pares de clique química (cicloadi- ção de azida alcino na presença de catalisador Cu (1)) ou grupos reativos tiol.

Parte 2 podem ser também um grupo reativo, que forma uma ligação covalente com a biblioteca química, ou um bloco de construção na posição A ou porção arcabouço.

Tal um grupo reativo pode ser, por exemplo, uma a- mina, um tiol, uma azida, ou um alcino para reações à base de água ou vá- rios outros grupos reativos para as reações de base orgânica.

Parte 3 pode ' 10 serum espaçador quimicamente inerte de comprimento variável, introduzido : entre a parte 1 e 2. Como um espaçador pode ser uma cadeia de unidades de etileno glicol (por exemplo, PEGs de comprimentos diferentes), um alca- no, um alceno, a cadeia de polieno, ou cadeia peptídica.

O ligante pode con- ter ramificações ou inserções com porções hidrofóbicas (tal como, por e- xemplo, anéis de benzeno) para melhorar a solubilidade da cabeça em sol- ventes orgânicos, bem como porções fluorescentes (por exemplo, fluoresce-

ína ou Cy-3) utilizadas para fins de detecção de biblioteca.

Exemplos de ligantes comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, ligantes amino-carboxílico (por exemplo, peptídeos (por exemplo, Z-GlyGlyGly-Osu or Z-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Osu), PEG (por exemplo, Fmoc-aminoPEG2000-NHS ou amino-PEG (12-24)-NHS), ou cadeias de ácido alcano (por exemplo, ácido-Osu Boc-e-aminocaproico)), ligantes de clique químico (por exemplo, peptídeos (por exemplo, azidohomalanina-Gly- GlIy-Gly-OSu ou propargilglicina-Gly-Gly-Gly-OSu), PEG (por exemplo, azi- do-PEG-NHS), ou cadeias de ácido alcano (por exemplo, ácido 5- azidopentanoico, (S)-2-(azidometil)-1-Boc-pirrolidina, ou éster de N- hidroxissuccinimida de ácido 4-azido-butan-1-0ico)), ligantes reativos tiol (por exemplo, PEG (por exemplo, SM(PEG)n NHS-PEG-maleimide), cadeias al- cano (por exemplo, ácido-Osu 3-(piridin-2-ildissulfanil)-propiônico ou 6-(3'-[2- pirididditiol-propionamido)hexanoato))) de sulfossuccinimiídila, amiditas para síntese de oligonucleotídeo (por exemplo, modificadores de amino (por e- xemplo, 6-(trifluoroacetilamino)-hexil-(2-cianoetil)-(N, N-di-isopropil)-

- 30/37 fosforamidita), modificadores de tiol (por exemplo, S-tritil-6-mercaptohexol-1- [(2-cianoetil)-(N, N-di-isopropil)]-fosforamidita, ou modificadores de clique químico (por exemplo, 6-hexin-1-il-(2-cianoetil)-(N N-di-isopropil)- fosforamidita, 3-Dimetoxitritilóxi-2-(3-(3- propargiloxipropanamido)propanamido)propil-1-O-succinoilal, alquilamino de cadeia longa CPG, ou éster de de N-hidroxissuccinimida de ácido 4-azido- butan-1-oico)).

Resíduos hidrofóbicos no projeto de cabeça podem ser variados com o projeto do ligante para facilitar síntese de biblioteca em solventes or- ] 10 gânicos. Por exemplo, a combinação de cabeça e ligante é projetada para . ter resíduos apropriados em que o coeficiente de octanol : água (Poct) seja de, por exemplo, 1.0 a 2.5.

EXEMPLOS Os seguintes exemplos pretendem ilustrar a invenção. Eles não pretendem limitar a invenção em nenhuma maneira. Exemplo 1. Preparação da cabeça (Variante 1) Um oligonucleotídeo cabeça fosforilado (oligo HP) tendo a se- guinte sequência foi sintetizado e HPLC purificada por DNA IDT. 5'-(fosfato) TCCTGGCTGAGGCGAGAGTT(dT-C6-NH) TTCTCTCGCCT- CAGCCAGGACC-3'(SEQ ID NO: 51) O oligonucleotídeo se dobrou em uma estrutura em formato de grampo (figura 10) com uma inclinação e contém um sítio de clivagem (CCTCAGC) para enzima de restrição BbvCI ou versões recortadas desta enzima Nb.BbvCI ou Nt.BbvCl, que podem clivar o filamento superior ou o inferior (New England BioLabs). No meio do laço em formato de grampo, a cadeia lateral dt C5-amino-modificado dT é inserida (dT-C6-NH; "C6" refere- se ao ligante de carbono 6), que foi usado para o acoplamento do ligante amino-PEG (PEG2000, aproximadamente 45 unidades de etileno glicol). Os filamentos superior e inferior das marcações de DNA A, B, e C foram sinteti- zados e purificados pro DNA IDT e purificados por dessalgagem-padrão. Oligonucleotídeos mais longos, tais como a extremidade 3' e os iniciadores PCR, foram sintetizados por DNA IDT e HPLC purificada.

- 31/37 Dez nanomoles do oligo HP foram dissolvidos em 50 ul de água. Um excesso molar de 20 vezes de éster Fmoc-amino-PEG2000-carboxil- NHS (JenKem Technology USA) foi dissolvido em 50 ul de dimetilformamida (DMF) e foi adicionado à solução de oligonucleotídeo em 2 porções durante ocursode?2 horas à temperatura ambiente (composição de solvente final de 50% DMF/50% de água). Subsequentemente, 60 ul de 1 M de Tris HCl, pH

7.0 (concentração final de 200 mM), foram adicionados para resfriar brusca- mente o excesso de ésteres NHS, e a solução foi incubada por um adicional de 30 minutos à temperatura ambiente. A mistura de reação resultante foi ] 10 diluída em 500 ul com água e foi dessalgada passando através de uma co- ' luna NAP-5 (Sephadex-25, GE Healthcare).

O material resultante foi liofilizado e dissolvido em 100 ul de á- gua. 20 ul de piperidina (a uma concentração final de 20%) foram adiciona- dos e incubados por 2 horas à temperatura ambiente. Um precipitado turvo foiformado devido à desproteção da amina e liberação do grupo grupo Fmoc insolúvel em água. A reação foi em seguida filtrada através de filtros amoví- veis de 0.2-um (Millipore) e precipitada usando 300 mM de acetato de sódio pela adição de 3 volumes de etanol. A forma Fmoc protegido do oligonucleo- tídeo modificado foi encontrada como sendo solúvel em etanol e isopropa- nol. Devido a alta eficiência de acoplamento, o cabeça resultante (HP-1) foi usado sem purificação adicional (figura 11).

Exemplo 2. Preparação do cabeça (Variante 2) Uma cabeça completa (HP-1) tendo a seguinte sequência foi preparada por Trilink, Inc., seguindo um procedimento similar como descrito acima, eRP-HPLC purificado. 5'-(fosfato)TCCTGGCTGAGGCGAGAGTT(dT-C6-NH)(X) TTCTCTCGCCT- CAGCCAGGACC-3' (SEQ ID NO: 52) onde X permanece para amino-PEG2000.

Exemplo 3. Síntese de um membro da biblioteca modelo Etapa1: Acoplamento de DTAF A fim de preparar uma "biblioteca de 1," um composto modelo, 5 -(4,6-diclorotriazinil-aminofluoresceína) (DTAF; Anaspec) (figura 12), foi aco-

: 32/37 plado ao grupo amino de HP-1. DTAF estruturalmente representa um arca- bouço de triclorotriazihna com um composto amino acoplado.

Para formar uma biblioteca, arcabouços de triclorotriazina podem ser derivatizados com uma diversidade de blocos de construção em cada uma das três posições do cloro.

DTAF também provê um rótulo fluorescente para a biblioteca modelo.

A reação (10 ul) foi ajustada como segue.

A 5 ul de 400 uM de HP-1 dissol- vido em água, 2 ul de 750 mM tampão de borato, pH 9.5, e 1 ul de DMF fo- ram aidcionados.

DTAF foi dissolvido em DMF para 50 mM e 2 ul foi adicio- nado à reação.

Concentrações finais do HP-1 e DTAF foram 200 uM e 10 ] 10 mM, respectivamente, Assim gerando um excesso de 50 vezes do DTAF.

À . concentração de DMF final foi 30%. Foi notado que HP-1 pemaneceu solúvel em até 90% DMF, demonstrando que ele foi solúvel em um solvente orgâni- co, por exemplo, DMF.

A reação foi permitida prosseguir a 4ºC por 16-20 horas.

A mistura de reação foi em seguida diluída com água a 30-50 ul e dessalgada em uma coluna de rotação Zeba (Pierce). Nenhuma purificação adicional foi finalizada neste ponto.

Etapa 2: Acoplamento de amino-biotina Após DTAF ter sido acoplado a HP-1, um grupo mais reativo na molécula de arcabouço está ainda disponível para modificação.

Foi escolhi- do um análogo de amino-biotina, EZ-Link Pentilamina-Biotina (Pierce), para se acoplar nesta posição a fim de gerar um composto de ligação modelo (fi- gura 12). A reação foi ajustada como segue. 20 ul de uma mistura de reação continha em torno de 200 pmoles de HP-1-DTAF (Etapa 1) dissolvido em 150 mM de tampão de borato, pH 9.5, e 10 nmoles de pentilamina-biotina.

A reação foi permitida prosseguir por 4-12 horas a 75ºC.

A reação foi em se- guida purificada por dessalgagem em uma coluna de rotação Zeba, como descrito acima.

Etapa 3: Ligação das marcações de DNA a HP-1-DTAF-biotina Marcações de DNA fosforiladas (região iniciador de extremidade 3 einiciadores PCR 5' e 3') foram sintetizadas por DNA IDT.

Sequências de oligonucleotídeo (figura 13) são como seguem.

Marcação de DNA A1 (superior): 5-fos-GGAGGACTGT (SEQ ID NO: 53)

- 33/37 Marcação de DNA A1 (inferior): 5-fos-AGTCCTCCGG (SEQ ID NO: 54) Marcação de DNA B1 (superior): 5'-fos-CAGACGACGA (SEQ ID NO: 55) Marcação de DNA B1 (inferior): 5-fos-GTCGTCTGAC (SEQ ID NO: 56) Marcação de DNA C1 (superior): 5-fos-CGATGCTCTT (SEQ ID NO: 57) Marcação de DNA C1 (inferior): 5-fos-GAGCATCGTC (SEQ ID NO: 58) Extremidade 3' (superior): 5-fos-GCTGTGCAGGTAGAGTGC-3' (SEQ ID NO: 59) Extremidade 3' (inferior): -ANMACGACACGTCCATCTCACG (SEQ ID NO: 60) Iniciador PCR 5": -CTCTCGCCTCAGCCAGGA (SEQ ID NO: 61) Ú 10 Iniciador PCR 3": S-GCACTCTACCTGCACAGC (SEQ ID NO: 62) BR Quantidades equivalentes de pares superior e inferior de marca- ções e oligonucleotídeos de extremidade 3' foram dissolvidas em água e aneladas por aquecimento a 85ºC e esfriadas para 4ºC em 200 mM de NaCl, 50 mM de Tris HCl, pH 7.0, tampão.

Primeiro, a marcação A1 de duplo filamento foi ligada à cabeça.

A reação de ligação (20 ul) continha 2.5 uM de HP-1-DTAF-biotina e 2.5 uM de a marcação A1 de duplo filamento em tampão 1x T4 DNA ligase e 60 u- nidades Weiss de T4 DNA ligase (New England BioLabs). A reação foi incu- bada a 16ºC por 16 horas. O produto resultante não foi redissolvida em qualquer um dos geles testados, incluindo diferentes porcentagens de TBE- ureia, NativePage, SDS-PAGE, ou 2% e 4% de E-gel de agarose (Invitrogen, Inc.). Mobilidade do oligonucleotídeo, modificou com ligante PEG e DTAF- biotina, foi a maior parte determinada pela presença desses grupos em vez de pelo DNA propriamente (dados não mostrados). Para testar a eficiência daligação,todasas marcações foram ligadas e oligonucleotídeos de extre- midade 3' e realizados ensaios PCR do construto resultante para confirmar a eficiência da ligação. A reação de ligação (70 ul) continha: 2.5 uM de HP-1- DTAF-biotina; 2.5 UM de de cada uma das Marcações de DNA duplo fila- mentadas aneladas (A1, B1, e C1), bem como a marcação de extremidade 3'1xtampão de T4 DNA ligase; e 210 unidades Weiss de T4 DNA ligase. À reação foi incubada a 16ºC por 20 horas.

A mistura de reação foi carregada em 4% de gel de agarose e a

- 34/37 banda fluorescente foi extraída do gel.

Este material foi usado para amplifi- cação de PCR de 24 ciclos teste usando iniciadores 5' e 3' como descrito acima.

Os resultados são resumidos na figura 13. Etapa 4: Purificação de HP-1-DTAF-biotina em contas de estrep- tavidinaae reação com estreptavidina Purificação de HP-1-DTAF-biotina em estreptavidina (SA) contas magnéticas Dynal M-280 (Invitrogen) servem como um modelo para seleção por afinidade para a biblioteca química de DNA marcado.

Beads de SA fo- ram pré-equilibradas em 2x tampão de PBS contendo 0.05% de Triton X- Ú 10 100.50 pmoles de HP-1-DTAF-biotina foram carregados em 25 ul das beads : SA pré-lavadas por 15 minutos à temperatura ambiente com aplicação por rotação em tambor.

A corrente foi coletada e as contas foram lavadas 3 ve- zes por 30 minutos com 1 ml do mesmo tampão.

Uma lavagem final foi reali- zada a 80ºC por 10 minutos com 30 ul de água (coletada). As contas foram 15 eluídas com 30 ul de 25 mM de EDTA e 5 mM de NaOH por 10 minutos a 90ºC, e o eluente foi imediatamente neutralizado pela adição de 3 ul de 1 M de Tris HCl, pH 7.0. Para o experimento de ligação de estreptavidina, 5 ul das amos- tras de eluição foram incubados com um excesso de estreptavidina em 50 20 mM de NaClI/10 mM Tris HCl, pH 7.0, por 10 minutos.

As amostras foram misturadas com tampão de gel de carregamento sem fervura e redissovildas em um gel NuPage SDS a 4-12% (Invitrogen) usando tampão de execução MES.

Os resultados são resumidos na figura 14. Exemplo 4. Acoplamento de peptídeo H(-Arg-eAhx)6-Arg-OH a HP-1-DTAF. 25 Foi escolhido um peptídeo rico em arginina R7, H(-Arg-eAhx)6- Arg-OH (Bachem), para usar como outra modificação para o último grupo de reação no arcabouço de triazina.

Isto é um peptídeo permeável na membra- na celular de ácido um arginina-aminohexanoico usado para liberar um com- posto intracelular.

A reação foi ajustada similarmente às condições de rea- 30 ção descritas acima: 20 ul de reação continha em torno de 200 pmoles de HP-1-DTAF (Etapa 1) dissolvido em 150 mM de tampão de borato, pH 9.5, e nmoles de peptídeo R7. Sob essas condições, as cadeias laterais das

. 35/37 argininas não reagiram, e a única amina reativa no peptídeo é a N-terminal.

A reação foi permitida prosseguir por 12 horas a 75ºC e foi em seguida puri- ficada por dessalgagem em uma coluna de rotação Zeba.

Exemplo 5. Construto de DNA para experimento de detecção de liberação deRNAPT7 O construto de DNA para o experimento de liberação intracelular da "biblioteca de 1" química foi preparado a partir de um produto de PCR de um único clone de DNA VH de —400 pb caracterizando uma região do pro- motor T7 na extremidade 5' e uma região Cmu constante de pequeno anti- | 10 corpo fechada na extremidade 3' da molécula.

A fim de ligar o construto de ' DNA à cabeça modificado da biblioteca química modelo, um sítio de restri- ção Bsml foi anexado a jusante da região do promotor T7 por aplificação de PCR do clone.

Digestão por restrição de Bsml produziu uma saliência em GG 3', que permitiu ligçaão ao cabeça (saliência CC 3'). O iniciador 5' com o sítio Bsml (sublinhado) foi sintetizado por DNA IDT, Inc. 5-GGATGCCGAATGCCTAATACGACTCACTATAGGG- ACAATTACTATTTACAATTACA (SEQ ID NO: 63) Seguindo amplificação de PCR, o construto de DNA foi purifica- do usando um kit de purificação de PCR (Invitrogen), e o DNA resultante foi digerido com 250 U Bsml (New England BioLabs) a 65ºC em tampão de NEB 4 por 2 horas.

O DNA foi purificado em um gel de agarose a 2%. A rea- ção de ligação (30 ul) continha 2 pmoles de cada construto DNA VH, digeri- do com Bsml, bem como HP-1-DTAF-R7 (peptídeo de arginina-ácido amino- hexanoico) em 1x tampão DNA ligase T4 e 60 unidades Weiss de T4 DNA ligase (New England BioLabs). A reação foi incubada a 16ºC por 20 horas.

Devido a alta eficiência da ligação, o material foi adicionalmente usado para a liberação intracelular /experimento T7 RNAP sem purificação adicional.

Os resultados são resumidos na figura 15. Exemplo 6. Síntese de 10x10 Biblioteca Etapa 1. Ligação da marcação A ào cabeça HP-T Nesta biblioteca exemplar, apenas posições B e C são usadas.

Uma marcação A é ligada a HP-T.

A marcação tem a seguinte sequência:

- 36/37 Marcação de DNA A1 (superior): 5"-fos-GGAGGACTGT (SEQ ID NO: 64) Marcação de DNA A1 (inferior): 5-fos-AGTCCTCCGG (SEQ ID NO: 65) 30 nmoles de HP-T foram misturados com 45 nmols de cada oli- gos marcação A1 superior e marcação A1 inferior em 1x tampão T4 DNA ligase e foram anelados por aquecimento a 95ºC por 1 minuto, seguido por resfriamento a 4ºC a 0.2ºC/segundo. As amostras foram então trazidas para 16ºC. 300 Unidades Weiss de T4 DNA ligase foi adicionado e as amostras foram permitidas incubar por 16-20 horas a 16ºC. Seguinte à ligação, HP-T- A foi dessalgado usando uma coluna Zeba (Pierce). Ver, por exemplo, figura i 10 16A. . Etapa 2. Ligação de marcações B1-B12 e marcações C Doze reações de ligação foram ajustas similarmente às reações de ligação descritas acima. Em cada um dos 12 tubos, 5 nmoles de pares de oligos B1-B12 superior e inferior foram adicionados a 1x tampão T4 DNA ligase e anelados como descrito acima. HP-T-A foi dissolvido em 1x tampão T4 DNA ligase. 2.5 nmoles de HP-T-A foram aliquotados nestes 12 tubos. 30 Unidades Weiss de T4 DNA ligase foram adicionadas a cada tubo e as rea- ções foram permitidas prosseguir por 20 horas a 16ºC. Seguinte à incuba- ção, cada mistura de reação foi individualmente dessalgada em uma coluna derotaçãoZeba a 0.5 ml, equilibrada com 150 mM de tampão de borato, pH

9.0. A cada tubo, um excesso de 20x de cloreto cianúrico (50 nmoles), dis- solvido em acetonitrila, foi adicionado e incubado por 1,5 hora a 4ºC. Seguin- te a esta incubação, um excesso de 100x (250 nmoles, isto é, 5X excesso relativo a cloreto cianúrico) de aminas B1-B12, dissolvidas em acetonitrila ou DMF,foiadicionado em correspondência com as marcações B1-B12 ligadas. A reação com aminas foi permitida prosseguir por 20 horas a 4ºC. Seguinte a esta reação a biblioteca foi agrupada, dessalgada duas vezes em 2-ml de coluna Zeba e liofilizada. Ver, por exemplo, Figuras 16B e 16C. Como as reações acima, as marcações C e aminas são adicio- nadas usando condições de reação similares àquelas descritas acima. Outras modalidades Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencio-

- 37/37 nados no relatório acima são incorporados por referência.

Várias modifica- ções e variações do método descrito e o sistema da invenção serão eviden- tes para aqueles versados na técnica sem se afastar do escopo e do espírito da invenção.

Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com moda-

lidades específicas, deve-se compreender que a invenção, tal como reivindi- cada não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas.

De fato, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção que são óbvias para aqueles versados na técnica têm a intenção de estar dentro do escopo da invenção. '

Outras modalidades estão nas reivindicações.

Claims (20)

. 18 REIVINDICAÇÕES

1. Método de marcação de bibliotecas químicas de DNA codifi- cado, o método compreendendo ligar um primeiro grupo funcional de um ligante bifuncional um oligonucleotídeo iniciador na extremidade 5' do oligo- —nucleotídeo iniciador e ligar um segundo grupo funcional do ligante bifuncio- nal a um componente da biblioteca química, em que o ligante bifuncional ou oligonucleotídeo iniciador é modificado para aumentar a solubilidade de um membro do Biblioteca química de DNA codificado em condições orgânicas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o oligonu- : 10 cleotídeo iniciador ligado ao ligante bifuncional forma uma estrutura em for- . mato de grampo. .

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o oligonu- , cleotídeo iniciador compreende uma primeira região identificadora. '

4. O método, de acordo com a reivindicação 3, em que o oligo- nucleotídeo iniciador compreende uma segunda região identificadora que hibridiza a primeira região identificadora do oligonucleotídeo iniciador.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o ligante bi- funcional é modificado para aumentar a solubilidade de um membro da bibli- oteca química de DNA codificado em condições orgânicas.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, em que o ligante bi- funcional modificado compreende um ou mais dentre uma cadeia alquila, uma unidade de polietileno glicol, uma espécie ramificada com cargas positi- vas, ou uma estrutura de anel hidrofóbico.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o oligonu- —cleotídeo iniciador é modificado para aumentar a solubilidade de um membro da biblioteca química de DNA codificado em condições orgânicas.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que o oligonu- cleotídeo iniciador compreende uma primeira região identificadora e um se- gunda região identificadora, e em que a primeira região identificadora ou a segunda região identificadora é modificada para aumentar a solubilidade de um membro da biblioteca química de DNA codificado em condições orgâni- cas.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que o oligonu- cleotídeo iniciador modificado compreende um ou mais dentre um nucleotí- deo tendo uma porção hidrofóbica ou uma inserção tendo uma porção hidro- fóbica.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, em que o oligonu- cleotídeo iniciador modificado compreende o nucleotídeo tendo uma porção hidrofóbica, e a porção hidrofóbica é uma cadeia alifática na posição C5.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, em que o oligonu- cleotídeo iniciador modificado compreende a inserção tendo uma porção : 10 hidrofóbica, e a porção hidrofóbica é um azobenzeno. .

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o membro da biblioteca química de DNA codificado tem um coeficiente de octanol: á- gua de 1,0 a 2,5. '

13. Método de marcar bibliotecas químicas de DNA codificado, o método compreendendo ligar um primeiro grupo funcional de um ligante bi- funcional a um oligonucleotídeo iniciador na extremidade 5' do oligonucleotí- deo iniciador, em que o oligonucleotídeo iniciador ligado ao ligante bifuncio- nal forma uma estrutura em formato de grampo, e ligar um segundo grupo funcional do ligante bifuncional a um componente da biblioteca química.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que o oligo- nucleotídeo iniciador compreende uma primeira região identificadora.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que o oligo- nucleotídeo iniciador compreende uma segunda região identificadora que hibridiza a primeira região identificadora do oligonucleotídeo iniciador.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que a segun- da região identificadora compreende uma marcação fluorescente ou o rótulo de biotina.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, em que a segun- da região identificadora não é amplificada antes da análise após uma etapa de seleção.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, em que o ligante bifuncional, oligonucleotídeo iniciador, primeira região iden-

. 3/3 tificadora, ou segunda região identificadora são modificados para aumentar a solubilidade de um membro da biblioteca química de DNA codificado em condições orgânicas.

19. Método de criação de bibliotecas de DNA codificado, o mé- — todo compreendendo: (a) criar um primeiro nodo de diversidade; (b) codificar o primeiro nodo de diversidade em vasos separa- dos; (c) agrupas o primeiro nodo de diversidade, e " 10 (d) dividir o primeiro nodo de diversidade agrupado em um se- , gundo conjunto de vasos separados, em que o primeiro nodo de diversidade . reage para formar um segundo nodo de diversidade.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que o segun- ' do nodo de diversidade não é codificado e agrupado.

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