WO2023095841A1 - Ｄｎａコード化ライブラリの評価方法 - Google Patents

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WO2023095841A1
WO2023095841A1 PCT/JP2022/043405 JP2022043405W WO2023095841A1 WO 2023095841 A1 WO2023095841 A1 WO 2023095841A1 JP 2022043405 W JP2022043405 W JP 2022043405W WO 2023095841 A1 WO2023095841 A1 WO 2023095841A1
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del
group
stranded
crosslinker
double
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雅俊 丹羽
宗史 ▲徳▼川
潤 林田
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日産化学株式会社
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes

Definitions

  • the present invention relates to methods for evaluating DNA-encoded libraries.
  • a compound library is a group of compound derivatives systematically collecting compounds that may have specific activities, such as drug candidate compounds. This compound library is often synthesized based on combinatorial chemistry synthetic techniques and methodologies. Combinatorial chemistry is a research field related to experimental techniques for efficiently synthesizing a series of compound libraries, which are enumerated and designed based on combinatorial theory, through systematic synthetic routes.
  • One class of compound libraries based on combinatorial chemistry are DNA-encoded libraries.
  • the DNA-encoded library is appropriately abbreviated as DEL.
  • DEL a DNA tag is added to each compound in the library. The DNA tag has a sequence designed so that each structure of each compound can be identified, and functions as a compound label (Patent Documents 1 to 3).
  • Screening using DEL has so far identified a plurality of compounds that are effective in drug development. Screening using DEL is performed, for example, as follows (Non-Patent Documents 1 to 3). 1) immobilizing the target protein on an immobilizing carrier 2) contacting the target with DEL 3) washing away the DEL with low affinity for the target 4) denaturing the target protein to achieve high affinity Elute the DEL 5) Amplify the DNA Sequence Contained in the Eluted DEL and Identify the Sequence
  • the screening method as described above has several problems. First, it is necessary to immobilize the target protein, so depending on the protein, the three-dimensional structure may change after the immobilization operation.
  • Non-Patent Documents 4 and 5 the compounds obtained by screening do not bind to the desired non-immobilized target protein, which limits the target application range of DEL.
  • high affinity binders can be recovered, but intermediate affinity binders (eg, those with a Kd value of ⁇ M order) are kinetically stable complexes with the target protein. It is difficult to recover after cleaning and removal.
  • intermediate affinity binders are also useful as hit compounds that serve as a starting point for drug discovery, and are also useful as structure-activity relationship information (Non-Patent Document 6 ).
  • a relatively short double-stranded DNA tag of about 9 to 13 mers with a 2-mer sticky end is often used, and the double-stranded DNA tag is introduced by a ligation reaction using DNA ligase.
  • the use of such a short DNA tag is made possible by the strong intramolecular formation of a double strand by the hairpin strand DNA and the fact that the DNA site other than the sticky end does not interfere with the DNA tag.
  • the use of short double-stranded DNA tags has several advantages in DEL synthesis. One advantage is the low cost of synthesizing DNA tags. Another advantage is that the use of shorter DNA tags reduces the total length of DEL when encoding the same number of reaction cycles.
  • Non-Patent Document 3 construction of a DEL using hairpin-strand DNA that encodes 6 cycles of reactions is achieved by using hairpin-strand DNA.
  • hairpin strands form double strands stronger than double strands (higher Tm value) if the strand length is the same. Therefore, under various chemical conditions during the introduction of building blocks, each chemical structure of the hairpin strand DNA, especially the structure of the base portion, should be more resistant to structural transformation than the double strand.
  • a hairpin strand DNA forms a double strand within the molecule, and it is difficult to newly form a double strand with another oligonucleotide strand. Therefore, it is difficult to convert to crosslinker-modified double-stranded DEL by providing newly crosslinker-modified oligonucleotides.
  • double-stranded DEL DEL using double-stranded DNA is synthesized using single-stranded DNA (single-stranded DNA that is not a hairpin strand) or double-stranded DNA having functional groups for introducing various building blocks as a starting material (headpiece).
  • DEL single-stranded DNA
  • Double-stranded DNA can be denatured into single-stranded DNA or subjected to strand exchange reaction, which is advantageous in that it can be converted into a DNA structure suitable for various uses. Therefore, it is also possible to convert to a crosslinker-modified double-stranded DEL by imparting a new crosslinker-modified single-stranded oligonucleotide (Non-Patent Documents 7, 8 and 11).
  • hairpin strand DNA and double-stranded DNA have advantages when synthesizing and evaluating DEL, respectively, but there is no known technique for achieving both advantages.
  • Non-Patent Documents 7 and 8 a single-stranded DEL having a library molecule at the 5' end is synthesized, a double strand is formed with a DNA having a photoreactive crosslinker at the 3' end, and screening is performed. A binding agent with a degree of affinity has been obtained.
  • this method since the DNA ligated with the photoreactive crosslinker does not contain the coding sequence, if it is exposed to strong separation or elution conditions for the removal of non-specific binding agents, etc., two It is possible that the strands will separate and the sequence encoding the desired structure will not be obtained.
  • the single-stranded DEL since the single-stranded DEL is used, it is a method in which the merits of the hairpin-stranded DEL cannot be utilized in the synthesis.
  • Non-Patent Document 5 Non-Patent Documents 4, 5 and 12
  • linker-modified DEL By synthesizing a single-stranded DEL having a library molecule at the 3' end and forming a double strand with a short-stranded DNA having a photoreactive crosslinker at the 5' end, a photoreactive cross It is referred to as linker-modified DEL.
  • linker-modified DEL An advantage of this approach is the presence of a photoreactive crosslinker at the 5' end, which covalently joins the coding sequence to the target through an extension reaction with a DNA polymerase.
  • Patent Document 4 describes a hairpin chain DEL having a linking site with a crosslinker. Although this method can solve the problems described in Non-Patent Document 5 above, it is necessary to perform library synthesis without damaging the functional groups for crosslinker ligation, and usable reactions and / or Another problem is that the library molecular structure can be restricted.
  • Patent Document 6 synthesis of a double-stranded DEL crosslinked by a reversible covalent bond (considered to have properties equivalent to a hairpin strand DEL in terms of double-strand formation ability and the like), and crosslinker-modified is described for conversion to DEL.
  • a reversible covalent bond a covalent bond by [2 + 2] photocyclization between a special base such as cyanovinylcarbazole and a pyrimidine base is disclosed.
  • photocyclized pyrimidine bases have lost their aromaticity, and such pyrimidine bases that have lost their aromaticity are known to be chemically unstable and decompose under basic conditions.
  • Non-Patent Document 13 Therefore, in this method, usable reactions are limited during DEL synthesis, and library molecular structures that can be constructed are also limited.
  • the present invention provides a method for inducing and evaluating a DEL containing a cleavable site in its DNA strand into a crosslinker-modified double-stranded DEL.
  • Nucleic acid cleaving technology is one of the nucleic acid chemistries such as DNA.
  • introduction of deoxyuridine into the DNA strand allows for selective cleavage by the USER® Enzyme.
  • the present inventors have found that by introducing a cleavable site such as deoxyuridine into the DNA chain, it is possible to achieve both the advantages of hairpin strand DNA and double-stranded DNA. The above problem was solved by simply inducing to DEL. Accordingly, the present invention is as follows.
  • a method for evaluating crosslinker-modified double-stranded DELs derived from hairpin DNA-encoding libraries (DELs) with "selectively cleavable sites” comprising the steps of: (1) contacting the DEL with a biological target under conditions suitable for binding of at least one library molecule of the DEL to the biological target; (2) cross-linking the cross-linker of the library molecule bound to the biological target with the biological target; (3) allowing complexes of cross-linked library molecules and biological targets to separate from non-cross-linked library molecules; (4) identifying the sequence of the oligonucleotide possessed by the library molecule in the recovered complex; (5) using the sequences determined in (4) to identify the structure of one or more compounds that bind to the biological target; A method consisting of: [2] The method of [1], wherein the crosslinker of the crosslinker-modified double-stranded DEL is linked to an oligonucleotide having a coding sequence via a covalent bond.
  • a hairpin DEL having a "selectively cleavable site” is cleaved at least one "selectively cleavable site” to convert it into a double-stranded DEL.
  • oligonucleotides to which library molecules are not bound are removed and converted to single-stranded DEL.
  • a crosslinker-modified double-stranded DEL is derived by reacting a reactive group for crosslinker modification with a crosslinker unit.
  • a crosslinker-modified primer is added to the single-stranded DEL obtained in (ii), and the attached primer is extended to induce a crosslinker-modified double-stranded DEL.
  • the method according to any one of [1] to [3], wherein the induction to crosslinker-modified double-stranded DEL comprises the following steps.
  • a hairpin DEL having a "selectively cleavable site” is cleaved at least one "selectively cleavable site” to convert it into a double-stranded DEL.
  • a crosslinker-modified double-stranded DEL is derived by reacting a reactive group for crosslinker modification with a crosslinker unit.
  • a hairpin DEL having a "selectively cleavable site” is cleaved at least one "selectively cleavable site” to convert it into a double-stranded DEL.
  • a crosslinker-modified primer is added to the double-stranded DEL obtained in (i), and the added primer is extended to induce a crosslinker-modified double-stranded DEL.
  • a hairpin DEL having a "selectively cleavable site” is cleaved at least one "selectively cleavable site” to convert it into a double-stranded DEL.
  • a modified primer having a reactive group for crosslinker modification is applied to the double-stranded DEL obtained in (i), the applied primer is extended, and a reactive group for crosslinker modification and a cross A crosslinker-modified double-stranded DEL is induced by reacting with the linker unit.
  • step (II) a modified primer having a reactive group for crosslinker modification, wherein the reactive group for crosslinker modification is directly attached to the 5′ end of the oligonucleotide or is attached via a bifunctional spacer; use.
  • the oligonucleotide to which the library molecule is not bound has a functional molecule and is removed by treatment according to the function of the functional molecule, [4] to [7] ] The method according to any one of [13] The method of [12], wherein the functional molecule is biotin.
  • step (ii) the removal of oligonucleotides to which library molecules are not bound is degradation by exonuclease.
  • step (ii) the removal of oligonucleotides to which library molecules are not bound is degradation by exonuclease.
  • the exonuclease is lambda exonuclease.
  • the crosslinker contains at least one azide group, diazirine group, sulfonyl fluoride group, diazo group, cinnamoyl group, or acrylate group.
  • the crosslinker contains at least one azide group, diazirine group, or sulfonyl fluoride group.
  • the crosslinker is represented by formulas (AA) to (AE): (Wherein, * means the 5' end of the double-stranded DEL, or the binding position to the bifunctional spacer side that is bound to the 5' end)
  • the crosslinker is represented by formulas (AA) to (AE): (Wherein, * means the 5' end of the double-stranded DEL, or the binding position to the bifunctional spacer side that is bound to the 5' end)
  • the crosslinker has the formula (BA) or (BB): (Wherein, * means the 5' end of the double-stranded DEL, or the binding position to the bifunctional spacer
  • the method according to any one of [1] to [19], which is a step of cross-linking with a biological target by [26] The method according to [25], wherein the light irradiation condition is light irradiation with a wavelength of 250 to 500 nm.
  • the step (2) of "crosslinking the crosslinker of the library molecule bound to the biological target with the biological target” is replaced by “crosslinking the crosslinker of the library molecule bound to the biological target by incubation.
  • the step (3) of "separating the complexes of the crosslinked library molecules and the biological targets from the non-crosslinked library molecules” includes “separating the complexes of the crosslinked library molecules and the biological targets.” , separating from non-crosslinked library molecules by electrophoresis”.
  • the method of [31], wherein the electrophoresis is gel electrophoresis.
  • a hairpin-type DEL having a "selectively cleavable site” has the formula (I) (In the formula, X and Y are oligonucleotide chains, E and F are each independently an oligomer composed of nucleotides or nucleic acid analogs; provided that E and F contain complementary base sequences to form a double-stranded oligonucleotide, LP is the loop site; L is a linker; D is a divalent group derived from a reactive functional group, Sp is a bond or a bifunctional spacer; An is a substructure composed of at least one building block.
  • ) is a compound represented by X and Y have a sequence capable of forming a double strand at least in part, X is attached to E at the 5' end, Y is attached to F at the 3' end, It has at least one selectively cleavable site in at least one of the E, F, or LP sites.
  • DEL represented by The method according to any one of [1] to [34].
  • a hairpin DEL with a "selectively cleavable site" is represented by formula (III) An-Sp-C-Bn (III) (In the formula, An and Sp have the same meaning as in [35], Bn represents a double-stranded oligonucleotide tag formed by oligonucleotide chain X and oligonucleotide chain Y; C is of formula (I) (wherein E, LP, L, D and F have the same meaning as in [35], except that D is directly attached to An or via a bifunctional spacer, and E and F binds to the respective ends of the double-stranded oligonucleotide tag Bn.) is DEL represented by The method of [35].
  • An is the same as [35] and is a partial structure constructed from n building blocks ⁇ 1 to ⁇ n (n is an integer from 1 to 10); Bn is a double-stranded oligonucleotide tag formed by oligonucleotide chain X and oligonucleotide chain Y, and is a partial structure containing an oligonucleotide containing a base sequence capable of identifying the structure of An. The method of [35] or [36]. [38] L.P.
  • LP1 is a loop site represented by p-LS-(LP2) q
  • LS is a partial structure selected from the group of compounds described in (A) to (C) below
  • Nucleotide B
  • Nucleic acid analogue C1-14 trivalent group
  • LP1 optionally having a substituent may be alone or different from the group of compounds described in (1) and (2) below is each partial structure selected by p pieces
  • Nucleotide (2) Nucleic acid analog LP2 is each partial structure selected singly or differently from the group of compounds described in (1) and (2) below
  • (1) the total number of nucleotides (2) nucleic acid analogs p and q is from 0 to 40; [35] The method according to any one of [37].
  • LP1, LP2 and LS each have the following structure: (A) a nucleotide or (B) a nucleic acid analogue requiring (B11) to (B15) below (B11) a phosphate (or equivalent site) and a hydroxyl group (or equivalent site thereof), (B12) composed of carbon, hydrogen, oxygen, nitrogen, phosphorus or sulfur, (B13) has a molecular weight of 142 to 1,500; (B14) the number of atoms between residues is 3 to 30, (B15) the bonding patterns of atoms between residues are all single bonds, or contain 1 to 2 double bonds and the rest are single bonds; The method of any one of [38]-[42], wherein the structure is selected singly or differently from [44] LP1, LP2 and LS each have the following structure: (A) a nucleotide or (B) a nucleic acid analogue requiring (B21) to (B25) below (B21) having a phosphat
  • LS is represented by formulas (a) to (g): (Wherein, * means the bonding position with the linker, ** means the bonding position with LP1 or LP2, and R is a hydrogen atom or a methyl group.) The method according to any one of [38] to [50].
  • LS is of formula (h): (Wherein, * means the binding position with the linker, ** means the binding position with LP1 or LP2) The method according to any one of [38] to [50].
  • [53] The method according to any one of [38] to [50], wherein LS is polyalkylene glycol phosphate.
  • LS is represented by formulas (i) to (k): (Wherein, n1, m1, p1, and q1 are each independently an integer of 1 to 20, * means the binding position with the linker, ** means the binding position with LP1 or LP2 .) The method according to any one of [38] to [50].
  • LS is of formula (l): (Wherein, * means the binding position with the linker, ** means the binding position with LP1 or LP2) The method according to any one of [38] to [50].
  • LS is (B42), (B43) or (B44): (B42) Amino C6 dT (B43) mdC (TEG-Amino) (B44) Uni-Link (registered trademark) Amino Modifier The method according to any one of [38] to [50]. [57] The method of any one of [38]-[50], wherein LS is a nucleotide.
  • LS is (C) a C1-14 trivalent group optionally having a substituent, and (C) has the following structure: (1) optionally substituted C1-10 aliphatic hydrocarbon optionally substituted with 1 to 3 heteroatoms; (2) optionally substituted C6-14 aromatic hydrocarbons, (3) an optionally substituted C2-9 aromatic heterocyclic ring, or (4) an optionally substituted C2-9 non-aromatic heterocyclic ring, [38]-[ 42] and the method according to any one of [46] to [50].
  • LS is (C) a C1-14 trivalent group optionally having a substituent, and (C) has the following structure: (1) optionally substituted C1-6 aliphatic hydrocarbons, (2) optionally substituted C6-10 aromatic hydrocarbon, or (3) optionally substituted C2-5 aromatic heterocycle [38]-[42] and the method according to any one of [46] to [50].
  • LS is (C) a C1-14 trivalent group optionally having a substituent
  • (C) has the following structure: (1) C1-6 aliphatic hydrocarbons, (2) benzene, or (3) a C2-5 nitrogen-containing aromatic heterocyclic ring wherein the above (1) to (3) are unsubstituted, or 1 to which are independently or differently selected from the substituent group ST1 It may be substituted with three substituents, and the substituent group ST1 is a group composed of a C1-6 alkyl group, a C1-6 alkoxy group, a fluorine atom and a chlorine atom, provided that the substituent group ST1 is When substituting with an aliphatic hydrocarbon, an alkyl group is not selected from the substituent group ST1,
  • LS is (C) a C1-14 trivalent group optionally having a substituent, and (C) has the following structure: (1) a
  • LS is (C) a C1-14 trivalent group optionally having a substituent, and (C) has the following structure: (1) The method according to any one of [38] to [42] and [46] to [50], which is a C1-6 alkyl group.
  • E and F are each independently an oligomer composed of nucleotides or nucleic acid analogs; the chain length of E and F is 3 to 40, respectively; [35] The method according to any one of [62].
  • E and F are each independently an oligomer composed of nucleotides or nucleic acid analogs; The method according to any one of [35] to [63], wherein E and F have chain lengths of 4 to 30, respectively.
  • E and F are each independently an oligomer composed of nucleotides or nucleic acid analogs; The method according to any one of [35] to [64], wherein E and F have chain lengths of 6 to 25, respectively.
  • E and F are each independently an oligomer composed of nucleotides or nucleic acid analogs; E and F comprise complementary base sequences to form a double-stranded oligonucleotide; The E and F double-stranded oligonucleotides are overhanging ends, [35] The method according to any one of [65]. [67] The method of [66], wherein the overhang of the protruding end has a length of 2 or more bases.
  • E and F are each independently an oligomer composed of nucleotides or nucleic acid analogs; E and F comprise complementary base sequences to form a double-stranded oligonucleotide; the E and F double-stranded oligonucleotides are blunt-ended; [35] The method according to any one of [65]. [69] The method according to any one of [35] to [68], wherein each of complementary base sequences contained in E and F has a length of 3 bases or more. [70] The method according to any one of [35] to [69], wherein each of complementary nucleotide sequences contained in E and F has a chain length of 4 or more bases.
  • nucleotide is deoxyadenosine, deoxyguanosine, thymidine, or deoxycytidine.
  • E and F are each independently oligomers composed of nucleic acid analogues.
  • L is (1) optionally substituted C1-20 aliphatic hydrocarbons optionally substituted with 1 to 3 heteroatoms; Or (2) the method according to any one of [35] to [76], which is a C6-14 aromatic hydrocarbon optionally having a substituent.
  • L is a C1-6 aliphatic hydrocarbon optionally having a substituent, a C1-6 aliphatic hydrocarbon optionally substituted with 1 or 2 oxygen atoms, or having a substituent is a C6-10 aromatic hydrocarbon.
  • L is a C1-6 aliphatic hydrocarbon that can be substituted with a substituent group ST1, or a benzene that can be substituted with a substituent group ST1, wherein the substituent group ST1 is a C1-6 alkyl group, A group consisting of a C1-6 alkoxy group, a fluorine atom and a chlorine atom (however, when the substituent group ST1 is substituted with an aliphatic hydrocarbon, no alkyl group is selected from the substituent group ST1.), [35 ] to [78].
  • the reactive functional group of D is Any one of [35] to [81], which is a reactive functional group capable of forming a C—C, amino, ether, carbonyl, amide, ester, urea, sulfide, disulfide, sulfoxide, sulfonamide, or sulfonyl bond described method.
  • the reactive functional group of D is a C hydrocarbon having a halogen atom, a C hydrocarbon having a sulfonic acid leaving group, an amino group, a hydroxyl group, a carboxy group, a halogenated carboxy group, a thiol group, or an aldehyde group
  • the reactive functional group of D is —CH 2 Cl, —CH 2 Br, —CH 2 OSO 2 CH 3 , —CH 2 OSO 2 CF 3 , an amino group, a hydroxyl group, or a carboxy group, [35 ] to [84].
  • the reactive functional group of D is a primary amino group.
  • the selectively cleavable site is a deoxyribonucleoside that is neither deoxyadenosine, deoxyguanosine, thymidine, nor deoxycytidine; [35] The method according to any one of [86].
  • the selectively cleavable site is deoxyuridine, bromodeoxyuridine, deoxyinosine, 8-hydroxydeoxyguanosine, 3-methyl-2'-deoxyadenosine, N6-etheno-2'-deoxyadenosine, 7-
  • the method of any one of [35] to [88], wherein the selectively cleavable site is deoxyuridine or deoxyinosine.
  • An is a low-molecular-weight organic compound having substituents selected singly or differently from the substituent group consisting of an aryl group, a non-aromatic cyclyl group, a heteroaryl group and a non-aromatic heterocyclyl group, [35] The method according to any one of -[102]. [104] The method according to any one of [35] to [103], wherein An has a molecular weight of 5,000 or less. [105] The method according to any one of [35] to [104], wherein An has a molecular weight of 800 or less. [106] The method according to any one of [35] to [105], wherein An has a molecular weight of 500 or less.
  • the bifunctional spacers are each SpD-SpL-SpX; SpD is a divalent group derived from a primary amino group, SpL is polyethylene glycol or polyethylene, SpX is a divalent group derived from a carboxy group; The method according to any one of [1] to [107].
  • oligonucleotide chain X and oligonucleotide chain Y contain complementary nucleotide sequences.
  • the present invention provides a method for inducing and evaluating a DEL containing a cleavable site in its DNA strand into a crosslinker-modified double-stranded DEL. That is, the present invention provides a compound screening technique that combines "simple DEL synthesis technique” and “expansion/improvement of DEL evaluation technique” than conventionally. Therefore, according to the present invention, opportunities for obtaining useful hit compounds in the development of pharmaceuticals, agricultural chemicals, and medical materials are expanded.
  • FIG. 1 shows an exemplary DEL manufacturing method of Modality 1.
  • FIG. Starting with a first oligonucleotide strand containing a cleavable site in the DNA strand, a headpiece containing a loop site and a second oligonucleotide strand, binding building blocks, and oligonucleotide tags corresponding to the building blocks. (3 times in FIG. 1) and, if desired, double-stranded ligation of the oligonucleotide tag containing the primer region, the production of DEL is achieved.
  • FIG. 11 shows an exemplary DEL usage of Modality 1.
  • a cleaving means such as an enzyme is used to cleave the cleavable site into a double-stranded oligonucleotide that is not bound at the loop site.
  • PCR can be performed with high efficiency.
  • FIG. 11 shows an exemplary DEL usage of mod 2.
  • a cleaving means such as an enzyme is used to cleave the cleavable site into a double-stranded oligonucleotide that is not bound at the loop site.
  • PCR can be performed with high efficiency.
  • 3 illustrates an exemplary DEL usage of mod 3.
  • a cleaving means such as an enzyme is used to cleave both the cleavable sites so that the loop site is
  • PCR can be performed with high efficiency.
  • 4 shows an exemplary DEL usage of form 4.
  • the cleavage conditions are selected to One of the second oligonucleotide strands can be selectively cleaved.
  • 4 shows an exemplary DEL usage of Form 5.
  • FIG. New overhanging ends can be generated by providing a cleavable site near the end of the DNA tag and cleaving the site if desired. The overhanging ends can be used as sticky ends to ligate desired nucleic acid sequences such as UMIs (specific molecular identification sequences) to impart new functions.
  • Figure 6 shows an exemplary DEL usage of form 6;
  • a cleavable site, a modifying group, or a functional molecule can be used in combination.
  • DEL can be prepared by converting hairpin strand DNA to single-stranded DNA.
  • a functional molecule e.g., biotin
  • the synthesized DEL compound ligate a double-stranded oligonucleotide chain having a functional molecule (e.g., biotin) at the 3' end (A), cleave the cleavable site (B), and (C).
  • the functional molecule is biotin
  • streptavidin beads or the like having biotin affinity are used to selectively remove biotin-bound oligonucleotide chains from the system.
  • FIG. 6 shows an exemplary usage of DEL obtained in Form 6.
  • FIG. DEL having a single-stranded DNA obtained in mode 6 forms a double strand with a modified oligonucleotide having a desired functional site (for example, a crosslinker-modified DNA such as a photoreactive crosslinker) to form a new function.
  • a desired functional site for example, a crosslinker-modified DNA such as a photoreactive crosslinker
  • Figure 7 shows an exemplary DEL usage of form 7;
  • a cleavable site can be used to introduce a crosslinker.
  • a cleavable site is cleaved from the synthesized DEL compound (A), a modified primer is provided (B), and a crosslinker-modified double-stranded DEL compound can be synthesized based on the provided primer. (C).
  • a crosslinker-modified double-stranded DEL compound can markedly improve detection sensitivity in DEL library screening (see Non-Patent Documents 7 and 11, etc.).
  • Example 1 the partial structures of hairpin-type DEL containing deoxyuridine (U-DEL1-sh, U-DEL2-sh, U-DEL3-sh, U-DEL4-sh, U-DEL5-HP, U-DEL6- 10 types of HP, U-DEL7-HP, U-DEL8-HP, U-DEL9-HP, and U-DEL10-HP) each incubation when verifying the cleavage reaction by USER (registered trademark) enzyme 1 is a graph representing the conversion rate of a cleavage reaction over time.
  • hairpin DELs U-DEL1, U-DEL2, U-DEL4, U-DEL7, U-DEL8, U-DEL9, U-DEL10, H-DEL, 1 is a schematic diagram showing the synthesis procedure of U-DEL5, U-DEL11, U-DEL12, U-DEL13, I-DEL1, I-DEL2, I-DEL3, R-DEL1, and BIO-DEL).
  • FIG. Hairpin DEL synthesis is achieved by two-step double-stranded ligation with double-stranded oligonucleotides Pr_TAG and CP using the corresponding headpieces as starting materials.
  • Example 2 the eight hairpin DELs (U-DEL1, U-DEL2, U-DEL4, U-DEL7, U-DEL8, U-DEL9, U-DEL10, and H-DEL) and the double-stranded DEL Fig. 3 is a graph showing Ct values measured by real-time PCR of (DS-DEL) for each sample amount. Samples treated with USER (registered trademark) enzyme for various DELs are indicated as "USER (+)", and untreated samples are indicated as "USER (-)”.
  • Deoxyuridine-containing cleavable hairpins DEL (U-DEL1, U-DEL2, U-DEL4, U-DEL7, U-DEL8, U-DEL9, and U-DEL10) are 2-fold after USER® enzyme treatment. It shows Ct values comparable to main-strand DEL (DS-DEL).
  • a hairpin DEL (U-DEL5, U-DEL7, U-DEL9, U-DEL11, U-DEL12 and U-DEL13) containing six deoxyuridines was cleaved using USER (registered trademark) enzyme.
  • FIG. 2 is an image of a gel obtained by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis showing progress.
  • Example 4 denaturing polyacrylamide gel electrophoresis showing the progress of cleavage reaction by endonuclease V of hairpins DEL containing four deoxyinosines (I-DEL1, I-DEL2, I-DEL3 and I-DEL4) It is an image of the resulting gel. Note that the numbers in the figure indicate the number of each lane.
  • FIG. 10 is a gel image obtained by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, showing the progress of cleavage reaction of ribonucleoside-containing hairpin DEL (R-DEL1) by RNase HII in Example 5.
  • R-DEL1 ribonucleoside-containing hairpin DEL
  • FIG. 2 is a schematic showing the synthesis procedure of a model library containing 3 ⁇ 3 ⁇ 3 (27) compound species starting from U-DEL9-HP.
  • the synthesis of the model library is accomplished by three (cycles A, B, C) split-and-pool steps. Each cycle also includes a double-stranded oligonucleotide tag ligation reaction and a chemical reaction for introducing building blocks.
  • FIG. 10 is an image of a gel obtained by agarose gel electrophoresis, showing the progress of each cycle of ligation reaction in model library synthesis of Example 6.
  • FIG. 18A is a chromatograph obtained from a sample after completion of cycle C in the model library synthesis of Example 6.
  • FIG. 18B is the deconvolution result of the MS spectrum obtained from the sample after completion of Cycle C in the model library synthesis of Example 6.
  • FIG. 10 is a gel image obtained by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, showing the progress of the cleavage reaction of the model library with USER (registered trademark) enzyme in Example 6.
  • USER registered trademark
  • Example 7 five DEL compounds having biotin at the 3′ end (“AAZ-BIO-DEL”, “SABA-BIO-DEL”, “ClSABA-BIO-DEL”, “mSABA-BIO-DEL”, and "Amino-BIO-DEL”) are images of gels obtained by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, showing the progress of the cleavage reaction by USER (registered trademark) enzyme. Note that the numbers in the figure indicate the number of each lane.
  • DEL compounds having single-stranded DNA (“SS-AAZ-DEL”, “SS-SABA-DEL”, “SS-ClSABA-DEL”, “SS-mSABA-DEL”, and “SS- Amino-DEL”) and a photoreactive crosslinker-modified primer “PXL-Pr” are images of gels obtained by polyacrylamide gel electrophoresis, showing the results of primer extension reactions. Note that the numbers in the figure indicate the number of each lane.
  • Example 8 in order to compare the binding agent recovery efficiency of various photoreactive crosslinker-modified double-stranded DELs with or without photocrosslinking reaction, the recovered amount was measured by real-time PCR, and the Ct value and ⁇ Ct value (negative control It is a graph showing the difference from the Ct value). Samples without UV irradiation are indicated as "UV(-)", and samples with UV irradiation are indicated as "UV(+)”. Also, “solution S” is indicated as “S”, and “solution E” is indicated as "E”. Each notation in the graph corresponds to each sample as follows.
  • DEL compounds with single-stranded DNA (“SS-AAZ-DEL3”, “SS-SABA-DEL3”, “SS-ClSABA-DEL3”, “SS-mSABA-DEL3”, and “SS- Amino-DEL3”) and a photoreactive crosslinker-modified primer “PXL-Pr3” are images of gels obtained by polyacrylamide gel electrophoresis, showing the results of primer extension reactions. Note that the numbers in the figure indicate the number of each lane.
  • Example 11 the ⁇ Ct value calculated using the Ct value measured by real-time PCR was used to compare the binding agent recovery efficiency of various photoreactive crosslinker-modified double-stranded DELs with different linker structures with or without photocrosslinking reaction.
  • Fig. 3 is a graph showing (difference from negative control). A sample without UV irradiation is indicated as "UV(-)", and a sample with UV irradiation is indicated as "UV(+)”. Each notation in the graph corresponds to each sample as follows.
  • Fig. 10 is a graph showing the ⁇ Ct value (difference from negative control) calculated using the Ct value measured by real-time PCR, in order to compare the binding agent recovery efficiency with "modified double-stranded DEL".
  • Each bar in the graph corresponds to each sample in order from the left as follows.
  • Leftmost bar “PXL-DS-SABA-DEL3” without UV irradiation Second bar from left: “PXL-DS-ClSABA-DEL3” without UV irradiation
  • Third bar from left: Without UV irradiation "PXL-DS-mSABA-DEL3” 4th bar from the left: “PXL-DS-SABA-DEL3” with UV irradiation 5th bar from the left: “PXL-DS-ClSABA-DEL3” with UV irradiation 6th bar from left: “PXL-DS-mSABA-DEL3” with UV irradiation 7th bar from left: "PXL-DS-SABA-DEL4" without UV irradiation 8th bar from left: UV "PXL-DS-ClSABA-DEL4" without irradiation 9th bar from the left: "PXL-DS
  • FIG. 10 is a graph showing the ⁇ Ct value (difference from negative control) calculated using the Ct value measured by real-time PCR, in order to compare the binding agent recovery efficiency with "modified double-stranded DEL".
  • ⁇ Ct value difference from negative control
  • FIG. 10 is a gel image obtained by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, showing the progress of the cleavage reaction of the hairpin DEL compound (“mSABA-DEL5”) with USER® enzyme in Example 14.
  • mSABA-DEL5 hairpin DEL compound
  • a DEL compound (“SS-mSABA-DEL5") having a single-stranded DNA and a photoreactive crosslinker-modified primer "PXL-Pr5" were used to perform a primer extension reaction.
  • 1 is an image of a gel obtained by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • FIG. 2 is an image of a gel obtained by polyacrylamide gel electrophoresis showing the results of performing an extension reaction.
  • FIG. 16 a DEL compound (“SS-mSABA-DEL") having a single-stranded DNA and a reactive group-modified primer "BCN-Pr" for crosslinker modification were used to perform a primer extension reaction.
  • Example 17 is an image of a gel obtained by polyacrylamide gel electrophoresis showing . Note that the numbers in the figure indicate the number of each lane.
  • a primer extension reaction was performed using a single-stranded DEL model library, a photoreactive crosslinker-modified primer "PXL-Pr” and a reactive group-modified primer for crosslinker modification "BCN-Pr”. is an image of a gel obtained by polyacrylamide gel electrophoresis, showing the results of performing . Note that the numbers in the figure indicate the number of each lane.
  • the compound library is a group of compound derivatives systematically collecting compounds that may have specific activities, such as drug candidate compounds.
  • This compound library is often synthesized based on combinatorial chemistry synthetic techniques and methodologies.
  • Combinatorial chemistry is a field of research related to experimental techniques for efficiently synthesizing a series of compound libraries, which are enumerated and designed based on combinatorial theory, through systematic synthetic routes.
  • DNA-encoded library As mentioned above and well known to those skilled in the art, one type of compound library based on combinatorial chemistry is the DNA-encoded library.
  • DNA-encoding libraries are abbreviated DEL where appropriate. DEL is also essentially synonymous with DNA-encoded compound library.
  • a DNA-encoded library means a library in which DNA tags are added to each compound in the library. The DNA tag has a sequence designed so that each structure of each compound can be identified, and functions as a compound label.
  • Nucleotides are generally understood as substances in which a phosphate group is attached to a nucleoside.
  • Nucleotide and nucleoside are terms well known to those skilled in the art, and one general aspect of nucleoside is that a nucleobase such as a purine base or a pyrimidine base is glycoside-bonded to the 1-position of a sugar such as a pentasaccharide. understood.
  • Nucleosides and nucleotides are also units constituting nucleic acids such as DNA and RNA.
  • Nucleic acid is also a concept well known to those skilled in the art, but is generally understood as a polymer of nucleotides.
  • the nucleic acid of the present invention is a polymer composed of nucleotides and nucleic acid analogues described below.
  • nucleic acid polymers composed of nucleotides and nucleic acid analogues
  • nucleic acid monomers such as nucleotides and nucleic acid analogues
  • nucleic acids are sometimes simply referred to as nucleic acids.
  • the latter usage is also a usage in accordance with common general technical knowledge, and can be understood by a person skilled in the art according to the appropriate context.
  • Nucleotide in a broad sense includes not only natural nucleotides (original nucleotides) but also artificial nucleotides (various nucleic acid analogues).
  • the broad definition of nucleotides in the present invention includes the following aspects.
  • Natural nucleoside nucleotides include adenosine, thymidine, guanosine, cytidine, uridine, deoxyadenosine, deoxyuridine, deoxyguanosine, deoxycytidine, inosine or diaminopurine deoxyriboside).
  • nucleotides of nucleosides having nucleobase analogs include 2-aminoadenosine, 2-thiothymidine, pyrrolopyrimidine deoxyriboside, 3-methyladenosine, C5-propynylcytidine, C5 -propynyluridine, C5-bromouridine, C5-fluorouridine, C5-iodouridine, C5-methylcytidine, 7-deazaadenosine, 7-deazaguanosine, 8-oxoadenosine, 8-oxoguanosine, 6-O- methylguanosine or 2-thiocytidine.
  • C a nucleotide having an intercalated nucleobase
  • D a non-natural nucleotide having ribose or 2'-deoxyribose
  • E a nucleot
  • nucleic acid analogs examples include cyclohexanyl nucleic acid, cyclohexenyl nucleic acid, morpholino nucleic acid (PMO), locked nucleic acid (LNA), glycol nucleic acid (GNA), threose nucleic acid (TNA), serinol Nucleic acids (SNA), acyclic threoninol nucleic acids (aTNA), or nucleic acids in which the oxygen in ribose is replaced.
  • PMO locked nucleic acid
  • LNA locked nucleic acid
  • GAA glycol nucleic acid
  • TAA threose nucleic acid
  • SNA serinol Nucleic acids
  • aTNA acyclic threoninol nucleic acids
  • (F1) PMO PMO is a nucleic acid analogue having a morpholine ring at the sugar moiety and an uncharged phosphorodiamidate structure at the phosphodiester moiety.
  • (F2) LNA LNA is a nucleic acid analogue having a cross-linked structure in the sugar moiety. is bridged by Examples of bridge structures include methylene, propylene, ether or amino bridge structures. Typical LNAs include 2',4'-BNA (2'-O,4'-C-methano bridged nucleic acids).
  • F3 GNA Glycol nucleic acid is also called GNA. Examples include R-GNA or S-GNA.
  • TNA Threose nucleic acid is also called TNA. In this case ribose is replaced by ⁇ -L-threofuranosyl-(3′ ⁇ 2′).
  • SNA Serinol nucleic acids are also called SNA. In this case ribose is replaced by a serinol unit attached to a phosphodiester bond.
  • F6 aTNA Acyclic threoninol nucleic acids are also referred to as aTNA. Examples include D-aTNA or L-aTNA.
  • ribose is replaced by a threoninol unit attached to a phosphodiester bond.
  • F7 Sugar in which the oxygen in ribose is replaced Specific examples include those in which oxygen is replaced with S, Se, or alkylene (eg, methylene or ethylene).
  • G backbone-modified nucleotides (examples of the backbone-modified nucleotides include peptide nucleic acids (the peptide nucleic acids are also called PNAs.
  • the 2-aminoethyl-glycine linkage is attached to the ribose and phosphodiester backbones supersedes.
  • a nucleotide with a modified phosphate group examples include phosphorothioate, 5′-N-phosphoramidite, phosphoroselenate, boranophosphoric acid, boranophosphate, hydrogen phosphonates, phosphoramidates, phosphorodiamidates, alkyl or aryl phosphonates, phosphotriesters, bridged phosphoramidates, bridged phosphorothioates, bridged methylene-phosphonates, and the like.
  • nucleotide when a nucleotide is described without particular limitation, it means a natural nucleotide.
  • Natural nucleotide is a term well known to those skilled in the art and is not particularly limited as long as it is essentially a naturally occurring nucleotide.
  • the natural nucleotide in the present invention is the nucleotide described in (A) above.
  • Nucleic acid analog Nucleic acid analog is a term well known to those skilled in the art, and the structure of the nucleic acid analog in the present invention is not limited as long as it has the effect of the present invention.
  • the nucleic acid analogue is a compound according to aspects (B) to (H) above.
  • the nucleic acid analogue in the present invention is a compound having a phosphate-corresponding site and a hydroxyl group-corresponding site in a nucleic acid monomer. Nucleic acid analogues are more preferably compounds having a phosphate moiety and a hydroxyl group. As one aspect, the nucleic acid analogue in the present invention is a compound that can be used as a monomer in a nucleic acid synthesizer. As is well known to those skilled in the art, in a nucleic acid synthesizer, the phosphoric acid (or corresponding site) of a nucleic acid analogue is phosphoramidized, and the hydroxyl group (or its corresponding site) is protected with a protecting group.
  • Nucleic acid oligomers can be synthesized.
  • a partial structure other than the phosphate site (or corresponding site) and hydroxyl group (or corresponding site) in the nucleic acid analog can be referred to as a nucleic acid analog residue.
  • the structure of the nucleic acid analog residue is not limited as long as it has the effect of the present invention, but when the structural features of natural nucleic acids (deoxyadenosine, thymidine, deoxycytidine, deoxyguanosine) are confirmed as a reference here, the molecular weight is 322 (thymidine monophosphate) to 347 (deoxyguanosine monophosphate), and the number of atoms (oxygen atoms and phosphorus including atoms (hereinafter also referred to as the number of inter-residue atoms) is six.
  • the following are known as nucleic acid analogs that can be used in nucleic acid synthesizers.
  • the nucleic acid analogue is a compound (B1) characterized by: (B11) has a phosphoric acid (or corresponding site) and a hydroxyl group (or its corresponding site). (B12) composed of carbon, hydrogen, oxygen, nitrogen, phosphorus or sulfur; (B13) It has a molecular weight of 142 to 1,500. (B14) The number of inter-residue atoms is 5-30. (B15) The bond mode of atoms between residues are all single bonds or contain 1 to 2 double bonds and the rest are single bonds.
  • the nucleic acid analogue is compound (B2) characterized by: (B21) having a phosphoric acid and a hydroxyl group; (B22) composed of carbon, hydrogen, oxygen, nitrogen or phosphorus; (B23) It has a molecular weight of 142 to 1,000. (B24) The number of inter-residue atoms is 5-20. (B25) The bonding mode of atoms between residues are all single bonds.
  • the nucleic acid analogue is a compound (B3) characterized by: (B31) having a phosphoric acid and a hydroxyl group; (B32) composed of carbon, hydrogen, oxygen, nitrogen or phosphorus; (B33) has a molecular weight of 142 to 700; (B34) The number of inter-residue atoms is 5-12. (B35) The bonding modes of atoms between residues are all single bonds.
  • the nucleic acid analog is the following compounds (B41), (B42), (B43), (B44), (B5), (B51), or (B52).
  • B41 d-Spacer
  • B42 Amino C6 dT
  • B43 mdC
  • TAG-Amino B44
  • Uni-Link registered trademark
  • Amino Modifier B5
  • B51 Diethylene glycol phosphate or triethylene glycol phosphate
  • Oligonucleotides and oligonucleotide chains in the present invention mean polymers of nucleotides having one or more nucleotides at internal positions between the 5' and 3' ends and between the 5' and 3' ends.
  • a base sequence complementary to each other means that two oligonucleotides of a nucleic acid form a fixed pair of adenine and thymine (or uracil) or guanine and cytosine to form a so-called complementary base pair connected by hydrogen bonding.
  • a sequence of nucleotides that can be Formation of complementary base pairs is also called hybridization.
  • Complementary base pairing is a concept generally called "Watson-Crick base pairing" or "natural base pairing".
  • base pairs are Watson-Crick type, Hoogsteen base pairs, or other hydrogen bonding motifs (for example, diaminopurine and T, 5-methyl C and G, 2-thiothymine and A, 6- Hydroxypurine and C, pseudoisocytosine and G) base pairs formed by formation may also be used.
  • base pairs are Watson-Crick type, Hoogsteen base pairs, or other hydrogen bonding motifs (for example, diaminopurine and T, 5-methyl C and G, 2-thiothymine and A, 6- Hydroxypurine and C, pseudoisocytosine and G) base pairs formed by formation may also be used.
  • the homology is preferably 99% or more, 98% or more, 95% or more, 90% or more, 85% or more, 80% or more, 70% or more, 60% or more, or 50% or more in the order of preference.
  • to hybridize in the present invention means the act of forming a double strand between oligonucleotides or oligonucleotide strands containing complementary base sequences, and the act of forming a double strand between oligonucleotides or oligonucleotide strands containing complementary sequences. It means a phenomenon in which they form a double strand.
  • a double strand means a state in which two nucleic acid strands form complementary base pairs (hybridize).
  • the two nucleic acid strands may be derived from two nucleic acid strands or from two nucleic acid sequences within one nucleic acid strand molecule.
  • a double-stranded oligonucleotide and a double-stranded oligonucleotide chain in the present invention mean a secondary structure formed by hybridizing two or more different oligonucleotide chains.
  • the two oligonucleotides may differ in length and may have non-hybridized regions.
  • the region where the double strands hybridize is the double strand.
  • double-stranded DNA means a secondary structure formed by hybridizing two different DNA strands.
  • Each DNA strand may have a different length and may have a non-hybridized region.
  • the DNA strand is not limited to naturally occurring deoxyribonucleotides, but means all oligonucleotide strands that can be amplified by DNA polymerase.
  • forming a double strand means that a double strand may be formed under standard conditions for handling oligonucleotides, such as a temperature of 4 to 40°C, an aqueous solvent, and a pH of 4 to 10. .
  • a temperature of 4 to 40°C such as a temperature of 4 to 40°C, an aqueous solvent, and a pH of 4 to 10.
  • the nucleic acid is a nucleic acid that forms a double strand. .
  • the Tm value refers to the temperature at which half of the DNA molecules are annealed with the complementary strand.
  • a blunt end in the present invention means that the ends of a double-stranded oligonucleotide are paired without protruding from either end.
  • a protruding end in the present invention means that one of the ends of a double-stranded oligonucleotide has a protruding portion.
  • the overhang of the protruding end can be of any length, but is preferably 1 to 50 bases, more preferably 1 to 30 bases, even more preferably 1 to 15 bases, most preferably 2 to 6 bases. is the length of In certain embodiments, the overhangs can be used as hybridizing regions when performing sticky-end ligations.
  • PCR means polymerase chain reaction.
  • PCR is a means of amplifying oligonucleotide strands and is a technique well known to those skilled in the art.
  • (1) a double-stranded oligonucleotide chain to be amplified is dissociated into two single strands by heat treatment or the like, and (2) the temperature is adjusted to be suitable for the enzymatic reaction.
  • an enzyme such as DNA polymerase
  • an enzyme such as DNA polymerase
  • a primer means an oligonucleotide that can be annealed to a template oligonucleotide chain and extended by a polymerase in a template-dependent manner.
  • the primer sequence for PCR means the sequence of the portion of the oligonucleotide chain to which the primer anneals, and is preferably a sequence suitable for PCR as known in the art. It is preferably present at the end of the nucleotide chain.
  • a nick means a portion of a double-stranded oligonucleotide chain that lacks an internucleotide bond and breaks the oligonucleotide chain.
  • the 5' side of this missing portion may or may not have a phosphate group.
  • a gap means a portion where one or more consecutive nucleotides are deleted in a double-stranded oligonucleotide chain and the oligonucleotide chain is dissociated.
  • the 5' side of the deleted portion may or may not have a phosphate group.
  • a hairpin strand is a single-stranded structure in which two complementary nucleic acid strands are linked, and the characteristics of the hairpin strand and the hairpin strand DEL are as described above.
  • the terms "hairpin site”, “hairpin structure”, and “hairpin type” used in the present invention are understood as terms derived from the same concept as the above-mentioned "hairpin chain”.
  • nucleic acid ligation reaction and "ligation” means a reaction that connects the ends of nucleic acids.
  • Enzymatic nucleic acid ligation reaction and enzymatic ligation refer to a reaction that uses an enzyme to join the ends of nucleic acids.
  • Enzymes that can be used for nucleic acid ligation reactions are, for example, DNA ligase, RNA ligase, DNA polymerase, RNA polymerase, or topoisomerase.
  • DNA ligase is an enzyme that joins the ends of DNA strands with phosphodiester bonds.
  • a DNA ligase is understood as a ligase belonging to EC number: 6.5.1.1 or 6.5.1.2.
  • DNA ligase is also called polydeoxyribonucleotide synthase or polynucleotide ligase. Examples of DNA ligases include DNA ligase I, II, III, IV and T4 DNA ligase.
  • RNA ligase is an enzyme that joins the ends of RNA strands with phosphodiester bonds.
  • RNA ligase is understood as a ligase belonging to EC number: 6.5.1.3.
  • the RNA ligase belongs to the poly(ribonucleotide):poly(ribonucleotide) ligase family.
  • RNA ligase is also called polyribonucleotide synthase or polyribonucleotide ligase.
  • chemical ligation means a reaction that joins the ends of nucleic acids together without using an enzyme.
  • Paired functional groups for chemical reactions include, for example, optionally substituted alkynyl groups and optionally substituted azide groups, optionally substituted dienes having a 4 ⁇ -electron system (e.g., substituted optionally substituted 1,3-unsaturated compounds such as optionally substituted 1,3-butadiene, 1-methoxy-3-trimethylsilyloxy-1,3-butadiene, cyclopentadiene, cyclohexadiene or furan.
  • optionally substituted alkynyl groups and optionally substituted azide groups optionally substituted dienes having a 4 ⁇ -electron system
  • substituted optionally substituted 1,3-unsaturated compounds such as optionally substituted 1,3-butadiene, 1-methoxy-3-trimethylsilyloxy-1,3-butadiene, cyclopentadiene, cyclohexadiene or furan.
  • an optionally substituted dienophile or optionally substituted heterodienophile having a 2 ⁇ -electron system for example, an optionally substituted alkenyl group or an optionally substituted alkynyl group.
  • a pair of an optionally substituted amino group and a carboxylic acid group e.g., a pair of a phosphorothioate group and an iodo group (e.g., a 3′-terminal phosphorothioate group and a 5′-terminal iodo group), or a phosphoric acid and a hydroxy group pair (eg, a 5'-terminal phosphate group and a 3'-terminal hydroxy group pair or a 5'-terminal hydroxy group and a 3'-terminal phosphate group pair).
  • Chemical ligation is a concept well known to those skilled in the art, and those skilled in the art can appropriately achieve chemical ligation based on common technical knowledge.
  • Artificial DNA PNA & XNA, 2014, Vol. 5, e27896, Current Opinion in Chemical Biology, 2015, Vol. 26, pp. 80-88.
  • selectively cleavable means that in a certain compound, only a specific site can be selectively cleaved under predetermined conditions without changing other molecular structures of the compound.
  • selectively cleavable site means a site that can be selectively cleaved under predetermined conditions in a certain compound.
  • the preferred structure of the "selectively cleavable site" in the present invention is a "selectively cleavable nucleic acid".
  • the site may be a site composed of a plurality of nucleic acids and cleaved by a specific sequence, or may be a site composed of a single nucleic acid.
  • the cleavable site is a nucleic acid
  • an established production method such as a nucleic acid synthesizer can be used and production efficiency is high
  • the reaction conditions for constructing the building block of DEL are the DNA tag Since it is essential that the part of the nucleic acid is not degraded, it is preferable from the viewpoint that if the cleavable site is a nucleic acid, it should not be degraded.
  • a more preferred structure of the "selectively cleavable nucleic acid” is a nucleic acid containing nucleotides not included in the DNA tag sequence of DEL. If the cleavable site is a nucleotide that is not included in the sequence of the DNA tag, it can be used without limiting the sequence of the DNA tag in order to avoid cleavage of the DNA tag portion.
  • Deoxyadenosine, deoxyguanosine, thymidine, and deoxycytidine are preferable as nucleic acids used for DNA tag sequences. Accordingly, preferred structures for selectively cleavable sites are nucleic acids that are neither deoxyadenosine, deoxyguanosine, thymidine, nor deoxycytidine.
  • Examples of “selectively cleavable sites” include “nucleotides having cleavable bases”.
  • a “nucleotide with a cleavable base” in DEL has the N-glycosidic bond between the base and sugar moieties cleaved by the action of DNA glycosylase, leaving an abasic site.
  • Phosphodiester bonds flanking the abasic site can be altered by chemical conditioning (e.g., temperature elevation, basic hydrolysis, etc.) or by enzymes with apurinic/apyrimidinic (AP) endonuclease or AP lyase activity (e.g., endonuclease activity).
  • chemical conditioning e.g., temperature elevation, basic hydrolysis, etc.
  • AP apurinic/apyrimidinic
  • nuclease III endonuclease IV, endonuclease V, endonuclease VI, endonuclease VII, endonuclease VIII, APE1 (human-derived AP endonuclease), Fpg (formamidopyridine-DNA glycosylase), etc.) and cut into 1 base Form a gap or nick.
  • nucleotides having a cleavable base include deoxyuridine, bromodeoxyuridine, deoxyinosine, 8-hydroxydeoxyguanosine, 3-methyl-2'-deoxyadenosine, N6-etheno-2'-deoxyadenosine, 7-methyl-2'-deoxyguanosine, 2'-deoxyxanthosine, 5,6-dihydroxydeoxythymidine and the like. Nucleotides with other cleavable bases will be apparent to those skilled in the art. DEL is selectively abasic by incorporating these "nucleotides with cleavable bases" into DEL and using a DNA glycosylase that specifically recognizes the structure.
  • DNA glycosylase refers to any enzyme having glycosylase activity, which recognizes any nucleobase portion in an oligonucleotide, cleaves the N-glycosidic bond between the base portion and the sugar portion, and decomposes.
  • An enzyme that creates a base site is an enzyme having glycosylase activity, which recognizes any nucleobase portion in an oligonucleotide, cleaves the N-glycosidic bond between the base portion and the sugar portion, and decomposes.
  • uracil DNA glycosylase (recognizes deoxyuridine), alkyladenine DNA glycosylase (recognizes 3-methyl-2'-deoxyadenosine, 7-methyl-2'-deoxyguanosine, and deoxyinosine), Fpg (8-hydroxydeoxy guanosine), endonuclease VIII (recognizes degraded pyrimidine bases such as 5,6-dihydroxydeoxythymidine and uracil glycol), SUMG1 (abbreviation for single-strand selective uracil-DNA glycosylase, recognizes deoxyuridine), etc. mentioned.
  • More preferred examples of the "selectively cleavable site" in the present invention include deoxyinosine and deoxyuridine.
  • a particularly preferred example of the "selectively cleavable site" in the present invention is deoxyuridine.
  • the "selectively cleavable site" in the present invention is preferably cleaved using an enzyme.
  • Enzymes generally have high substrate specificity, and do not recognize the DNA tag portion of DEL and the compound portion constructed from multiple building blocks as substrates, and act by recognizing only “selectively cleavable sites”. It is preferable because Cleavage using the enzyme may also be achieved by changing the chemical conditions after structurally changing the "selectively cleavable site” with the enzyme. Examples of such enzymes include glycosylases and nucleases.
  • a glycosylase is an enzyme that has the function of hydrolyzing a glycosidic bond (a covalent bond formed by dehydration condensation between a sugar molecule and another organic compound).
  • DNA glycosylase is an enzyme that recognizes a nucleobase portion in an oligonucleotide and hydrolyzes its glycosidic bond, as described above.
  • a nuclease in the present invention is an enzyme that has the function of hydrolyzing the phosphodiester bond between the sugar and phosphate of nucleic acids.
  • Nucleases include, for example, AP endonucleases, nicking endonucleases, ribonucleases.
  • DNA glycosylase cleaves the phosphodiester bond adjacent to the abasic site generated by the action of any DNA glycosylase. Therefore, in the present invention, it is preferable to use DNA glycosylase and AP endonuclease in combination.
  • a nicking endonuclease (eg, Nb.BbvCI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI, etc.) recognizes a specific DNA sequence and produces a nick in which the phosphodiester bond is cleaved on only one of the double strands.
  • Endonuclease V is also capable of generating nicks with the second phosphodiester bond cleaved 3' from the deoxyinosine and is useful in the practice of the present invention.
  • a ribonuclease is an enzyme that degrades RNA.
  • a ribonucleoside is used as a "selectively cleavable site" and can be used by allowing ribonuclease to act.
  • RNase HII a type of ribonuclease, is capable of generating nicks in which the 5' phosphodiester bonds of ribonucleotides incorporated into DNA sequences are cleaved and is useful in the practice of the present invention.
  • USER (registered trademark) means "Uracil-Specific Excision Reagent” Enzyme.
  • USER is an endonuclease cocktail that removes uracil containing uracil DNA glycosylase (UDG) and endonuclease VIII. USER removes uracil in double-stranded DNA to create a 1-base gap and breaks the DNA strand.
  • UDG uracil DNA glycosylase
  • UDG uracil DNA glycosylase
  • USER removes uracil in double-stranded DNA to create a 1-base gap and breaks the DNA strand.
  • UDG first removes the uracil base to create an abasic site.
  • An endonuclease then cleaves the phosphodiester bond to release baseless deoxyribose, creating a one-base gap.
  • USER® Enzyme and USER® Enzyme are USER® as defined above.
  • an exonuclease is an enzyme that has the function of sequentially hydrolyzing phosphodiester bonds from the 5' or 3' end of nucleic acids.
  • Exonucleases include, for example, lambda exonuclease, exonuclease III, T7 exonuclease.
  • Lambda exonuclease is an enzyme that degrades DNA phosphorylated at the 5' end of double-stranded DNA.
  • the present invention is useful in converting double-stranded DEL to single-stranded DEL.
  • a building block is a portion that has a functional group and can constitute a part of a compound, and may be in the form of a compound.
  • the base sequence that can identify each building block means a specific base sequence designed to correspond to the structure of each building block.
  • Designing a sequence means assigning a nucleobase sequence to each structure, for example, nucleobase sequence AAA for building block structure A, nucleobase sequence TTT for structure B, and nucleobase sequence CGC for structure C. means that The sequence can be freely designed as long as the object of the present invention can be achieved. For example, any number of base sequences can be assigned to one building block.
  • an oligonucleotide tag is a partial structure containing an oligonucleotide containing a base sequence that allows identification of the structure of the partial structure constructed by building blocks.
  • Oligonucleotide tags in the present invention may be oligonucleotides corresponding to each building block, or longer oligonucleotides containing oligonucleotides corresponding to multiple building blocks.
  • Nucleotides constituting the oligonucleotide tag of the present invention are not limited as long as the effect of the present invention is achieved, but from the viewpoint of easiness of amplification by PCR and analysis by a sequencer, nucleotides suitable for these operations are desirable. .
  • nucleotides examples include nucleotides having the above-described natural nucleobase as the base portion and having the above-described ribose or 2′-deoxyribose as the sugar portion. More preferred examples are deoxyadenosine, thymidine, deoxycytidine or deoxyguanosine.
  • a head piece in the present invention means a starting compound for preparing a compound library such as DEL.
  • the structure of the headpiece of the present invention is not limited as long as the object of the present invention is achieved, but in a most typical embodiment, at least one site to which a building block can be linked and at least one site to which an oligonucleotide tag can be linked. and at least one selectively cleavable site in the structure.
  • the DNA tag is preferably a double-stranded oligonucleotide strand and there are preferably two sites to which the oligonucleotide tag can be ligated.
  • the headpiece is the compound shown in the schematic below.
  • the headpiece is desirably chemically stable.
  • the headpiece preferably has a structure that allows the DNA tag and the building block to be arranged in appropriate spaces.
  • the headpiece preferably has moderate flexibility.
  • more appropriate spatial arrangement and flexibility will be explained.
  • the structural characteristics of the headpiece described here may be achieved by the headpiece alone, or by combining the headpiece and a bifunctional spacer.
  • preferable structural characteristics of the headpiece are such that the headpiece and the DNA tag do not inhibit the formation reaction of the building block, and conversely, the headpiece and the building block do not inhibit the elongation reaction of the DNA tag. be.
  • preferred structural properties of the headpiece are such that the headpiece and the DNA tag portion do not affect the interaction between the building block compound (library compound) and the target (target protein, etc.). be.
  • preferred headpiece structural features are those that orient DNA tags and building block moieties in opposite directions (eg, 90 degrees or more opposite).
  • the preferred structural characteristics of the headpiece are such that the loop portion of the headpiece and the building block are separated by several atoms to ten and several atoms in terms of the skeleton of the organic compound.
  • the headpiece preferably has a moderate affinity for the DNA tag portion and building block portion.
  • Moderate affinity means chemical reactivity and stability such that a bond can be formed, maintained, and cleaved under desired conditions, eg, to practice the present invention.
  • a bifunctional spacer means a spacer moiety that has at least two reactive groups that allow bonding between the building block moiety and the headpiece.
  • headpiece In the description of the present invention, the terms “headpiece”, “headpiece compound”, and “compound for headpiece” are terms indicating compounds of the same concept.
  • a compound for use as a headpiece can be understood in essentially the same way as “the use of a compound as a headpiece” from the point of use, and from the point of view of the method, "a compound used as a headpiece”. can be understood essentially the same as “method of using as a piece”. The same is true for compound libraries.
  • a preferred structure of the headpiece will be described below, but the structure of the headpiece is not limited as long as the effects of the present invention are achieved.
  • the headpiece includes: (D) a reactive functional group that has at least one site that can be directly linked to a building block or indirectly via a bifunctional spacer; (L) a linker extending from a reactive functional group; (E) a first oligonucleotide strand having one binding site that can be linked to one strand of an oligonucleotide tag; (F) a second oligonucleotide strand with one binding site that can be linked to the other strand of the oligonucleotide tag, and (LP) a loop site that connects the linker and the two oligonucleotide strands; is composed of It has at least one selectively cleavable site in at least one of the E, F, or LP sites.
  • the headpiece is a compound represented by formula (I) below.
  • E and F are independently oligomers composed of nucleotides or nucleic acid analogues, provided that E and F contain base sequences complementary to each other to form a double-stranded oligonucleotide
  • LP is the loop site
  • L is a linker
  • D is a reactive functional group.
  • the partial structure of the site that binds to the linker may be referred to as a linking site or (LS).
  • E-LP-F may be collectively referred to as a hairpin site.
  • first and second oligonucleotide strands Preferred embodiments of the first oligonucleotide strand (E) and the second oligonucleotide strand (F) are described below.
  • the first oligonucleotide strand (E) and the second oligonucleotide strand (F) form a double strand in the molecule via the loop site (LP), and the headpiece forms a hairpin structure.
  • the preferred chain length for intramolecular double chain formation is 3 bases or more, more preferably 4 bases or more, and still more preferably 6 bases or more.
  • the chain length of E and F is 3 to 40 each in one embodiment.
  • the chain length of E and F is 4 to 40 each in one embodiment.
  • the chain length of E and F is 6 to 25 each in one embodiment.
  • the site where the oligonucleotide tag is ligated preferably has a structure suitable for enzymatic ligation or chemical ligation.
  • the ligation of the headpiece and the oligonucleotide tag is performed by enzymatic double-stranded ligation.
  • the first and second oligonucleotide strands preferably form overhanging ends for ligation.
  • the chain length of the protruding end is preferably 2 bases or more, more preferably 2 to 10 bases, still more preferably 2 to 5 bases. Therefore, one of the first and second oligonucleotide strands is preferably longer than the other strand by the length of the protruding end.
  • the 5' end of the strand having the 5' end of the headpiece among the first and second oligonucleotide strands is preferably phosphorylated.
  • first and second oligonucleotide strands may contain part or all of the primer binding sequences for PCR.
  • a suitable chain length for the primer binding sequence is 17 to 25 bases.
  • linker Preferred embodiments of the linker (L) are described below.
  • a linker as described above, is a moiety that extends from a reactive functional group and binds to a linking moiety.
  • the linker is a divalent group (-L-) derived from the following aspects.
  • linker is the following embodiment (L1).
  • (L1) optionally substituted C1-20 aliphatic hydrocarbon optionally substituted by 1 to 3 heteroatoms, or (2) optionally substituted C6-14 aromatic hydrocarbon.
  • L is the following aspect (L2), (L3), (L4) or (L5).
  • (L2) optionally substituted C1-6 aliphatic hydrocarbons, optionally substituted C1-6 aliphatic hydrocarbons optionally substituted by 1 or 2 oxygen atoms, or optionally substituted C6-10 aromatic family hydrocarbons.
  • (L3) C1-6 aliphatic hydrocarbons substitutable with the substituent group ST1, or benzene substitutable with the substituent group ST1.
  • the substituent group ST1 is a group composed of a C1-6 alkyl group, a C1-6 alkoxy group, a fluorine atom and a chlorine atom.
  • a reactive functional group as described above, has at least one site that can be directly linked to a building block or indirectly via a bifunctional spacer, and is the site of attachment to the linker group.
  • the reactive functional group becomes a monovalent group (D-) in the headpiece, and in DEL a "reactive functional group-derived divalent group" (-D- ).
  • D is an amino group
  • R-HN- a specific structure for (D-)
  • R is a substituent as described below.
  • R is not limited as long as the effects of the present invention are achieved, but in the following aspects (D1) to (D5), R is preferably (1) a hydrogen atom, or (2) unsubstituted or A C1-6 alkoxy group, a C1-6 alkyl group substituted with 1 to 3 substituents selected singly or differently from the substituent group consisting of a fluorine atom and a chlorine atom.
  • R is more preferably a hydrogen atom or a C1-3 alkyl group, still more preferably a hydrogen atom.
  • (D-) is a methylene group having a leaving group (X-)
  • the specific structure of (D-) is (X-CH 2 -), for example, amino group, hydroxy or with nucleophiles such as thiol groups to form carbon-nitrogen, carbon-oxygen, or carbon-sulfur bonds.
  • the specific structure of (-D-) is (-CH 2 -).
  • the specific structure of (D-) is (HOC-).
  • Aldehyde groups for example, by reductive amination reactions with amino groups, form carbon-nitrogen bonds, in which (-D-) become -CH 2 -, and, for example, by reaction with phosphorus ylide groups, carbon-carbon double bonds are formed.
  • the site (D-) is the following aspect (D1).
  • D1 A functional group capable of forming a C—C, amino, ether, carbonyl, amide, ester, urea, sulfide, disulfide, sulfoxide, sulfonamide, or sulfonyl bond.
  • (-D-) becomes a C-C, amino, ether, carbonyl, amide, ester, urea, sulfide, disulfide, sulfoxide, sulfonamide, or sulfonyl bond.
  • (D-) is the following aspect (D2), (D3), (D4) or (D5).
  • (D2) A C1 hydrocarbon with a leaving group, an amino group, a hydroxyl group, a precursor of a carbonyl group, a thiol group, or an aldehyde group.
  • (D3) a C1 hydrocarbon having a halogen atom, a C1 hydrocarbon having a sulfonic acid leaving group, an amino group, a hydroxyl group, a carboxy group, a halogenated carboxy group, a thiol group, or an aldehyde group;
  • (D4) —CH 2 Cl, —CH 2 Br, —CH 2 OSO 2 CH 3 , —CH 2 OSO 2 CF 3 , an amino group, a hydroxyl group, or a carboxy group.
  • (D5) Primary amino group. In this case, (-D-) becomes -NH-.
  • the loop site (LP) is designed so that the first oligonucleotide strand (E) and the second oligonucleotide strand (F) form an intramolecular duplex and the headpiece can form a hairpin structure. preferably. That is, the loop site (LP) preferably has a chain length and binding flexibility that make the loop structure thermodynamically stable.
  • the loop site (LP) is: LP is (LP1) is a loop site represented by p-LS-(LP2) q, LS is a partial structure selected from the group of compounds described in (A) to (C) below, (A) Nucleotide (B) Nucleic acid analogue (C) C1-14 trivalent group LP1 optionally having a substituent may be alone or different from the group of compounds described in the following (1) and (2) is each partial structure selected by p pieces, (1) Nucleotide (2) Nucleic acid analog LP2 is each partial structure selected individually or differently from the group of compounds described in (1) and (2) below, (1) The total number of nucleotides (2) nucleic acid analogues p and q is 0-40.
  • loop site Further preferred aspects of the loop site are as described above.
  • the structure of the loop site will be supplemented below.
  • nucleotides are the natural nucleotides described above, and the nucleic acid analogs are as described above.
  • LP1 is each partial structure selected singly or differently from the group of compounds described in (1) and (2) below, and LP2 is described in (1) and (2) below. It is each partial structure selected singly or differently from the group of compounds represented by q.
  • Nucleotides (2) Nucleic acid analogues Individually or p different selected means that, for example, when p is 4, LP1 is AATG, ATCG, TC (d-Spacer) G or A (d-Spacer) ( d-Spacer) C, may be selected singly or differently from the group of compounds described in (1) and (2). The same is true for LP2.
  • the loop site may contain part or all of the primer binding sequence for PCR.
  • LS is (A) a nucleotide or (B) a nucleic acid analogue.
  • the loop site becomes a nucleic acid oligomer.
  • the nucleic acid oligomer of the present invention is an oligomer in which nucleotides or nucleic acid analogues are linked as monomers. Oligomers can also be referred to as chain compounds.
  • nucleic acid oligomers of the invention are either oligonucleotide strands, nucleic acid analog strands, or mixed strands of nucleotides and nucleic acid analogs.
  • the loop site becomes a nucleic acid oligomer.
  • the headpiece can be manufactured by a nucleic acid synthesizer, which is significantly preferable in practice.
  • LS is (A) a nucleotide or (B) a nucleic acid analogue
  • a linker site (L) and a reactive functional group site (D) are combined with LS for nucleic acid synthesis.
  • Monomers can be prepared and then nucleic acid oligomers synthesized. Examples of such nucleic acid synthesis monomers include the aforementioned Amino C6 dT, mdC (TEG-Amino), Uni-Link (registered trademark) Amino Modifier, and the like.
  • the nucleotide portion corresponds to the linking site (LS), and the side chain portion extending from the base corresponds to the linker site (L) and the reactive functional It corresponds to the base site (D).
  • the reactive functional group (D) may be protected with a protecting group.
  • the nucleic acid analogue is the following compound (B6).
  • (B6) A compound in which the (-LD) is bound to the base portion of a nucleotide.
  • the nucleic acid analog is the following compounds (B61), (B62), (B63), (B64) or (B65).
  • (B61) (-L-D) is (-L1-D1) (B6) (B62) (-LD) is (-L2-D2) (B6).
  • (B63) (-LD) is (-L3-D3) (B6).
  • (B64) (-LD) is (-L4-D4) (B6).
  • B65 The compound according to any one of (B61) to (B64), wherein (-D) is (-D5).
  • LS is (A) a nucleotide or (B) a nucleic acid analogue
  • a nucleic acid oligomer is first synthesized, and then the linker site (L) and the reactive functional group site ( D) can be combined.
  • the linker site (L) and the reactive functional group site ( D) can be combined.
  • the "specific nucleic acid analogue” include the aforementioned Amino C6 dT, mdC (TEG-Amino), and Uni-Link (registered trademark) Amino Modifier.
  • mdC (TEG-Amino) itself corresponds to the linking site (LS), and from the base side chain, the additional site that further binds to the linker site (L) and the reactive functional group site (D). Equivalent to.
  • the chain length of the loop site is such that the first oligonucleotide chain (E) and the second oligonucleotide chain (F) form a double chain in the molecule, and the headpiece forms a hairpin structure.
  • Chain length is preferred.
  • the sum of p and q is 1-40.
  • the sum of p and q is 2-20.
  • the sum of p and q is 2-10.
  • the sum of p and q is 2-7.
  • the loop site of the present invention is (A) is composed of nucleotides and the following nucleic acid analogues (B41), (B42), (B43), (B44) or (B52).
  • B41 d-Spacer
  • B42 Amino C6 dT
  • B43 mdC
  • TAG-Amino B44
  • Uni-Link registered trademark
  • Amino Modifier B52
  • LS is preferably B42, B43 or B44.
  • LP1 and LP2 are preferably A, B41 or B52.
  • the loop site is a nucleic acid oligomer according to the sequences (X1) to (X9) below.
  • (X1) A-B41-B42-B41-A (X2) A-B41-B43-B41-A (X3) A-B41-B44-B41-A (X4) B41-B41-B42-B41-B41 (X5) B41-B41-B43-B41-B41 (X6) B41-B41-B44-B41-B41 (X7) B52-B42-B52 (X8) B52-B43-B52 (X9) A52-A44-A52
  • the number of cuttable parts is preferably 5 or less, more preferably 1 to 2.
  • At least one cleavable site is in the first oligonucleotide strand or between the first oligonucleotide strand and the linker attachment site. and the at least one cleavable site is preferably in the second oligonucleotide strand or between the second oligonucleotide strand and the linker attachment site.
  • the position of the cleavable site is preferably within 20 bases starting from the binding portion between the loop site and the first oligonucleotide strand or the second oligonucleotide strand. Yes, more preferably within 10 bases, still more preferably within 3 bases.
  • the present invention provides suitable conditions in a method of deriving and evaluating a DEL containing a cleavable site in its DNA strand into a cross-linker-modified double-stranded DEL.
  • the position of the cleavable site is in the 3′ direction from the binding portion between the loop site and the first oligonucleotide strand or the second oligonucleotide strand. , preferably within 20 bases, more preferably within 10 bases, still more preferably within 3 bases, and most preferably within 1 base.
  • the compound constituting the DEL of the present invention is a compound represented by the following formula (II).
  • X and Y are oligonucleotide chains, E and F are each independently an oligomer composed of nucleotides or nucleic acid analogs; provided that E and F contain complementary base sequences to form a double-stranded oligonucleotide, LP is the loop site; L is a linker; D is a divalent group derived from a reactive functional group, Sp is a bond or a bifunctional spacer; An is a substructure composed of at least one building block.
  • X is attached to E at the 5' end
  • Y is attached to F at the 3' end
  • preferred embodiments of E, F, LP, L and D in the compounds of formula (II) above are the preferred embodiments of E, F, LP, L and D described with respect to formula (I) above. It is the same as the aspect. Preferred aspects of X, Y, Sp, and An are described separately.
  • a bifunctional spacer is a spacer moiety that has at least two reactive groups that allow bonding of the substructure An of the compound library to the headpiece.
  • the bifunctional spacer is SpD-SpL-SpX.
  • SpX is a reactive group that forms a covalent bond with the reactive functional group of the headpiece.
  • SpD is a reactive group that forms a covalent bond with the partial structure An of the compound library.
  • SpL is a chemically inert spacing moiety.
  • the reactive group (SpX) becomes a monovalent group (-SpX) in the bifunctional spacer alone (reagent state before bonding to the headpiece), and DEL ( In the state where it is combined with the headpiece), it becomes "a divalent group derived from a reactive group" (-SpX-) based on the above (-SpX).
  • the reactive group (SpD) becomes a monovalent group (SpD-) in the state before bonding to An, and in DEL (the state bonded to An), the "reactive group-derived is a divalent group” (-SpD-).
  • SpX are reactive groups that form amino, carbonyl, amide, ester, urea, or sulfonamide bonds.
  • SpX is the following structure (SpX1), (SpX2) or (SpX3), which is a reactive group suitable when the reactive functional group of the headpiece is an amino group.
  • SpX1 carboxy group, carboxyl halide group, aldehyde group, or sulfonyl halide group
  • SpX2 carboxy group
  • SpX3 carboxy group
  • SpD is (D1), (D2), (D3), (D4) or (D5) as described above.
  • SpL is (L1), (L2), (L3), (L4) or (L5) described above.
  • SpL is the following (SpL1), (SpL2) or (SpL3).
  • SpL1 Polyalkylene glycol, polyethylene, C1-20 aliphatic hydrocarbon optionally substituted with heteroatom, peptide, oligonucleotide, or combinations thereof.
  • SpL2 polyalkylene glycol, polyethylene, C1-10 aliphatic hydrocarbon, or peptide
  • SpL3 polyethylene glycol, or polyethylene
  • the bifunctional spacer is as follows. (Sp1): (D4) - (SpL1) - (SpX1) (Sp2): (D4) - (SpL2) - (SpX2) (Sp3): (D4) - (SpL3) - (SpX3) (Sp4): (D5) - (SpL1) - (SpX1) (Sp5): (D5) - (SpL2) - (SpX2) (Sp6): (D5) - (SpL3) - (SpX3)
  • the (Sp-DL) portion of the compound constituting DEL is the following (SpDL1), (SpDL2), (SpDL3) (SpDL4), (SpDL5), (SpDL6), (SpDL7), (SpDL8), (SpDL9), or (SpDL10).
  • the headpiece can be synthesized on a nucleic acid synthesizer.
  • a linker site (L) and a reactive functional group site (D) are bound to LS to prepare a monomer for nucleic acid synthesis, and then synthesize a nucleic acid oligomer.
  • Examples of such nucleic acid synthesis monomers include the aforementioned Amino C6 dT, mdC (TEG-Amino), Uni-Link (registered trademark) Amino Modifier, and the like.
  • the length of the linker site may be limited.
  • introduction of a suitable bifunctional spacer makes it possible to adjust the distance between the headpiece and An, which is advantageous in carrying out the invention.
  • C1-C6 and “C1-6” in terms such as “C1-C6 alkyl group” and “C1-6 alkyl group” have 1 to 6 carbon atoms. means that Similarly, when m and n are integers, the description “Cm to Cn” or “Cm to n” means that the number of carbon atoms is m to n. Therefore, “C1-C6 alkyl group” and “C1-6 alkyl group” refer to alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, and “C1-C6 alkylene” and “C1-6 alkylene” refer to is 1 to 6 alkylene.
  • C1-6 alkyl in the present invention means a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl and the like.
  • C1-3 alkyl in the present invention means a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms. Specific examples are methyl, ethyl, propyl, isopropyl.
  • C1-6 alkoxy means linear or branched alkoxy having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, pentyloxy, hexyloxy and the like.
  • C1-3 alkoxy means linear or branched alkoxy having 1 to 3 carbon atoms. Specific examples are methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy.
  • hydrocarbon means a chain, branched or cyclic saturated or unsaturated compound composed only of carbon atoms and hydrogen atoms.
  • aliphatic hydrocarbons mean non-aromatic hydrocarbons.
  • An “aliphatic hydrocarbon” may be linear, branched or cyclic, and saturated or unsaturated. Exemplary structures include structures with alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl or cycloalkenyl, or combinations thereof.
  • C1-20 aliphatic hydrocarbon means an aliphatic hydrocarbon having 1 to 20 carbon atoms.
  • C1-10 aliphatic hydrocarbon means an aliphatic hydrocarbon having 1 to 10 carbon atoms.
  • C1-6 aliphatic hydrocarbon means an aliphatic hydrocarbon having 1 to 6 carbon atoms.
  • aromatic hydrocarbon as used in the present invention means an aromatic hydrocarbon among hydrocarbons.
  • C6-14 aromatic hydrocarbon means aromatic hydrocarbon having 6 to 14 carbon atoms. Specific examples include benzene, naphthalene and anthracene.
  • C6-10 aromatic hydrocarbon means aromatic hydrocarbon having 6 to 10 carbon atoms. Specific examples are benzene or naphthalene.
  • the heteroaromatic ring of the present invention is an aromatic heterocyclic ring having as a heteroatom in the ring structure an element selected singly or differently from the group consisting of nitrogen, oxygen and sulfur.
  • the aromatic heterocycle is a "C1-9 aromatic heterocycle” having 1 to 9 carbon atoms, and in one embodiment, the "C1-9 aromatic heterocycle” has 5 to 10 membered aromatic heterocycle”.
  • the aromatic heterocyclic ring is a "C1-5 aromatic heterocyclic ring” having 1 to 5 carbon atoms, and in one aspect, the "C1-5 aromatic heterocyclic ring” membered aromatic heterocycle”.
  • the aromatic heterocycle is a "C2-9 aromatic heterocycle” having 2 to 9 carbon atoms, and in one embodiment, the "C2-9 aromatic heterocycle” membered aromatic heterocycle”. In one embodiment, the aromatic heterocycle is a "C2-5 heteroaromatic ring” having 2 to 5 carbon atoms, and in one embodiment, the "C2-5 heteroaromatic ring” has 5 to 6 membered aromatic heterocycle”.
  • the nitrogen-containing aromatic heterocycle of the present invention is an aromatic heterocycle having nitrogen as a heteroatom in the ring structure.
  • the nitrogen-containing aromatic heterocycle is a "C1-5 nitrogen-containing aromatic heterocycle” having 1 to 5 carbon atoms, and in one embodiment, "C1-5 nitrogen-containing aromatic heterocycle ”is a 5- to 6-membered aromatic heterocycle”.
  • the nitrogen-containing aromatic heterocycle is a "C2-5 nitrogen-containing aromatic heterocycle” having 2 to 5 carbon atoms, and in one embodiment, a "C2-5 nitrogen-containing aromatic heterocycle ”is a 5- to 6-membered aromatic heterocycle”.
  • the non-aromatic heterocycles of the present invention are non-aromatic heterocycles having as heteroatoms in the ring structure an element selected singly or differently from the group consisting of nitrogen, oxygen and sulfur.
  • Non-aromatic heterocycles may contain partially unsaturated bonds.
  • the non-aromatic heterocycle is a "C2-9 non-aromatic heterocycle” having 2 to 9 carbon atoms, and in one embodiment, the "C2-9 non-aromatic heterocycle” is 5- to 10-membered non-aromatic heterocyclic ring”.
  • the "C1-14 trivalent group” means a trivalent group derived from a compound having 1 to 14 carbon atoms.
  • the structure is not limited as long as the effects of the present invention are achieved.
  • the heteroatom means an atom other than carbon and hydrogen.
  • the heteroatom is preferably an oxygen atom, a nitrogen atom, a silicon atom, a phosphorus atom or a sulfur atom, more preferably an oxygen atom, a nitrogen atom or a sulfur atom.
  • propyl (—CH 2 —CH 2 —CH 3 ) as an example of a hydrocarbon
  • “propyl optionally substituted with heteroatoms” means that methylene (—CH 2 —) in alkyl is Ether ((--CH 2 --O--CH 3 ) or (--O--CH 2 --CH 3 )) substituted with oxygen, or amine ((--CH 2 --NH--CH 3 ) or (--CH 2 --NH---CH 3 ) substituted with nitrogen —NH—CH 2 —CH 3 )) and other structures.
  • the substituent is not limited as long as the object of the present invention is achieved.
  • the substituent is preferably a C1-6 alkyl group, a C1-6 alkoxy group, an amino group, a hydroxy group, a nitro group, a cyano group, an oxo group or a halogen atom.
  • the substituent is more preferably a C1-6 alkyl group, a C1-6 alkoxy group, a fluorine atom or a chlorine atom.
  • polypeptides and peptides mean compounds or partial structures formed by linking amino acids.
  • Amino acid is a general term for organic compounds having both amino and carboxyl functional groups.
  • Amino acids constituting the polypeptides and peptides of the present invention are not particularly limited, and include modified amino acids and the like.
  • proline which is classified as an imino acid
  • Amino acids constituting the polypeptides and peptides of the present invention are preferably ⁇ -amino acids, more preferably "protein-constituting amino acids”.
  • halogen atoms include fluorine atoms, chlorine atoms, bromine atoms and iodine atoms.
  • the substituent on the nitrogen atom is preferably a C1-6 alkyl group or a hydrogen atom, more preferably a hydrogen atom.
  • a CC bond means a carbon-carbon bond.
  • CC bonds include single, double and triple bonds.
  • steps a and/or c of the production method of the present invention a bond appropriately selected from the above 11 types is constructed. These eleven types of bonds are among the most fundamental bonding modes in organic chemistry, and the reactions to build them are also well known to those skilled in the art. Therefore, in designing and constructing the partial structure An of the compound library of the present invention, those skilled in the art can appropriately combine these 11 types of bonds and use them.
  • the organic compound composed of elements selected singly or differently from the element group consisting of H, B, C, N, O, Si, P, S, F, Cl, Br and I is It is an organic compound that is built up by bonding.
  • the partial structure An of the compound library of the present invention is constructed from the above 12 elements. These twelve elements are particularly basic elements in organic compounds, and the reactions to build them are also well known to those skilled in the art. Therefore, in designing and constructing the partial structure An of the compound library of the present invention, those skilled in the art can appropriately combine these 12 elements and use them.
  • a low-molecular-weight organic compound having substituents selected singly or differently from the substituent group consisting of an aryl group, a non-aromatic cyclyl group, a heteroaryl group and a non-aromatic heterocyclyl group means a chemical structure understood by each name. It is a low-molecular-weight organic compound having A low-molecular-weight compound is a concept well known to those skilled in the art, and examples of preferred molecular weights of low-molecular-weight compounds in the present invention are mentioned separately.
  • the aryl group of the present invention is preferably a C6-10 aryl group, more preferably a phenyl group.
  • the non-aromatic cyclyl group of the present invention is preferably a 5- to 8-membered non-aromatic cyclyl group, more preferably a 5- or 6-membered non-aromatic cyclyl group.
  • the non-aromatic cyclyl group may contain a partially unsaturated bond.
  • the heteroaryl group and non-aromatic heterocyclyl group of the present invention are groups having an element selected singly or differently from the group consisting of nitrogen, oxygen and sulfur as a heteroatom within the ring structure.
  • the heteroaryl group, non-aromatic heterocyclyl group of the present invention is preferably a 5- to 8-membered group, more preferably a 5- or 6-membered group, and the non-aromatic heterocyclyl group is a partially unsaturated bond may contain
  • the partial structure An of the compound library of the present invention has the above four groups. These four groups are particularly basic substructures in organic compounds, and reactions for building them into compounds are also well known to those skilled in the art. Therefore, in designing and constructing the partial structure An of the compound library of the present invention, those skilled in the art can appropriately combine these four groups and use them.
  • the synthesis history of An means a record of all the operations performed until An was synthesized, and in particular, the structure and order of the building blocks used until An was synthesized. For example, if the reaction is carried out in two or more separate reaction vessels, each using different building blocks and/or using different reaction conditions, the reaction may be carried out with oligos of predetermined sequence before or after the reaction. By ligating a nucleotide chain to the product in each reaction vessel, the synthesis history is given as sequence information of the oligonucleotide. By repeating such operations until An is constructed, an oligonucleotide of Bn having the synthesis history of An is constructed.
  • Split-and-pool synthesis is a synthetic method developed by Geisen et al. as a combinatorial chemical construction method for peptide libraries using solid-phase synthesis during the early days of combinatorial chemistry.
  • Split-and-pool synthesis is also called a split-mix method.
  • a sample is cut out from a solid-phase carrier to which amino acids are peptide-bonded at each step of peptide extension. After the N types of carriers are mixed and homogenized, they are equally divided to extend the next N types of amino acids.
  • one type of peptide chain will be generated for each carrier, and if all 20 natural amino acids are applied at each step, a peptide library that can be combined with all peptides of a specific length will be constructed.
  • assays can be performed using peptides on a solid-phase carrier using the ELISA method.
  • the carrier particles that have reacted with the assay are picked up (for example, fluorescence-labeled carrier particles of about 0.1 mm are picked up with an optical microscope).
  • the target peptide sequence is determined by an instrumental analyzer (peptide analyzer, etc.) from the peptides of the particles, or peptide sequences that are candidates for screening are indirectly identified by other combinatorial chemical identification methods (eg, tagging method). can decide.
  • A2-Sp-C-B2 (A2(a)-Sp-C-B2(a), A2(b)-Sp-C-B2(b)...
  • w types of structures ⁇ 3 ( ⁇ 3(a ⁇ w)) and w types of ⁇ 3 ( ⁇ 2(a ⁇ w)) corresponding thereto are prepared, and w pieces of (A2(a ⁇ v)-Sp- C-B2 (a-v) mixtures) are subjected to steps (c) and (d), respectively.
  • a mixture of (v ⁇ w) types of A3-Sp-C-B3 compound library is obtained by mixing the obtained w products. For example, if this mixture is subjected to a drug receptor binding test, (v ⁇ w) kinds of compounds can be screened in one go. By washing away compounds that did not bind to the drug receptor, only bound compounds can be isolated.
  • the DNA of the isolated A3-Sp-C-B3 compound is amplified to a sequence-readable amount, and the sequence information allows the structure of A3 to be determined.
  • compound library building block, split-and-pool, and the like are terms well known to those skilled in the art in fields such as combinatorial chemistry, and can be performed as appropriate with reference to the following literature.
  • Takashi Takahashi, Takayuki Doi “Combinatorial Chemistry”, Synthetic Organic Chemistry Association Journal, 2002, Vol. 60, pp. 426-433 (2) Combinatorial Chemistry Study Group ed.
  • a DNA-encoded library is a compound library consisting of a group of compounds (DNA-encoded compounds) labeled with DNA or oligonucleotides having substantially the same function as DNA.
  • DNA-encoded compounds are screened in the form of mixtures of 10 2 -10 20 compounds, and the DNA sequences contained in the compounds obtained are identified by techniques known in the art (e.g., next-generation Identification by use of sequencers and/or use of microarrays) makes it possible to identify the structure of the compound.
  • a technique of contacting a target such as a protein with a DNA-encoded library and selecting compounds that bind to the target can be selected.
  • Bio target is a term well known to those skilled in the art, but in one aspect, in the present invention, "biological target” is a target in the development of drugs such as pharmaceuticals and agricultural chemicals.
  • a group of biological substances such as enzymes (e.g., kinases, phosphatases, methylases, demethylases, proteases, and DNA repair enzymes), proteins involved in protein:protein interactions (e.g., receptor ligands), Included are receptor targets (eg, GPCRs), ion channels, cells, bacteria, viruses, parasites, DNA, RNA, prions, or carbohydrates.
  • evaluation of biological activity is a term well known to those skilled in the art.
  • evaluation of biological activity refers to the biological activity of a compound (e.g., the ability to bind to a biological target). , enzyme activity inhibition function, enzyme activity promotion function, etc.).
  • a compound e.g., the ability to bind to a biological target.
  • enzyme activity inhibition function e.g., enzyme activity promotion function, etc.
  • the aforementioned Patent Documents 2 and 3, Non-Patent Documents 1 to 6, etc. can also be referred to.
  • “Functional evaluation” is a term well known to those skilled in the art, but in one aspect, in the present invention, “functional evaluation” refers to a specific function of a compound (e.g., binding ability, biological activity, luminescence It is to evaluate the presence or absence or strength of characteristics, etc.).
  • the present invention provides a plurality of approaches with several advantages regarding DEL and methods for producing DEL by using DNA strands with cleavable sites. Forms 1 through 7 are described in detail below.
  • Form 1 The present invention provides a DEL using the "hairpin-shaped headpiece having a cleavable site”.
  • PCR can be performed with high efficiency by deriving double-stranded oligonucleotides that are not bound at loop sites.
  • Mode 2 (Regarding Form 2)
  • the cleavable site may be present in the second oligonucleotide strand.
  • the features of Mode 2 are similar to Mode 1, except for the cleavable site.
  • the cleavable site is present in both the first and second oligonucleotide strands. good.
  • the loop site is cleaved from both oligonucleotide strands, which is expected to further improve PCR efficiency.
  • the cleavable site may be present in both the first oligonucleotide strand (E) and the second oligonucleotide strand (F), and the cleavable
  • the structure of each site may be different. In such cases, differences in the properties of the two (or more) cleavable sites can be exploited to control the cleavage site.
  • deoxyuridine may be used as the cleavable site in the first oligonucleotide strand (E) and deoxyinosine as the cleavable site in the second oligonucleotide strand (F).
  • the USER enzyme can be used to selectively cleave the deoxyuridine of the first oligonucleotide strand (E).
  • alkyladenine DNA glycosylase and endonuclease VIII can be used to selectively cleave the second oligonucleotide chain (F) at a cleavage site starting from deoxyinosine.
  • the present invention can also have a cleavable site in the DNA tag portion (eg, oligonucleotide strand (Y)).
  • New overhanging ends can be generated by providing a cleavable site near the end of the DNA tag and cleaving the site if desired.
  • the overhanging ends can be used as sticky ends to ligate desired nucleic acid sequences such as UMIs (specific molecular identification sequences).
  • UMIs specific molecular identification sequences
  • UMIs specific molecular identification sequences
  • UMIs are molecular identifiers that give individual DNA sequences to individual DNA molecules by attaching them to DNA contained in a sample (Document Nature Method, 2012, 9, pp. 72-74).
  • PCR overlap sequences derived from the same molecule
  • PCR amplification bias can be reduced. quantification becomes possible.
  • a cleavable site, a modification group, or a functional molecule can be used in combination.
  • DEL is prepared by converting hairpin strand DNA into single-stranded DNA. Is possible.
  • a DEL compound using a headpiece having a cleavable site in the E section is taken as an example.
  • Step A A double-stranded oligonucleotide chain having a solid phase-supported removable modification group (eg, biotin) at the 3′ end is ligated to the synthesized DEL compound.
  • Step B Cut the cleavable site.
  • Step C Add a treatment according to the function of the modifying group.
  • a treatment according to the function of the modifying group for example, in the case of biotin, streptavidin beads or the like having biotin affinity are used to selectively remove biotin-bound oligonucleotide chains from the system. It is thereby possible to obtain DEL with single-stranded DNA.
  • the functional molecule is a molecule having a specific chemical or biological function (e.g., solubility, photoreactivity, substrate-specific reactivity, target proteolysis-inducing properties). By assigning it, it becomes possible to evaluate and purify DEL according to its function.
  • a specific chemical or biological function e.g., solubility, photoreactivity, substrate-specific reactivity, target proteolysis-inducing properties
  • biotin means all biotins that bind to avidin, including not only vitamin B7 but also desthiobiotin, for example.
  • the present invention provides suitable conditions in a method of deriving and evaluating a DEL containing a cleavable site in its DNA strand into a cross-linker-modified double-stranded DEL.
  • Another method for preparing DEL in which hairpin-stranded DNA is converted to single-stranded DNA is the method using the following exonuclease.
  • Step A A hairpin type having a "selectively cleavable site" is cut with an enzyme such as USER (registered trademark) Enzyme that is cleaved with the 5' end of the cleavage site phosphorylated after the cleavage reaction. Use to cut.
  • Step B One oligonucleotide strand phosphorylated at the 5' end is degraded and removed, for example, by treatment with lambda exonuclease. Thereby, a DEL having single-stranded DNA (single-stranded DEL) is obtained.
  • the single-stranded DEL obtained above is preferably a single-stranded DEL having library molecules in the 3' direction of the oligonucleotide strand.
  • the single-stranded DEL is capable of performing a primer extension reaction using a crosslinker-modified primer with a crosslinker at its 5' end. This technique enables easy synthesis of a “crosslinker-modified double-stranded DEL” in which a crosslinker is covalently linked to an oligonucleotide having a coding sequence.
  • the “selectively cleavable site” of the raw hairpin-type DEL is 3′ from the site to which the library molecule is bound. Existing.
  • a DEL having a single-stranded DNA is a modified oligonucleotide having a desired functional site (for example, a crosslinker-modified DNA such as a photoreactive crosslinker, or a crosslinker such as a photoreactive crosslinker).
  • a new function can be imparted by forming a double strand with a linker-modified primer).
  • the optionally provided primer may be extended to lead to a crosslinker-modified double-stranded DEL compound.
  • Such crosslinker-modified double-stranded DEL compounds are useful in the present invention because, after screening, a covalent bond is formed between the biological target and the coding sequence.
  • the present invention utilizes cleavable sites to introduce cross-linkers.
  • a DEL compound using a headpiece having a cleavable site in the E section is taken as an example.
  • Step A Cleavage the cleavable site to the synthesized DEL compound.
  • Step B Providing a modified primer (for example, a crosslinker-modified primer such as a photoreactive crosslinker) having a desired functional site.
  • a modified primer for example, a crosslinker-modified primer such as a photoreactive crosslinker
  • the crosslinker-modified double-stranded DEL compound can further bind the crosslinker to the target protein, resulting in remarkable detection sensitivity.
  • Non-Patent Documents 7, 11, etc. In the practice of DEL technology for evaluating a very large number of library compounds, it is very useful to enhance the affinity of the library compounds and improve the detection sensitivity.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides a novel and highly efficient method for producing a crosslinker-modified double-stranded DEL compound, and is extremely useful.
  • the present invention provides suitable conditions in a method of deriving and evaluating a DEL containing a cleavable site in its DNA strand into a cross-linker-modified double-stranded DEL.
  • the crosslinker-modified double-stranded DEL compound preferably has a crosslinker linked to an oligonucleotide having a coding sequence via a covalent bond.
  • Such a "crosslinker-modified double-stranded DEL compound” forms a covalent bond between the target and the coding sequence after screening, and for the removal of non-specific binding agents, etc., stronger separation and separation than before. It is very useful because it is resistant to elution conditions.
  • crosslinker in one embodiment, means a reactive group capable of forming a covalent bond through reaction with a biological target such as a protein or nucleic acid molecule.
  • a biological target such as a protein or nucleic acid molecule.
  • crosslinkers as described in Thermo Scientific Crosslinking Technical Handbook are known.
  • the crosslinker used in the present invention is preferably a reactive group containing at least one azide group, diazirine group, sulfonyl fluoride group, diazo group, cinnamoyl group, or acrylate group, more preferably an azide group, It is a reactive group containing at least one diazirine group or sulfonyl fluoride group.
  • crosslinker and “crosslinker modification” mean having a partial structure containing a crosslinker as a substituent.
  • crosslinker-modified double-stranded DEL is the five of "double-stranded DEL", “DNA”, and “primer”, respectively.
  • a crosslinker is directly attached to the ' end or is attached via a bifunctional spacer.
  • the crosslinker has the following formulas (AA) to (AE) or (BA) or (BB ) is preferred. (Wherein, * means the 5' end of "double-stranded DEL", “DNA”, or “primer”, or the binding position with the bifunctional spacer side bound to the 5' end)
  • the crosslinker used in the present invention is a photoreactive crosslinker.
  • the photoreactive crosslinker is a reactive group that changes to a reactive group with high reactivity (e.g., nitrene and carbene) by light irradiation and forms a covalent bond with a nearby biological target.
  • a reactive group with high reactivity e.g., nitrene and carbene
  • an azide group and a diazirine group are known, and the structures of the above formulas (AA) to (AE) are known.
  • the crosslinker used in the present invention is a reactive group containing at least one sulfonyl fluoride group.
  • Sulfonyl fluoride groups for example, react with residues such as serine, threonine, tyrosine, lysine, cysteine, and histidine in biological target proteins to form covalent bonds.
  • residues such as serine, threonine, tyrosine, lysine, cysteine, and histidine in biological target proteins to form covalent bonds.
  • the structures of the above formulas (BA)-(BB) are known.
  • the cross-linking reaction between the crosslinker and the biological target is preferably carried out in a temperature range in which the desired higher-order structure of the biological target does not change significantly.
  • Preferred temperatures are, for example, in the range of 4-40°C.
  • a bifunctional spacer is a spacer moiety that has at least two reactive groups that allow bonding of the substructure An of the compound library to the headpiece. Further in the context of the present invention, a bifunctional spacer is a spacer moiety that has two reactive groups that allow binding of a crosslinker to a "double stranded DEL", "DNA” or "primer”. This embodiment of the bifunctional spacer is sometimes referred to as a "crosslinker bifunctional spacer".
  • bifunctional spacers that bind to the aforementioned compound library are sometimes referred to as “compound library bifunctional spacers.”
  • preferred aspects of the "crosslinker bifunctional spacer” are the same as the preferred aspects of the aforementioned "compound library bifunctional spacer”.
  • the "crosslinker bifunctional spacer” has a molecular chain length suitable for reacting the crosslinker with the biological target when the compound library binds to the biological target during screening. and preferably has a molecular chain length equivalent to that of the "bifunctional spacer of the compound library”.
  • the “coding sequence” is a sequence portion of an oligonucleotide having a sequence that allows the structure of the library molecule to be identified among the sequences of the oligonucleotides contained in the DEL.
  • the "reactive group for crosslinker modification” is not particularly limited as long as it is a reactive group capable of reacting with the crosslinker unit described below.
  • the "reactive group for crosslinker modification” is a reactive group having reactivity selectivity with the crosslinker. Having reaction selectivity with the crosslinker makes it possible to apply to the present invention reaction conditions to which the crosslinker cannot be applied, such as the crosslinker reacting first and undergoing structural conversion. That is, a unit having a reactive group for crosslinker modification is introduced into the process of the present invention, reaction conditions to which the crosslinker cannot be applied are used in the process of the present invention, and then reacted with the crosslinker unit to obtain the crosslinker of the present invention. can be introduced into the crosslinker-modified DEL of the invention.
  • the "reactive group for crosslinker modification” and the “reactive group paired with the reactive group for crosslinker modification” are a pair of reactive groups with high affinity in the binding reaction. When two compounds each having this pair bind, the pair preferentially reacts to form a bond with high selectivity, even if there are various other functional groups in the compounds.
  • a “click response” is understood as one aspect as follows.
  • a “click reaction” has at least the following characteristics: (1) it exhibits orthogonality of functional groups (i.e., the functional moiety reacts complementary to it without reacting with other reactive sites); and (2) the resulting bond is irreversible (i.e., once reactants react to form products, decomposition of the products into reactants becomes difficult).
  • reaction in which the resulting bond may be reversible (ie, under appropriate conditions, reverts to the reactants).
  • "click" chemistry is characterized by: (1) stereospecificity; (2) reaction conditions without rigorous purification, atmosphere control, etc.; (3) readily available starting materials and reagents; (4) the availability of harmless solvents or no solvent at all; (5) isolation of the product by crystallization or distillation; (6) physiological stability; (8) a single reaction product; and (9) high chemical yield (eg, greater than 50%), or You can have more than one.
  • the "reactive group for crosslinker modification” and the “reactive group paired with the reactive group for crosslinker modification” are preferably reactive groups for click reaction, and more preferably, It is an alkynyl group, an alkenyl group, an azide group or a tetrazinyl group, more preferably any one of formulas (CA) to (CL).
  • the pair of "reactive group for crosslinker modification” and “reactive group paired with the reactive group for crosslinker modification” is preferably an azide group for an alkynyl group or a tetrazinyl group for an alkenyl group. mentioned. These pairs have a so-called bolt and nut relationship and are interchangeable. For example, when an alkynyl group is used as the “reactive group for crosslinker modification”, an azide group can be used as the "reactive group paired with the reactive group for crosslinker modification". Their selection is well known to those skilled in the art.
  • the "reactive group for crosslinker modification” and the “reactive group paired with the reactive group for crosslinker modification” include the above (CA) and (CH), (CB) and (CH) , (CC) and (CH), (CE) and (CI), (CE) and (CJ), (CE) and (CK), (CE) and (CL), (CF) and (CI), ( CF) and (CJ), (CF) and (CK), (CF) and (CL), (CG) and (CI), (CG) and (CJ), (CG) and (CK), (CG) and (CL).
  • crosslinker unit is not particularly limited as long as it is a unit having the aforementioned "reactive group paired with the reactive group for crosslinker modification” and a crosslinker.
  • the "crosslinker unit” is composed of a "reactive group paired with a reactive group for crosslinker modification", a “bifunctional spacer” and a “crosslinker”.
  • the embodiment of the "bifunctional spacer” is as described above.
  • DNA having a reactive group for crosslinker modification is not particularly limited as long as it is a compound having the aforementioned "reactive group for crosslinker modification”.
  • DNA having a reactive group for crosslinker modification is composed of a “reactive group for crosslinker modification", a “bifunctional spacer” and “DNA”.
  • the embodiment of the "bifunctional spacer" is as described above.
  • crosslinker modified primer For the aspect of "modified primer having a reactive group for crosslinker modification", the aforementioned “crosslinker modified primer” is referred to. However, “crosslinker” is referred to as "reactive group for crosslinker modification”.
  • nucleic acids with various sequences in the examples can be prepared according to standard methods, for example, using an automatic nucleic acid synthesizer.
  • automatic nucleic acid synthesizers include nS-8II (manufactured by Genedesign).
  • outsourced synthesis or contract laboratories can be used. Contract labs well known to those skilled in the art include Genedesign, LGC Biosearch Technologies, and the like. In general, these contract laboratories prepare nucleic acids with sequences specified by the consignor under confidentiality agreements and deliver them to the consignor.
  • Example 1 [Verification of Cleavage Reaction of Partial Structure of Hairpin-Type DEL Containing Deoxyuridine by USER (Registered Trademark) Enzyme]
  • Compounds having the sequences shown in Table 1 were prepared using an automatic nucleic acid synthesizer nS-8II (manufactured by Genedesign).
  • nS-8II automatic nucleic acid synthesizer
  • each sequence unit is linked by a phosphodiester bond
  • A means deoxyadenosine
  • T means thymidine.
  • U-DEL1-sh, U-DEL5-HP, U-DEL6-HP, U-DEL7-HP, U-DEL8-HP, U-DEL9-HP, and U-DEL10-HP are 20 ⁇ L each after 20 hours sampled.
  • U-DEL8-HP and U-DEL9-HP were further incubated at 90° C. for 1 hour, and then sampled at 20 ⁇ L each.
  • U-DEL1-sh, U-DEL2-sh, U-DEL3-sh, and U-DEL4-sh were analyzed under the following analysis conditions 1, U-DEL5-HP, U- DEL6-HP, U-DEL7-HP, U-DEL8-HP, U-DEL9-HP, and U-DEL10-HP were analyzed under analysis condition 2 shown below.
  • Tables 2 and 3 show the sequences and theoretical molecular weights of the products assumed in each reaction solution (the abasic form of the deoxyuridine moiety and the cleaved fragment), and the molecular weights detected in each reaction solution. Note that the notation of each column in Tables 2 and 3 is as follows.
  • Entry Experiment numbers are shown, and substrates corresponding to each experiment number (Entry) are as follows. Entry. 1: U-DEL1-sh Entry. 2: U-DEL2-sh Entry. 3: U-DEL3-sh Entry. 4: U-DEL4-sh Entry. 5: U-DEL5-HP Entry. 6: U-DEL6-HP Entry. 7: U-DEL7-HP Entry. 8: U-DEL8-HP Entry. 9: U-DEL9-HP Entry. 10: U-DEL10-HP
  • No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, and 10 are substrates of each reaction solution; 11, 14, 17, 20, 22, 25, 29, 31, 33, and 35 are abasic versions of the deoxyuridine portion of each substrate, and the remaining SEQ ID NOs are fragments of each substrate cleaved.
  • the conversion rate of the abasic reaction and the cleavage reaction was calculated from the area ratio of the peak corresponding to each detected sequence.
  • the abasic reaction showed more than 99% conversion for all substrates at 37° C. for 1 hour (substrate peak was less than 1%, remaining peaks were abasic and cleaved fragments only).
  • FIG. 10 shows a graph showing the conversion rate of the cleavage reaction.
  • the compound (hairpin DEL) having the sequence shown in Table 4 was synthesized by the following procedure.
  • "S” is the following formula (7) means a group represented by and other notations are the same as in Table 1.
  • the name of the compound corresponding to each sequence number (No.) is as follows. No. 37: U-DEL1 No. 38: U-DEL2 No. 39: U-DEL4 No. 40: U-DEL7 No. 41: U-DEL8 No. 42: U-DEL9 No. 43: U-DEL10 No. 44: H-DEL
  • the compound names of the raw material headpieces for synthesizing each hairpin DEL are as follows.
  • the raw material headpieces shown in Table 5 were prepared in the same manner as in Example 1 using an automatic nucleic acid synthesizer nS-8II (manufactured by Genedesign).
  • a PCR tube 2.0 ⁇ L of 1 mM aqueous solution of various raw material headpieces; 2.4 ⁇ L of 1 mM aqueous solution of Pr_TAG (prepared by annealing Pr_TAG_a and Pr_TAG_b synthesized as in Example 1, sequences are shown in Table 6); 0.8 ⁇ L of 10 ⁇ ligase buffer (500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 500 mM sodium chloride; 100 mM magnesium chloride; 100 mM dithiothreitol; 20 mM adenosine triphosphate) and 2.0 ⁇ L deionized water were added.
  • 10 ⁇ ligase buffer 500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 500 mM sodium chloride; 100 mM magnesium chloride; 100 mM dithiothreitol; 20 mM adenosine triphosphate
  • reaction solution was treated with 0.8 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 17.6 ⁇ L of cold ( ⁇ 20° C.) ethanol and left at ⁇ 78° C. for 2 hours. After centrifugation, the supernatant was removed and the resulting pellet was air-dried. A solution was prepared by adding 2.0 ⁇ L deionized water to each pellet.
  • reaction solution was treated with 0.8 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 17.6 ⁇ L of cold ( ⁇ 20° C.) ethanol and left at ⁇ 78° C. for 2 hours. After centrifugation, the supernatant was removed and the resulting pellet was air-dried. 10 ⁇ L of deionized water was added to the pellet to form a solution.
  • H-DEL is a conventional hairpin DEL, and the remaining seven are cleavable hairpin DELs containing deoxyuridine.
  • Real-time PCR analysis was performed to compare the PCR efficiencies of various hairpin DELs before and after treatment with USER® enzyme.
  • DS-DEL shown in Table 7 (prepared by annealing the compounds of sequence Nos. 47 and 48) was used.
  • "(amino-C6-L)" is the following formula (8) means a group represented by and other notations are the same as in Table 1.
  • the Ct values of the various DEL samples obtained above were measured by real-time PCR, and the PCR efficiencies were compared. The conditions are as follows, and the results are shown in FIG.
  • the Ct value is the number of cycles at which the fluorescent signal generated by DNA amplification reaches an arbitrary threshold value in real-time PCR. That is, the higher the PCR efficiency, the lower the Ct value for the same initial number of DNA molecules.
  • Apparatus 7500 real-time PCR system (manufactured by Applied Biosystems) Plate: MicroAmp 96-well plate (manufactured by Applied Biosystems, catalog number N8010560) PCR reaction solution: ⁇ TB Green Premix Ex taqII (manufactured by Takara Bio Inc., catalog number RR820): 10 ⁇ L ⁇ Forward primer (Table 9, SEQ ID NO: 55): 0.80 ⁇ L ⁇ Reverse primer (Table 9, SEQ ID NO: 56): 0.80 ⁇ L ⁇ ROX Reference Dye II (manufactured by Takara Bio Inc., catalog number RR39LR): 0.40 ⁇ L ⁇ Aqueous solutions of various DEL samples (0.05 pM, 0.5 pM, 5 pM) * 1: 2.0 ⁇ L ⁇ Deionized water: 6.0 ⁇ L *1: The number of moles of the DEL sample is 0.1 amol, 1 amol, and 10 amol. Temperatur
  • the conventional hairpin DEL had no change in Ct values before and after USER enzyme treatment
  • the deoxyuridine-containing cleavable hairpin DEL U-DEL1, U- DEL2, U-DEL4, U-DEL7, U-DEL8, U-DEL9, and U-DEL10
  • the deoxyuridine-containing cleavable hairpin DEL U-DEL1, U- DEL2, U-DEL4, U-DEL7, U-DEL8, U-DEL9, and U-DEL10
  • Example 3 [Verification of cleavage reaction of hairpin DEL containing deoxyuridine by USER (registered trademark) enzyme] ⁇ Synthesis of four hairpin DELs (U-DEL5, U-DEL11, U-DEL12, and U-DEL13)> A compound (hairpin DEL) having the sequence shown in Table 10 was synthesized by the following procedure.
  • “[mdC (TEG-amino)]” is the following formula (9) means a group represented by and other notations are the same as in Table 4.
  • the name of the compound corresponding to each sequence number (No.) is as follows. No. 57: U-DEL5 No. 58: U-DEL11 No.
  • U-DEL12-HP and U-DEL13-HP were prepared in the same manner as in Example 1 using an automatic nucleic acid synthesizer nS-8II (manufactured by Genedesign).
  • U-DEL11-HP was similarly prepared according to the standard method.
  • a portion of the obtained solution was sampled, diluted with deionized water, and subjected to mass spectrometry by ESI-MS under the following analysis conditions 3 to identify the target product (theoretical molecular weight of each sequence, and The molecular weights detected are shown in Table 10). After the remainder of the solution was lyophilized, deionized water was added to each to adjust to 20 ⁇ M.
  • the MS of the substrate was not detected in any sample, and the MS of the product after cleavage was observed as the main peak.
  • Lane 1 20 bp DNA ladder (manufactured by Lonza, Lonza 20 bp DNA Ladder, catalog number 50330) Lane 2: U-DEL5 Lane 3: After the cleavage reaction of U-DEL5 Sample lane 4: U-DEL7 Lane 5: after the cleavage reaction of U-DEL7 Sample lane 6: U-DEL9 Lane 7: after the cleavage reaction of U-DEL9 Sample lane 8: U-DEL11 Lane 9: Sample after cleavage reaction of U-DEL11 Lane 10: U-DEL12 Lane 11: Sample after cleavage reaction of U-DEL12 Lane 12: U-DEL13 Lane 13: Sample denaturing polyacrylamide gel electrophoresis after U-DEL13 cleavage reaction: Gel: NovexTM 10% TBE-urea gel (manufactured by Invitrogen by ThermoFisher SCIENTIFIC, catalog number EC68755BOX) Loading Buffer: Novex
  • Example 4 [Verification of cleavage reaction of hairpin DEL containing deoxyinosine by endonuclease V] ⁇ Synthesis of Hairpin DEL (I-DEL1, I-DEL2, I-DEL3, and I-DEL4) Containing Four Deoxyinosines>
  • a compound (hairpin DEL) having the sequence shown in Table 13 was synthesized by the following procedure.
  • "I” means deoxyinosine, and other notations are the same as in Table 2.
  • the name of the compound corresponding to each sequence number (No.) is as follows. No. 73: I-DEL1 No. 74: I-DEL2 No. 75: I-DEL3 No.
  • the raw material headpiece shown in Table 14 was prepared according to a standard method.
  • the MS of the substrate was not detected in any sample, and the MS of the product after cleavage was observed as the main peak.
  • Lane 1 20 bp DNA ladder (manufactured by Lonza, Lonza 20 bp DNA Ladder, catalog number 50330) Lane 2: I-DEL1 Lane 3: Sample lane 4 after I-DEL1 cleavage reaction: I-DEL2 Lane 5: After I-DEL2 cleavage reaction Sample lane 6: I-DEL3 Lane 7: After I-DEL3 cleavage reaction Sample lane 8: I-DEL4 Lane 9: Sample after I-DEL4 cleavage reaction
  • endonuclease V cleaves the second phosphodiester bond in the 3' direction from deoxyinosine in hairpin-type DELs containing various deoxyinosines.
  • Example 5 [Verification of cleavage reaction by RNase HII of hairpin DEL containing ribonucleoside] ⁇ Synthesis of Hairpin DEL (R-DEL1) Containing Ribonucleoside>
  • a compound (hairpin DEL) having the sequence shown in Table 16 was synthesized by the following procedure.
  • "u” means uridine, and other notations are the same as in Table 2.
  • the names of the compounds corresponding to the sequence numbers (No.) are as follows.
  • No. 87: R-DEL1 The compound names of the raw material headpieces for synthesizing each hairpin DEL are as follows.
  • Hairpin DEL Raw headpiece R-DEL1: R-DEL1-HP
  • SEQ ID NO "No.” and sequence "Seq” of R-DEL1-HP are shown in Table 17 below. Note that the notations in Table 17 are the same as those in Table 16.
  • the raw material headpiece shown in Table 17 was prepared according to a standard method.
  • the MS of the substrate was not detected in any sample, and the MS of the product after cleavage was observed as the main peak.
  • ⁇ U-DEL9-HP - 3 building blocks (BB1, BB2, and BB3): - 10 types of double-stranded oligonucleotide tags (tag numbers in Table 19: Pr, A1, A2, A3, B1, B2, B3, C1, C2, and C3)
  • each double-stranded oligonucleotide tag was prepared by annealing two oligonucleotides of SEQ ID NOs corresponding to each tag number.
  • the above solution was treated with 295 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 9.7 mL of cooled ( ⁇ 20° C.) ethanol, respectively, and allowed to stand at ⁇ 78° C. overnight. After centrifugation, the supernatant was removed and the resulting pellet was air-dried. Each pellet was dissolved by adding 2.75 mL of deionized water, added with 306 ⁇ L of piperidine at 0° C., and shaken at 10° C. for 3 hours. After centrifuging the mixture, the precipitate was removed by filtration and washed twice with 1.47 mL of deionized water.
  • the resulting filtrates were each treated with 600 ⁇ L of 5 M aqueous sodium chloride solution and 19.8 mL of chilled ( ⁇ 20° C.) ethanol, and left at ⁇ 78° C. overnight. After centrifugation, the supernatant was removed and the resulting pellet was air-dried.
  • the reaction solution was treated with 80 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 2640 ⁇ L of cold (-20° C.) ethanol and incubated at -78° C. for 2 hours. After centrifugation, the supernatant was removed and 400 ⁇ L of deionized water was added to the resulting pellet. The resulting solution was concentrated with an Amicon® Ultra Centrifugal filter (30 kD cutoff). A part of the obtained solution was sampled and subjected to mass spectrometry by ESI-MS under the conditions of analysis condition 2 to identify the target product (the theoretical molecular weight of the compound and the detected molecular weight are shown in Table 21. ).
  • ⁇ Cycle A> In each of three PCR tubes, 20 ⁇ L of a 1 mM solution of the compound “AOP-U-DEL9-HP-Pr” obtained above; 30 ⁇ L of a 1 mM aqueous solution of one of the double-stranded oligonucleotide tags A1-A3; 8.0 ⁇ L of 10 ⁇ ligase buffer (500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 500 mM sodium chloride; 100 mM magnesium chloride; 100 mM dithiothreitol; 20 mM adenosine triphosphate) and 21.6 ⁇ L of deionized water were added. 0.4 ⁇ L of T4 DNA ligase (Thermo Fisher, Catalog No. EL0013) was added to the solution and the resulting solution was incubated at 16° C. for 18 hours.
  • T4 DNA ligase Thermo Fisher, Catalog No. EL0013
  • reaction solutions were treated with 8.0 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 264 ⁇ L of cooled (-20° C.) ethanol and allowed to stand at -78° C. for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and each pellet obtained was dissolved in 20 ⁇ L of 150 mM sodium borate buffer (pH 9.4).
  • reaction solutions were treated with 3.2 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 106 ⁇ L of cooled (-20°C) ethanol and allowed to stand at -78°C for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, 18 ⁇ L of deionized water was added to each pellet obtained, and the three solutions were mixed in one PCR tube.
  • ⁇ Cycle B> For each of three PCR tubes, 13.7 ⁇ L of a 1 mM solution of the starting material obtained in cycle A; 20.6 ⁇ L of a 1 mM aqueous solution of one of the double-stranded oligonucleotide tags B1-B3; 5.5 ⁇ L of 10X ligase. Buffer (500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 500 mM sodium chloride; 100 mM magnesium chloride; 100 mM dithiothreitol; 20 mM adenosine triphosphate) and 14.8 ⁇ L of deionized water were added. 0.3 ⁇ L of T4 DNA ligase (Thermo Fisher, Catalog No. EL0013) was added to the solution and the resulting solution was incubated at 16° C. for 16 hours.
  • T4 DNA ligase Thermo Fisher, Catalog No. EL0013
  • reaction solutions were treated with 5.5 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 181 ⁇ L of cooled (-20°C) ethanol, and allowed to stand at -78°C for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and each pellet obtained was dissolved in 13.7 ⁇ L of 150 mM sodium borate buffer (pH 9.4).
  • each tube To each tube, add 80 equivalents of one of building blocks BB1-BB3 (5.5 ⁇ L, 200 mM N,N-dimethylacetamide solution) followed by 80 equivalents of DMTMM (5.5 ⁇ L, 200 mM aqueous solution), Shake at 10°C for 1 hour. Further, 40 equivalents of building block (2.3 ⁇ L, 200 mM N,N-dimethylacetamide solution) and then 40 equivalents of DMTMM (2.3 ⁇ L, 200 mM aqueous solution) were added to each tube and shaken at 10°C for 2 hours. I did.
  • reaction solutions were treated with 2.5 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 81.4 ⁇ L of cooled (-20°C) ethanol, and allowed to stand at -78°C for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, 12.3 ⁇ L of deionized water was added to each pellet obtained, and the three solutions were mixed in one PCR tube.
  • ⁇ Cycle C> For each of three PCR tubes, 14.5 ⁇ L of a 0.48 mM solution of the starting material obtained in Cycle B; 10.5 ⁇ L of a 1 mM aqueous solution of one of the double-stranded oligonucleotide tags C1-C3; and 2.8 ⁇ L. of 10X ligase buffer (500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 500 mM sodium chloride; 100 mM magnesium chloride; 100 mM dithiothreitol; 20 mM adenosine triphosphate) was added. 0.14 ⁇ L of T4 DNA ligase (Thermo Fisher, Catalog No. EL0013) was added to the solution and the resulting solution was incubated at 16° C. for 16 hours.
  • 10X ligase buffer 500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 500 mM sodium chloride; 100 mM magnesium chloride; 100 mM dithiothrei
  • reaction solutions were treated with 2.8 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 92 ⁇ L of cooled (-20° C.) ethanol and allowed to stand at -78° C. for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and each pellet obtained was dissolved in 7.0 ⁇ L of 150 mM sodium borate buffer (pH 9.4).
  • reaction solutions were treated with 1.3 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 41.4 ⁇ L of cooled (-20°C) ethanol, and allowed to stand at -78°C for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, 6.3 ⁇ L of deionized water was added to each pellet obtained, and the three solutions were mixed in one PCR tube.
  • ⁇ CP ligation> In a PCR tube, 12.2 ⁇ L Cycle C 0.41 mM solution of starting material; 6.0 ⁇ L CP 1 mM in water (same as used in Example 2); 2.1 ⁇ L 10X ligase buffer solution (500 mM Tris-HCl, pH 7.5; 500 mM sodium chloride; 100 mM magnesium chloride; 100 mM dithiothreitol; 20 mM adenosine triphosphate) and 0.7 ⁇ L of deionized water were added.
  • 0.1 ⁇ L of T4 DNA ligase (manufactured by Thermo Fisher, catalog number EL0013) was added to the solution and the resulting solution was incubated at 16° C. for 16 hours.
  • reaction solution was treated with 2.1 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 69.6 ⁇ L of cooled (-20°C) ethanol and allowed to stand at -78°C for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and 400 ⁇ L of deionized water was added to the resulting pellet. The resulting solution was concentrated by Amicon® Ultra Centrifugal filter (30 kD cutoff) and adjusted to 20 ⁇ M by adding deionized water.
  • Lane 1 AOP-U-DEL9-HP-Pr
  • Lane 2 Sample after cycle A double-stranded oligonucleotide tag A1 ligation
  • Lane 3 Sample after cycle A double-stranded oligonucleotide tag A2 ligation
  • Lane 4 Cycle A after double-stranded oligonucleotide tag A3 ligation
  • Sample lane 5 After double-stranded oligonucleotide tag B1 ligation in cycle B
  • Sample lane 6 After double-stranded oligonucleotide tag B2 ligation in cycle B
  • Sample lane 7 After double-stranded oligonucleotide tag B3 ligation in cycle B
  • Sample lane 8 Sample lane 9 after Cycle C double-stranded oligonucleotide tag C1 ligation: Sample lane 10 after Cycle C double-stranded oligonucleotide tag C2 ligation: Cycle C double-stranded oligonucle
  • FIG. 18 shows the results of chromatograph and mass spectrum. An average molecular weight of 35532.4 was observed by deconvolution of the obtained mass spectrum. This result is consistent with the expected average molecular weight (35514.2) after completion of cycle C, and the reactions for library synthesis (ligation of double-stranded oligonucleotide tags and introduction of building blocks) were achieved with high efficiency. It was shown that
  • model library 20 ⁇ M aqueous solution
  • CutSmart (registered trademark) Buffer manufactured by New England BioLabs, catalog number B7204S
  • USER® enzyme manufactured by New England BioLabs, Catalog No. M5505S
  • Example 7 [Conversion of DEL compound from hairpin DNA to single-stranded DNA and imparting new function] ⁇ Synthesis of DEL compound raw material headpiece (AAZ-DEL-HP)> AAZ-DEL-HP having the sequence shown in Table 22 was synthesized by the following procedure.
  • AAZ-AOP-AminoC7) is the following formula (11) means a group represented by and other notations are the same as in Table 2.
  • the reaction solution was put together in one Violamo centrifuge tube, treated with 800 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 26.3 mL of cooled ( ⁇ 20° C.) ethanol, and allowed to stand at ⁇ 78° C. for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and the resulting pellet was air-dried. The pellet was dissolved in deionized water and purified by reverse phase HPLC using a Phenomenex Gemini C18 column. A binary mobile phase gradient profile was used to elute the target using 50 mM triethylammonium acetate buffer (pH 7.5) and acetonitrile/water (100:1, v/v).
  • DEL compounds with the sequences shown in Table 24 were synthesized by the following procedure.
  • “(BIO)” is the following formula (15) and other notations are the same as in Tables 2, 20, 22 and 23.
  • the name of the compound corresponding to each sequence number (No.) is as follows. No. 117: AAZ-BIO-DEL No. 118: SABA-BIO-DEL No. 119: ClSABA-BIO-DEL No.
  • DEL compound Raw material headpiece AAZ-BIO-DEL: AAZ-DEL-HP SABA-BIO-DEL : SABA-DEL-HP ClSABA-BIO-DEL: ClSABA-DEL-HP mSABA-BIO-DEL : mSABA-DEL-HP Amino-BIO-DEL: AOP-U-DEL9-HP
  • the reaction solution was treated with 4 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 132 ⁇ L of cooled (-20° C.) ethanol and allowed to stand at -78° C. for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, the resulting pellet was air-dried, and the pellet was dissolved in deionized water. The resulting solution was desalted with an Amicon (registered trademark) Ultra Centrifugal filter (3 kD cutoff).
  • Amicon registered trademark
  • Table 26 The sequence notation in Table 26 is the same as in Table 24, and the five compounds are SEQ ID NOS: 124 and 125, SEQ ID NOS: 126 and 127, SEQ ID NOS: 128 and 129, and SEQ ID NO: 130, respectively. and SEQ ID NO: 131, and SEQ ID NO: 132 and SEQ ID NO: 133.
  • the resulting reaction solution was desalted and concentrated with an Amicon (registered trademark) Ultra Centrifugal filter (3 kD cutoff), ethanol precipitation was performed, and then deionized water was added to each obtained pellet to obtain an aqueous solution. .
  • Amicon registered trademark
  • Ultra Centrifugal filter 3 kD cutoff
  • Example 3 A portion of the resulting solution was sampled, diluted with deionized water, and subjected to mass spectrometry by ESI-MS under the analysis conditions 3 of Example 3 to obtain a DEL compound "DS -AAZ-BIO-DEL", “DS-SABA-BIO-DEL”, “DS-ClSABA-BIO-DEL”, “DS-mSABA-BIO-DEL”, and “DS-Amino-BIO-DEL” respectively identified (theoretical molecular weights of the compounds and the detected molecular weights are shown in Table 26)
  • DEL compounds having the double-stranded nucleic acid obtained above “DS-AAZ-BIO-DEL”, “DS-SABA-BIO-DEL”, “DS-ClSABA-BIO-DEL”, “DS-mSABA-BIO- DEL” and “DS-Amino-BIO-DEL” are treated with streptavidin beads, respectively, and the DEL compounds "SS-AAZ-DEL” and "SS-SABA-DEL” having single-stranded DNA are prepared by the following procedure. ”, “SS-ClSABA-DEL”, “SS-mSABA-DEL”, and “SS-Amino-DEL” were prepared. The five compounds are oligonucleotide chains of SEQ ID NOs: 125, 127, 129, 131 and 133 in Table 26, respectively.
  • the resulting particles were respectively labeled "DS-AAZ-BIO-DEL”, “DS-SABA-BIO-DEL”, “DS-ClSABA-BIO-DEL”, “DS-mSABA-BIO-DEL”, or "DS -Amino-BIO-DEL” (700 pmol, 450 ⁇ L, respectively), and 450 ⁇ L of 2 ⁇ binding buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid; 2 M sodium chloride; 0.1% v/v Tween 20 ) was added, mixed and shaken at room temperature for 20 minutes.
  • 2 ⁇ binding buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid; 2 M sodium chloride; 0.1% v/v Tween 20
  • the supernatant was removed from each mixture by magnetic separation, and 900 ⁇ L of 1 ⁇ binding buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 0.5 mM ethylenediaminetetraacetic acid; 1 M sodium chloride; 0.05% v/v Tween 20) was added. The washing of the particles used and the removal of the supernatant by magnetic separation were each repeated twice. After that, 900 ⁇ L of denaturation solution (0.1 M sodium hydroxide; 0.1 M sodium chloride) was added to each, and the supernatant was recovered by magnetic separation.
  • 1 ⁇ binding buffer 10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 0.5 mM ethylenediaminetetraacetic acid; 1 M sodium chloride; 0.05% v/v Tween 20
  • reaction solution was treated with 23.6 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 778.8 ⁇ L of cooled (-20°C) ethanol and allowed to stand overnight at -78°C. After centrifugation, the supernatant was removed and the resulting pellet was air-dried. After adding 180 ⁇ L of deionized water to the pellet to make a solution, 20 ⁇ L of piperidine was added and shaken at 10° C. for 3 hours.
  • the obtained solution was treated with 20 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 660 ⁇ L of cold (-20° C.) ethanol and allowed to stand at -78° C. for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, and 200 ⁇ L of deionized water was added to the obtained pellet to make a 1 mM solution.
  • the obtained solution was treated with 20 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 660 ⁇ L of cold (-20° C.) ethanol and allowed to stand at -78° C. for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, and 100 ⁇ L of deionized water was added to the resulting pellet, followed by 75 ⁇ L of triethylamine hydrochloride buffer (500 mM, pH 10) and 50 equivalents of Sulfo-SDA (25 ⁇ L, 200 mM aqueous solution). , 37° C. for 1 hour and 20 minutes. An additional 50 equivalents of Sulfo-SDA (25 ⁇ L, 200 mM aqueous solution) was added and shaken at 37° C. for 40 minutes.
  • the resulting solution was treated with 22.5 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 743 ⁇ L of chilled (-20°C) ethanol and allowed to stand overnight at -78°C. After centrifugation, the supernatant was removed, and 100 ⁇ L of deionized water was added to the resulting pellet, followed by 75 ⁇ L of triethylamine hydrochloride buffer (500 mM, pH 10), followed by 50 equivalents of Sulfo-SDA (25 ⁇ L, 200 mM aqueous solution). ) was added and shaken at 37° C. for 3 hours.
  • the resulting solution was treated with 20 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 660 ⁇ L of chilled (-20° C.) ethanol and allowed to stand at -78° C. overnight. After centrifugation, the supernatant was removed and the resulting pellet was air-dried.
  • the pellet was dissolved in 50 mM triethylammonium acetate buffer (pH 7.5) and purified by reverse-phase HPLC using a Phenomenex Gemini C18 column. A binary mobile phase gradient profile was used to elute the target using 50 mM triethylammonium acetate buffer (pH 7.5) and acetonitrile/water (100:1, v/v).
  • a part of the obtained solution was sampled, diluted with deionized water, and then subjected to mass spectrometry by ESI-MS under the analysis conditions 3 of Example 3 to obtain the desired photoreactive crosslinker.
  • a modified primer 'PXL-Pr' was identified (compound theoretical and detected molecular weights are shown in Table 27).
  • Table 29 The sequence notation in Table 29 is the same as in Tables 26 and 27, and the five compounds are SEQ ID NOS: 136 and 125, SEQ ID NOS: 136 and 127, and SEQ ID NOS: 136 and 129, respectively. , SEQ ID NO: 136 and SEQ ID NO: 131, and SEQ ID NO: 136 and SEQ ID NO: 133.
  • the resulting solution was desalted with an Amicon (registered trademark) Ultra Centrifugal filter (3 kD cutoff). Deionized water was added to the obtained supernatant to make a solution of 60 ⁇ L, which was then treated with 6 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 198 ⁇ L of cold ( ⁇ 20° C.) ethanol, and allowed to stand at ⁇ 78° C. for 30 minutes. . After centrifugation, the supernatant was removed and the resulting pellet was air-dried. 30 ⁇ L of deionized water was added to the pellet to form a solution.
  • Amicon registered trademark
  • Lane 1 20 bp DNA ladder (manufactured by Lonza, Lonza 20 bp DNA Ladder, catalog number 50330)
  • Lane 2 DS-AAZ-BIO-DEL (concentration 1)
  • Lane 3 SS-AAZ-DEL (concentration 1)
  • Lane 4 sample after primer extension reaction of SS-AAZ-DEL (PXL-DS-AAZ-DEL) (concentration 1)
  • Lane 5 DS-AAZ-BIO-DEL (concentration 2)
  • Lane 6 SS-AAZ-DEL (concentration 2)
  • Lane 7 sample after primer extension reaction of SS-AAZ-DEL (PXL-DS-AAZ-DEL) (concentration 2)
  • Lane 8 DS-SABA-BIO-DEL (concentration 1)
  • Lane 9 SS-SABA-DEL (concentration 1)
  • Lane 10 sample after primer extension reaction of SS-SABA-DEL (PXL-DS-SABA-DEL) (concentration 1)
  • Lane 11 DS-S
  • Polyacrylamide gel electrophoresis Gel: SuperSep (trademark) DNA 15% TBE gel (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, catalog number 190-15481)
  • Loading buffer 6x Loading Buffer (manufactured by Takara Bio Inc., catalog number 9156)
  • Electrophoresis time 50 minutes
  • Staining reagent SYBER (trademark) Green II Nucleic Acid Gel Stain (manufactured by Takara Bio Inc., catalog number 5770A)
  • Example 8 [Comparison of binder recovery efficiency of photoreactive crosslinker-modified double-stranded DEL with and without photocrosslinking reaction] ⁇ Preparation of DEL sample> Each of the five photoreactive crosslinker-modified double-stranded DELs obtained above was diluted with deionized water to prepare a 50 nM DEL sample.
  • UVP Ultraviolet Crosslinker
  • Reaction tube bottom vial for 96 holes (manufactured by Techno Lab Bossy Co., Ltd., catalog number 96-V050FB)
  • Photocrosslinking reaction solution - Salmon Sperm DNA, sheared (Invitrogen, catalog number AM9680): 1.6 ⁇ L ⁇ 1 M NaCl aqueous solution: 5.0 ⁇ L ⁇ D-PBS (-) (9 manufactured by FUJIFILM, catalog number 045-29795): 32.4 ⁇ L ⁇ Carbonic Anhydrase IX/CA9 (Sino Biology cal, catalog number 10107-H08H): 10.0 ⁇ L ⁇ 50 nM aqueous solution of various DEL samples: 1.0 ⁇ L Reaction conditions: A mixture of the CA9 protein having the above composition and the DEL solution was incubated on ice for 1 hour. A portion of the solution was then collected
  • the reaction solution after UV irradiation was mixed with dyanebeads his-tag pulldown and incubated at room temperature for 30 minutes. It was fixed on a magnetic stand, allowed to stand for 2 minutes, the supernatant was removed, and 200 ⁇ L of wash buffer was added to suspend the Dynabeads. Furthermore, this washing operation was repeated five times. 80 ⁇ L of D-PBS( ⁇ ) was added to the washed Dybabeads and allowed to react at 95° C. for 10 minutes. After the reaction, the Dynabeads were placed on a magnetic stand, and after 2 minutes the supernatant was collected (solution E).
  • Apparatus 7500 real-time PCR system (manufactured by Applied Biosystems) Plate: MicroAmp 96-well plate (manufactured by Applied Biosystems, catalog number N8010560) PCR reaction solution: ⁇ TaqMan Gene Expression Master Mix (manufactured by Applied Biosystems, catalog number 4369016): 10.0 ⁇ L - Forward primer 1 (Table 30, SEQ ID NO: 137): 1.0 ⁇ L - Reverse primer 1 (Table 30, SEQ ID NO: 138): 1.0 ⁇ L -Taqman MGB probe (manufactured by Thermo Fisher, product number 4316034, TaqMan (registered trademark) labeled with FAM (registered trademark) fluorescent dye at the 5' end of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 139 in Table 30, and NFQ and MGB at the 3' end ) probe): 0.50 ⁇ L ⁇ Aqueous solutions of various DEL samples (S, E samples)
  • Example 9 [Preparation of DEL with single-stranded DNA using Lambda Exonuclease]
  • the DEL compound "DS-Amino-BIO-DEL” having a double-stranded nucleic acid was treated with Lambda Exonuclease to convert it to a DEL compound "SS-Amino-DEL” having a single-stranded DNA according to the following procedure.
  • DS-Amino-BIO-DEL 500 pmol aqueous solution; 5 ⁇ L of 10 ⁇ Lambda Exonuclease Reaction Buffer (New England BioLabs, catalog number B0262); Grand BioLabs, catalog number M0262) was added, and deionized water was added to prepare a solution with a total volume of 50 ⁇ L. The resulting solution was incubated at 37°C for 30 minutes.
  • the MS of one oligonucleotide strand (SEQ ID NO: 132) contained in DS-Amino-BIO-DEL was not detected, and the MS of the product after single-strand formation was observed as the main peak. It was confirmed that the chain reaction was progressing.
  • Example 10 Synthesis of Photoreactive Crosslinker-Modified Double-Stranded DEL with Different Linker Structure from Photoreactive Crosslinker-Modified Double-Stranded DEL Used in Example 8] ⁇ Preparation of DEL having 5 types of single-stranded DNA>
  • Example 7 DEL compounds having five types of single-stranded DNA ("SS-AAZ-DEL”, “SS-SABA-DEL”, “SS-ClSABA-DEL”, “SS-mSABA-DEL” , and "SS-Amino-DEL” were prepared.However, in the step ⁇ Synthesis of five DEL compounds having biotin at the 3'end> described in Example 7, Pr_TAG2_CP (Example Prepared by annealing Pr_TAG2_CP_a and Pr_TAG2_CP_b synthesized in the same manner as in Example 1, the sequences are shown in Table 31), instead of the ⁇ Preparation of DEL with single-stranded DNA using streptavidin beads> step, Example 9 Preparation of DEL having single-stranded DNA was carried out in the same procedure as in. The sequence notation in Table 31 is the same as in Table 25. The name of the compound corresponding to each sequence number (No.) is They are as follows. No. 122: Pr_
  • 3-(3-methyl-3H-diazilin-3-yl)propanoic acid (5 ⁇ L, 0.2 M N,N-dimethylacetamide solution) was added to the PCR tube.
  • 1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxide hexafluorophosphate (2.5 ⁇ L, 0.4M N,N- dimethylacetamide solution), followed by N,N-diisopropylethylamine (2.5 ⁇ L, 0.4M N,N-dimethylacetamide solution), and the resulting solution was shaken at 4° C. for 10 minutes.
  • the above solution was treated with 11 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 363 ⁇ L of chilled (-20°C) ethanol and allowed to stand overnight at -78°C. After centrifugation, the supernatant was removed and the resulting pellet was air-dried. After dissolving the resulting pellet in deionized water, the solution was desalted through an Amicon® Ultra Centrifugal filter (3 kD cutoff).
  • a part of the obtained supernatant was sampled, diluted with deionized water, and subjected to mass spectrometry by ESI-MS under the analysis conditions 3 of Example 3 to obtain the desired photoreactive crosslinker.
  • a modified primer "PXL-Pr2" was identified (theoretical and detected molecular weights for each compound are shown in Table 32).
  • Table 33 The sequence notation in Table 33 is the same as in Tables 26 and 32, and the five compounds are SEQ ID NOS: 142 and 125, SEQ ID NOS: 142 and 127, and SEQ ID NOS: 142 and 129, respectively. , SEQ ID NO: 142 and SEQ ID NO: 131, and SEQ ID NO: 142 and SEQ ID NO: 133.
  • Double-stranded DEL “PXL-DS-AAZ-DEL2”, “PXL-DS-SABA-DEL2”, “PXL-DS-ClSABA-DEL2”, “PXL-DS-mSABA-DEL2”, and "PXL-DS- Amino-DEL2” was identified (compound theoretical molecular weight and detected molecular weight are shown in Table 33).
  • Lane 1 20 bp DNA ladder (manufactured by Lonza, Lonza 20 bp DNA Ladder, catalog number 50330)
  • Lane 2 SS-AAZ-DEL
  • Lane 3 sample after primer extension reaction of SS-AAZ-DEL (PXL-DS-AAZ-DEL2)
  • Lane 4 SS-SABA-DEL
  • Lane 5 sample after primer extension reaction of SS-SABA-DEL (PXL-DS-SABA-DEL2)
  • Lane 6 SS-ClSABA-DEL
  • Lane 7 sample after primer extension reaction of SS-ClSABA-DEL (PXL-DS-ClSABA-DEL2)
  • Lane 8 SS-mSABA-DEL
  • Lane 9 sample after primer extension reaction of SS-mSABA-DEL (PXL-DS-mSABA-DEL2)
  • Lane 10 SS-Amino-DEL Lane 11: Sample after SS-Amino-DEL primer extension reaction (PXL-DS-
  • DEL compound “SS-Amino-DEL3” having single-stranded DNA was prepared in the same manner as in Example 1 using an automatic nucleic acid synthesizer nS-8II (manufactured by Genedesign).
  • "SS-Amino-DEL3" uses "U-DEL12-HP" (sequence shown in Table 11) as a raw material headpiece, and the procedure is the same as the above ⁇ Preparation of DEL having 5 types of single-stranded DNA>. is the same structure as the oligonucleotide derived from Moreover, the sequence notation in Table 34 is the same as in Table 10.
  • Example 3 A part of the obtained solution was sampled, diluted with deionized water, and then subjected to mass spectrometry by ESI-MS under the conditions of analysis condition 3 in Example 3 to obtain the desired single-stranded DNA.
  • the DEL compound 'SS-AAZ-DEL3' was identified (the compound's theoretical and detected molecular weights are shown in Table 35).
  • the above solution was treated with 5.8 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 192 ⁇ L of cooled (-20° C.) ethanol and allowed to stand at -78° C. for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and the resulting pellet was air-dried.
  • the resulting pellet was dissolved in 50 mM triethylammonium acetate buffer (pH 7.5) and purified by reversed-phase HPLC using a Phenomenex Gemini C18 column. Targets were eluted using a binary mobile phase gradient profile using 50 mM triethylammonium acetate buffer (pH 7.5) and acetonitrile/500 mM triethylammonium acetate buffer (9:1, v/v). Fractions containing the desired product were collected, combined and concentrated. The obtained solution was desalted with an Amicon (registered trademark) Ultra Centrifugal filter (3 kD cutoff), ethanol precipitation was performed, and then deionized water was added to the pellet to make a solution.
  • Amicon registered trademark
  • a part of the obtained solution was sampled, diluted with deionized water, and subjected to mass spectrometry by ESI-MS under the conditions of analysis condition 3 in Example 3 to obtain the desired photoreactive crosslinker modification.
  • a primer "PXL-Pr3" was identified (theoretical and detected molecular weights of each compound are shown in Table 37).
  • DEL compounds (“PXL-DS-AAZ-DEL3”, “PXL-DS-SABA-DEL3”, “PXL-DS-ClSABA-DEL3”, “PXL-DS-mSABA-DEL3”, and “PXL-DS-Amino -DEL3”) were synthesized.
  • the sequence notation in Table 39 is the same as in Tables 34 to 37, and the five compounds are respectively SEQ ID NOS: 150 and 144, SEQ ID NOS: 150 and 145, SEQ ID NOS: 150 and 146, and the sequence It means formed by the double strands of the oligonucleotide strands of No. 150 and SEQ ID No. 147 and SEQ ID No. 150 and SEQ ID No. 143.
  • Double-stranded DEL compounds “PXL-DS-AAZ-DEL3”, “PXL-DS-SABA-DEL3”, “PXL-DS-ClSABA-DEL3”, “PXL-DS-mSABA-DEL3”, and “PXL-DS -Amino-DEL3” were identified respectively (the theoretical molecular weight of the compound and the detected molecular weight are shown in Table 39).
  • Lane 1 20 bp DNA ladder (manufactured by Lonza, Lonza 20 bp DNA Ladder, catalog number 50330)
  • Lane 2 SS-AAZ-DEL3
  • Lane 3 sample after primer extension reaction of SS-AAZ-DEL3 (PXL-DS-AAZ-DEL3)
  • Lane 4 SS-SABA-DEL3
  • Lane 5 sample after primer extension reaction of SS-SABA-DEL3 (PXL-DS-SABA-DEL3)
  • Lane 6 SS-ClSABA-DEL3
  • Lane 7 sample after primer extension reaction of SS-ClSABA-DEL3 (PXL-DS-ClSABA-DEL3)
  • Lane 8 SS-mSABA-DEL3
  • Lane 9 sample after primer extension reaction of SS-mSABA-DEL3 (PXL-DS-mSABA-DEL3)
  • Lane 10 SS-Amino-DEL3
  • Lane 11 sample after primer extension reaction of SS-Amin
  • Example 11 [Comparison of binder recovery efficiency of photoreactive crosslinker-modified double-stranded DEL synthesized in Example 10 with and without photocrosslinking reaction] ⁇ Preparation of DEL sample>
  • Four photoreactive crosslinker-modified double-stranded DELs obtained in Example 10 (PXL-DS-mSABA-DEL2, PXL-DS-Amino-DEL2, PXL-DS-mSABA-DEL3, and PXL-DS- Amino-DEL 3) was each diluted with deionized water to prepare 50 nM DEL samples.
  • UVP Ultraviolet Crosslinker
  • Microtube 1.5 mL siliconized microtube round bottom (manufactured by Watson Co., Ltd., catalog number 131-615CH)
  • Reaction tube Bottom vial for 96 holes (manufactured by Techno Lab Bossy Co., Ltd., catalog number 96-V050FB)
  • Photocrosslinking reaction solution - Salmon Sperm DNA, sheared (Invitrogen, catalog number AM9680): 1.6 ⁇ L ⁇ 1M NaCl (manufactured by FUJIFILM, catalog number 191-01665): 5.0 ⁇ L ⁇ D-PBS (-) (manufactured by FUJIFILM, catalog number 045-29795): 32.4 ⁇ L ⁇ Carbonic Anhydrase IX/CA9 (manufactured by Sino Biological, catalog number 10107-H08H): 10.0 ⁇ L ⁇ Aqueous solution
  • D-PBS(-) was added to the reaction solution after UV irradiation. The remaining solution was then mixed with the Dyanebeads his-tag pulldown and incubated for 30 minutes at room temperature. It was fixed on a magnetic stand, allowed to stand for 2 minutes, the supernatant was removed, and 200 ⁇ L of wash buffer was added to suspend the Dynabeads. Furthermore, this operation was repeated 5 times. 100 ⁇ L of Elution buffer was added to the washed Dynabeads and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. After the reaction, the Dynabeads were placed on a magnetic stand, and after 2 minutes the supernatant was collected as a sample.
  • FIG. 25 shows the result of comparing the ⁇ Ct value (difference from the Ct value of the negative control).
  • the ⁇ Ct value is small in all samples without UV irradiation, and similar to the results of Example 8, in DEL screening, when photocrosslinking reaction is not performed, moderate affinity It suggests that obtaining a sexual binder is difficult.
  • Example 12 “Photoreactive crosslinker-modified double-stranded DEL with covalent bond between crosslinker and coding sequence” and “Photoreactive crosslinker-modified double-stranded DEL with no covalent bond between crosslinker and coding sequence”] Comparison of binding agent recovery efficiency (DNA detection sensitivity) with
  • Table 40 The sequence notation in Table 40 is the same as Tables 34, 36, and 37, and the four compounds are SEQ ID NOS: 148 and 145, SEQ ID NOS: 148 and 146, and SEQ ID NO: 148, respectively. It means that it is formed by double strands of oligonucleotide strands of SEQ ID NO: 147 and SEQ ID NO: 148 and SEQ ID NO: 143.
  • UVP Ultraviolet Crosslinker
  • Microtube 1.5 mL siliconized microtube round bottom (manufactured by Watson Co., Ltd., catalog number 131-615CH)
  • Reaction tube Bottom vial for 96 holes (manufactured by Techno Lab Bossy Co., Ltd., catalog number 96-V050FB)
  • Photocrosslinking reaction solution - Salmon Sperm DNA, sheared (Invitrogen, catalog number AM9680): 1.6 ⁇ L ⁇ 1M NaCl (manufactured by FUJIFILM, catalog number 191-01665): 5.0 ⁇ L ⁇ D-PBS (-) (FUJIFILM 9, catalog number 045-29795): 32.4 ⁇ L ⁇ Carbonic Anhydrase IX/CA9 (manufactured by Sino Biological, catalog number 10107-H08H): 10.0 ⁇ L ⁇ Aqueous solution of various DEL samples (50
  • the reaction solution after UV irradiation was mixed with Dynabeads his-tag pulldown and incubated at room temperature for 30 minutes. It was fixed on a magnetic stand, allowed to stand for 2 minutes, the supernatant was removed, and 200 ⁇ L of wash buffer was added to suspend the Dynabeads. Furthermore, this operation was repeated 5 times. 100 ⁇ L of Elution buffer was added to the washed Dynabeads and allowed to react at room temperature for 10 minutes. After the reaction, the Dynabeads were placed on a magnetic stand, and after 2 minutes the supernatant was collected as a sample.
  • FIG. 26 shows the result of comparing the ⁇ Ct value (difference from the Ct value of the negative control).
  • UVP Ultraviolet Crosslinker
  • Reaction tube bottom vial for 96 holes (manufactured by Techno Lab Bossy Co., Ltd., catalog number 96-V050FB)
  • Photocrosslinking reaction solution - Salmon Sperm DNA, sheared (Invitrogen, catalog number AM9680): 1.6 ⁇ L ⁇ 1M NaCl (manufactured by FUJIFILM, catalog number 191-01665): 5.0 ⁇ L ⁇ D-PBS (-) (FUJIFILM 9, catalog number 045-29795): 39.4 ⁇ L ⁇ Carbonic Anhydrase IX/CA9 (manufactured by Sino Biological, catalog number 10107-H08H): 3.0 ⁇ L ⁇ Aqueous solution of various DEL samples (50 nM): 1.0 ⁇ L Reaction conditions: A mixture of the CA9 protein having the above composition and the DEL solution was incuba
  • the reaction solution after UV irradiation was mixed with Dynabeads his-tag pulldown and incubated at room temperature for 30 minutes. It was fixed on a magnetic stand, allowed to stand for 2 minutes, then the supernatant was removed, 200 ⁇ L of wash buffer was added to suspend the Dynabeads, and reacted at 90° C. for 10 minutes. Furthermore, this operation was repeated 3 times. 30 ⁇ L of a 200 mM imidazole solution was added to the washed Dynabeads and allowed to react at room temperature for 10 minutes. After the reaction, the Dynabeads were placed on a magnetic stand, and after 2 minutes the supernatant was collected as a sample.
  • FIG. 27 shows the result of comparing the ⁇ Ct value (difference from the Ct value of the negative control).
  • the present results show that the "photoreactive crosslinker-modified double-stranded DEL having a covalent bond between the crosslinker and the coding sequence" derived from a hairpin-type DEL having a "selectively cleavable site" It is suggested that it is applicable to DEL screening under strong separation conditions and elution conditions for the purpose of removing non-specific binders and the like.
  • Example 14 [Conversion of Hairpin DNA Using U-DEL-13-HP as Raw Material to Single-Strand DNA, and Addition of New Functions] ⁇ Synthesis of DEL compound raw material headpiece (“mSABA-DEL-HP5”)> Using "mSABA-DEL-HP5" having the sequence shown in Table 41 and "U-DEL13-HP" as a starting material, Example 10 ⁇ 3 types of DEL compounds having single-stranded DNA (“SS-SABA-DEL3 ”, “SS-ClSABA-DEL3”, and “SS-mSABA-DEL3”)>. Note that the notation in Table 41 is the same as in Table 36.
  • a hairpin DEL compound (“mSABA-DEL5”) having the sequence shown in Table 42 was synthesized in the same manner as in Example 10 by double-stranded ligation of the starting headpiece “mSABA-DEL-HP5” and Pr_TAG2_CP.
  • the array notation in Table 42 is the same as in Table 36.
  • DEL compound "DS-mSABA-DEL5" was identified (theoretical and detected molecular weights for each compound are shown in Table 43).
  • Lane 1 20 bp DNA ladder (manufactured by Lonza, Lonza 20 bp DNA Ladder, catalog number 50330)
  • Lane 2 mSABA-DEL5
  • Lane 3 Sample lane 4: 20 bp DNA ladder (manufactured by Lonza, Lonza 20 bp DNA Ladder, catalog number 50330) after mSABA-DEL5 was cleaved with USER (registered trademark) enzyme.
  • the DEL compound “DS-mSABA-DEL5" having the double-stranded nucleic acid obtained above was treated with Lambda Exonuclease in the same manner as in Example 9, and the DEL compound "SS-mSABA-DEL5" having a single-stranded DNA was obtained.
  • SS-mSABA-DEL5 is the oligonucleotide chain of SEQ ID NO: 154 in Table 43.
  • a part of the obtained supernatant was sampled, diluted with deionized water, and subjected to mass spectrometry by ESI-MS under the analysis condition 3 of Example 3. A molecular weight of 23825.8 was observed. A DEL compound "SS-mSABA-DEL5" having the desired single-stranded DNA was identified.
  • a part of the obtained solution was sampled, diluted with deionized water, and subjected to mass spectrometry by ESI-MS under the conditions of analysis condition 3 in Example 3 to obtain the desired photoreactive crosslinker modification.
  • a primer "PXL-Pr5" was identified (theoretical and detected molecular weights of each compound are shown in Table 44).
  • a part of the obtained solution was sampled, diluted with deionized water, and subjected to mass spectrometry by ESI-MS under the conditions of analysis condition 3 in Example 3 to obtain the desired photoreactive crosslinker modification.
  • a double-stranded DEL "PXL-DS-mSABA-DEL5" was identified (compound theoretical and detected molecular weights are shown in Table 46).
  • Lane 1 20 bp DNA ladder (manufactured by Lonza, Lonza 20 bp DNA Ladder, catalog number 50330)
  • Lane 2 DS-mSABA-DEL5
  • Lane 3 SS-mSABA-DEL5
  • Lane 4 sample after primer extension reaction of SS-mSABA-DEL5 (PXL-DS-mSABA-DEL5)
  • Lane 5 20 bp DNA ladder (manufactured by Lonza, Lonza 20 bp DNA Ladder, catalog number 50330)
  • Example 15 [Synthesis of cross-linker-modified double-stranded DEL] ⁇ Synthesis of three types of crosslinker-modified primers (PA-Pr, TPD-Pr, ACA-Pr)> Various crosslinker-modified primers having the sequences shown in Table 47 were synthesized by the following procedure.
  • “(PA)” is the following formula (22)
  • “(TPD)” means a group represented by the following formula (23)
  • (ACA)” is the following formula (24) means a group represented by and other notations are the same as in Table 2.
  • combining each compound is as follows, respectively.
  • reaction solution was treated with 12 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 396 ⁇ L of cooled (-20°C) ethanol and allowed to stand at -78°C for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and the resulting pellet was air-dried.
  • the resulting pellet was dissolved in 50 mM triethylammonium acetate buffer (pH 7.5) and purified by reversed-phase HPLC using a Phenomenex Gemini C18 column. Targets were eluted using a binary mobile phase gradient profile using 50 mM triethylammonium acetate buffer (pH 7.5) and acetonitrile/500 mM triethylammonium acetate buffer (9:1, v/v). Fractions containing the desired product were collected, combined and concentrated. The obtained solution was desalted with an Amicon (registered trademark) Ultra Centrifugal filter (3 kD cutoff), ethanol precipitation was performed, and then deionized water was added to the pellet to make a solution.
  • Amicon registered trademark
  • reaction solution was treated with 23.6 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 778.8 ⁇ L of cooled (-20°C) ethanol and allowed to stand overnight at -78°C. After centrifugation, the supernatant was removed and the resulting pellet was air-dried. After adding 180 ⁇ L of deionized water to the pellet to make a solution, 20 ⁇ L of piperidine was added and shaken at 10° C. for 3 hours.
  • the obtained solution was treated with 20 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 660 ⁇ L of cold (-20° C.) ethanol and allowed to stand at -78° C. for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed, and 200 ⁇ L of deionized water was added to the obtained pellet to make a 1 mM solution.
  • a solution of AOP-L-Pr 40 ⁇ L, 0.5 mM in sodium phosphate buffer (125 mM, pH 9.4) cooled to 10°C was added to the PCR tube.
  • Fifty equivalents of N-succinimidyl 3-maleimidopropionate (5 ⁇ L, 0.2 M dimethylsulfoxide solution) were added to the tube, and the resulting mixture was shaken at 10° C. for 40 minutes. 20 ⁇ L of dimethylsulfoxide was then added and the resulting mixture was further shaken at 10° C. for 25 minutes.
  • reaction solution was treated with 5 ⁇ L of 5 M sodium chloride aqueous solution and 215 ⁇ L of cold (-20°C) ethanol and allowed to stand at -78°C for 30 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and the resulting pellet was air-dried. After dissolving the resulting pellet in deionized water, the solution was desalted through an Amicon® Ultra Centrifugal filter (3 kD cutoff).
  • Table 50 The sequence notation in Table 50 is the same as in Tables 26 and 47, and "TPD-DS-mSABA-DEL" is formed by two strands of the oligonucleotide strands of SEQ ID NO: 163 and SEQ ID NO: 131. indicate that
  • Example 3 A part of the obtained solution was sampled, diluted with deionized water, and subjected to mass spectrometry by ESI-MS under the analysis conditions 3 of Example 3 to obtain the desired crosslinker-modified double strand.
  • the DEL "TPD-DS-mSABA-DEL" was identified (the theoretical molecular weight of the compound and the detected molecular weight are shown in Table 50).
  • Example 3 A part of the obtained solution was sampled, diluted with deionized water, and subjected to mass spectrometry by ESI-MS under the analysis conditions 3 of Example 3 to obtain the desired crosslinker-modified double strand.
  • the DEL "ACA-DS-ClSABA-DEL" was identified (the compound's theoretical and detected molecular weights are shown in Table 51).
  • Example 16 [Synthesis of crosslinker-modified double-stranded DEL using double-stranded DEL having reactive groups for crosslinker modification] ⁇ Synthesis of a primer (“BCN-Pr”) having a reactive group for crosslinker modification> A primer “BCN-Pr” having a reactive group for crosslinker modification of the sequences shown in Table 52 was synthesized by the following procedure.
  • “(BCN)” is the following formula (27) means a group represented by and other notations are the same as in Table 2.
  • a part of the obtained solution was sampled, diluted with deionized water, and subjected to mass spectrometry by ESI-MS under the conditions of analysis condition 3 in Example 3 to determine the desired crosslinker modification.
  • a double-stranded DEL "BCN-DS-mSABA-DEL" with reactive groups was identified (compound theoretical and detected molecular weights are shown in Table 53).
  • Example 7 A part of the obtained reaction solution was sampled and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis under the conditions shown in Example 7. From the results shown in FIG. 31, it was confirmed that the primer extension reaction resulted in conversion to "BCN-DS-mSABA-DEL" at a high yield.
  • the samples for each lane in FIG. 31 are as follows. Samples were prepared so that the loading amount of each DEL compound was approximately 40 ng.
  • Lane 1 20 bp DNA ladder (manufactured by Lonza, Lonza 20 bp DNA Ladder, catalog number 50330)
  • Lane 2 SS-mSABA-DEL
  • Lane 3 sample after primer extension reaction of SS-mSABA-DEL (BCN-DS-mSABA-DEL)
  • Lane 4 20 bp DNA ladder (manufactured by Lonza, Lonza 20 bp DNA Ladder, catalog number 50330)
  • BCN-DS-mSABA-DEL solution (2 ⁇ L, 0.1 mM) in sodium phosphate buffer (250 mM, pH 7.0) was added to the PCR tube, followed by 1.8 ⁇ L of dimethylsulfoxide. After that, 0.2 ⁇ L of the diluted solution obtained above was added, and the obtained solution was shaken at 25° C. for 2 hours.
  • BCN-DS-mSABA-DEL solution (2 ⁇ L, 0.1 mM) in sodium phosphate buffer (250 mM, pH 7.0) was added to the PCR tube, followed by 1.8 ⁇ L of dimethylsulfoxide. After that, 0.2 ⁇ L of the diluted solution obtained above was added, and the obtained solution was shaken at 25° C. for 2 hours.
  • Example 17 [Conversion of Model Library Using U-DEL9-HP as Raw Material to Single-Strand DNA, and Addition of New Functions] ⁇ Conversion of model library to DEL compound having single-stranded DNA using Lambda Exonuclease> Using the sample (synthesized in Example 6) after the cleavage reaction of the model library with USER (registered trademark) enzyme, the model library was converted to a DEL compound having single-stranded DNA in the same manner as in Example 9. bottom. The obtained solution was used as a starting material for the next step.
  • Lane 1 20 bp DNA ladder (manufactured by Lonza, Lonza 20 bp DNA Ladder, catalog number 50330)
  • Lane 2 After cleavage reaction of model library with USER (registered trademark) enzyme
  • Sample lane 3 Sample lane after single-strand DEL conversion reaction with Lambda
  • Exonuclease of model library 4 Single-strand DEL-converted model library and PXL -Sample lane 5 after primer extension reaction with Pr: Sample lane 6 after primer extension reaction between single-stranded DEL model library and BCN-Pr: 20 bp DNA ladder (manufactured by Lonza, Lonza 20 bp DNA Ladder , catalog number 50330)
  • the present invention provides methods utilizing nucleic acid compounds containing selectively cleavable sites. Furthermore, the present invention provides a method for inducing a DEL containing a cleavable site in the DNA strand to a crosslinker-modified double-stranded DEL and evaluating it. It is possible to perform compound screening that combines "expansion and improvement of evaluation methods".

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Abstract

切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に含むＤＮＡコード化ライブラリ（ＤＥＬ）を、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導し、評価する方法を提供する。　本発明は、デオキシウリジンのような切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に導入することで、ヘアピン鎖ＤＥＬと２本鎖ＤＥＬの長所を両立する。さらに本発明は、クロスリンカー修飾ＤＥＬへ簡便に誘導することで、簡便なＤＥＬ合成手法」と「ＤＥＬ評価手法の拡大・改善」とを兼ね備えた化合物スクリーニング技術を提供する。

Description

ＤＮＡコード化ライブラリの評価方法
　本発明は、ＤＮＡコード化ライブラリの評価方法に関する。
　化合物ライブラリとは、医薬品候補化合物など、特定の活性を有する可能性のある化合物を系統的に集めた化合物誘導体群である。この化合物ライブラリは、多くの場合コンビナトリアル化学の合成技術と方法論に基づき合成される。コンビナトリアル化学とは、組み合わせ論に基づいて列挙し設計された一連の化合物ライブラリを系統的な合成経路で効率的に多品種合成するための実験手法とそれに関する研究分野である。
　コンビナトリアル化学に基づく化合物ライブラリの一つの種として、ＤＮＡコード化ライブラリがある。以下、ＤＮＡコード化ライブラリを適宜ＤＥＬと略す。ＤＥＬでは、ライブラリ化された各化合物に、ＤＮＡのタグが付加される。ＤＮＡのタグは、各化合物の各構造を同定できるように配列が設計されており、化合物の標識として機能する（特許文献１乃至３）。
　これまでＤＥＬを用いたスクリーニングにより、医薬品開発において有力な化合物が複数見出されている。ＤＥＬを用いたスクリーニングは、例えば、以下のように実施される（非特許文献１乃至３）。
１）標的のタンパク質を固定化用担体に固定化する
２）標的とＤＥＬとを接触させる
３）標的との親和性の低いＤＥＬを洗浄除去する
４）標的のタンパク質を変性させ、親和性の高いＤＥＬを溶出させる
５）溶出したＤＥＬに含まれるＤＮＡ配列を増幅し、配列を特定する
　しかし、上記のようなスクリーニング手法は、いくつかの課題を有している。まず、標的となるタンパク質を固定化する必要があるため、タンパク質によっては、固定化操作後に立体構造が変化してしまう。そのような場合、スクリーニングにより得られた化合物が、目的の固定化されていない標的タンパクには結合せず、ＤＥＬの標的適応範囲が制限されることとなる（特許文献４及び５、非特許文献４及び５）。また、上記スクリーニング手法では、高い親和性の結合剤を回収できるが、中程度の親和性の結合剤（例えば、Ｋｄ値がμＭオーダーのもの）は、標的タンパク質との複合体の速度論的安定性が低く、洗浄除去後に回収することが難しい。当業者には周知であるが、このような中程度の親和性の結合剤も、創薬の起点となるヒット化合物として有用であり、また構造活性相関情報としても有益である（非特許文献６）。
　上記の課題の解決に向けた取り組みとして、最近では、クロスリンカー修飾されたＤＥＬを用いたスクリーニング手法が、複数報告されている。後に示すように、いくつかの異なる手法が報告されているが、いずれも、親和性のあるライブラリ分子と近接した標的を、クロスリンカーと反応させ、共有結合を形成させるという点で共通している。この手法によれば、標的タンパクを固定化せずとも（もしくは固定化する前に）、ＤＥＬのスクリーニングが可能となるため、有用である（特許文献４及び５、非特許文献４及び５、７乃至９）。
　ここで一度、ＤＥＬのＤＮＡ鎖構造に関して説明する。従来知られているＤＥＬのＤＮＡ鎖構造は、ヘアピン鎖と２本鎖の２つが代表的である。
　以下、２本鎖ＤＥＬとヘアピン鎖ＤＥＬの概要と長所短所について概説する。
（１）ヘアピン鎖ＤＥＬ
　ヘアピン鎖ＤＮＡをもちいるＤＥＬは、相補的な２本のＤＮＡ鎖がつながった１本鎖構造であり、種々のビルディングブロック導入のための官能基を有するヘアピン型ＤＮＡを出発原料（ヘッドピース）として用いて合成される（特許文献３、非特許文献１及び２）。
（Ａ）長所
（ａ）短いＤＮＡタグが使用できる。
　本手法では、多くの場合、２ｍｅｒの粘着末端を有する９～１３ｍｅｒ程度の比較的短い２本鎖ＤＮＡタグが使用されており、２本鎖ＤＮＡタグはＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応により導入される。このような短いＤＮＡタグの使用は、ヘアピン鎖ＤＮＡが分子内で強く二重鎖を形成し、粘着末端以外のＤＮＡ部位がＤＮＡタグと干渉しないことにより可能となっている。短い２本鎖ＤＮＡタグの使用は、ＤＥＬ合成において、いくつかの利点を有する。一つの利点として、ＤＮＡタグの合成にかかるコストが低いことが挙げられる。また、もう一つの利点として、より短いＤＮＡタグの使用は、同じ反応サイクル数をコードする場合、ＤＥＬの全長が短く抑えられることが挙げられる。すなわち、より多くのサイクル数をコードしても、次世代シーケンサーによって効率的にＤＮＡ配列を読み取り可能な範囲までＤＥＬの全長を抑えられる。実際に非特許文献３では、ヘアピン鎖ＤＮＡをもちいることにより、６サイクルもの反応をコードしたヘアピン鎖ＤＮＡをもちいたＤＥＬの構築が達成されている。
（ｂ）化学的安定性が高い
　２本鎖と異なりヘアピン鎖では、加熱反応中に二重鎖構造が融解しても、その後の再アニール条件下で、鎖交換を生じることなく、元の分子内での二重鎖が再形成される。したがって、ヘアピン鎖ＤＮＡをもちいるＤＥＬは、より広範な化学条件で使用可能という利点を有する（非特許文献２）。また、一般に核酸鎖は、同じ鎖長であればヘアピン鎖の方が２本鎖よりも強く二重鎖を形成する（Ｔｍ値が高い）。したがって、ビルディングブロック導入時の種々の化学的条件下において、ヘアピン鎖ＤＮＡの各化学構造、特に塩基部の構造は２本鎖に比べ構造変換に抵抗するはずである。
（Ｂ）短所
　ヘアピン鎖ＤＮＡは、分子内で二重鎖を形成しており、新たに別のオリゴヌクレオチド鎖と２本鎖を形成させることは困難である。したがって、新たにクロスリンカー修飾されたオリゴヌクレオチドを付与することでクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬに変換することは困難である。
（２）２本鎖ＤＥＬ
　２本鎖ＤＮＡをもちいるＤＥＬは、種々のビルディングブロック導入のための官能基を有する１本鎖ＤＮＡ（ヘアピン鎖でない１本鎖ＤＮＡ）又は２本鎖ＤＮＡを出発原料（ヘッドピース）として合成される。
（Ａ）短所
　ヘアピン鎖ＤＮＡをもちいるＤＥＬと対照的に、多くの場合、４～１０ｍｅｒの粘着末端を有する２０～３０ｍｅｒ程度の比較的長い１本鎖または２本鎖ＤＮＡタグが使用されおり（特許文献２、非特許文献１０）、３サイクル程度の反応をコードしたＤＥＬが一般的である。
（Ｂ）長所
　２本鎖ＤＮＡは変性により１本鎖ＤＮＡにすること、もしくは鎖交換反応を実施することが可能であり、様々用途に即したＤＮＡ構造に変換できる点で有利である。したがって、新たにクロスリンカー修飾された１本鎖オリゴヌクレオチドを付与することでクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへの変換も可能である（非特許文献７、８及び１１）。
　このように、ヘアピン鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡは、それぞれＤＥＬの合成時、評価時において長所を有するものの、長所を両立する技術は知られていない。
クロスリンカー修飾されたＤＥＬを用いたスクリーニングに関する報告例として、以下が知られている。
　非特許文献７及び８では、５‘末端にライブラリ分子を有する１本鎖ＤＥＬを合成し、３‘末端に光反応性クロスリンカーを有するＤＮＡと２本鎖を形成させ、スクリーニングを実施し、中程度の親和性の結合剤を取得している。一方で、本手法は、光反応性クロスリンカーと連結しているＤＮＡはコード配列を含んでいないため、非特異な結合剤の除去などのために、強い分離や溶出条件にさらすと、２本鎖が乖離し、望みの構造をコードする配列が得られなくなってしまう可能性がある。また、１本鎖ＤＥＬを使用するため、合成においてヘアピン鎖ＤＥＬの長所は活かせない手法となる。
　Ｘｉaｏｙｕ　Ｌｉらは、クロスリンカー修飾ＤＥＬを利用したスクリーニング手法を報告している（特許文献５、非特許文献４、５及び１２）。非特許文献５では、３‘末端にライブラリ分子を有する１本鎖ＤＥＬを合成し、５‘末端に光反応性クロスリンカーを有する短鎖ＤＮＡと２本鎖を形成させることで、光反応性クロスリンカー修飾ＤＥＬとしている。本手法の利点として、光反応性クロスリンカーが５‘末端に存在するため、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応によって、コード配列を標的と共有結合によって連結させる点が挙げられる。したがって、強い分離や溶出条件をスクリーニングに含めることが可能となる。しかし、３‘末端にライブラリ分子を有する１本鎖ＤＥＬを簡便に合成する手法は報告されていない。また同様に合成においてヘアピン鎖ＤＥＬの長所は活かせない手法となる。
　特許文献４は、クロスリンカーとの連結部位を有するヘアピン鎖ＤＥＬが記載されている。本手法は、上記の非特許文献５のような課題は解決しうるものの、クロスリンカー連結のための官能基を損なうことなく、ライブラリ合成を実施する必要があり、使用可能な反応、及び／またはライブラリ分子構造に制限ができてしまうという別の課題を有している。
　特許文献６では、可逆的な共有結合で架橋された２本鎖ＤＥＬ（二重鎖形成能等の観点でヘアピン鎖ＤＥＬと同等の特性を有すると考えらえる）の合成、及びクロスリンカー修飾されたＤＥＬへの変換に関して記載されている。可逆的な共有結合として、シアノビニルカルバゾール等の特殊塩基と、ピリミジン塩基との［２ ＋ ２］光環化による共有結合が開示されている。しかし、光環化されたピリミジン塩基は芳香族性を失っており、このような芳香族性を喪失したピリミジン塩基は、化学的に不安定で、塩基性条件下で分解してしまうことが知られている（非特許文献１３）。したがって、本手法ではＤＥＬ合成時に、使用可能な反応が制限され、構築可能なライブラリ分子構造も制限されてしまう。
　このように、従来のヘアピン鎖ＤＥＬと同水準で、合成面での長所を有し、且つ簡便にクロスリンカー修飾されたＤＥＬでのスクリーニングに適応可能な技術は知られていない。
国際公開第９３／２０２４３号 国際公開第２００４／０３９８２５号 国際公開第２００５／０５８４７９号 国際公開第２０１９／１４９１９８号 国際公開第２０１９／１５７６９２号 ＣＮ１１２７６０７２０
ネイチャー・ケミカル・バイオロジー、２００９年、５巻、６４７－６５４頁 Ａ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｆｏｒ　ＤＮＡ－Ｅｎｃｏｄｅｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｒｏｂｅｒｔ　Ａ．Ｇｏｏｄｎｏｗ，Ｊｒ．編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０２０年、５９巻、１８１－２４９頁、チャプター４－Ａｎ　ｏｖｅｒｖｉｅｗ　ｏｆ　ＤＮＡ－ｅｎｃｏｄｅｄ　ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｄｒｕｇ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション、２０１４年、５３巻、１００５６－１００５９頁 エーシーエス・コンビナトリアル・サイエンス、２０１９年、２１巻、３４５－３４９頁 ケムバイオケム、２０１９年、２０巻、９５５－９６２頁 エーシーエス・コンビナトリアル・サイエンス、２０２０年、２２巻、２０４－２１２頁 ケミストリー・ア・ヨーロピアン・ジャーナル、２０２１年、２７巻、７１６０－７１６７頁 アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ、２０２１年、５４巻、３４９１－３５０３頁 ネイチャー・ケミストリー、２０１８年、１０巻、４４１－４４８頁 アニューアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー、２０１８年、８７巻、４７９－５０２頁 バイオコンジュゲート・ケミストリー、２０１７年、２８巻、２２９３－２３０１頁 米国化学会誌、２０１４年、１３６巻、１２９３８－１２９４６頁
　本発明は、切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に含むＤＥＬを、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導し、評価する方法を提供する。
　ＤＮＡなどの核酸化学の一つとして核酸の切断技術がある。例えば、ＤＮＡ鎖中にデオキシウリジンを導入すると、ＵＳＥＲ（登録商標）酵素により選択的に切断することができる。
　本発明者は、鋭意研究の結果、例えばデオキシウリジンのような切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に導入することで、ヘアピン鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡの長所を両立できることを見出し、さらにクロスリンカー修飾ＤＥＬへ簡便に誘導することで上記課題を解決した。
　したがって、本発明は、以下のとおりである。
　［１］　「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＮＡコード化ライブラリ（ＤＥＬ）から誘導されたクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの評価方法であって、以下のステップ：
（１）当該ＤＥＬを、生物学的標的と、当該ＤＥＬの少なくとも１つのライブラリ分子が生物学的標的と結合するために適した条件下で接触させる、
（２）生物学的標的と結合したライブラリ分子のクロスリンカーを、生物学的標的と架橋させる、
（３）架橋されたライブラリ分子と生物学的標的との複合体を、架橋されていないライブラリ分子から分離させる、
（４）回収された複合体中のライブラリ分子が有するオリゴヌクレオチドの配列を同定する、
（５）（４）において決定された配列を使用し、生物学的標的と結合する１つ以上の化合物の構造を同定する、
により構成される方法。
　［２］　前記クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬのクロスリンカーが、コード配列を有するオリゴヌクレオチドと、共有結合を介して連結されている［１］に記載の方法。
　［３］　前記クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬのクロスリンカーが、オリゴヌクレオチドの５‘末端に直接結合するか、または２官能性スペーサーを介して結合している、［１］または［２］に記載の方法。
　［４］　クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへの誘導が、以下のステップを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
（ｉ）「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬの、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を切断し、２本鎖ＤＥＬに変換する。
（ｉｉ）（ｉ）で得られた２本鎖ＤＥＬのうち、ライブラリ分子が結合していないオリゴヌクレオチドを除去し、１本鎖ＤＥＬに変換する。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた１本鎖ＤＥＬと、クロスリンカー修飾ＤＮＡとを２本鎖形成させることで、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導する。
　［５］　クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへの誘導が、以下のステップを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
（ｉ）「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬの、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を切断し、２本鎖ＤＥＬに変換する。
（ｉｉ）（ｉ）で得られた２本鎖ＤＥＬのうち、ライブラリ分子が結合していないオリゴヌクレオチドを除去し、１本鎖ＤＥＬに変換する。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた１本鎖ＤＥＬと、クロスリンカー修飾のための反応基を有するＤＮＡとを２本鎖形成させ、
（ｉｖ）クロスリンカー修飾のための反応基と、クロスリンカーユニットとを反応させることで、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導する。
　［６］　クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへの誘導が、以下のステップを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
（ｉ）「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬの、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を切断し、２本鎖ＤＥＬに変換する。
（ｉｉ）（ｉ）で得られた２本鎖ＤＥＬのうち、ライブラリ分子が結合していないオリゴヌクレオチドを除去し、１本鎖ＤＥＬに変換する。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた１本鎖ＤＥＬに、クロスリンカー修飾プライマーを付与し、付与したプライマーを伸長させ、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導する。
　［７］　クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへの誘導が、以下のステップを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
（ｉ）「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬの、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を切断し、２本鎖ＤＥＬに変換する。
（ｉｉ）（ｉ）で得られた２本鎖ＤＥＬのうち、ライブラリ分子が結合していないオリゴヌクレオチドを除去し、１本鎖ＤＥＬに変換する。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた１本鎖ＤＥＬに、クロスリンカー修飾のための反応基を有する修飾プライマーを付与し、付与したプライマーを伸長させ、クロスリンカー修飾のための反応基を有する２本鎖ＤＥＬへ誘導し、
（ｉｖ）クロスリンカー修飾のための反応基と、クロスリンカーユニットとを反応させることで、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導する。
　［８］　クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへの誘導が、以下のステップを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
（ｉ）「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬの、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を切断し、２本鎖ＤＥＬに変換する。
（ｉｉ）（ｉ）で得られた２本鎖ＤＥＬに、クロスリンカー修飾プライマーを付与し、付与したプライマーを伸長させ、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導する。
　［９］　クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへの誘導が、以下のステップを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
（ｉ）「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬの、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を切断し、２本鎖ＤＥＬに変換する。
（ｉｉ）（ｉ）で得られた２本鎖ＤＥＬに、クロスリンカー修飾のための反応基を有する修飾プライマーを付与し、付与したプライマーを伸長させ、クロスリンカー修飾のための反応基と、クロスリンカーユニットとを反応させることで、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導する。
　［１０］　以下を特徴とする［６］または［８］に記載の方法。
（Ｉ）少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」が、ライブラリ分子が結合している部位より３‘方向に存在するヘアピン型ＤＥＬを用いる。
（ＩＩ）クロスリンカーが、オリゴヌクレオチドの５‘末端に直接結合するか、または２官能性スペーサーを介して結合しているクロスリンカー修飾プライマーを用いる。
　［１１］　以下を特徴とする［７］または［９］に記載の方法。
（Ｉ）少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」が、ライブラリ分子が結合している部位より３‘方向に存在するヘアピン型ＤＥＬを用いる。
（ＩＩ）クロスリンカー修飾のための反応基が、オリゴヌクレオチドの５‘末端に直接結合するか、または２官能性スペーサーを介して結合しているクロスリンカー修飾のための反応基を有する修飾プライマーを用いる。
　［１２］　前記（ｉｉ）のステップにおいて、ライブラリ分子が結合していないオリゴヌクレオチドが、機能性分子を有し、該機能性分子の機能に応じた処理により除去される、［４］～［７］のいずれかに記載の方法。
　［１３］　機能性分子がビオチンである、［１２］に記載の方法。
　［１４］　前記（ｉｉ）のステップにおいて、ライブラリ分子が結合していないオリゴヌクレオチドの除去が、エキソヌクレアーゼによる分解である、［４］～［７］のいずれかに記載の方法。
　［１５］　エキソヌクレアーゼが、ラムダエキソヌクレアーゼである、［１４］に記載の方法。
　［１６］　クロスリンカーが、アジド基、ジアジリン基、スルホニルフルオリド基、ジアゾ基、シンナモイル基、またはアクリレート基を少なくとも一つ含む、［１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
　［１７］　クロスリンカーが、アジド基、ジアジリン基、またはスルホニルフルオリド基を少なくとも一つ含む、［１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
　［１８］　クロスリンカーが、式（ＡＡ）～（ＡＥ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（式中、＊は２本鎖ＤＥＬの５‘末端、もしくは該５‘末端と結合している２官能性スペーサー側との結合位置を意味する）
のいずれかの構造を含む、［１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
　［１９］　クロスリンカーが、式（ＡＡ）～（ＡＥ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（式中、＊は２本鎖ＤＥＬの５‘末端、もしくは該５‘末端と結合している２官能性スペーサー側との結合位置を意味する）
のいずれかの構造である、［１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
　［２０］　クロスリンカーが、式（ＢＡ）または（ＢＢ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（式中、＊は２本鎖ＤＥＬの５‘末端、もしくは該５‘末端と結合している２官能性スペーサー側との結合位置を意味する）
のいずれかの構造を含む、［１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
　［２１］　クロスリンカーが、式（ＢＡ）または（ＢＢ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（式中、＊は２本鎖ＤＥＬの５‘末端、もしくは該５‘末端と結合している２官能性スペーサー側との結合位置を意味する）
のいずれかの構造である、［１］～［１５］のいずれかに記載の方法。
［２２］　クロスリンカー修飾のための反応基が、クリック反応のための反応基である、［５］、［７］、［９］または［１１］のいずれかに記載の方法。
［２３］　クロスリンカー修飾のための反応基が、アルキニル基、アルケニル基、アジドを基またはテトラジニル基である、［５］、［７］、［９］または［１１］に記載の方法。
［２４］　クロスリンカー修飾のための反応基が、式（ＣＡ）～（ＣＬ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（式中、＊は２本鎖ＤＥＬの５’末端、もしくは５’末端と結合している２官能性スペーサー側との結合位置を意味する）
のいずれかの構造である、［５］、［７］、［９］または［１１］に記載の方法。
　［２５］　（２）の「生物学的標的と結合したライブラリ分子のクロスリンカーを、生物学的標的と架橋させる」工程が、「生物学的標的と結合したライブラリ分子のクロスリンカーを、光照射により生物学的標的と架橋させる」工程である、［１］～［１９］のいずれかに記載の方法。
　［２６］　光照射の条件が、波長２５０～５００ｎｍの光照射である、［２５］に記載の方法。
　［２７］　光照射の条件が、波長３６５ｎｍの光照射である、［２５］に記載の方法。
　［２８］　光照射の条件が、１０秒～１８０分間の光照射である、［２５］～［２７］のいずれかに記載の方法。
　［２９］　光照射の条件が、３０秒～３０分間の光照射である、［２５］～［２７］のいずれかに記載の方法。
　［３０］　（２）の「生物学的標的と結合したライブラリ分子のクロスリンカーを、生物学的標的と架橋させる」工程が、「生物学的標的と結合したライブラリ分子のクロスリンカーを、インキュベーションにより生物学的標的と架橋させる」工程である、［１］～［２４］のいずれかに記載の方法。
　［３１］
　（３）の「架橋されたライブラリ分子と生物学的標的との複合体を、架橋されていないライブラリ分子から分離させる」工程が、「架橋されたライブラリ分子と生物学的標的との複合体を、架橋されていないライブラリ分子から電気泳動により分離させる」工程である、［１］～［３０］のいずれかに記載の方法。
　［３２］　電気泳動が、ゲル電気泳動である、［３１］に記載の方法。
　［３３］　電気泳動が、キャピラリー電気泳動である、［３１］に記載の方法。
　［３４］　（３）の「架橋されたライブラリ分子と生物学的標的との複合体を、架橋されていないライブラリ分子から分離させる」工程が、「架橋されたライブラリ分子と生物学的標的との複合体を、生物学的標的の固定化用担体への固定化と、架橋されていないライブラリ分子の洗浄除去により分離させる」である、［１］～［３０］のいずれかに記載の方法。
　［３５］　「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬが、式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（式中、
ＸおよびＹは、オリゴヌクレオチド鎖であり、
ＥおよびＦは、それぞれ独立して
ヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ただし、ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＬＰは、ループ部位であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、反応性官能基由来の２価の基であり、
Ｓｐは、結合又は２官能性スペーサーであり、
Ａｎは、少なくとも１つのビルディングブロックにより構成される部分構造である。）
で表される化合物であり、
ＸとＹは、少なくとも一部で二重鎖を形成しうる配列を有し、
Ｘは５‘末端でＥに結合し、
Ｙは３‘末端でＦに結合し、
Ｅ、Ｆ、又はＬＰの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有する。）
で表されるＤＥＬである、
［１］～［３４］のいずれかに記載の方法。
　［３６］　「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬが、式（ＩＩＩ）
Ａｎ－Ｓｐ－Ｃ－Ｂｎ　（ＩＩＩ）
（式中、
ＡｎおよびＳｐは、［３５］と同じ意味を表し、
Ｂｎは、オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとで形成される２本鎖オリゴヌクレオチドタグを表し、
Ｃは、式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（式中、Ｅ、ＬＰ、Ｌ、ＤおよびＦは、［３５］と同じ意味を表し、ただし、ＤはＡｎと直接結合するか、または２官能性スペーサーを介して結合し、ＥとＦとは２本鎖オリゴヌクレオチドタグＢｎのそれぞれ対応する末端側に結合する。）
で表されるＤＥＬである、
［３５］に記載の方法。
　［３７］　Ａｎが、［３５］と同じであり、かつ、ｎ個のビルディングブロックα１～αｎ（ｎは、１～１０の整数である。）により構築される部分構造であり、
Ｂｎが、オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとで形成される２本鎖オリゴヌクレオチドタグであり、かつ、Ａｎの構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む部分構造である、
［３５］又は［３６］に記載の方法。
　［３８］　ＬＰが、
（ＬＰ１）ｐ－ＬＳ－（ＬＰ２）ｑで表されるループ部位であり、
ＬＳは、以下の（Ａ）ないし（Ｃ）に記載される化合物群から選ばれる部分構造であり、
（Ａ）ヌクレオチド
（Ｂ）核酸アナログ
（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基
ＬＰ１は、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｐ個選ばれる各部分構造であり、
（１）ヌクレオチド
（２）核酸アナログ
ＬＰ２は、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｑ個選ばれる各部分構造であり、
（１）ヌクレオチド
（２）核酸アナログ
ｐとｑの総数が０～４０である、
［３５］～［３７］のいずれかに記載の方法。
　［３９］　ｐとｑの総数が２～２０である、［３８］に記載の方法。
　［４０］　ｐとｑの総数が２～１０である、［３８］に記載の方法。
　［４１］　ｐとｑの総数が２～７である、［３８］に記載の方法。
　［４２］　ｐとｑの総数が０である、［３８］に記載の方法。
　［４３］　ＬＰ１、ＬＰ２およびＬＳが、それぞれ以下の構造： 
（Ａ）ヌクレオチド
または
（Ｂ）以下の（Ｂ１１）から（Ｂ１５）を要件とする核酸アナログ
　（Ｂ１１）リン酸（または相当部位）および水酸基（またはその相当部位）を有する、
　（Ｂ１２）炭素、水素、酸素、窒素、リン又は硫黄により構成される、
　（Ｂ１３）分子量が１４２から１５００である、
　（Ｂ１４）残基間原子数が３～３０である、
　（Ｂ１５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合であるか、または１乃至２つの二重結合を含み残りは単結合である、
から単独もしくは異なって選ばれる構造である、［３８］～［４２］のいずれかに記載の方法。
　［４４］　ＬＰ１、ＬＰ２およびＬＳが、それぞれ以下の構造： 
（Ａ）ヌクレオチド
または
（Ｂ）以下の（Ｂ２１）から（Ｂ２５）を要件とする核酸アナログ
　（Ｂ２１）リン酸および水酸基を有する、
　（Ｂ２２）炭素、水素、酸素、窒素又はリンにより構成される、
　（Ｂ２３）分子量が１４２から１０００である、
　（Ｂ２４）残基間原子数が３～１５である、
　（Ｂ２５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合である、
から単独もしくは異なって選ばれる構造である、［３８］～［４３］のいずれかに記載の方法。
　［４５］　ＬＰ１、ＬＰ２およびＬＳが、それぞれ以下の構造： 
（Ａ）ヌクレオチド
または
（Ｂ）以下の（Ｂ３１）から（Ｂ３５）を要件とする核酸アナログ
　（Ｂ３１）リン酸および水酸基を有する、
　（Ｂ３２）炭素、水素、酸素、窒素又はリンにより構成される、
　（Ｂ３３）分子量が１４２から７００である、
　（Ｂ３４）残基間原子数が４～７である、
　（Ｂ３５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合である、
から単独もしくは異なって選ばれる構造である［３８］～［４４］のいずれかに記載の方法。
　［４６］　ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれ以下： 
（Ｂ４１）d-Spacer、
（Ｂ５）ポリアルキレングリコールリン酸エステル
のいずれかである、［３８］～［４５］のいずれかに記載の方法。
　［４７］　ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれジエチレングリコールリン酸エステルまたはトリエチレングリコールリン酸エステルである、［３８］～［４６］のいずれかに記載の方法。
　［４８］　ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれトリエチレングリコールリン酸エステルである、［３８］～［４７］のいずれかに記載の方法。
　［４９］　ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれd-Spacerである、［３８］～［４６］のいずれかに記載の方法。
　［５０］　ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれヌクレオチドである、［３８］～［４５］のいずれかに記載の方法。
　［５１］　ＬＳが、式（ａ）～式（ｇ）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
（式中、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味し、Ｒは、水素原子またはメチル基である。）
のいずれかである、［３８］～［５０］のいずれかに記載の方法。
　［５２］　ＬＳが、式（ｈ）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
（式中、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味する）
である、［３８］～［５０］のいずれかに記載の方法。
　［５３］　ＬＳが、ポリアルキレングリコールリン酸エステルである、［３８］～［５０］のいずれかに記載の方法。
　［５４］　ＬＳが、式（ｉ）～式（ｋ）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　（式中、ｎ１、ｍ１、ｐ１、及びｑ１はそれぞれ独立して、１～２０の整数であり、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味する。）
である、［３８］～［５０］のいずれかに記載の方法。
　［５５］　ＬＳが、式（ｌ）： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
（式中、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味する）
である、［３８］～［５０］いずれかに記載の方法。
　［５６］　ＬＳが、（Ｂ４２）、（Ｂ４３）又は（Ｂ４４）：
（Ｂ４２）Amino C6 dT
（Ｂ４３）mdC（TEG-Amino）
（Ｂ４４）Uni-Link（商標登録）Amino Modifier　
のいずれかである、［３８］～［５０］のいずれかに記載の方法。
　［５７］　ＬＳが、ヌクレオチドである、［３８］～［５０］のいずれかに記載の方法。
　［５８］　ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造： 
（１）置換基を有しても良く、１～３個のヘテロ原子で置き換えられても良いＣ１～１０脂肪族炭化水素、
（２）置換基を有してもよいＣ６～１４芳香族炭化水素、
（３）置換基を有してもよいＣ２～９芳香族複素環、　または
（４）置換基を有してもよいＣ２～９非芳香族複素環
のいずれかである、［３８］～［４２］及び［４６］～［５０］のいずれかに記載の方法。
　［５９］　ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造： 
（１）置換基を有しても良いＣ１～６脂肪族炭化水素、
（２）置換基を有しても良いＣ６～１０芳香族炭化水素、または
（３）置換基を有してもよいＣ２～５芳香族複素環
のいずれかである［３８］～［４２］及び［４６］～［５０］のいずれかに記載の方法。
　［６０］　ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造： 
（１）Ｃ１～６脂肪族炭化水素、
（２）ベンゼン、または
（３）Ｃ２～５含窒素芳香族複素環
　ここで、前記（１）～（３）は無置換であるか、または置換基群ＳＴ１から単独もしくは異なって選ばれる１～３個の置換基で置換されてもよく、置換基群ＳＴ１は、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルコキシ基、フッ素原子および塩素原子により構成される群であり、ただし、置換基群ＳＴ１が脂肪族炭化水素に置換する場合、置換基群ＳＴ１からアルキル基は選択されない、
のいずれかである［３８］～［４２］及び［４６］～［５０］のいずれかに記載の方法。
　［６１］　ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造： 
（１）Ｃ１～６アルキル基、または
（２）無置換であるか１つまたは２つのＣ１～３アルキル基若しくはＣ１～３アルコキシ基で置換されたベンゼン
のいずれかである［３８］～［４２］及び［４６］～［５０］のいずれかに記載の方法。
　［６２］　ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造： 
（１）Ｃ１～６アルキル基
である、［３８］～［４２］及び［４６］～［５０］のいずれかに記載の方法。
　［６３］　ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ＥおよびＦの鎖長が、それぞれ３乃至４０である、
［３５］～［６２］のいずれかに記載の方法。
　［６４］　ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ＥおよびＦの鎖長が、それぞれ４乃至３０である
［３５］～［６３］のいずれかに記載の方法。
　［６５］　ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ＥおよびＦの鎖長が、それぞれ６乃至２５である
［３５］～［６４］のいずれかに記載の方法。
　［６６］
　ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＥとＦの二重鎖オリゴヌクレオチドが突出末端である、
［３５］～［６５］のいずれかに記載の方法。
　［６７］　前記突出末端の突出部が、２塩基以上の長さである、［６６］に記載の方法。
　［６８］　ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＥとＦの二重鎖オリゴヌクレオチドが平滑末端である、
［３５］～［６５］のいずれかに記載の方法。
　［６９］　ＥとＦに含まれる、互いに相補的な塩基配列の鎖長が、それぞれ３塩基以上 である［３５］～［６８］のいずれかに記載の方法。
　［７０］　ＥとＦに含まれる、互いに相補的な塩基配列の鎖長が、それぞれ４塩基以上である［３５］～［６９］のいずれかに記載の方法。
　［７１］　ＥとＦに含まれる、互いに相補的な塩基配列の鎖長が、それぞれ６塩基以上である［３５］～［７０］のいずれかに記載の方法。
　［７２］　ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチドにより構成されるオリゴマーである、［３５］～［７１］のいずれかに記載の方法。
　［７３］　ヌクレオチドが、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである［３５］～［７２］のいずれかに記載の方法。
　［７４］　ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである［３５］～［７３］のいずれかに記載の方法。
　［７５］　ヌクレオチドが、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、又はデオキシシチジンである［３５］～［７４］のいずれかに記載の方法。
　［７６］　ＥおよびＦが、それぞれ独立して核酸アナログにより構成されるオリゴマーである、［３５］～［７１］のいずれかに記載の方法。
　［７７］　Ｌが、
（１）置換基を有しても良く、１～３個のヘテロ原子で置き換えられても良いＣ１～２０脂肪族炭化水素、
又は
（２）置換基を有してもよいＣ６～１４芳香族炭化水素
である、［３５］～［７６］のいずれかに記載の方法。
　［７８］　Ｌが、置換基を有しても良いＣ１～６脂肪族炭化水素、１若しくは２個の酸素原子で置き換えられても良いＣ１～６脂肪族炭化水素、又は置換基を有しても良いＣ６～１０芳香族炭化水素である、［３５］～［７７］のいずれかに記載の方法。
　［７９］　Ｌが、置換基群ＳＴ１で置換可能なＣ１～６脂肪族炭化水素、又は置換基群ＳＴ１で置換可能なベンゼンであり、ここで、置換基群ＳＴ１は、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルコキシ基、フッ素原子および塩素原子により構成される群である（ただし、置換基群ＳＴ１が脂肪族炭化水素に置換する場合、置換基群ＳＴ１からアルキル基は選択されない。）、［３５］～［７８］のいずれかに記載の方法。
　［８０］　Ｌが、Ｃ１～６アルキル基、又は無置換であるか１つまたは２つのＣ１～３アルキル基若しくはＣ１～３アルコキシ基で置換されたベンゼンである、［３５］～［７９］のいずれかに記載の方法。
　［８１］　Ｌが、Ｃ１～６アルキル基である、［３５］～［８０］のいずれかに記載の方法。
　［８２］　Ｄの反応性官能基が、
Ｃ―Ｃ、アミノ、エーテル、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホンアミド、又はスルホニル結合を構成しうる反応性官能基である、［３５］～［８１］のいずれかに記載の方法。
　［８３］　Ｄの反応性官能基が、脱離基を有するＣ１炭化水素、アミノ基、水酸基、カルボニル基の前駆体、チオール基、又はアルデヒド基である、［３５］～［８２］のいずれかに記載の方法。
　［８４］　Ｄの反応性官能基が、ハロゲン原子を有するＣ１炭化水素、スルホン酸系脱離基を有するＣ１炭化水素、アミノ基、水酸基、カルボキシ基、ハロゲン化カルボキシ基、チオール基、又はアルデヒド基である、［３５］～［８３］のいずれかに記載の方法。
　［８５］　Ｄの反応性官能基が、－ＣＨ２Ｃｌ、－ＣＨ２Ｂｒ、－ＣＨ２ＯＳＯ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＯＳＯ２ＣＦ３、アミノ基、水酸基、又はカルボキシ基である、［３５］～［８４］のいずれかに記載の方法。
　［８６］　Ｄの反応性官能基が、第１級アミノ基である、［３５］～［８５］のいずれかに記載の方法。
　［８７］　選択的に切断可能な部位が、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、及びデオキシシチジンのいずれでもないデオキシリボヌクレオシドである、
［３５］～［８６］のいずれかに記載の方法。
　［８８］　選択的に切断可能な部位が、デオキシウリジン、ブロモデオキシウリジン、デオキシイノシン、８-ヒドロキシデオキシグアノシン、３－メチル－２’－デオキシアデノシン、Ｎ６－エテノ－２’－デオキシアデノシン、７－メチル－２’－デオキシグアノシン、２’－デオキシキサントシン、又は５，６－ジヒドロキシ－５，６ジヒドロデオキシチミジンである、［３５］～［８７］のいずれかに記載の方法。
　［８９］　選択的に切断可能な部位が、デオキシウリジン、又はデオキシイノシンである、［３５］～［８８］のいずれかに記載の方法。
　［９０］
　選択的に切断可能な部位が、デオキシウリジンである、［３５］～［８９］のいずれかに記載の方法。
　［９１］　選択的に切断可能な部位が、デオキシイノシンである、［３５］～［８９］のいずれかに記載の方法。
　［９２］
　選択的に切断可能な部位が、デオキシイノシンから３‘方向に２番目のホスホジエステル結合である、［３５］～［８６］のいずれかに記載の方法。
　［９３］　選択的に切断可能な部位が、リボヌクレオシドである、［３５］～［８６］のいずれかに記載の方法。
　［９４］　選択的に切断可能な部位が、１つである、［３５］～［９３］のいずれかに記載の方法。
　［９５］　少なくとも１つの切断可能な部位を、Ｅ又は（ＬＰ１）ｐに含み、かつ少なくとも１つの切断可能な部位を、Ｆ又は（ＬＰ２）ｑに含む、［３５］～［９３］のいずれかに記載の方法。
　［９６］　Ｅ又は（ＬＰ１）ｐに含まれる切断可能な部位と、Ｆ又は（ＬＰ２）ｑに含まれる切断可能な部位が異なる条件で切断可能である、
［９５］に記載の方法。
　［９７］　Ａｎが、ｎ個のビルディングブロックα１～αｎ（ｎは、１～１０の整数である。）により構築される部分構造である、
［３５］～［９６］のいずれかに記載の方法。
　［９８］　Ａｎが、低分子有機化合物である、［３５］～［９７］のいずれかに記載の方法。
　［９９］　Ａｎのビルディングブロックが、分子量５００以下の化合物である、［３５］～［９８］のいずれかに記載の方法。
　［１００］　Ａｎのビルディングブロックが、分子量３００以下の化合物である、［３５］～［９９］のいずれかに記載の方法。
　［１０１］　Ａｎのビルディングブロックが、分子量１５０以下の化合物である、［３５］～［１００］のいずれかに記載の方法。
　［１０２］　Ａｎが、Ｈ、Ｂ、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる元素群より単独又は異なって選ばれる元素により構成される有機化合物である、［３５］～［１０１］のいずれかに記載の方法。
　［１０３］　Ａｎが、アリール基、非芳香族シクリル基、ヘテロアリール基及び非芳香族ヘテロシクリル基からなる置換基群より単独又は異なって選ばれる置換基を有する低分子有機化合物である、［３５］～［１０２］のいずれかに記載の方法。
　［１０４］　Ａｎが、分子量５０００以下である、［３５］～［１０３］のいずれかに記載の方法。
　［１０５］　Ａｎが、分子量８００以下である、［３５］～［１０４］のいずれかに記載の方法。
　［１０６］　Ａｎが、分子量５００以下である、［３５］～［１０５］のいずれかに記載の方法。
　［１０７］　Ａｎが、ポリペプチドである、［３５］～［９７］のいずれかに記載の方法。
　［１０８］　Ｓｐが２官能性スペーサーである、［３５］～［１０７］のいずれかに記載の方法。
　［１０９］　２官能性スペーサーが、それぞれＳｐＤ－ＳｐＬ－ＳｐＸであり、
ＳｐＤが、Ｃ―Ｃ、アミノ、エーテル、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホンアミド、又はスルホニル結合を構成しうる反応性基由来の２価の基であり、
ＳｐＬが、ポリアルキレングリコール、ポリエチレン、任意にヘテロ原子で置き換えられても良いＣ１～２０脂肪族炭化水素、ペプチド、オリゴヌクレオチド、またはこれらの組み合わせあり、
ＳｐＸが、アミノ、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、又はスルホンアミド結合を形成する反応基由来の２価の基である、［１］～［１０７］のいずれかに記載の方法。
　［１１０］　２官能性スペーサーが、それぞれＳｐＤ－ＳｐＬ－ＳｐＸであり、
ＳｐＤが、第一級アミノ基由来の２価の基であり、
ＳｐＬが、ポリエチレングリコール、またはポリエチレンであり、
ＳｐＸが、カルボキシ基由来の２価の基である、
［１］～［１０７］のいずれかに記載の方法。
　［１１１］　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、二重鎖を形成可能な配列である、［３５］～［１１０］のいずれかに記載の方法。
　［１１２］　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、相補的な塩基配列を含む、［３５］～［１１１］のいずれかに記載の方法。
　［１１３］　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、それぞれ１～２００塩基の長さである、［３５］～［１１２］のいずれかに記載の方法。
　［１１４］　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、それぞれ３～１５０塩基の長さである、［３５］～［１１３］のいずれかに記載の方法。
　［１１５］　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、それぞれ３０～１５０塩基の長さである、［３５］～［１１４］のいずれかに記載の方法。
　［１１６］　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、平滑末端を有する、［３５］～［１１５］のいずれかに記載の方法。
　［１１７］　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、突出末端を有する、［３５］～［１１５］のいずれかに記載の方法。
　［１１８］　突出末端の突出部が、１～３０塩基の長さである、［１１７］に記載の方法。
　［１１９］　突出末端の突出部が、２～５塩基の長さである、［１１７］又は［１１８］に記載の方法。
　［１２０］　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、突出末端を有し、当該突出末端に、さらに特定分子識別配列が結合する、［１１７］～［１１９］のいずれかに記載の方法。
　［１２１］　ＸおよびＹのいずれか一方に、機能性分子が結合した、［３５］～［１２０］のいずれかに記載の方法。
　［１２２］　ＸおよびＹのいずれか一方に、ビオチンが結合した、［３５］～［１２０］のいずれかに記載の方法。
　［１２３］　Ｓｐが結合である、［３５］～［１０７］のいずれかに記載の方法。
　本発明では、切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に含むＤＥＬを、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導し、評価する方法を提供する。すなわち、従来よりも、「簡便なＤＥＬ合成手法」と「ＤＥＬ評価手法の拡大・改善」とを兼ね備えた化合物スクリーニング技術を提供する。したがって、本発明によれば、医薬品、農薬、医療材料開発において有用なヒット化合物を取得できる機会が拡大される。
様式１の例示的なＤＥＬ製造方法を示す。切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に含む第１のオリゴヌクレオチド鎖、ループ部位および第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むヘッドピースを出発原料とし、ビルディングブロックの結合と、該ビルディングブロックに対応するオリゴヌクレオチドタグの２本鎖ライゲーションとを繰り返し（図１では３回）、さらに所望によりプライマー領域を含むオリゴヌクレオチドタグの２本鎖ライゲーションをすることによって、ＤＥＬの製造が達成される。 様式１の例示的なＤＥＬの使用方法を示す。切断可能な部位をヘッドピースの第１のオリゴヌクレオチド鎖中に含むＤＥＬに対し、酵素などの切断手段を用いて切断可能な部位を切断し、ループ部位で結合されていない２本鎖オリゴヌクレオチドへと誘導することで、高い効率でＰＣＲを行うことができる。 様式２の例示的なＤＥＬの使用方法を示す。切断可能な部位をヘッドピースの第２のオリゴヌクレオチド鎖中に含むＤＥＬに対し、酵素などの切断手段を用いて切断可能な部位を切断し、ループ部位で結合されていない２本鎖オリゴヌクレオチドへと誘導することで、高い効率でＰＣＲを行うことができる。 様式３の例示的なＤＥＬの使用方法を示す。切断可能な部位をヘッドピースの第１のオリゴヌクレオチド鎖中および第２のオリゴヌクレオチド鎖中に含むＤＥＬに対し、酵素などの切断手段を用いて切断可能な部位の双方を切断し、ループ部位が結合していない２本鎖オリゴヌクレオチドへと誘導することで、高い効率でＰＣＲを行うことができる。 様式４の例示的なＤＥＬの使用法を示す。互いに異なる２種の切断可能な部位をヘッドピースの第１のオリゴヌクレオチド鎖中および第２のオリゴヌクレオチド鎖中に含むＤＥＬに対し、切断条件を選択することで、第１のオリゴヌクレオチド鎖中または第２のオリゴヌクレオチド鎖の一方を選択的に切断することができる。 様式５の例示的なＤＥＬの使用法を示す。ＤＮＡタグの末端近くに切断可能な部位を設け、所望に応じて当該部位を切断することで、新たな突出末端を生成することができる。当該突出末端は粘着末端として利用して、所望の核酸配列、例えばＵＭＩｓ（特定分子識別配列）などをライゲートすることができ、新たな機能を付与することができる。 様式６の例示的なＤＥＬの使用法を示す。本発明では、切断可能な部位と、修飾基や機能性分子を組み合わせて使用することでき、例えば、ヘアピン鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変換したＤＥＬを調製することが可能である。例えば、合成されたＤＥＬ化合物に対し、３‘末端に機能性分子（例えばビオチン）を有する２本鎖オリゴヌクレオチド鎖をライゲートし（Ａ）、切断可能な部位を切断し（Ｂ）、機能性分子の機能に応じた処理を加える（Ｃ）。例えば機能性分子がビオチンの場合、ビオチン親和性を有するストレプトアビジンビーズなどを用い、ビオチンが結合したオリゴヌクレオチド鎖を選択的に系中から除去する。それにより、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬを取得することが可能である。 様式６で取得したＤＥＬの例示的な使用法を示す。様式６で取得した１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬは、所望の機能部位を有する修飾オリゴヌクレオチド（例えば光反応性クロスリンカーなどのクロスリンカー修飾ＤＮＡ）と２本鎖を形成させることで、新たな機能を付与することが可能となる。 様式７の例示的なＤＥＬの使用法を示す。本発明では、切断可能な部位を利用し、クロスリンカーを導入することができる。合成されたＤＥＬ化合物に対し、切断可能な部位を切断し（Ａ）、修飾プライマーを付与し（Ｂ）、付与したプライマーをもとに、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物を合成することができる（Ｃ）。クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物は、ＤＥＬライブラリのスクリーニングにおいて検出感度を顕著に向上させることができる（非特許文献７，１１など参照）。 実施例１において、デオキシウリジンを含むヘアピン型ＤＥＬの部分構造（Ｕ－ＤＥＬ１－ｓｈ、Ｕ－ＤＥＬ２－ｓｈ、Ｕ－ＤＥＬ３－ｓｈ、Ｕ－ＤＥＬ４－ｓｈ、Ｕ－ＤＥＬ５－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ６－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ７－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ、及びＵ－ＤＥＬ１０－ＨＰの１０種）のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の検証を実施した際の、各インキュベーション時間における切断反応の転化率を表したグラフである。 実施例２、３、４、５、及び７において、各種ヘアピンＤＥＬ（Ｕ－ＤＥＬ１、Ｕ－ＤＥＬ２、Ｕ－ＤＥＬ４、Ｕ－ＤＥＬ７、Ｕ－ＤＥＬ８、Ｕ－ＤＥＬ９、Ｕ―ＤＥＬ１０、Ｈ－ＤＥＬ、Ｕ－ＤＥＬ５、Ｕ－ＤＥＬ１１、Ｕ－ＤＥＬ１２、Ｕ－ＤＥＬ１３、Ｉ－ＤＥＬ１、Ｉ－ＤＥＬ２、Ｉ－ＤＥＬ３、Ｒ－ＤＥＬ１、及びＢＩＯ－ＤＥＬ）の合成手順を示す概略図である。それぞれに対応するヘッドピースを原料とし、２本鎖オリゴヌクレオチドＰｒ＿ＴＡＧ、及びＣＰとの２段階の２本鎖ライゲーションによりヘアピンＤＥＬ合成が達成される。 実施例２において、８種のヘアピンＤＥＬ（Ｕ－ＤＥＬ１、Ｕ－ＤＥＬ２、Ｕ－ＤＥＬ４、Ｕ－ＤＥＬ７、Ｕ－ＤＥＬ８、Ｕ－ＤＥＬ９、Ｕ－ＤＥＬ１０、及びＨ－ＤＥＬ）、及び２本鎖ＤＥＬ（ＤＳ－ＤＥＬ）のリアルタイムＰＣＲにより測定したＣｔ値を示す、サンプル量ごとのグラフである。各種ＤＥＬをＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅにより処理した試料を “ＵＳＥＲ（＋）”と表示し、未処理の試料を“ＵＳＥＲ（－）”と表示している。デオキシウリジンを含む切断可能なヘアピンＤＥＬ（Ｕ－ＤＥＬ１、Ｕ－ＤＥＬ２、Ｕ－ＤＥＬ４、Ｕ－ＤＥＬ７、Ｕ－ＤＥＬ８、Ｕ－ＤＥＬ９、及びＵ－ＤＥＬ１０）は、ＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ処理後に２本鎖ＤＥＬ（ＤＳ－ＤＥＬ）と同等のＣｔ値を示している。 実施例３において、６種のデオキシウリジンを含むヘアピンＤＥＬ（Ｕ－ＤＥＬ５、Ｕ－ＤＥＬ７、Ｕ－ＤＥＬ９、Ｕ－ＤＥＬ１１、Ｕ－ＤＥＬ１２及びＵ－ＤＥＬ１３）のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の進行を示す、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。 実施例４において、４種のデオキシイノシンを含むヘアピンＤＥＬ（Ｉ－ＤＥＬ１、Ｉ－ＤＥＬ２、Ｉ－ＤＥＬ３及びＩ－ＤＥＬ４）のエンドヌクレアーゼＶによる切断反応の進行を示す、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。 実施例５において、リボヌクレオシドを含むヘアピンＤＥＬ（Ｒ－ＤＥＬ１）のＲＮａｓｅＨＩＩによる切断反応の進行を示す、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。 Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰを原料とした、３×３×３（２７）化合物種を含むモデルライブラリの合成手順を示す概略図である。実施例６において、Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰを原料とし、３回（サイクルＡ、Ｂ，Ｃ）のスプリット・アンド・プール工程によりモデルライブラリの合成が達成される。また、各サイクルでは、２本鎖オリゴヌクレオチドタグのライゲーション反応と、ビルディングブロック導入のための化学反応が含まれている。 実施例６のモデルライブラリ合成における、各サイクルのライゲーション反応の進行を示す、アガロースゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。 図１８Ａは、実施例６のモデルライブラリ合成における、サイクルＣ完了後のサンプルより得られたクロマトグラフである。図１８Ｂは、実施例６のモデルライブラリ合成における、サイクルＣ完了後のサンプルより得られたＭＳスペクトルのデコンボリューション結果である。 実施例６において、モデルライブラリのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の進行を示す、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。 実施例７において、５種の３’末端にビオチンを有するＤＥＬ化合物（「ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、及び「Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」）のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の進行を示す、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。 実施例７において、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物（「ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、及び「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ」）、及び光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ」を用いて、プライマー伸長反応を実施した結果を示す、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。 実施例８において、各種光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの結合剤回収効率を、光架橋反応有無で比較するため、回収量をリアルタイムＰＣＲにより測定したＣｔ値、及びΔＣｔ値（ネガティブコントロールのＣｔ値との差分）を示す、グラフである。ＵＶ照射のない試料を “ＵＶ（－）”と表示し、ＵＶ照射を実施した試料を“ＵＶ（＋）”と表示している。また、「溶液Ｓ」を“Ｓ”と表示し、「溶液Ｅ」を“Ｅ”と表示している。なお、グラフ中の各表記は、下記のように各サンプルに対応する。グラフ中表記　　：サンプルＡＡＺ　　　　　：「ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ」ＳＡＢＡ　　　　：「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ」ＣｌＳＡＢＡ　　：「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」ｍＳＡＢＡ　　　：「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」Ａｍｉｎｏ　　　：「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ」 実施例１０において、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物（「ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、及び「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ」）、及び光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ２」を用いて、プライマー伸長反応を実施した結果を示す、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。 実施例１０において、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物（「ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ３」、「ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、及び「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３」）、及び光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ３」を用いて、プライマー伸長反応を実施した結果を示す、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。 実施例１１において、リンカー構造が異なる各種光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの結合剤回収効率を、光架橋反応有無で比較するため、リアルタイムＰＣＲにより測定したＣｔ値を用いて算出したΔＣｔ値（ネガティブコントロールとの差分）を示す、グラフである。ＵＶ照射のない試料を”ＵＶ（－）”と表示し、ＵＶ照射を実施した試料を”ＵＶ（＋）”と表示している。また、グラフ中の各表記は、下記の様に各サンプルに対応する。グラフ中表記：　　　　　サンプルｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ２：　「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ２」ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３：　「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」 実施例１２において、各種「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合を有する光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」と各種「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合のない光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」との結合剤回収効率を比較するため、リアルタイムＰＣＲにより測定したＣｔ値を用いて算出したΔＣｔ値（ネガティブコントロールとの差分）を示す、グラフである。なお、グラフ中の各バーは、左から順に下記の様に各サンプルに対応する。一番左のバー：　　　　ＵＶ照射のない「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」左から２番目のバー：　ＵＶ照射のない「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」左から３番目のバー：　ＵＶ照射のない「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」左から４番目のバー：　ＵＶ照射を実施した「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」左から５番目のバー：　ＵＶ照射を実施した「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」左から６番目のバー：　ＵＶ照射を実施した「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」左から７番目のバー：　ＵＶ照射のない「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」左から８番目のバー：　ＵＶ照射のない「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」左から９番目のバー：　ＵＶ照射のない「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」左から１０番目のバー：ＵＶ照射を実施した「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」左から１１番目のバー：ＵＶ照射を実施した「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」一番右のバー：　　　　ＵＶ照射を実施した「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」 実施例１３において、各種「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合を有する光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」と各種「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合のない光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」との結合剤回収効率を比較するため、リアルタイムＰＣＲにより測定したＣｔ値を用いて算出したΔＣｔ値（ネガティブコントロールとの差分）を示す、グラフである。なお、グラフ中の各バーは、左から順に下記の様に各サンプルに対応する。一番左のバー：　　　　ＵＶ照射のない「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」左から２番目のバー：　ＵＶ照射のない「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」左から３番目のバー：　ＵＶ照射のない「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」左から４番目のバー：　ＵＶ照射を実施した「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」左から５番目のバー：　ＵＶ照射を実施した「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」左から６番目のバー：　ＵＶ照射を実施した「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」左から７番目のバー：　ＵＶ照射のない「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」左から８番目のバー：　ＵＶ照射のない「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」左から９番目のバー：　ＵＶ照射のない「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」左から１０番目のバー：　ＵＶ照射を実施した「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」左から１１番目のバー：ＵＶ照射を実施した「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」一番右のバー：　　　　ＵＶ照射を実施した「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」 実施例１４において、ヘアピンＤＥＬ化合物（「ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」）のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の進行を示す、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。 実施例１４において、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物（「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」）、及び光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ５」を用いて、プライマー伸長反応を実施した結果を示す、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。 実施例１５において、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」とクロスリンカー修飾プライマー「ＴＰＤ－Ｐｒ」、及び「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」と「ＡＣＡ－Ｐｒ」を用いて、プライマー伸長反応を実施した結果を示す、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。 実施例１６において、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物（「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」）、及びクロスリンカー修飾のための反応基修飾プライマー「ＢＣＮ－Ｐｒ」を用いて、プライマー伸長反応を実施した結果を示す、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。 実施例１７において、１本鎖ＤＥＬ化したモデルライブラリと、光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ」及びクロスリンカー修飾のための反応基修飾プライマー「ＢＣＮ－Ｐｒ」を用いて、プライマー伸長反応を実施した結果を示す、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により得られたゲルの画像である。なお、図中の数字は各レーンの番号を示している。
　前述のとおりであり、また当業者に周知の概念であるが、本発明において、化合物ライブラリとは、医薬品候補化合物など、特定の活性を有する可能性のある化合物を系統的に集めた化合物誘導体群を意味する。この化合物ライブラリは、多くの場合コンビナトリアル化学の合成技術と方法論に基づき合成される。コンビナトリアル化学とは、組み合わせ論に基づいて列挙し設計された一連の化合物ライブラリを系統的な合成経路で効率的に多品種合成するための実験手法とそれに関する研究分野である。
　前述のとおりであり、また当業者には周知であるが、コンビナトリアル化学に基づく化合物ライブラリの一つの種として、ＤＮＡコード化ライブラリがある。ＤＮＡコード化ライブラリは適宜ＤＥＬと略される。またＤＥＬは、ＤＮＡコード化化合物ライブラリとも本質的に同義である。
　本発明において、ＤＮＡコード化ライブラリは、ライブラリ化された各化合物に、ＤＮＡのタグが付加されたライブラリを意味する。ＤＮＡのタグは、各化合物の各構造を同定できるように配列が設計されており、化合物の標識として機能する。
　ヌクレオチドとは、一般に、ヌクレオシドにリン酸基が結合した物質として理解される。ヌクレオチドやヌクレオシドは当業者に周知の用語であるが、ヌクレオシドは一つの一般的な態様として、五単糖などの糖の１位に、プリン塩基又はピリミジン塩基などの核酸塩基がグリコシド結合したものとして理解される。ヌクレオシドやヌクレオチドは、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を構成する単位でもある。
　また、核酸も当業者に周知の概念であるが、一般的な態様として、ヌクレオチドのポリマーとして理解される。
　一つの態様として、本発明の核酸とは、後述するヌクレオチド及び核酸アナログにより構成されるポリマーである。
　また、本明細書中において、ヌクレオチドや核酸アナログにより構成される核酸ポリマーのほか、ヌクレオチドや核酸アナログなどの核酸モノマーのことも単に核酸と記載されることがある。後者の用法も技術常識に従った用法であり、当業者であれば適宜文脈に従って理解することができる。
　広義のヌクレオチドには、天然のヌクレオチド（本来のヌクレオチド）のほか、人工のヌクレオチド（各種の核酸アナログ）も含まれる。
　本発明における広義のヌクレオチドは、以下の態様を含む。
（Ａ）天然のヌクレオシドのヌクレオチド
（当該ヌクレオシドの例としては、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシウリジン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、イノシン又はジアミノプリンデオキシリボシドが挙げられる。）
（Ｂ）核酸塩基のアナログを有するヌクレオシドのヌクレオチド
（当該核酸塩基アナログを有するヌクレオシドの例としては、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、ピロロピリミジンデオキシリボシド、３－メチルアデノシン、Ｃ５－プロピニルシチジン、Ｃ５－プロピニルウリジン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－メチルシチジン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、６－Ｏ－メチルグアノシン又は２－チオシチジンが挙げられる。）
（Ｃ）インターカレートされた核酸塩基を有するヌクレオチド
（Ｄ）リボース又は２’－デオキシリボースを有する非天然のヌクレオチド
（Ｅ）修飾された糖を糖部分に有するヌクレオチド
（当該修飾された糖の例としては、修飾されたリボース、修飾された２’－デオキシリボース、２’－Ｏ－メチルリボース、２’－フルオロリボース、Ｄ－トレオニノール、アラビノース、ヘキソース、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール又はマンニトールが挙げられる。）
（Ｆ）核酸類縁体
（当該核酸類縁体の例としては、シクロヘキサニル核酸、シクロヘキセニル核酸、モルホリノ核酸（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、セリノール核酸（ＳＮＡ）、アサイクリックスレオニノール核酸（ａＴＮＡ）又はリボース中の酸素が置き換えられた核酸が挙げられる。）
以下、各核酸類縁体について詳細に説明する。
（Ｆ１）ＰＭＯ
　ＰＭＯは、糖部にモルフォリン環を、リン酸ジエステル部位に電荷のないホスホロジアミデート構造を有する核酸類縁体である。
（Ｆ２）ＬＮＡ
　ＬＮＡは、糖部分に架橋構造を有する核酸類縁体であり、最も典型的な例としては、リボースの２’－ヒドロキシルが同じリボース糖の４’－炭素にＣ１～６アルキレン又はＣ１～６ヘテロアルキレンによって架橋されている。架橋構造の例としては、メチレン、プロピレン、エーテル又はアミノ架橋構造が挙げられる。
　典型的なＬＮＡとしては、２’，４’－ＢＮＡ（２'－Ｏ,４'－Ｃ－メタノ架橋核酸）が挙げられる。
（Ｆ３）ＧＮＡ
　グリコール核酸はＧＮＡとも呼ぶ。例えばＲ－ＧＮＡ又はＳ－ＧＮＡが挙げられる。この場合、リボースはホスホジエステル結合に結合されたグリコール単位により置き換えられる。
（Ｆ４）ＴＮＡ
　トレオース核酸はＴＮＡとも呼ぶ。この場合、リボースはα－Ｌ－トレオフラノシル－（３’→２’）で置き換えられる。
（Ｆ５）ＳＮＡ
　セリノール核酸はＳＮＡとも呼ぶ。この場合、リボースはホスホジエステル結合に結合されたセリノール単位により置き換えられる。
（Ｆ６）ａＴＮＡ
　アサイクリックスレオニノール核酸はａＴＮＡとも呼ぶ。例えば、Ｄ－ａＴＮＡ又はＬ－ａＴＮＡが挙げられる。この場合、リボースはホスホジエステル結合に結合されたスレオニノール単位により置き換えられる。
（Ｆ７）リボース中の酸素が置き換えられた糖
　具体的な例としては、酸素の、Ｓ、Ｓｅ、又はアルキレン（例えば、メチレンもしくはエチレンが挙げられる。）との置換体が挙げられる。
（Ｇ）骨格が修飾されたヌクレオチド
（当該骨格が修飾されたヌクレオチドの例としては、ペプチド核酸（該ペプチド核酸はＰＮＡとも呼ぶ。この場合、２－アミノエチル－グリシンリンケージがリボース及びホスホジエステル骨格に取って代わる。）が挙げられる。）
（Ｈ）リン酸基が修飾されたヌクレオチド
（当該リン酸基が修飾されたヌクレオチドの例としては、ホスホロチオエート、５’－Ｎ－ホスホロアミダイト、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホルアミダート、ホスホロジアミダート、アルキル若しくはアリールホスホネート、ホスホトリエステル、架橋ホスホルアミダート、架橋ホスホロチオエート又は架橋メチレン－ホスホネートなどが挙げられる。）
　以下の説明における、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド鎖、２本鎖オリゴヌクレオチド、２本鎖オリゴヌクレオチド鎖、及び２本鎖ＤＮＡは、上記定義のヌクレオチドである。
　本発明において、特に限定なくヌクレオチドと記載する場合は、天然のヌクレオチドを意味する。天然のヌクレオチドは、当業者に周知の用語であり、本質的に天然に存在するヌクレオチドであれば特に限定されない。一つの態様として、本発明における天然のヌクレオチドは、前記（Ａ）に記載のヌクレオチドである。
　（核酸アナログ）
　核酸アナログとは当業者に周知の用語であり、本発明における核酸アナログの構造は、本発明の効果を有する限り限定はされない。
　一つの態様として、核酸アナログとは、前記（Ｂ）乃至（Ｈ）の態様の化合物である。
　一つの態様として、本発明における核酸アナログとは、核酸モノマーにおけるリン酸相当部位と水酸基相当部位とを有する化合物である。核酸アナログは、より好ましくはリン酸部位と水酸基とを有する化合物である。
　一つの態様として、本発明における核酸アナログとは、核酸合成機においてモノマーとして利用可能な化合物である。当業者には周知であるが、核酸合成機では、核酸アナログのリン酸（または相当部位）をホスホロアミダイト化し、水酸基（またはその相当部位）を保護基で保護したモノマーとして利用することで、核酸オリゴマーを合成することができる。
　また、核酸アナログにおける、リン酸部位（または相当部位）および水酸基（または相当部位）以外の部分構造は、核酸アナログ残基ということができる。核酸アナログ残基の構造は、本発明の効果を有する限り限定されないが、ここで参照として天然の核酸（デオキシアデノシン、チミジン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン）のそれぞれの構造の特徴を確認すると、分子量が３２２（チミジン一リン酸）から３４７（デオキシグアノシン一リン酸）程度であり、かつ核酸鎖を構成する３‘位の水酸基酸素原子から５’位のリン原子の間の原子数（酸素原子およびリン原子を含む。以下残基間原子数とも呼ぶ）が６つであることが挙げられる。また、核酸合成機に利用可能な核酸アナログとして、以下が知られている。
Amino C6 dT　　　　　　分子量：４７６、残基原子数：６
mdC（TEG-Amino） 　　　分子量：５２６、残基原子数：６
Uni-Link（商標登録）Amino Modifier　分子量：２２７、残基原子数：６
（文献ヌクレイック　アシッド　リサーチ、１９９２年、２０巻、６２５３－６２５９頁参照）
d-Spacer　分子量：１９８、残基原子数：６　
トリエチレングリコールリン酸エステル（Spacer9）　分子量：２３０、残基原子数：１１
参考として各核酸アナログの構造を以下に記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　したがって、一つの態様として、核酸アナログは、以下を特徴とする化合物（Ｂ１）である。
（Ｂ１１）リン酸（または相当部位）および水酸基（またはその相当部位）を有する。
（Ｂ１２）炭素、水素、酸素、窒素、リン又は硫黄により構成される。
（Ｂ１３）分子量が１４２から１５００である。
（Ｂ１４）残基間原子数が５～３０である。
（Ｂ１５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合であるか、または１乃至２つの二重結合を含み残りは単結合である。
　一つの態様として、核酸アナログは、以下を特徴とする化合物（Ｂ２）である。
（Ｂ２１）リン酸および水酸基を有する。
（Ｂ２２）炭素、水素、酸素、窒素又はリンにより構成される。
（Ｂ２３）分子量が１４２から１０００である。
（Ｂ２４）残基間原子数が５～２０である。
（Ｂ２５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合である。
　一つの態様として、核酸アナログは、以下を特徴とする化合物（Ｂ３）である。
（Ｂ３１）リン酸および水酸基を有する。
（Ｂ３２）炭素、水素、酸素、窒素又はリンにより構成される。
（Ｂ３３）分子量が１４２から７００である。
（Ｂ３４）残基間原子数が５～１２である。
（Ｂ３５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合である。
　一つの態様として、核酸アナログは、以下の化合物（Ｂ４１）、（Ｂ４２）、（Ｂ４３）、（Ｂ４４）、（Ｂ５）、（Ｂ５１）、または（Ｂ５２）である。
（Ｂ４１）d-Spacer
（Ｂ４２）Amino C6 dT
（Ｂ４３）mdC（TEG-Amino）
（Ｂ４４）Uni-Link（商標登録）Amino Modifier
（Ｂ５）ポリアルキレングリコールリン酸エステル
（Ｂ５１）ジエチレングリコールリン酸エステルまたはトリエチレングリコールリン酸エステル
（Ｂ５２）トリエチレングリコールリン酸エステル
　本発明でオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド鎖とは、５’末端と３’末端、及び５’末端と３’末端の間の内部位置に１個以上のヌクレオチドを有するヌクレオチドの重合体を意味する。
　互いに相補的な塩基配列とは、核酸の２本のオリゴヌクレオチドの間で、アデニンとチミン（又はウラシル）、又はグアニンとシトシンという決まった組みを作り、水素結合でつながるいわゆる相補的塩基対を形成することができるヌクレオチドの配列を意味する。相補的塩基対の形成はハイブリダイズとも呼ばれる。
　なお、相補的塩基対は、一般に「ワトソン・クリック型塩基対」「天然型塩基対」と呼ばれる概念である。ただし、塩基対はワトソン・クリック型であっても、フーグスティーン型塩基対、もしくは他の水素結合モチーフ(例えば、ジアミノプリンとＴ、５－メチルＣとＧ、２―チオチミンとＡ、６－ヒドロキシプリンとＣ、プソイドイソシトシンとＧ)形成による塩基対などであっても良い。２本のオリゴヌクレオチドが２本鎖を組みうる配列であり、本発明の目的に利用できる限りで、「互いに相補的な塩基配列」の配列に制限はなく、２つの配列の相同性にも制限はない。相同性は、より好ましい順に、９９％以上、９８％以上、９５％以上、９０％以上、８５％以上、８０％以上、７０％以上、６０％以上又は５０％以上であることが好ましい。
　繰り返しになるが、本発明でハイブリダイズするとは、互いに相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド鎖同士で２本鎖を形成させる行為、及び相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド鎖同士が二重鎖を形成する現象を意味する。
　本発明で二重鎖とは、２つの核酸鎖が相補的塩基対を形成している（ハイブリダイズしている）状態のことを意味する。２つの核酸鎖は、２本の核酸鎖に由来するものでも良く、１本の核酸鎖分子内の２つの核酸配列に由来するものでも良い。
　本発明で２本鎖オリゴヌクレオチド及び２本鎖オリゴヌクレオチド鎖とは、２つ以上の異なるオリゴヌクレオチド鎖がハイブリダイズすることで形成される二次構造体を意味する。２つのオリゴヌクレオチドの鎖長は異なっていてもよく、ハイブリダイズされない領域を有していてもよい。
　なお、２本鎖がハイブリダイズしている領域は、二重鎖である。
　本発明で２本鎖ＤＮＡとは、２つの異なるＤＮＡ鎖がハイブリダイズすることで形成される二次構造体を意味する。それぞれのＤＮＡ鎖の鎖長は異なっていてもよく、ハイブリダイズされない領域を有していてもよい。ＤＮＡ鎖は天然に存在するデオキシリボヌクレオチドに限定されず、ＤＮＡポリメラーゼにより増幅可能なオリゴヌクレオチド鎖全般を意味する。
　本発明で「二重鎖を形成する」とは、例えば４～４０℃の温度、水性溶媒、ｐＨ４～１０のような、オリゴヌクレオチドを取り扱うにあたって標準的な条件において二重鎖を形成すればよい。例えば、特定の溶媒、条件によって二重鎖を形成しない場合があっても、当該核酸が標準的な条件において二重鎖を形成するのであれば、当該核酸は二重鎖を形成する核酸である。
　本発明でＴｍ値とは、ＤＮＡ分子の半数が、相補鎖とアニールするときの温度をいう。
　本発明で平滑末端とは、２本鎖オリゴヌクレオチドの末端が、どちらもが突き出ることなく対になっていることを意味する。
　本発明で突出末端とは、２本鎖オリゴヌクレオチドの末端のうち、一方の鎖が突出部を有していることを意味する。突出末端の突出部は、任意の長さであることができるが、好ましくは、１～５０塩基、より好ましくは１～３０塩基、さらに好ましくは１～１５塩基、最も好ましくは、２～６塩基の長さである。特定の態様では、前記突出部は、粘着末端のライゲーションを実施する際のハイブリダイズ領域として使用することが可能である。
　ＰＣＲとは、ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。ＰＣＲは、オリゴヌクレオチド鎖の増幅手段であり、当業者に周知の技術である。ＰＣＲのプロセスの概略を説明すると、ＰＣＲでは、（１）増幅対象の２本鎖オリゴヌクレオチド鎖を加熱処理などにより２つの１本鎖に解離させ、（２）酵素反応に適した温度に調整したのち、反応系中に存在させている酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）により、それぞれの１本鎖に相補的な鎖を合成する。すなわち、１つの２本鎖オリゴヌクレオチドを２つに増幅することができる。ＰＣＲでは、（１）と（２）のプロセスを温度調整により繰り返すことで、高い効率でオリゴヌクレオチド鎖を増幅することができる。
　本発明でプライマーとは、鋳型となるオリゴヌクレオチド鎖にアニールし、鋳型依存的にポリメラーゼにより伸長され得るオリゴヌクレオチドを意味する。
　本発明でＰＣＲ用のプライマー配列とは、オリゴヌクレオチド鎖中にあって、プライマーがアニールする部分の配列を意味し、当該分野で公知であるようなＰＣＲに適した配列であることが好ましく、オリゴヌクレオチド鎖の末端に存在することが好ましい。
　本発明でニックとは、２本鎖オリゴヌクレオチド鎖において、ヌクレオチド間結合が欠如しており、オリゴヌクレオチド鎖が断裂している部分を意味する。この欠如部の５’側は、リン酸基を有していても、リン酸基を有していなくても良い。
　本発明でギャップとは、２本鎖オリゴヌクレオチド鎖において、１つ以上連続したヌクレオチドが欠失しており、オリゴヌクレオチド鎖が乖離している部分を意味する。欠失部の５’側に、リン酸基を有していても、リン酸基を有していなくても良い。
　本発明でヘアピン鎖とは、相補的な２本の核酸鎖がつながった１本鎖構造であり、ヘアピン鎖やヘアピン鎖ＤＥＬの特徴は前記のとおりである。本発明で用いられる「ヘアピン部位」、「ヘアピン構造」、「ヘアピン型」という用語は、前述の「ヘアピン鎖」と同概念のヘアピンに由来する用語として理解される。
　本発明で核酸連結反応及びライゲーションとは、核酸の末端どうしを連結する反応を意味する。
　酵素による核酸連結反応及び酵素的ライゲーションとは、酵素を用いて核酸の末端どうしを連結する反応を意味する。
　核酸連結反応に用いることができる酵素は、例えば、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、又はトポイソメラーゼである。
　一つの態様として、ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ鎖の末端同士をリン酸ジエステル結合でつなぐ酵素である。一つの態様として、ＤＮＡリガーゼは、ＥＣ番号：６．５．１．１又は６．５．１．２に属するリガーゼとして理解される。ＤＮＡリガーゼは、ポリデオキシリボヌクレオチドシンターゼ又はポリヌクレオチドリガーゼなどとも呼ばれる。ＤＮＡリガーゼの例としては、ＤＮＡリガーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶやＴ４ＤＮＡリガーゼなどが挙げられる。
　一つの態様として、ＲＮＡリガーゼは、ＲＮＡ鎖の末端同士をリン酸ジエステル結合でつなぐ酵素である。一つの態様として、ＲＮＡリガーゼは、ＥＣ番号：６．５．１．３に属するリガーゼとして理解される。また、一つの態様としてＲＮＡリガーゼは、ポリ（リボヌクレオチド):ポリ（リボヌクレオチド)リガーゼの系統に属す。ＲＮＡリガーゼは、ポリリボヌクレオチドシンターゼ又はポリリボヌクレオチドリガーゼとも呼ばれる。
　本発明で化学的ライゲーションとは、核酸の末端どうしを、酵素を用いずに結合する反応を意味する。
　化学的ライゲーションにおいては、化学反応の対となる官能基を有する核酸の末端どうしが反応することで連結部が形成される。化学反応の対となる官能基は、例えば、置換されていてもよいアルキニル基と置換されていてもよいアジド基との対、４π電子系を有する置換されていてもよいジエン（例えば、置換されていてもよい１，３－不飽和化合物、例えば、置換されていてもよい１，３－ブタジエン、１－メトキシ－３－トリメチルシリルオキシ－１，３－ブタジエン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン又はフランが挙げられる。)と２π電子系を有する置換されていてもよいジエノフィル又は置換されていてもよいヘテロジエノフィル(例えば、置換されていてもよいアルケニル基又は置換されていてもよいアルキニル基が挙げられる。)との対、置換されてもよいアミノ基とカルボン酸基の対、ホスホロチオエート基とヨード基 (例えば、３’末端のホスホロチオエート基と５’末端のヨード基が挙げられる。)との対又はリン酸基とヒドロキシ基の対(例えば、５’末端のリン酸基と３’末端のヒドロキシ基の対又は５’末端のヒドロキシ基と３’末端のリン酸基の対が挙げられる。)である。
　化学的ライゲーションは、当業者に周知の概念であり、当業者は技術常識に基づき適宜、化学的ライゲーションを達成できる。上記のほか、アーティフィシアル・ＤＮＡ；ＰＮＡ＆ＸＮＡ、２０１４年、５巻、ｅ２７８９６、キャレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー、２０１５年、２６巻、８０－８８頁なども参照される。
　本発明で「選択的に切断可能」とは、ある化合物において、化合物のその他の分子構造に変化を与えることなく、所定の条件で特定の部位のみ選択的に切断できることを意味する。
　本発明で「選択的に切断可能な部位」とは、ある化合物において、所定の条件で選択的に切断できる部位を意味する。
　一つの態様として、本発明における「選択的に切断可能な部位」の好ましい構造は、「選択的に切断可能な核酸」である。当該部位は、複数の核酸により構成され特定の配列が奏功して切断される部位でもよく、単一の核酸による部位でも良い。切断可能な部位が核酸である場合、（１）核酸合成機などの確立された製造方法を利用することができ製造効率が良いこと、（２）ＤＥＬのビルディングブロック構築の反応条件は、ＤＮＡタグ部分の核酸が分解しないことが必須であるため、切断可能な部位が核酸であればやはり分解しないこと、などの観点で好ましい。
　前記「選択的に切断可能な核酸」のより好ましい構造は、ＤＥＬのＤＮＡタグの配列に含まれないヌクレオチドを含む核酸である。切断可能な部位が、ＤＮＡタグの配列に含まれないヌクレオチドであれば、ＤＮＡタグ部分の切断を避けるために、ＤＮＡタグの配列を限定することなく利用可能となる。
　ＤＮＡタグの配列に使用する核酸としては、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、及びデオキシシチジンが好ましい。したがって、選択的に切断可能な部位の好ましい構造は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、及びデオキシシチジンのいずれでもない核酸である。
　「選択的に切断可能な部位」の例として、「切断可能な塩基を有するヌクレオチド」が挙げられる。例えば、ＤＥＬ中の「切断可能な塩基を有するヌクレオチド」は、ＤＮＡグリコシラーゼの作用によって、塩基部と糖部の間のＮ－グリコシド結合が切断され、脱塩基部位を残す。脱塩基部位に隣接するホスホジエステル結合は、化学的条件変化（例えば温度上昇、塩基性加水分解など）、又は脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼ活性やＡＰリアーゼ活性を有する酵素（例えば、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＡＰＥ１（ヒト由来ＡＰエンドヌクレアーゼ）、Ｆｐｇ（ホルムアミドピリジン－ＤＮＡグリコシラーゼ）など）によって切断され、１塩基分のギャップ、あるいはニックを形成する。
　「切断可能な塩基を有するヌクレオチド」の例としては、デオキシウリジン、ブロモデオキシウリジン、デオキシイノシン、８－ヒドロキシデオキシグアノシン、３－メチル－２’－デオキシアデノシン、Ｎ６－エテノ－２’－デオキシアデノシン、７－メチル－２’－デオキシグアノシン、２’－デオキシキサントシン、５，６－ジヒドロキシデオキシチミジンなどが挙げられる。他の切断可能な塩基を有するヌクレオチドは、当業者にとって明白である。これらの「切断可能な塩基を有するヌクレオチド」をＤＥＬ中に組み込み、その構造を特異的に認識するＤＮＡグリコシラーゼを用いることでＤＥＬは選択的に脱塩基される。
　本発明でＤＮＡグリコシラーゼとは、グリコシラーゼ活性を有する任意の酵素であって、オリゴヌクレオチド中の任意の核酸塩基部を認識し、その塩基部と糖部の間のＮ－グリコシド結合を切断し、脱塩基部位を作成する酵素である。例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（デオキシウリジンを認識）、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（３－メチル－２’－デオキシアデノシン、７－メチル－２’－デオキシグアノシン、及びデオキシイノシンを認識）、Ｆｐｇ（８－ヒドロキシデオキシグアノシンを認識）、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（５，６－ジヒドロキシデオキシチミジンやウラシルグリコールなどの分解されたピリミジン塩基を認識）、ＳＵＭＧ１（１本鎖選択的ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの略称、デオキシウリジンを認識）などが挙げられる。
　本発明で「選択的に切断可能な部位」のより好ましい例として、デオキシイノシン、デオキシウリジンが挙げられる。
　本発明で「選択的に切断可能な部位」の特に好ましい例として、デオキシウリジンが挙げられる。
　一つの態様として、本発明における「選択的に切断可能な部位」は、好ましくは酵素を用いて切断される。酵素は一般的に基質特異性が高く、ＤＥＬのＤＮＡタグ部分、及び複数のビルディングブロックにより構築された化合物部分を基質として認識せず、「選択的に切断可能な部位」のみを認識して作用させられるため、好ましい。また、前記酵素を用いた切断は、「選択的に切断可能な部位」を酵素により構造変化させたのちに、化学的条件を変化させることで達成されても良い。該酵素の例としては、グリコシラーゼ、及びヌクレアーゼが挙げられる。
　本発明でグリコシラーゼとは、グリコシド結合（糖分子と別の有機化合物とが脱水縮合して形成する共有結合）を加水分解する機能を有する酵素である。そのなかでもＤＮＡグリコシラーゼは、前述したように、オリゴヌクレオチド中の核酸塩基部を認識し、そのグリコシド結合を加水分解する酵素である。
　本発明でヌクレアーゼとは、核酸の糖とリン酸の間のホスホジエステル結合を加水分解する機能を有する酵素である。ヌクレアーゼには、例えば、ＡＰエンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼが含まれる。
　ＡＰエンドヌクレアーゼは、前述したように、任意のＤＮＡグリコシラーゼの作用によって生成した脱塩基部位に隣接するホスホジエステル結合を切断する。したがって、本発明において、ＤＮＡグリコシラーゼとＡＰエンドヌクレアーゼを併用することが好ましい。
　ニッキングエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ.ＢｓｒＤＩなど）は、特定のＤＮＡ配列を認識し、２本鎖のうち一方の鎖だけホスホジエステル結合が切断されたニックを生じさせる。また、エンドヌクレアーゼＶは、デオキシイノシンから３’方向に２番目のホスホジエステル結合が切断されたニックを生じさせることが可能であり、本発明の実施において有用である。
　リボヌクレアーゼはＲＮＡを分解する酵素である。本発明においては、リボヌクレオシドを「選択的に切断可能な部位」として用い、リボヌクレアーゼを作用させることで利用が可能である。リボヌクレアーゼの一種であるＲＮａｓｅＨＩＩは、ＤＮＡ配列中に組み込まれたリボヌクレオチドの５’側のホスホジエステル結合が切断されたニックを生じさせることが可能であり、本発明の実施において有用である。
　本発明でＵＳＥＲ（登録商標）とは、「Uracil-Specific Excision Reagent」 Enzymeを意味する。ＵＳＥＲは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）とエンドヌクレアーゼＶＩＩＩとを含むウラシルを除去するエンドヌクレアーゼカクテルである。ＵＳＥＲは、２本鎖ＤＮＡ中のウラシルを除去して１塩基のギャップを生じ、ＤＮＡ鎖を切断する。ＵＳＥＲによるプロセスでは、まずＵＤＧがウラシル塩基を除去して脱塩基部位をつくる。続いてエンドヌクレアーゼがホスホジエステル結合を分解して塩基が無いデオキシリボースを遊離して１塩基分のギャップをつくる。
　本明細書の説明における、ＵＳＥＲ（登録商標）酵素、及びＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅは上記定義のＵＳＥＲ（登録商標）である。
　本発明でエキソヌクレアーゼとは、核酸の５’末端もしくは３’末端から逐次的にホスホジエステル結合を加水分解する機能を有する酵素である。エキソヌクレアーゼには、例えば、ラムダエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ７エキソヌクレアーゼが含まれる。
　ラムダエキソヌクレアーゼは、２本鎖ＤＮＡのうち、５’末端がリン酸化されているＤＮＡを分解する酵素である。本発明では、２本鎖ＤＥＬを１本鎖ＤＥＬに変換する場面において有用である。
　本発明でビルディングブロックとは、官能基を有し、化合物の一部を構成することができる部分であり、化合物の形態であってもよい。
　本発明でそれぞれのビルディングブロックを同定することができる塩基配列とは、それぞれのビルディングブロックの構造に対応するように設計された特定の塩基配列を意味する。配列を設計するとは、例えば、ビルディングブロック構造Ａには核酸塩基配列ＡＡＡを、構造Ｂには核酸塩基配列ＴＴＴを、構造Ｃには核酸塩基配列ＣＧＣというように、構造ごとに核酸塩基配列を割り当てることを意味する。配列は、本発明の目的が達せられる限りにおいて自由に設計することができる。例えば、任意の数の塩基配列を１つのビルディングブロックに割り当てることができる。
　本発明でオリゴヌクレオチドタグとは、ビルディングブロックにより構築される部分構造の構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む部分構造である。本発明でオリゴヌクレオチドタグとは、各ビルディングブロックに対応するオリゴヌクレオチドであっても良く、複数のビルディングブロックに対応するオリゴヌクレオチドを含む、より長鎖のオリゴヌクレオチドであっても良い。
　本発明のオリゴヌクレオチドタグを構成するヌクレオチドは、本発明の効果を達成する限り制限されないが、ＰＣＲによる増幅やシーケンサーによる解析の容易さという観点において、これらの操作に適応したヌクレオチドであることが望ましい。このような好ましいヌクレオチドの例としては、塩基部として前記した天然の核酸塩基を有し、糖部として前記したリボース又は２’－デオキシリボースを有するヌクレオチドが挙げられ、より好ましい例としてはデオキシアデノシン、チミジン、デオキシシチジン又はデオキシグアノシンが挙げられる。
（ヘッドピース）
　本発明でヘッドピースとは、ＤＥＬなどの化合物ライブラリ製造のための出発化合物を意味する。本発明のヘッドピースの構造は、本発明の目的を達成する限り限定を受けないが、最も典型的な態様として、ビルディングブロックが連結され得る少なくとも１つの部位と、オリゴヌクレオチドタグが連結され得る少なくとも１つの部位とを有し、さらに少なくとも一つの選択的に切断可能な部位を構造中に含む。
　後述のとおり、ＤＮＡタグは好ましくは２本鎖オリゴヌクレオチド鎖であり、オリゴヌクレオチドタグが連結され得る部位は、好ましくは２つである。
　一つの態様として、ヘッドピースは下記の模式図で示される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　一つの態様として、ヘッドピースは、化学的に安定であることが望ましい。
　また、一つの態様として、ヘッドピースは、ＤＮＡタグとビルディングブロックとを適切な空間に配置できる構造であることが好ましい。
　一つの態様として、ヘッドピースは、適度なフレキシビリティーを有することが好ましい。
　ここで、さらに適度な空間配置やフレキシビリティー（ヘッドピースの構造特性）について説明する。なお、ここで説明するヘッドピースの構造特性は、ヘッドピース単体で達成されてもよく、ヘッドピースと２官能性スペーサーを結合させることで達成されてもよい。
　一つの態様として、好ましいヘッドピースの構造特性は、ビルディングブロックの形成反応をヘッドピースやＤＮＡタグが阻害しない、逆に、ＤＮＡタグの伸長反応をヘッドピースやビルディングブロックが阻害しないような構造特性である。
　一つの態様として、好ましいヘッドピースの構造特性は、ビルディングブロック化合物（ライブラリ化合物）とターゲット（標的タンパク質など）との相互作用に対し、ヘッドピースやＤＮＡタグ部分が影響を与えないような構造特性である。
　一つの態様として、好ましいヘッドピースの構造特性は、ＤＮＡタグとビルディングブロック部位を、反対側（たとえば９０度以上反対側）に配向するような構造特性である。
　一つの態様として、好ましいヘッドピースの構造特性は、ヘッドピースのループ部位とビルディングブロックとを、有機化合物の骨格換算で数原子から十数原子分隔てるような構造特性である。
　一つの態様として、ヘッドピースは、ＤＮＡタグ部分、ビルディングブロック部分と適度な親和性を有することが好ましい。適度な親和性とは、例えば、本発明を実施するために、所望の条件で結合を形成し、維持し、切断できるような化学的反応性および安定性を意味する。
　なお、本発明において、２官能性スペーサーとは、ビルディングブロック部位とヘッドピースとの結合を可能にする少なくとも２つの反応基を有するスペーサー部分を意味する。
　本発明の説明において、「ヘッドピース」、「ヘッドピース化合物」、「ヘッドピースのための化合物」という用語は、同概念の化合物を示す用語である。
　本発明の説明において、「ヘッドピースとして用いる化合物」は、使用の観点からすると「化合物のヘッドピースとしての使用」と本質的に同様に理解することができ、方法の観点からすると「化合物をヘッドピースとして用いる方法」と本質的に同様に理解することができる。化合物ライブラリについても同様である。
　以下、好ましいヘッドピースの構造を説明するが、ヘッドピースの構造は本発明の効果を達成する限りにおいて限定はされない。
　一つの態様として、ヘッドピースは、
（Ｄ）ビルディングブロックと直接連結するか、または２官能性スペーサーを介して間接的に連結し得る少なくとも１つの部位を有する反応性官能基、
（Ｌ）反応性官能基から伸長するリンカー、
（Ｅ）オリゴヌクレオチドタグの一方の鎖と連結され得る１つの結合部位を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖、
（Ｆ）オリゴヌクレオチドタグのもう一方の鎖と連結され得る１つの結合部位を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖、および
（ＬＰ）前記リンカーと２つのオリゴヌクレオチド鎖に結合するループ部位、
により構成され、
Ｅ、Ｆ、又はＬＰの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有する。
　一つの態様として、ヘッドピースは次の式（Ｉ）で示される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
（式中、ＥおよびＦは、それぞれ独立して
ヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ただし、ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＬＰは、ループ部位であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、反応性官能基である。）
で表される化合物であり、
Ｅ、Ｆ、又はＬＰの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有する化合物。
　なお、本発明において、ループ部位のうち、リンカーと結合する部位の部分構造のことを連結部位または（ＬＳ）と呼ぶことがある。
　また、本発明においてＥ－ＬＰ－Ｆを合わせてヘアピン部位と呼ぶことがある。
　（第１および第２のオリゴヌクレオチド鎖）
　以下に、第１のオリゴヌクレオチド鎖（Ｅ）および第２のオリゴヌクレオチド鎖（Ｆ）の好ましい態様について説明する。
　第１のオリゴヌクレオチド鎖（Ｅ）と第２のオリゴヌクレオチド鎖（Ｆ）は、ループ部位（ＬＰ）を介して分子内で二重鎖を形成し、ヘッドピースがヘアピン構造を形成することが好ましい。分子内での二重鎖の形成に好ましい鎖長とは３塩基以上であり、より好ましくは４塩基以上であり、さらに好ましくは６塩基以上である。
　ＥおよびＦの鎖長は、一つの態様としてそれぞれ３乃至４０である。
　ＥおよびＦの鎖長は、一つの態様としてそれぞれ４乃至４０である。
　ＥおよびＦの鎖長は、一つの態様としてそれぞれ６乃至２５である。
　オリゴヌクレオチドタグが連結される部位は、酵素的ライゲーション、又は化学的ライゲーションに適した構造であることが好ましい。一つの態様として、ヘッドピースとオリゴヌクレオチドタグとの連結は、酵素を用いた２本鎖ライゲーションにより実施される。その場合、第１および第２のオリゴヌクレオチド鎖はライゲーションのための突出末端を形成することが好ましい。前記該突出末端の鎖長は、好ましくは２塩基以上であり、より好ましくは２乃至１０塩基であり、さらに好ましくは２乃至５塩基である。したがって、第１および第２のオリゴヌクレオチド鎖の一方は、もう一方の鎖よりも突出末端の鎖長分長いことが好ましい。また、ＤＮＡリガーゼによるライゲーションのためには、第１および第２のオリゴヌクレオチド鎖のうち、ヘッドピースの５‘末端を有している鎖の５‘末端はリン酸化されていることが好ましい。
　また、第１および第２のオリゴヌクレオチド鎖はＰＣＲのためのプライマー結合配列の一部又は全部を含んでいても良い。プライマー結合配列として適切な鎖長は１７乃至２５塩基である。
　（リンカー）
　以下に、リンカー（Ｌ）の好ましい態様について説明する。
　リンカーは、前記のとおり、反応性官能基から伸長し、連結部位と結合する部位である。典型的には、リンカーは以下の態様に由来する２価の基（－Ｌ－）である。
　一つの態様として、リンカーは、以下の態様（Ｌ１）である。
（Ｌ１）置換基を有しても良く、１～３個のヘテロ原子で置き換えられても良いＣ１～２０脂肪族炭化水素、又は（２）置換基を有してもよいＣ６～１４芳香族炭化水素。
　その他の態様として、Ｌは、以下の態様（Ｌ２）、（Ｌ３）、（Ｌ４）又は（Ｌ５）である。
　（Ｌ２）
　置換基を有しても良いＣ１～６脂肪族炭化水素、１若しくは２個の酸素原子で置き換えられても良いＣ１～６脂肪族炭化水素、又は置換基を有しても良いＣ６～１０芳香族炭化水素。
　（Ｌ３）
　置換基群ＳＴ１で置換可能なＣ１～６脂肪族炭化水素、又は置換基群ＳＴ１で置換可能なベンゼン。ここで、置換基群ＳＴ１は、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルコキシ基、フッ素原子および塩素原子により構成される群である。ただし、置換基群ＳＴ１が脂肪族炭化水素に置換する場合、置換基群ＳＴ１からアルキル基は選択されない。
　（Ｌ４）
　Ｃ１～６アルキル、又は無置換であるか１つまたは２つのＣ１～３アルキル基若しくはＣ１～３アルコキシ基で置換されたベンゼン。
　（Ｌ５）
　Ｃ１～６アルキル。
　（反応性官能基）
　以下に、反応性官能基（Ｄ）の好ましい態様について説明する。
　反応性官能基は、前記のとおり、ビルディングブロックと直接連結するか、または２官能性スペーサーを介して間接的に連結し得る少なくとも１つの部位を有し、リンカー基と結合する部位である。典型的には、反応性官能基は、ヘッドピースにおいて一価の基（Ｄ－）となり、ＤＥＬにおいては前記（Ｄ－）に基づく「反応性官能基由来の２価の基」（－Ｄ－）となる。
　たとえば、Ｄがアミノ基の場合、（Ｄ－）の具体的構造は（Ｒ－ＨＮ－）である（Ｒは以下に説明される置換基）。例えば、活性化カルボキシ基、反応性スルホニル基、又はイソシアネート基と反応し、それぞれアミド結合、スルホンアミド結合、又はウレア結合を形成する。その際（－Ｄ－）の具体的構造は（－ＮＲ－）となる。
　Ｒは、本発明の効果を達成する限り限定されないが、以下の（Ｄ１）～（Ｄ５）の態様において、Ｒは、好ましくは、（１）水素原子、または（２）無置換であるかまたはＣ１～６アルコキシ基、フッ素原子および塩素原子からなる置換基群より単独もしくは異なって選択される１～３個の置換基で置換されたＣ１～６アルキル基、である。
　Ｒは、より好ましくは、水素原子またはＣ１～３アルキル基であり、さらに好ましくは水素原子である。
　また、たとえば、（Ｄ－）が、脱離基（Ｘ－）を有するメチレン基である場合、（Ｄ－）の具体的構造は（Ｘ－ＣＨ２－）であり、例えば、アミノ基、ヒドロキシ基、又はチオール基といった求核試薬と反応し、炭素―窒素結合、炭素―酸素結合、又は炭素―硫黄結合を形成する。その際、（－Ｄ－）の具体的構造は（－ＣＨ２－）となる。また、たとえば、（Ｄ－）が、アルデヒド基である場合、（Ｄ－）の具体的構造は（ＨＯＣ－）である。アルデヒド基は、例えばアミノ基との還元的アミノ化反応により、炭素―窒素結合を形成し、その際（－Ｄ－）は－ＣＨ２－となり、例えばリンイリド基との反応により炭素―炭素二重結合を形成し、その際（－Ｄ－）は－ＣＨ＝となり、例えばα－ジアゾホスホネート基と反応により炭素―炭素三重結合を形成し、その際（－Ｄ－）は－Ｃ≡となる。
　一つの態様として、部位（Ｄ－）は、以下の態様（Ｄ１）である。
　（Ｄ１）
　Ｃ―Ｃ、アミノ、エーテル、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホンアミド、又はスルホニル結合を構成しうる官能基。
（字義どおりであるが、この場合、（－Ｄ－）は、Ｃ―Ｃ、アミノ、エーテル、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホンアミド、又はスルホニル結合となる。）
　その他の態様として、（Ｄ－）は、以下の態様（Ｄ２）、（Ｄ３）、（Ｄ４）又は（Ｄ５）である。
　（Ｄ２）
　脱離基を有するＣ１炭化水素、アミノ基、水酸基、カルボニル基の前駆体、チオール基、またはアルデヒド基。
　なお、この場合、（－Ｄ－）は、－（Ｃ１炭化水素）－、－ＮＲ－、－Ｏ－、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｓ－、－ＣＨ２－、－ＣＨ＝、又は－Ｃ≡、などとなりうる。
　（Ｄ３）
　ハロゲン原子を有するＣ１炭化水素、スルホン酸系脱離基を有するＣ１炭化水素、アミノ基、水酸基、カルボキシ基、ハロゲン化カルボキシ基、チオール基、又はアルデヒド基。
　なお、この場合、（－Ｄ－）は、－（Ｃ１炭化水素）－、－ＮＲ－、－Ｏ－、－（Ｃ＝Ｏ）－、－Ｓ－、－ＣＨ２－、－ＣＨ＝、又は－Ｃ≡、などとなりうる。
　（Ｄ４）
　－ＣＨ２Ｃｌ、－ＣＨ２Ｂｒ、－ＣＨ２ＯＳＯ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＯＳＯ２ＣＦ３、アミノ基、水酸基、又はカルボキシ基。
　なお、この場合、（－Ｄ－）は、それぞれ、－ＣＨ２－、－ＮＲ－、－Ｏ－、又は－（Ｃ＝Ｏ）－となる。
　（Ｄ５）
　第一級アミノ基。
　なお、この場合、（－Ｄ－）は、－ＮＨ－となる。
　以下に、ループ部位（ＬＰ）の好ましい態様について説明する。
　ループ部位（ＬＰ）は、第１のオリゴヌクレオチド鎖（Ｅ）と第２のオリゴヌクレオチド鎖（Ｆ）が分子内で二重鎖を形成し、ヘッドピースがヘアピン構造を形成可能なように設計されることが好ましい。すなわち、ループ部位（ＬＰ）は、ループ構造が熱力学的に安定となる鎖長、及び結合の柔軟性を有していることが好ましい。
　したがって、一つの態様として、ループ部位（ＬＰ）は以下である。
ＬＰが、
（ＬＰ１）ｐ－ＬＳ－（ＬＰ２）ｑで表されるループ部位であり、
ＬＳは、以下の（Ａ）ないし（Ｃ）に記載される化合物群から選ばれる部分構造であり、
（Ａ）ヌクレオチド
（Ｂ）核酸アナログ
（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基
ＬＰ１は、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｐ個選ばれる各部分構造であり、
（１）ヌクレオチド
（２）核酸アナログ
ＬＰ２は、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｑ個選ばれる各部分構造であり、
（１）ヌクレオチド
（２）核酸アナログ
ｐとｑの総数が０～４０である。
　ループ部位のさらに好ましい態様は、前記説明のとおりである。
　以下、さらにループ部位の構造について補足する。
　ここで、ヌクレオチドは前記説明の天然ヌクレオチドであり、核酸アナログは前記説明のとおりである。
　ここで、ＬＰ１は、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｐ個選ばれる各部分構造であり、ＬＰ２は、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｑ個選ばれる各部分構造である。
（１）ヌクレオチド
（２）核酸アナログ
　単独もしくは異なってｐ個選ばれるとは、例えば、ｐが４である場合、ＬＰ１はＡＡＴＧ、ＡＴＣＧ、ＴＣ（d-Spacer）ＧあるいはＡ（d-Spacer）（d-Spacer）Ｃといったように、（１）と（２）に記載の化合物群より単独もしくは異なって選ぶことができる。ＬＰ２も同様である。
　また、ループ部位は、ＰＣＲのためのプライマー結合配列の一部または全部を含んでいても良い。
（ＬＳについて）
　一つの態様として、ＬＳは（Ａ）ヌクレオチドまたは（Ｂ）核酸アナログである。
　ＬＳが（Ａ）ヌクレオチドまたは（Ｂ）核酸アナログの場合、ループ部位は、核酸オリゴマーとなる。本発明の核酸オリゴマーとは、ヌクレオチドまたは核酸アナログをモノマーとして連結させたオリゴマーである。オリゴマーは、鎖状化合物ともいうことができる。
　したがって、本発明の核酸オリゴマーとは、オリゴヌクレオチド鎖、核酸アナログ鎖、またはヌクレオチドと核酸アナログの混合鎖のいずれかである。
　ＬＳが（Ａ）ヌクレオチドまたは（Ｂ）核酸アナログの場合、ループ部位は核酸オリゴマーとなる。その場合、ヘッドピースは核酸合成機で製造できることになり、実務上、顕著に好ましい。
　ＬＳが（Ａ）ヌクレオチドまたは（Ｂ）核酸アナログの場合、ヘッドピースの製造においては、一つの態様として、リンカー部位（Ｌ）および反応性官能基部位（Ｄ）が、ＬＳと結合した核酸合成用モノマーを調製し、そののち核酸オリゴマーを合成することができる。
　そのような核酸合成モノマーの例としては、前述のAmino C6 dT、mdC（TEG-Amino）、Uni-Link（商標登録）Amino Modifierなどが挙げられる。
　この態様の場合、たとえば当該モノマーであるmdC（TEG-Amino）の構造のうち、ヌクレオチド部分が連結部位（ＬＳ）に相当し、塩基から伸長する側鎖部分がリンカー部位（Ｌ）および反応性官能基部位（Ｄ）に相当する。
　調製において、反応性官能基（Ｄ）は保護基で保護されていても良い。
　その場合、一つの態様として、核酸アナログは、以下の化合物（Ｂ６）である。
（Ｂ６）ヌクレオチドの塩基部に、前記（－Ｌ－Ｄ）が結合した化合物。
　一つの態様として、核酸アナログは、以下の化合物（Ｂ６１）、（Ｂ６２）、（Ｂ６３）、（Ｂ６４）または（Ｂ６５）である。
（Ｂ６１）（－Ｌ－Ｄ）が（－Ｌ１－Ｄ１）である（Ｂ６）
（Ｂ６２）（－Ｌ－Ｄ）が（－Ｌ２－Ｄ２）である（Ｂ６）。
（Ｂ６３）（－Ｌ－Ｄ）が（－Ｌ３－Ｄ３）である（Ｂ６）。
（Ｂ６４）（－Ｌ－Ｄ）が（－Ｌ４－Ｄ４）である（Ｂ６）。
（Ｂ６５）（－Ｄ）が（－Ｄ５）である（Ｂ６１）～（Ｂ６４）のいずれかに記載の化合物。
　ＬＳが（Ａ）ヌクレオチドまたは（Ｂ）核酸アナログの場合、ヘッドピースの製造においては、一つの態様として、先に核酸オリゴマーを合成し、そののち前記リンカー部位（Ｌ）および反応性官能基部位（Ｄ）を結合させることができる。
　その場合において、リンカー部位が結合する相手の「特定の核酸アナログ」を、連結部位（ＬＳ）としてヘアピン部位（核酸アナログオリゴマー）の中に入れておくことが好ましい。当該「特定の核酸アナログ」の例としては、前述のAmino C6 dT、mdC（TEG-Amino）、Uni-Link（商標登録）Amino Modifierを挙げることができる。
　この態様の場合、たとえばmdC（TEG-Amino）自体が連結部位（ＬＳ）に相当し、塩基側鎖から、さらに結合する付加部位が、リンカー部位（Ｌ）および反応性官能基部位（Ｄ）に相当する。
（ｐとｑについて）
　前述のとおり、前記ループ部位の鎖長は、第１のオリゴヌクレオチド鎖（Ｅ）と第２のオリゴヌクレオチド鎖（Ｆ）が分子内で二重鎖を形成し、ヘッドピースがヘアピン構造を形成する鎖長であることが好ましい。
一つの態様として、ｐとｑの総数は１～４０である。
一つの態様として、ｐとｑの総数は２～２０である。
一つの態様として、ｐとｑの総数は２～１０である。
一つの態様として、ｐとｑの総数は２～７である。
　一つの態様として、本発明のループ部位は、
（Ａ）ヌクレオチド
および以下の核酸アナログ（Ｂ４１）、（Ｂ４２）、（Ｂ４３）、（Ｂ４４）または（Ｂ５２）により構成される。
（Ｂ４１）d-Spacer 
（Ｂ４２）Amino C6 dT
（Ｂ４３）mdC（TEG-Amino）
（Ｂ４４）Uni-Link（商標登録）Amino Modifier
（Ｂ５２）トリエチレングリコールリン酸エステル
　一つの態様として、ＬＳはＢ４２、Ｂ４３またはＢ４４が好ましい。
　また一つの態様として、ＬＰ１およびＬＰ２は、Ａ、Ｂ４１またはＢ５２が好ましい。
　一つの態様として、ループ部位は、以下の（Ｘ１）乃至（Ｘ９）記載の配列による核酸オリゴマーである。
（Ｘ１）Ａ－Ｂ４１－Ｂ４２－Ｂ４１－Ａ
（Ｘ２）Ａ－Ｂ４１－Ｂ４３－Ｂ４１－Ａ
（Ｘ３）Ａ－Ｂ４１－Ｂ４４－Ｂ４１－Ａ
（Ｘ４）Ｂ４１－Ｂ４１－Ｂ４２－Ｂ４１－Ｂ４１
（Ｘ５）Ｂ４１－Ｂ４１－Ｂ４３－Ｂ４１－Ｂ４１
（Ｘ６）Ｂ４１－Ｂ４１－Ｂ４４－Ｂ４１－Ｂ４１
（Ｘ７）Ｂ５２－Ｂ４２－Ｂ５２
（Ｘ８）Ｂ５２－Ｂ４３－Ｂ５２
（Ｘ９）Ａ５２－Ａ４４－Ａ５２
　前記のヘッドピースにおいて、切断可能な部位の数は、好ましくは５つ以内であり、１乃至２つがより好ましい。
　前記のヘッドピースにおいて、切断可能な部位が２つ以上の場合、少なくとも１つの切断可能な部位は、第１のオリゴヌクレオチド鎖中にあるか、第１のオリゴヌクレオチド鎖とリンカー結合部位との間にあり、かつ少なくとも１つの切断可能な部位は、第２のオリゴヌクレオチド鎖中にあるか、第２のオリゴヌクレオチド鎖とリンカー結合部位との間にあることが好ましい。
　一つの態様として、前記のヘッドピースにおいて、切断可能な部位の位置は、ループ部位と、第１のオリゴヌクレオチド鎖もしくは第２のオリゴヌクレオチド鎖との結合部分を起点として、好ましくは２０塩基以内であり、より好ましくは１０塩基以内であり、さらに好ましくは３塩基以内である。
　一つの側面として、本発明は、切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に含むＤＥＬを、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導し、評価する方法における適切な条件を提供する。
　一つの態様として、前記のヘッドピースにおいて、切断可能な部位の位置は、ループ部位と、第１のオリゴヌクレオチド鎖もしくは第２のオリゴヌクレオチド鎖との結合部分を起点として、３‘方向に存在し、好ましくは２０塩基以内であり、より好ましくは１０塩基以内であり、さらに好ましくは３塩基以内であり、最も好ましくは１塩基以内である。
　念のための説明であるが、「選択的に切断可能な部位」の好ましい態様と、例えばＥ、Ｆ又はＬＰなどの好ましい態様は、それぞれ別の概念である。すなわち、「選択的に切断可能な部位」の位置が、Ｅに含まれた場合であっても、Ｅの好ましい態様が、「選択的に切断可能な部位」に適用されるわけではない。
　一つの態様として、本発明のＤＥＬを構成する化合物は次の式（ＩＩ）で示される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
（式中、
ＸおよびＹは、オリゴヌクレオチド鎖であり、
ＥおよびＦは、それぞれ独立して
ヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
ただし、ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
ＬＰは、ループ部位であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、反応性官能基由来の２価の基であり、
Ｓｐは、結合又は２官能性スペーサーであり、
Ａｎは、少なくとも１つのビルディングブロックにより構成される部分構造である。）
で表される化合物であり、
ＸとＹは、少なくとも一部で二重鎖を形成しうる配列を有し、
Ｘは５‘末端でＥに結合し、
Ｙは３‘末端でＦに結合し、
Ｅ、Ｆ、又はＬＰの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有する化合物。
　一つの態様として、前述の式（ＩＩ）で示される化合物におけるＥ、Ｆ、ＬＰ、ＬおよびＤの好ましい態様は、前述の式（Ｉ）に関し説明したＥ、Ｆ、ＬＰ、ＬおよびＤの好ましい態様と同様である。
　Ｘ、Ｙ、Ｓｐ、およびＡｎの好ましい態様は別途説明される。
　（２官能性スペーサー）
　前記のとおり、２官能性スペーサーは、化合物ライブラリの部分構造Ａｎとヘッドピースとの結合を可能にする少なくとも２つの反応基を有するスペーサー部分である。一つの態様として、２官能性スペーサーはＳｐＤ－ＳｐＬ－ＳｐＸである。
　ＳｐＸは、ヘッドピースの反応性官能基と共有結合を形成する反応基である。
　ＳｐＤは、化合物ライブラリの部分構造Ａｎと共有結合を形成する反応基である。
　ＳｐＬは、化学的に不活性なスペーシング部分である。
　なお、反応性官能基（Ｄ）と同様に、反応基（ＳｐＸ）は、２官能性スペーサー単体（ヘッドピースと結合させる前の試薬の状態）において一価の基（－ＳｐＸ）となり、ＤＥＬ（ヘッドピースと結合した状態）においては前記（－ＳｐＸ）に基づく「反応基由来の２価の基」（－ＳｐＸ－）となる。
　また同様に、反応基（ＳｐＤ）は、Ａｎと結合させる前の状態において一価の基（ＳｐＤ－）となり、ＤＥＬ（Ａｎと結合した状態）においては前記（ＳｐＤ－）に基づく「反応基由来の２価の基」（－ＳｐＤ－）となる。
　ＳｐＸの好ましい態様は、アミノ、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、又はスルホンアミド結合を形成する反応性基である。一つの態様として、ＳｐＸはヘッドピースの反応性官能基がアミノ基であった場合に適した反応性基である、以下の（ＳｐＸ１）、（ＳｐＸ２）または（ＳｐＸ３）の構造である。
　（ＳｐＸ１）：カルボキシ基、ハロゲン化カルボキシ基、アルデヒド基、またはハロゲン化スルホニル基
　（ＳｐＸ２）：カルボキシ基、またはハロゲン化スルホニル基
　（ＳｐＸ３）：カルボキシ基
　ＳｐＤの好ましい態様は、前述のＤと同じである。
　一つの態様として、ＳｐＤは前述の（Ｄ１）、（Ｄ２）、（Ｄ３）、（Ｄ４）または（Ｄ５）である。
　ＳｐＬの好ましい態様は、下記の態様である。
　一つの態様として、ＳｐＬは前述の（Ｌ１）、（Ｌ２）、（Ｌ３）、（Ｌ４）又は（Ｌ５）である。
　一つの態様として、ＳｐＬは以下の（ＳｐＬ１）、（ＳｐＬ２）または（ＳｐＬ３）である。
　（ＳｐＬ１）ポリアルキレングリコール、ポリエチレン、任意にヘテロ原子で置き換えられても良いＣ１～２０脂肪族炭化水素、ペプチド、オリゴヌクレオチド、またはこれらの組み合わせ。
　（ＳｐＬ２）ポリアルキレングリコール、ポリエチレン、Ｃ１～１０脂肪族炭化水素、またはペプチド
　（ＳｐＬ３）ポリエチレングリコール、またはポリエチレン
　一つの態様として、２官能性スペーサーは、以下のとおりである。
　（Ｓｐ１）：（Ｄ４）－（ＳｐＬ１）－（ＳｐＸ１）
　（Ｓｐ２）：（Ｄ４）－（ＳｐＬ２）－（ＳｐＸ２）
　（Ｓｐ３）：（Ｄ４）－（ＳｐＬ３）－（ＳｐＸ３）
　（Ｓｐ４）：（Ｄ５）－（ＳｐＬ１）－（ＳｐＸ１）
　（Ｓｐ５）：（Ｄ５）－（ＳｐＬ２）－（ＳｐＸ２）
　（Ｓｐ６）：（Ｄ５）－（ＳｐＬ３）－（ＳｐＸ３）
　一つの態様として、ＤＥＬを構成する化合物の（Ｓｐ－Ｄ－Ｌ）部分は、以下の（ＳｐＤＬ１）、（ＳｐＤＬ２）、（ＳｐＤＬ３）（ＳｐＤＬ４）、（ＳｐＤＬ５）、（ＳｐＤＬ６）、（ＳｐＤＬ７）、（ＳｐＤＬ８）、（ＳｐＤＬ９）、または（ＳｐＤＬ１０）のように構成される。
　（ＳｐＤＬ１）：（Ｄ４）－（Ｌ１）
　（ＳｐＤＬ２）：（Ｄ５）－（Ｌ１）
　（ＳｐＤＬ３）：（Ｄ４）－（Ｌ２）
　（ＳｐＤＬ４）：（Ｄ５）－（Ｌ２）
　（ＳｐＤＬ５）：（Ｓｐ１）－（Ｄ５）－（Ｌ５）
　（ＳｐＤＬ６）：（Ｓｐ２）－（Ｄ５）－（Ｌ５）
　（ＳｐＤＬ７）：（Ｓｐ３）－（Ｄ５）－（Ｌ５）
　（ＳｐＤＬ８）：（Ｓｐ４）－（Ｄ５）－（Ｌ５）
　（ＳｐＤＬ９）：（Ｓｐ５）－（Ｄ５）－（Ｌ５）
　（ＳｐＤＬ１０）：（Ｓｐ６）－（Ｄ５）－（Ｌ５）
　なお、（ＳｐＤＬ１）、（ＳｐＤＬ２）、（ＳｐＤＬ３）、（ＳｐＤＬ４）において、Ｓｐは結合を意味する。
　本発明の実施において、ヘッドピースは核酸合成装置で合成できると有利である。当該実施においては、前述のとおり、一つの態様として、リンカー部位（Ｌ）および反応性官能基部位（Ｄ）が、ＬＳと結合した核酸合成用モノマーを調製し、そののち核酸オリゴマーを合成することができる。そのような核酸合成モノマーの例としては、前述のAmino C6 dT、mdC（TEG-Amino）、Uni-Link（商標登録）Amino Modifierなどが挙げられる。
　一方、上記のような市販の核酸合成モノマーまたは核酸合成機で使用可能な核酸アナログを用いた場合、リンカー部位の長さが制限される可能性がある。そのような場合、一つの態様として、適切な２官能性スペーサーを導入することで、ヘッドピースとＡｎの距離を調整することが可能となり、発明の実施において有利となる。
　本発明の説明において、「Ｃ１～Ｃ６のアルキル基」や「Ｃ１～６アルキル基」のような用語における「Ｃ１～Ｃ６の」や「Ｃ１～６」とは炭素数が１乃至６個であることを意味する。同様にｍ、ｎが整数の場合に、「Ｃｍ～Ｃｎの」や「Ｃｍ～ｎ」との記載があった場合、当該記載は炭素数がｍ～ｎ個であることを意味する。したがって「Ｃ１～Ｃ６のアルキル基」や「Ｃ１～６アルキル基」とは炭素数が１乃至６個であるアルキル基を、「Ｃ１～Ｃ６のアルキレン」や「Ｃ１～６アルキレン」とは炭素数が１乃至６個であるアルキレンを意味する。
　本発明で「Ｃ１～６アルキル」とは、炭素原子数が１ないし６個である直鎖または分岐鎖状のアルキル基を意味する。具体例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
　本発明で「Ｃ１～３アルキル」とは、炭素原子数が１ないし３個である直鎖または分岐鎖状のアルキル基を意味する。具体例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルである。
　本発明で「Ｃ１～６アルコキシ」とは、炭素原子数が１ないし６個である直鎖または分岐鎖状のアルコキシを意味する。具体例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどが挙げられる。
　本発明で「Ｃ１～３アルコキシ」とは、炭素原子数が１ないし３個である直鎖または分岐鎖状のアルコキシを意味する。具体例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシである。
　本発明で「炭化水素」とは、炭素原子および水素原子のみから構成される鎖状、分岐鎖状または環状の飽和または不飽和の化合物を意味する。
　本発明で「脂肪族炭化水素」とは、炭化水素のうち、非芳香族のものを意味する。「脂肪族炭化水素」は、鎖状、分岐鎖状または環状であっても良く、また飽和または不飽和であって良い。構造の具体例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル若しくはシクロアルケニル、又はこれらの組合せによる構造が挙げられる。
　本発明で「Ｃ１～２０脂肪族炭化水素」とは、炭素原子数が１ないし２０個である脂肪族炭化水素を意味する。
　本発明で「Ｃ１～１０脂肪族炭化水素」とは、炭素原子数が１ないし１０個である脂肪族炭化水素を意味する。
　本発明で「Ｃ１～６脂肪族炭化水素」とは、炭素原子数が１ないし６個である脂肪族炭化水素を意味する。
　本発明で「芳香族炭化水素」とは、炭化水素のうち、芳香族のものを意味する。
　本発明で「Ｃ６～１４芳香族炭化水素」とは、炭素原子数が６ないし１４個である芳香族炭化水素を意味する。具体例としては、ベンゼン、ナフタレン、アントラセンが挙げられる。
　本発明で「Ｃ６～１０芳香族炭化水素」とは、炭素原子数が６ないし１０個である芳香族炭化水素を意味する。具体例は、ベンゼン又はナフタレンである。
　本発明の芳香族複素環は、環構造内にヘテロ原子として、窒素、酸素及び硫黄からなる群より単独又は異なって選ばれる元素を有する芳香族の複素環である。
　一つの態様として、芳香族複素環は、炭素原子を１～９個有する「Ｃ１～９芳香族複素環」であり、一つの態様として、「Ｃ１～９芳香族複素環」は、５～１０員の芳香族複素環」である。
　一つの態様として、芳香族複素環は、炭素原子を１～５個有する「Ｃ１～５芳香族複素環」であり、一つの態様として、「Ｃ１～５芳香族複素環」は、５～６員の芳香族複素環」である。
　一つの態様として、芳香族複素環は、炭素原子を２～９個有する「Ｃ２～９芳香族複素環」であり、一つの態様として、「Ｃ２～９芳香族複素環」は、５～１０員の芳香族複素環」である。
　一つの態様として、芳香族複素環は、炭素原子を２～５個有する「Ｃ２～５芳香族複素環」であり、一つの態様として、「Ｃ２～５芳香族複素環」は、５～６員の芳香族複素環」である。
　本発明の含窒素芳香族複素環は、環構造内にヘテロ原子として、窒素を有する芳香族の複素環である。
　一つの態様として、含窒素芳香族複素環は、炭素原子を１～５個有する「Ｃ１～５含窒素芳香族複素環」であり、一つの態様として、「Ｃ１～５含窒素芳香族複素環」は、５～６員の芳香族複素環」である。
　一つの態様として、含窒素芳香族複素環は、炭素原子を２～５個有する「Ｃ２～５含窒素芳香族複素環」であり、一つの態様として、「Ｃ２～５含窒素芳香族複素環」は、５～６員の芳香族複素環」である。
　本発明の非芳香族複素環は、環構造内にヘテロ原子として、窒素、酸素及び硫黄からなる群より単独又は異なって選ばれる元素を有する非芳香族の複素環である。
　非芳香族複素環は部分不飽和結合を含んでも良い。
　一つの態様として、非芳香族複素環は、炭素原子を２～９個有する「Ｃ２～９非芳香族複素環」であり、一つの態様として、「Ｃ２～９非芳香族複素環」は、５～１０員の非芳香族複素環」である。
　本発明で「Ｃ１～１４の３価の基」とは、炭素原子数が１ないし１４個である化合物に由来する３価の基を意味する。本発明の効果を達成する限り、構造は限定されない。
　本発明で「ヘテロ原子で置き換えられても良い」との記載があった場合、ヘテロ原子とは、炭素および水素以外の原子を意味する。
　当該ヘテロ原子は、好ましくは、酸素原子、窒素原子、ケイ素原子、リン原子、又は硫黄原子であり、より好ましくは、酸素原子、窒素原子又は硫黄原子である。
　したがって、例えば炭化水素の例としてプロピル（－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ３）を挙げると、「ヘテロ原子で置き換えられても良いプロピル」とは、アルキル中のメチレン（－ＣＨ２－）が、酸素に置き換えられたエーテル（（－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３）若しくは（－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３））や、窒素に置き換えられたアミン（（－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ３）若しくは（－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ３））などの構造を含有する概念である。
　本発明で「置換基を有しても良い」との記載があった場合、その置換基は、本発明の目的を達成するかぎり限定されない。
　当該置換基は、好ましくは、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルコキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、オキソ基若しくはハロゲン原子である。
　当該置換基は、より好ましくは、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルコキシ基、フッ素原子若しくは塩素原子である。
　本発明でポリペプチド及びペプチドとは、アミノ酸がつながって形成される化合物又は部分構造を意味する。アミノ酸とは、アミノ基とカルボキシ基の両方の官能基を持つ有機化合物の総称である。本発明のポリペプチド及びペプチドを構成するアミノ酸は、特に限定されず修飾アミノ酸などを含む。生命科学分野における一般的な用法にしたがい、本発明ではプロリン（イミノ酸に分類される）もアミノ酸に含める。本発明のポリペプチド及びペプチドを構成するアミノ酸は、好ましくはαアミノ酸であり、より好ましくは「タンパク質を構成するアミノ酸」である。　
　本発明の、ハロゲン原子はフッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子が挙げられる。
　Ｃ―Ｃ、アミノ、エーテル、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホンアミド、及びスルホニル結合とは、各々の名称により理解される化学構造を有する化学結合である。当業者は、例えば、エーテル結合は一般に“－Ｏ－”で表現されうる結合であり、カルボニル結合は一般に“－Ｃ（＝Ｏ）－”で表現されうる結合であることを理解する。アミノ、アミド及びウレア結合は、窒素原子上に水素原子又はその他の置換基を有するが、本発明の効果を有する限り窒素原子上の構造は限定されない。前記窒素原子上の置換基は、好ましくはＣ１～６アルキル基又は水素原子であり、より好ましくは水素原子である。また、言及するまでもないが、Ｃ－Ｃ結合とは炭素―炭素結合を意味する。Ｃ－Ｃ結合には単結合、二重結合、及び三重結合が含まれる。一つの態様として、本発明の製造方法の工程ａ及び／又はｃでは、上記１１種から適宜選択される結合が構築される。これら１１種の結合は、有機化学における特に基本的な結合様式であり、それらを構築するための反応も当業者に周知である。したがって本発明の化合物ライブラリの部分構造Ａｎを設計・構築するにあたり、当業者であれば、これら１１種の結合を適宜組みわせて用いることができる。
　Ｈ、Ｂ、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる元素群より単独又は異なって選ばれる元素により構成される有機化合物とは、前記１２種の元素の結合により構築される有機化合物である。
　一つの態様として、本発明の化合物ライブラリの部分構造Ａｎは、上記１２種の元素により構築される。これら１２種の元素は、有機化合物における特に基本的な元素であり、それらを構築するための反応も当業者に周知である。したがって本発明の化合物ライブラリの部分構造Ａｎを設計・構築するにあたり、当業者であれば、これら１２種の元素を適宜組みあわせて用いることができる。
　アリール基、非芳香族シクリル基、ヘテロアリール基及び非芳香族ヘテロシクリル基からなる置換基群より単独又は異なって選ばれる置換基を有する低分子有機化合物とは、各々の名称により理解される化学構造を有する低分子有機化合物である。低分子化合物は、当業者に周知の概念であり、本発明における低分子化合物の好ましい分子量の例は、別途言及される。
　本発明のアリール基は、好ましくはＣ６～１０アリール基であり、より好ましくはフェニル基である。
　本発明の非芳香族シクリル基は、好ましくは、５員から８員の非芳香族シクリル基であり、より好ましくは５員又は６員の非芳香族シクリル基である。当該非芳香族シクリル基は部分不飽和結合を含んでも良い。
　本発明のヘテロアリール基及び非芳香族ヘテロシクリル基は、環構造内にヘテロ原子として、窒素、酸素及び硫黄からなる群より単独又は異なって選ばれる元素を有する基である。本発明のヘテロアリール基、非芳香族ヘテロシクリル基は、好ましくは、５員から８員の基であり、より好ましくは５員又は６員の基であり、非芳香族ヘテロシクリル基は部分不飽和結合を含んでも良い。
　一つの態様として、本発明の化合物ライブラリの部分構造Ａｎは、上記４種の基を有する。これら４種の基は、有機化合物における特に基本的な部分構造であり、それらを化合物中に構築するための反応も当業者に周知である。したがって本発明の化合物ライブラリの部分構造Ａｎを設計・構築するにあたり、当業者であれば、これら４種の基を適宜組みわせて用いることができる。
　前記の好ましい態様、すなわち、１１種の結合、１２種の元素、及び／又は４種の基で構築される化合物ライブラリは、特に核心的な価値を有する。したがって、これらの好ましい態様を外して構築した化合物ライブラリは、一般的には用途が限定され、多くの場合に商業的価値も限定されたものになることを、当業者は理解するであろう。
　Ａｎの合成履歴とは、Ａｎが合成されるまでに行われた操作全般の記録を意味し、とくに、Ａｎが合成されるまでに使用されたビルディングブロックの構造とその順序を意味する。例えば、２つ以上の別個の反応容器にて、それぞれ異なるビルディングブロックの使用、及び／又は異なる反応条件により反応が実行される場合に、反応の前、もしくは後に、あらかじめ決めておいた配列のオリゴヌクレオチド鎖を、それぞれの反応容器中の生成物に連結させることで、合成履歴がオリゴヌクレオチドの配列情報として付与される。このような操作をＡｎが構築されるまでの間、繰り返し行うことで、Ａｎの合成履歴を有するＢｎのオリゴヌクレオチドが構築される。
　スプリット・アンド・プール合成とは、ゲイセンらがコンビナトリアル化学の創成期に固相合成法を利用したペプチドライブラリのコンビナトリアル化学的な構築法として開発した合成法である。スプリット・アンド・プール合成は、スプリット・ミックス法などとも呼ばれる。
　上記経緯に従い、固相合成法を利用したペプチドライブラリの合成を例に説明すると、スプリット・アンド・プール合成では、ペプチド増端の段階ごとに、アミノ酸をペプチド結合させた固相担体からサンプルを切り出すことなく、一旦Ｎ種の担体を混合均一化させた後に等分して次のＮ種のアミノ酸を増端させる。
　すなわち担体ごとに１種類のペプチド鎖が生成することになり、各段階で天然アミノ酸２０種全てを適用すれば特定の長さのペプチドについて全ての組み合わせ可能なペプチドライブラリを構築することになる。
　このペプチドライブラリは抗原提示や受容体結合でスクリーニングするのであれば、ＥＬＩＳＡ法などを利用すれば固相担体上のペプチドを利用してアッセイを実施できる。つまり担体から試料のペプチドを切り出す必要は無く、アッセイに反応した担体粒子を拾い上げる（たとえは光学顕微鏡で０．１ｍｍほどの蛍光標識された担体粒子を拾い上げる）。そしてその粒子のペプチドを機器分析装置（ペプチドアナライザー等）で目的のペプチド配列を決定したり、他のコンビナトリアル化学的同定方法（例えばタグ法）などで間接的にスクリーニングの候補となったペプチド配列を決定したりすることができる。
　さらに本発明の製造方法において、ｍが２のときにｖ種類、ｍが３の場合にｗ種類の構造を、スプリット・アンド・プール合成で合成する場合を例として説明する。なお、本説明では、工程を（ｃ）（ｄ）の順で繰り返す。
（ｍ＝２）
　ｍ＝２のステップは、Ａ１－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ１に対し、工程（ｃ）でα２を、工程（ｄ）でβ２をそれぞれ付加し、Ａ２－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２を製造する。
　ここで、ｖ種類の構造のα２（α２（ａ－ｖ））とそれに対応するｖ種類のβ２（β２（ａ－ｖ））を準備し、各構造について工程（ｃ）（ｄ）をそれぞれ行うと、ｖ種類のＡ２－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２（Ａ２（ａ）－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２（ａ）、Ａ２（ｂ）－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２（ｂ）．．．Ａ２（ｖ）－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２（ｖ）：すなわちＡ２（ａ－ｖ）－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２（ａ－ｖ））が得られる。スプリット・アンド・プール合成では、ｖ種類のＡ２－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２を混合したのち、ｗ個に分割する。分割とは、最も具体的にはｗ個の反応容器に小分けすることを意味する。
（ｍ＝３）
　ｍ＝３のステップは、Ａ２－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２に対し、工程（ｃ）でα３を、工程（ｄ）でβ３をそれぞれ付加し、Ａ３－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ３を製造する。
　ここで、ｗ種類の構造のα３（α３（ａ－ｗ））と、それに対するｗ種類のβ３（β２（ａ－ｗ））を用意し、ｗ個の（Ａ２（ａ－ｖ）－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ２（ａ－ｖ）混合物）に対し、それぞれ工程（ｃ）（ｄ）を実施する。すると、ｎ＝２と３のステップを通じ、（ｖ＋ｗ）回の合成で、（ｖ×ｗ）種類のＡ３－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ３が効率よく合成できることになる。
（生物評価）
　得られたｗ個の生成物を混合すると、（ｖ×ｗ）種類のＡ３－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ３化合物ライブラリの混合物が得られる。例えば、この混合物に対し薬物受容体の結合試験を行えば、（ｖ×ｗ）種類の化合物のスクリーニングを１回で行えることとなる。薬物受容体に結合しなかった化合物を洗い流すことで、結合した化合物のみを単離することができる。本発明のようなＤＥＬでは、単離したＡ３－Ｓｐ－Ｃ－Ｂ３化合物のＤＮＡを配列解読可能な量にまで増幅し、その配列情報によりＡ３の構造が把握できることとなる。
　なお、化合物ライブラリ、ビルディングブロック、スプリット・アンド・プールなどは、コンビナトリアル化学などの分野で当業者に周知に用語であり、以下の文献等を参考に適時行うことができる。
（１）高橋孝志、土井隆行「コンビナトリアルケミストリー」、有機合成化学協会誌、２００２年、 ６０巻、４２６－４３３頁
（２）コンビナトリアルケミストリー研究会編、「コンビナトリアルケミストリー」、化学同人
　ＤＮＡコード化ライブラリ（又はＤＥＬ）とは、ＤＮＡ、もしくはＤＮＡと実質的に同等の機能を有するオリゴヌクレオチドによって標識された化合物（ＤＮＡコード化化合物）の群からなる化合物ライブラリである。上記に記載したようなスプリット・アンド・プール合成によって、標識ＤＮＡには各化合物の構造、もしくは合成履歴が配列情報として付与される。このような特性から、ＤＮＡコード化ライブラリは１０２～１０２０種の化合物の混合物の形態で、スクリーニングし、取得された化合物に含まれるＤＮＡ配列を当技術分野で知られる手法（例えば、次世代シーケンサーの使用及び／又はマイクロアレイの使用）によって同定することにより、化合物の構造を同定することが可能となる。前記スクリーニングの手法の一つの態様として、タンパク質などの標的をＤＮＡコード化ライブラリと接触させ、標的と結合した化合物を選別するという手法が選択されうる。
　「生物学的標的」とは当業者に周知の用語であるが、一つの態様として、本発明において、「生物学的標的」とは、医農薬に代表される薬剤等の開発において標的となりうる生物学的な物質群のことであり、例えば酵素（たとえば、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、プロテアーゼ、およびＤＮＡ修復酵素）、タンパク質：タンパク質相互作用に関係するタンパク質（たとえば、受容体のリガンド）、受容体標的（たとえば、ＧＰＣＲ）、イオンチャンネル、細胞、細菌、ウイルス、寄生虫、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プリオン、または糖質が含まれる。
　「生物活性評価」とは当業者に周知の用語であるが、一つの態様として、本発明において、「生物活性評価」とは、化合物の有する生物活性（例えば、生物学的標的との結合能、酵素活性の阻害機能、酵素活性の促進機能など）の有無、又は強弱を評価することである。生物活性評価の具体例として、前述の特許文献２および３、非特許文献１～６なども参照できる。
　「機能性評価」とは当業者に周知の用語であるが、一つの態様として、本発明において、「機能性評価」とは、化合物の有する特定の機能（例えば、結合能、生物活性、発光特性など）の有無、又は強弱を評価することである。
　本発明は、切断可能な部位を有するＤＮＡ鎖を用いることで、ＤＥＬ、及びＤＥＬの製造方法に関して、いくつかの利点を有する複数の手法を提供する。様式１乃至７を以下に詳細に記述する。
様式１
　本発明は、前記の「切断可能な部位を有するヘアピン型のヘッドピース」を用いたＤＥＬを提供する。
　図１で例示されるように、様式１では、切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に含む第１のオリゴヌクレオチド鎖、ループ部位および第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むヘッドピースを出発原料とし、ビルディングブロックの結合と、該ビルディングブロックに対応するオリゴヌクレオチドタグの２本鎖ライゲーションとを繰り返し（図１では３回）、さらに所望によりプライマー領域を含むオリゴヌクレオチドタグの２本鎖ライゲーションをすることによって、ＤＥＬの製造が達成される。
　図２で例示されるように、様式１では、切断可能な部位をヘッドピースの第１のオリゴヌクレオチド鎖中に含むＤＥＬに対し、酵素などの切断手段を用いて切断可能な部位を切断し、ループ部位で結合されていない２本鎖オリゴヌクレオチドへと誘導することで、高い効率でＰＣＲを行うことができる。
　（様式２について）
　図３で例示されるように、「切断可能な部位を有するヘアピン型のヘッドピース」を用いたＤＥＬでは、切断可能な部位が第２のオリゴヌクレオチド鎖に存在しても良い。様式２の特徴は、切断可能な部位以外には、様式１と同様である。
　（様式３について）
　図４で例示されるように、「切断可能な部位を有するヘアピン型のヘッドピース」を用いたＤＥＬでは、切断可能な部位が、第１と第２の双方のオリゴヌクレオチド鎖に存在しても良い。本態様では、ループ部位が双方のオリゴヌクレオチド鎖から切断されることで、ＰＣＲ効率がさらに向上することが期待される。
　（様式４について）
　図５で例示されるように、本発明では、切断可能な部位が、第１のオリゴヌクレオチド鎖（Ｅ）と第２のオリゴヌクレオチド鎖（Ｆ）の双方に存在しても良く、さらに切断可能な部位の構造は異なっていても良い。そのような場合、２つの（またはそれ以上の）切断可能な部位の特性の差を利用し、切断部位を制御することができる。
　たとえば、第１のオリゴヌクレオチド鎖（Ｅ）での切断可能な部位としてデオキシウリジンを、第２のオリゴヌクレオチド鎖（Ｆ）での切断可能な部位としてデオキシイノシンを用いても良い。
　この場合ＵＳＥＲ酵素を用いると、第１のオリゴヌクレオチド鎖（Ｅ）のデオキシウリジンを選択的に切断できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　一方、アルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを用いると、第２のオリゴヌクレオチド鎖（Ｆ）において、デオキシイノシンを起点とする切断部位を選択的に切断できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　このように、切断部位を所望に応じ選択することで、より幅広いＤＥＬの修飾が可能となり、その後の評価もより幅広い手法が適応可能となる。
が期待できる。
　（様式５について）
　図６で例示されるように、本発明では、切断可能な部位を、ＤＮＡタグ部分（例えばオリゴヌクレオチド鎖（Ｙ））に有することもできる。ＤＮＡタグの末端近くに切断可能な部位を設け、所望に応じて当該部位を切断することで、新たな突出末端を生成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　当該突出末端は粘着末端として利用して、所望の核酸配列、例えばＵＭＩｓ（特定分子識別配列）などをライゲートすることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　生物評価ののち、選抜されたＤＥＬ化合物に対し、上記のようにＵＭＩｓ領域を付与し、ＤＮＡシーケンシングすることで、ＰＣＲによる増幅バイアスが減少した解析が可能となる。
　このように、本発明では、核酸配列に選択的に切断可能な部位を有することで、ＤＥＬ化合物の製造や使用の局面で、従来にない性能を付与することができる。
　ここでＵＭＩｓ（特定分子識別配列）とは、あるサンプル中に含まれるＤＮＡに付与することで、ＤＮＡ分子一つ一つに個別のＤＮＡ配列を与える分子識別子である（文献ネイチャー　メソッド、２０１２年、９巻、７２－７４頁参照）。このような分子識別子をＰＣＲ増幅前に付与することで、サンプル中の特定配列を有するＤＮＡ分子数を定量する際、ＰＣＲ重複（同一分子由来配列）の識別が可能となり、ＰＣＲ増幅バイアスを減少させた定量が可能となる。
（様式６について）
　図７で例示されるように、本発明では、切断可能な部位と、修飾基や機能性分子を組み合わせて使用することでき、例えば、ヘアピン鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変換したＤＥＬを調製することが可能である。
図７に従い、Ｅ部分に切断可能な部位を有するヘッドピースを用いたＤＥＬ化合物を例に挙げる。
（ステップＡ）合成されたＤＥＬ化合物に対し、３‘末端に固相担持除去可能な修飾基（例えばビオチン）を有する２本鎖オリゴヌクレオチド鎖をライゲートする。
（ステップＢ）切断可能な部位を切断する。
（ステップＣ）修飾基の機能に応じた処理を加える。例えばビオチンの場合、ビオチン親和性を有するストレプトアビジンビーズなどを用い、ビオチンが結合したオリゴヌクレオチド鎖を選択的に系中から除去する。それにより、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬを取得することが可能である。
　ここで機能性分子とは、特定の化学的、又は生物学的機能（例えば、溶解性、光反応性、基質特異的反応性、標的タンパク分解誘導特性）を有する分子のことであり、ＤＥＬに付与することで、機能に応じたＤＥＬの評価や精製が可能となる。
　ここでビオチンとは、アビジンと結合するビオチン類全般を意味し、ビタミンＢ７だけでなく、例えばデスチオビオチンをも含む。
　一つの側面として、本発明は、切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に含むＤＥＬを、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導し、評価する方法における適切な条件を提供する。
　ヘアピン鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変換したＤＥＬを調製する別の方法として、次のエキソヌクレアーゼを用いた方法も挙げられる。
　（ステップＡ）「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型を、例えばＵＳＥＲ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅなどの、切断反応後に切断部位の５‘末端がリン酸化された状態で切断される酵素を用いて、切断する。
　（ステップＢ）例えば、ラムダエキソヌクレアーゼによる処理によって、５‘末端がリン酸化されている一方のオリゴヌクレオチド鎖を分解し除去する。それにより、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ（１本鎖ＤＥＬ）を取得する。
　上記で取得される１本鎖ＤＥＬは、好ましくは、オリゴヌクレオチド鎖の３‘方向にライブラリ分子を有する１本鎖ＤＥＬである。該１本鎖ＤＥＬは、５‘末端にクロスリンカーを有するクロスリンカー修飾プライマーを用いて、プライマー伸長反応の実施が可能である。本手法により、クロスリンカーが、コード配列を有するオリゴヌクレオチドと、共有結合を介して連結されている「クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」を容易に合成可能となる。 
　上記の３‘方向にライブラリ分子を有する１本鎖ＤＥＬを取得する場合、原料となるヘアピン型ＤＥＬの「選択的に切断可能な部位」は、ライブラリ分子が結合している部位より３‘方向に存在している。
　図８で例示されるように、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬは、所望の機能部位を有する修飾オリゴヌクレオチド（例えば光反応性クロスリンカーなどのクロスリンカー修飾ＤＮＡや、光反応性クロスリンカーなどのクロスリンカー修飾プライマー）と２本鎖を形成させることで、新たな機能を付与することが可能となる。
　さらに、クロスリンカー修飾プライマーを用いた場合は、任意で付与したプライマーを伸長し、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物に誘導しても良い。そのようなクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物は、スクリーニング後に、生物学的標的とコード配列との間に共有結合が形成されるため、本発明において有用である。
（様式７について）
　図９で例示されるように、本発明では、切断可能な部位を利用し、クロスリンカーを導入することができる。
　図９に従い、Ｅ部分に切断可能な部位を有するヘッドピースを用いたＤＥＬ化合物を例に挙げる。
（ステップＡ）合成されたＤＥＬ化合物に対し、切断可能な部位を切断する。
（ステップＢ）所望の機能部位を有する修飾プライマー（例えば光反応性クロスリンカーなどのクロスリンカー修飾プライマー）を付与する。
（ステップＣ）付与したプライマーを伸長し、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物を合成する。
　ＤＥＬ評価の場面において、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物は、ビルディングブロック化合物（ライブラリ低分子化合物）が標的タンパクに結合する際、さらにクロスリンカーを標的タンパクに結合させることができ、検出感度を顕著に向上させることができる（非特許文献７、１１など参照）。非常に多数のライブラリ化合物を評価するＤＥＬ技術の実務上、ライブラリ化合物のアフィニティーを増強し、検出感度を向上させることは、非常に有用である。
　本発明は、斬新で高効率なクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物の製造法を提供するものであり、非常に有用である。
　一つの側面として、本発明は、切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に含むＤＥＬを、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導し、評価する方法における適切な条件を提供する。
　　一つの態様として、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物は、クロスリンカーが、コード配列を有するオリゴヌクレオチドと、共有結合を介して連結されていることが好ましい。このような「クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物」は、スクリーニング後に、標的とコード配列との間に共有結合が形成され、非特異な結合剤の除去などのために、従来よりも強い分離や溶出条件にも耐性があり、非常に有用である。
　（クロスリンカー）
　一つの態様として、本発明において、「クロスリンカー」とは、タンパク質や核酸分子などの生物学的標的との反応により、共有結合形成可能な反応性を有する反応性基を意味する。例えば、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｈａｎｄｂｏｏｋに掲載のようなクロスリンカーが知られている。
　本発明で用いられるクロスリンカーは、好ましくは、アジド基、ジアジリン基、スルホニルフルオリド基、ジアゾ基、シンナモイル基、またはアクリレート基を少なくとも一つ含む反応性基であり、より好ましくは、アジド基、ジアジリン基、またはスルホニルフルオリド基を少なくとも一つ含む反応性基である。
　一つの態様として、本発明において、「クロスリンカーを有する」、及び「クロスリンカー修飾」とは、クロスリンカーを含む部分構造を置換基として有することを意味する。
　一つの好ましい態様として、「クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」、「クロスリンカー修飾ＤＮＡ」、及び「クロスリンカー修飾プライマー」は、それぞれ「２本鎖ＤＥＬ」、「ＤＮＡ」、及び「プライマー」の５‘末端にクロスリンカーが直接結合するか、２官能性スペーサーを介して結合している。
　その際、クロスリンカーは、次の式（ＡＡ）～（ＡＥ）または（ＢＡ）もしくは（ＢＢ
）のいずれかの構造であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
（式中、＊は「２本鎖ＤＥＬ」、「ＤＮＡ」、又は「プライマー」の５‘末端、もしくは該５‘末端と結合している２官能性スペーサー側との結合位置を意味する）
　一つの好ましい態様として、本発明で用いられるクロスリンカーは、光反応性クロスリンカーである。本発明で、光反応性クロスリンカーとは、光照射により反応活性の高い反応性基（例えば、ナイトレン、及びカルベン）に変化し、近傍の生物学的標的と共有結合を形成する反応性基を意味する。例えば、アジド基、及びジアジリン基が知られており、前記の式（ＡＡ）～（ＡＥ）の構造が知られている。
　また、一つの好ましい態様として、本発明で用いられるクロスリンカーは、スルホニルフルオリド基を少なくとも一つ含む反応性基である。スルホニルフルオリド基は、例えば、生物学的標的タンパク中のセリン、トレオニン、チロシン、リジン、システイン、及びヒスチジンなどの残基と反応し、共有結合を形成する。例えば、前記の式（ＢＡ）～（ＢＢ）の構造が知られている。
　本発明において、クロスリンカーと生物学的標的との架橋反応は、生物学的標的の望みの高次構造が大きく変化しない温度範囲で実施されることが好ましい。好ましい温度は、例えば、４～４０℃の範囲である。
　（クロスリンカーの２官能性スペーサー）
　前記のとおり、２官能性スペーサーは、化合物ライブラリの部分構造Ａｎとヘッドピースとの結合を可能にする少なくとも２つの反応基を有するスペーサー部分である。
　さらに本発明において、２官能性スペーサーは、クロスリンカーと「２本鎖ＤＥＬ」、「ＤＮＡ」、もしくは「プライマー」との結合を可能にする２つの反応基を有するスペーサー部分である。この態様の２官能性スペーサーを「クロスリンカーの２官能性スペーサー」と呼ぶことがある。対照として、前述の化合物ライブラリに結合する２官能性スペーサーを「化合物ライブラリの２官能性スペーサー」と呼ぶことがある。
　一つの態様として、「クロスリンカーの２官能性スペーサー」の好ましい様態は、前述の「化合物ライブラリの２官能性スペーサー」における好ましい態様と同じである。
　また、一つの態様として、「クロスリンカーの２官能性スペーサー」は、スクリーニング時に、化合物ライブラリが生物学的標的と結合した際、クロスリンカーを生物学的標的と反応させるために適した分子鎖長であることが好ましく、「化合物ライブラリの２官能性スペーサー」と同等の分子鎖長であることが好ましい。
　（コード配列）
　本発明において、「コード配列」とは、ＤＥＬに含まれるオリゴヌクレオチドの配列のうち、ライブラリ分子の構造を同定可能な配列を有するオリゴヌクレオチドの配列部分である。
　「クロスリンカー修飾のための反応基」とは、後述のクロスリンカーユニットと反応しうる反応基であれば、特に制限されない。
　一つの態様として、「クロスリンカー修飾のための反応基」は、クロスリンカーと反応性選択性をもつ反応基である。クロスリンカーと反応選択性をもつことで、クロスリンカーが先に反応して構造変換を受けてしまうなど、クロスリンカーが適用できない反応条件を本発明に適用できるようになる。すなわち、クロスリンカー修飾のための反応基を有するユニットを本発明のプロセスに導入し、クロスリンカーが適用できない反応条件を本発明のプロセスに用い、そののちクロスリンカーユニットと反応させることで、本発明に必要なクロスリンカーを、本発明のクロスリンカー修飾ＤＥＬに導入することができる。
　一つの態様として、「クロスリンカー修飾のための反応基」および「クロスリンカー修飾のための反応基と対となる反応基」は、結合反応における高い親和性をもつ一対の反応基である。この対をそれぞれ有する２つの化合物が結合する場合、たとえ化合物中にさまざまな他の官能基があったとしても、高い選択性をもって当該対が優先的に反応し結合を形成する。
　上記の対の例として、クリック反応における官能基の対が挙げられる。
　「クリック反応」は、当業者に周知の概念である。（H. C. Kolb, M. G. Finn & K. B. Sharpless : Angew. Chem. Int. Ed., 40, 2004（2001）などを参照）
　「クリック反応」は一つの態様として次のとおりに理解される。
　「クリック反応」は、少なくとも以下の特徴、（１）官能基の直交性を呈すること（すなわち、官能性部分は、他の反応性部位と反応することなく、その官能性部分に相補的な反応性部位だけと反応する）、および（２）得られた結合が不可逆的であること（すなわち、反応物が反応して生成物を形成すると、反応物への生成物の分解が困難になる）、またはある場合には、得られた結合が可逆的であり得ること（すなわち、適切な条件下では、反応物に戻る）を有する反応を指す。任意選択的に、「クリック」ケミストリーは、以下の特徴、（１）立体特異性、（２）厳密な精製、雰囲気制御等を伴わない反応条件、（３）容易に利用可能な出発材料および試薬、（４）無害な溶媒を利用できることまたは溶媒を全く利用せずに済むこと、（５）晶出または蒸留によって生成物が単離されること、（６）生理的安定性、（７）熱力学的駆動力が大きいこと（例えば、１０～２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、（８）単一の反応生成物、ならびに（９）高い化学的収率（例えば、５０％超）であること、の一つまたは複数をさらに有することができる。
　一つの態様として、「クロスリンカー修飾のための反応基」および「クロスリンカー修飾のための反応基と対となる反応基」は、好ましくはクリック反応のための反応基であり、より好ましくは、アルキニル基、アルケニル基、アジド基またはテトラジニル基であり、さらに好ましくは式（ＣＡ）～（ＣＬ）のいずれかである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　ここで、「クロスリンカー修飾のための反応基」と「クロスリンカー修飾のための反応基と対となる反応基」の対としては、好ましくは、アルキニル基に対するアジド基、アルケニル基に対するテトラジニル基が挙げられる。これらの対は、いわゆるボルトとナットの関係であり、相互に交換可能である。例えば、「クロスリンカー修飾のための反応基」にアルキニル基を用いた場合、「クロスリンカー修飾のための反応基と対となる反応基」としてアジド基を用いることができる。それらの選択は当業者に周知である。
　「クロスリンカー修飾のための反応基」と「クロスリンカー修飾のための反応基と対となる反応基」の好ましい例としては、前記の（ＣＡ）と（ＣＨ）、（ＣＢ）と（ＣＨ）、（ＣＣ）と（ＣＨ）、（ＣＥ）と（ＣＩ）、（ＣＥ）と（ＣＪ）、（ＣＥ）と（ＣＫ）、（ＣＥ）と（ＣＬ）、（ＣＦ）と（ＣＩ）、（ＣＦ）と（ＣＪ）、（ＣＦ）と（ＣＫ）、（ＣＦ）と（ＣＬ）、（ＣＧ）と（ＣＩ）、（ＣＧ）と（ＣＪ）、（ＣＧ）と（ＣＫ）、（ＣＧ）と（ＣＬ）などが挙げられる。
　「クロスリンカーユニット」とは、前述の「クロスリンカー修飾のための反応基と対となる反応基」およびクロスリンカーを有するユニットであれば、特に制限されない。
　一つの態様として、「クロスリンカーユニット」は、「クロスリンカー修飾のための反応基と対となる反応基」、「２官能スペーサー」および「クロスリンカー」で構成される。「２官能スペーサー」」の態様は前述のとおりである。
　「クロスリンカー修飾のための反応基を有するＤＮＡ」とは、前述の前述の「クロスリンカー修飾のための反応基」を有する化合物であれば、特に制限されない。
　一つの態様として、「クロスリンカー修飾のための反応基を有するＤＮＡ」は、「クロスリンカー修飾のための反応基」、「２官能スペーサー」および「ＤＮＡ」で構成される。「２官能スペーサー」」の態様は前述のとおりである。
　「クロスリンカー修飾のための反応基を有する修飾プライマー」の態様は、前述の「クロスリンカー修飾プライマー」が参照される。ただし、「クロスリンカー」を「クロスリンカー修飾のための反応基」と読み替えて参照する。
　以下に実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　なお、実施例における各種の配列の核酸は、例えば、核酸自動合成機により定法にしたがい調製することができる。核酸自動合成機の例としては、ｎＳ－８II（ジーンデザイン社製）などが挙げられる。また、核酸の調製には、委託合成やコントラクトラボなどを利用することもできる。当業者に周知にコントクトラボとしては、ジーンデザイン社やＬＧＣ　Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社などが挙げられる。一般に
これらコントラクトラボは、秘密保持契約のもと、委託者の指定した配列の核酸を調製し、委託者に納入する。
実施例１
　［デオキシウリジンを含むヘアピン型ＤＥＬの部分構造のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の検証］
　表１に示す配列の化合物を、核酸自動合成機ｎＳ－８II（ジーンデザイン社製）を使用して調製した。なお、表１中の配列表記において、当業者には明らかであるが、各配列単位間はリン酸ジエステル結合で結合していて、「Ａ」はデオキシアデノシンを意味し、「Ｔ」はチミジンを意味し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを意味し、「Ｃ」はデオキシシチジンを意味し、「（ｄＵ）」はデオキシウリジンを意味し、「（ｐ）」はリン酸を意味し、「（ａｍｉｎｏ－Ｃ６－ｄＴ）」は次の式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
で表される修飾核酸を意味し、「（ａｍｉｎｏ－ＮＣ６－ｄＴ）」は次の式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
で表される修飾核酸を意味し、「（ｄＳｐａｃｅｒ）」は次の式（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
で表される基を意味し、「（ａｍｉｎｏＣ７）」は次の式（４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
で表される基を意味する。また、ａｍｉｎｏ－ＮＣ６－ｄＴは、（米国化学会誌，１９９３年、１１５巻、７１２８－７１３４貢）に記載の方法に準じて合成した次の式（５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　の核酸合成試薬を用いて導入した。
　表１中、左カラムの“Ｎｏ．”は配列番号を表し、右カラムの“Ｓｅｑ．”は配列を表す。配列は左側が５‘側を表し、右側が３’側を表す。また、各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．１：Ｕ－ＤＥＬ１－ｓｈ　　　Ｎｏ．２：Ｕ－ＤＥＬ２－ｓｈ
Ｎｏ．３：Ｕ－ＤＥＬ３－ｓｈ　　　Ｎｏ．４：Ｕ－ＤＥＬ４－ｓｈ
Ｎｏ．５：Ｕ－ＤＥＬ５－ＨＰ　　　Ｎｏ．６：Ｕ－ＤＥＬ６－ＨＰ
Ｎｏ．７：Ｕ－ＤＥＬ７－ＨＰ　　　Ｎｏ．８：Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰ
Ｎｏ．９：Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ　　　Ｎｏ．１０：Ｕ－ＤＥＬ１０－ＨＰ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
　表１に示す配列の化合物それぞれ０．１ｍＭ水溶液を調製し、以下の手順でＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の検討を行った。
　ＰＣＲチューブに、１μＬの表１に示す配列の化合物０．１ｍＭ水溶液；１０μＬのＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｂ７２０４Ｓ）及び７９μＬの脱イオン水を加えた。溶液に１０μＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｍ５５０５Ｓ）を加え、得られた溶液を３７℃でインキュベーションを開始した。
　各反応溶液をインキュベーション開始後、１時間、及び３時間経過した後に、それぞれ２０μＬサンプリングした。Ｕ－ＤＥＬ１－ｓｈ、Ｕ－ＤＥＬ５－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ６－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ７－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ、及びＵ－ＤＥＬ１０－ＨＰは２０時間経過後もそれぞれ２０μＬサンプリングした。Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰ、及びＵ－ＤＥＬ９－ＨＰは、さらに９０℃で１時間インキュベーションした後に、それぞれ２０μＬサンプリングした。
　サンプリングした溶液のうち、Ｕ－ＤＥＬ１－ｓｈ、Ｕ－ＤＥＬ２－ｓｈ、Ｕ－ＤＥＬ３－ｓｈ、及びＵ－ＤＥＬ４－ｓｈは以下に示す分析条件１で分析を行い、Ｕ－ＤＥＬ５－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ６－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ７－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ、及びＵ－ＤＥＬ１０－ＨＰは以下に示す分析条件２で分析を行った。
分析条件１：
装置：ｍａＸｉｓ（Ｂｒｕｋｅｒ製）、ＵｌｔｉＭａｔｅ　３０００（Ｄｉｏｎｅｘ製）
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ＢＥＨ　Ｃ１８　Ｃｏｌｕｍｎ（１３０Å、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ）
カラム温度：５０℃
溶媒：
　　Ａ液：水（０．７５％　ｖ／ｖ　ヘキサフルオロイソプロパノール；０．０３８％　ｖ／ｖ　トリエチルアミン；５μＭ　エチレンジアミン四酢酸）
　　Ｂ液：９０％　ｖ／ｖ　メタノール水溶液（０．７５％　ｖ／ｖ　ヘキサフルオロイソプロパノール；０．０３８％　ｖ／ｖ　トリエチルアミン；５μＭ　エチレンジアミン四酢酸）
グラジエント条件：
流速０．３６ｍＬ／ｍｉｎ、Ａ液とＢ液の混合比を９５／５（ｖ／ｖ）に固定して測定開始し、０．５６分後に５．５分間でＡ液とＢ液の混合比を４０／６０（ｖ／ｖ）に直線的に変えた。
検出波長：２６０ｎｍ
分析条件２：
装置：Ｗａｔｅｒｓ　ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ／ＳＱ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ＢＥＨ　Ｃ１８　Ｃｏｌｕｍｎ（１３０Å、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ）
カラム温度：５０℃
溶媒：
　　Ａ液：水（０．７５％　ｖ／ｖ　ヘキサフルオロイソプロパノール；０．０３８％　ｖ／ｖ　トリエチルアミン；５μＭ　エチレンジアミン四酢酸）
　　Ｂ液：９０％　ｖ／ｖ　メタノール水溶液（０．７５％　ｖ／ｖ　ヘキサフルオロイソプロパノール；０．０３８％　ｖ／ｖ　トリエチルアミン；５μＭ　エチレンジアミン四酢酸）
グラジエント条件：
流速０．３６ｍＬ／ｍｉｎ、Ａ液とＢ液の混合比を９５／５（ｖ／ｖ）に固定して測定開始し、０．５６分後に５．５分間でＡ液とＢ液の混合比を４０／６０（ｖ／ｖ）に直線的に変えた。
検出波長：２６０ｎｍ
　各反応溶液において想定される生成物（デオキシウリジン部分の脱塩基体、及び切断されたフラグメント）の配列と理論分子量、及び各反応溶液において検出された分子量を表２、表３に示す。なお、表２、表３中、の各カラムの表記は以下のとおりである。
 “Ｅｎｔｒｙ”（ 一番左）:
　実験番号を示し、各実験番号（Ｅｎｔｒｙ）に該当する基質は以下のとおりである。
Ｅｎｔｒｙ．１：Ｕ－ＤＥＬ１－ｓｈ　　　Ｅｎｔｒｙ．２：Ｕ－ＤＥＬ２－ｓｈ
Ｅｎｔｒｙ．３：Ｕ－ＤＥＬ３－ｓｈ　　　Ｅｎｔｒｙ．４：Ｕ－ＤＥＬ４－ｓｈ
Ｅｎｔｒｙ．５：Ｕ－ＤＥＬ５－ＨＰ　　　Ｅｎｔｒｙ．６：Ｕ－ＤＥＬ６－ＨＰ
Ｅｎｔｒｙ．７：Ｕ－ＤＥＬ７－ＨＰ　　　Ｅｎｔｒｙ．８：Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰ
Ｅｎｔｒｙ．９：Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ　　　Ｅｎｔｒｙ．１０：Ｕ－ＤＥＬ１０－ＨＰ
　“Ｎｏ．”（左から２番目）：
　配列番号を表す。なお、各配列番号（Ｎｏ．）のうち、Ｎｏ．１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０は各反応溶液の基質であり、Ｎｏ．１１、１４、１７、２０、２２、２５、２９ 、３１、３３、及び３５は、各基質のデオキシウリジン部分の脱塩基体であり、残りの配列番号は各基質が切断されたフラグメントである。
 “Ｓｅｑ．” （左から３番目）：
　配列を表し、左側が５‘側を表し、右側が３’側を表す。
　なお、配列表記において、「（Ｂ）」は次の式（６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
で表される基（脱塩基部位）を意味し、その他の表記は表１と同じである。
 “Ｅｘｐｅｃｔｅｄ　ＭＷ．” （左から４番目）：
　各配列の理論分子量（Ｄａ）の数値を表す。
 “Ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ＭＷ．” （ 一番右）：
　各配列として同定した検出された分子量（Ｄａ）の数値を表す。なお、「－」表記は未検出であることを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
　検出された各配列に該当するピークの面積比から、脱塩基反応および切断反応の転化率を算出した。脱塩基反応はすべての基質において、３７℃、１時間の段階で９９％以上転化していた（基質のピークが１％未満であり、残りのピークが脱塩基体と切断されたフラグメントのみ）。
　また、切断反応の転化率を表したグラフを図１０に示す。グラフに示すように、Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰとＵ－ＤＥＬ９－ＨＰを除く、すべての基質において３７℃、２０ｈまでに９５％以上切断反応が進行しており、Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰとＵ－ＤＥＬ９－ＨＰにおいても、９０℃、１時間のインキュベーションを追加することで、切断反応が１００％完了した。
　以上の結果から、各種デオキシウリジンを含むヘアピン型ＤＥＬの部分構造は、デオキシウリジン部位でＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる脱塩基反応、続いて切断反応が進行することが示された。
実施例２
　［従来型ヘアピンＤＥＬと切断可能なヘアピンＤＥＬ（デオキシウリジンを含むヘアピン型ＤＥＬ）のＰＣＲ効率の比較］
　図１１に示す概略図のように、表４に示す配列の化合物（ヘアピンＤＥＬ）を以下の手順にて合成した。なお、表４中の配列表記において、「Ｓ」は次の式（７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
で表される基を意味し、その他の表記は表１と同じである。
各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．３７：Ｕ－ＤＥＬ１　　　Ｎｏ．３８：Ｕ－ＤＥＬ２
Ｎｏ．３９：Ｕ－ＤＥＬ４　　　Ｎｏ．４０：Ｕ－ＤＥＬ７
Ｎｏ．４１：Ｕ－ＤＥＬ８　　　Ｎｏ．４２：Ｕ－ＤＥＬ９
Ｎｏ．４３：Ｕ－ＤＥＬ１０　　Ｎｏ．４４：Ｈ－ＤＥＬ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
　なお、各ヘアピンＤＥＬを合成するための原料ヘッドピースの化合物名はそれぞれ以下のとおりである。
ヘアピンＤＥＬ　：原料ヘッドピース
Ｕ－ＤＥＬ１　　：Ｕ－ＤＥＬ１－ＨＰ　　　
Ｕ－ＤＥＬ２　　：Ｕ－ＤＥＬ２－ＨＰ
Ｕ－ＤＥＬ４　　：Ｕ－ＤＥＬ４－ＨＰ　　　
Ｕ－ＤＥＬ７　　：Ｕ－ＤＥＬ７－ＨＰ
Ｕ－ＤＥＬ８　　：Ｕ－ＤＥＬ８－ＨＰ　　　
Ｕ－ＤＥＬ９　　：Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ
Ｕ－ＤＥＬ１０　：Ｕ－ＤＥＬ１０－ＨＰ　　　
Ｈ－ＤＥＬ　　　：Ｈ－ＤＥＬ－ＨＰ
さらに、Ｕ－ＤＥＬ１－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ２－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ４－ＨＰ、及びＨ－ＤＥＬ－ＨＰの配列番号“Ｎｏ．”および配列“Ｓｅｑ”は以下の表５のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
　表５に示す原料ヘッドピースを、実施例１と同様に核酸自動合成機ｎＳ－８II（ジーンデザイン社製）を使用して調製した。
　ＰＣＲチューブに、２．０μＬの各種原料ヘッドピースの１ｍＭ水溶液；２．４μＬのＰｒ＿ＴＡＧの１ｍＭ水溶液（実施例１と同様に合成したＰｒ＿ＴＡＧ＿ａとＰｒ＿ＴＡＧ＿ｂをアニーリングして調製、表６に配列を示す）；０．８μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ　トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ　塩化ナトリウム；１００ｍＭ　塩化マグネシウム；１００ｍＭ　ジチオスレイトール；２０ｍＭ　アデノシン三リン酸）及び２．０μＬの脱イオン水を加えた。溶液に０．８μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）の１０倍希釈水溶液を加え、得られた溶液を１６℃で２４時間インキュベーションした。なお、表６中の配列表記は表１と同じである。また、各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．４９：Ｐｒ_ＴＡＧ_ａ　　　Ｎｏ．５０：Ｐｒ_ＴＡＧ_ｂ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
　反応溶液を、０．８μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および１７．６μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で２時間精置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。各ペレットに２．０μＬ脱イオン水を加え溶液を調製した。
　得られた各溶液に、２．４μＬのＣＰの１ｍＭ水溶液（実施例１と同様に合成したＣＰ＿ａとＣＰ＿ｂをアニーリングして調製、表７に配列を示す）；０．８μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ　トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ　塩化ナトリウム；１００ｍＭ　塩化マグネシウム；１００ｍＭ　ジチオスレイトール；２０ｍＭ　アデノシン三リン酸）及び２．０μＬの脱イオン水を加えた。溶液に０．８μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）の１０倍希釈水溶液を加え、得られた溶液を１６℃で２４時間インキュベーションした。なお、表７中の配列表記は表１と同じである。また、各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．５１：ＣＰ＿ａ　　　Ｎｏ．５２：ＣＰ＿ｂ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
　反応溶液を、０．８μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および１７．６μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で２時間精置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。ペレットに１０μＬ脱イオン水を加え溶液にした。
　得られた溶液のうち１．０μＬをサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例１の分析条件２の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物を同定した（各配列の理論分子量、及び検出された分子量を表４中に示す）。溶液の残りを凍結乾燥した後、それぞれ脱イオン水を加え、２０μＭに調製した。
　上記で得られた８種ヘアピン型ＤＥＬのうち、Ｈ－ＤＥＬは従来型ヘアピンＤＥＬであり、残りの７種はデオキシウリジンを含む切断可能なヘアピンＤＥＬである。各種ヘアピン型ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる処理前のＰＣＲ効率と、処理後のＰＣＲ効率を比較するため、リアルタイムＰＣＲ解析を実施した。また、比較対象の２本鎖ＤＥＬとして表７に示すＤＳ－ＤＥＬ（配列Ｎｏ．４７とＮｏ．４８の化合物をアニーリングして調製）を用いた。なお、表８中の配列表記において、「（ａｍｉｎｏ－Ｃ６－Ｌ）」は次の式（８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
で表される基を意味し、その他の表記は表１と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
＜ＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる処理工程＞
　８種のヘアピンＤＥＬ、及び２本鎖ＤＥＬ（ＤＳ－ＤＥＬ）のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる処理を以下の手順で行った。
　ＰＣＲチューブに、１μＬの各種ＤＥＬ２０μＭ水溶液；１μＬのＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｂ７２０４Ｓ）及び７μＬの脱イオン水を加えた。溶液に１μＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｍ５５０５Ｓ）を加え、得られた溶液を３７℃で１時間インキュベーションした。
＜ＤＥＬ試料の調製＞
　各種ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ処理前のサンプル、および処理後の反応溶液をそれぞれ脱イオン水で希釈し、０．０５ｐＭ、０．５ｐＭ、および５ｐＭのＤＥＬ試料を調製した。
＜リアルタイムＰＣＲのよるＣｔ値の測定＞
  上記で得られた各種ＤＥＬ試料を、リアルタイムＰＣＲによりＣｔ値を測定し、ＰＣＲ効率を比較した。条件は以下のとおりであり、結果を図１２に示す。なお、Ｃｔ値とは、リアルタイムＰＣＲにおいて、ＤＮＡの増幅に伴って生じる蛍光シグナルが任意の閾値に到達するサイクル数のことである。すなわち、初期のＤＮＡ分子数が同等である場合、ＰＣＲ効率が高いほどＣｔ値が低くなる。
装置：７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
プレート：ＭｉｃｒｏＡｍｐ　９６－Ｗｅｌｌプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号Ｎ８０１０５６０）
ＰＣＲ反応溶液：
・ＴＢ　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ｔａｑII（タカラバイオ社製、カタログ番号ＲＲ８２０）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　：１０μＬ
・フォワードプライマー（表９、配列番号５５）　　　　　　　　　　　：０．８０μＬ
・リバースプライマー（表９、配列番号５６）　　　　　　　　　　　　：０．８０μＬ
・ＲＯＸ　Ｒｅｆｆｅｒｅｎｃｅ　ＤｙｅII（タカラバイオ社製、カタログ番号ＲＲ３９ＬＲ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　：０．４０μＬ
・各種ＤＥＬ試料の水溶液（０．０５ｐＭ、０．５ｐＭ、５ｐＭ）＊１　：２．０μＬ
・脱イオン水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　：６．０μＬ
＊ １ ：ＤＥＬ試料のモル数は、０．１ａｍоｌ、１ａｍоｌ、１０ａｍоｌとなる。
温度条件：
・９５℃で２分間保持した後、以下のサイクルを３５サイクル繰り返した。
・９５℃、５秒間
・５２℃、３０秒間
・７２℃、３０秒間
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
　なお、表９中の配列表記は表１と同じである。
　図１２に示すように、従来型ヘアピンＤＥＬ（Ｈ－ＤＥＬ）はＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ処理の前後でＣｔ値が変化しないが、デオキシウリジンを含む切断可能なヘアピンＤＥＬ（Ｕ－ＤＥＬ１、Ｕ－ＤＥＬ２、Ｕ－ＤＥＬ４、Ｕ－ＤＥＬ７、Ｕ－ＤＥＬ８、Ｕ－ＤＥＬ９、及びＵ－ＤＥＬ１０）は、ＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ処理後に２本鎖ＤＥＬであるＤＳ－ＤＥＬと同等までＣｔ値が低下した。
　本結果は、ＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅにより切断されたＤＥＬは、切断前よりもＰＣＲ効率が向上していること、及び、デオキシウリジンを含む切断可能なヘアピンＤＥＬは、ＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅにより高効率、高選択的に切断されていることを示している。
実施例３
　［デオキシウリジンを含むヘアピンＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の検証］
＜４種のヘアピンＤＥＬ（Ｕ－ＤＥＬ５、Ｕ－ＤＥＬ１１、Ｕ－ＤＥＬ１２、及びＵ－ＤＥＬ１３）の合成＞
　表１０に示す配列の化合物（ヘアピンＤＥＬ）を以下の手順にて合成した。なお、表１０中の配列表記において、「［ｍｄＣ（ＴＥＧ－ａｍｉｎｏ）］」は次の式（９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
で表される基を意味し、その他の表記は表４と同じである。
各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．５７：Ｕ－ＤＥＬ５　　　Ｎｏ．５８：Ｕ－ＤＥＬ１１
Ｎｏ．５９：Ｕ－ＤＥＬ１２　　Ｎｏ．６０：Ｕ－ＤＥＬ１３
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
　なお、各ヘアピンＤＥＬを合成するための原料ヘッドピースの化合物名はそれぞれ以下のとおりである。
ヘアピンＤＥＬ　：原料ヘッドピース
Ｕ－ＤＥＬ５　　：Ｕ－ＤＥＬ５－ＨＰ　　　
Ｕ－ＤＥＬ１１　：Ｕ－ＤＥＬ１１－ＨＰ
Ｕ－ＤＥＬ１２　：Ｕ－ＤＥＬ１２－ＨＰ　　　
Ｕ－ＤＥＬ１３　：Ｕ－ＤＥＬ１３－ＨＰ
さらに、Ｕ－ＤＥＬ１１－ＨＰ、Ｕ－ＤＥＬ１２－ＨＰ、及びＵ－ＤＥＬ１３－ＨＰの配列番号“Ｎｏ．”および配列“Ｓｅｑ”は以下の表１１のとおりである。なお、表１１中の表記は表１０と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
　表１１に示す原料ヘッドピースのうちＵ－ＤＥＬ１２－ＨＰ及びＵ－ＤＥＬ１３－ＨＰは、実施例１と同様に核酸自動合成機ｎＳ－８II（ジーンデザイン社製）を使用して調製した。Ｕ－ＤＥＬ１１－ＨＰも同様に定法に従い調製した。
　実施例２と同様に、各種原料ヘッドピースを用い、２本鎖オリゴヌクレオチドＰｒ＿ＴＡＧ、及びＣＰとの２段階の２本鎖ライゲーションを実施した。
　得られた溶液の一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、以下に示す分析条件３にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物を同定した（各配列の理論分子量、及び検出された分子量を表１０中に示す）。溶液の残りを凍結乾燥した後、それぞれ脱イオン水を加え、２０μＭに調製した。
分析条件３：
装置：Ｗａｔｅｒｓ　ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ／ＳＱ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ＢＥＨ　Ｃ１８　Ｃｏｌｕｍｎ（１３０Å、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ）
カラム温度：６０℃
溶媒：
　　Ａ液：水（０．７５％　ｖ／ｖ　ヘキサフルオロイソプロパノール；０．０３８％　ｖ／ｖ　トリエチルアミン；５μＭ　エチレンジアミン四酢酸）
　　Ｂ液：９０％　ｖ／ｖ　メタノール水溶液（０．７５％　ｖ／ｖ　ヘキサフルオロイソプロパノール；０．０３８％　ｖ／ｖ　トリエチルアミン；５μＭ　エチレンジアミン四酢酸）
グラジエント条件：
流速０．３６ｍＬ／ｍｉｎ、Ａ液とＢ液の混合比を９５／５（ｖ／ｖ）に固定して測定開始し、０．５６分後に５．５分間でＡ液とＢ液の混合比を４０／６０（ｖ／ｖ）に直線的に変えた。
検出波長：２６０ｎｍ
デコンボリューション：
イオンシグナルをＰｒｏＭａｓｓ　ｆｏｒ　ＭａｓｓＬｙｎｘ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｗａｔｅｒｓ製）を用いて解析した。
＜ＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応＞
　６種のデオキシウリジンを含むヘアピンＤＥＬ（Ｕ－ＤＥＬ５、Ｕ－ＤＥＬ７、Ｕ－ＤＥＬ９、Ｕ－ＤＥＬ１１、Ｕ－ＤＥＬ１２、及びＵ－ＤＥＬ１３）のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応の検討を以下の手順で行った。
　ＰＣＲチューブに、２μＬの各種ヘアピンＤＥＬ２０μＭ水溶液；２μＬのＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｂ７２０４Ｓ）及び１４μＬの脱イオン水を加えた。溶液に２μＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｍ５５０５Ｓ）を加え、得られた溶液を３７℃で１６時間インキュベーションした後、さらに９０℃で１時間インキュベーションした。
＜ＬＣ―ＭＳ測定による切断後の生成物の確認＞
　得られた反応溶液のうち５．０μＬをサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、分析条件３にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行った。各反応溶液において想定される切断後の生成物の配列と理論分子量、及び各反応溶液において検出された分子量を表１２に示す。なお、各実験番号（Ｅｎｔｒｙ）に該当する基質は以下のとおりであり、その他の表記は表１０と同じである。
Ｅｎｔｒｙ．１：Ｕ－ＤＥＬ５　　　Ｅｎｔｒｙ．２：Ｕ－ＤＥＬ７
Ｅｎｔｒｙ．３：Ｕ－ＤＥＬ９　　Ｅｎｔｒｙ．４：Ｕ－ＤＥＬ１１
Ｅｎｔｒｙ．５：Ｕ－ＤＥＬ１２　　Ｅｎｔｒｙ．６：Ｕ－ＤＥＬ１３
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
　いずれのサンプルも基質のＭＳは検出されず、切断後の生成物のＭＳがメインピークとして観測された。
＜ゲル電気泳動による切断反応の確認＞
　また、得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、以下に示す条件で、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図１３に示す結果から、いずれの基質も高収率で切断反応が進行していることが確認された。なお、図１３の各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：Ｕ－ＤＥＬ５
レーン３：Ｕ－ＤＥＬ５の切断反応実施後サンプル
レーン４：Ｕ－ＤＥＬ７
レーン５：Ｕ－ＤＥＬ７の切断反応実施後サンプル
レーン６：Ｕ－ＤＥＬ９
レーン７：Ｕ－ＤＥＬ９の切断反応実施後サンプル
レーン８：Ｕ－ＤＥＬ１１
レーン９：Ｕ－ＤＥＬ１１の切断反応実施後サンプル
レーン１０：Ｕ－ＤＥＬ１２
レーン１１：Ｕ－ＤＥＬ１２の切断反応実施後サンプル
レーン１２：Ｕ－ＤＥＬ１３
レーン１３：Ｕ－ＤＥＬ１３の切断反応実施後サンプル
変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動：
ゲル：Ｎｏｖｅｘ（商品商標）１０％ＴＢＥ－ウレアゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　ｂｙ　ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製、カタログ番号ＥＣ６８７５５ＢＯＸ）
ローディングバッファー：Ｎｏｖｅｘ（商品商標）１０％ＴＢＥ－Ｕｒｅａ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（２×）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　ｂｙ　ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製、カタログ番号ＬＣ６８７６）
温度：６０℃
電圧：１８０Ｖ
泳動時間：３０分
染色試薬：ＳＹＢＥＲ（商品商標）　ＧｒｅｅｎII　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｇｅｌ　Ｓｔａｉｎ（タカラバイオ社製、カタログ番号５７７０Ａ）
　以上の結果から、各種デオキシウリジンを含むヘアピン型ＤＥＬは、デオキシウリジン部位でＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応が進行することが示された。
実施例４
　［デオキシイノシンを含むヘアピンＤＥＬのエンドヌクレアーゼＶによる切断反応の検証］
＜４種のデオキシイノシンを含むヘアピンＤＥＬ（Ｉ－ＤＥＬ１、Ｉ－ＤＥＬ２、Ｉ－ＤＥＬ３、及びＩ－ＤＥＬ４）の合成＞
　表１３に示す配列の化合物（ヘアピンＤＥＬ）を以下の手順にて合成した。なお、表１３中の配列表記において、「Ｉ」はデオキシイノシンを意味し、その他の表記は表２と同じである。
各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．７３：Ｉ－ＤＥＬ１　　　Ｎｏ．７４：Ｉ－ＤＥＬ２
Ｎｏ．７５：Ｉ－ＤＥＬ３　　　Ｎｏ．７６：Ｉ－ＤＥＬ４
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
　なお、各ヘアピンＤＥＬを合成するための原料ヘッドピースの化合物名はそれぞれ以下のとおりである。
ヘアピンＤＥＬ　：原料ヘッドピース
Ｉ－ＤＥＬ１　　：Ｉ－ＤＥＬ１－ＨＰ　　　
Ｉ－ＤＥＬ２　　：Ｉ－ＤＥＬ２－ＨＰ
Ｉ－ＤＥＬ３　　：Ｉ－ＤＥＬ３－ＨＰ　　　
Ｉ－ＤＥＬ４　　：Ｉ－ＤＥＬ４－ＨＰ
さらに、Ｉ－ＤＥＬ１－ＨＰ、Ｉ－ＤＥＬ２－ＨＰ、Ｉ－ＤＥＬ３－ＨＰ、及びＩ－ＤＥＬ４－ＨＰの配列番号“Ｎｏ．”および配列“Ｓｅｑ”は以下の表１４のとおりである。なお、表１４中の表記は表１３と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
　表１４に示す原料ヘッドピースは、定法に従い調製した。
　実施例２と同様に、各種原料ヘッドピースを用い、２本鎖オリゴヌクレオチドＰｒ＿ＴＡＧ、及びＣＰとの２段階の２本鎖ライゲーションを実施した。
　得られた溶液の一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、分析条件３にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物を同定した（各配列の理論分子量、及び検出された分子量を表１３中に示す）。溶液の残りを凍結乾燥した後、それぞれ脱イオン水を加え、２０μＭに調製した。
＜エンドヌクレアーゼＶによる切断反応＞
　４種のデオキシイノシンを含むヘアピンＤＥＬ（Ｉ－ＤＥＬ１、Ｉ－ＤＥＬ２、Ｉ－ＤＥＬ３、Ｉ－ＤＥＬ４）のエンドヌクレアーゼＶによる切断反応の検討を以下の手順で行った。
　ＰＣＲチューブに、１μＬの各種ヘアピンＤＥＬ２０μＭ水溶液；２μＬのＮＥＢｕｆｆｅｒ（登録商標）４（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｂ７００４）及び１５μＬの脱イオン水を加えた。溶液に２μＬのＥｎｄｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｖ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｍ０３０５Ｓ）を加え、得られた溶液を３７℃で２４時間インキュベーションした。
＜ＬＣ―ＭＳ測定による切断後の生成物の確認＞
　得られた反応溶液のうち８．０μＬをサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、分析条件３にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行った。各反応溶液において想定される切断後の生成物の配列と理論分子量、及び各反応溶液において検出された分子量を表１５に示す。なお、各実験番号（Ｅｎｔｒｙ）に該当する基質は以下のとおりであり、その他の表記は表１３と同じである。
Ｅｎｔｒｙ．１：Ｉ－ＤＥＬ１　　　Ｅｎｔｒｙ．２：Ｉ－ＤＥＬ２
Ｅｎｔｒｙ．３：Ｉ－ＤＥＬ３　　　Ｅｎｔｒｙ．４：Ｉ－ＤＥＬ４
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
　いずれのサンプルも基質のＭＳは検出されず、切断後の生成物のＭＳがメインピークとして観測された。
＜ゲル電気泳動による切断反応の確認＞
　また、得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、実施例３と同じ条件で、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図１４に示す結果から、いずれの基質も高収率で切断反応が進行していることが確認された。なお、図１４の各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：Ｉ－ＤＥＬ１
レーン３：Ｉ－ＤＥＬ１の切断反応実施後サンプル
レーン４：Ｉ－ＤＥＬ２
レーン５：Ｉ－ＤＥＬ２の切断反応実施後サンプル
レーン６：Ｉ－ＤＥＬ３
レーン７：Ｉ－ＤＥＬ３の切断反応実施後サンプル
レーン８：Ｉ－ＤＥＬ４
レーン９：Ｉ－ＤＥＬ４の切断反応実施後サンプル
　以上の結果から、各種デオキシイノシンを含むヘアピン型ＤＥＬは、エンドヌクレアーゼＶにより、デオキシイノシンから３‘方向に２番目のホスホジエステル結合が切断されることが示された。
　実施例５
　［リボヌクレオシドを含むヘアピンＤＥＬのＲＮａｓｅＨＩＩによる切断反応の検証］
＜リボヌクレオシドを含むヘアピンＤＥＬ（Ｒ－ＤＥＬ１）の合成＞
　表１６に示す配列の化合物（ヘアピンＤＥＬ）を以下の手順にて合成した。なお、表１６中の配列表記において、「ｕ」はウリジンを意味し、その他の表記は表２と同じである。
配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．８７：Ｒ－ＤＥＬ１
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
　なお、各ヘアピンＤＥＬを合成するための原料ヘッドピースの化合物名は以下のとおりである。
ヘアピンＤＥＬ　：原料ヘッドピース
Ｒ－ＤＥＬ１　　：Ｒ－ＤＥＬ１－ＨＰ　　　
さらに、Ｒ－ＤＥＬ１－ＨＰの配列番号“Ｎｏ．”および配列“Ｓｅｑ”は以下の表１７のとおりである。なお、表１７中の表記は表１６と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059
　表１７に示す原料ヘッドピースは、定法に従い調製した。
　実施例２と同様に、原料ヘッドピースを用い、２本鎖オリゴヌクレオチドＰｒ＿ＴＡＧ、及びＣＰとの２段階の２本鎖ライゲーションを実施した。
　得られた溶液の一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、分析条件３にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物を同定した（各配列の理論分子量、及び検出された分子量を表１６中に示す）。溶液の残りを凍結乾燥した後、それぞれ脱イオン水を加え、２００μＭに調製した。
＜ＲＮａｓｅＨＩＩによる切断反応＞
　リボヌクレオシドを含むヘアピンＤＥＬ（Ｒ－ＤＥＬ１）のＲＮａｓｅＨＩＩによる切断反応の検討を以下の手順で行った。
　ＰＣＲチューブに、０．５μＬのヘアピンＤＥＬ２００μＭ水溶液；４．９μＬのＴｈｅｒｍｏＰｏｌ（登録商標）　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｐａｃｋ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｂ９００４）及び４３．６μＬの脱イオン水を加えた。溶液に１μＬのＲＮａｓｅ　ＨＩＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｍ０２８８Ｓ）を加え、得られた溶液を３７℃で８時間インキュベーションした。
＜ＬＣ―ＭＳ測定による切断後の生成物の確認＞
　得られた反応溶液のうち１０μＬをサンプリングし、分析条件３にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行った。想定される切断後の生成物の配列と理論分子量、及び検出された分子量を表１８に示す。なお、実験番号（Ｅｎｔｒｙ）に該当する基質は以下のとおりであり、その他の表記は表１６と同じである。
Ｅｎｔｒｙ．１：Ｒ－ＤＥＬ１
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000060
　いずれのサンプルも基質のＭＳは検出されず、切断後の生成物のＭＳがメインピークとして観測された。
＜ゲル電気泳動による切断反応の確認＞
　また、得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、実施例３と同じ条件で、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図１５に示す結果から、いずれの基質も高収率で切断反応が進行していることが確認された。なお、図１５の各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：Ｒ－ＤＥＬ１
レーン３：Ｒ－ＤＥＬ１の切断反応実施後サンプル
　以上の結果から、リボヌクレオシドを含むヘアピン型ＤＥＬは、ＲＮａｓｅＨＩＩにより、リボヌクレオチドの５’側のホスホジエステル結合が切断されることが示された。
実施例６
　［Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰを原料としたモデルライブラリの作成］
　図１６に示す概略図のように、Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰを原料とし、スプリット・アンド・プール合成により３×３×３（２７）化合物種を含むモデルライブラリの合成を、以下の試薬を用いて実施した。
・Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ
・ビルディングブロック３種（ＢＢ１、ＢＢ２、及びＢＢ３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
・２本鎖オリゴヌクレオチドタグ１０種（表１９のタグ番号：Ｐｒ、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｃ１、Ｃ２、及びＣ３）
　表１９中、“Ｔａｇ　Ｎｏ．”（一番左）はタグ番号を表し、“Ｎｏ．”（左から２番目）は配列番号を表し、“Ｓｅｑ．”（左から３番目）は配列を表す。なお、配列表記は表１と同じである。
　なお、各２本鎖オリゴヌクレオチドタグは、表１９中に示すように、各タグ番号に対応する配列番号２種のオリゴヌクレオチドをアニーリングして調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000062
＜化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ」の合成＞
　表２０中に示す配列の化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ」を以下の手順にて合成した。なお、表２０中の配列表記において、「（ＡＯＰ－ＡｍｉｎｏＣ７）」は次の式（１０）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
で表される基を意味し、その他の表記は表２と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000064
　４個のビオラモ遠沈管チューブに、１０℃に冷却したホウ酸ナトリウム緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）のＵ－ＤＥＬ９－ＨＰの溶液（２．５ｍＬ、１ｍＭ）を加えた。それぞれのチューブに、４０当量のＮ－Ｆｍｏｃ－１５－アミノ－４，７，１０，１３－テトラオキサオクタデカン酸（２５０μＬ、０．４Ｍ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）、続いて４０当量の塩化４－（４，６－ジメトキシ［１．３．５］トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム水和物（ＤＭＴＭＭ）（２００μＬ、０．５Ｍ水溶液）を加え、得られた溶液を１０℃で５時間振とうした。
　上記溶液を、それぞれ２９５μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び９．７ｍＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で終夜静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。ペレットにそれぞれ２．７５ｍＬの脱イオン水を加え溶解し、０℃で３０６μＬのピペリジンを加え、１０℃で３時間振とうした。混合物を遠心分離した後、沈殿物をろ過により除去し、１．４７ｍＬの脱イオン水で２回洗浄した。得られたろ液を、それぞれ６００μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び１９．８ｍＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で終夜精置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。
　得られたペレットに、１０ｍＬの脱イオン水を加え溶液にした。得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈した後、実施例１の分析条件２の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表２０中に示す）。溶液の残りを凍結乾燥した後、脱イオン水を加え、５ｍＭに調製した。
＜２本鎖オリゴヌクレオチドタグ「Ｐｒ」の導入＞
　化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ」と２本鎖オリゴヌクレオチドタグ「Ｐｒ」をライゲーションすることで表２１中に示す配列の化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ－Ｐｒ」を以下の手順にて合成した。なお、表２１中の配列表記は表２０と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000065
　ビオラモ遠沈管チューブに、４０μＬの化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ」の５ｍＭ水溶液；１６０μＬの１００ｍＭ　炭酸水素ナトリウム水溶液水；２４０μＬの２本鎖オリゴヌクレオチドタグ「Ｐｒ」の１ｍＭ水溶液；８０μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ　トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ　塩。化ナトリウム；１００ｍＭ　塩化マグネシウム；１００ｍＭ　ジチオスレイトール；２０ｍＭ　アデノシン三リン酸）及び２７２μＬの脱イオン水を加えた。溶液に８．０μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）を加え、得られた溶液を１６℃で２４時間インキュベーションした。
　反応溶液を、８０μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および２６４０μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で２時間精置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに４００μＬの脱イオン水を加えた。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３０ｋＤカットオフ）により濃縮した。得られた溶液の一部をサンプリングし、分析条件２の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表２１中に示す）。以上の工程により、純度８４．５％の化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ－Ｐｒ」が１３３ｎｍｏｌ得られた。得られた化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ－Ｐｒ」に１００ｍＭ　炭酸水素ナトリウム水溶液水を加え、１ｍＭに調製した。
＜サイクルＡ＞
　３本の各ＰＣＲチューブに、２０μＬの上記で得られた化合物「ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ－Ｐｒ」の１ｍＭ溶液；３０μＬの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＡ１～Ａ３のうちの一つの１ｍＭ水溶液；８．０μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ　トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ　塩化ナトリウム；１００ｍＭ　塩化マグネシウム；１００ｍＭ　ジチオスレイトール；２０ｍＭ　アデノシン三リン酸）及び２１．６μＬの脱イオン水を加えた。溶液に０．４μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）を加え、得られた溶液を１６℃で１８時間インキュベーションした。
　反応溶液をそれぞれ、８．０μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および２６４μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットをそれぞれ、２０μＬの１５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）に溶解させた。
　それぞれのチューブに、４０当量のビルディングブロックＢＢ１～ＢＢ３（４．０μＬ、２００ｍＭ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）のうちの一つ、続いて４０当量の塩化４－（４，６－ジメトキシ［１．３．５］トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム水和物（ＤＭＴＭＭ）（４．０μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、１０℃で２時間振とうした。さらに、それぞれのチューブに、２０当量のビルディングブロック（２．０μＬ、２００ｍＭ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）、続いて２０当量のＤＭＴＭＭ（２．０μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、１０℃で３０分間振とうした。
　反応溶液をそれぞれ、３．２μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および１０６μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットにそれぞれ１８μＬの脱イオン水を加えたのち、３種の溶液を１本のＰＣＲチューブに混合した。
　混合した溶液に、０℃で６．０μＬのピペリジンを加え、室温で１時間振とうした。反応溶液を、６．０μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および１９８μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で１８時間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに４００μＬの脱イオン水を加えた。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３０ｋＤカットオフ）により濃縮し、１００ｍＭ　炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、１ｍＭに調製し、次工程の出発原料として使用した。
＜サイクルＢ＞
　３本の各ＰＣＲチューブに、１３．７μＬのサイクルＡで得られた出発原料１ｍＭ溶液；２０．６μＬの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＢ１～Ｂ３のうちの一つの１ｍＭ水溶液；５．５μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ　トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ　塩化ナトリウム；１００ｍＭ　塩化マグネシウム；１００ｍＭ　ジチオスレイトール；２０ｍＭ　アデノシン三リン酸）及び１４．８μＬの脱イオン水を加えた。溶液に０．３μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）を加え、得られた溶液を１６℃で１６時間インキュベーションした。
　反応溶液をそれぞれ、５．５μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および１８１μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットをそれぞれ、１３．７μＬの１５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）に溶解させた。
　それぞれのチューブに、８０当量のビルディングブロックＢＢ１～ＢＢ３（５．５μＬ、２００ｍＭ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）のうちの一つ、続いて８０当量のＤＭＴＭＭ（５．５μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、１０℃で１時間振とうした。さらに、それぞれのチューブに、４０当量のビルディングブロック（２．３μＬ、２００ｍＭ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）、続いて４０当量のＤＭＴＭＭ（２．３μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、１０℃で２時間振とうした。
　反応溶液をそれぞれ、２．５μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および８１．４μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットにそれぞれ１２．３μＬの脱イオン水を加えたのち、３種の溶液を１本のＰＣＲチューブに混合した。
　混合した溶液に、０℃で４．1μＬのピペリジンを加え、室温で３時間振とうした。反応溶液を、４．１μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および１３６μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３時間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに４００μＬの脱イオン水を加えた。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３０ｋＤカットオフ）により濃縮し、１００ｍＭ　炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、０．４８ｍＭに調製し、次工程の出発原料として使用した。
＜サイクルＣ＞
　３本の各ＰＣＲチューブに、１４．５μＬのサイクルＢで得られた出発原料０．４８ｍＭ溶液；１０．５μＬの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＣ１～Ｃ３のうちの一つの１ｍＭ水溶液；及び２．８μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ　トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ　塩化ナトリウム；１００ｍＭ　塩化マグネシウム；１００ｍＭ　ジチオスレイトール；２０ｍＭ　アデノシン三リン酸）を加えた。溶液に０．１４μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）を加え、得られた溶液を１６℃で１６時間インキュベーションした。
　反応溶液をそれぞれ、２．８μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および９２μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットをそれぞれ、７．０μＬの１５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．４）に溶解させた。
　それぞれのチューブに、８０当量のビルディングブロックＢＢ１～ＢＢ３（２．８μＬ、２００ｍＭ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）のうちの一つ、続いて８０当量のＤＭＴＭＭ（２．８μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、１０℃で１時間振とうした。さらに、それぞれのチューブに、４０当量のビルディングブロック（１．４μＬ、２００ｍＭ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）、続いて４０当量のＤＭＴＭＭ（１．４μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、１０℃で２時間振とうした。
　反応溶液をそれぞれ、１．３μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および４１．４μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットにそれぞれ６．３μＬの脱イオン水を加えたのち、３種の溶液を１本のＰＣＲチューブに混合した。
　混合した溶液に、０℃で２．1μＬのピペリジンを加え、室温で２時間振とうした。反応溶液を、２．１μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および６９μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３時間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに４００μＬの脱イオン水を加えた。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３０ｋＤカットオフ）により濃縮し、１００ｍＭ　炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、０．４１ｍＭに調製し、次工程の出発原料として使用した。
＜ＣＰのライゲーション＞
　ＰＣＲチューブに、１２．２μＬのサイクルＣで得られた出発原料０．４１ｍＭ溶液；６．０μＬのＣＰの１ｍＭ水溶液（実施例２で使用したものと同じである）；２．１μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ　トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ　塩化ナトリウム；１００ｍＭ　塩化マグネシウム；１００ｍＭ　ジチオスレイトール；２０ｍＭ　アデノシン三リン酸）及び０．７μＬの脱イオン水を加えた。溶液に０．１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）を加え、得られた溶液を１６℃で１６時間インキュベーションした。
　反応溶液を、２．１μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液および６９．６μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに４００μＬの脱イオン水を加えた。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３０ｋＤカットオフ）により濃縮し、脱イオン水を加え２０μＭに調製した。
＜結果＞
　各サイクルの２本鎖オリゴヌクレオチドタグのライゲーション後のサンプルを２．２％アガロースゲル（ロンザ製、ＦｌａｓｈＧｅｌ（登録商標）カセット、カタログ番号５７０３１）を用いて、電気泳動により分析した。図１７に示す結果から、各サイクルにおいて、２本鎖オリゴヌクレオチドタグによるコード化が、高効率で達成されたことが確認された。なお、図１７の各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ－Ｐｒ
レーン２：サイクルＡの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＡ１ライゲーション後のサンプル
レーン３：サイクルＡの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＡ２ライゲーション後のサンプル
レーン４：サイクルＡの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＡ３ライゲーション後のサンプル
レーン５：サイクルＢの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＢ１ライゲーション後のサンプル
レーン６：サイクルＢの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＢ２ライゲーション後のサンプル
レーン７：サイクルＢの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＢ３ライゲーション後のサンプル
レーン８：サイクルＣの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＣ１ライゲーション後のサンプル
レーン９：サイクルＣの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＣ２ライゲーション後のサンプル
レーン１０：サイクルＣの２本鎖オリゴヌクレオチドタグＣ３ライゲーション後のサンプル
レーン１１：ＣＰライゲーション後のサンプル
レーン１２：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
　サイクルＣ完了後のサンプルを、分析条件３にて分析を行った。図１８クロマトグラフとマススペクトルの結果を示す。得られたマススペクトルのデコンボリューションにより、平均分子量として３５５３２．４が観測された。この結果は、サイクルＣ完了後に予想される平均分子量（３５５１４．２）と一致し、ライブラリ合成のための反応（２本鎖オリゴヌクレオチドタグのライゲーション、およびビルディングブロックの導入）が高効率で達成されていることが示された。
　以上により、上記合成手順にて、Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰを原料とした３×３×３（２７）化合物種を含むモデルライブラリの合成が達成された。
＜得られたモデルライブラリのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断＞
　上記にて得られたモデルライブラリのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応を以下の手順で実施した。
　ＰＣＲチューブに、２．０μＬのモデルライブラリ２０μＭ水溶液；２μＬのＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｂ７２０４Ｓ）及び１４μＬの脱イオン水を加えた。溶液に２μＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｍ５５０５Ｓ）を加え、得られた溶液を３７℃で１６時間インキュベーションした後、さらに９０℃で１時間インキュベーションした。
　得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、実施例３と同じ条件で、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図１９に示す結果から、Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰを原料としたモデルライブラリが、ＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅにより、高効率で切断反応が進行することが確認された。なお、図１９の各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：モデルライブラリ
レーン３：モデルライブラリのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後サンプル
実施例７
　［ＤＥＬ化合物のヘアピンＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの変換、及び新たな機能の付与］
＜ＤＥＬ化合物の原料ヘッドピース（ＡＡＺ－ＤＥＬ－ＨＰ）の合成＞
　表２２中に示す配列のＡＡＺ－ＤＥＬ－ＨＰを以下の手順にて合成した。なお、表２２中の配列表記において、「（ＡＡＺ－ＡＯＰ－ＡｍｉｎｏＣ７）」は次の式（１１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
で表される基を意味し、その他の表記は表２と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000067
　８本のＰＣＲチューブに、それぞれジメチルスルホキシド（５９９μＬ）、４－オキソ－４－［（５－スルファモイル－１，３，４－チアジアゾール－２－イル)アミノ）ブタン酸（３７．５μＬ、０．２Ｍ　ジメチルスルホキシド溶液）、１－ヒドロキシ－２，５－ジオキソピロリジン－３－スルホン酸ナトリウム（６０μＬ、０．３３Ｍ　ジメチルスルホキシド／脱イオン水（２：１，ｖ／ｖ）溶液）、続いて１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（７２μＬ、０．１Ｍ　ジメチルスルホキシド溶液）を加え、得られた溶液を３０℃で３０分間振とうした。そして、それぞれの溶液に、１５０μＬのトリエチルアミン塩酸緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ１０）、続いてＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ（実施例６にて合成）の水溶液（７５μＬ、０．６７ｍＭ）を加え、３７℃で６時間振とうした。
　反応溶液を、１本のビオラモ遠沈管チューブにまとめ、８００μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び２６．３ｍＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。ペレットを脱イオン水に溶解させ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ　Ｇｅｍｉｎｉ　Ｃ１８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。二元移動相勾配プロファイルを用いて、５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５）及びアセトニトリル／水（１００：１、ｖ／ｖ）を使用し、目的物を溶出した。目的物を含む画分をそれぞれ収集し、混合し、濃縮した。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩し、エタノール沈殿を実施した後、ペレットに脱イオン水を加え１ｍＭ水溶液にした。
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例２の分析条件２の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物のＡＡＺ－ＤＥＬ－ＨＰを同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表２２中に示す）。
＜３種のＤＥＬ化合物の原料ヘッドピース（ＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ、ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ、ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ）の合成＞
　表２３中に示す配列の化合物を以下の手順にて合成した。なお、表２３中の配列表記において、「（ＳＡＢＡ－ＡＯＰ－ＡｍｉｎｏＣ７）」は次の式（１２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
で表される基を意味し、「（ＣｌＳＡＢＡ－ＡＯＰ－ＡｍｉｎｏＣ７）」は次の式（１３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
で表される基を意味し、「（ｍＳＡＢＡ－ＡＯＰ－ＡｍｉｎｏＣ７）」は次の式（１４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
で表される基を意味し、その他の表記は表２と同じである。
各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．１１４：ＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ
Ｎｏ．１１５：ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ
Ｎｏ．１１６：ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000071
　なお、各化合物を合成するための原料カルボン酸はそれぞれ以下のとおりである。
化合物：　　　　　　　　　　　原料カルボン酸
ＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ：　　　４－スルファモイル安息香酸
ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ：　４－クロロ－３－スルファモイル安息香酸
ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ：　　３－スルファモイル安息香酸
　それぞれＰＣＲチューブに、原料カルボン酸（５０μＬ、０．２Ｍ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）を加えた。それぞれのチューブに、３－ヒドロキシトリアゾロ［４、５－ｂ］ピリジン（１６．７μＬ、０．６Ｍ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）、Ｎ、Ｎ′－ジイソプロピルカルボジイミド（１６．７μＬ、０．６Ｍ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）、続いてＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１６．７μＬ、０．６Ｍ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）を加え、得られた溶液を２５℃で３０分間振とうした。そして、それぞれの溶液に、ホウ酸ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ９．４）のＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ（実施例６にて合成）の溶液（１００μＬ、１ｍＭ）を加え、２５℃で９０分間振とうした。
　上記溶液を、それぞれ２０μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び６６０μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。ペレットをそれぞれ５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ　Ｇｅｍｉｎｉ　Ｃ１８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。二元移動相勾配プロファイルを用いて、５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５）及びアセトニトリル／水（１００：１、ｖ／ｖ）を使用し、目的物を溶出した。それぞれ目的物を含む画分を収集し、混合し、濃縮した。それぞれの得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩し、エタノール沈殿を実施した後、ペレットに脱イオン水を加え１ｍＭ水溶液にした。
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例２の分析条件２の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、それぞれ目的物を同定した（各化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表２３中に示す）。
＜５種の３’末端にビオチンを有するＤＥＬ化合物（「ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、及び「Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」）の合成＞
　表２４に示す配列のＤＥＬ化合物を以下の手順にて合成した。なお、表２４中の配列表記において、「（ＢＩＯ）」は次の式（１５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
で表される基を意味し、その他の表記は表２、表２０、表２２、及び表２３と同じである。
各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．１１７：ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ
Ｎｏ．１１８：ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ
Ｎｏ．１１９：ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ
Ｎｏ．１２０：ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ
Ｎｏ．１２１：Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000073
　なお、各ＤＥＬ化合物を合成するための原料ヘッドピースの化合物名はそれぞれ以下のとおりである。
ＤＥＬ化合物　　　　　　　　：原料ヘッドピース
ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ　　　：ＡＡＺ－ＤＥＬ－ＨＰ
ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ　　：ＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ
ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ：ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ
ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ　：ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ
Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ　：ＡＯＰ－Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰ
　ＰＣＲチューブに、１０μＬの各種原料ヘッドピースの１ｍＭ水溶液；１２μＬのＰｒ_ＴＡＧ２_ＣＰ－ＢＩＯの１ｍＭ水溶液（実施例１と同様に合成したＰｒ_ＴＡＧ２_ＣＰ＿ａとＰｒ_ＴＡＧ２_ＣＰ－ＢＩＯ＿ｂをアニーリングして調製、表２５に配列を示す）；４μＬの１０Ｘリガーゼ緩衝液（５００ｍＭ　トリス塩酸、ｐＨ７．５；５００ｍＭ　塩化ナトリウム；１０ｍＭ　塩化マグネシウム；１００ｍＭ　ジチオスレイトール；２０ｍＭ　アデノシン三リン酸）及び１０μＬの脱イオン水を加えた。溶液に４μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（サーモフィッシャー製、カタログ番号ＥＬ００１３）の１０倍希釈水溶液を加え、得られた溶液を１６℃で終夜インキュベーションした。なお、表２５中の配列表記は表２４と同じである。また、各配列番号に（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．１２２：Ｐｒ_ＴＡＧ２_ＣＰ＿ａ
Ｎｏ．１２３：Ｐｒ_ＴＡＧ２_ＣＰ－ＢＩＯ＿b
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000074
　反応溶液を、４μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び１３２μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾し、ペレットを脱イオン水に溶解した。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩した。
　得られた上清のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、それぞれ目的物を同定した（各化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表２４中に示す）。
＜５種の３’末端にビオチンを有するＤＥＬ化合物（ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ、ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ、ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ、ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ、Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ）のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断＞
　上記で得られた５種のＤＥＬ化合物「ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、及び「Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応を以下の手順で行い、それぞれ表２６に示す配列の２本鎖核酸を有するＤＥＬ化合物「ＤＳ－ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、及び「ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」に変換した。なお、表２６中の配列表記は表２４と同じであり、５種の化合物がそれぞれ、配列番号１２４と配列番号１２５、配列番号１２６と配列番号１２７、配列番号１２８と配列番号１２９、配列番号１３０と配列番号１３１、及び配列番号１３２と配列番号１３３のオリゴヌクレオチド鎖の２本鎖により形成されていることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000075
　ＰＣＲチューブに、１０μＬの各種ＤＥＬ化合物１００μＭ水溶液；１００μＬのＣｕｔＳｍａｒｔ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号７２４０Ｓ）及び８６０μＬの脱イオン水を加えた。溶液にそれぞれ３０μＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号５５０５Ｓ）を加え、得られた溶液を３７℃で１時間インキュベーションした。
　得られた反応溶液を、それぞれＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩濃縮し、エタノール沈殿を実施した後、それぞれの得られたペレットに脱イオン水を加えて水溶液とした。
　得られた溶液の一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的の２本鎖核酸を有するＤＥＬ化合物「ＤＳ－ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、及び「ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」をそれぞれ同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表２６中に示す）
　また、得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、実施例３と同じ条件で、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図２０に示す結果から、「ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、及び「Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」が、高収率で切断され、それぞれ「ＤＳ－ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、及び「ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」に変換されていることが確認された。なお、図２０の各レーンのサンプルは以下のとおりである。また、濃度１及び濃度２はそれぞれ、ＤＥＬ化合物のロード量が約４０ｎｇ及び約８０ｎｇになるようサンプルを調製したことを意味する。
レーン１：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度１）
レーン３：ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度２）
レーン４：ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後のサンプル（濃度１）
レーン５：ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後のサンプル（濃度２）
レーン６：ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度１）
レーン７：ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度２）
レーン８：ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後のサンプル（濃度１）
レーン９：ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後のサンプル（濃度２）
レーン１０：ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度１）
レーン１１：ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度２）
レーン１２：ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後のサンプル（濃度１）
レーン１３：ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後のサンプル（濃度２）
レーン１４：ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度１）
レーン１５：ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度２）
レーン１６：ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後のサンプル（濃度１）
レーン１７：ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後のサンプル（濃度２）
レーン１８：Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度１）
レーン１９：Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度２）
レーン２０：Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後のサンプル（濃度１）
レーン２１：Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後のサンプル（濃度２）
レーン２２：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
＜ストレプトアビジンビーズを用いた１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬの調製＞
　上記で得られた２本鎖核酸を有するＤＥＬ化合物「ＤＳ－ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、及び「ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」を、それぞれストレプトアビジンビーズにて処理し、以下の手順で１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、及び「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ」を調製した。なお、５種の化合物は、それぞれ表２６中の配列番号１２５、１２７、１２９、１３１、及び１３３のオリゴヌクレオチド鎖である。
　５本のＰＣＲチューブに、それぞれ４５０μLのＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ（商品商標）ＭＳ１６０／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＪＳＲ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号Ｊ－ＭＳ－Ｓ１６０Ｓ）を加え、磁気分離により上清を除去した後、９００μＬの１×バインディング緩衝液（１０ｍＭ　トリス塩酸、ｐＨ７．５；０．５ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸；１Ｍ　塩化ナトリウム；０．０５％　ｖ／ｖ　Ｔｗｅｅｎ２０）を加え磁気分離により上清を除去した。得られた粒子にそれぞれ、「ＤＳ－ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、「ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」、あるいは「ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」の水溶液（それぞれ７００ｐｍｏｌ、４５０μＬ）、及び４５０μＬの２×バインディング緩衝液（２０ｍＭ　トリス塩酸、ｐＨ７．５；１ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸；２Ｍ　塩化ナトリウム；０．１％　ｖ／ｖ　Ｔｗｅｅｎ２０）を加えて混合し、室温で２０分間振とうした。
　それぞれの混合物から磁気分離により上清を除去し、９００μＬの１×バインディング緩衝液（１０ｍＭ　トリス塩酸、ｐＨ７．５；０．５ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸；１Ｍ　塩化ナトリウム；０．０５％　ｖ／ｖ　Ｔｗｅｅｎ２０）を用いた粒子の洗浄及び磁気分離による上清の除去をそれぞれ２回繰り返した。その後、それぞれ９００μＬの変性溶液（０．１Ｍ　水酸化ナトリウム；０．１Ｍ　塩化ナトリウム）を加え、磁気分離により上清を回収した。
　得られた上清に、それぞれ９００μＬの３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（１．０Ｍ、ｐＨ７．０）を加え、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩した。得られた上清それぞれを、エタノール沈殿を実施した後、ペレットに脱イオン水を加え溶液した。
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行ったところ、それぞれ分子量２４２５５．３、２４１７０．５、２４２０８．８、２４１７６．７、及び２３９８４．８が観測され、目的の１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、及び「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ」を同定した。
＜光反応性クロスリンカー修飾プライマーの合成＞
　表２７に示す配列の光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ」を以下の手順にて合成した。なお、表２７中の配列表記において、「Ｘ」は次の式（１６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
で表される基を意味し、その他の表記は表２と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000077
　ＰＣＲチューブに、１０℃に冷却したホウ酸ナトリウム緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）のＬ－Ｐｒ（実施例１と同様に合成、表２８に配列を示す）の溶液（２００μＬ、１ｍＭ）を加えた。チューブに、４０当量のＮ－Ｆｍｏｃ－１５－アミノ－４，７，１０，１３－テトラオキサオクタデカン酸（２０μＬ、０．４Ｍ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）、続いて４０当量の、塩化４－（４，６－ジメトキシ［１．３．５］トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム水和物（ＤＭＴＭＭ）（１６μＬ、０．５Ｍ　水溶液）を加え、生じた混合物を１０℃で４時間振とうした。なお、表２８中の配列表記は表８と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000078
　反応液を、２３．６μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び７７８．８μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で終夜静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。ペレットに１８０μＬの脱イオン水を加え溶液にした後、２０μＬのピペリジンを加え、１０℃で３時間振とうした。
　得られた溶液を、２０μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び６６０μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに２００μＬの脱イオン水を加え１ｍＭの溶液にした。
　上記で得られた溶液１００μＬに、７５μＬのトリエチルアミン塩酸緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ１０）、続いて５０当量の、１－（（３－（３－メチル－３Ｈ－ジアジリン－３－イル）プロパノイル）オキシ）－２，５－ジオキソピロリジン－３－スルホン酸ナトリウム（Ｓｕｌｆｏ－ＳＤＡ）（２５μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、３７℃で２時間振とうした。
　得られた溶液を、２０μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び６６０μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに１００μＬの脱イオン水を加え、続いて７５μＬのトリエチルアミン塩酸緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ１０）、５０当量のＳｕｌｆｏ－ＳＤＡ（２５μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、３７℃で１時間２０分振とうした。さらに５０当量のＳｕｌｆｏ－ＳＤＡ（２５μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、３７℃で４０分間振とうした。
　得られた溶液を、２２．５μLの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び７４３μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で終夜静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに１００μＬの脱イオン水を加え、続いて７５μＬのトリエチルアミン塩酸緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ１０）、続いて５０当量の、Ｓｕｌｆｏ－ＳＤＡ（２５μＬ、２００ｍＭ水溶液）を加え、３７℃で３時間振とうした。
　得られた溶液を、２０μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び６６０μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で終夜静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。ペレットを５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ　Ｇｅｍｉｎｉ　Ｃ１８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。二元移動相勾配プロファイルを用いて、５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５）及びアセトニトリル／水（１００：１、ｖ／ｖ）を使用し、目的物を溶出した。目的物を含む画分を収集し、混合し、濃縮した。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩し、エタノール沈殿を実施した後、ペレットに１００μＬの脱イオン水を加え溶液にした。
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物の光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ」を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表２７中に示す）。
＜光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの合成＞
　上記で得られた１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物（「ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、及び「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ」）を鋳型ＤＮＡとし、それぞれ「ＰＸＬ－Ｐｒ」を用いたプライマー伸長反応を以下の手順で行い、表２９に示す配列の光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物（「ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ」）を合成した。なお、表２９中の配列表記は表２６、及び表２７と同じであり、５種の化合物がそれぞれ、配列番号１３６と配列番号１２５、配列番号１３６と配列番号１２７、配列番号１３６と配列番号１２９、配列番号１３６と配列番号１３１、及び配列番号１３６と配列番号１３３のオリゴヌクレオチド鎖の２本鎖により形成されていることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000079
　ＰＣＲチューブに、３０μＬの各種１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物の１０μＭ水溶液；０．５０５μＬの「ＰＸＬ－Ｐｒ」５９４μＭ水溶液；６０μＬの１０×ＮＥＢｕｆｆｅｒ（登録商標）２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｂ７００２Ｓ）及び４７６μＬの脱イオン水を加えた。溶液に６μＬのＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ、Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｍ０２１０）及び１２μＬのＤｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ｄＮＴＰ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｎ０４４７）を加え、得られた溶液を２５℃で９０分間インキュベーションした。
　得られた溶液を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩した。得られた上清に、脱イオン水を加え６０μＬの溶液とし、その後６μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び１９８μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。ペレットに３０μＬの脱イオン水を加え溶液にした。
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物の光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ「ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ」を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表２９中に示す）。
　また、得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、以下に示す条件で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図２１に示す結果から、プライマーの伸長反応により、高収率でそれぞれ、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ」に変換されていることが確認された。なお、図２１の各レーンのサンプルは以下のとおりである。また、濃度１及び濃度２はそれぞれ、ＤＥＬ化合物のロード量が約４０ｎｇ及び約８０ｎｇになるようサンプルを調製したことを意味する。
レーン１：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：ＤＳ－ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度１）
レーン３：ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ（濃度１）
レーン４：ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ）（濃度１）
レーン５：ＤＳ－ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度２）
レーン６：ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ（濃度２）
レーン７：ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ）（濃度２）
レーン８：ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度１）
レーン９：ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ（濃度１）
レーン１０：ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ）（濃度１）
レーン１１：ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度２）
レーン１２：ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ（濃度２）
レーン１３：ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ）（濃度２）
レーン１４：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン１５：ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度１）
レーン１６：ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ（濃度１）
レーン１７：ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ）（濃度１）
レーン１８：ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度２）
レーン１９：ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ（濃度２）
レーン２０：ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ）（濃度２）
レーン２１：ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度１）
レーン２２：ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ（濃度１）
レーン２３：ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ）（濃度１）
レーン２４：ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度２）
レーン２５：ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ（濃度２）
レーン２６：ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ）（濃度２）
レーン２７：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２８：ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度１）
レーン２９：ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ（濃度１）
レーン３０：ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ）（濃度１）
レーン３１：ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（濃度２）
レーン３２：ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ（濃度２）
レーン３３：ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ）（濃度２）
ポリアクリルアミドゲル電気泳動：
ゲル：ＳｕｐｅｒＳｅｐ（商品商標）ＤＮＡ１５％ＴＢＥゲル（富士フイルム和光純薬製、カタログ番号１９０－１５４８１）
ローディングバッファー：６×　Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製、カタログ番号９１５６） 
温度：室温
電圧：２００Ｖ
泳動時間：５０分
染色試薬：ＳＹＢＥＲ（商品商標）　ＧｒｅｅｎＩＩ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｇｅｌ　Ｓｔａｉｎ（タカラバイオ社製、カタログ番号５７７０Ａ）
実施例８
　［光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの光架橋反応有無での結合剤回収効率の比較］
＜ＤＥＬ試料の調製＞
　上記で得られた５種の光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬをそれぞれ脱イオン水で希釈し、５０ｎＭのＤＥＬ試料を調製した。
＜光架橋反応＞
装置：ＣＬ－１０００　Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（ＵＶＰ，ＩＮＣ社製）
反応チューブ：９６穴用ボトムバイアル　（テクノラボスシィ株式会社製、カタログ番号９６－Ｖ０５０ＦＢ）
光架橋反応溶液：
・Ｓａｌｍｏｎ　Ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡ，　ｓｈｅａｒｅｄ　　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＡＭ９６８０）：１．６μＬ
・１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液：５．０μＬ
・Ｄ－ＰＢＳ（－）（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製９、カタログ番号０４５―２９７９５）：３２．４μＬ
　・Ｃａｒｂｏｎｉｃ　Ａｎｈｙｄｒａｓｅ　ＩＸ／ＣＡ９　（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇi
ｃａｌ社製、カタログ番号１０１０７－Ｈ０８Ｈ）：１０．０μＬ
・各種ＤＥＬ試料の５０ｎＭ水溶液：１．０μＬ
反応条件：
　上記組成のＣＡ９タンパク質とＤＥＬ溶液を混合したものを氷上で１時間インキュベーションさせた。その後、溶液の一部を回収した（溶液Ｓ）。残りの溶液を、氷上に維持し、３６５ｎｍのＵＶ照射を２０分間行った。
＜タンパクと架橋されたＤＥＬの回収＞
・Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｉｓｔａｇ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　＆　ｐｕｌｌｄｏｗｎ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号１０１０４Ｄ）　　　　　：１０．０μＬ
・Ｔｗｅｅｎ２０　（Ｓｉｇｍａ社製、カタログ番号Ｐ７９４９―１００ＭＬ）
・１０％ＳＤＳ　（ＮＩＰＰＯＮ　ＧＥＮＥ社製、カタログ番号３１１－９０２７１）
・Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ－ＰＢＳ（－）をＴｗｅｅｎ２０と１０％ＳＤＳで希釈し０．２％に調製）
ＵＶ照射後の反応溶液を、Ｄｙａｎｅｂｅａｄｓ　ｈｉｓ－ｔａｇ　ｐｕｌｌｄｏｗｎと混合し、室温で３０分間インキュベーションした。マグネットスタンドに固定し、２分間静置後上清を取り除き、２００μＬのＷａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒを加えて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを懸濁した。さらにこの洗浄操作を５回繰り返した。洗浄後のＤｙｂａｂｅａｄｓに８０μＬのＤ－ＰＢＳ（－）を加えて、９５℃、１０分間反応させた。反応後Ｄｙｎａｂｅａｄｓをマグネットスタンドに設置し、２分後に上清を回収した（溶液Ｅ）。
＜光架橋反応をしないサンプルの調製＞
　上記一連の操作を、ＵＶ照射の操作をせずに実施し、それぞれ溶液Ｓ、溶液Ｅをサンプルとして調製した。
＜リアルタイムＰＣＲのよるＣｔ値の測定＞
　上記で得られた各種ＤＥＬ試料を、リアルタイムＰＣＲによりＣｔ値を測定し、ＰＣＲ効率を比較した。条件は以下のとおりであり、結果を図２２に示す。
装置：７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
プレート：ＭｉｃｒｏＡｍｐ　９６－Ｗｅｌｌプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号Ｎ８０１０５６０）
ＰＣＲ反応溶液：
・ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号４３６９０１６）：１０．０μＬ
・フォワードプライマー１（表３０、配列番号１３７）：１．０μＬ
・リバースプライマー１（表３０、配列番号１３８）：１．０μＬ
・Ｔａｑｍａｎ　ＭＧＢプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製、製品番号４３１６０３４、表３０の配列番号１３９の塩基配列の５’末端にＦＡＭ（登録商標）蛍光色素、３’末端にＮＦＱおよびＭＧＢによって標識したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）：０．５０μＬ
・各種ＤＥＬ試料の水溶液（Ｓ、Ｅサンプル）：２．０μＬ
・脱イオン水：５．５μＬ
温度条件：
・５０℃で２分間保持した後、９５℃で１０分間保持し以下のサイクルを４０サイクル繰り返した。
・９５℃、１５秒間
・５９℃、１分間
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000080
　ＣＡ９タンパクと各化合物との結合剤としての親和性の強度は下記の順となると想定される（非特許文献６、及び７）。
「ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ」＞「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ」＞「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」＞「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」＞「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ（ネガティブコントロール）」
　図２２のグラフに示すように、ＵＶ照射のない溶液Ｅにおいては、高い親和性の結合剤を有する「ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ」は、ネガティブコントロールと比較し、優位にＣｔ値が低下した。しかし、中程度の親和性の結合剤を有する「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」は、ネガティブコントロールと比較し、優位なＣｔ値変化は確認されなかった。本結果は、ＤＥＬスクリーニングにおいて、光架橋反応を実施しない場合には、高い親和性の結合剤の取得は期待できるが、中程度の親和性の結合剤の取得は困難であることを示唆している。
　一方で、ＵＶ照射を実施した溶液Ｅにおいては、いずれの化合物もネガティブコントロールと比較し、優位にＣｔ値が低下する結果となった。すなわち、本結果は、ＤＥＬスクリーニングにおいて、光架橋反応を実施した場合には、中程度の親和性の結合剤の取得にも期待ができることを示唆している。
　本結果は、「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬより誘導された、光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬが、光架橋反応を利用したＤＥＬスクリーニングにおいて、有用であることを意味する。
実施例９
　［Ｌａｍｂｄａ　Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅを用いた１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬの調製］
　２本鎖核酸を有するＤＥＬ化合物「ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ」のＬａｍｂｄａ　Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理による、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ」への変換を以下の手順で行った。
　ＰＣＲチューブに、ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ（５００ｐｍоｌ）の水溶液；５μＬの１０×Ｌａｍｂｄａ　Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｂ０２６２）；１μＬのＬａｍｂｄａ　Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製、カタログ番号Ｍ０２６２）を加えた後、脱イオン水で総液量が５０μＬの溶液になるよう調製した。得られた溶液を３７℃で３０分間インキュベーションした。
　得られた反応溶液のうち１０μＬをサンプリングし、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行ったところ、２４０２４．９が観測され、目的の１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ」を同定した。
　ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬに含まれる、一方のオリゴヌクレオチド鎖（配列番号１３２）のＭＳは検出されず、１本鎖化後の生成物のＭＳがメインピークとして観測され、高収率で一本鎖化反応が進行していることが確認された。
実施例１０
　［実施例８で使用した光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬとリンカー構造が異なる光クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの合成］
＜５種の１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬの調製＞
　実施例７と同様に、５種の１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物（「ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、及び「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ」を調製した。ただし、実施例７記載における＜５種の３’末端にビオチンを有するＤＥＬ化合物の合成＞工程では、Ｐｒ＿ＴＡＧ２＿ＣＰ－ＢＩＯの代わりに、Ｐｒ＿ＴＡＧ２＿ＣＰ（実施例１と同様に合成したＰｒ＿ＴＡＧ２＿ＣＰ＿ａとＰｒ＿ＴＡＧ２＿ＣＰ＿ｂをアニーリングして調製、表３１に配列を示す）を用い、＜ストレプトアビジンビーズを用いた１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬの調製＞工程の代わりに、実施例９と同様の手順で１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬの調製を実施した。なお、表３１中の配列表記は表２５と同じである。また、各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．１２２：Ｐｒ＿ＴＡＧ２＿ＣＰ_a
Ｎｏ．１４０：Ｐｒ＿ＴＡＧ２＿ＣＰ_ｂ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000081
＜光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ２」の合成＞
　表３２に示す配列の光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ２」を以下の手順にて合成した。なお、表３２中の配列表記において、「（Ｘ２）」は次の式（１７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
で表される基を意味し、その他の表記は表２と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000083
　ＰＣＲチューブに、３－（３－メチル－３Ｈ－ジアジリン－３－イル）プロパン酸（５μＬ、０．２Ｍ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）を加えた。チューブに、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（２．５μＬ、０．４Ｍ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）、続いてＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．５μＬ、０．４Ｍ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）を加え、得られた溶液を４℃で１０分間振とうした。そして、得られた溶液に、ホウ酸ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ９．５）のＬ－Ｐｒ（表２８に配列を示す）の溶液（１００μＬ、１ｍＭ）を加え、１０℃で３０分間振とうした。
　上記溶液を、１１μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び３６３μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で終夜静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。得られたペレットを脱イオン水で溶解した後、溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩した。
　得られた上清のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的の光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ２」を同定した（各化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表３２中に示す）。
＜光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの合成＞
　上記で得られた１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物（「ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、及び「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ」）を鋳型ＤＮＡとし、「ＰＸＬ－Ｐｒ２」を用いたプライマー伸長反応を実施例７と同様の手順で行い、表３３に示す配列の光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物（「ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ２」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ２」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ２」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ２」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ２」）を合成した。なお、表３３中の配列表記は表２６、及び表３２と同じであり、５種の化合物がそれぞれ、配列番号１４２と配列番号１２５、配列番号１４２と配列番号１２７、配列番号１４２と配列番号１２９、配列番号１４２と配列番号１３１、及び配列番号１４２と配列番号１３３のオリゴヌクレオチド鎖の２本鎖により形成されていることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000084
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的の光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ「ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ２」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ２」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ２」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ２」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ２」を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表３３中に示す）。
　また、得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、実施例７で示した条件にて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図２３に示す結果から、プライマーの伸長反応により、高収率でそれぞれ、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ２」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ２」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ２」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ２」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ２」に変換されていることが確認された。なお、図２３の各レーンのサンプルは以下のとおりである。なお、各ＤＥＬ化合物のロード量がそれぞれ約４０ｎｇとなるよう、サンプルを調製した。
レーン１：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ
レーン３：ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ２）
レーン４：ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ
レーン５：ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ２）
レーン６：ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ
レーン７：ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ２）
レーン８：ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ
レーン９：ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ２）
レーン１０：ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ
レーン１１：ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ２）
レーン１２：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
＜１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３」の調製＞
　１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３」（表３４に配列を示す）を、実施例１と同様に核酸自動合成機ｎＳ－８II（ジーンデザイン社製）を使用して調製した。なお、「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３」は、「Ｕ－ＤＥＬ１２－ＨＰ」（表１１に配列を示す）を原料ヘッドピースとして、上記＜５種の１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬの調製＞と同じ手順によって誘導されるオリゴヌクレオチドと同じ構造である。また、表３４中の配列表記は表１０と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000085
＜１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ３」の合成＞
　表３５に示す配列の１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ３」を以下の手順にて合成した。なお、表３５中の配列表記において、「［ＡＡＺ－ｍｄＣ（ＴＥＧ－ａｍｉｎｏ）］」は次の式（１８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
で表される基を意味し、その他の表記は表１０と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000087
　実施例７＜ＤＥＬ化合物の原料ヘッドピース（ＡＡＺ－ＤＥＬ－ＨＰ）の合成＞と同様に、原料に「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３」を用い、４－オキソ－４－［（５－スルファモイル－１，３，４－チアジアゾール－２－イル)アミノ）ブタン酸との縮合反応を実施した。
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的の１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ３」を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表３５中に示す）。
＜３種の１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物（「ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、及び「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」）の合成＞
　表３６に示す配列の３種の１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物（「ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、及び「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」）を以下の手順にて合成した。なお、表３６中の配列表記において、「［ＳＡＢＡ－ｍｄＣ（ＴＥＧ－ａｍｉｎｏ）］」は次の式（１９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
で表される基を意味し、「［ＣｌＳＡＢＡ－ｍｄＣ（ＴＥＧ－ａｍｉｎｏ）］」は次の式（２０）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
で表される基を意味し、「［ｍＳＡＢＡ－ｍｄＣ（ＴＥＧ－ａｍｉｎｏ）］」は次の式（２１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
で表される基を意味し、その他の表記は表１０と同じである。各配列番号（Ｎｏ．）に該当する化合物の名称は以下のとおりである。
Ｎｏ．１４５：ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３
Ｎｏ．１４６：ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３
Ｎｏ．１４７：ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000091
　なお、各化合物を合成するための原料カルボン酸はそれぞれ以下のとおりである。
化合物：　　　　　　　　　　　原料カルボン酸
ＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ：　　　４－スルファモイル安息香酸
ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ：　４－クロロ－３－スルファモイル安息香酸
ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ：　　３－スルファモイル安息香酸
　ＰＣＲチューブに、原料カルボン酸（４μＬ、０．２Ｍ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）を加えた。チューブに、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（２μＬ、０．４Ｍ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）、続いてＮ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２μＬ、０．４Ｍ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）を加え、得られた溶液を１０℃で３０分間振とうした。そして、得られた溶液に、ホウ酸ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ９．５）のＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３の溶液（５０μＬ、１ｍＭ）を加え、１０℃で２時間振とうした。
　上記溶液を、５．８μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び１９２μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。
　得られたペレットを５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ　Ｇｅｍｉｎｉ　Ｃ１８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。二元移動相勾配プロファイルを用いて、５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５）及びアセトニトリル／５００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（９：１、ｖ／ｖ）を使用し、目的物を溶出した。目的物を含む画分を収集し、混合し、濃縮した。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩し、エタノール沈殿を実施した後、ペレットに脱イオン水を加え溶液にした。
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的の「ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、及び「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」を同定した（各化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表３６中に示す）。
＜光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ３」の合成＞
　表３７に示す配列の光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ３」を上記＜光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ２」の合成＞と同様の手順にて合成した。ただし、原料に「Ｌ－Ｐr」の代わりに、「Ｌ－Ｐｒ３」（実施例１と同様に合成、表３８に配列を示す）を用いた。なお、表３７中の配列表記は表３２と同じである。また、表３８中の配列表記は表８と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000092
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000093
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的の光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ３」を同定した（各化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表３７中に示す）。
＜５種の光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ「ＰＸＬ－ＤＳ－ＤＥＬ３」の合成＞
　上記で得られた１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物（「ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ３」、「ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、及び「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３」）を鋳型ＤＮＡとし、「ＰＸＬ－Ｐｒ３」を用いたプライマー伸長反応を実施例７と同様の手順で行い、表３９に示す配列の５種の光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物（「ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３」）を合成した。なお、表３９中の配列表記は表３４～３７と同じであり、５種の化合物がそれぞれ、配列番号１５０と配列番号１４４、配列番号１５０と配列番号１４５、配列番号１５０と配列番号１４６、配列番号１５０と配列番号１４７、及び配列番号１５０と配列番号１４３のオリゴヌクレオチド鎖の２本鎖により形成されていることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000094
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的の光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物「ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３」をそれぞれ同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表３９中に示す）。
　また、得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、実施例７で示した条件にて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図２４に示す結果から、プライマーの伸長反応により、高収率でそれぞれ、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３」に変換されていることが確認された。なお、図２４の各レーンのサンプルは以下のとおりである。なお、各ＤＥＬ化合物のロード量がそれぞれ約４０ｎｇとなるよう、サンプルを調製した。
レーン１：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ３
レーン３：ＳＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ３のプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ＡＡＺ－ＤＥＬ３）
レーン４：ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３
レーン５：ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３のプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３）
レーン６：ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３
レーン７：ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３のプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３）
レーン８：ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３
レーン９：ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３のプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３）
レーン１０：ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３
レーン１１：ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３のプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３）
レーン１２：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
実施例１１
　［実施例１０で合成した光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの光架橋反応有無での結合剤回収効率の比較］
＜ＤＥＬ試料の調製＞
　実施例１０で得られた４種の光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ（ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ２、ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ２、ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３、及びＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３）をそれぞれ脱イオン水で希釈し、５０ｎＭのＤＥＬ試料を調製した。
＜光架橋反応＞
装置：ＣＬ－１０００　Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（ＵＶＰ，ＩＮＣ社製）
マイクロチューブ：１．５ｍＬ　シリコナイズ　マイクロチューブ　丸底　（ワトソン株式会社製、カタログ番号１３１－６１５ＣＨ）
反応チューブ：９６穴用ボトムバイアル　（テクノラボスシィ株式会社製、カタログ番号９６－Ｖ０５０ＦＢ）
光架橋反応溶液：
・Ｓａｌｍｏｎ　Ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡ，　ｓｈｅａｒｅｄ　　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＡＭ９６８０）　：１．６μＬ
・１Ｍ　ＮａＣｌ　（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製、カタログ番号１９１－０１６６５）　：５．０μＬ
・Ｄ－ＰＢＳ（－）（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製、カタログ番号０４５―２９７９５）　：３２．４μＬ
・Ｃａｒｂｏｎｉｃ　Ａｎｈｙｄｒａｓｅ　IX／ＣＡ９　（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｏｃａｌ社製、カタログ番号１０１０７－Ｈ０８Ｈ）　：１０．０μＬ
・各種ＤＥＬ試料の水溶液（５０ｎＭ）　：１．０μＬ
反応条件：
　マイクロチューブに上記組成のＣＡ９タンパク質とＤＥＬ溶液を混合し、氷上で１時間反応させた。全量を反応チューブに分注し、氷上に維持し、３６５ｎｍのＵＶ照射を２０分間行った。
＜タンパクと架橋されたＤＥＬの回収＞
・Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｉｓｔａｇ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　＆　ｐｕｌｌｄｏｗｎ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号１０１０４Ｄ）　：１０．０μＬ
・Ｔｗｅｅｎ２０　（Ｓｉｇｍａ社製、カタログ番号Ｐ７９４９―１００ＭＬ）
・１０％ＳＤＳ　（ＮＩＰＰＯＮ　ＧＥＮＥ社製、カタログ番号３１１－９０２７１）
・Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ－ＰＢＳ（－）をＴｗｅｅｎ２０と１０％ＳＤＳで希釈し０．２％に調製）
・イミダゾール　（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製、カタログ番号０９７－０５３９１）
・Ｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ－ＰＢＳ（－）に２００ｍＭとなるようイミダゾールを溶解し、ｐＨ７．４に調製）
　ＵＶ照射後の反応溶液にＤ－ＰＢＳ（－）を加えた。その後、残りの溶液を、Ｄｙａｎｅｂｅａｄｓ　ｈｉｓ－ｔａｇ　ｐｕｌｌｄｏｗｎと混合し、室温で３０分間インキュベーションした。マグネットスタンドに固定し、２分間静置後上清を取り除き、２００μＬのＷａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒを加えて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを懸濁した。さらにこの操作を５回繰り返した。洗浄後のＤｙｎａｂｅａｄｓに１００μＬのＥｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒを加えて、室温で１０分間静置した。反応後Ｄｙｎａｂｅａｄｓをマグネットスタンドに設置し、２分後に上清をサンプルとして回収した。
＜光架橋反応をしないサンプルの調製＞
　上記一連の操作を、ＵＶ照射の操作をせずに実施し、それぞれサンプルを回収した。
＜リアルタイムＰＣＲのよるＣｔ値の測定＞
　上記で得られた各種ＤＥＬ試料を、実施例８と同様に、リアルタイムＰＣＲによりＣｔ値を測定した。ΔＣｔ値（ネガティブコントロールのＣｔ値との差分）を比較した結果を図２５に示す。
　実施例８に記載した通り、ＣＡ９タンパクと「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ２」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」との親和性の強度は、それぞれ中程度になると想定される（非特許文献６、及び７）。
　図２５のグラフに示すように、ＵＶ照射のないサンプルにおいては、いずれもΔＣｔ値が小さく、実施例８の結果と同様、ＤＥＬスクリーニングにおいて、光架橋反応を実施しない場合には、中程度の親和性の結合剤の取得は困難であることを示唆している。
　一方で、ＵＶ照射を実施したサンプルにおいては、ＵＶ照射のないサンプルと比較し、いずれもΔＣｔ値が上昇する結果となった。本実施例で使用した光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ（いずれも実施例８で使用した光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬとリンカー構造が異なる）においても、中程度の親和性の結合剤の取得に期待ができることを示唆している。
　本結果は、「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬより誘導された、様々なリンカー構造を有する光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬが、光架橋反応を利用したＤＥＬスクリーニングにおいて、有用であることを意味する。
実施例１２
　［「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合を有する光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」と「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合のない光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」との結合剤回収効率（ＤＮＡ検出感度）の比較］
＜クロスリンカーとコード配列の間に共有結合のない光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの合成＞
　実施例１０で得られた１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物（「ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、及び「ＳＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３」）を用い、「ＰＸＬ－Ｐｒ３」を用いたアニーリングを以下の手順で行い、表４０に示す配列の４種の光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物（「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ４」）を合成した。なお、表４０中の配列表記は表３４、表３６、及び表３７と同じであり、４種の化合物がそれぞれ、配列番号１４８と配列番号１４５、配列番号１４８と配列番号１４６、配列番号１４８と配列番号１４７、及び配列番号１４８と配列番号１４３のオリゴヌクレオチド鎖の２本鎖により形成されていることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000095
　ＰＣＲチューブに、３０μＬの各種１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物の１０μＭ水溶液；３．７７μＬの「ＰＸＬ－Ｐｒ３」１５９μＭ水溶液を加えた。得られた水溶液に脱イン水を加え、総液量を６０μＬとした。その後、９０℃で２分間インキュベーションした後、３０分かけて室温まで冷却した。
＜ＤＥＬ試料の調製＞
　上記で得られた「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合のない光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」４種（「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ４」）、及び実施例１０で得られた「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合を有する光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」４種（「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３」）をそれぞれ脱イオン水で希釈し、５０ｎＭのＤＥＬ試料を調製した。
＜光架橋反応＞
装置：ＣＬ－１０００　Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（ＵＶＰ，ＩＮＣ社製）
マイクロチューブ：１．５ｍＬ　シリコナイズ　マイクロチューブ　丸底　（ワトソン株式会社製、カタログ番号１３１－６１５ＣＨ）
反応チューブ：９６穴用ボトムバイアル　（テクノラボスシィ株式会社製、カタログ番号９６－Ｖ０５０ＦＢ）
光架橋反応溶液：
・Ｓａｌｍｏｎ　Ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡ，　ｓｈｅａｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＡＭ９６８０）　：１．６μＬ
・１Ｍ　ＮａＣｌ　（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製、カタログ番号１９１－０１６６５）　：５．０μＬ
・Ｄ－ＰＢＳ（－）（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製９、カタログ番号０４５―２９７９５）　：３２．４μＬ
　・Ｃａｒｂｏｎｉｃ　Ａｎｈｙｄｒａｓｅ　IX／ＣＡ９　（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｏｃａｌ社製、カタログ番号１０１０７－Ｈ０８Ｈ）　：１０．０μＬ
・各種ＤＥＬ試料の水溶液（５０ｎＭ）　：１．０μＬ
反応条件：
　上記組成のＣＡ９タンパク質とＤＥＬ溶液を混合したものを氷上で２時間インキュベーションさせた。その後、氷上に維持し、３６５ｎｍのＵＶ照射を２０分間行った。
＜タンパクと架橋されたＤＥＬの回収＞
・Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｉｓｔａｇ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　＆　ｐｕｌｌｄｏｗｎ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号１０１０４Ｄ）　：１０．０μＬ
・Ｔｗｅｅｎ２０　（Ｓｉｇｍａ社製、カタログ番号Ｐ７９４９―１００ＭＬ）
・１０％ＳＤＳ　（ＮＩＰＰＯＮ　ＧＥＮＥ社製、カタログ番号３１１－９０２７１）
・Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ－ＰＢＳ（－）をＴｗｅｅｎ２０と１０％ＳＤＳで希釈し０．２％に調製）
・イミダゾール　（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製、カタログ番号０９７－０５３９１）
・Ｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ－ＰＢＳ（－）に２００ｍＭとなるようイミダゾールを溶解し、ｐＨ７．４に調製）
　ＵＶ照射後の反応溶液を、Ｄｙnａｂｅａｄｓ　ｈｉｓ－ｔａｇ　ｐｕｌｌｄｏｗｎと混合し、室温で３０分間インキュベーションした。マグネットスタンドに固定し、２分間静置後上清を取り除き、２００μＬのＷａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒを加えて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを懸濁した。さらにこの操作を５回繰り返した。洗浄後のＤｙｎａｂｅａｄｓに１００μＬのをＥｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ加えて、室温で１０分間反応させた。反応後Ｄｙｎａｂｅａｄｓをマグネットスタンドに設置し、２分後に上清をサンプルとして回収した。
＜光架橋反応をしないサンプルの調製＞
　上記一連の操作を、ＵＶ照射の操作をせずに実施し、それぞれサンプルを回収した。
＜リアルタイムＰＣＲのよるＣｔ値の測定＞
　上記で得られた各種ＤＥＬ試料を、実施例８と同様に、リアルタイムＰＣＲによりＣｔ値を測定した。ΔＣｔ値（ネガティブコントロールのＣｔ値との差分）を比較した結果を図２６に示す。
　実施例８と同様に、ＣＡ９タンパクと各化合物との結合剤としての親和性の強度は下記の順となると想定される（非特許文献６、及び７）。
「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」＞「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」＞「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」＞「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３（ネガティブコントロール）」、「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ４（ネガティブコントロール）」
　図２６のグラフに示すように、ＵＶ照射を実施したサンプルにおいて、いずれの結合剤においても、「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合を有する光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ（ＰＸＬ－ＤＳ－ＤＥＬ３）」の方が、「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合のない光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ（ＰＸＬ－ＤＳ－ＤＥＬ４）」よりもΔＣｔ値が優位に高い結果となっている。結合剤の種類は同じであっても、光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの構造の違いで、ΔＣｔ値が異なっており、「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合を有する光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」の方が、結合剤回収効率（ＤＮＡ検出感度）が高いことを示唆している。
　本結果は、「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬより誘導された「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合を有する光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」が、光架橋反応を利用したＤＥＬスクリーニングにおいて、「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合のない光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」よりも有用であることを意味する。
実施例１３
　［強い分離、溶出条件に適用した光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの光架橋反応での結合剤回収効率の検証］　
＜ＤＥＬ試料の調製＞
　実施例１２と同様に、「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合のない光架反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」４種（「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ４」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ４」）、及び「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合を有する光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」４種（「ＰＸＬ－ＤＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、及び「ＰＸＬ－ＤＳ－Ａｍｉｎｏ－ＤＥＬ３」）をそれぞれ脱イオン水で希釈し、５０ｎＭのＤＥＬ試料を調製した。
＜光架橋反応＞
　装置：ＣＬ－１０００　Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ　Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（ＵＶＰ，ＩＮＣ社製）
反応チューブ：９６穴用ボトムバイアル　（テクノラボスシィ株式会社製、カタログ番号９６－Ｖ０５０ＦＢ）
光架橋反応溶液：
・Ｓａｌｍｏｎ　Ｓｐｅｒｍ　ＤＮＡ，　ｓｈｅａｒｅｄ　　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＡＭ９６８０）　：１．６μＬ
・１Ｍ　ＮａＣｌ　（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製、カタログ番号１９１－０１６６５）　：５．０μＬ
・Ｄ－ＰＢＳ（－）（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製９、カタログ番号０４５―２９７９５）　：３９．４μＬ
　・Ｃａｒｂｏｎｉｃ　Ａｎｈｙｄｒａｓｅ　IX／ＣＡ９　（Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｏｃａｌ社製、カタログ番号１０１０７－Ｈ０８Ｈ）　：３．０μＬ
・各種ＤＥＬ試料の水溶液（５０ｎＭ）　：１．０μＬ
反応条件：
　上記組成のＣＡ９タンパク質とＤＥＬ溶液を混合したものを氷上で２時間インキュベートさせた。その後、氷上に維持し、３６５ｎｍのＵＶ照射を２０分間行った。
＜タンパクと架橋されたＤＥＬの回収＞
・Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｈｉｓｔａｇ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　＆　ｐｕｌｌｄｏｗｎ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号１０１０４Ｄ）　：１０．０μＬ
・Ｔｗｅｅｎ２０　（Ｓｉｇｍａ社製、カタログ番号Ｐ７９４９―１００ＭＬ）
・Ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ－ＰＢＳ（－）をＴｗｅｅｎ２０で希釈し０．２％に調製）
・２００ｍＭ　イミダゾール溶液（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製、カタログ番号０９７－０５３９１）
　ＵＶ照射後の反応溶液を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　ｈｉｓ－ｔａｇ　ｐｕｌｌｄｏｗｎと混合し、室温で３０分間インキュベーションした。マグネットスタンドに固定し、２分間静置後上清を取り除き、２００μＬのＷａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒを加えて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを懸濁し、９０℃、１０分間反応させた。さらにこの操作を３回繰り返した。洗浄後のＤｙｎａｂｅａｄｓに３０μＬの２００ｍＭイミダゾール溶液を加えて、室温で１０分間反応させた。反応後Ｄｙｎａｂｅａｄｓをマグネットスタンドに設置し、２分後に上清をサンプルとして回収した。
＜光架橋反応をしないサンプルの調製＞
　上記一連の操作を、ＵＶ照射の操作をせずに実施し、それぞれサンプルを回収した。
　上記＜タンパクと架橋されたＤＥＬの回収＞に記載の通り、タンパクと架橋されたＤＥＬの回収時に、加熱条件に臥しており、強い分離、溶出条件となっている。
＜リアルタイムＰＣＲのよるＣｔ値の測定＞
　上記で得られた各種ＤＥＬ試料を、実施例８と同様に、リアルタイムＰＣＲによりＣｔ値を測定した。ΔＣｔ値（ネガティブコントロールのＣｔ値との差分）を比較した結果を図２７に示す。
　図２７のグラフに示すように、ＵＶ照射を実施したサンプルにおいて、いずれの結合剤においても、「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合を有する光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ（ＰＸＬ－ＤＳ－ＤＥＬ３）」の方が、「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合のない光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ（ＰＸＬ－ＤＳ－ＤＥＬ４）」よりもΔＣｔ値が優位に高い結果となっている。結合剤の種類は同じであっても、光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの構造の違いで、ΔＣｔ値が異なっており、「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合を有する光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」の方が、結合剤回収効率（ＤＮＡ検出感度）が高いことを示唆している。
　本結果は、「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬより誘導された「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合を有する光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」が、光架橋反応を利用したＤＥＬスクリーニングにおいて、「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合のない光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」よりも有用であることを意味する。
　また、本結果は、「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬより誘導された「クロスリンカーとコード配列の間に共有結合を有する光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ」は、非特異な結合剤などの除去を目的とした、強い分離条件や溶出条件でのＤＥＬスクリーニングにも適応可能であることを示唆している。
実施例１４
　［Ｕ－ＤＥＬ－１３－ＨＰを原料としたヘアピンＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの変換、及び新たな機能の付与］
＜ＤＥＬ化合物の原料ヘッドピース（「ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ５」）の合成＞
　表４１中に示す配列の「ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ５」を、原料に「Ｕ－ＤＥＬ１３－ＨＰ」を用い、実施例１０＜３種の１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物（「ＳＳ－ＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」、及び「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ３」）の合成＞と同様の手順にて合成した。なお、表４１中の表記は表３６と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000096
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的の「ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ５」を同定した（各化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表４１中に示す）。
＜ヘアピンＤＥＬ化合物（「ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」）の合成＞
　表４２に示す配列のヘアピンＤＥＬ化合物（「ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」）を実施例１０と同様に、原料ヘッドピース「ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ－ＨＰ５」とＰｒ＿ＴＡＧ２＿ＣＰとの２本鎖ライゲーションにより合成した。なお、表４２中の配列表記は表３６と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000097
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的の「ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」を同定した（各化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表４２中に示す）。
＜ヘアピンＤＥＬ化合物（「ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」）のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断＞
　上記で得られたヘアピンＤＥＬ化合物「ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応を実施例７＜５種の３’末端にビオチンを有するＤＥＬ化合物（ＡＡＺ－ＢＩＯ－ＤＥＬ、ＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ、ＣｌＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ、ｍＳＡＢＡ－ＢＩＯ－ＤＥＬ、Ａｍｉｎｏ－ＢＩＯ－ＤＥＬ）のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断＞と同様の手順で行い、表４３に示す配列の２本鎖核酸を有するＤＥＬ化合物「ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」に変換した。なお、表４３中の配列表記は表３６と同じであり、配列番号１５３と配列番号１５４のオリゴヌクレオチド鎖の２本鎖により形成されていることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000098
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的の２本鎖核酸を有するＤＥＬ化合物「ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」を同定した（各化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表４３中に示す）。
　また、得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、実施例３と同じ条件で、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図２８に示す結果から、「ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」が、高収率で切断され、「ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」に変換されていることが確認された。なお、図２８の各レーンのサンプルは以下のとおりである。
レーン１：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５
レーン３：ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５のＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後のサンプル
レーン４：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
＜２本鎖核酸を有するＤＥＬ化合物「ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」のＬａｍｂｄａ　Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅによる１本鎖ＤＥＬへの変換＞
　上記で得られた２本鎖核酸を有するＤＥＬ化合物「ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」を、実施例９と同様にＬａｍｂｄａ　Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅにより処理し、１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」を調製した。なお、「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」は、表４３中の配列番号１５４のオリゴヌクレオチド鎖である。
　得られた上清のうち一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行ったところ、分子量２３８２５．８が観測され、目的の１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」を同定した。
＜光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ５」の合成＞
　表４４に示す配列の光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ５」を実施例１０＜光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ２」の合成＞と同様の手順にて合成した。ただし、原料に「Ｌ－Ｐｒ」の代わりに、「Ｌ－Ｐｒ５」（実施例１と同様に合成、表４５に配列を示す）を用いた。なお、表４４中の配列表記は表３２と同じである。また、表４５中の配列表記は表８と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000099
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000100
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的の光反応性クロスリンカー修飾プライマー「ＰＸＬ－Ｐｒ５」を同定した（各化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表４４中に示す）。
＜光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物（「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」）の合成＞
　上記で得られた１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」を
を鋳型ＤＮＡとし、「ＰＸＬ－Ｐｒ５」を用いたプライマー伸長反応を実施例７と同様の手順で行い、表４６に示す配列の光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」を合成した。なお、表４６中の配列表記は表３６、及び表４４と同じであり、配列番号１５７と配列番号１５４のオリゴヌクレオチド鎖の２本鎖により形成されていることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000101
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的の光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表４６中に示す）。
　また、得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、実施例７で示した条件にて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図２９に示す結果から、プライマーの伸長反応により、高収率で「ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５」に変換されていることが確認された。なお、図２９の各レーンのサンプルは以下のとおりである。なお、各ＤＥＬ化合物のロード量がそれぞれ約４０ｎｇとなるよう、サンプルを調製した。
レーン１：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５
レーン３：ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５
レーン４：ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５のプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＰＸＬ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ５）
レーン５：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
実施例１５
　［クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの合成］
＜３種のクロスリンカー修飾プライマー（ＰＡ－Ｐｒ、ＴＰＤ－Ｐｒ、ＡＣＡ－Ｐｒ）の合成＞
　表４７に示す配列の各種クロスリンカー修飾プライマーを以下の手順にて合成した。なお、表４７中の配列表記において、「（ＰＡ）」は次の式（２２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000102
で表される基を意味し、「（ＴＰＤ）」は次の式（２３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
で表される基を意味し、「（ＡＣＡ）」は次の式（２４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000104
で表される基を意味し、その他の表記は表２と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000105
　なお、各化合物を合成するための原料活性エステルはそれぞれ以下のとおりである。
化合物：　　　　原料活性エステル
ＰＡ－Ｐｒ：　　４－アジド安息香酸　Ｎ－スクシンイミジル
ＴＰＤ－Ｐｒ：　４－（３－（トリフルオロメチル）－３Ｈ－ジアジリン－３－イル）安息香酸　Ｎ－スクシンイミジル
ＡＣＡ－Ｐｒ：　アクリル酸　Ｎ－スクシンイミジル
　ＰＣＲチューブに、１０℃に冷却したホウ酸ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ９．４）のＬ－Ｐｒ（実施例７に記載）の溶液（１ｍＭ）を加えた。チューブに、５０当量の原料活性エステル（２５μＬ、０．２Ｍ　ジメチルスルホキシド溶液）を加え、生じた混合物を１０℃で３０分間時間振とうした。
　反応液を、１２μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び３９６μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。
　得られたペレットを５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ　Ｇｅｍｉｎｉ　Ｃ１８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。二元移動相勾配プロファイルを用いて、５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．５）及びアセトニトリル／５００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（９：１、ｖ／ｖ）を使用し、目的物を溶出した。目的物を含む画分を収集し、混合し、濃縮した。得られた溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩し、エタノール沈殿を実施した後、ペレットに脱イオン水を加え溶液にした。
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、それぞれ目的物を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表４７中に示す）。
＜化合物「ＡＯＰ－Ｌ－Ｐｒ」の合成＞
　表４８に示す配列の化合物「ＡＯＰ－Ｌ－Ｐｒ」を以下の手順にて合成した。なお、表４８中の配列表記において、「（ＡＯＰ－ａｍｉｎｏＣ６－Ｌ）」は次の式（２５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000106
で表される基を意味し、その他の表記は表２と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000107
　ＰＣＲチューブに、１０℃に冷却したホウ酸ナトリウム緩衝液（１５０ｍＭ、ｐＨ９．４）のＬ－Ｐｒ（実施例１と同様に合成、表２８に配列を示す）の溶液（２００μＬ、１ｍＭ）を加えた。チューブに、４０当量のＮ－Ｆｍｏｃ－１５－アミノ－４，７，１０，１３－テトラオキサオクタデカン酸（２０μＬ、０．４Ｍ　Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド溶液）、続いて４０当量の、塩化４－（４，６－ジメトキシ［１．３．５］トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム水和物（ＤＭＴＭＭ）（１６μＬ、０．５Ｍ　水溶液）を加え、生じた混合物を１０℃で４時間振とうした。
　反応液を、２３．６μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び７７８．８μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で終夜静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。ペレットに１８０μＬの脱イオン水を加え溶液にした後、２０μＬのピペリジンを加え、１０℃で３時間振とうした。
　得られた溶液を、２０μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び６６０μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットに２００μＬの脱イオン水を加え１ｍＭの溶液にした。
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例１の分析条件２の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的物を同定した（各配列の理論分子量、及び検出された分子量を表４８中に示す）。
＜クロスリンカー修飾プライマー（ＢＭＰ－Ｐｒ）の合成＞
　表４９に示す配列のクロスリンカー修飾プライマー（ＢＭＰ－Ｐｒ）を以下の手順にて合成した。なお、表４９中の配列表記において、「（ＢＭＰ）」は次の式（２６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000108
で表される基を意味し、その他の表記は表２と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000109
　ＰＣＲチューブに、１０℃に冷却したリン酸ナトリウム緩衝液（１２５ｍＭ、ｐＨ９．４）のＡＯＰ－Ｌ－Ｐｒの溶液（４０μＬ、０．５ｍＭ）を加えた。チューブに、５０当量の３－マレイミドプロピオン酸　Ｎ－スクシンイミジル（５μＬ、０．２Ｍ　ジメチルスルホキシド溶液）を加え、生じた混合物を１０℃で４０分間振とうした。その後、ジメチルスルホキシド２０μＬを加え、生じた混合物をさらに１０℃で２５分間振とうした。
　反応液を、５μＬの５Ｍの塩化ナトリウム水溶液及び２１５μＬの冷却された（－２０℃）エタノールにより処理し、－７８℃で３０分間静置した。遠心分離後、上清を除き、得られたペレットを風乾した。得られたペレットを脱イオン水で溶解した後、溶液をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルタ（３ｋＤカットオフ）により脱塩した。
　得られた上清のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的のクロスリンカー修飾プライマー「ＢＭＰ－Ｐｒ」を同定した（各化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表４９中に示す）。
＜クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ（「ＴＰＤ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」）の合成＞
　実施例１０で得られた１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」を鋳型ＤＮＡとし、上記＜３種のクロスリンカー修飾プライマーの合成＞で得られたクロスリンカー修飾プライマー「ＴＰＤ－Ｐｒ」を用いたプライマー伸長反応を以下の手順で行い、表５０に示す配列のクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物「ＴＰＤ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」を合成した。なお、表５０中の配列表記は表２６、及び表４７と同じであり、「ＴＰＤ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」が、配列番号１６３と配列番号１３１のオリゴヌクレオチド鎖の２本鎖により形成されていることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000110
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的のクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ「ＴＰＤ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表５０中に示す）。
＜クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ（「ＡＣＡ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」）の合成＞
　実施例１０で得られた１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物「ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」を鋳型ＤＮＡとし、上記で得られたクロスリンカー修飾プライマー「ＡＣＡ－Ｐｒ）を用いたプライマー伸長反応を実施例７と同様の手順で行い、表５１に示す配列のクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物「ＡＣＡ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」を合成した。なお、表５１中の配列表記は表２６、及び表４７と同じであり、「ＡＣＡ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」が、配列番号１６４と配列番号１２９のオリゴヌクレオチド鎖の２本鎖により形成されていることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000111
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的のクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ「ＡＣＡ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表５１中に示す）。
＜ゲル電気泳動によるプライマー伸長反応の確認＞
　上記＜クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ（「ＴＰＤ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」）の合成＞、及び＜クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ（「ＡＣＡ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」）の合成＞で得られた溶液のうち一部をサンプリングし、実施例７で示した条件で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図３０に示す結果から、プライマーの伸長反応により、高収率で「ＴＰＤ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」、及び「ＡＣＡ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ」に変換されていることが確認された。なお、図３０の各レーンのサンプルは以下のとおりである。なお、各ＤＥＬ化合物のロード量がそれぞれ約４０ｎｇとなるよう、サンプルを調製した。
レーン１：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ
レーン３：ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＴＰＤ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ）
レーン４：ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ
レーン５：ＳＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＡＣＡ－ＤＳ－ＣｌＳＡＢＡ－ＤＥＬ）
レーン６：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
実施例１６
　［クロスリンカー修飾のための反応基を有する２本鎖ＤＥＬを用いたクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの合成］
＜クロスリンカー修飾のための反応基を有するプライマー（「ＢＣＮ－Ｐｒ」）の合成＞
　表５２に示す配列のクロスリンカー修飾のための反応基を有するプライマー「ＢＣＮ－Ｐｒ」を以下の手順にて合成した。なお、表５２中の配列表記において、「（ＢＣＮ）」は次の式（２７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000112
で表される基を意味し、その他の表記は表２と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000113
　実施例１５と同様に、原料に「ＡＯＰ－Ｌ－Ｐｒ」を用い、原料活性エステルに炭酸スクシンイミジル（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６.１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルを用い、「ＢＣＮ－Ｐｒ」の合成を実施した。
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的の「ＢＣＮ－Ｐr」を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表５２中に示す）。
＜クロスリンカー修飾のための反応基を有する２本鎖ＤＥＬの合成＞
　実施例１０で得られた「ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」を鋳型ＤＮＡとし、「ＢＣＮ－Ｐｒ」を用いたプライマー伸長反応を実施例７と同様の手順で行い、表５３に示す配列のクロスリンカー修飾のための反応基を有する２本鎖ＤＥＬ化合物「ＢＣＮ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」を合成した。なお、表５３中の配列表記は表２６、及び表５２と同じであり、「ＢＣＮ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」が、配列番号１６６と配列番号１３１のオリゴヌクレオチド鎖の２本鎖により形成されていることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000114
　得られた溶液のうち、一部をサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的のクロスリンカー修飾のための反応基を有する２本鎖ＤＥＬ「ＢＣＮ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表５３中に示す）。
　また、得られた反応溶液のうち一部をサンプリングし、実施例７で示した条件で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図３１に示す結果から、プライマーの伸長反応により、高収率で「ＢＣＮ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」に変換されていることが確認された。なお、図３１の各レーンのサンプルは以下のとおりである。なお、各ＤＥＬ化合物のロード量がそれぞれ約４０ｎｇとなるよう、サンプルを調製した。
レーン１：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ
レーン３：ＳＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬのプライマー伸長反応実施後のサンプル（ＢＣＮ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ）
レーン４：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
＜クロスリンカー修飾のための反応基を有する２本鎖ＤＥＬとのクリック反応によるクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ（「ＰＳＦ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」）の合成＞
　上記で得られた「ＢＣＮ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」に対し、クリック反応によりクロスリンカーを導入し、表５４に示す配列のクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物「ＰＳＦ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」を合成した。合成手順を以下に示す。なお、表５４中の配列表記において、「（ＰＳＦ－t）」は次の式（２８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000115
で表される基を意味し、その他の表記は表２６と同じであり、「ＰＳＦ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」が、配列番号１３１と配列番号１６７のオリゴヌクレオチド鎖の２本鎖により形成されていることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000116
　ＰＣＲチューブに、２－アジド酢酸　Ｎ－スクシンイミジル（１２５μＬ、０．２Ｍ　ジメチルスルホキシド溶液）を加えた。チューブに、Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５．２μＬ）、続いて４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（３０ｍｇ）を加え、得られた混合物を１０℃で１時間振とうした。
　得られた混合物にジメチルスルホキシドを加え、１０倍希釈した（希釈液）。
　ＰＣＲチューブに、リン酸ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ７．０）のＢＣＮ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ溶液（２μL、０．１ｍＭ）を加え、続いてジメチルスルホキシド１．８μＬを加えた。その後、上記で得られた希釈液０．２μＬを加え、得られた溶液を２５℃で２時間振とうした。
　得られた溶液の内１μＬをサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的のクリック修飾２本鎖ＤＥＬ「ＰＳＦ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表５４中に示す）。
＜クロスリンカー修飾のための反応基を有する２本鎖ＤＥＬとのクリック反応によるクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ（「ＢＭＰ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」）の合成＞
　上記で得られた「ＢＣＮ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」に対し、クリック反応によりクロスリンカーを導入し、表５５に示す配列のクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ化合物「ＢＭＰ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」を合成した。合成手順を以下に示す。なお、表５５中の配列表記において、「（ＢＭＰ－t）」は次の式（２９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000117
で表される基を意味し、その他の表記は表２６と同じであり、「ＢＭＰ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」が、配列番号１３１と配列番号１６８のオリゴヌクレオチド鎖の２本鎖により形成されていることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000118
　ＰＣＲチューブに、３－アジドプロピルアミン（４．８ｍｇ、０．２Ｍ　ジメチルスルホキシド溶液）を加えた。チューブに、３－マレイミドプロピオン酸　Ｎ－スクシンイミジル（３０ｍｇ）を加え、得られた混合物を１０℃で１時間振とうした。
　得られた混合物にジメチルスルホキシドを加え、１０倍希釈した（希釈液）。
　ＰＣＲチューブに、リン酸ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ７．０）のＢＣＮ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ溶液（２μL、０．１ｍＭ）を加え、続いてジメチルスルホキシド１．８μＬを加えた。その後、上記で得られた希釈液０．２μＬを加え、得られた溶液を２５℃で２時間振とうした。
　得られた溶液の内１μＬをサンプリングし、脱イオン水で希釈したのち、実施例３の分析条件３の条件にて、ＥＳＩ－ＭＳによる質量分析を行い、目的のクリック修飾２本鎖ＤＥＬ「ＢＭＰ－ＤＳ－ｍＳＡＢＡ－ＤＥＬ」を同定した（化合物の理論分子量、及び検出された分子量を表５５中に示す）。
実施例１７
　［Ｕ－ＤＥＬ９－ＨＰを原料としたモデルライブラリから１本鎖ＤＮＡへの変換、及び新たな機能の付与］
＜Ｌａｍｂｄａ　Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅを用いたモデルライブラリの１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物への変換＞
　モデルライブラリのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後サンプル（実施例６で合成）を用いて、実施例９と同様の手順でモデルライブラリの１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬ化合物への変換を実施した。そして、得られた溶液を次工程の出発原料とした。
＜１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬに変換したモデルライブラリのクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへの変換＞
　上記で得られた１本鎖ＤＮＡを有するＤＥＬに変換したモデルライブラリを鋳型ＤＮＡとし、「ＰＸＬ－Ｐｒ」（実施例７で合成）、及び「ＢＣＮ－Ｐｒ」（実施例１６で合成）を用いたプライマー伸長反応を実施例７と同様の手順で実施した。
＜結果＞
　上記２種のプライマー伸長反応より得られた反応溶液のうち一部をそれぞれサンプリングし、実施例７に示した条件で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。図３２に示す結果から、プライマーの伸長反応により、高収率で、１本鎖ＤＥＬ化したモデルライブラリが光反応性クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬ、及びクロスリンカー修飾のための反応基を有する２本鎖ＤＥＬへ変換されていることが確認された。なお、図３２の各レーンのサンプルは以下のとおりである。なお、各ＤＥＬ化合物のロード量がそれぞれ約４０ｎｇとなるよう、サンプルを調製した。
レーン１：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
レーン２：モデルライブラリのＵＳＥＲ（登録商標）ｅｎｚｙｍｅによる切断反応実施後サンプル
レーン３：モデルライブラリのＬａｍｂｄａ　Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅによる１本鎖ＤＥＬ化反応実施後のサンプル
レーン４：１本鎖ＤＥＬ化したモデルライブラリとＰＸＬ－Ｐｒとのプライマー伸長反応実施後のサンプル
レーン５：１本鎖ＤＥＬ化したモデルライブラリとＢＣＮ－Ｐｒとのプライマー伸長反応実施後のサンプル
レーン６：２０ｂｐ　ＤＮＡラダー（ロンザ製、Ｌｏｎｚａ　２０　ｂｐ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、カタログ番号５０３３０）
　本発明では、選択的に切断可能な部位を含む核酸化合物を利用する方法を提供する。さらに本発明では、切断可能な部位をＤＮＡ鎖中に含むＤＥＬを、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導し、評価する方法を提供し、従来よりも、「簡便なＤＥＬ合成手法」と「ＤＥＬ評価手法の拡大・改善」とを兼ね備えた化合物スクリーニングが可能となる。

Claims (123)

  1. 　「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＮＡコード化ライブラリ（ＤＥＬ）から誘導されたクロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬの評価方法であって、以下のステップ：
    （１）当該ＤＥＬを、生物学的標的と、当該ＤＥＬの少なくとも１つのライブラリ分子が生物学的標的と結合するために適した条件下で接触させる、
    （２）生物学的標的と結合したライブラリ分子のクロスリンカーを、生物学的標的と架橋させる、
    （３）架橋されたライブラリ分子と生物学的標的との複合体を、架橋されていないライブラリ分子から分離させる、
    （４）回収された複合体中のライブラリ分子が有するオリゴヌクレオチドの配列を同定する、
    （５）（４）において決定された配列を使用し、生物学的標的と結合する１つ以上の化合物の構造を同定する、
    により構成される方法。
  2. 　前記クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬのクロスリンカーが、コード配列を有するオリゴヌクレオチドと、共有結合を介して連結されている、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬのクロスリンカーが、オリゴヌクレオチドの５‘末端に直接結合するか、または２官能性スペーサーを介して結合している、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへの誘導が、以下のステップを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法、
    （ｉ）「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬの、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を切断し、２本鎖ＤＥＬに変換する。
    （ｉｉ）（ｉ）で得られた２本鎖ＤＥＬのうち、ライブラリ分子が結合していないオリゴヌクレオチドを除去し、１本鎖ＤＥＬに変換する。
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた１本鎖ＤＥＬと、クロスリンカー修飾ＤＮＡとを２本鎖形成させることで、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導する。
  5. 　クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへの誘導が、以下のステップを含む、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法、
    （ｉ）「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬの、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を切断し、２本鎖ＤＥＬに変換する。
    （ｉｉ）（ｉ）で得られた２本鎖ＤＥＬのうち、ライブラリ分子が結合していないオリゴヌクレオチドを除去し、１本鎖ＤＥＬに変換する。
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた１本鎖ＤＥＬと、クロスリンカー修飾のための反応基を有するＤＮＡとを２本鎖形成させ、
    （ｉｖ）クロスリンカー修飾のための反応基と、クロスリンカーユニットとを反応させることで、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導する。
  6. 　クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへの誘導が、以下のステップを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法、
    （ｉ）「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬの、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を切断し、２本鎖ＤＥＬに変換する。
    （ｉｉ）（ｉ）で得られた２本鎖ＤＥＬのうち、ライブラリ分子が結合していないオリゴヌクレオチドを除去し、１本鎖ＤＥＬに変換する。
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた１本鎖ＤＥＬに、クロスリンカー修飾プライマーを付与し、付与したプライマーを伸長させ、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導する。
  7. 　クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへの誘導が、以下のステップを含む、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の方法、
    （ｉ）「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬの、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を切断し、２本鎖ＤＥＬに変換する。
    （ｉｉ）（ｉ）で得られた２本鎖ＤＥＬのうち、ライブラリ分子が結合していないオリゴヌクレオチドを除去し、１本鎖ＤＥＬに変換する。
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた１本鎖ＤＥＬに、クロスリンカー修飾のための反応基を有する修飾プライマーを付与し、付与したプライマーを伸長させ、クロスリンカー修飾のための反応基を有する２本鎖ＤＥＬへ誘導し、
    （ｉｖ）クロスリンカー修飾のための反応基と、クロスリンカーユニットとを反応させることで、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導する。
  8. 　クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへの誘導が、以下のステップを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法、
    （ｉ）「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬの、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を切断し、２本鎖ＤＥＬに変換する。
    （ｉｉ）（ｉ）で得られた２本鎖ＤＥＬに、クロスリンカー修飾プライマーを付与し、付与したプライマーを伸長させ、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導する。
  9. 　クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへの誘導が、以下のステップを含む、請求項１～請求項３のいずれかに１項に記載の方法、
    （ｉ）「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬの、少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」を切断し、２本鎖ＤＥＬに変換する。
    （ｉｉ）（ｉ）で得られた２本鎖ＤＥＬに、クロスリンカー修飾のための反応基を有する修飾プライマーを付与し、付与したプライマーを伸長させ、クロスリンカー修飾のための反応基と、クロスリンカーユニットとを反応させることで、クロスリンカー修飾２本鎖ＤＥＬへ誘導する。
  10. 　以下を特徴とする請求項６または請求項８に記載の方法。
    （Ｉ）少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」が、ライブラリ分子が結合している部位より３‘方向に存在するヘアピン型ＤＥＬを用いる。
    （ＩＩ）クロスリンカーが、オリゴヌクレオチドの５‘末端に直接結合するか、または２官能性スペーサーを介して結合しているクロスリンカー修飾プライマーを用いる。
  11. 　以下を特徴とする請求項７または請求項９に記載の方法。
    （Ｉ）少なくとも一つの「選択的に切断可能な部位」が、ライブラリ分子が結合している部位より３‘方向に存在するヘアピン型ＤＥＬを用いる。
    （ＩＩ）クロスリンカー修飾のための反応基が、オリゴヌクレオチドの５‘末端に直接結合するか、または２官能性スペーサーを介して結合しているクロスリンカー修飾のための反応基を有する修飾プライマーを用いる。
  12. 　前記（ｉｉ）のステップにおいて、ライブラリ分子が結合していないオリゴヌクレオチドが、機能性分子を有し、該機能性分子の機能に応じた処理により除去される、請求項４～７のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　機能性分子がビオチンである、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記（ｉｉ）のステップにおいて、ライブラリ分子が結合していないオリゴヌクレオチドの除去が、エキソヌクレアーゼによる分解である、請求項４～７のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　エキソヌクレアーゼが、ラムダエキソヌクレアーゼである、請求項１４に記載の方法。
  16. 　クロスリンカーが、アジド基、ジアジリン基、スルホニルフルオリド基、ジアゾ基、シンナモイル基、またはアクリレート基を少なくとも一つ含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　クロスリンカーが、アジド基、ジアジリン基、またはスルホニルフルオリド基を少なくとも一つ含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  18. 　クロスリンカーが、式（ＡＡ）～（ＡＥ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    （式中、＊は２本鎖ＤＥＬの５‘末端、もしくは該５‘末端と結合している２官能性スペーサー側との結合位置を意味する）
    のいずれかの構造を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  19. 　クロスリンカーが、式（ＡＡ）～（ＡＥ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    （式中、＊は２本鎖ＤＥＬの５‘末端、もしくは該５‘末端と結合している２官能性スペーサー側との結合位置を意味する）
    のいずれかの構造である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  20. 　クロスリンカーが、式（ＢＡ）または（ＢＢ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    （式中、＊は２本鎖ＤＥＬの５‘末端、もしくは該５‘末端と結合している２官能性スペーサー側との結合位置を意味する）
    のいずれかの構造を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  21. 　クロスリンカーが、式（ＢＡ）または（ＢＢ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    （式中、＊は２本鎖ＤＥＬの５‘末端、もしくは該５‘末端と結合している２官能性スペーサー側との結合位置を意味する）
    のいずれかの構造である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  22. 　クロスリンカー修飾のための反応基が、クリック反応のための反応基である、請求項５、７、９または１１のいずれか１項に記載の方法。　
  23. 　クロスリンカー修飾のための反応基が、アルキニル基、アルケニル基、アジドを基またはテトラジニル基である、請求項５、７、９または１１のいずれか１項に記載の方法。
  24. 　クロスリンカー修飾のための反応基が、式（ＣＡ）～（ＣＬ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    （式中、＊は２本鎖ＤＥＬの５’末端、もしくは５’末端と結合している２官能性スペーサー側との結合位置を意味する）
    のいずれかの構造である請求項５、７、９または１１のいずれか１項に記載の方法。
  25. 　（２）の「生物学的標的と結合したライブラリ分子のクロスリンカーを、生物学的標的と架橋させる」工程が、「生物学的標的と結合したライブラリ分子のクロスリンカーを、光照射により生物学的標的と架橋させる」工程である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  26. 　光照射の条件が、波長２５０～５００ｎｍの光照射である、請求項２５に記載の方法。
  27. 　光照射の条件が、波長３６５ｎｍの光照射である、請求項２５に記載の方法。
  28. 　光照射の条件が、１０秒～１８０分間の光照射である、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 　光照射の条件が、３０秒～３０分間の光照射である、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の方法。
  30. 　（２）の「生物学的標的と結合したライブラリ分子のクロスリンカーを、生物学的標的と架橋させる」工程が、「生物学的標的と結合したライブラリ分子のクロスリンカーを、インキュベーションにより生物学的標的と架橋させる」工程である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  31. 　（３）の「架橋されたライブラリ分子と生物学的標的との複合体を、架橋されていないライブラリ分子から分離させる」工程が、「架橋されたライブラリ分子と生物学的標的との複合体を、架橋されていないライブラリ分子から電気泳動により分離させる」工程である、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 　電気泳動が、ゲル電気泳動である、請求項３１に記載の方法。
  33. 　電気泳動が、キャピラリー電気泳動である、請求項３１に記載の方法。
  34. 　（３）の「架橋されたライブラリ分子と生物学的標的との複合体を、架橋されていないライブラリ分子から分離させる」工程が、「架橋されたライブラリ分子と生物学的標的との複合体を、生物学的標的の固定化用担体への固定化と、架橋されていないライブラリ分子の洗浄除去により分離させる」である、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  35. 　　「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬが、式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    （式中、
    ＸおよびＹは、オリゴヌクレオチド鎖であり、
    ＥおよびＦは、それぞれ独立して
    ヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
    ただし、ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
    ＬＰは、ループ部位であり、
    Ｌは、リンカーであり、
    Ｄは、反応性官能基由来の２価の基であり、
    Ｓｐは、結合又は２官能性スペーサーであり、
    Ａｎは、少なくとも１つのビルディングブロックにより構成される部分構造である。）
    で表される化合物であり、
    ＸとＹは、少なくとも一部で二重鎖を形成しうる配列を有し、
    Ｘは５‘末端でＥに結合し、
    Ｙは３‘末端でＦに結合し、
    Ｅ、Ｆ、又はＬＰの少なくともいずれか１つの部位に、少なくとも１つの選択的に切断可能な部位を有する。）
    で表されるＤＥＬである、
    請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 　「選択的に切断可能な部位」を有するヘアピン型ＤＥＬが、式（ＩＩＩ）
    Ａｎ－Ｓｐ－Ｃ－Ｂｎ　（ＩＩＩ）
    （式中、
    ＡｎおよびＳｐは、請求項３５と同じ意味を表し、
    Ｂｎは、オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとで形成される２本鎖オリゴヌクレオチドタグを表し、
    Ｃは、式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    （式中、Ｅ、ＬＰ、Ｌ、ＤおよびＦは、請求項３５と同じ意味を表し、ただし、ＤはＡｎと直接結合するか、または２官能性スペーサーを介して結合し、ＥとＦとは２本鎖オリゴヌクレオチドタグＢｎのそれぞれ対応する末端側に結合する。）
    で表されるＤＥＬである、
    請求項３５に記載の方法。
  37. 　Ａｎが、請求項３５と同じであり、かつ、ｎ個のビルディングブロックα１～αｎ（ｎは、１～１０の整数である。）により構築される部分構造であり、
    Ｂｎが、オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとで形成される２本鎖オリゴヌクレオチドタグであり、かつ、Ａｎの構造を同定することができる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む部分構造である、
    請求項３５又は３６に記載の方法。
  38. 　ＬＰが、
    （ＬＰ１）ｐ－ＬＳ－（ＬＰ２）ｑで表されるループ部位であり、
    ＬＳは、以下の（Ａ）ないし（Ｃ）に記載される化合物群から選ばれる部分構造であり、
    （Ａ）ヌクレオチド
    （Ｂ）核酸アナログ
    （Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基
    ＬＰ１は、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｐ個選ばれる各部分構造であり、
    （１）ヌクレオチド
    （２）核酸アナログ
    ＬＰ２は、以下の（１）および（２）に記載される化合物群から単独もしくは異なってｑ個選ばれる各部分構造であり、
    （１）ヌクレオチド
    （２）核酸アナログ
    ｐとｑの総数が０～４０である、
    請求項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 　ｐとｑの総数が２～２０である、請求項３８に記載の方法。
  40. 　ｐとｑの総数が２～１０である、請求項３８に記載の方法。
  41. 　ｐとｑの総数が２～７である、請求項３８に記載の方法。
  42. 　ｐとｑの総数が０である、請求項３８に記載の方法。
  43. 　ＬＰ１、ＬＰ２およびＬＳが、それぞれ以下の構造： 
    （Ａ）ヌクレオチド
    または
    （Ｂ）以下の（Ｂ１１）から（Ｂ１５）を要件とする核酸アナログ
    　（Ｂ１１）リン酸（または相当部位）および水酸基（またはその相当部位）を有する、
    　（Ｂ１２）炭素、水素、酸素、窒素、リン又は硫黄により構成される、
    　（Ｂ１３）分子量が１４２から１５００である、
    　（Ｂ１４）残基間原子数が３～３０である、
    　（Ｂ１５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合であるか、または１乃至２つの二重結合を含み残りは単結合である、
    から単独もしくは異なって選ばれる構造である、請求項３８～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 　ＬＰ１、ＬＰ２およびＬＳが、それぞれ以下の構造： 
    （Ａ）ヌクレオチド
    または
    （Ｂ）以下の（Ｂ２１）から（Ｂ２５）を要件とする核酸アナログ
    　（Ｂ２１）リン酸および水酸基を有する、
    　（Ｂ２２）炭素、水素、酸素、窒素又はリンにより構成される、
    　（Ｂ２３）分子量が１４２から１０００である、
    　（Ｂ２４）残基間原子数が３～１５である、
    　（Ｂ２５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合である、
    から単独もしくは異なって選ばれる構造である、請求項３８～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 　ＬＰ１、ＬＰ２およびＬＳが、それぞれ以下の構造： 
    （Ａ）ヌクレオチド
    または
    （Ｂ）以下の（Ｂ３１）から（Ｂ３５）を要件とする核酸アナログ
    　（Ｂ３１）リン酸および水酸基を有する、
    　（Ｂ３２）炭素、水素、酸素、窒素又はリンにより構成される、
    　（Ｂ３３）分子量が１４２から７００である、
    　（Ｂ３４）残基間原子数が４～７である、
    　（Ｂ３５）残基間の原子の結合様式は、全て単結合である、
    から単独もしくは異なって選ばれる構造である請求項３８～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 　ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれ以下： 
    （Ｂ４１）d-Spacer、
    （Ｂ５）ポリアルキレングリコールリン酸エステル
    のいずれかである、請求項３８～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 　ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれジエチレングリコールリン酸エステルまたはトリエチレングリコールリン酸エステルである、請求項３８～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 　ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれトリエチレングリコールリン酸エステルである、請求項３８～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 　ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれd-Spacerである、請求項３８～４６のいずれか１項に記載の方法。
  50. 　ＬＰ１およびＬＰ２が、それぞれヌクレオチドである、
    請求項３８～４５のいずれか１項に記載の方法。
  51. 　ＬＳが、式（ａ）～式（ｇ）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    （式中、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味し、Ｒは、水素原子またはメチル基である。）
    のいずれかである、請求項３８～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 　ＬＳが、式（ｈ）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    （式中、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味する）
    である、請求項３８～５０のいずれか１項に記載の方法。
  53. 　ＬＳが、ポリアルキレングリコールリン酸エステルである、請求項３８～５０のいずれか１項に記載の方法。
  54. 　ＬＳが、式（ｉ）～式（ｋ）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    　（式中、ｎ１、ｍ１、ｐ１、及びｑ１はそれぞれ独立して、１～２０の整数であり、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味する。）
    である、請求項３８～５０のいずれか１項に記載の方法。
  55. 　ＬＳが、式（ｌ）： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
    （式中、＊はリンカーとの結合位置を意味し、＊＊はＬＰ１又はＬＰ２との結合位置を意味する）
    である、請求項３８～５０いずれか１項に記載の方法。
  56. 　ＬＳが、（Ｂ４２）、（Ｂ４３）又は（Ｂ４４）：
    （Ｂ４２）Amino C6 dT
    （Ｂ４３）mdC（TEG-Amino）
    （Ｂ４４）Uni-Link（商標登録）Amino Modifier　
    のいずれかである、請求項３８～５０のいずれか１項に記載の方法。
  57. 　ＬＳが、ヌクレオチドである、
    請求項３８～５０のいずれか１項に記載の方法。
  58. 　ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造： 
    （１）置換基を有しても良く、１～３個のヘテロ原子で置き換えられても良いＣ１～１０脂肪族炭化水素、
    （２）置換基を有してもよいＣ６～１４芳香族炭化水素、
    （３）置換基を有してもよいＣ２～９芳香族複素環、　または
    （４）置換基を有してもよいＣ２～９非芳香族複素環
    のいずれかである、請求項３８～４２及び４６～５０のいずれか１項に記載の方法。
  59. 　ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造： 
    （１）置換基を有しても良いＣ１～６脂肪族炭化水素、
    （２）置換基を有しても良いＣ６～１０芳香族炭化水素、または
    （３）置換基を有してもよいＣ２～５芳香族複素環
    のいずれかである請求項３８～４２及び４６～５０のいずれか１項に記載の方法。
  60. 　ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造： 
    （１）Ｃ１～６脂肪族炭化水素、
    （２）ベンゼン、または
    （３）Ｃ２～５含窒素芳香族複素環
    　ここで、前記（１）～（３）は無置換であるか、または置換基群ＳＴ１から単独もしくは異なって選ばれる１～３個の置換基で置換されてもよく、置換基群ＳＴ１は、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルコキシ基、フッ素原子および塩素原子により構成される群であり、ただし、置換基群ＳＴ１が脂肪族炭化水素に置換する場合、置換基群ＳＴ１からアルキル基は選択されない、
    のいずれかである請求項３８～４２及び４６～５０のいずれか１項に記載の方法。
  61. 　ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造： 
    （１）Ｃ１～６アルキル基、または
    （２）無置換であるか１つまたは２つのＣ１～３アルキル基若しくはＣ１～３アルコキシ基で置換されたベンゼン
    のいずれかである請求項３８～４２及び４６～５０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 　ＬＳが、（Ｃ）置換基を有してもよいＣ１～１４の３価の基であり、（Ｃ）が以下の構造： 
    （１）Ｃ１～６アルキル基
    である、請求項３８～４２及び４６～５０いずれか１項に記載の方法。
  63. 　ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
    ＥおよびＦの鎖長が、それぞれ３乃至４０である、
    請求項３６～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 　ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
    ＥおよびＦの鎖長が、それぞれ４乃至３０である
    請求項３５～６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. 　ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
    ＥおよびＦの鎖長が、それぞれ６乃至２５である
    請求項３５～６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 　ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
    ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
    ＥとＦの二重鎖オリゴヌクレオチドが突出末端である、
    請求項３５～６５のいずれか１項に記載の方法。
  67. 　前記突出末端の突出部が、２塩基以上の長さである、請求項６６に記載の方法。
  68. 　ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチド又は核酸アナログにより構成されるオリゴマーであり、
    ＥとＦが互いに相補的な塩基配列を含み、二重鎖オリゴヌクレオチドを形成し、
    ＥとＦの二重鎖オリゴヌクレオチドが平滑末端である、
    請求項３５～６５のいずれか１項に記載の方法。
  69. 　ＥとＦに含まれる、互いに相補的な塩基配列の鎖長が、それぞれ３塩基以上 である
    請求項３５～６８のいずれか１項に記載の方法。
  70. 　ＥとＦに含まれる、互いに相補的な塩基配列の鎖長が、それぞれ４塩基以上である
    請求項３５～６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 　ＥとＦに含まれる、互いに相補的な塩基配列の鎖長が、それぞれ６塩基以上である
    請求項３５～７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 　ＥおよびＦが、それぞれ独立してヌクレオチドにより構成されるオリゴマーである、
    請求項３５～７１のいずれか１項に記載の方法。
  73. 　ヌクレオチドが、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである請求項３５～７２のいずれか１項に記載の方法。
  74. 　ヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである請求項３５～７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 　ヌクレオチドが、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、又はデオキシシチジンである請求項３５～７４のいずれか１項に記載の方法。
  76. 　ＥおよびＦが、それぞれ独立して核酸アナログにより構成されるオリゴマーである、請求項３５～７１のいずれか１項に記載の方法。
  77. 　Ｌが、
    （１）置換基を有しても良く、１～３個のヘテロ原子で置き換えられても良いＣ１～２０脂肪族炭化水素、
    又は
    （２）置換基を有してもよいＣ６～１４芳香族炭化水素
    である、請求項３５～７６のいずれか１項に記載の方法。
  78. 　Ｌが、置換基を有しても良いＣ１～６脂肪族炭化水素、１若しくは２個の酸素原子で置き換えられても良いＣ１～６脂肪族炭化水素、又は置換基を有しても良いＣ６～１０芳香族炭化水素である、請求項３５～７７のいずれか１項に記載の方法。
  79. 　Ｌが、置換基群ＳＴ１で置換可能なＣ１～６脂肪族炭化水素、又は置換基群ＳＴ１で置換可能なベンゼンであり、ここで、置換基群ＳＴ１は、Ｃ１～６アルキル基、Ｃ１～６アルコキシ基、フッ素原子および塩素原子により構成される群である（ただし、置換基群ＳＴ１が脂肪族炭化水素に置換する場合、置換基群ＳＴ１からアルキル基は選択されない。）、請求項３５～７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. 　Ｌが、Ｃ１～６アルキル基、又は無置換であるか１つまたは２つのＣ１～３アルキル基若しくはＣ１～３アルコキシ基で置換されたベンゼンである、請求項３５～７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 　Ｌが、Ｃ１～６アルキル基である、請求項３５～８０のいずれか１項に記載の方法。
  82. 　Ｄの反応性官能基が、
    Ｃ―Ｃ、アミノ、エーテル、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホンアミド、又はスルホニル結合を構成しうる反応性官能基である、請求項３５～８１のいずれか１項に記載の方法。
  83. 　Ｄの反応性官能基が、脱離基を有するＣ１炭化水素、アミノ基、水酸基、カルボニル基の前駆体、チオール基、又はアルデヒド基である、請求項３５～８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. 　Ｄの反応性官能基が、ハロゲン原子を有するＣ１炭化水素、スルホン酸系脱離基を有するＣ１炭化水素、アミノ基、水酸基、カルボキシ基、ハロゲン化カルボキシ基、チオール基、又はアルデヒド基である、請求項３５～８３のいずれか１項に記載の方法。
  85. 　Ｄの反応性官能基が、－ＣＨ２Ｃｌ、－ＣＨ２Ｂｒ、－ＣＨ２ＯＳＯ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＯＳＯ２ＣＦ３、アミノ基、水酸基、又はカルボキシ基である、請求項３５～８４のいずれか１項に記載の方法。
  86. 　Ｄの反応性官能基が、第１級アミノ基である、請求項３５～８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. 　選択的に切断可能な部位が、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、及びデオキシシチジンのいずれでもないデオキシリボヌクレオシドである、
    請求項３５～８７のいずれか１項に記載の方法。
  88. 　選択的に切断可能な部位が、デオキシウリジン、ブロモデオキシウリジン、デオキシイノシン、８-ヒドロキシデオキシグアノシン、３－メチル－２’－デオキシアデノシン、Ｎ６－エテノ－２’－デオキシアデノシン、７－メチル－２’－デオキシグアノシン、２’－デオキシキサントシン、又は５，６－ジヒドロキシ－５，６ジヒドロデオキシチミジンである、
    請求項３５～８７のいずれか１項に記載の方法。
  89. 　選択的に切断可能な部位が、デオキシウリジン、又はデオキシイノシンである、
    請求項３５～８８のいずれか１項に記載の方法。
  90. 　選択的に切断可能な部位が、デオキシウリジンである、
    請求項３５～８９のいずれか１項に記載の方法。
  91. 　選択的に切断可能な部位が、デオキシイノシンである、
    請求項３５～８９のいずれか１項に記載の方法。
  92. 　選択的に切断可能な部位が、デオキシイノシンから３‘方向に２番目のホスホジエステル結合である、
    請求項３５～８６のいずれか１項に記載の方法。
  93. 　選択的に切断可能な部位が、リボヌクレオシドである、
    請求項３５～８６のいずれか１項に記載の方法。
  94. 　選択的に切断可能な部位が、１つである、
    請求項３５～９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. 　少なくとも１つの切断可能な部位を、Ｅ又は（ＬＰ１）ｐに含み、かつ少なくとも１つの切断可能な部位を、Ｆ又は（ＬＰ２）ｑに含む、
    請求項３５～９３のいずれか１項に記載の方法。
  96. 　Ｅ又は（ＬＰ１）ｐに含まれる切断可能な部位と、Ｆ又は（ＬＰ２）ｑに含まれる切断可能な部位が異なる条件で切断可能である、
    請求項９５に記載の方法。
  97. 　Ａｎが、ｎ個のビルディングブロックα１～αｎ（ｎは、１～１０の整数である。）により構築される部分構造である、
    請求項３５～９６のいずれか１項に記載の方法。
  98. 　Ａｎが、低分子有機化合物である、請求項３５～９７のいずれか１項に記載の方法。
  99. 　Ａｎのビルディングブロックが、分子量５００以下の化合物である、請求項３５～９８のいずれか１項に記載の方法。
  100. 　Ａｎのビルディングブロックが、分子量３００以下の化合物である、請求項３５～９９のいずれか１項に記載の方法。
  101. 　Ａｎのビルディングブロックが、分子量１５０以下の化合物である、請求項３５～１００のいずれか１項に記載の方法。
  102. 　Ａｎが、Ｈ、Ｂ、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる元素群より単独又は異なって選ばれる元素により構成される有機化合物である、請求項３５～１０１のいずれか１項に記載の方法。
  103. 　Ａｎが、アリール基、非芳香族シクリル基、ヘテロアリール基及び非芳香族ヘテロシクリル基からなる置換基群より単独又は異なって選ばれる置換基を有する低分子有機化合物である、請求項３５～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  104. 　Ａｎが、分子量５０００以下である、請求項３５～１０３のいずれか１項に記載の方法。
  105. 　Ａｎが、分子量８００以下である、請求項３５～１０４のいずれか１項に記載の方法。
  106. 　Ａｎが、分子量５００以下である、請求項３５～１０５のいずれか１項に記載の方法。
  107. 　Ａｎが、ポリペプチドである、
    請求項３５～９７のいずれか１項に記載の方法。
  108. 　Ｓｐが２官能性スペーサーである、請求項３５～１０７のいずれか１項に記載の方法。
  109. 　２官能性スペーサーが、それぞれＳｐＤ－ＳｐＬ－ＳｐＸであり、
    ＳｐＤが、Ｃ―Ｃ、アミノ、エーテル、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホンアミド、又はスルホニル結合を構成しうる反応性基由来の２価の基であり、
    ＳｐＬが、ポリアルキレングリコール、ポリエチレン、任意にヘテロ原子で置き換えられても良いＣ１～２０脂肪族炭化水素、ペプチド、オリゴヌクレオチド、またはこれらの組み合わせあり、
    ＳｐＸが、アミノ、カルボニル、アミド、エステル、ウレア、又はスルホンアミド結合を形成する反応基由来の２価の基である、
    請求項１～１０７のいずれか１項に記載の方法。
  110. 　２官能性スペーサーが、それぞれＳｐＤ－ＳｐＬ－ＳｐＸであり、
    ＳｐＤが、第一級アミノ基由来の２価の基であり、
    ＳｐＬが、ポリエチレングリコール、またはポリエチレンであり、
    ＳｐＸが、カルボキシ基由来の２価の基である、
    請求項１～１０７のいずれか１項に記載の方法。
  111. 　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、二重鎖を形成可能な配列である、請求項３５～１１０のいずれか１項に記載の方法。
  112. 　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、相補的な塩基配列を含む、請求項３５～１１１のいずれか１項に記載の方法。
  113. 　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、それぞれ１～２００塩基の長さである、請求項３５～１１２のいずれか１項に記載の方法。
  114. 　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、それぞれ３～１５０塩基の長さである、請求項３５～１１３のいずれか１項に記載の方法。
  115. 　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、それぞれ３０～１５０塩基の長さである、請求項３５～１１４のいずれか１項に記載の方法。
  116. 　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、平滑末端を有する、請求項３５～１１５のいずれか１項に記載の方法。
  117. 　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、突出末端を有する、請求項３５～１１５のいずれか１項に記載の方法。
  118. 　突出末端の突出部が、１～３０塩基の長さである、請求項１１７に記載の方法。
  119. 　突出末端の突出部が、２～５塩基の長さである、請求項１１７又は１１８に記載の方法。
  120. 　オリゴヌクレオチド鎖Ｘとオリゴヌクレオチド鎖Ｙとが、突出末端を有し、当該突出末端に、さらに特定分子識別配列が結合する、請求項１１７～１１９のいずれか１項に記載の方法。
  121. 　ＸおよびＹのいずれか一方に、機能性分子が結合した、請求項３５～１２０のいずれか１項に記載の方法。
  122. 　ＸおよびＹのいずれか一方に、ビオチンが結合した、請求項３５～１２０のいずれか１項に記載の方法。
  123. 　Ｓｐが結合である、請求項３５～１０７のいずれか１項に記載の方法。
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