JP2020534872A - オリゴヌクレオチドにコードされた化学ライブラリ - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2017年9月25日に出願された米国仮特許出願第62/562,905号、および2017年9月25日にさらに出願された米国仮特許出願第62/562,912号の利益ならびに優先権を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
水性液滴が、油媒体もしくは疎水性液体媒体中に懸濁される、または制限された容積が、ピコウェルを含む、またはピコウェルが、規則的なアレイに組織化される、または複数の制限された容積が、規則的なアレイに組織化される、上記の方法である。
表1は、略称および非限定的な定義を示す。
(I)ビーズ
(II)1つのビーズ、1つの化合物(OBOC)
(III)核酸をビーズに結合する
(IV)DNAバーコード
(V)化合物をビーズに結合する
(VI)化合物を作製するために化学モノマーを互いに結合する
(VII)スプリットプール合成および平行合成
(VIII)ピコウェルを製作する
(IX)ビーズをピコウェル内に堆積させる
(X)ピコウェル内のビーズ結合核酸のシーケンシング
(XI)ビーズからのビーズ結合化合物を放出する
(XII化合物の生化学的アッセイ
(XIII)化合物についての細胞系アッセイ
(XIV)細胞での摂動−応答分析
(I)ビーズ
多くの実験において、事前に合成された化合物をビーズに負荷することが有利であり、ビーズは、化合物をアッセイに送達するためのビヒクルとして使用できる。生体標本への薬物送達に使用される標準的な技術の多くは、化合物をアッセイに送達するために適合され得る(Wilczewska et al(2012)Nanoparticles as drug delivery systems.Pharmacological Reports.64:1020−1037、Kohane DS(2007)Microparticles and nanoparticles for drug delivery.Biotechnol.Bioeng.96:203−209、Singh et al(2010)Microencapsulation:A promising technique for controlled drug delivery.Res Pharm Sci.5:65−77を参照されたい)。
コンビナトリアルライブラリの製造に使用される方法は、(1)ライブラリの調整、(2)ライブラリ内の化合物のスクリーニング、(3)化合物の構造、例えば、すべての化合物またはスクリーニングで興味深い結果が提供された化合物のみ構造を決定する3つのステップを含む(Lam et al(1997)The One−Bead−One−Compound Combinatorial Library Method.Chem.Rev.97:411−448を参照されたい)。ビーズ結合合成を介した化合物の合成の利点は、「スプリットプール」法によって化合物を迅速に作製できることである。
連鎖状バーコードおよび直交性バーコードのトピックを理解する1つの方法は、一方が他方を超えて有する有意性に注意することである。連鎖状バーコード化を超える直交性バーコード化の利点は、以下のとおりである。成長する化合物の各モノマーの付着で、平行して付着されるのは、DNAバーコードモジュールである。連鎖状バーコード化では、所定のモジュールの付着が不完全である場合(つまり、すべての付着部位が必要とされるモジュールと正常に結合されなかった場合)、完成されたバーコードの配列は、正確ではないであろう。「正確ではない」という表現は、不完全なカップリングを意味し、完成された正しいDNAバーコードであると想定された小さな塊から欠落し得る塊を意味する。ここで、すべてのモジュールの付着に失敗したため、完成されたバーコード配列は誤りを含むであろう。対照的に、直交性バーコード化は、各個々のモジュールがビーズ上の独自の固有の付着部位に共有結合的に結合する。また、モジュールがビーズ上の所定の部位に付着されると、すでに付着されているモジュールにさらなるモジュールは接続されないであろう。
直交性式ビーズの合成。直交性合成では、各DNAモジュールが、ビーズ上の別々の部位に共有結合的に付着され、その結果、DNAバーコード全体が複数のDNAモジュールによって提供される。DNAバーコードが直交性構造を有する場合、DNAバーコードモジュールは、相互に付着されておらず、代わりに、DNAバーコード分子の各々すべては、その特定のDNAバーコードモジュール専用のそれ独自のビーズ付着部位を有する。
クリックケミストリーは、DNAバーコードの段階的な合成に使用できる。ここで、結合できるのは、ビーズに直接的に結合された第1のDNAバーコードモジュール、またはビーズ結合リンカーに結合された第1のDNAバーコードモジュールである。
BEAD−TCO−テトラジン−第1のDNAバーコードモジュール−アジド−DBCO−TCO−[テトラジン]−[第2のDNAバーコードモジュール]−[アジド]
上記のスキームは、より多くのDNAバーコードモジュールを段階的に追加するための一連のステップを含み、これらの追加は、より多くの化学モノマーの追加と平行する。他で述べたように、この「平行」合成は、化学モノマーを付着した後、そのモノマーを特定するDNAバーコードモジュールを接続するか、あるいは、DNAバーコードモジュールを付着した後、その特定の化学モノマーによって特定される化学モノマーを付着することを伴うことができる。
図17は、DNAバーコードモジュール、最終的にはDNAバーコード全体の合成中にデオキシシチジン残基(dC)を接続するのに好適な化合物の化学合成を開示する。開始物質は、N4−アセチル−2’−デオキシ−5’−O−DMTシチジンである。「DMT」という略称は、4,4−ジメトキシトリチルを表す。この有機合成の多段階経路の最終生成物は、シトシン部分、三リン酸基、およびリボース基の3’位置に付着しているプロパルギル基を有する。プロパルギル基は、クリックケミストリーに使用され、アジド基と縮合して共有結合を生成する。縮合後の結果は、残った化学物質(核酸において自然には決して存在しない)が、実行されているクリックケミストリーからの「痕跡」として発生することである。利用可能なのは、クリックケミストリーによって作製されたDNAバーコードの合成によるシーケンシング(sequencing−by−synthesis)について使用できるDNAポリメラーゼであり、DNAポリメラーゼは、痕跡をわたって移動でき、痕跡は、シーケンシングのエラーを引き起こさない。TBAIは、ヨウ化テトラブチルアンモニウムである。
以下の記載では、DNAバーコードを作製するために、DNAバーコードモジュールが一列に組み立てられている。しかしながら、以下に示すテキスト中の図は、テキスト中の図をページに合わせるために、「DNAバーコードモジュール」の代わりに「DNAバーコード」という用語が使用される。図7は、ここに示されるのと同じステップを示すが、ビーズの図などの詳細が追加される。各追加のDNAバーコードモジュールを追加するために、繰り返される一連の反応を使用できる。
ビーズ/第1のDNAバーコード/第1のアニーリング部位/
代替的に、5’末端から3’末端までのビーズ結合成長DNAバーコードは、ステップ数をコードする核酸を含み得、ビーズ結合成長DNAバーコードは、以下の順序で、核酸を有する:
ビーズ/第1のDNAバーコード/ステップ数をコードする核酸/第1のアニーリング部位/
代替的に、ビーズ結合成長DNAバーコードは、以下に示すように、機能性核酸(シーケンシングプライマーアニーリング部位)である核酸を含むことができる:
ビーズ/第1のDNAバーコード/シーケンシングプライマーアニーリング部位/第1のアニーリング部位/
これらのテキスト中の図に示されていないのは、ビーズへのDNAバーコードのカップリングを媒介する任意のリンカーである。リンカーは、核酸の形態をとることができるか、またはいくつかの他の有機化学物質で作製できる。
第1のアニーリング部位/第2のDNAバーコード/第2のアニーリング部位
図7に示されているいくつかの情報を繰り返すと、すぐ下に示されているのは、スプリントオリゴである:
ステップ3.DNAポリメラーゼおよびdNTPを追加して、ビーズ結合DNAバーコードを伸長する。以下は、ビーズ結合DNAバーコードであり、スプリントオリゴは、依然としてハイブリダイズされ、「第2のDNAバーコードモジュール」である核酸および「第2のアニーリング部位」である核酸が付着されているため、ビーズ結合成長バーコードは以前より長くなる。図7はさらにこのステップを示す。スプリントオリゴは、ビーズ結合バーコードの下に表示される:
ビーズ/第1のDNAバーコード/第1のアニーリング部位/第2のDNAバーコード/第2のアニーリング部位
ステップ4.スプリントオリゴを洗浄する。スプリントオリゴは、加熱することにより、すなわち、ピコウェルプレート全体を、例えば、約60度、約65度、約70度、約75度、約80度に約10分間加熱することによりビーズ結合成長バーコードから解離するように促すことができ、または、代替的に、希釈NaOHをピコウェルアレイに追加して中和する。
ステップ6.このオリゴヌクレオチドが対応するビーズ結合「第2のアニーリング部位」にアニーリングできるようにし、DNAポリメラーゼがビーズ結合オリゴヌクレオチドを伸長できるようにし、これにより、以下の補足物を含む:「第3のDNAバーコード/第3のアニーリング部位/
この可溶性オリゴヌクレオチドは、ビーズ結合オリゴヌクレオチドの「第3のアニーリング部位」にアニーリングできる核酸を有する。アニールすると、4つのdNTPを有するDNAポリメラーゼが利用され、ビーズ結合オリゴヌクレオチドを伸長して、さらに別のDNAバーコードモジュール(第4のDNAバーコード)をコードするために使用される。上記のステップのサイクルは、化合物のライブラリおよび関連するDNAバーコードを平行して作製するスプリットプール手順全体で繰り返され、各DNAバーコードは、所定の化合物に関連付けされる(各DNAバーコードは、関連する化合物の化学合成の履歴を通知する)。化合物のライブラリの化学合成が完了されている場合、上記のステップのサイクルが停止される。完成されたビーズ結合DNAバーコード化学ライブラリを制御して、次にビーズは、ピコウェルアレイのピコウェルに分配できる。
本発明で開示される様々な実施形態は、DNAの5’末端を介してDNAをビーズにカップリングすることに関し、他の実施形態では、DNAバーコードまたはDNAタグなどのDNAは、それらの3’末端を介してビーズに結合され得る。DNAの3’ヒドロキシル基は、特定の化学合成条件下(例えば、光延変換)で反応する可能性があり、3’末端をレンダリングすると、損傷し、伸長、連結、または他のステップに関与できなくなる。したがって、DNAタグは、3’末端を介してビーズに付着し、不要な化学反応を防ぎ、DNAバーコードへの損傷を防ぎ得る。
第1のアニーリング部位/第2のDNAバーコード/第2のアニーリング部位
ビーズ/第1のDNAバーコード/第1のアニーリング部位/第2のDNAバーコード/第2のアニーリング部位
3つのDNAバーコードモジュールを有するビーズ結合DNAバーコードを生成する、2サイクルのアニーリング/重合を用いた方法。本開示は、ビーズ結合組成物、システム、および方法を包含し、2つの異なるスプリットオリゴが使用される(第1のスプリントオリゴ;第2のスプリントオリゴ)。この状況では、第1のスプリントオリゴは、第1のアニーリング部位/第2のDNAバーコード/第2のアニーリング部位の構造からなり、第2のスプリントオリゴは、第2のアニーリング部位/第3のDNAバーコード/第3のアニーリング部位の構造からなる。
直交性DNAバーコードを使用して損傷を低減する(連鎖状DNAバーコードの代わりに)。連鎖状DNAバーコードおよび直交性DNAバーコードのトピックを理解する1つの方法は、一方が他方を超えて有する有意性に注意することである。連鎖状バーコード化を超える直交性バーコード化の利点は、以下のとおりである。成長する化合物の各モノマーの付着で、平行して付着されるのは、化学ライブラリを作製するための化合物ライブラリモノマー、および完成された完全長DNAバーコードを作製するDNAバーコードモジュールである。
本開示は、(1)化学ライブラリメンバーをビーズなどの基質に付着させるリンカー、(2)核酸バーコードをビーズなどの基質に付着させるリンカー、(3)例えば、UV光により切断可能、プロテアーゼなどの酵素により切断可能である、切断可能なリンカー、(4)切断不可能なリンカー、(5)二官能性リンカー、(6)多機能性リンカー、(7)連鎖に使用される複数のビーズを提供する。例えば、利用可能なものは、4−ヒドロキシメチル安息香酸(HMBA)リンカー、4−ヒドロキシメチルフェニル酢酸リンカーである(Camperi,Marani,Cascone(2005)Tetrahedron Letters.46:1561−1564を参照されたい)。
例示的な化学モノマー。本開示の組成物および方法のための化学モノマーとしての使用に好適なアミノ酸誘導体を図4に示す。図は、例えば、AnaSpec EGT Group,Fremont,CA;Sigman−Aldrich,St.Louis,MO;Acros Organics(ThermoFisher Scientificの一部)、またはCombi−Blocks,San Diego,CAなどの化学物質の供給元を示す。
これは、化合物のライブラリを合成するための「スプリットプール」法の使用、ならびにビーズ結合化合物およびビーズ結合DNAバーコードの同時合成に「スプリット「プール」法が使用される方法に関する。これは、化合物の混合セットを作製するためのスプリット化およびプール化についても記載する。後のある時点で、以下に開示されているのは、非アミノ酸のカップリング、およびポリエチレングリコール(PEG)で修飾されたビーズの調整である。
本開示は、任意の所定のビーズ(または任意のビーズの集団)について、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99.5%などである「化学ライブラリの均一性」を提供する。
本開示のいくつかの実施形態において、DNAバーコードが主に外面に付着されているビーズを製造および使用することが所望される場合がある。内部DNAバーコードを伴うビーズを作製および使用しない1つの理由は、内部空間へのDNAオリゴマーの浸透が低く、内部空間へのDNAリガーゼ(完成されたDNAバーコードを作製するためにDNAモジュールを相互に接続するためのリガーゼ)の浸透が低いことである。シーケンシングの目的で、内部DNAバーコードを作製および使用しない理由は、バーコードの最終的なシーケンシングに必要なDNAを増幅するために必要な酵素の浸透が低いことである。内部DNAバーコードを伴うビーズを作製および使用しない、さらなる別の理由は、化学ライブラリのメンバーを付着させるための内部空間に費用がかかるためである。
ピコウェルアレイプレートを作製するためのUV光、フォトマスク、フォトレジストの組み合わせ。多くのマイクロウェルまたはピコウェルを含むプレートは、本開示で使用するために以下のように作製することができる。簡単に述べると、3層のサンドイッチが組み立てられる。上部層は、フォトレジストである。中間層は、ガラスウエハである。底部層は、フォトマスクである。ピコウェルは、UV光によりフォトレジストから切り分けられるであろう。ピコウェルがフォトレジストの平らなシートから切り分けられた後、フォトレジストは、マフィンを焼くためのカップを含む一般的な金属製の皿に類似し、マフィンバッターを保持するために使用される皿のカップは、傾いた側面を有する。UV光は、フォトレジストのポリマーを分解するため、「非架橋剤」として機能する。UV処理後、溶剤が追加され、UV処理されたフォトレジストが洗い流され、清潔に見えるピコウェルが残る。
ピコウェルを伴うプレートは、96ウェルプレートの形態をとることができ、これらの96ウェルの各々は、何千ものピコウェルを含む。また、ピコウェルを伴うプレートは、24ウェルプレートの形態をとることができ、これらの24ウェルの各々は、何千ものピコウェルを含む。96ウェルプレートの場合、各ウェルは、水または水溶液中のビーズの懸濁液0.1〜0.2mLを使用して充填できる。24ウェルプレートの場合、各ウェルは、水または水溶液中のビーズの懸濁液0.5mLを使用して充填できる。懸濁液は、使い捨てチップ付きの通常のピペットを使用して追加できる。懸濁液中にあるビーズの数は、1つのビーズのみを含むピコウェルの約3分の1、2つのビーズを含むピコウェルの約3分の1、およびビーズを含まないか、または2つ以上ビーズのいずれかを含むビーズの約3分の1をもたらすことができる。また、懸濁液中のビーズの数は、状況に起因することができ、1つ以上のビーズを含むウェルの少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%は、これらのウェルの1つのみのビーズを含む。
ビーズ結合核酸は、ビーズに付着したままシーケンシングできる。代替的に、または追加的に、ビーズ結合核酸は、ビーズからのDNAバーコードの切断後にシーケンシングされ得る。
切断可能なリンカー。提供されるのは、切断できないリンカーである。また、提供されるのは、切断可能なリンカーである(Holmes and Jones((1995)J.Org.Chem.60:2318−2319、Whitehouse et al(1997)Tetrahedron Lett.38:7851−7852、およびYoo and Greenberg((1995)J.Org.Chem.60:3358−3364を参照されたく、Gordon et al(1999)J.Chem.Technology Biotechnology.74:835−851により引用される)。切断可能なリンカーには、アルカリ加水分解に存在するアシルスルホンアミドリンカー、ならびに穏やかな条件下で切断される活性化N−アルキル誘導体、およびアリール−シリコン結合に基づくトレースレスリンカー、およびシリルエーテル連結に基づくトレースレスリンカーも含まれる(Gordon et al(1999)J.Chemical Technology Biotechnology.74:835−851の839および842ページき記載される)。さらに、提供されるのは、切断時にC末端アルデヒドを生成する酒石酸に基づくリンカーであり、切断は、過ヨウ素酸酸化によるものであるPaulick et al(2006)J.Comb.Chem.8:417−426を参照されたい)。
ピコウェル内のビーズを使用して、様々な生化学的アッセイが可能である。非限定的な例には、結合アッセイ、酵素アッセイ、触媒アッセイ、蛍光系アッセイ、発光系アッセイ、散乱系アッセイなどが含まれる。以下に例を示す。
ピコウェル内で行われる細胞系アッセイは、ヒト細胞、非ヒト細胞、ヒトがん細胞、非ヒトがん細胞、細菌細胞、マラリア原虫細胞などの寄生虫の細胞を使用することができる。また、細胞系アッセイは、「殺傷されたが代謝的に活性な」ヒト細胞または非ヒト細胞を用いて行うことができ、すなわち、それらのゲノムは、代謝を可能にするが細胞分裂を防ぐために架橋されている(Dubenskyの米国特許公開番号第2007/0207170号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。さらに、細胞系アッセイは、アポトーシス性の細胞、ネクローシス性の細胞、または死細胞で行うことができる。細菌細胞を用いた細胞系アッセイは、抗生物質のスクリーニングに使用できる。ウイルスに感染したヒト細胞は、抗ウイルス剤のスクリーニングに使用できる。細胞の組み合わせは、細胞系アッセイについて提供される。例えば、樹状細胞およびT細胞の組み合わせは、抗原提示を刺激するか、または代替的に、抗原提示を損なう化合物をスクリーニングおよび同定するために提供される。
本明細書に記載される方法は、摂動ライブラリおよび細胞のライブラリを含み得る。いくつかの実施形態において、摂動および細胞は、制限された環境でインキュベートされる。インキュベーション中または後に、摂動を特定するバーコード(「摂動バーコード」)が、それがインキュベーションされている細胞に移行され得る。本方法は、摂動から細胞を放出する(すなわち、分離または除去する)こと、および摂動バーコードと共に細胞内容物が捕捉される第2の制限に細胞を供することをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、第2の制限は、細胞特異的なバーコードを含み得、その後、細胞内容物および摂動バーコードを研究するために使用され得、それにより摂動を細胞応答に関連付ける。
本開示は、以下に「第1のワークフロー」および「第2のワークフロー」として概説される方法を含む方法を提供する。
第1のワークフローは、(1)DELBを生成する、(2)ビーズをピコウェル内へ、(3)アッセイ試薬をピコウェル内へ負荷する、(4)ビーズ結合化合物を放出する、(5)アッセイの読み出しを測定する、(6)アッセイの読み出しをランク付けする、および(7)DELBの新しいセットを生成するステップを含む。
代2のワークフローは、キャップで密封されたピコウェルを伴う。キャップは、ピコウェルの直径よりわずかに大きい直径の球の形態をとることができ、この直径は、ピコウェルの上部の縁で測定される(ピコウェルの底部では測定されない)。ピコウェルプレート全体を穏やかな重力遠心に供することにより、キャップをピコウェルの上部にぴったりとフィットさせることができる。第2のワークフローでは、キャップは、リンカーを含むビーズの形態をとり、各リンカーは、化合物に連結される。リンカーは、切断可能なリンカーであり、切断すると化合物が放出され、細胞への拡散が可能になる。この種類のキャップは、「能動的キャップ」と称される。第2のワークフローは、(1)DELBを生成する、(2)アッセイ試薬をピコウェル内へ負荷する、(3)DELBでピコウェルをキャップする、(4)キャップとして機能するビーズからビーズ結合化合物を放出する、(5)アッセイの読み出しを測定する、(6)ビーズ上にあるDNAバーコードの配列を決定する、(7)アッセイの読み出しをランク付けする、および(8)DELBの新しいセットを生成するステップを含む。
これは、ビーズ結合化合物の放出の制御およびモニタリングに関連する。出願人は、ビーズ結合放出モニターを合成するために以下の手順を考案した。図11および以下のテキストを参照されたい。
TentaGel(登録商標)樹脂(M30102、10μm NH2、0.23mmol/g、10mg;MB160230、160μm RAM、0.46mmol/g、2mg)を、チューブ(1.5 mL Eppendorf)に量り入れ、膨潤(400μL、DMA)した。
L−Fmoc−Lys(Mtt)−OH(21μmole、6.6eq.)、DIEA(42μmole、13.3eq.)、COMU(21μmole、6.6eq.)を含む溶液を調整し、DMA(350μL)内で混合し、インキュベートし(1分、室温)、次に、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に加え、ボルテックスし、インキュベートし(15分、40°C)、遊離アミンをアミド化する。樹脂を真空で濾過し、この反応を1回繰り返した。
ペンダントFmocを脱保護した(DMA内に2%DBUを含む5%ピペラジン、400μL;40°Cで2x10分)。
QSY7−NHS(4.9μmole、1.55eq.)、Oxyma(9.5eq、3.3eq.)、DIC(21μmole、6.6eq.)、TMP(3.5μmole、1.1eq.)を含む溶液を調整し、DMA(350μL)内で混合し、インキュベートし(1分、室温)、次に、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に加え、ボルテックスし、インキュベートし(14時間、40°C)、遊離アミンをアミド化する。
TFA(96μL)、メタノール(16μL)を含む、Mtt脱保護カクテルを調製し、DCM(1488μL)内で混合し、6:1:93%のTFA:メタノール:DCM溶液を得た。
Fmoc−PCL−OH(32μmole、10eq.)、Oxyma(32μmole、10eq.)、DIC(50μmole、15.8eq.)、TMP(32μmole、10eq.)を含む溶液を調整し、DMA(400μL)内で混合し、インキュベートし(1分、室温)、次に、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に加え、ボルテックスし、インキュベートし(14時間、40℃)、遊離ε−アミンをアミド化する。
ペンダントFmocを脱保護した(DMA内に2%DBUを含む5%ピペラジン、400μL;40°Cで2x10分)。
TAMRA(6μmole、1.9eq.)、TMP(24μmole、7.6eq.)、COMU(16μmole、5eq.)を含む溶液を調整し、DMA(400μL)内で混合し、インキュベートし(1分、室温)、次に、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に加え、ボルテックスし、混合しながらインキュベートし(2時間、40℃、800RPM)、遊離アミンをアミド化する。
化合物の細胞系アッセイ(セレブロン系アッセイ)から結果。細胞系アッセイのための試薬および方法。出願人は、ATCC(American Type Culture Collection,Manasses,VA)から入手したCCL−2 HeLa細胞を使用した。細胞培地は、HEPESで緩衝されたGibco DMEM高グルコース培地であった。細胞培養の上の大気は、37度のインキュベーターで、5%の二酸化炭素が補充された大気である。細胞培地は、DMEM + 10%ウシ胎児血清に、GlutaMAX(登録商標)(Gibco Thermofisher)を追加、ならびにさらに非必須アミノ酸およびペニシリン+ストレプトマイシン(Gibco Thermofisher,Waltham,MA)を追加したものである。HeLa細胞に、LTR−CTCF−プロモーター−IKZF1(またはIKZF3)−mNeon−P2A−mScar−LTR−CTCFの形態をとる構築物をトランスフェクトした。mScarletは、陽性対照として使用される要素である。mScarletは、「mScarlet」と称される赤い蛍光タンパク質をコードする(Bindels et al(2017)Nature Methods.14:53−56を参照されたい)。プロモーターは、基質の迅速な開始誘導および滴定を可能にするドキシサイクリン可換プロモーターである。P2Aは、2つの他のポリペプチドの間に位置する要素である。P2Aは、翻訳中に2つの別々のポリペプチドを生成するように機能するため、mScarポリペプチドが、IKZF1/緑色蛍光タンパク質(GFP)からなる融合タンパク質のユビキチン化および分解による影響を受けることなく、赤色光を生成する陽性対照として機能できる。mNeonGreenは、ナメクジウオのニシナメクジウオの多量体黄色蛍光タンパク質(Allele Biotechnology,San Diego,CA)に由来する。P2Aは、P2Aタンパク質内のある部位で自己切断を可能にする領域である。より正確には、P2Aペプチドは、リボソームに2AペプチドのC末端でのグリシル−プロリルペプチド結合の合成をスキップさせ、2Aペプチドおよびそのすぐ下流のペプチドの間の切断をもたらす(Kim,Lee,Li,Choi(2011)PLoS ONE.6:e18556(8ページ)。
プレートを400rcfで1分間スピンする。365nm LED光源を使用して、適切な時間、ビーズから化合物を光放出する。イメージング(蛍光レポーターの読み出し)までCO2インキュベーターでインキュベートする。
アミノ基を含むようにガラスを修飾する。シリカ基質は、複数の「官能性シラン」の1つ以上を介して、アミノ基を含むように修飾できる。これらの「官能性シラン」は、3−アミノプロピル−トリエトキシシラン(APTES)、3−アミノプロピル−トリメトキシシラン(APTMS)、N−(2−アミノエチル)−3−アミノプロピルトリエトキシシラン(AEAPTES)、N−(2−アミノエチル)−3−アミノプロピルトリメトキシシラン(AEAPTMS)、およびN−(6−アミノヘキシル)アミノメチルトリエトキシシラン(AHAMTES)である。これらの試薬とガラスとの反応は、気相または液相で行うことができる(Zhu,Lerum,Chen(2012)28:416−423を参照されたい)。
スライド/共有結合的に結合するビーズ/ビーズ結合抗p53 Ab/ユビキチン化p53
このアッセイからの読み出しは、ユビキチン化p53であり、ユビキチン化p53は、ユビキチンに特異的である蛍光抗体により検出される。詳細には、抗体は、ヤギで作製されたポリクローナル抗体であり、抗体は、フルオロフォア(AF488)でタグ付けされている。図8は、AF488の構造を開示する。この蛍光抗体は、ユビキチンに結合する。したがって、ユビキチン化p53が検出された場合、以下のサンドイッチが存在する:
スライド/共有結合的に結合するビーズ/ビーズ結合結合抗p53 Ab/ユビキチン化p53/蛍光Ab
ビーズ結合DNAバーコードのシーケンシングを実行し、ビーズは、ピコウェルごとに1つのビーズをピコウェル内に位置した。アッセイ法は、蛍光ヌクレオチドの一過性結合を介した一度に1つずつのビーズ結合DNAバーコード上の各位置を調査することを伴う。各ビーズは、約100アトモルの結合DNAバーコードを含み、結合は、クリックケミストリーによるものであった。この数は、ビーズごとに結合した約6,000万のオリゴヌクレオチドに相当する。DNAバーコード上の各塩基について、アッセイは、同時に4つすべての蛍光dNTPを追加する。いかなる限定を意味することなく、4つの蛍光dNTPは、AF488−dGTP、CY3−dATP、TexasRed−dUTP、およびCY5−dCTPであった。蛍光シグナルを取得し、次にImageJソフトウェア(国立衛生研究所、NIH)により処理し、対応する数値を提供する。データは、ビーズ結合DNAバーコードの一部であった5つの連続したヌクレオチド(すべて連続)のシーケンシングからである。ビーズ結合DNAバーコードは、DNAヘアピン領域を含む。DNAヘアピン領域の塩基は、それ自体にアニールしてヘアピンが形成され、DNAヘアピンの3’末端ヌクレオチドは、シーケンシングプライマーとして機能した。一過性結合によるシーケンシングは、この3’末端で開始した。シーケンシングアッセイを3回、つまり3つの異なるビーズを使用して実施し、1つのDNAバーコード配列を3つのビーズの各々に使用した。換言すると、3つのビーズの各々は、他の2つのビーズにより提供されるものと同一の読み出しをシーケンシングすることを提供することが期待される。
バーコード化の概念についての導入。これは、バーコード化の概念を導入する。一般的なバーコード化技術は、所定の単一細胞のトランスクリプトームをバーコード化することである。図36および図37は、将来のシーケンシングに備えて、トランスクリプトームが捕捉および増幅される手順のステップを示す。図36は、mRNAを放出するための細胞の溶解、その後の逆転写を示す。図37は、固定化されたポリ(dT)を介したmRNAの捕捉、その後の逆転写、および最終的なシーケンシングを示す。シーケンシングは、次世代シーケンシング(NGS)を使用できる。
キャップ化ピコウェル。各ピコウェルは球でキャップされ、各ピコウェルに1つの球があり、球はピコウェルの穴(上部開口)にフィットする。球をピコウェルプレートに適用するには、球を成長培地に入れて懸濁し、次に、ピコウェルプレートの上面に適用し、球を沈降させる。次に、各ピコウェルの穴に球をしっかりと固定するために、プレート全体を遠心機に入れ、低重力で回転させる。
これは、紙に印刷する、またはコンピュータ言語で保存することのできる、一連の情報に関し、DNA配列と化合物ライブラリメンバーとを関連付ける「DNAバーコード」を提供する。このDNAバーコードは、「レジェンド」または「キー」と称され得る。DNAバーコードは、特定のFDA承認抗がん剤の類似体など、特定のクラスの化合物を特定できる核酸も提供し、またはユーザーの名前を特定する、またはビーズ結合化学ライブラリで試験する特定の疾患を特定できる。
図13、14、および15は、レナリドマイドの3つの異なる誘導体への変換を開示しており、各誘導体は、カルボン酸基を有する。これらのカルボン酸基の各々は、その後、ビーズ−リンカー複合体と縮合するために使用することができる。この状況では、カルボン酸基が、ビーズ−リンカー複合体に縮合され、それは、以前にFmocで占められていた位置に付着する。
本開示は、化合物に対する細胞の応答を評価するための試薬、システム、および方法を提供し、測定される応答は、トランスクリプトームの変化の形態をとる。「トランスクリプトームの変化」とは、いかなる限定も意味せずに、細胞内の各々およびすべての種類の固有のmRNAの量の変化、ならびに細胞内の予め決定された一連のmRNA分子の量の変化を指すことができる。「トランスクリプトームの変化」は、検出下限未満から検出可能になるまでの変化、ならびに検出可能から検出下限未満に低下するまでの変化が含まれ、これらの変化は、ビーズ結合化合物の放出に関連する。
Claims (89)
- 化合物をスクリーニングするためのシステムであって、
(a)複数のピコウェルを含むピコウェルアレイプレートであって、各ピコウェルが、前記ピコウェルの上部に開口を画定する上部穴、床によって画定される底部を有し、前記上部穴が、前記床から壁によって分離され、前記壁が、前記上部穴と前記床との間に存在する、ピコウェルアレイプレートと、
(b)ピコウェル内に配置されるビーズであって、複数の実質的に同一のビーズ結合DNAバーコード、および複数の実質的に同一のビーズ結合化合物を含む、ビーズと、
(c)前記ビーズが、連鎖状DNAバーコードまたは直交性DNAバーコードのいずれかの形態をとるビーズ結合DNAバーコードを含み、前記DNAバーコードが、連鎖状DNAバーコードの形態をとる場合、前記連鎖状DNAバーコードが、
(i)クリックケミストリーを使用すること、または
(ii)ステップの繰り返しサイクルを使用することのうちの一方もしくは両方を使用する方法によって作製され、前記ステップの繰り返しサイクルが、部分的に作製されたビーズ結合DNAバーコードとハイブリダイズ可能なスプリントオリゴヌクレオチド(スプリントオリゴ)を使用することを含み、前記ハイブリダイズが、前記スプリントオリゴ上のアニーリング部位および前記部分的に作製されたビーズ結合DNAバーコードの対応する相補的なアニーリング部位によって媒介され、
アニールされた前記スプリントオリゴが、DNAポリメラーゼを使用して前記部分的に作製されたDNAバーコードを伸長するための鋳型として使用され、前記スプリントオリゴが、前記部分的に作製されたビーズ結合DNAバーコードに重合されるDNAバーコードモジュールに相補的な塩基を含み、前記スプリントオリゴもまた、前記部分的に作製されたビーズ結合DNAバーコードに重合されるアニーリング部位に相補的な塩基を含むことと、
(d)前記複数の実質的に同一のビーズ結合化合物の各1つずつが、1つ以上の化学ライブラリモノマーを含み、各ビーズ結合DNAバーコードモジュールが、対応する化学ライブラリモノマーを特定し、「化合物」という用語が、1つ以上の化学ライブラリメンバーを含む完成された生成物を指すために使用され、前記完成されたDNAバーコードが、前記化合物を特定することと、を含む、システム。 - ビーズ結合DNAバーコードに含まれる1つ以上のDNAバーコードモジュールのシーケンシングを誘導可能なオリゴヌクレオチドシーケンシングプライマーをさらに含み、任意で、前記システムが、DNAシーケンシング機器を含み、前記DNAシーケンシング機器が、発光系シーケンサーではなく、pH系DNAシーケンシング機器ではない、請求項1に記載のシステム。
- 複数の球状キャップをさらに含み、各キャップが、ピコウェルの前記穴にフィットすることが可能であり、前記穴が、円形であり、各キャップが、前記ピコウェルの内部にある流体の蒸発を最小化するか、または防止することが可能であり、各キャップが、前記ピコウェルの内部にある流体の漏れを最小化するか、または防止することが可能である、請求項1に記載のシステム。
- 前記少なくとも1つのピコウェルに配置される前記少なくとも1つのビーズが、前記少なくとも1つのビーズと結合した少なくとも1つの応答捕捉要素を含む、請求項1に記載のシステム。
- ピコウェル内に配置される前記ビーズの前記少なくとも1つが、
前記少なくとも1つのビーズと結合した少なくとも1つの応答捕捉要素を含み、前記少なくとも1つの応答捕捉要素が、
(a)ポリ(dT)、
(b)エクソン標的化RNAプローブ、
(c)抗体、または
(d)アプタマーを含む、請求項1に記載のシステム。 - 前記DNAバーコードが、連鎖状DNAバーコードまたは直交性DNAバーコードのいずれかであり、前記DNAバーコードが、1つ以上のDNAバーコードモジュールを含み、1つ以上のDNAバーコードモジュールの各々が、化学ライブラリモノマーを特定する情報をコードし、前記連鎖状DNAバーコードまたは前記直交性DNAバーコードが、
(a)1つ以上の機能性核酸、および
(b)化学ライブラリモノマーの同一性以外の種類の情報をコードする1つ以上の核酸のうちの一方または両方をさらに含む、請求項1に記載のシステム。 - 前記ビーズ結合連鎖状DNAバーコードが、
(i)第1のDNAバーコードモジュール、または
(i)第1のDNAバーコードモジュール、第1のアニーリング部位、および第2のDNAバーコードモジュール、または
(ii)第1のDNAバーコードモジュール、第1のアニーリング部位、第2のDNAバーコードモジュール、第2のアニーリング部位、および第3のDNAバーコードモジュール、または
(iii)第1のDNAバーコードモジュール、第1のアニーリング部位、第2のDNAバーコードモジュール、第2のアニーリング部位、第3のDNAバーコードモジュール、第3のアニーリング部位、および第4のDNAバーコードモジュール、または
(iv)第1のDNAバーコードモジュール、第1のアニーリング部位、第2のDNAバーコードモジュール、第2のアニーリング部位、第3のDNAバーコードモジュール、第3のアニーリング部位、第4のDNAバーコードモジュール、第4のアニーリング部位、および第5のDNAバーコードモジュール、または
(v)第1のDNAバーコードモジュール、第1のアニーリング部位、第2のDNAバーコードモジュール、第2のアニーリング部位、第3のDNAバーコードモジュール、第3のアニーリング部位、第4のDNAバーコードモジュール、第4のアニーリング部位、第5のDNAバーコードモジュール、第5のアニーリング部位、および第6のDNAバーコードモジュールを含む、請求項1に記載のシステム。 - 前記ビーズが、直交性DNAバーコードであるDNAバーコードを含み、前記ビーズが、外面を含み、前記直交性DNAバーコードが、
(a)第1のDNAバーコードモジュールおよびシーケンシングプライマーのためのアニーリング部位を含む第1の核酸であって、第1の位置で前記ビーズと結合する、第1の核酸と、
(b)第2のDNAバーコードモジュールおよびシーケンシングプライマーのためのアニーリング部位を含む第2の核酸であって、第2の位置で前記ビーズと結合する、第2の核酸と、
(c)第3のDNAバーコードモジュールおよびシーケンシングプライマーのためのアニーリング部位を含む第3の核酸であって、前記第2の核酸が第3の位置で前記ビーズと結合する、第3の核酸と、を含み、
前記ビーズ上の前記第1、第2、および第3の位置が、前記ビーズの外面上の異なる位置に各々位置する、請求項1に記載のシステム。 - 前記連鎖状DNAバーコードが、
(i)クリックケミストリーおよび前記スプリントオリゴを使用する前記ステップの繰り返しサイクルの両方、
(ii)クリックケミストリーおよびクリックケミストリー法ではない化学的方法の両方、
(iii)クリックケミストリーのみ、または
(iv)前記スプリントオリゴを使用する前記ステップの繰り返しサイクルのみを使用する方法によって作製される、請求項1に記載のシステム。 - 前記複数の実質的に同一のビーズ結合化合物の各々が、切断可能なリンカーを介して、または光切断可能なリンカーである切断可能なリンカーを介して、または切断不可能なリンカーを介して前記ビーズと結合される、請求項1に記載のシステム。
- 前記少なくとも1つのビーズが、ポリエチレングリコール(PEG)がグラフトされている低架橋ポリスチレンマトリックスからなる、グラフトされたコポリマーを含む、請求項1に記載のシステム。
- 少なくとも1つのピコウェルが、少なくとも1つの細胞を含み、
前記複数の実質的に同一のビーズ結合化合物が、切断可能なリンカーを介して前記少なくとも1つのビーズと結合され、前記切断可能なリンカーを切断することが、前記ビーズから前記ビーズ結合化合物を放出し、放出された化合物を生成し、
前記放出された化合物が、前記少なくとも1つの細胞と接触することが可能であり、前記少なくとも1つの細胞が、
(i)がん細胞ではない哺乳動物細胞、
(ii)哺乳動物がん細胞、
(iii)死んだ哺乳動物細胞、
(iv)アポトーシス性の哺乳動物細胞、
(v)ネクローシス性の哺乳動物細胞、
(vi)細菌細胞、
(vii)マラリア原虫細胞、
(vii)代謝的に活性であるが、架橋されたゲノムを有し、細胞分裂を起こすことが不可能である細胞、または
(ix)ウイルスに感染した哺乳動物細胞である、請求項1に記載のシステム。 - 各ピコウェルが、前記ピコウェルの上部に開口を画定する上部穴、床によって画定される底部を有し、前記上部穴が、前記床から分離され、壁が、前記上部穴と前記床との間に存在し、
前記穴が、円形であり、前記床が、円形であり、前記壁が、円錐台の形態をとり、前記穴が、第1の直径を有し、前記床が、第2の直径を有し、前記第1の直径が、前記第2の直径より大きい、請求項1に記載のシステム。 - 各ピコウェルが、前記ピコウェルの上部に開口を画定する上部穴、床によって画定される底部を有し、前記上部穴が、前記床から分離され、壁が、前記上部穴と前記床との間に存在し、
前記穴が、円形であり、前記床が、円形であり、前記壁が、円錐台の形態をとり、前記穴が、第1の直径を有し、前記床が、第2の直径を有し、前記第1の直径が、前記第2の直径より大きく、
前記穴にぴったりとフィットするキャップをさらに含み、前記穴が、より大きなデュロメータ(より硬い)を有するポリマーにより構成され、前記キャップが、より小さなデュロメータ(より軟らかい)を有するポリマーから作製され、前記キャップおよび穴の相対デュロメータが、前記キャップを可逆的かつぴったりと前記穴にフィットさせることを可能にし、
前記キャップが、
(i)前記ピコウェルに栓をし、漏れを防ぐことのみを目的としたキャップ、
(ii)受動的キャップであり、細胞培地内の細胞が前記ピコウェル内で培養されている状況で、細胞により放出される代謝産物を吸収することが可能であるキャップ、
(iii)能動的キャップであり、複数の本質的に同一の化合物を含むビーズの形態をとるキャップであって、
前記複数の本質的に同一の化合物の各々が、切断可能なリンカーで前記ビーズと結合される、キャップ、
(iv)能動的キャップであり、複数の同一の試薬を含むビーズの形態をとるキャップであって、前記複数の本質的に同一の試薬の各々が、切断可能なリンカーで前記ビーズと結合される、キャップである、請求項1に記載のシステム。 - 少なくとも1つの球状キャップをさらに含む、請求項14に記載のシステム。
- 少なくとも1つの非球状キャップをさらに含む、請求項14に記載のシステム。
- 前記DNAバーコードが、任意の化学モノマーをコードしないが、代わりに
(a)前記ビーズと切断可能に付着している化合物のクラス、
(b)ビーズ結合核酸が、ビーズ結合化合物を作製するために使用される所定の化学モノマーに対応し、所定の化学モノマーに対応する前記ビーズ結合核酸が、その化学モノマーを特定する、有機合成の多段階経路におけるステップ、
(c)前記ビーズ結合化合物が、合成された日、
(d)前記ビーズ結合化合物が、治療を目的とする疾患、
(e)前記ビーズ結合化合物が、刺激もしくは阻害を目的とする細胞性事象、または
(f)所定の化学ライブラリモノマーを前記ビーズと結合するために使用される反応条件のうちの1つ以上を特定する1つ以上の核酸を含む、請求項1に記載のシステム。 - 前記ビーズ結合化合物のいずれかを前記ビーズ結合DNAバーコードのいずれかと連結する任意のヘッドピースが存在しない、請求項1に記載のシステム。
- 前記連鎖状DNAバーコードが、DNAバーコードモジュールである少なくとも1つの核酸、および
(a)シーケンシングプライマーのアニーリング部位として使用可能である、
(b)ヘアピン構造を形成することが可能であって、前記ヘアピン構造が、前記ヘアピン構造におけるシーケンシングプライマー、前記シーケンシングプライマーのアニーリング部位、およびビーズを含み、前記ビーズが、前記シーケンシングプライマーに対して5プライムであり、前記シーケンシングプライマーの前記アニーリング部位の3プライムである、ヘアピン構造を形成することが可能である、または
(c)スペーサー核酸である、少なくとも1つの機能性核酸を含む、請求項1に記載のシステム。 - 前記直交性DNAバーコードが、複数のDNAバーコードモジュールを含み、前記DNAバーコードモジュールの各々が、直接性またはリンカーを介して、前記ビーズ上の異なる部位と結合され、前記複数のDNAバーコードモジュールの各々が、
(a)シーケンシングプライマーのアニーリング部位として使用可能であるもの、
(b)ヘアピン構造を形成することが可能であるものであって、前記ヘアピン構造が、前記ヘアピン構造におけるシーケンシングプライマー、前記シーケンシングプライマーのアニーリング部位、およびビーズを含み、前記ビーズが、前記シーケンシングプライマーに対して5プライムであり、前記シーケンシングプライマーの前記アニーリング部位の3プライムである、ヘアピン構造を形成することが可能であるもの、または
(c)スペーサー核酸である、少なくとも1つの機能性核酸を含む、請求項1に記載のシステム。 - ピコウェル内に存在する溶液中の化合物の濃度を制御する方法であって、前記方法が、ピコウェル内のビーズ結合化合物に適用され、前記ピコウェルが、溶液を含み、前記ビーズ結合化合物が、切断可能なリンカーを介して前記ビーズと結合され、前記方法が、
(a)前記ビーズ結合化合物を、前記切断可能なリンカーの切断をもたらす条件に曝露するステップであって、前記条件が、前記切断可能なリンカーを切断することが可能である光を含む、ステップ、
(b)前記ビーズからの前記ビーズ結合化合物の放出を許可し、放出された化合物を生成するステップであって、放出に続いて、前記溶液中の前記放出された化合物の拡散または分散により、前記溶液中の前記化合物の実質的に均一な濃度がもたらされる、ステップ
(c)前記実質的に均一な濃度の決定された濃度を生成するように前記条件を調整するステップであって、前記決定された濃度が、ビーズ結合放出モニターから放出される、放出されるフルオロフォアの濃度を考慮して実行される、ステップを含む、方法。 - 前記条件が、光の波長、光の強度のうちの1つ以上を調整することによって、および露光の持続期間によって調整され、任意で
(i)ビーズ結合放出モニターから放出される、放出されるフルオロフォアの濃度が、前記ビーズから前記ビーズ結合化合物の放出をもたらし、放出される化合物を生成すると同時に決定されるか、または
(ii)ビーズ結合放出モニターから放出される、放出されるフルオロフォアの濃度が、前記ビーズから前記ビーズ結合化合物の放出をもたらし、放出される化合物を生成する実質的に前の時点で決定される、請求項21に記載の方法。 - 複数のピコウェルを含むピコウェルプレートと組み合わせたキャップであって、
前記キャップが、前記ピコウェルプレートと共に使用することが可能であり、
前記複数のピコウェルの各々が、穴、床、および壁によって画定可能であり、前記壁が、上部の前記穴および底部の前記床によって画定され、前記穴が、円形であり、前記床が、円形であり、前記壁が、円錐台の表面の形態をとり、
前記穴が、第1の直径を有し、前記床が、第2の直径を有し、前記第1の直径が、前記第2の直径より大きく、
前記キャップが、前記穴にぴったりとフィットすることが可能な球状キャップであり、前記穴が、より大きなデュロメータ(より硬い)を有するポリマーにより構成され、前記キャップが、より小さなデュロメータ(より軟らかい)を有するポリマーから作製され、
前記キャップおよび穴の相対デュロメータが、前記球状キャップを可逆的かつぴったりと前記穴にフィットさせることを可能にし、前記キャップが、
(i)前記ピコウェルに栓をして漏れを防ぐことが可能であり、
(ii)受動的キャップであり、細胞培地内の細胞が前記ピコウェル内で培養されている状況で、細胞より放出される代謝産物を吸収することが可能であり、
(iii)能動的キャップであり、複数の本質的に同一の化合物を含むビーズの形態をとり、
前記複数の本質的に同一の化合物の各々が、切断可能なリンカーでビーズと結合され、前記複数のピコウェルの少なくとも1つが、水性培地を含み、前記切断可能なリンカーの切断が、前記ビーズから前記複数の本質的に同一の化合物の少なくともいくつかを前記水性培地に放出する、キャップ。 - 一般的に平面である上部、複数のピコウェルを含むピコウェルアレイプレートであって、各ピコウェルが、前記ピコウェルの上部に開口を画定する上部穴、床によって画定される底部を有し、前記上部穴が、前記床から壁によって分離され、前記壁が、前記上部穴と前記床との間に存在する、ピコウェルアレイプレートと、
任意で、前記複数のピコウェルの少なくとも1つに配置されるビーズであって、複数の実質的に同一のビーズ結合DNAバーコード、および複数の実質的に同一のビーズ結合化合物を含む、ビーズと、を含むシステムであって、
前記ピコウェルアレイプレートが、前記複数のピコウェルの少なくとも1つもしくは全ての上部にある前記開口を確実に覆うか、または前記複数のピコウェルの少なくとも1つもしくは全ての上部にある前記開口を事実上確実に覆うことが可能であるマットをさらに含み、前記確実に覆うことが、可逆的であり、前記マットが、任意で
(a)前記ピコウェルアレイプレートの前記上部の一般的な平面と接触して配置された場合に、前記複数のピコウェルの1つ以上に含まれ得る任意の代謝物、生化学物質、またはタンパク質を吸収可能である吸収面、
(b)前記ピコウェルアレイプレートの前記上部の一般的な平面との可逆的な接着を維持可能である接着面のうちの1つまたは全てを含む、システム。 - アッセイからのシグナルおよびビーズ上のシーケンシングの読み出しを決定し、それにより前記アッセイから目的の1つ以上の化合物を特定する方法であって、
(a)複数のビーズを提供することであって、各ビーズが、実質的に互いに関連している前記ビーズに付着した複数の化合物、および複数のオリゴヌクレオチドを含み、各ビーズに付着した前記複数のオリゴヌクレオチドが、同じビーズに付着した前記複数の化合物を特定する、提供するステップと、
(b)前記ビーズに付着した前記複数の化合物を伴う前記アッセイを実行するステップと、
(c)ステップbの前記アッセイにおける前記化合物の性能を反映する少なくとも1つのシグナルを決定するステップと、
(d)前記ビーズから前記オリゴヌクレオチドを除去することなく、前記ビーズに付着した前記複数のオリゴヌクレオチドをシーケンシングし、それにより各ビーズのシーケンシングの読み出しを決定するステップと、
(e)ステップdの前記シーケンシングの読み出しによって前記ビーズに付着した前記化合物を特定し、それをステップcの前記決定されたシグナルに含まれるアッセイ性能と関連付けすることであって、前記アッセイおよび前記シーケンシングの読み出しからのシグナルを有するビーズが、目的の前記化合物を特定する、関連付けするステップと、を含む、方法。 - 所望される特性を有する化合物について化合物ライブラリをスクリーニングする方法であって、
(a)複数のビーズを提供することであって、各ビーズが、前記ビーズ表面に付着した複数のオリゴヌクレオチド、および前記ビーズ表面に付着した複数の実質的に関連する化合物を含み、前記ビーズに付着した前記オリゴヌクレオチドの配列が、前記ビーズ表面に付着した前記複数の実質的に関連する化合物の同一性をコードする、提供することと、
(b)前記化合物ライブラリ内の化合物の所望される特性についてのアッセイに前記複数のビーズを組み込むことと、
(c)少なくとも1つのビーズからのシグナルを捕捉することであって、前記シグナルが、前記アッセイにおける前記ビーズ上の前記化合物の性能を反映する、捕捉することと、
(d)前記ビーズから前記オリゴヌクレオチドを除去することなく、アッセイシグナルがさらに捕捉された前記少なくとも1つのビーズに付着した前記複数のオリゴヌクレオチドをシーケンシングすることと、
(e)ステップ(d)の前記シーケンシングの読み出しから少なくとも1つの化合物を特定し、それをステップ(c)の前記シグナルで捕捉された対応するアッセイ性能と関連付けすることとを含む、方法。 - 各ビーズが、異なる複数のオリゴヌクレオチドおよび異なる複数の実質的に関連する化合物を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチドが、複数のDNAオリゴヌクレオチドである、請求項25〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の化合物が、複数の化合物構成要素をタンデムに連結することにより、前記ビーズ表面に付着され、前記化合物構成要素のすべてが、前記化合物を一緒に構成する、請求項25に記載の方法。
- 各DNAモジュールおよび各化合物構成要素が、経時的および代替的に組み立てられる、請求項29に記載の方法。
- 複数の同一の化合物中の各化合物が、切断可能なリンカーを介して前記ビーズ表面に付着される、請求項25〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記切断可能なリンカーが、光切断可能なリンカー、プロテアーゼ切断可能なリンカー、または酸切断可能なリンカーである、請求項31に記載の方法。
- 前記化合物が、ステップ(a)の後およびステップ(d)の前に前記ビーズ表面から切断される、請求項25〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記化合物の前記所望される特性を反映する前記シグナルが、蛍光シグナルである、請求項25〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 各ビーズのサイズが、1μm〜100μmである、請求項25〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 各ビーズのサイズが、1μm〜10μmである、請求項35に記載の方法。
- 各ビーズのサイズが、約3μmである、請求項36に記載の方法。
- 前記方法が、複数の潜在的な標的中の標的候補を特定することをさらに含み、前記所望される特性を有する前記化合物が、前記標的候補と結合する、請求項25〜37のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)が、前記複数の潜在的な標的中で前記複数のビーズをインキュベートすることを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記潜在的な標的が、タンパク質または核酸である、請求項37または38に記載の方法。
- 前記シーケンシングが、単一分子リアルタイムシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンス、合成によるシーケンシング、ブリッジ増幅によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ナノポアシーケンシング、鎖終結シーケンシング、超並列シグネチャシーケンシング、ポロニーシーケンシング、heliscope単一分子シーケンシング、ショットガンシーケンシング、SOLiDシーケンシング、イルミナシーケンシング、トンネル電流DNAシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、質量分析を用いたシーケンシング、マイクロ流体サンガーシーケンシング、およびオリゴヌクレオチド伸長シーケンシングにより実行される、請求項25〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 所望される特性を有する化合物について化合物ライブラリをスクリーニングする方法であって、
(a)複数のビーズを提供することであって、各ビーズが、前記ビーズ表面に付着した複数のオリゴヌクレオチド、および前記ビーズ表面に付着した複数の実質的に関連する化合物を含み、前記ビーズに付着した前記オリゴヌクレオチドの配列が、前記ビーズ表面に付着した前記複数の実質的に関連する化合物の合成履歴をコードする、提供することと、
(b)前記化合物ライブラリ内の化合物の所望される特性についてのアッセイに前記複数のビーズを組み込むことと、
(c)少なくとも1つのビーズからのシグナルを捕捉することであって、前記シグナルが、前記アッセイにおける前記ビーズ上の前記化合物の性能を反映する、捕捉することと、
(d)前記ビーズから前記オリゴヌクレオチドを除去することなく、アッセイシグナルがさらに捕捉された前記少なくとも1つのビーズに付着した前記複数のオリゴヌクレオチドをシーケンシングすることと、
(e)ステップ(d)の前記シーケンシングの読み出しから少なくとも1つの化合物を特定し、それをステップ(c)の前記シグナルで捕捉された対応するアッセイ性能と関連付けすることと、を含む、方法。 - 前記アッセイが、結合アッセイを含む、請求項42に記載の方法。
- 前記アッセイが、活性アッセイを含む、請求項42に記載の方法。
- 前記アッセイが、競合結合アッセイまたは競合阻害アッセイを含む、請求項42、43、または44に記載の方法。
- 前記アッセイが、非接続化合物と他のアッセイ試薬との相互作用を含み、前記非接続化合物が、前記ビーズ表面から放出された化合物である、請求項42に記載の方法。
- 前記化合物が、前記化合物を前記ビーズに接続する切断可能なリンカーを切断することにより放出される、請求項45に記載の方法。
- 前記アッセイが、複数の制限された容積内で発生し、名目上の1つのビーズが、制限された容積ごとに分散される、請求項42〜47に記載の方法。
- 前記制限された容積が、水性液滴を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記水性液滴が、油媒体または疎水性液体媒体中に懸濁される、請求項49に記載の方法。
- 前記制限された容積が、ピコウェルを含む、請求項48に記載の方法。
- 前記ピコウェルが、規則的なアレイに組織化される、請求項50に記載の方法。
- 前記複数の制限された容積が、規則的なアレイに組織化される、請求項51に記載の方法。
- 前記制限された容積が、前記ビーズの周囲に接着した水性媒体の層を含み、前記ビーズが、疎水性媒体に懸濁される、請求項48に記載の方法。
- 前記アッセイ試薬が、前記オリゴヌクレオチドをシーケンシングする前に洗い流される、請求項42に記載の方法。
- 前記シーケンシングステップ(d)が、前記アッセイステップ(b)の前に実行される、請求項42に記載の方法。
- 前記ビーズ上の前記オリゴヌクレオチドが、前記シーケンシングステップの後であるが、前記アッセイステップの前に除去される、請求項56に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記除去が、酵素消化、化学的切断、熱分解、または物理的剪断を含む、請求項57に記載の方法。
- 前記結合アッセイが、RNA分子の前記ビーズとの結合を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記ビーズからの前記シグナルが、結合したRNA分子のシーケンシングを含む、請求項43に記載の方法。
- 前記結合アッセイが、蛍光標識された結合アッセイを含み、前記ビーズ上の前記化合物と結合する分子が、フルオロフォアを含む、請求項42に記載の方法。
- 前記結合アッセイが、核酸標識された結合アッセイを含み、前記ビーズ上の前記化合物と結合する分子が、核酸タグを含み、前記アッセイからの前記シグナルが、前記ビーズ上の前記化合物と結合する分子に付着した前記核酸タグのシーケンシングをさらに含む、請求項42に記載の方法。
- 前記所望される特性が、
(i)酵素の触媒活性を阻害または刺激すること、
(ii)細胞系アッセイまたは生体内アッセイにより測定可能なTh1型免疫応答を刺激すること、
(iii)細胞系アッセイまたは生体内アッセイにより測定可能なTh2型免疫応答を刺激すること、
(iv)細胞系アッセイまたは生体内アッセイにより測定可能なTh1型免疫応答を阻害すること、
(v)細胞系アッセイまたは生体内アッセイにより測定可能なTh2型免疫応答を阻害すること、
(vi)精製されたタンパク質、細胞系アッセイ、または生体内アッセイにより測定可能な、タンパク質のユビキチン媒介分解を刺激または阻害することのうちの1つ以上を含む、請求項42に記載の方法。 - 所望される活性を有する化合物について化合物ライブラリをスクリーニングするためのシステムであって、
(a)複数の化合物が付着し、オリゴヌクレオチドがコードされたビーズを受け入れるための試料区画と、
(b)前記試料区画内の複数のカプセル化区画であって、各カプセル化区画が、名目上、アッセイ媒体中に分散された単一のビーズを含み、さらに前記アッセイ媒体が、前記ビーズ上の前記化合物との相互作用がアッセイされ、測定可能なシグナルをもたらす試薬を含む、複数のカプセル化区画と、
(c)シグナルを測定するための検出器と、
(d)シーケンシングプラットフォームと、
(e)ユーザーから1つ以上のコマンドを受信するためのユーザーインターフェイスと、を含む、システム。 - 前記カプセル化区画が、液滴を含む、請求項64に記載のシステム。
- 前記カプセル化区画が、ピコウェルを含む、請求項64に記載のシステム。
- さらに前記カプセル化区画が、アッセイ試薬を含む、請求項64に記載のシステム。
- 前記検出器が、光学検出器を含む、請求項64に記載のシステム。
- 前記シーケンサーが、光学検出器を含む、請求項64に記載のシステム。
- 細胞を摂動させる方法であって、
(a)核酸にコードされた摂動を提供し、前記核酸にコードされた摂動で細胞を制限することと、
(b)前記細胞を、制限された容積内で前記核酸にコードされた摂動と接触させることであって、前記摂動の開始および用量が、制御される、接触させることと、
(c)前記細胞を、前記核酸をコードした摂動と共に特定の期間インキュベートすることと、
(d)前記核酸にコードされた摂動をコードする前記核酸を前記細胞に移入することと、を含む、方法。 - 前記核酸にコードされた摂動が、核酸にコードされた化合物または薬物分子である、請求項70に記載の方法。
- 前記核酸にコードされた摂動が、DNAにコードされたライブラリである、請求項70または71に記載の方法。
- 前記摂動および前記摂動をコードする前記核酸が、溶液中に付着しておらず、遊離している、請求項70〜72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記摂動および前記摂動をコードする前記核酸が、互いに付着している、請求項70〜73のいずれか一項に記載の方法。
- 前記摂動および前記摂動をコードする前記核酸が、同じ基質に付着しているが、互いに付着していない、請求項70〜72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記摂動の前記基質への付着および前記核酸の前記基質への付着が、切断可能な付着である、請求項75に記載の方法。
- 前記切断可能な付着が、光切断可能な付着、温度で切断可能な付着、pH感受性付着、酸で切断可能な付着、塩基で切断可能な付着、音で切断可能な付着、塩で切断可能な付着、レドックス感受性付着、または物理的に切断可能な付着からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記細胞および前記摂動を制限することが、液滴カプセル化、エマルジョンカプセル化、ピコウェルカプセル化、マクロウェルカプセル化、物理的付着、気泡カプセル化、またはマイクロ流体制限を含む、請求項70〜77のいずれか一項に記載の方法。
- 前記摂動にわたる制御が、光曝露を制御する、温度曝露を制御する、pH曝露を制御する、時間曝露を制御する、音曝露を制御する、塩曝露を制御する、化学的もしくは物理的レドックス電位を制御する、または機械的撹拌暴露を制御することを含む、請求項70〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インキュベーションが、前記摂動を前記基質から切断した後、または前記核酸を前記基質から切断した後に、前記細胞を前記摂動に曝露することを含む、請求項75〜79のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インキュベーションが、前記摂動を前記基質から切断することなく、または前記核酸を前記摂動から切断することなく、前記細胞を前記摂動に曝露することを含む、請求項75〜79のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸にコードされた摂動をコードする前記核酸を前記細胞に移入することが、前記核酸を前記細胞の細胞表面に付着させることを含む、請求項70〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸を前記細胞の細胞表面に付着させることが、前記核酸を前記細胞膜に挿入することを含む、請求項82に記載の方法。
- 前記核酸を前記細胞の細胞表面に付着させることが、前記核酸を細胞表面上の生体分子に付着させることを含む、請求項82に記載の方法。
- 前記生体分子が、タンパク質または炭水化物である、請求項84に記載の方法。
- 前記核酸を前記細胞の細胞表面に付着させることが、前記核酸上の任意のタグを介して付着することを含む、請求項82〜85のいずれか一項に記載の方法。
- 摂動で細胞を摂動し、前記摂動の同一性で前記細胞をコードする方法であって、
(a)ビーズ結合DNAにコードされたライブラリを提供することと、
(b)前記ビーズ結合DNAにコードされたライブラリで細胞を制限することであって、前記ビーズ結合DNAにコードされたライブラリが、コンビナトリアル合成された化合物の1つ以上のコピーおよびコード化核酸タグの1つ以上のコピーを含み、前記化合物および前記コード化核酸が、ビーズに付着され、前記コード化核酸が、前記化合物の同一性をコードし、前記ビーズ結合DNAにコードされたライブラリおよび前記細胞が、制限化容積に制限される、制限することと、
(c)前記ビーズから前記化合物を放出し、前記化合物を前記細胞と共に前記制限化容積内でインキュベートすることと、
(d)任意で、前記コード化核酸タグを前記ビーズから放出することと、
(e)前記コード化核酸タグを前記細胞に付着させ、それにより、前記細胞に付着された前記コード化核酸タグを介して前記化合物の同一性を維持することと、を含む、方法。 - 細胞を摂動し、前記摂動の同一性で前記細胞をコードし、前記摂動に対する前記細胞の応答を測定する方法であって、
(a)細胞を、第1の制限された容積内でビーズ結合DNAコード化ライブラリと接触させることであって、前記ビーズ結合DNAコード化ライブラリが、コンビナトリアル合成された化合物の1つ以上のコピーおよびコード化核酸タグの1つ以上のコピーを含み、前記化合物および前記コード化核酸が、ビーズに付着され、前記コード化核酸が、前記化合物の同一性をコードする、接触することと、
(b)ライブラリ内の前記化合物を前記ビーズから放出し、前記ライブラリ内の前記化合物を前記第1の制限された容積内の前記細胞と共にインキュベートすることと、
(c)任意で、前記第1の制限された容積内の前記ビーズから前記コード化核酸タグを放出することと、
(d)前記コード化核酸タグを、前記細胞の細胞表面に捕捉し、それにより、前記細胞が、前記ライブラリ内の前記化合物に曝露され、曝露された前記化合物の同一性が、細胞表面上に捕捉されることと、
(e)前記第1の制限された容積から前記細胞を放出することであって、前記コード化核酸タグが、前記細胞に付着され、前記コード化核酸タグが、前記細胞が曝露される前記化合物の同一性をコードする、放出することと、
(f)以前に摂動され、核酸でタグ付けされた細胞を、第2の制限された容積内の応答検出ビーズで捕捉することであって、前記細胞が、前記細胞の細胞内容物を応答捕獲ビーズに曝露する溶解条件に曝露され、前記応答捕獲ビーズが、前記細胞内容物を捕獲する捕獲プローブ、および前記以前に摂動され、核酸でタグ付けされた細胞における前記摂動をコードする核酸タグを含む、捕捉することと、
(g)前記応答捕捉ビーズを、前記第2の制限された容積内の溶解された細胞と共にインキュベートし、それにより、細胞内容物および前記応答捕捉ビーズへの前記摂動をコードする前記核酸タグの両方を捕捉することと、
(h)任意で、前記摂動に対する前記細胞の前記応答を、核酸シグナルに変換することであって、前記摂動に対する前記細胞の前記応答が、核酸シグナルではない、変換することと、
(i)前記応答捕獲ビーズに付着された前記核酸タグをシーケンシングし、それにより、前記摂動の同一性を前記摂動に対する前記細胞の前記応答に相関させることと、を含む、方法。 - 細胞を摂動させ、前記摂動に対する前記細胞の応答を捕捉する方法であって、
(a)ピコウェルのアレイおよび機能化された摂動ビーズのライブラリを提供することであって、前記ピコウェルが、単一の細胞および単一の機能化された摂動ビーズを収容可能であり、各機能化された摂動ビーズが、異なる複数の実質的に同一の放出可能な化合物および前記化合物をコードする複数のヌクレオチドバーコードを含み、前記ヌクレオチドバーコードが、前記細胞の細胞内容物を捕捉可能な機能化されたバーコードであり、細胞の前記細胞内容物が、前記機能化された摂動ビーズに含まれる前記摂動に対する細胞応答を含む、提供することと、
(b)前記ピコウェルアレイの各ピコウェルに単一の細胞を捕捉することと、
(c)単一の機能化された摂動ビーズを、単一の細胞を含む前記ピコウェルに捕捉することと、
(d)前記機能化された摂動ビーズから前記化合物を放出し、前記放出された化合物と共に前記細胞をインキュベートすることであって、前記ピコウェル間の化合物が、最小限の拡散を有する、インキュベートすることと、
(e)前記細胞を溶解して前記細胞内容物を放出することと、
(f)前記機能化された摂動ビーズ上の機能化されたオリゴヌクレオチド上に前記細胞内容物の1つ以上の成分を捕捉することであって、前記捕捉することが、ヌクレオチドバーコードを前記細胞内容物の核酸要素と組み合わせるためのハイブリダイゼーションおよび酵素的伸長を含み、それにより、前記ヌクレオチドバーコードおよび前記細胞内容物の前記核酸要素のハイブリッドを形成する、捕捉することと、
(g)前記ハイブリッドを放出し、機能化された摂動ビーズの前記ライブラリから前記ハイブリッドを収集し、前記ハイブリッドをシーケンシングし、それにより、前記摂動を、前記摂動に対する前記細胞応答に関連付けることと、を含む、方法。
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