CN113549676B

CN113549676B - 一种基于磁珠的RNA pull down新方法

Info

Publication number: CN113549676B
Application number: CN202110972587.2A
Authority: CN
Inventors: 喻常富
Original assignee: Chongqing Van Der Waals Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chongqing Van Der Waals Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-08-24
Filing date: 2021-08-24
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2041-08-24
Also published as: CN113549676A

Abstract

本发明公开了一种基于磁珠的RNA pull down新方法，包括如下步骤：1）体外转录获得目的RNA；2）制备寡核苷酸或单个核苷酸磁珠；3）制备目的RNA磁珠复合物；4）捕获目的RNA‑蛋白复合物；5）收集目的RNA‑蛋白复合物，用于后续分析（WB、银染、质谱等）。本发明利用体外转录获得的目的RNA，还原其在细胞内的真实结构；目的RNA与磁珠上的核苷酸的连接稳定，不会形成混连；避免了在游离状态下目的RNA末端连接生物素标记的单个核苷酸所造成的生物素数量过多的弊端；本发明无需在目的RNA与生物素标记的核苷酸连接后进行纯化，节约了时间和成本。

Description

一种基于磁珠的RNA pull down新方法

技术领域

本发明涉及一种基于磁珠的RNA pull down新方法及试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

细胞内分子间的相互作用是细胞信号转导的基础。要阐明细胞生物学功能的分子机制避不开研究分子间的相互作用，进而弄清信号转导过程，从而理解其分子机理并找到干预疾病进程的靶点。近年来，越来越多的研究表明RNA特别是长链非编码RNA（longnoncoding RNA, lncRNA）与蛋白的相互作用能够调控蛋白的稳定性、修饰、转位等。目前研究lncRNA与蛋白的相互作用主要有如下方法：1）RNA pull down方法（以Thermo公司的Pierce^TM Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit为代表），以RNA为主要研究对象，采用此方法可找到与RNA相互作用的蛋白分子；2）RNA immunoprecipitation (RIP)方法（以Millipore公司的 Magna RIP^TM RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit为代表），以蛋白为主要对象，采用此方法找到与蛋白相互作用的RNA分子。

目前的RNA pull down试剂盒主要基于链霉亲和素与生物素的亲和结合原理，以生物素标记的单个核苷酸为原料，体外转录获得带生物素标记的目的RNA，进而与样品蛋白结合，再与链霉亲和素磁珠结合；在目的RNA或RNA/DNA探针末端连接生物素标记的单个核苷酸，进而与链霉亲和素磁珠结合，再与样品蛋白结合，通过磁分离将带生物素标记的RNA及其复合物分离出来。目前主要有以下三种方法：

1. 探针法：利用生物素标记的RNA或DNA探针捕获其靶向的RNA及复合物，CN106168615A中阐述了这种方法：针对目标区域设计特异性RNA探针，探针经过脱硫生物素标记；链霉亲和素偶联在磁珠上，并和脱硫生物素亲和结合；细胞全蛋白与磁珠-探针复合物孵育，作用蛋白分子可以和RNA探针特异性结合。经过洗涤去除非特异性结合蛋白分子，最后洗脱得到目的探针-蛋白复合物。该方法的优势在于可捕获内源性的RNA分子及复合物；不足在于：1）针对每个不同的目的RNA，都需要重新设计能够捕获目的RNA的生物素标记探针，因此该试剂盒需定制而非通用；2）探针可能存在非特异性捕获，探针可能同时靶向目的RNA或其他RNA，这是探针自身的局限所导致的；3）探针可能无法捕获目的RNA及其复合物或仅捕获游离的目的RNA，因为细胞内RNA与蛋白或其他分子形成复合物以后，目的RNA暴露在外的结构不明确，如果探针靶向的RNA部位在复合物中并未暴露，则会导致探针无法捕获目的RNA及其复合物。CN 106168615A中阐述针对目标区域设计特异性RNA探针，然后用这段探针去与细胞全蛋白孵育，进而获得目的探针-蛋白复合物，该描述指出RNA探针可能直接与蛋白形成复合物，而非捕获目的RNA及其蛋白复合物，因此进一步指出RNA探针本身的局限性。

2. 通过人工设计，合成或引物扩增DNA模板，以生物素标记的核苷酸为原料，通过体外转录、纯化获得带有生物素标记的目的RNA，进而与样品蛋白孵育，再与链霉亲和素磁珠结合，通过磁分离将目的RNA及其复合物分离并鉴定。此方法的优点在于：1）步骤简单，生物素标记的目的RNA在体外转录时即可获得，纯化以后便可直接用于RNA pull down实验，无需再处理。其缺点在于：1）由于目的RNA是以生物素标记的核苷酸作为原料生成的目的RNA，其本身就带有众多生物素标记，其机构被人为修饰，而非细胞内的真实结构，因此极有可能影响RNA的结构和功能；2）以生物素标记的核苷酸作为原料生成目的RNA，需要大量生物素标记的核苷酸，而生物素标记的核苷酸价格不菲，因此成本偏高；3）以生物素标记的核苷酸作为原料生成目的RNA，与常规的核苷酸原料相比，生成目的RNA的产量较低，因此进一步增加了成本。

3. 通过人工设计，合成或引物扩增DNA模板，通过体外转录、纯化获得目的RNA，通过RNA连接酶将目的RNA末端与生物素标记的单个核苷酸连接，纯化获得生物素标记的目的RNA，进而与链酶亲和素磁珠结合，再与样品蛋白孵育，通过磁分离将目的RNA及其复合物分离并鉴定。此方法（以Thermo公司的试剂盒为代表）的优点在于：1）试剂盒具有通用性，即可以在任意RNA末端连接生物素标记的单个核苷酸；2）目的RNA本身没有被人为修饰，因此不影响目的RNA的结构及功能。其缺点在于：1）在目的RNA末端连接生物素标记的单个核苷酸数量不能控制，可连接几个至几千核苷酸不等，同时会存在目的RNA与生物素标记的单个核苷酸的混连，而多余的生物素标记的核苷酸会占位磁珠上的链霉亲和素位点，导致磁珠结合的目的RNA数量每次不相同，从而导致批间重现性不稳定；2）在目的RNA末端连接生物素标记的单个核苷酸后需要纯化才能与带链霉亲和素的磁珠结合，而在纯化过程中会损失部分经过生物素标记的目的RNA；3）在目的RNA末端连接生物素标记的单个核苷酸过程中所需的生物素标记的核苷酸数量较多，而生物素标记的单个核苷酸价格昂贵，导致该试剂盒的成本偏高。

发明内容

针对以上问题，本发明提供一种基于磁珠的RNA pull down新方法，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明采用体外转录获得目的RNA，不以任何人工修饰的核苷酸为原料生成目的RNA。因此，与以生物素等标记的核苷酸为原料直接生成的目的RNA相比，本发明可高度还原细胞内RNA的真实结构。

2.本发明采用人工设计，合成或引物扩增DNA模板，以DNA模板生成目的RNA，因此可对目的RNA进行突变或截断，可精确分析目的RNA与蛋白相互作用的具体结合位点，而采用探针法则无法做到。同时，探针法具有其自身的缺陷，即探针的捕获可能具有非特异性，以及探针只能靶向目的RNA-蛋白质复合物中被暴露的RNA片段。

3.本发明首先将生物素标记的寡核苷酸或单个核苷酸结合到链霉亲和素磁珠上，通过洗涤去除未结合或非特异性结合的核苷酸，再通过RNA连接酶将目的RNA与核苷酸连接，这就避免了在游离状态下目的RNA末端连接生物素标记的单个核苷酸时其数量无法控制的不足。因为生物素标记的单个核苷酸的数量过多会大量占位磁珠上的链霉亲和素位点，所以导致整个RNA pull down实验的批间重现性不稳定，而其重现性取决于目的RNA末端修饰生物素数量。

4.本发明通过RNA连接酶将目的RNA连接至磁珠的核苷酸上，再通过洗涤去除未连接的目的RNA，以获得高纯度的目的RNA磁珠。以Thermo公司为代表的方法，其在目的RNA末端连接生物素标记的单个核苷酸后需对该RNA进行纯化，在纯化过程中不可避免地存在样品丢失且需要额外的试剂，而本发明在整个过程中无需对目的RNA进行纯化，因此节约了时间和成本。

5.本发明提供的试剂盒中包含人工合成的生物素标记的寡核苷酸或单个核苷酸，其特点是稳定性好、生物素标记的单个核苷酸数量恒定，由于每条目的RNA只需要1 - 3个生物素标记的核苷酸，所以无需大量生物素标记的核苷酸作为原料，节约了成本。

6.本发明提供的试剂盒，只需准备无任何人工修饰的目的RNA，便可在数小时内完成RNA pull down实验，因此效率高。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种基于磁珠的RNA pull down新方法，其特征在于，包括如下步骤：1）体外转录获得目的RNA；2）制备寡核苷酸或单个核苷酸磁珠；3）制备目的RNA磁珠；4）捕获目的RNA-蛋白复合物；5）收集目的RNA-蛋白复合物。

进一步，一种基于磁珠的RNA pull down新方法，其特征在于，所述步骤1）体外转录获得目的RNA的方法为：针对不同目的RNA的研究，通过人工设计，合成或引物扩增相应的DNA模板，在获得纯化的DNA模板后通过体外转录、纯化获得目的RNA。

进一步，一种基于磁珠的RNA pull down新方法，其特征在于，所述步骤2）寡核苷酸或单个核苷酸磁珠的制备方法为：将人工合成的寡核苷酸通过直接固定或者间接固定到磁珠上，直接固定不需要预处理直接使用，事先将羧基磁珠通过EDC和NHS活化，与人工合成的带氨基的寡核苷酸或单个核苷酸通过生成酰胺键共价固定到磁珠上；间接固定需要预处理，具体步骤是将生物素标记的寡核苷酸或单个核苷酸与链霉亲和素磁珠在核苷酸捕获缓冲液中孵育，采用旋转混合仪持续混匀，孵育时间为30 min - 120 min，孵育温度为15℃ -37℃，通过生物素与链霉亲和素的亲和力将寡核苷酸或单个核苷酸间接固定至磁珠表面，经过磁分离、洗涤获得寡核苷酸或单个核苷酸磁珠，核苷酸捕获缓冲液包括：10 - 50 mMTris、pH 7.0 - 7.5、0.5 - 1 M NaCl、1 - 5 mM EDTA，洗涤缓冲液包括：10 - 50 mMTris、pH 7.0 - 7.5、10 - 50 mM NaCl、0.1 - 1% 吐温20。

进一步，一种基于磁珠的RNA pull down新方法，其特征在于，所述步骤2）中的寡核苷酸为人工合成的5 - 30个碱基的寡核苷酸，其构成的碱基为A、U、C、G，其末端的1 - 3个碱基上带有氨基或者生物素，具体方法为用带氨基的核苷酸或者带生物素的核苷酸合成寡核苷酸末端的1 - 3个核苷酸；氨基或生物素标记的单个核苷酸，其构成为生物素、磷酸基团、核糖或脱氧核糖、碱基，其中碱基为A、U、C、G，氨基或生物素与碱基之间包含5 - 30个碳原子。

进一步，一种基于磁珠的RNA pull down新方法，其特征在于，所述步骤3）制备目的RNA磁珠复合物的方法为：将步骤2）所得核苷酸磁珠，通过 RNA连接酶在RNA连接缓冲溶液中将目的RNA与磁珠上的核苷酸连接，采用旋转混合仪持续混匀，连接时间为0.5 h - 24h，连接温度为4℃ - 37℃，经过磁分离洗涤获得目的RNA磁珠，RNA连接缓冲溶液包括：10 -50 mM Tris，pH 7.0 - 7.5，10 - 50 mM MgCl₂，1 - 5 mM DTT，10 - 50 mM ATP，0.1 - 1%BSA，10 - 30% PEG 6000或PEG 8000。

进一步，一种基于磁珠的RNA pull down新方法，其特征在于，所述步骤4）捕获目的RNA-蛋白复合物的方法为：将步骤3）得到的目的RNA磁珠在RNA-蛋白结合缓冲溶液中与样品蛋白进行孵育，采用旋转混合仪持续混匀，孵育时间为30 min - 120 min，孵育温度为4℃ - 37℃，经过磁分离洗涤获得目的RNA-蛋白磁珠复合物，RNA-蛋白结合缓冲溶液包括：10 - 50 mM Tris、pH 7.0 - 7.5、0.5 – 1 M NaCl、10 – 50 mM MgCl₂、0.1 - 1% 吐温20。

进一步，一种基于磁珠的RNA pull down新方法，其特征在于，所述步骤5）收集目的RNA蛋白复合物的方法为：将步骤4）得到的目的RNA-蛋白磁珠复合物，如果是直接固定的核苷酸，加入RNA酶A或H进行洗脱；如果是间接固定的核苷酸，加入1 - 5 mM生物素洗脱液进行洗脱；采用旋转混合仪持续混匀，孵育时间为30 min - 120 min，孵育温度为15℃ -37℃，经过磁分离洗涤收集上清即为目的RNA-蛋白复合物，用于后续分析（WB、银染、质谱等）。

附图说明

图1 、RNA pull down示意图

图2 、不同方法RNA pull-down效果图

具体实施方式：

实施例中所用试剂及溶液如下：

生物素标记的寡核苷酸（北京擎科生物）、T4 RNA连接酶及10 × RNA连接反应buffer（Takara）、RNA酶抑制剂（Takara）、30% PEG 6000（Sigma-Aldrich)、无菌无酶水（Solarbio）、RNA Pull Down试剂盒（Waals）、Pierce^TM Magnetic RNA-Protein Pull-DownKit（Thermo）、RNA 3’末端生物素连接试剂盒（Thermo）、HuR单克隆抗体（CST）

实施例1

磁珠准备

1.重悬磁珠，吸取50μL至无酶离心管中。

2.将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

3.用50 μL 20mM Tris重悬磁珠。

4.将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

5.重复步骤3和4。

6.用50 μL 1 × RNA Capture Buffer重悬磁珠。

磁珠与生物素标记的寡核苷酸反应

1.将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

2.用50 μL 1 × RNA Capture Buffer重悬磁珠。

3.加入1 μL Biotinylated Oligonucleotides (50 - 100 pmol/μL)或1 μLBiotinylated Single Nucleotides (50 - 100 pmol/μL)，在旋转混合仪上室温旋转孵育30分钟。

4.将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

5.加入100μL无菌无酶水，温和重悬磁珠。

6.重复步骤3和4。

7.加入100μL无菌无酶水，温和重悬磁珠。

连接

在目的RNA与核苷酸磁珠连接前，将目的RNA置于85℃孵育5分钟，立即置于冰上冷却。

用WaalsTM RNA Ligation Kit提供的试剂按照下表配置成RNA Ligation Mix：

试剂名称	体积 (μL)	终浓度
			10 × RNA Ligase Reaction Buffer	3	1 ×
RNase Inhibitor	1	40U
			Control RNA or Test RNA	6	50pmol
Nuclease-free Water	3	-
			T4 RNA Ligase	2	40U
30% PEG	15	15%
				30

30% PEG须最后加入并充分混匀。

1.将目的RNA在85℃孵育5分钟，立即冰上冷却，以去除其二级结构。

2.将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

3.将30μL RNA Ligation Mix加入上述离心管中，温和混匀。

4.在旋转混合仪上室温旋转反应1-2小时。

5.将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

6.将10 × RNA-Protein Binding Buffer稀释为1 ×，即加入30μL 10 × RNA-Protein Binding Buffer至270μL无菌无酶水中，混匀。

7.加入100μL 1 × RNA-Protein Binding Buffer，温和重悬。

8.将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

9. 重复步骤6和7.

10.加入100μL 1 × RNA-Protein Binding Buffer于离心管中，温和重悬。

用WaalsTM RNA Ligation试剂盒提供的试剂按下表配置成RNA Pull Down Mix：

试剂名称	体积 (μL)	终浓度
			10 × RNA-Protein Binding Buffer	10	1 ×
RNase Inhibitor	2	80U
			50% glycerol	30	-
Lysate (protein conc. >2mg/mL)	30-58	>60μg
			Nuclease-free water	to 100	-
	100

1.将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

2.将100μL RNA Pull Down Mix加入离心管中，温和重悬。

3.在旋转混合仪上室温旋转反应30-60分钟或4℃旋转反应过夜。

4.将离心管置于磁力架上，收集磁珠，将上清液转入新的离心管，可用于后续分析。

5.加入100μL 1 × Wash buffer，温和重悬。

6.将离心管置于磁力架上，收集磁珠弃掉上清液（可转入新的离心管，用于后续分析）。

7.重复步骤5和6，2次。

8.加入100μL 1 × Wash buffer，温和重悬。

9.将离心管置于磁力架上，收集磁珠，将上清液转入新的离心管，可用于后续分析，以观察是否还有残留。

10.加入50μL Elution buffer至离心管中，充分混匀。

11.在旋转混合仪上室温旋转反应30-60分钟。将离心管置于磁力架上，收集上清液至新的离心管中，用于后续分析（WB、银染、质谱等）。

对比例使用Pierce^TM Magnetic RNA-Protein Pull-Down 试剂盒（Thermo），RNA3’末端生物素连接试剂盒（Thermo），具体按照试剂盒说明书步骤操作。

使用本发明实施例和对比例的方法分别验证 YWAHEP5与SERPINB3蛋白相互作用的Pull-down效果，以及5’-CUGGGCUUUUUUUUUCUCUUUCUCUCCUUUCUUUUUCUUCUUCCCUCCCUA-3’与HuR蛋白相互作用的Pull-down效果。图2A、图2B为分别采用本发明方法（Waals^TM RNAPull Down Kit）以及Thermo试剂盒（Pierce^TM Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit）进行RNA pull down的SDS-PAGE效果图及银染效果图，该实验以长链非编码RNA YWHAEP5的正义链为研究对象；YWAHEP5 1和2为两次重复；Washing 1和2为最后一次洗涤上清液，确保已洗净。图2C为采用本发明方法以及Thermo试剂盒行RNA pull down及Western blotting效果图，该实验以核苷酸片段5’-CUGGGCUUUUUUUUUCUCUUUCUCUCCUUUCUUUUUCUUCUUCCCUCCCUA-3’为研究对象，该片段已知与HuR蛋白相互作用；Repeat 1-4为4次重复实验。图2D为采用本发明方法以及Thermo试剂盒进行RNA pull down及Western blotting效果图，该实验以长链非编码RNA YWHAEP5的正义链为研究对象，以其反义链为阴性对照；SERPINB3为新鉴定的与YWHAEP5的正义链相互作用的蛋白。

可见相对于对比例，采用本发明方法具有较高的稳定性且能够获得更多的特异性产物，说明本试剂盒蛋白富集效率更高，灵敏度高，重现性更好。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案和其应用而非限制；本领域普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 重庆范德瓦尔斯生物科技有限公司

<120> 一种基于磁珠的RNA pull down新方法

<140> 2021109725872

<141> 2022-08-24

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 51

<212> RNA

<213> 人工序列(HuR蛋白的RNA片段)

<400> 2

cugggcuuuu uuuuucucuu ucucuccuuu cuuuuucuuc uucccucccu a 51

Claims

1.一种基于磁珠的RNA pull down方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)体外转录获得目的RNA；

2)制备寡核苷酸磁珠；

3)制备目的RNA磁珠；

4)捕获目的RNA-蛋白复合物；

5)收集目的RNA-蛋白复合物；

所述步骤2)寡核苷酸磁珠的制备方法为：将生物素标记的寡核苷酸与链霉亲和素磁珠在核苷酸捕获缓冲液中孵育，采用旋转混合仪持续混匀，孵育时间为30min-120min，孵育温度为15℃-37℃，通过生物素与链霉亲和素的亲和力将寡核苷酸固定至磁珠表面，经过磁分离、洗涤获得寡核苷酸磁珠，核苷酸捕获缓冲液pH 7.0-7.5，包括：10-50mM Tris、0.5-1MNaCl、1-5mM EDTA，洗涤缓冲液pH 7.0-7.5，包括：10-50mM Tris、10-50mM NaCl、0.1％-1％吐温20；

所述步骤2)中的寡核苷酸为人工合成的含5-30个碱基的寡核苷酸，其构成的碱基为A、U、C、G，其末端的1-3个碱基上带有生物素，具体方法为用带生物素的核苷酸合成寡核苷酸末端的1-3个核苷酸；

所述步骤3)制备目的RNA磁珠复合物的方法为：将步骤2)所得核苷酸磁珠，通过RNA连接酶在RNA连接缓冲溶液中将目的RNA与磁珠上的寡核苷酸连接，采用旋转混合仪持续混匀，连接时间为0.5h-24h，连接温度为4℃-37℃，经过磁分离洗涤获得目的RNA磁珠，RNA连接缓冲溶液pH 7.0-7.5，包括：10-50mM Tris，10-50mM MgCl₂，1-5mM DTT，10-50mM ATP，0.1％-1％BSA，10％-30％PEG 6000或PEG 8000；

所述步骤4)捕获目的RNA-蛋白复合物的方法为：将步骤3)得到的目的RNA磁珠在RNA-蛋白结合缓冲溶液中与样品蛋白进行孵育，采用旋转混合仪持续混匀，孵育时间为30min-120min，孵育温度为4℃-37℃，经过磁分离洗涤获得目的RNA-蛋白磁珠复合物，RNA-蛋白结合缓冲溶液pH 7.0-7.5，包括：10-50mM Tris、0.5–1M NaCl、10–50mM MgCl₂、0.1％-1％吐温20。

2.根据权利要求1所述的一种基于磁珠的RNA pull down方法，其特征在于：

所述步骤1)体外转录获得目的RNA的方法为：针对不同目的RNA的研究，通过人工设计，合成或引物扩增相应的DNA模板，在获得纯化的DNA模板后通过体外转录、纯化获得目的RNA。

3.根据权利要求1所述的一种基于磁珠的RNA pull down方法，其特征在于，所述步骤5)收集目的RNA蛋白复合物的方法为：将步骤4)得到的目的RNA-蛋白磁珠复合物，加入1-5mM生物素洗脱液进行洗脱；采用旋转混合仪持续混匀，孵育时间为30min-120min，孵育温度为15℃-37℃，经过磁分离洗涤收集上清即为目的RNA-蛋白复合物，用于后续的蛋白质印迹、银染、质谱分析。