CN112877404A - 一种检测体内rna与dna及蛋白互作的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者互作的试剂盒及其使用方法,包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶,生物素标记的dCTP,阳性探针及阴性探针,细胞裂解液,链霉亲和素磁珠,杂交液,洗液,蛋白酶K及其缓冲液,无RNA酶水,DNA洗脱液,蛋白洗脱液。本发明利用生物素标记的DNA探针抓取特异RNA,并随之获取与RNA互作的蛋白与DNA。首先用交联剂将体内互作的RNA、DNA和蛋白交联在一起,再利用与RNA序列互补且标记生物素的DNA探针与交联后的裂解液孵育,之后用链霉亲和素磁珠捕获RNA、DNA、蛋白互作复合物,最后分别洗脱RNA、蛋白以及DNA。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物领域,尤其涉及一种检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒及其使用方法
背景内容
非编码RNA参与细胞增值、迁移,EMT转化,干细胞分化,细胞凋亡等众多细胞进程的调控,是生物体重要的调控因子。非编码RNA主要包括lncRNA、circRNA、microRNA、eRNA等,这些RNA在胞质中的功能已研究的非常深入。近年来,研究表明,大量非编码RNA,尤其是lncRNA和eRNA,通过参与表观遗传过程来调控细胞进程。
表观遗传指的是在DNA序列不改变的情况下基因表达发生可遗传变化。主要包括DNA甲基化,甲基化、乙酰化等组蛋白修饰以及染色质重构等。在真核生物中,被研究的最清楚的表观调控过程是干细胞分化过程。该过程通过转录因子调控Nanog、Sox2、Oct2三大核心调控因子,进而招募激活复合物或抑制复合物,从而激活或抑制干性相关基因,从而调控干细胞的分化。许多研究表明,这一调控机制也适用于癌症等多种疾病的研究。近年来。非编码RNA作为一种新兴的表观遗传调控分子,被大量研究。研究结果表明,非编码RNA可以直接缠绕在转录因子上或作为支架调控转录因子,从而调控组蛋白与相关沉默或激活复合物,进而调控基因的转录。
非编码RNA与DNA、蛋白的互作是研究RNA参与表观调控的关键。已往的技术是将三者的互作两两分开,先通过RIP或RNA pull down研究RNA与蛋白互作情况,再通过ChIP研究DNA与蛋白互作,最后进行生物统计比较,找到三者互作的蛋白。这种方法既不能统一实验条件,也不能直观的证明三者者的互作,只能通过实验实验推断互作,具有很高的假阳性。很多实验没有阳性对照和阴性对照去评估实验的准确性,实验的可重复性差。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷,本发明的在于克服现有技术的不足,提供一种特异性好、经济、完整的简便检测RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒及其使用方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现:
一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者联合互作的试剂盒及其使用方法,包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶,生物素标记的dUTP,阳性探针及阴性探针,细胞裂解液,链霉亲和素磁珠,杂交液,洗液,蛋白酶K及其缓冲液,无RNA酶水,DNA洗脱液,蛋白洗脱液。本发明利用生物素标记的DNA探针抓取特异RNA,并随之获取与RNA互作的蛋白与DNA。首先用交联剂将体内互作的RNA、DNA和蛋白交联在一起,再利用与RNA序列互补且标记生物素的DNA探针与交联后的裂解液孵育,之后用链霉亲和素磁珠捕获RNA、DNA、蛋白互作复合物,最后分别洗脱RNA、蛋白以及DNA。
进一步地,所述检测RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒,其特征在于,所述的阳性探针为TERC探针,阴性探针为LacZ探针,探针序列如下:
(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
(6)LacZ探针1的核苷酸序列:5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
(7)LacZ探针2的核苷酸序列:5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
(8)LacZ探针3的核苷酸序列:5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
(9)LacZ探针4的核苷酸序列:5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
(10)LacZ探针5的核苷酸序列:5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’
其中TERC探针序列是经过优化的序列,该序列与端粒酶序列互补,且每个序列间隔均匀,间距均在80-100bp之间,探针的GC含量均在45%-55%之间。LacZ为原核生物序列,其探针序列也经过严格优化,选取lacZ序列的中前端序列设计探针,探针间距为200-300bp之间,探针的GC含量均在45%-55%之间。探针数量均为5条,这经过我们严格测定,探针为5条是,捕获效率最高。
所述细胞裂解液的配方包括如下原料:
1~1.5%(W/V)SDS
Tris-Cl 50~100mmol/L
EDTA 10~15mmol/L
PMSF 0.8~1.2mmol/L;
所述Tris-Cl的PH值为7.0~7.5。
其中,SDS是一种离子型强力去垢剂,可以裂解胞膜,1%左右的SDS可以迅速裂解细胞膜及核膜;Tris-HCl作为一种稳定的缓冲液,可以维持稳定的pH值,pH值为7.2~7.5,与细胞正常PH值(7.4左右)保持一致,保持正常的DNA和蛋白形态;EDTA为乙二胺四乙酸,可以和细胞中Mg2+、Mn2+、Zn2+等二价金属离子络合,抑制细胞内多种酶的活性;PMSF为磷酸酶抑制剂,主要抑制磷酸酶的活性。
所述杂交液的配方包括如下原料:
1~1.5%(W/V)SDS
15~20%(V/V)formamide
NaCl 500~750mmol/L
Tris-Cl 50~100mmol/L
EDTA 1~2mmol/L
PMSF 0.8~1.2mmol/L
所述Tris-Cl的PH值为7.0~7.5。
其中,SDS是一种离子型强力去垢剂,可以裂解胞膜,1%左右的SDS可以迅速裂解细胞膜;formamide是去离子甲酰胺,它可以与核酸形成氢键,使DNA或RNA的变性,15~20%的去离子甲酰胺可以使游离的RNA保持变性状态,而DNA则保持双链结构保持,使探针与RNA更好的结合。Tris-HCl作为一种缓冲液,可以维持稳定的pH值,pH值为7.2~7.5,与细胞正常PH值(7.4左右)保持一致,保持正常的DNA和蛋白形态;Nacl作为一种电解质,500~750mmol/L的Nacl,是一个高盐状态,高浓度的Na+可以中和核酸上的电性,促进碱基互补配对作用,从而促进探针与RNA的结合;EDTA为乙二胺四乙酸,可以和细胞中Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等二价金属离子络合,抑制细胞内多种酶的活性;PMSF为磷酸酶抑制剂,主要抑制磷酸酶的活性。
所述蛋白酶K缓冲液的配方包括如下原料:
0.3~0.8%(W/V)SDS
NaCl 100~150mmol/L
Tris-Cl 10~20mmol/L
EDTA 1~2mmol/L
所述Tris-Cl的PH值为两个范围,提取RNA时,Tris-Cl的PH值为6.5-7.0,提取DNA时,Tris-Cl的PH值为8.0~8.5。
其中,SDS是一种离子型强力去垢剂,0.5%左右的SDS可以使蛋白质变性,从而增强蛋白酶K的降解能力;Nacl作为一种电解质,100~150mmol/L的Nacl,维持细胞的正常渗透压;Tris-HCl作为一种缓冲液,可调节PH,RNA为单链核酸,提取应PH为中性,DNA为双链核酸,提取时PH应偏碱性;EDTA为乙二胺四乙酸,可以螯合体系中Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等二价金属离子,增强蛋白酶K的活性。
所述洗液的配方包括如下原料:
0.3~0.8%(W/V)SDS
NaCl 300~400mmol/L
柠檬酸钠30~40mmol/L
其中,SDS是一种离子型强力去垢剂,0.5%左右的SDS可以使蛋白质变性,更好的去除蛋白杂质。Nacl作为一种电解质,300~500mmol/L的Nacl,高于细胞渗透压,是一种高盐状态,高浓度的高浓度的Na+可以中和核酸上的电性,使核酸处于疏水状态,洗脱时可以将更好的将核酸与其他杂质分开。柠檬酸钠可以络合Mg2+、Ca2+、Fe2+等金属离子,还具有较高的溶解度,是一种强碱弱酸盐,是很好的缓冲试剂,维持体系PH的稳定。
所述DNA洗脱液的配方包括如下原料:
0.8~1.2%(W/V)SDS
NaHCO3 50~80mmol/L
其中,SDS是一种离子型强力去垢剂,1%SDS可以降低离心管壁对DNA的吸附作用。NaHCO3是一种强碱弱酸盐,可以维持体系的弱碱性,同时它也是一种良好的缓冲试剂,50~80mmol/L的Na+浓度保护DNA,防止DNA降解。
所述蛋白洗脱液的配方包括如下原料:
220~280mmol/L Tris-HCl;
8.5~11.5%(W/V)SDS;
0.4~0.6%(W/V)溴酚蓝;
45~55%(V/V)甘油;
4~6%(W/V)β-巯基乙醇;
所述Tris-HCL的pH值为6.6~7.0。
其中,10%左右的SDS可以使蛋白变性,并使蛋白均匀带负荷,溴酚蓝,电泳时指示蛋白条带的位置;甘油可增加溶液的粘稠度,上样后,使液体更容易沉淀;5%左右的β-巯基乙醇可以使蛋白变性;蛋白带负电荷,溶液的PH值应保持在偏酸性,所以所述Tris-HCL的pH值调为6.6~7.0。
所述简便检测RNA与DNA、蛋白互作的试剂盒的使用方法,包括如下步骤:
S1生物素标记的DNA探针制备:首先根据RNA序列设计合成DNA探针序列,通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶将生物素标记的dCTP标记到DNA的3’末端。
S2细胞交联,用甲醛或戊二醛对细胞进行交联。
S3细胞裂解:加入细胞裂解液裂解细胞。
S4超声断裂染色质:超声打断染色质,片段长度范围为200~500bp:
S5探针与裂解液孵育:将S1制备好的探针与超声后的裂解液孵育。
S6磁珠孵育:将链霉亲和磁珠与S5中的复合物进行孵育,使RNA以及与其结合的DNA和蛋白通过生物素标记的DNA探针固定在链霉亲和磁珠上,用洗液洗掉未结合的物质。
S7产物获取:产物包括DNA、RNA和蛋白。
步骤S1的具体步骤为:依次加入5X末端转移酶缓冲液10ul,线性DNA 10pmol,生物素标记的dCTP 100pmol,末端脱氧核糖核苷酸转移酶40U,加水至50ul,37℃反应15~30分钟,70℃加热10分钟。
步骤S2的具体步骤为:细胞中加入1%的甲醛或戊二醛,振荡器振荡交联10分钟,加入终浓度为125nmol/L的甘氨酸,终止交联5分钟,PBS洗2次。
在S2步骤中,如果最终获取物是DNA或RNA,交联剂用甲醛,如果最终获取物为蛋白,交联剂用戊二醛,甲醛通过交联反应可以将核酸蛋白等交联在一起,
但甲醛容易形成较大的交联复合物,不适合蛋白交联,戊二醛可以与蛋白巯基、羟基、羧基和氨基反应,使其烷基化,不会形成大的交联复合物,适合蛋白交联。
步骤S3的具体步骤为:收集细胞,每3~5x107个细胞加入1mL细胞裂解液,冰上裂解10分钟。
步骤S4的具体步骤为:将细胞移入超声管中,超声设置为30秒开、30秒关,超声15~20个循环,取10ul超声后的裂解液,加入80μL蛋白酶K缓冲液(PH=8.0),以及10μL蛋白酶K,65℃孵育1~3小时。提取DNA,1%琼脂糖检测片段大小。
在步骤S4中,如果样本不是细胞,而是细菌、真菌或植物组织,建议设置超声梯度,以5个循环为基数,每次增加5个循环,直到将样本超声至合适的片段。
步骤S5的具体步骤为:取10μL作为RNA的input,取10μL作为DNA的input,取10μL作为蛋白的input。将1mL染色质转移至15mL离心管中,加入2mL杂交液,加入100pmol来自S1制备的探针。37℃旋转孵育4~5小时。
步骤S6的具体步骤为:用500μL细胞裂解液清洗链霉亲和素磁珠,每个样品中加入100μL磁珠,37℃孵育30~60分钟,3000rpm离心2分钟去除上清,加入1mL洗液清洗磁珠,离心去上清,重复清洗5次
步骤S7的具体步骤为:获取RNA:向input RNA中加入85μL蛋白酶K缓冲液(pH7.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH 7.0)重悬100μL磁珠。各管加入5μL Proteinease K,50℃孵育45min,RNA提取试剂盒或酚氯仿法提取RNA,用15μL无RNA酶水洗脱RNA。获取DNA:向inputDNA中加入85ul蛋白酶K缓冲液(pH 8.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH 8.0)重悬100μL磁珠。各管加入5ul Proteinease K,50℃孵育45min,DNA提取试剂盒或酚氯仿法提取DNA,用15μLDNA洗脱液洗脱DNA。获取蛋白:向input蛋白及磁珠中直接加入15μL蛋白洗脱液洗脱蛋白。
在步骤S7中,获取不同的产物,要用不同的提取液。因此,一个实验只能获取一中产物,如果要同时获取三种不同的产物,需要同时做三个实验,每个实验获取一种产物。
所述简便检测RNA与DNA、蛋白互作的试剂盒,阳性对照的探针为TERC,阴性对照探针为Lac Z;检测RNA阳性为TERC,检测RNA阴性为GAPDH;检测蛋白阳性为TEBP,蛋白阴性为GAPDH;检测DNA阳性为端粒重复序列,检测阴性DNA为Alu重复序列。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)探针设计灵活,多个探针抓取同一条RNA,大大提高了抓取效率。
(2)通过末端转移酶标记探针,可同时标记多个探针,大大提高标记效率,节约成本。
(3)根据不同目的需求,选择最优的交联剂,最大限度保证结果的可靠性。
(4)可准确获取内源性与RNA互作的蛋白,比RNA pull down结果更能真实反应生物体内RNA与蛋白互作情况
(5)获取的DNA可进行qPCR或测序,灵活性高。
(6)本发明比单独购买合成的末端标记DNA、磁珠和试剂更为经济,可工业化生产;
(7)完整:包含标记和富集组分,阳性对照探针、阴性对照探针及相应的核酸检测引物;
序列表
TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
LacZ探针1的核苷酸序列:5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
LacZ探针2的核苷酸序列:5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
LacZ探针3的核苷酸序列:5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
LacZ探针4的核苷酸序列:5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
LacZ探针5的核苷酸序列:5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’
端粒酶qPCR检测引物:
F:TGTCTAACCCTAACTGAGAAGG
R:CTCTAGAATGAACGGTGGAA
GAPDH检测引物:
F:CCAGAAGACTGTGGATGGCC
R:CATGCCAGTGAGCTTCCC
检测端粒重复序列的dotblot探针序列为:
TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
检测Alu重复序列的dotblot探针序列为:
CACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCAC
附图说明
图1为本发明原理及流程图;
图2为本发明的RNA获取效率检测图
图3为本发明的银染图与传统RNA pull down结果比对图
图4为本发明的蛋白获取检测图
图5为本发明的DNA获取检测图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者联合互作的试剂盒及其使用方法,包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶,生物素标记的dUTP,阳性探针及阴性探针,细胞裂解液,链霉亲和素磁珠,杂交液,洗液,蛋白酶K及其缓冲液,无RNA酶水,DNA洗脱液,蛋白洗脱液。
阳性探针为TERC探针,阴性探针为LacZ探针,探针序列如下:
(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
(6)LacZ探针1的核苷酸序列:5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
(7)LacZ探针2的核苷酸序列:5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
(8)LacZ探针3的核苷酸序列:5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
(9)LacZ探针4的核苷酸序列:5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
(10)LacZ探针5的核苷酸序列:5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’
具体步骤如下:
S1探针制备:依次加入5X末端转移酶缓冲液10ul,线性DNA 10pmol,生物素标记的dCTP100pmol,末端脱氧核糖核苷酸转移酶40U,加水至50ul,37℃反应15~30分钟,70℃加热10分钟。
S2细胞交联:细胞中加入1%的甲醛或戊二醛,交联10分钟,加入终浓度为125nmol/L的甘氨酸,终止交联5分钟,PBS洗2次。
S3:细胞收集:每3~5x107个细胞加入1mL细胞裂解液,冰上裂解10分钟。
S4:染色质超声:将细胞移入超声管中,超声设置为30秒开、30秒关,超声15~20个循环,取10ul超声后的裂解液,加入80μL蛋白酶K缓冲液(PH=8.0),以及10μL蛋白酶K,65℃孵育1~3小时。提取DNA,1%琼脂糖检测片段大小。
S5:探针孵育:超声后的裂解液,取10μL作为RNA的input,将1mL染色质转移至15mL离心管中,加入2mL杂交液,加入100pmol来自S1制备的探针。37℃孵育4~5小时。
S6:磁珠孵育:用500μL细胞裂解液清洗链霉亲和素磁珠,每个样品中加入100μL磁珠,37℃孵育30~60分钟,3000rpm离心2分钟去除上清,加入1mL洗液清洗磁珠,离心去上清,重复清洗5次
S7:提取RNA:向input RNA中加入85ul蛋白酶K缓冲液(pH 7.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH7.0)重悬100ul磁珠。各管加入5ul Proteinease K,50℃孵育45min,RNA提取试剂盒或酚氯仿法提取RNA,用15ul无RNA酶水洗脱RNA。
将上述获得的RNA,进行反转录,再进行qPCR检测,具体如下:
将获得的15ul IP组RNA和input组RNA分别用逆转录试剂盒进行逆转录,获得20ulcDNA,分别取1ul进行qPCR检测,获取探针的捕获效率。
图2为qPCR检测结果,从图2可以看出TERC探针对TERC的富集效率非常高,是阴性探针LacZ的3000倍左右。而LacZ阴性探针的富集则是接近阴性。这说明我们设计的阳性探针与阴性探针是非常有效的。
实施例2
一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者联合互作的试剂盒及其使用方法,包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶,生物素标记的dUTP,阳性探针及阴性探针,细胞裂解液,链霉亲和素磁珠,杂交液,洗液,蛋白酶K及其缓冲液,无RNA酶水,DNA洗脱液,蛋白洗脱液。
阳性探针为TERC探针,阴性探针为LacZ探针,探针序列如下:
(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
(6)LacZ探针1的核苷酸序列:5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
(7)LacZ探针2的核苷酸序列:5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
(8)LacZ探针3的核苷酸序列:5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
(9)LacZ探针4的核苷酸序列:5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
(10)LacZ探针5的核苷酸序列:5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’
具体步骤如下:
S1探针制备:依次加入5X末端转移酶缓冲液10ul,线性DNA 10pmol,生物素标记的dCTP100pmol,末端脱氧核糖核苷酸转移酶40U,加水至50ul,37℃反应15~30分钟,70℃加热10分钟。
S2细胞交联:细胞中加入1%戊二醛,交联10分钟,加入终浓度为125nmol/L的甘氨酸,终止交联5分钟,PBS洗2次。
S3:细胞收集:每3~5x107个细胞加入1mL细胞裂解液,冰上裂解10分钟。
S4:染色质超声:将细胞移入超声管中,超声设置为30秒开、30秒关,超声15~20个循环,取10ul超声后的裂解液,加入80μL蛋白酶K缓冲液(PH=8.0),以及10μL蛋白酶K,65℃孵育1~3小时。提取DNA,1%琼脂糖检测片段大小。
S5:探针孵育:取10μL作为蛋白的input,将1mL染色质转移至15mL离心管中,加入2mL杂交液,加入100pmol来自S1制备的探针。37℃孵育4~5小时。
S6:磁珠孵育:用500μL细胞裂解液清洗链霉亲和素磁珠,每个样品中加入100μL磁珠,37℃孵育30~60分钟,3000rpm离心2分钟去除上清,加入1mL洗液清洗磁珠,离心去上清,重复清洗5次
S7:蛋白洗脱:向input蛋白及磁珠中直接加入15ul蛋白洗脱液洗脱蛋白。
将上述获得的蛋白进行银染、免疫印迹检测、质谱,具体如下:
(1)银染:将洗脱的蛋白样品,取1~3ul,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离蛋白样品,对聚丙烯酰胺凝胶进行银染,蛋白条带显现,对差异蛋白进行分析。
结果如图3所示,其中A为本发明的银染结果,B为RNA pull down实验的银染结果,对比两个结果,可以看出,本发明的实验结果蛋白条带更清洗,阴性探针的背景更低,本实验结果明显优于传统的RNA pull down实验结果。
(2)蛋白斑点杂交:将3ul蛋白提取物点到PVDF膜上,真空抽干,用3%的BSA封闭10分钟,加入一抗,室温孵育2小时,洗膜,加入二抗,室温孵育1小时,洗膜,加发液曝光。
结果如图4所示,阳性探针为TERC探针,阴性探针为LacZ探针。阳性检测蛋白为TEBP端粒酶结合蛋白,阴性检测蛋白为GAPDH甘油醛磷酸脱氢酶。从图中结果,我们可以看出,TERC探针明显捕获到与TERC结合的TEBP蛋白,而阴性探针LacZ明显没有捕获到TEBP蛋白,说明我们的探针捕获与RNA结合蛋白的效率及特异性非常高。
实施例3
一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者联合互作的试剂盒及其使用方法,包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶,生物素标记的dUTP,阳性探针及阴性探针,细胞裂解液,链霉亲和素磁珠,杂交液,洗液,蛋白酶K及其缓冲液,无RNA酶水,DNA洗脱液,蛋白洗脱液。
阳性探针为TERC探针,阴性探针为LacZ探针,探针序列如下:
(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
(6)LacZ探针1的核苷酸序列:5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
(7)LacZ探针2的核苷酸序列:5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
(8)LacZ探针3的核苷酸序列:5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
(9)LacZ探针4的核苷酸序列:5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
(10)LacZ探针5的核苷酸序列:5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’
具体步骤如下:
S1探针制备:依次加入5X末端转移酶缓冲液10ul,线性DNA 10pmol,生物素标记的dCTP100pmol,末端脱氧核糖核苷酸转移酶40U,加水至50ul,37℃反应15~30分钟,70℃加热10分钟。
S2细胞交联:细胞中加入1%甲醛,交联10分钟,加入终浓度为125nmol/L的甘氨酸,终止交联5分钟,PBS洗2次。
S3:细胞收集:每3~5x107个细胞加入1mL细胞裂解液,冰上裂解10分钟。
S4:染色质超声:将细胞移入超声管中,超声设置为30秒开、30秒关,超声15~20个循环,取10ul超声后的裂解液,加入80μL蛋白酶K缓冲液(PH=8.0),以及10μL蛋白酶K,65℃孵育1~3小时。提取DNA,1%琼脂糖检测片段大小。
S5:探针孵育:取10μL作为DNA的input,将1mL染色质转移至15mL离心管中,加入2mL杂交液,加入100pmol来自S1制备的探针。37℃孵育4~5小时。
S6:磁珠孵育:用500μL细胞裂解液清洗链霉亲和素磁珠,每个样品中加入100μL磁珠,37℃孵育30~60分钟,3000rpm离心2分钟去除上清,加入1mL洗液清洗磁珠,离心去上清,重复清洗5次
S7:提取DNA:向input DNA中加入85ul蛋白酶K缓冲液(pH 8.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH8.0)重悬100ul磁珠。各管加入5ul Proteinease K,50℃孵育45min,DNA提取试剂盒或酚氯仿法提取DNA,用15ul无DNA洗脱液洗脱DNA。
将上述获得的DNA,分别取1ul进行斑点杂交检测,或构建DNA文库。
DNA斑点杂交:将1~3ul获取的DNA,点到带正点的尼龙膜上,用鲑鱼精DNA封闭膜10分钟,洗膜,加入探针,37℃孵育1小时,洗膜,加入链霉亲和磁珠-HRP孵育30分钟,加入发光液,曝光显色。
图5为检测结果,阳性探针为TERC探针,阴性探针为LacZ探针。阳性检测DNA为端粒重复序列,阴性检测DNA为Alu重复序列。从图中结果,我们可以看出,TERC探针明显捕获到与TERC结合的端粒重复序列,而阴性探针LacZ明显没有捕获到端粒重复序列,说明我们的探针捕获与RNA结合的DNA的效率及特异性非常高。
序列表
<110> 广州赛诚生物科技有限公司
<120> 一种检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒及其使用方法
<130> 341357421
<140> 2020107989585
<141> 2020-08-12
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
caggcccacc ctccgcaacc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gcaaaagcac ggcgcctacg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ctctagaatg aacggtggaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
gcctccaggc ggggttcggg 20
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
ggctgacaga gcccaactct 20
<210> 6
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<212> DNA
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<400> 6
gccacatatc ctgatcttcc 20
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<400> 7
tcatcgataa tttcaccgcc 20
<210> 8
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<212> DNA
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gaagcagaac aactttaacg 20
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<400> 9
gtatcgctgg atcaaatctg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
gctgatcctt tgcgaatacg 20
Claims (10)
1.一种检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒,其特征在于,包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶,生物素标记的dCTP,阳性探针与阴性探针,细胞裂解液,链霉亲和素磁珠,杂交液,蛋白酶K及其缓冲液,洗液,无RNA酶水,DNA洗脱液,蛋白洗脱液。
2.根据权利要求1所述检测RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒,其特征在于,所述的阳性探针为TERC探针,阴性探针为LacZ探针,探针序列如下:
(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
(6)LacZ探针1的核苷酸序列:5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
(7)LacZ探针2的核苷酸序列:5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
(8)LacZ探针3的核苷酸序列:5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
(9)LacZ探针4的核苷酸序列:5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
(10)LacZ探针5的核苷酸序列:5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’。
3.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒,其特征在于,所述裂解液的配方包括如下原料:
1~1.5%(W/V)SDS
Tris-Cl 50~100mmol/L
EDTA 10~15mmol/L
PMSF 0.8~1.2mmol/L;
所述Tris-Cl的PH值为7.0~7.5。
4.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒,其特征在于,所述杂交液的配方包括如下原料:
1~1.5%(W/V)SDS
15~20%(V/V)formamide
NaCl 500~750mmol/L
Tris-Cl 50~100mmol/L
EDTA 1~2mmol/L
PMSF 0.8~1.2mmol/L
所述Tris-Cl的PH值为7.0~7.5。
5.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒,其特征在于,所述蛋白酶K缓冲液的配方包括如下原料:
0.3~0.8%(W/V)SDS
NaCl 100~150mmol/L
Tris-Cl 10~20mmol/L
EDTA 1~2mmol/L
所述Tris-Cl的PH值为两个范围,提取RNA时,Tris-Cl的PH值为7.0~7.5;提取DNA时,Tris-Cl的PH值为8.0~8.5。
6.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒,其特征在于,所述洗液的配方包括如下原料:
0.3~0.8%(W/V)SDS
NaCl 300~400mmol/L
柠檬酸钠30~40mmol/L。
7.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒,其特征在于,所述DNA洗脱液的配方包括如下原料:
0.8~1.2%(W/V)SDS
NaHCO3 50~80mmol/L。
8.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒,其特征在于,所述蛋白洗脱液的配方包括如下原料:
220~280mmol/L Tris-HCl;
8.5~11.5%(W/V)SDS;
0.4~0.6%(W/V)溴酚蓝;
45~55%(V/V)甘油;
4~6%(W/V)β-巯基乙醇;
所述Tris-HCL的pH值为6.6~7.0。
9.根据权利要求1~8任意一项所述体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1探针制备:首先根据RNA序列设计合成DNA探针序列,通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶将生物素标记的dCTP标记到DNA的3’末端。
S2细胞交联:用甲醛或戊二醛对细胞交联。
S3细胞裂解:加入细胞裂解液裂解细胞。
S4超声断裂染色质:超声打断染色质,片段长度范围为200~500bp:
S5探针与裂解液孵育:将S1制备好的探针与超声后的裂解液孵育。
S6磁珠孵育:将链霉亲和磁珠与S5中的复合物进行孵育,使RNA以及与其结合的DNA和蛋白通过生物素标记的DNA探针固定在链霉亲和磁珠上,用洗液洗掉未结合的物质。
S7产物获取:产物包括DNA、RNA和蛋白。
10.根据权利要求9所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒的使用方法,其特征在于,步骤S1-S7的具体操作如下:
S1探针制备:依次加入5X末端转移酶缓冲液10ul,线性DNA 10pmol,生物素标记的dCTP100pmol,末端脱氧核糖核苷酸转移酶40U,加水至50ul,37℃反应15~30分钟,70℃加热10分钟。
S2细胞交联:细胞中加入1%的甲醛或戊二醛,交联10分钟,加入终浓度为125nmol/L的甘氨酸,终止交联5分钟,PBS洗2次。
S3细胞裂解:每3~5x107个细胞加入1mL细胞裂解液,冰上裂解10分钟。
S4超声断裂染色质:将细胞移入超声管中,超声设置为30秒开、30秒关,超声15~20个循环,取10ul超声后的裂解液,加入80μL蛋白酶K缓冲液(PH=8.0),以及10μL蛋白酶K,65℃孵育1~3小时。提取DNA,1%琼脂糖检测片段大小。
S5探针与裂解液孵育:取10μL作为RNA的input,取10μL作为DNA的input,取10μL作为蛋白的input。将1mL染色质转移至15mL离心管中,加入2mL杂交液,加入100pmol来自S1制备的探针。37℃孵育4~5小时。
S6磁珠孵育:提取用500μL细胞裂解液清洗链霉亲和素磁珠,每个样品中加入100μL磁珠,37℃孵育30~60分钟,3000rpm离心2分钟去除上清,加入1mL洗液清洗磁珠,离心去上清,重复清洗5次
S7产物获取:获取RNA:向input RNA中加入85μL蛋白酶K缓冲液(pH 7.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH 7.0)重悬100ul磁珠。各管加入5μLProteinease K,50℃孵育45min,RNA提取试剂盒或酚氯仿法提取RNA,用15μL无RNA酶水洗脱RNA。获取DNA:向input DNA中加入85μL蛋白酶K缓冲液(pH 8.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH 8.0)重悬100ul磁珠。各管加入5μLProteineaseK,50℃孵育45min,DNA提取试剂盒或酚氯仿法提取DNA,用15μLDNA洗脱液洗脱DNA。获取蛋白:向input蛋白及磁珠中直接加入15μL蛋白洗脱液洗脱蛋白。
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