CN112877404A - 一种检测体内rna与dna及蛋白互作的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者互作的试剂盒及其使用方法，包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶，生物素标记的dCTP，阳性探针及阴性探针，细胞裂解液，链霉亲和素磁珠，杂交液，洗液，蛋白酶K及其缓冲液，无RNA酶水，DNA洗脱液，蛋白洗脱液。本发明利用生物素标记的DNA探针抓取特异RNA，并随之获取与RNA互作的蛋白与DNA。首先用交联剂将体内互作的RNA、DNA和蛋白交联在一起，再利用与RNA序列互补且标记生物素的DNA探针与交联后的裂解液孵育，之后用链霉亲和素磁珠捕获RNA、DNA、蛋白互作复合物，最后分别洗脱RNA、蛋白以及DNA。

Description

一种检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及分子生物领域，尤其涉及一种检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒及其使用方法
背景内容
非编码RNA参与细胞增值、迁移，EMT转化，干细胞分化，细胞凋亡等众多细胞进程的调控，是生物体重要的调控因子。非编码RNA主要包括lncRNA、circRNA、microRNA、eRNA等，这些RNA在胞质中的功能已研究的非常深入。近年来，研究表明，大量非编码RNA，尤其是lncRNA和eRNA，通过参与表观遗传过程来调控细胞进程。
表观遗传指的是在DNA序列不改变的情况下基因表达发生可遗传变化。主要包括DNA甲基化，甲基化、乙酰化等组蛋白修饰以及染色质重构等。在真核生物中，被研究的最清楚的表观调控过程是干细胞分化过程。该过程通过转录因子调控Nanog、Sox2、Oct2三大核心调控因子，进而招募激活复合物或抑制复合物，从而激活或抑制干性相关基因，从而调控干细胞的分化。许多研究表明，这一调控机制也适用于癌症等多种疾病的研究。近年来。非编码RNA作为一种新兴的表观遗传调控分子，被大量研究。研究结果表明，非编码RNA可以直接缠绕在转录因子上或作为支架调控转录因子，从而调控组蛋白与相关沉默或激活复合物，进而调控基因的转录。
非编码RNA与DNA、蛋白的互作是研究RNA参与表观调控的关键。已往的技术是将三者的互作两两分开，先通过RIP或RNA pull down研究RNA与蛋白互作情况，再通过ChIP研究DNA与蛋白互作，最后进行生物统计比较，找到三者互作的蛋白。这种方法既不能统一实验条件，也不能直观的证明三者者的互作，只能通过实验实验推断互作，具有很高的假阳性。很多实验没有阳性对照和阴性对照去评估实验的准确性，实验的可重复性差。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的在于克服现有技术的不足，提供一种特异性好、经济、完整的简便检测RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒及其使用方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者联合互作的试剂盒及其使用方法，包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶，生物素标记的dUTP，阳性探针及阴性探针，细胞裂解液，链霉亲和素磁珠，杂交液，洗液，蛋白酶K及其缓冲液，无RNA酶水，DNA洗脱液，蛋白洗脱液。本发明利用生物素标记的DNA探针抓取特异RNA，并随之获取与RNA互作的蛋白与DNA。首先用交联剂将体内互作的RNA、DNA和蛋白交联在一起，再利用与RNA序列互补且标记生物素的DNA探针与交联后的裂解液孵育，之后用链霉亲和素磁珠捕获RNA、DNA、蛋白互作复合物，最后分别洗脱RNA、蛋白以及DNA。
进一步地，所述检测RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述的阳性探针为TERC探针，阴性探针为LacZ探针，探针序列如下：
(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
(6)LacZ探针1的核苷酸序列：5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
(7)LacZ探针2的核苷酸序列：5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
(8)LacZ探针3的核苷酸序列：5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
(9)LacZ探针4的核苷酸序列：5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
(10)LacZ探针5的核苷酸序列：5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’
其中TERC探针序列是经过优化的序列，该序列与端粒酶序列互补，且每个序列间隔均匀，间距均在80-100bp之间，探针的GC含量均在45％-55％之间。LacZ为原核生物序列，其探针序列也经过严格优化，选取lacZ序列的中前端序列设计探针，探针间距为200-300bp之间，探针的GC含量均在45％-55％之间。探针数量均为5条，这经过我们严格测定，探针为5条是，捕获效率最高。
所述细胞裂解液的配方包括如下原料：
1～1.5％(W/V)SDS
Tris-Cl 50～100mmol/L
EDTA 10～15mmol/L
PMSF 0.8～1.2mmol/L；
所述Tris-Cl的PH值为7.0～7.5。
其中，SDS是一种离子型强力去垢剂，可以裂解胞膜，1％左右的SDS可以迅速裂解细胞膜及核膜；Tris-HCl作为一种稳定的缓冲液，可以维持稳定的pH值，pH值为7.2～7.5，与细胞正常PH值(7.4左右)保持一致,保持正常的DNA和蛋白形态；EDTA为乙二胺四乙酸，可以和细胞中Mg2+、Mn2+、Zn2+等二价金属离子络合，抑制细胞内多种酶的活性；PMSF为磷酸酶抑制剂，主要抑制磷酸酶的活性。
所述杂交液的配方包括如下原料：
1～1.5％(W/V)SDS
15～20％(V/V)formamide
NaCl 500～750mmol/L
Tris-Cl 50～100mmol/L
EDTA 1～2mmol/L
PMSF 0.8～1.2mmol/L
所述Tris-Cl的PH值为7.0～7.5。
其中，SDS是一种离子型强力去垢剂，可以裂解胞膜，1％左右的SDS可以迅速裂解细胞膜；formamide是去离子甲酰胺，它可以与核酸形成氢键，使DNA或RNA的变性，15～20％的去离子甲酰胺可以使游离的RNA保持变性状态，而DNA则保持双链结构保持，使探针与RNA更好的结合。Tris-HCl作为一种缓冲液，可以维持稳定的pH值，pH值为7.2～7.5，与细胞正常PH值(7.4左右)保持一致,保持正常的DNA和蛋白形态；Nacl作为一种电解质，500～750mmol/L的Nacl，是一个高盐状态，高浓度的Na+可以中和核酸上的电性，促进碱基互补配对作用，从而促进探针与RNA的结合；EDTA为乙二胺四乙酸，可以和细胞中Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等二价金属离子络合，抑制细胞内多种酶的活性；PMSF为磷酸酶抑制剂，主要抑制磷酸酶的活性。
所述蛋白酶K缓冲液的配方包括如下原料：
0.3～0.8％(W/V)SDS
NaCl 100～150mmol/L
Tris-Cl 10～20mmol/L
EDTA 1～2mmol/L
所述Tris-Cl的PH值为两个范围，提取RNA时，Tris-Cl的PH值为6.5-7.0，提取DNA时，Tris-Cl的PH值为8.0～8.5。
其中，SDS是一种离子型强力去垢剂，0.5％左右的SDS可以使蛋白质变性，从而增强蛋白酶K的降解能力；Nacl作为一种电解质，100～150mmol/L的Nacl，维持细胞的正常渗透压；Tris-HCl作为一种缓冲液，可调节PH，RNA为单链核酸，提取应PH为中性，DNA为双链核酸，提取时PH应偏碱性；EDTA为乙二胺四乙酸，可以螯合体系中Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等二价金属离子，增强蛋白酶K的活性。
所述洗液的配方包括如下原料：
0.3～0.8％(W/V)SDS
NaCl 300～400mmol/L
柠檬酸钠30～40mmol/L
其中，SDS是一种离子型强力去垢剂，0.5％左右的SDS可以使蛋白质变性，更好的去除蛋白杂质。Nacl作为一种电解质，300～500mmol/L的Nacl，高于细胞渗透压，是一种高盐状态，高浓度的高浓度的Na+可以中和核酸上的电性，使核酸处于疏水状态，洗脱时可以将更好的将核酸与其他杂质分开。柠檬酸钠可以络合Mg2+、Ca2+、Fe2+等金属离子，还具有较高的溶解度，是一种强碱弱酸盐，是很好的缓冲试剂，维持体系PH的稳定。
所述DNA洗脱液的配方包括如下原料：
0.8～1.2％(W/V)SDS
NaHCO3 50～80mmol/L
其中，SDS是一种离子型强力去垢剂，1％SDS可以降低离心管壁对DNA的吸附作用。NaHCO3是一种强碱弱酸盐，可以维持体系的弱碱性，同时它也是一种良好的缓冲试剂，50～80mmol/L的Na+浓度保护DNA，防止DNA降解。
所述蛋白洗脱液的配方包括如下原料：
220～280mmol/L Tris-HCl；
8.5～11.5％(W/V)SDS；
0.4～0.6％(W/V)溴酚蓝；
45～55％(V/V)甘油；
4～6％(W/V)β-巯基乙醇；
所述Tris-HCL的pH值为6.6～7.0。
其中，10％左右的SDS可以使蛋白变性，并使蛋白均匀带负荷，溴酚蓝，电泳时指示蛋白条带的位置；甘油可增加溶液的粘稠度，上样后，使液体更容易沉淀；5％左右的β-巯基乙醇可以使蛋白变性；蛋白带负电荷，溶液的PH值应保持在偏酸性，所以所述Tris-HCL的pH值调为6.6～7.0。
所述简便检测RNA与DNA、蛋白互作的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
S1生物素标记的DNA探针制备：首先根据RNA序列设计合成DNA探针序列，通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶将生物素标记的dCTP标记到DNA的3’末端。
S2细胞交联，用甲醛或戊二醛对细胞进行交联。
S3细胞裂解：加入细胞裂解液裂解细胞。
S4超声断裂染色质：超声打断染色质，片段长度范围为200～500bp：
S5探针与裂解液孵育：将S1制备好的探针与超声后的裂解液孵育。
S6磁珠孵育：将链霉亲和磁珠与S5中的复合物进行孵育，使RNA以及与其结合的DNA和蛋白通过生物素标记的DNA探针固定在链霉亲和磁珠上，用洗液洗掉未结合的物质。
S7产物获取：产物包括DNA、RNA和蛋白。
步骤S1的具体步骤为：依次加入5X末端转移酶缓冲液10ul，线性DNA 10pmol，生物素标记的dCTP 100pmol，末端脱氧核糖核苷酸转移酶40U,加水至50ul，37℃反应15～30分钟，70℃加热10分钟。
步骤S2的具体步骤为：细胞中加入1％的甲醛或戊二醛，振荡器振荡交联10分钟，加入终浓度为125nmol/L的甘氨酸，终止交联5分钟，PBS洗2次。
在S2步骤中，如果最终获取物是DNA或RNA，交联剂用甲醛，如果最终获取物为蛋白，交联剂用戊二醛，甲醛通过交联反应可以将核酸蛋白等交联在一起，
但甲醛容易形成较大的交联复合物，不适合蛋白交联，戊二醛可以与蛋白巯基、羟基、羧基和氨基反应，使其烷基化，不会形成大的交联复合物，适合蛋白交联。
步骤S3的具体步骤为：收集细胞，每3～5x107个细胞加入1mL细胞裂解液，冰上裂解10分钟。
步骤S4的具体步骤为：将细胞移入超声管中，超声设置为30秒开、30秒关，超声15～20个循环，取10ul超声后的裂解液，加入80μL蛋白酶K缓冲液(PH＝8.0),以及10μL蛋白酶K,65℃孵育1～3小时。提取DNA，1％琼脂糖检测片段大小。
在步骤S4中，如果样本不是细胞，而是细菌、真菌或植物组织，建议设置超声梯度，以5个循环为基数，每次增加5个循环，直到将样本超声至合适的片段。
步骤S5的具体步骤为：取10μL作为RNA的input，取10μL作为DNA的input，取10μL作为蛋白的input。将1mL染色质转移至15mL离心管中，加入2mL杂交液，加入100pmol来自S1制备的探针。37℃旋转孵育4～5小时。
步骤S6的具体步骤为：用500μL细胞裂解液清洗链霉亲和素磁珠，每个样品中加入100μL磁珠，37℃孵育30～60分钟，3000rpm离心2分钟去除上清，加入1mL洗液清洗磁珠，离心去上清，重复清洗5次
步骤S7的具体步骤为：获取RNA:向input RNA中加入85μL蛋白酶K缓冲液(pH7.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH 7.0)重悬100μL磁珠。各管加入5μL Proteinease K，50℃孵育45min，RNA提取试剂盒或酚氯仿法提取RNA，用15μL无RNA酶水洗脱RNA。获取DNA：向inputDNA中加入85ul蛋白酶K缓冲液(pH 8.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH 8.0)重悬100μL磁珠。各管加入5ul Proteinease K，50℃孵育45min，DNA提取试剂盒或酚氯仿法提取DNA，用15μLDNA洗脱液洗脱DNA。获取蛋白：向input蛋白及磁珠中直接加入15μL蛋白洗脱液洗脱蛋白。
在步骤S7中，获取不同的产物，要用不同的提取液。因此，一个实验只能获取一中产物，如果要同时获取三种不同的产物，需要同时做三个实验，每个实验获取一种产物。
所述简便检测RNA与DNA、蛋白互作的试剂盒，阳性对照的探针为TERC，阴性对照探针为Lac Z；检测RNA阳性为TERC，检测RNA阴性为GAPDH；检测蛋白阳性为TEBP，蛋白阴性为GAPDH；检测DNA阳性为端粒重复序列，检测阴性DNA为Alu重复序列。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)探针设计灵活，多个探针抓取同一条RNA，大大提高了抓取效率。
(2)通过末端转移酶标记探针，可同时标记多个探针，大大提高标记效率，节约成本。
(3)根据不同目的需求，选择最优的交联剂，最大限度保证结果的可靠性。
(4)可准确获取内源性与RNA互作的蛋白，比RNA pull down结果更能真实反应生物体内RNA与蛋白互作情况
(5)获取的DNA可进行qPCR或测序，灵活性高。
(6)本发明比单独购买合成的末端标记DNA、磁珠和试剂更为经济，可工业化生产；
(7)完整：包含标记和富集组分，阳性对照探针、阴性对照探针及相应的核酸检测引物；
序列表
TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
LacZ探针1的核苷酸序列：5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
LacZ探针2的核苷酸序列：5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
LacZ探针3的核苷酸序列：5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
LacZ探针4的核苷酸序列：5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
LacZ探针5的核苷酸序列：5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’
端粒酶qPCR检测引物：
F：TGTCTAACCCTAACTGAGAAGG
R:CTCTAGAATGAACGGTGGAA
GAPDH检测引物：
F:CCAGAAGACTGTGGATGGCC
R:CATGCCAGTGAGCTTCCC
检测端粒重复序列的dotblot探针序列为：
TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG
检测Alu重复序列的dotblot探针序列为：
CACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGCGGATCAC
附图说明
图1为本发明原理及流程图；
图2为本发明的RNA获取效率检测图
图3为本发明的银染图与传统RNA pull down结果比对图
图4为本发明的蛋白获取检测图
图5为本发明的DNA获取检测图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者联合互作的试剂盒及其使用方法，包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶，生物素标记的dUTP，阳性探针及阴性探针，细胞裂解液，链霉亲和素磁珠，杂交液，洗液，蛋白酶K及其缓冲液，无RNA酶水，DNA洗脱液，蛋白洗脱液。
阳性探针为TERC探针，阴性探针为LacZ探针，探针序列如下：
(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
(6)LacZ探针1的核苷酸序列：5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
(7)LacZ探针2的核苷酸序列：5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
(8)LacZ探针3的核苷酸序列：5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
(9)LacZ探针4的核苷酸序列：5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
(10)LacZ探针5的核苷酸序列：5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’
具体步骤如下：
S1探针制备:依次加入5X末端转移酶缓冲液10ul，线性DNA 10pmol，生物素标记的dCTP100pmol，末端脱氧核糖核苷酸转移酶40U,加水至50ul，37℃反应15～30分钟，70℃加热10分钟。
S2细胞交联:细胞中加入1％的甲醛或戊二醛，交联10分钟，加入终浓度为125nmol/L的甘氨酸，终止交联5分钟，PBS洗2次。
S3：细胞收集：每3～5x107个细胞加入1mL细胞裂解液，冰上裂解10分钟。
S4:染色质超声：将细胞移入超声管中，超声设置为30秒开、30秒关，超声15～20个循环，取10ul超声后的裂解液，加入80μL蛋白酶K缓冲液(PH＝8.0),以及10μL蛋白酶K,65℃孵育1～3小时。提取DNA，1％琼脂糖检测片段大小。
S5：探针孵育：超声后的裂解液，取10μL作为RNA的input，将1mL染色质转移至15mL离心管中，加入2mL杂交液，加入100pmol来自S1制备的探针。37℃孵育4～5小时。
S6:磁珠孵育：用500μL细胞裂解液清洗链霉亲和素磁珠，每个样品中加入100μL磁珠，37℃孵育30～60分钟，3000rpm离心2分钟去除上清，加入1mL洗液清洗磁珠，离心去上清，重复清洗5次
S7:提取RNA:向input RNA中加入85ul蛋白酶K缓冲液(pH 7.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH7.0)重悬100ul磁珠。各管加入5ul Proteinease K，50℃孵育45min，RNA提取试剂盒或酚氯仿法提取RNA，用15ul无RNA酶水洗脱RNA。
将上述获得的RNA，进行反转录，再进行qPCR检测，具体如下：
将获得的15ul IP组RNA和input组RNA分别用逆转录试剂盒进行逆转录，获得20ulcDNA，分别取1ul进行qPCR检测，获取探针的捕获效率。
图2为qPCR检测结果，从图2可以看出TERC探针对TERC的富集效率非常高，是阴性探针LacZ的3000倍左右。而LacZ阴性探针的富集则是接近阴性。这说明我们设计的阳性探针与阴性探针是非常有效的。
实施例2
一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者联合互作的试剂盒及其使用方法，包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶，生物素标记的dUTP，阳性探针及阴性探针，细胞裂解液，链霉亲和素磁珠，杂交液，洗液，蛋白酶K及其缓冲液，无RNA酶水，DNA洗脱液，蛋白洗脱液。
阳性探针为TERC探针，阴性探针为LacZ探针，探针序列如下：
(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
(6)LacZ探针1的核苷酸序列：5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
(7)LacZ探针2的核苷酸序列：5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
(8)LacZ探针3的核苷酸序列：5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
(9)LacZ探针4的核苷酸序列：5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
(10)LacZ探针5的核苷酸序列：5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’
具体步骤如下：
S1探针制备:依次加入5X末端转移酶缓冲液10ul，线性DNA 10pmol，生物素标记的dCTP100pmol，末端脱氧核糖核苷酸转移酶40U,加水至50ul，37℃反应15～30分钟，70℃加热10分钟。
S2细胞交联:细胞中加入1％戊二醛，交联10分钟，加入终浓度为125nmol/L的甘氨酸，终止交联5分钟，PBS洗2次。
S3：细胞收集：每3～5x107个细胞加入1mL细胞裂解液，冰上裂解10分钟。
S4:染色质超声：将细胞移入超声管中，超声设置为30秒开、30秒关，超声15～20个循环，取10ul超声后的裂解液，加入80μL蛋白酶K缓冲液(PH＝8.0),以及10μL蛋白酶K,65℃孵育1～3小时。提取DNA，1％琼脂糖检测片段大小。
S5：探针孵育：取10μL作为蛋白的input，将1mL染色质转移至15mL离心管中，加入2mL杂交液，加入100pmol来自S1制备的探针。37℃孵育4～5小时。
S6:磁珠孵育：用500μL细胞裂解液清洗链霉亲和素磁珠，每个样品中加入100μL磁珠，37℃孵育30～60分钟，3000rpm离心2分钟去除上清，加入1mL洗液清洗磁珠，离心去上清，重复清洗5次
S7:蛋白洗脱：向input蛋白及磁珠中直接加入15ul蛋白洗脱液洗脱蛋白。
将上述获得的蛋白进行银染、免疫印迹检测、质谱，具体如下：
(1)银染：将洗脱的蛋白样品，取1～3ul，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白样品，对聚丙烯酰胺凝胶进行银染，蛋白条带显现，对差异蛋白进行分析。
结果如图3所示，其中A为本发明的银染结果，B为RNA pull down实验的银染结果，对比两个结果，可以看出，本发明的实验结果蛋白条带更清洗，阴性探针的背景更低，本实验结果明显优于传统的RNA pull down实验结果。
(2)蛋白斑点杂交：将3ul蛋白提取物点到PVDF膜上，真空抽干，用3％的BSA封闭10分钟，加入一抗，室温孵育2小时，洗膜，加入二抗，室温孵育1小时，洗膜，加发液曝光。
结果如图4所示，阳性探针为TERC探针，阴性探针为LacZ探针。阳性检测蛋白为TEBP端粒酶结合蛋白，阴性检测蛋白为GAPDH甘油醛磷酸脱氢酶。从图中结果，我们可以看出，TERC探针明显捕获到与TERC结合的TEBP蛋白，而阴性探针LacZ明显没有捕获到TEBP蛋白，说明我们的探针捕获与RNA结合蛋白的效率及特异性非常高。
实施例3
一种检测体内RNA、DNA、蛋白三者联合互作的试剂盒及其使用方法，包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶，生物素标记的dUTP，阳性探针及阴性探针，细胞裂解液，链霉亲和素磁珠，杂交液，洗液，蛋白酶K及其缓冲液，无RNA酶水，DNA洗脱液，蛋白洗脱液。
阳性探针为TERC探针，阴性探针为LacZ探针，探针序列如下：
(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
(6)LacZ探针1的核苷酸序列：5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
(7)LacZ探针2的核苷酸序列：5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
(8)LacZ探针3的核苷酸序列：5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
(9)LacZ探针4的核苷酸序列：5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
(10)LacZ探针5的核苷酸序列：5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’
具体步骤如下：
S1探针制备:依次加入5X末端转移酶缓冲液10ul，线性DNA 10pmol，生物素标记的dCTP100pmol，末端脱氧核糖核苷酸转移酶40U,加水至50ul，37℃反应15～30分钟，70℃加热10分钟。
S2细胞交联:细胞中加入1％甲醛，交联10分钟，加入终浓度为125nmol/L的甘氨酸，终止交联5分钟，PBS洗2次。
S3：细胞收集：每3～5x107个细胞加入1mL细胞裂解液，冰上裂解10分钟。
S4:染色质超声：将细胞移入超声管中，超声设置为30秒开、30秒关，超声15～20个循环，取10ul超声后的裂解液，加入80μL蛋白酶K缓冲液(PH＝8.0),以及10μL蛋白酶K,65℃孵育1～3小时。提取DNA，1％琼脂糖检测片段大小。
S5：探针孵育：取10μL作为DNA的input，将1mL染色质转移至15mL离心管中，加入2mL杂交液，加入100pmol来自S1制备的探针。37℃孵育4～5小时。
S6:磁珠孵育：用500μL细胞裂解液清洗链霉亲和素磁珠，每个样品中加入100μL磁珠，37℃孵育30～60分钟，3000rpm离心2分钟去除上清，加入1mL洗液清洗磁珠，离心去上清，重复清洗5次
S7:提取DNA:向input DNA中加入85ul蛋白酶K缓冲液(pH 8.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH8.0)重悬100ul磁珠。各管加入5ul Proteinease K，50℃孵育45min，DNA提取试剂盒或酚氯仿法提取DNA，用15ul无DNA洗脱液洗脱DNA。
将上述获得的DNA，分别取1ul进行斑点杂交检测，或构建DNA文库。
DNA斑点杂交：将1～3ul获取的DNA，点到带正点的尼龙膜上，用鲑鱼精DNA封闭膜10分钟，洗膜，加入探针，37℃孵育1小时，洗膜，加入链霉亲和磁珠-HRP孵育30分钟，加入发光液，曝光显色。
图5为检测结果，阳性探针为TERC探针，阴性探针为LacZ探针。阳性检测DNA为端粒重复序列，阴性检测DNA为Alu重复序列。从图中结果，我们可以看出，TERC探针明显捕获到与TERC结合的端粒重复序列，而阴性探针LacZ明显没有捕获到端粒重复序列，说明我们的探针捕获与RNA结合的DNA的效率及特异性非常高。
序列表
<110> 广州赛诚生物科技有限公司
<120> 一种检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒及其使用方法
<130> 341357421
<140> 2020107989585
<141> 2020-08-12
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
caggcccacc ctccgcaacc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gcaaaagcac ggcgcctacg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ctctagaatg aacggtggaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
gcctccaggc ggggttcggg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
ggctgacaga gcccaactct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
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<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
tcatcgataa tttcaccgcc 20
<210> 8
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<212> DNA
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gaagcagaac aactttaacg 20
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<400> 9
gtatcgctgg atcaaatctg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
gctgatcctt tgcgaatacg 20

Claims (10)

1.一种检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，包括末端脱氧核糖核苷酸转移酶，生物素标记的dCTP，阳性探针与阴性探针，细胞裂解液，链霉亲和素磁珠，杂交液，蛋白酶K及其缓冲液，洗液，无RNA酶水，DNA洗脱液，蛋白洗脱液。
2.根据权利要求1所述检测RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述的阳性探针为TERC探针，阴性探针为LacZ探针，探针序列如下：
(1)TERC探针1的核苷酸序列:5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’
(2)TERC探针2的核苷酸序列:5’-GCAAAAGCACGGCGCCTACG-3’
(3)TERC探针3的核苷酸序列:5’-CTCTAGAATGAACGGTGGAA-3’
(4)TERC探针4的核苷酸序列:5’-GCCTCCAGGCGGGGTTCGGG-3’
(5)TERC探针5的核苷酸序列:5’-GGCTGACAGAGCCCAACTCT-3’
(6)LacZ探针1的核苷酸序列：5’-GCCACATATCCTGATCTTCC-3’
(7)LacZ探针2的核苷酸序列：5’-TCATCGATAATTTCACCGCC-3’
(8)LacZ探针3的核苷酸序列：5’-GAAGCAGAACAACTTTAACG-3’
(9)LacZ探针4的核苷酸序列：5’-GTATCGCTGGATCAAATCTG-3’
(10)LacZ探针5的核苷酸序列：5’-GCTGATCCTTTGCGAATACG-3’。
3.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述裂解液的配方包括如下原料：
1～1.5％(W/V)SDS
Tris-Cl 50～100mmol/L
EDTA 10～15mmol/L
PMSF 0.8～1.2mmol/L；
所述Tris-Cl的PH值为7.0～7.5。
4.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述杂交液的配方包括如下原料：
1～1.5％(W/V)SDS
15～20％(V/V)formamide
NaCl 500～750mmol/L
Tris-Cl 50～100mmol/L
EDTA 1～2mmol/L
PMSF 0.8～1.2mmol/L
所述Tris-Cl的PH值为7.0～7.5。
5.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K缓冲液的配方包括如下原料：
0.3～0.8％(W/V)SDS
NaCl 100～150mmol/L
Tris-Cl 10～20mmol/L
EDTA 1～2mmol/L
所述Tris-Cl的PH值为两个范围，提取RNA时，Tris-Cl的PH值为7.0～7.5；提取DNA时，Tris-Cl的PH值为8.0～8.5。
6.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述洗液的配方包括如下原料：
0.3～0.8％(W/V)SDS
NaCl 300～400mmol/L
柠檬酸钠30～40mmol/L。
7.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述DNA洗脱液的配方包括如下原料：
0.8～1.2％(W/V)SDS
NaHCO3 50～80mmol/L。
8.根据权利要求1所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒，其特征在于，所述蛋白洗脱液的配方包括如下原料：
220～280mmol/L Tris-HCl；
8.5～11.5％(W/V)SDS；
0.4～0.6％(W/V)溴酚蓝；
45～55％(V/V)甘油；
4～6％(W/V)β-巯基乙醇；
所述Tris-HCL的pH值为6.6～7.0。
9.根据权利要求1～8任意一项所述体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1探针制备：首先根据RNA序列设计合成DNA探针序列，通过末端脱氧核糖核苷酸转移酶将生物素标记的dCTP标记到DNA的3’末端。
S2细胞交联：用甲醛或戊二醛对细胞交联。
S3细胞裂解：加入细胞裂解液裂解细胞。
S4超声断裂染色质：超声打断染色质，片段长度范围为200～500bp：
S5探针与裂解液孵育：将S1制备好的探针与超声后的裂解液孵育。
S6磁珠孵育：将链霉亲和磁珠与S5中的复合物进行孵育，使RNA以及与其结合的DNA和蛋白通过生物素标记的DNA探针固定在链霉亲和磁珠上，用洗液洗掉未结合的物质。
S7产物获取：产物包括DNA、RNA和蛋白。
10.根据权利要求9所述检测体内RNA与DNA及蛋白互作的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤S1-S7的具体操作如下：
S1探针制备：依次加入5X末端转移酶缓冲液10ul，线性DNA 10pmol，生物素标记的dCTP100pmol，末端脱氧核糖核苷酸转移酶40U,加水至50ul，37℃反应15～30分钟，70℃加热10分钟。
S2细胞交联：细胞中加入1％的甲醛或戊二醛，交联10分钟，加入终浓度为125nmol/L的甘氨酸，终止交联5分钟，PBS洗2次。
S3细胞裂解：每3～5x107个细胞加入1mL细胞裂解液，冰上裂解10分钟。
S4超声断裂染色质：将细胞移入超声管中，超声设置为30秒开、30秒关，超声15～20个循环，取10ul超声后的裂解液，加入80μL蛋白酶K缓冲液(PH＝8.0),以及10μL蛋白酶K,65℃孵育1～3小时。提取DNA，1％琼脂糖检测片段大小。
S5探针与裂解液孵育：取10μL作为RNA的input，取10μL作为DNA的input，取10μL作为蛋白的input。将1mL染色质转移至15mL离心管中，加入2mL杂交液，加入100pmol来自S1制备的探针。37℃孵育4～5小时。
S6磁珠孵育：提取用500μL细胞裂解液清洗链霉亲和素磁珠，每个样品中加入100μL磁珠，37℃孵育30～60分钟，3000rpm离心2分钟去除上清，加入1mL洗液清洗磁珠，离心去上清，重复清洗5次
S7产物获取：获取RNA:向input RNA中加入85μL蛋白酶K缓冲液(pH 7.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH 7.0)重悬100ul磁珠。各管加入5μLProteinease K，50℃孵育45min，RNA提取试剂盒或酚氯仿法提取RNA，用15μL无RNA酶水洗脱RNA。获取DNA：向input DNA中加入85μL蛋白酶K缓冲液(pH 8.0)。用蛋白酶K缓冲液(pH 8.0)重悬100ul磁珠。各管加入5μLProteineaseK，50℃孵育45min，DNA提取试剂盒或酚氯仿法提取DNA，用15μLDNA洗脱液洗脱DNA。获取蛋白：向input蛋白及磁珠中直接加入15μL蛋白洗脱液洗脱蛋白。
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