CN107109399A - 显现单个细胞中的修饰的核苷酸和核酸相互作用 - Google Patents

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Abstract

用于显现单个细胞中的特异性核酸序列中的修饰的核苷酸或特异性核酸序列相互作用的方法，其中所述方法包括将原位杂交(ISH)反应与邻近连接测定(PLA)反应偶联。

Description

显现单个细胞中的修饰的核苷酸和核酸相互作用
领域
本公开涉及用于显现单个细胞中的特异性核酸序列中的修饰的核苷酸或特异性核酸序列相互作用的方法。
背景
表观遗传学是指在DNA序列没有改变的情况下发生的基因表达的遗传变化。主要表观遗传过程包括DNA甲基化和组蛋白共价修饰。存在许多技术可用于在分子水平或基因组规模上研究表观遗传标记。然而，需要的是，显现个体细胞中在单个基因组基因座的表观遗传标记的技术。
概述
在本公开的各个方面中，提供了用于显现细胞中特异性核酸序列中的修饰的核苷酸的方法。所述方法包括：a)使制备的细胞与至少一种核酸探针接触，所述至少一种核酸探针用至少一种标记物标记且与该特异性核酸序列互补，其中所述核酸探针与所述特异性核酸序列杂交以形成杂交细胞；b)使所述杂交细胞与第一结合剂和第二结合剂接触，所述第一结合剂结合所述核酸探针的标记物，所述第二结合剂结合所述修饰的核苷酸；和c)通过邻近连接测定法检测所述第一和第二结合剂以显现细胞中的特异性核酸序列中的修饰的核苷酸。在一些实施方案中，制备的细胞是固定的，透化的，并且任选地包含变性的染色体DNA。在其它实施方案中，所述修饰的核苷酸选自5-甲基胞苷、3-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羧基胞苷、1-甲基腺苷、6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、黄嘌呤核苷、肌苷、二氢尿苷或假尿苷或具有2'-O-甲基化的修饰的核糖。在进一步实施方案中，所述特异性核酸序列选自启动子DNA、增强子DNA、CpG岛、编码DNA、内含子DNA、信使RNA、微小RNA、非编码RNA、长非编码RNA、核糖体RNA、转移RNA、小核RNA、小核仁RNA、SmYRNA、YRNA、剪接的前导RNA、端粒酶RNA组分、小干扰RNA、Piwi-相互作用RNA或反式作用RNA。在其它实施方案中，所述标记物是选自生物素、洋地黄毒苷、二硝基苯基、荧光素、二乙基氨基香豆素、罗丹明、花青3、花青5或德克萨斯红的半抗原或染料。在仍然其它实施方案中，所述核酸探针是线性或环状的，包含DNA、RNA、LNA或其组合，并且具有约15个核苷酸至约500个核苷酸的长度。在替代实施方案中，所述细胞是选自真核细胞、哺乳动物细胞、人细胞、正常细胞或癌细胞的个体细胞，或者所述细胞在获得自真核生物的组织样品或流体样品内。在一些实施方案中，其中所述修饰的核苷酸是5-甲基胞苷，并且所述特异性核酸序列是Septin 9启动子。
本公开的另一个方面包括用于显现细胞中的两个核酸序列之间的相互作用的方法。所述方法包括：a)使制备的细胞与第一核酸探针和第二核酸探针接触，所述第一核酸探针包含第一标记物且与第一核酸序列具有互补性，所述第二核酸探针包含第二标记物且与第二核酸序列具有互补性，其中所述第一和第二标记物是不同的，并且所述第一和第二核酸探针分别与所述第一和第二核酸序列杂交；b)使所述细胞与结合所述第一标记物的第一结合剂和结合所述第二标记物的第二结合剂接触；和c)通过邻近连接测定法检测所述第一和第二结合剂以显现所述细胞中的两个核酸序列之间的相互作用。在一些实施方案中，所述制备的细胞是固定的，透化的，并且任选地包含变性的染色体DNA。在其它实施方案中，所述修饰的核苷酸选自5-甲基胞苷、3-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羧基胞苷、1-甲基腺苷、6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、黄嘌呤核苷、肌苷、二氢尿苷或假尿苷或具有2'-O-甲基化的修饰的核糖。在进一步实施方案中，所述特异性核酸序列选自启动子DNA、增强子DNA、CpG岛、编码DNA、内含子DNA、信使RNA、微小RNA、非编码RNA、长非编码RNA、核糖体RNA、转移RNA、小核RNA、小核仁RNA、SmY RNA、Y RNA、剪接的前导RNA、端粒酶RNA组分、小干扰RNA、Piwi-相互作用RNA或反式作用RNA。在其它实施方案中，所述标记物是选自生物素、洋地黄毒苷、二硝基苯基、荧光素、二乙基氨基香豆素、罗丹明、花青3、花青5或德克萨斯红的半抗原或染料。在仍然其它实施方案中，所述核酸探针是线性或环状的，包含DNA、RNA、LNA或其组合，并且具有约15个核苷酸至约500个核苷酸的长度。在替代实施方案中，所述细胞是选自真核细胞、哺乳动物细胞、人细胞、正常细胞或癌细胞的个体细胞，或者所述细胞在获得自真核生物的组织样品或流体样品内。
下面详述本公开的其它方面和特征。
附图简述
本专利或申请文件含有至少一个以颜色绘制的图。本专利或专利申请公开的具有彩图的拷贝在要求和支付必要费用后由专利和商标局提供。
图1概述了原位杂交–邻近连接测定(ISH-PLA)方案。
图2代表SEPTIN9启动子的序列和设计用于靶向SEPTIN 9启动子的CpG岛(以斜体显示)周围的启动子区域的18个寡核苷酸探针的位置(加下划线)。
图3A、图3B和图3C说明前列腺癌细胞(DU145)中SEPTIN 9启动子甲基化的可视化。图3A显示用DAPI染色的与LacZ探针(无PLA信号)孵育的对照前列腺癌(DU145)细胞。图3B和图3C显示与SEPTIN 9寡核苷酸探针孵育的细胞。PLA信号以红色显示。每个核两个红点代表SEPTIN 9所定位的DU145细胞中染色体17的二倍体数目。图3B呈现PLA信号和DAPI染色的叠加。图3C呈现PLA信号和微分干涉差(DIC)的叠加。
图4A和4B显示结肠癌细胞(SW480)中的SEPTIN 9启动子甲基化。PLA信号以红色显示。每个核三个红点代表SEPTIN 9所定位的SW480细胞中染色体17的三倍体数目。图4A显示PLA信号和DAPI叠加。图4B呈现DIC和PLA信号叠加。
图5说明在SW480细胞的5-AzaC处理后SEPTIN 9启动子甲基化减少。若干药物处理的细胞在改变的细胞形状方面显示细胞毒性作用，其导致PLA探针的捕获，并且是在若干细胞中观察到的弥漫性非特异性红色荧光的原因。
详述
本公开提供了用于显现单个细胞中的特异性核酸序列中的修饰的核苷酸或特异性核酸序列和蛋白或其它特异性核酸序列之间的相互作用的方法。所述方法包括将原位杂交(ISH)反应与邻近连接测定(PLA)反应偶联，并且可用于显现个体细胞中的单个基因组基因座处的表观遗传学标记，诸如DNA甲基化。许多疾病，诸如癌症，与异常启动子超甲基化相关。因此，本文公开的方法可用于在正常细胞背景下检测癌细胞和/或用作筛选癌症活检组织样品的诊断工具。
I.用于显现细胞中的修饰的核苷酸的方法
本公开的一个方面提供了用于显现细胞中的目标核酸序列中的修饰的核苷酸的方法。所述方法包括使制备的细胞与至少一种核酸探针接触，所述至少一种核酸探针用至少一种标记物标记且与目标特异性核酸序列互补，其中所述核酸探针与特异性核酸序列杂交。所述方法还包括使所述细胞与结合所述核酸探针的标记物的第一结合剂和结合所述目标修饰的核苷酸的第二结合剂接触。最后，所述方法包括通过邻近连接测定法检测所述第一和第二结合剂以显现细胞中的目标特异性核酸序列中的修饰的核苷酸。
(a)步骤A–使标记的探针与特异性核酸杂交
所述方法的第一步包括原位杂交反应。该步骤包括使制备的细胞与至少一种核酸探针接触，所述至少一种核酸探针用至少一种标记物标记且与特异性核酸序列具有互补性，使得所述核酸探针与包含所述修饰的核苷酸的特异性核酸序列杂交。
(i)修饰的核苷酸
本文公开的方法可用于检测和显现各种修饰的核苷酸。所述修饰的核苷酸可以在DNA或RNA内，并且所述核苷酸可以通过甲基化、羟基化、乙酰化、甲酰化、酰化、羧化、硫醇化、烷基化、胺化、酯化、磷酸化或其组合进行修饰。修饰的核苷酸的具体实例包括5-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羧基胞苷、3-甲基胞苷、N4-甲基胞苷、N4-乙酰基胞苷、2-硫代胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、N6,N6,N6-三甲基腺苷、N6-异戊基(isopenyl)腺苷、2-甲硫基-N6-异戊基腺苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、N2,N2,N2-三甲基鸟苷、7-甲基鸟苷、黄嘌呤核苷、肌苷、1-甲基肌苷、二氢尿苷、假尿苷、1-甲基假尿苷、3-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基尿苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、尿苷-5-氧基乙酸甲酯、尿苷-5-氧基乙酸、5-甲基-2-硫代尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、丁氧核苷(wybutoxosine)、怀丁苷(wybutosine)、辫苷(queuosine)、核糖基胸腺嘧啶、嘧啶二聚体和标准或修饰的核糖核苷酸的2'-O-甲基衍生物。在具体实施方案中，所述修饰的核苷酸是5-甲基胞苷。
(ii)特异性核酸序列
包含修饰的核苷酸的特异性核酸序列可以并且将变化。合适的核酸序列的非限制性实例包括染色体DNA、DNA的转录控制区、启动子DNA、CpG、增强子DNA、沉默子DNA、DNA的基因座控制区、蛋白编码DNA、内含子DNA、RNA编码DNA、附加体DNA、病毒RNA、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、非编码RNA(ncRNA)、长非编码RNA(lncRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、SmY RNA、Y RNA、剪接的前导RNA(SLRNA)、端粒酶RNA组分(TERC)、小干扰RNA(siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)或反式作用RNA(rasiRNA)。
包含修饰的核苷酸的特异性核酸序列的特征可以且将变化，条件是所有或部分特异性核酸序列的序列是已知的。在一些实施方案中，所述特异性核酸序列可以是编码与疾病或病症相关的蛋白的染色体序列(即，基因)的区域，所述疾病或病症与异常基因表达相关。异常基因表达可以与超甲基化或低甲基化启动子控制区相关。与异常基因表达相关的疾病或病症的非限制性实例包括癌症(例如结肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、脑癌、神经胶质瘤、白血病、黑色素瘤、前列腺癌和头颈癌)，自身免疫性疾病(诸如1型糖尿病、炎性肠病)，炎性疾病(诸如哮喘)和代谢性疾病。例如，与癌症相关的基因的非限制性实例包括Septin 9、ATM、APC、BRCA1、BRCA2、CDH1、E-Cad、CDKN2B、DAPK、FANCB、FANCF、GATA-4、GATA-5、GSTP1、HER2、HIC1、MGMT、MLH1、MSH2、MSH4、NEIL1、PITX2、p14ARF、p15INK4B、p16INK4A、p53、p73、RAD51C、RASSF1、RB、TIMP3、VHL和WRN。与自身免疫性或炎性疾病或病症相关的基因的实例包括但不限于AAA1、ABCB1、ARTS-1、ATG16L1、BSN、CLSTN3、CTLA4、ERBB3、FCER1A、GSTP1、GSDML、HLA、HLA-DQA1、IFIH1、IL2Ra、IL23R、IBD5、IRGM、JAZF1、KIQQ1109、LNPEP、LPP、MYO9B、MST、NKKX2-3、NELL1、NOD2、NOTCH2、PLA2G7、PPATG、PTPN2、RGS1、SH2B3、TAGAP、THADA、TNF和WSF1。在其它实施方案中，所述修饰的核苷酸可以在特异性mRNA序列(例如，任何上面列出的基因的转录物)中，在特异性miRNA(例如，与结肠癌相关的miRNA包括miR-551a、miR-552、miR-138、miR-451、miR-144、miR548h、miR-658、miR-595、miR-338-3p等)或特异性lncRNA(例如RepA、HOTAIR、Airnm、Kcnq1ot1、Evf-2、HSR1、SRA、NRON、MALAT1、NEAT2等)中。
(iii)核酸探针
所述方法中使用的一种或多种核酸探针用至少一种标记物标记，并且与包含所述修饰的核苷酸的特异性核酸序列具有互补性。所述核酸探针可以是DNA、RNA、LNA、PNA或其组合；可以包含标准核苷酸或核苷酸类似物；并且可以包含标准的糖-磷酸酯骨架或修饰的骨架(例如硫代磷酸酯)。所述核酸探针可以是单链的，或者所述核酸探针可以是双链的(并且在使用前变性)。所述核酸探针可以是线性或环状的，并且可以包含二级结构(例如发夹、环、茎、凸起等)。
所述核酸探针的长度可以变化。例如，所述核酸探针可以是范围为约10个核苷酸的长度至数千个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所述核酸探针可以为约10至30个核苷酸的长度，约15至25个核苷酸的长度，或约20个核苷酸的长度。在其它实施方案中，所述核酸探针的长度可以为约15至500个核苷酸，约30至100个核苷酸，约100至300个核苷酸，约300至约1000个核苷酸，或约1000至约10000个核苷酸。因此，在各个实施方案中，所述核酸探针的长度可以为约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10000个核苷酸，或落在上述整数的给定相邻集合之间的任何整数(例如，11、12、13或14、16、17、18或19；21、22、23或24等等)。
所述核酸探针用至少一种标记物标记。所述标记物可以是半抗原或染料。合适的半抗原和染料的非限制性实例包括生物素、洋地黄毒苷、二硝基苯基、荧光素、二乙基氨基香豆素、罗丹明、花青3、花青5和德克萨斯红。在一些实施方案中，所述标记物可以位于核酸探针的5'-末端或3'-末端。例如，所述标记物可以经由接头(例如四乙二醇(TEG)间隔物、聚乙二醇(PEG)间隔物、C6接头或本领域已知的另一接头)附接至核酸探针的任一末端。在其它实施方案中，所述标记物可以位于整个核酸探针中，即所述核酸探针可以包含标记的核苷酸。
可以化学或酶促合成所述核酸探针。在一个实施方案中，可以使用标准亚磷酰胺固相合成技术来合成所述核酸探针。所得探针可以使用标准程序用标记物末端标记。在另一个实施方案中，标记的DNA探针可以通过在标记的核苷酸(例如标记的dATP或标记的dCTP)存在的情况下通过切口平移来合成。在又一个实施方案中，标记的RNA探针可以在使用标记的核糖核苷酸(例如标记的UTP)存在的情况下通过体外转录来合成。
所述核酸探针被设计为与目标特异性核酸具有互补性(即，可以与目标特异性核酸碱基配对)。在各个实施方案中，所述核酸探针可以与目标特异性核酸具有约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列互补性。在具体实施方案中，所述核酸探针与目标特异性核酸具有至少约90％或95％的序列互补性。
在一些实施方案中，所述核酸探针包含短核酸序列的群体，其中每个短核酸序列与目标特异性核酸的相邻区域一般具有互补性，使得在杂交后，所述核酸探针在目标特异性核酸上“拼贴”。在其它实施方案中，所述核酸探针是在整个探针长度上包含标记的核苷酸的较长核酸序列。
(iv)细胞
各种细胞可以用于本文公开的方法中。通常，所述细胞是真核细胞。在各个方面，所述细胞可以是人细胞、非人哺乳动物细胞、非哺乳动物脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞或单细胞真核生物。所述细胞可以是正常细胞、异常细胞或癌细胞。所述细胞可以是原代细胞或细胞系细胞。所述细胞可以是成体细胞或胚胎细胞(例如胚胎)。在还有其它方面，所述细胞可以是干细胞。合适的干细胞包括但不限于胚胎干细胞、ES样干细胞、胎儿干细胞、成体干细胞、多能(pluripotent)干细胞、诱导的多能(pluripotent)干细胞、多能(multipotent)干细胞、寡能(oligopotent)干细胞、单能(unipotent)干细胞等。在示例性方面，所述细胞是哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，所述细胞可以是人细胞系细胞。合适的细胞系的非限制性实例包括DU145(转移癌)、SW490(结肠癌)、DLD-1(结肠癌)、KM20L2(结肠癌)、COLO 205(结肠癌)、HCC-2998(结肠癌)、HCT-116(结肠癌)、HCT-15(结肠癌)、HT29(结肠癌)、KM12(结肠癌)、SW-620(结肠癌)、SF-268(CNS)、SF-295(CNS)、SF-539(CNS)、SNB-19(CNS)、SNB-75(CNS)、U251(CNS)、CCRF-CEM(白血病)、HL-60(TB)(白血病)、K-562(白血病)、MOLT-4(白血病)、RPMI-8226(白血病)、SR(白血病)、A549(非小细胞肺癌)、EKVX(非小细胞肺癌)、HOP-62(非小细胞肺癌)、HOP-92(非小细胞肺癌)、NCI-H226(非小细胞肺癌)、NCI-H23(非小细胞肺癌)、NCI-H322M(非小细胞肺癌)、NCI-H460(非小细胞肺癌)、NCI-H522(非小细胞肺癌)、LOXIMVI(黑色素瘤)、MALME-3M(黑色素瘤)、M14(黑色素瘤)、MDA-MB-435(黑色素瘤)、SK-MEL-2(黑色素瘤)、SK-MEL-28(黑色素瘤)、SK-MEL-5U(黑色素瘤)、ACC-257(黑色素瘤)、UACC-62(黑色素瘤)、IGR-OV1(卵巢)、OVCAR-3(卵巢)、OVCAR-4OVCAR-5(卵巢)、OVCAR-8(卵巢)、SK-OV-3(卵巢)、786-0(肾)、A498(肾)、ACHN(肾)、CAKI-1(肾)、RXF 393(肾)、SN12C(肾)、TK-10(肾)、UO-31(肾)、PC-3(前列腺)、DU-145(前列腺)、MCF7(乳腺)、MDA-MB-231(乳腺)、MDA-MB-468(乳腺)、HS578T(乳腺)、BT-549(乳腺)和T-47D(乳腺)。
在其它实施方案中，所述细胞可以是哺乳动物细胞系细胞。合适的哺乳动物细胞系的非限制性实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞；小鼠骨髓瘤NS0细胞、小鼠胚胎成纤维细胞3T3细胞(NIH3T3)、小鼠B淋巴瘤A20细胞；小鼠黑色素瘤B16细胞；小鼠成肌细胞C2C12细胞；小鼠骨髓瘤SP2/0细胞；小鼠胚胎间充质C3H-10T1/2细胞；小鼠癌CT26细胞、小鼠前列腺DuCuP细胞；小鼠乳腺EMT6细胞；小鼠肝癌Hepa1c1c7细胞；小鼠骨髓瘤J5582细胞；小鼠上皮MTD-1A细胞；小鼠心肌MyEnd细胞；小鼠肾RenCa细胞；小鼠胰腺RIN-5F细胞；小鼠黑色素瘤X64细胞；小鼠淋巴瘤YAC-1细胞；大鼠成胶质细胞瘤9L细胞；大鼠B淋巴瘤RBL细胞；大鼠神经母细胞瘤B35细胞；大鼠肝癌细胞(HTC)；水牛大鼠肝脏BRL 3A细胞；犬肾细胞(MDCK)；犬乳腺(CMT)细胞；大鼠骨肉瘤D17细胞；大鼠单核细胞/巨噬细胞DH82细胞；猴肾SV-40转化的成纤维细胞(COS7)细胞；猴肾CVI-76细胞；非洲绿猴肾(VERO-76)细胞；和人胚胎肾细胞(HEK293，HEK293T)。哺乳动物细胞系的广泛列表可见于美国典型培养物保藏中心目录(ATCC,Manassas,VA)中。
在仍然其它实施方案中，所述细胞可以在从受试者获得的组织样品或流体样品内。例如，可以通过手术切除、切除活检、切口活检、核心活检或针抽吸活检来移除组织样品或流体样品。所述受试者可以是人、非人哺乳动物(例如啮齿动物、猫、狗、家畜动物等)或非哺乳动物脊椎动物(例如鱼、鸟等等)。所述组织样品可以冷冻或使用固定剂固定，如下所详述。固定的组织样品可以包埋入包埋介质诸如石蜡、塑化石蜡(paraplast)或类似的包埋介质中。
(v)制备细胞
通过固定细胞、透化细胞和任选地使细胞的染色体DNA变性来制备细胞用于原位杂交。各种固定剂可用于固定或交联细胞。合适的固定剂的实例包括丙酮、乙酸、乙醇、甲醛(或福尔马林，甲醛的37％水溶液)、戊二醛、碘仿、乳酸、甲醇、多聚甲醛、苦味酸及其组合。在具体实施方案中，所述固定剂可以是多聚甲醛。固定剂的浓度和固定过程的持续时间将根据细胞的类型(例如，细胞系细胞或组织中的细胞)而变化。
通过与包含至少一种表面活性剂和/或蛋白酶的溶液孵育来透化固定的细胞。合适的表面活性剂的非限制性实例包括Tween-20、Tween-80、Triton X-100、鲸蜡醇、癸基葡糖苷、毛地黄皂苷、十二烷基葡糖苷、IGEPAL CA-630、leucoperm、NP-40、壬苯醇醚-9、八乙二醇单十二烷基醚、正辛基β-D-硫代吡喃葡糖苷、油醇、辛基葡糖苷、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、皂苷、硬脂醇或其组合。合适的蛋白酶包括但不限于蛋白酶K、半胱天冬酶(caspase)、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶。在一些实施方案中，将细胞与包含Tween-20和/或TritonX-100的溶液一起孵育。表面活性剂或蛋白酶的浓度和孵育期的持续时间可以且将根据细胞、组织或流体的类型而变化。
在其中包含修饰的核苷酸的特异性核酸序列是双链的实施方案中，使所述细胞与变性溶液接触以将双链核酸转化为单链核酸。所述变性溶液可以是酸性的或者其可以是碱性的。酸性溶液包含酸诸如盐酸，且碱性溶液包含碱诸如碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠或氢氧化钾)。变性溶液中酸或碱的浓度和变性步骤的持续时间可以且将根据细胞、组织或流体的类型而变化。
在核酸变性后，所述细胞可以与蛋白酶接触以从核酸除去蛋白，由此使特异性核酸更易接近核酸探针。合适的蛋白酶的非限制性实例包括半胱天冬酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶及其组合。蛋白酶的浓度和孵育期的持续时间可以且将根据细胞、组织或流体的类型而变化。
在一些实施方案中，所述细胞可以在组织样品内或组织样品的切片内。所述样品可以是冷冻样品或福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。在样品是冷冻样品的情况下，可以将细胞固定和透化，可以将染色体DNA变性，并且可以基本如上所述使细胞与蛋白酶接触。在样品是FFPE样品的情况下，可以使用二甲苯或其它有机溶剂将样品脱蜡，可以将细胞透化，可以将染色体DNA变性，并且可以基本如上所述使细胞与蛋白酶接触。
(vi)杂交
所述方法包括使制备的细胞与标记的核酸探针接触以形成杂交的细胞，其中标记的核酸探针与包含修饰的核苷酸的特异性核酸序列进行碱基配对。为此，将制备的细胞与标记的核酸探针在允许在标记的核酸探针和目标核酸序列之间的细胞内(原位)杂交的条件下孵育。原位杂交方法和原位杂交溶液是本领域已知的。在具体实施方案中，所述杂交溶液可以含有50％甲酰胺、10％Ficoll 400、0.1％SDS和2X SSC(氯化钠-柠檬酸钠)。杂交反应的温度和持续时间可以根据细胞或组织的类型而变化。例如，在其中细胞是培养细胞的实施方案中，所述杂交可以在约37℃下进行约16小时。
(b)步骤B-结合第一和第二结合剂
所述方法还包括使包含杂交的核酸探针-特异性核酸序列复合物的杂交细胞与结合所述核酸探针的标记物的第一结合剂和结合目标修饰核苷酸的第二结合剂接触。第一和第二结合剂各自独立地可以是蛋白、抗体(例如单克隆抗体或多克隆抗体)、抗体片段(例如Fc片段或Fab片段)、核酸或适体。在具体实施方案中，所述第一和第二结合剂各自为抗体，其中各抗体在不同的物种中制备。例如，所述第一结合剂可以是识别所述标记的核酸探针中的标记物的兔多克隆抗体，且所述第二结合剂可以是识别所述修饰的核苷酸的小鼠单克隆抗体。用于使细胞与抗体孵育的方法是本领域技术人员众所周知的，合适的溶液同样如此(例如封闭溶液、漂洗或洗涤溶液、孵育溶液等)。
(c)步骤C-检测第一和第二结合剂
所述方法还包括检测紧密邻近的第一和第二结合剂。所述第一结合剂结合杂交的核酸探针的标记物，且所述第二结合剂结合细胞内的各个和每个修饰的核苷酸。为了检测与杂交的核酸探针-特异性核酸序列复合物结合的第一和第二结合剂(并因此检测目标特异性核酸序列中的修饰的核苷酸)，邻近连接测定法(PLA)用于检测紧密邻近(即在约40nm内，Gomez等人,2013,Nature Methods,10(2):171-177)的第一和第二结合剂。PLA试剂盒是商售的(例如，Sigma-Aldrich)。可以使用标准荧光显微镜和图像分析软件程序检测和分析PLA信号。
(d)具体实施方案
在一个实施方案中，所述修饰的核苷酸可以是5-甲基胞苷，所述特异性核酸序列可以是Septin 9启动子DNA，并且所述细胞可以是人癌细胞(例如结肠癌细胞)。所述特异性核酸序列可以用生物素标记，且所述第一结合剂可以是在兔中产生的抗生物素多克隆抗体。所述第二结合剂可以是在小鼠中产生的抗5-甲基-胞嘧啶单克隆抗体。
II.用于显现细胞中的核酸相互作用的方法
本公开的另一个方面提供了用于显现细胞中的特异性核酸之间的相互作用的方法。所述方法包括使制备的细胞与第一核酸探针和第二核酸探针接触，所述第一核酸探针包含第一标记物且与第一核酸序列具有互补性，所述第二核酸探针包含第二标记物且与第二核酸序列具有互补性，其中所述第一和第二标记物是不同的，并且所述第一和第二核酸探针分别与所述第一和第二核酸序列杂交。所述方法还包括使所述细胞与结合所述第一标记物的第一结合剂和结合所述第二标记物的第二结合剂接触，且然后通过邻近连接测定法检测所述第一和第二结合剂以显现所述细胞中的两个核酸之间的相互作用。
可以使用公开的方法检测各种核酸相互作用。非限制性实例包括RNA和DNA之间的相互作用(例如，在转录、复制、重组、修复或另一种核过程期间非编码RNA或功能性RNA与特异性染色体序列相互作用)，不同类别的RNA之间的相互作用(例如，在RNA加工、剪接、翻译、核转位和其它细胞事件期间)。如上在部分I(a)(ii)中详述了合适核酸的实例。
第一和第二核酸探针各自基本上如上文在部分I(a)(iii)中所述，然而第一和第二核酸探针各自用不同的标记物标记。在一个实施方案中，所述第一核酸探针可以用生物素标记，并且所述第二核酸探针可以用洋地黄毒苷标记。在另一个实施方案中，所述第一核酸探针可以用生物素标记，并且所述第二核酸探针可以用荧光素(例如，异硫氰酸荧光素，FITC)标记。
由于可以在不背离本发明的范围的情况下在上述方法中进行各种改变，所以意欲应当将上述描述和下面给出的实施例中含有的所有内容解释为说明性的而不是在限制性意义上解释。
定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编辑,1988)；The Glossary of Genetics,第5版,R.Rieger等人(编辑),Springer Verlag(1991)；和Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。除非另有规定，如本文所使用，以下术语具有认为属于它们的含义。
当引入本公开的要素或其优选方面时，冠词“一个”、“一种”、“该”和“所述”意指存在该要素中的一个或多个。术语“包含”、“包括”和“具有”意在是包括性的，并且意味着除了所列要素之外可以存在额外要素。
如本文所使用，术语“互补”或“互补性”是指通过经由特异性氢键的碱基配对的双链核酸的缔合。碱基配对可以是标准的Watson-Crick碱基配对(例如，5’-A G T C-3’与互补序列3’-T C A G-5’配对)。碱基配对也可以是Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键键合。通常相对于双链体区域测量互补性，因此例如排除突出端。如果只有一些碱基对是互补的，则双链体区域的两条链之间的互补性可以是部分的并且表示为百分比(例如，70％)。不互补的碱基是“错配的”。如果双链体区域的所有碱基对都是互补的，则互补性也可以是完全的(即，100％)。
术语“CpG岛”是指CpG位点簇，其中CpG位点是指DNA区域，其中线性碱基序列中沿其长度胞嘧啶核苷酸靠近鸟嘌呤核苷酸存在，其中“CpG”是“-C-磷酸酯-G-”键的缩写，即由单个磷酸酯分开的胞嘧啶和鸟嘌呤。
如本文所使用的“基因”是指编码基因产物的DNA区域(包括外显子和内含子)以及调节基因产物产生的所有DNA区域，无论此类调控序列是否邻近于编码和/或转录序列。因此，基因包括但不必限于启动子序列、终止子、翻译调节序列诸如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、隔离子(insulator)、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区域。
术语“核酸”和“多核苷酸”是指线形或环形构型和单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。为了本公开的目的，这些术语不应被解释为就聚合物的长度而言是限制性的。该术语可以包括天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸酯部分(例如硫代磷酸酯骨架)中修饰的核苷酸。通常，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即A的类似物将与T碱基配对。
术语“核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。所述核苷酸可以是标准核苷酸(即腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和尿苷)或核苷酸类似物。核苷酸类似物是指具有修饰的嘌呤或嘧啶碱基或修饰的核糖部分的核苷酸。核苷酸类似物可以是天然存在的核苷酸(例如，肌苷)或非天然存在的核苷酸。核苷酸的糖或碱基部分上的修饰的非限制性实例包括添加(或除去)乙酰基、氨基、羧基、羧甲基、羟基、甲基、磷酰基和硫醇基团，以及用其它原子取代碱基的碳和氮原子(例如7-脱氮嘌呤)。核苷酸类似物还包括双脱氧核苷酸、2'-O-甲基核苷酸，锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代类。
术语“多肽”和“蛋白”可互换地用来指氨基酸残基的聚合物。
用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术是本领域已知的。通常，此类技术包括确定基因的mRNA的核苷酸序列和/或确定由此编码的氨基酸序列，和将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。也可以以这种方式确定和比较基因组序列。通常，同一性是指两个多核苷酸或多肽序列分别的确切核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸对应性。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可以通过确定其百分比同一性来比较。两个序列(无论是核酸或氨基酸序列)的百分比同一性是两个比对序列之间的精确匹配数除以较短序列的长度并乘以100的数目。核酸序列的近似比对由Smith和Waterman,Advances in AppliedMathematics 2:482-489(1981)的局部同源性算法来提供。该算法可以通过使用由Dayhoff,Atlas of Protein Sequences and Structure,M.O.Dayhoff编,5suppl.3:353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA开发的评分矩阵来应用于氨基酸序列，并由Gribskov,Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763(1986)进行标准化。该算法确定序列百分比同一性的的示例性实现由Genetics Computer Group(Madison,Wis.)在“BestFit”实用应用中提供。用于计算序列之间的百分比同一性或相似性的其它合适程序是本领域通常已知的，例如，另一种比对程序是以默认参数使用的BLAST。例如，可以使用以下默认参数使用BLASTN和BLASTP：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高评分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。这些程序的详情可以在GenBank网站上找到。
实施例
以下实施例说明本发明的某些方面。
实施例1：显现个体癌细胞中的SEPTIN9启动子上的DNA甲基化
以下实施例的目的是开发高度灵敏的检测方法以检测个体细胞中的单个基因组基因座处的DNA甲基化。为此目的，开发了一种方法，以进行原位杂交，随后进行邻近连接测定(PLA)(又名Sigma-Aldrich)和细胞成像，以显现SEPTIN 9启动子上的DNA甲基化(5meC)。SEPTIN 9启动子甲基化是结肠癌的已知生物标志物(Wasserkort等人,2013,BMC Cancer,13:398)。在优化细胞交联(即固定)、细胞透化和染色质可接近性后，通过与靶向人SEPTIN 9启动子中的CpG岛的生物素化的寡核苷酸探针的合并物杂交来验证基因组特异性。使用抗生物素和抗5meC抗体、相应的(+和-)PLA探针和远红(Far Red)检测试剂进行PLA测定。图1概述了所述策略。
使用免费在线软件(即Stellaris FISH Probe Designer)针对人SEPTIN 9序列设计寡核苷酸(20聚体)探针。具有3’TEG-生物素修饰的探针由Sigma Custom Products合成，并通过HPLC纯化。图2呈现SEPTIN 9启动子序列，并显示18个寡核苷酸探针的位置。
使人癌细胞，即DU145(转移癌；来源于前列腺，迁移至脑)或SW480(结肠癌)在补充有10％FBS和Pen/Strep抗生素的DMEM(Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基)中生长，并在8孔培养室盖玻片板(具有硅胶垫圈)的每孔接种(～104个细胞)。将细胞用HBSS洗涤两次，然后在室温(RT)下用4％多聚甲醛溶液(40μL/孔，在1X PBS中以1:4稀释的16％多聚甲醛储备液)固定30分钟。通过添加5μL/孔的1.25M甘氨酸并在室温下孵育5分钟来终止交联。通过在室温下与透化缓冲液(1X PBS中的0.75％Tween 20和0.75％Triton X-100)孵育1小时来透化细胞。用1X PBS冲洗细胞。为了检测5-meC DNA，在室温下用4NHCl处理细胞10分钟。将细胞在室温下用1X PBS洗涤30分钟。将细胞用预温热(37℃)的0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液处理1分钟，并且通过在预温热(37℃)的猝灭溶液(即补充有10％FBS和3mg/mL BSA的DMEM)中孵育2分钟来使胰蛋白酶失活。将细胞用1XPBS洗涤，并在室温下用原位杂交封闭溶液封闭1小时。
使用载玻片杂交仪(Abbott Molecular)在37℃下将细胞与在水中制备的杂交缓冲液(50％甲酰胺，10％Ficoll 400，0.1％SDS，2X SSC)孵育30分钟。通过添加杂交缓冲液来使寡核苷酸探针变性，并将探针(即，(i)所有18种SEPTIN 9探针，(ii)最接近于CpG岛的5种SEPTIN 9探针，或(iii)LacZ对照探针；各100μM)添加至各孔，所述孔用杂交盖密封，并运行载玻片杂交仪变性/杂交程序(即，在80℃下变性5分钟，随后在37℃下杂交16小时)。将细胞用洗涤缓冲液(2X SSC,0.1％NP-40)洗涤三次，然后进行PLA方法，以封闭步骤开始。使用的抗体是抗生物素(Abcam 53494，兔中产生的多克隆抗体，PLA抗体稀释剂中的1:200稀释)和抗5-甲基胞嘧啶(Eurogentec BI-MECY-0100，小鼠中产生的单克隆抗体，PLA抗体稀释剂中1:200稀释)。
SEPTIN 9基因位于人染色体17上。因此，在对于染色体17为二倍体且两个拷贝的SEPTIN 9启动子被甲基化的癌细胞系中，本领域技术人员期望在细胞核中看到两个点状PLA(红色)点。这在与Septin 9启动子特异性探针(即围绕甲基化CpG岛的探针组(ii)寡核苷酸#5-9)孵育的几个DU145细胞中观察到(图3B和3C)。用探针组(i)获得相似数据(数据未显示)，但用非特异性LacZ探针则没有(图3A)。在正常包皮成纤维细胞(BJ)或胰腺癌细胞(BxPC3)中没有观察到PLA信号，数据未显示。
通过在结肠癌细胞系SW480(其是染色体17的三倍体)中进行相同的ISH-PLA测定来进一步证实甲基化SEPTIN 9启动子检测的特异性。实际上，当与SEPTIN 9探针组(ii)杂交时，在几个SW480细胞中观察到每个核三个PLA点(图4A和4B)，但与LacZ探针杂交则没有(数据未显示)。用5-氮杂胞苷(5-AzaC，500nM，24小时)(已知在体内阻断DNA甲基化的一种药物)处理的SW480细胞中的这种核ISH-PLA信号丧失，证实了PLA信号的5-meC表位依赖性质(图5)。若干药物处理的细胞在改变的细胞形状方面显示细胞毒性作用，其导致PLA探针的捕获，并且是在若干细胞中观察到的弥漫性非特异性红色荧光的原因。5-AzaC是具有抗肿瘤活性的胞苷的嘧啶核苷类似物。将氮杂胞苷掺入DNA中，其中其可逆地抑制DNA甲基转移酶，从而阻断DNA甲基化。

Claims (14)

1.用于显现细胞中特异性核酸序列中的修饰的核苷酸的方法，所述方法包括：
a)使制备的细胞与至少一种核酸探针接触，所述至少一种核酸探针用至少一种标记物标记且与所述特异性核酸序列互补，其中所述核酸探针与所述特异性核酸序列杂交以形成杂交细胞；
b)使所述杂交细胞与结合所述核酸探针的标记物的第一结合剂和结合所述修饰的核苷酸的第二结合剂接触；
c)通过邻近连接测定法检测所述第一和第二结合剂以显现细胞中的特异性核酸序列中的修饰的核苷酸。
2.权利要求1的方法，其中所述制备的细胞是固定的，透化的，并且任选地包含变性的染色体DNA。
3.权利要求1或2的方法，其中所述修饰的核苷酸选自5-甲基胞苷、3-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羧基胞苷、1-甲基腺苷、6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、黄嘌呤核苷、肌苷、二氢尿苷或假尿苷或具有2'-O-甲基化的修饰的核糖。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述特异性核酸序列选自启动子DNA、增强子DNA、CpG岛DNA、编码DNA、内含子DNA、信使RNA、微小RNA、非编码RNA、长非编码RNA、核糖体RNA、转移RNA、小核RNA、小核仁RNA、SmY RNA、Y RNA、剪接的前导RNA、端粒酶RNA组分、小干扰RNA、Piwi-相互作用RNA或反式作用RNA。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述标记物是选自生物素、洋地黄毒苷、二硝基苯基、荧光素、二乙基氨基香豆素、罗丹明、花青3、花青5或德克萨斯红的半抗原或染料。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述核酸探针是线性或环状的，包含DNA、RNA、LNA或其组合，并且具有约15个核苷酸至约500个核苷酸的长度。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述细胞是选自真核细胞、哺乳动物细胞、人细胞、正常细胞或癌细胞的个体细胞，或者所述细胞在获得自真核生物的组织样品或流体样品内。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述修饰的核苷酸是5-甲基胞苷，且所述特异性核酸序列是Septin 9启动子。
9.用于显现细胞中的两个核酸序列之间的相互作用的方法，所述方法包括：
a)使制备的细胞与第一核酸探针和第二核酸探针接触，所述第一核酸探针包含第一标记物且与第一核酸序列具有互补性，所述第二核酸探针包含第二标记物且与第二核酸序列具有互补性，其中所述第一和第二标记物是不同的，并且所述第一和第二核酸探针分别与所述第一和第二核酸序列杂交；
b)使来自步骤a)的细胞与结合所述第一标记物的第一结合剂和结合所述第二标记物的第二结合剂接触；
c)通过邻近连接测定法检测所述第一和第二结合剂以显现所述细胞中的两个核酸序列之间的相互作用。
10.权利要求9的方法，其中所述制备的细胞是固定的，透化的，并且任选地包含变性的染色体DNA。
11.权利要求9或10的方法，其中所述第一和第二核酸序列各自选自启动子DNA、增强子DNA、CpG岛DNA、编码DNA、内含子DNA、信使RNA、微小RNA、非编码RNA、长非编码RNA、核糖体RNA、转移RNA、小核RNA、小核仁RNA、SmY RNA、Y RNA、剪接的前导RNA、端粒酶RNA组分、小干扰RNA、Piwi-相互作用RNA或反式作用RNA。
12.权利要求9至11中任一项的方法，其中所述第一和第二标记物各自选自生物素、洋地黄毒苷、二硝基苯基、荧光素、二乙基氨基香豆素、罗丹明、花青3、花青5或德克萨斯红。
13.权利要求9至12中任一项的方法，其中所述第一和第二核酸探针各自是线性或环状的，包含DNA、RNA、LNA或其组合，并且具有约15个核苷酸至约500个核苷酸的长度。
14.权利要求9至13中任一项的方法，其中所述细胞是选自真核细胞、哺乳动物细胞、人细胞、正常细胞或癌细胞的个体细胞，或者所述细胞在获得自真核生物的组织样品或流体样品内。
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