CN112501259A - 长链非编码rna显色原位杂交试剂盒和检测方法 - Google Patents
长链非编码rna显色原位杂交试剂盒和检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112501259A CN112501259A CN202011376094.4A CN202011376094A CN112501259A CN 112501259 A CN112501259 A CN 112501259A CN 202011376094 A CN202011376094 A CN 202011376094A CN 112501259 A CN112501259 A CN 112501259A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- situ hybridization
- chromogenic
- long
- coding rna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 title claims abstract description 28
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 109
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 28
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 17
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 16
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 claims description 7
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 claims description 7
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 6
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 claims description 5
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 5
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 claims description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 22
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 20
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 20
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010824 Kaplan-Meier survival analysis Methods 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000012296 in situ hybridization assay Methods 0.000 description 2
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010051676 Metastases to peritoneum Diseases 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒和检测方法，其中，长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒包括第一探针、第二探针和第三探针中的至少一种，所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针用以显色原位杂交检测长链非编码RNA BC002811；所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒的步骤简单，容易操作，且检测准确性较高，适于临床应用推广。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒和检测方法。
背景技术
胃癌是全球最致命的恶性肿瘤之一，早期症状隐匿、缺乏特异性，常被 患者忽略。多数患者在确诊时已处于晚期，且常伴有淋巴结、血行或腹膜转 移，失去了手术根治的机会。因此，迫切需要寻找新的检测方法用于胃癌的 疾病诊断和预后评估。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类不编码蛋白质的内源性RNA转录本，长度大于200个核苷酸，可在转录及转录后水平调控基因表达，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡和衰老等重要的生物学过程。研究表明，lncRNA在胃癌发生、发展、转移、耐药及预后中均具有重要作用，可能成为胃癌的诊断标志物、治疗靶点或预后分子标志物。其中，lncRNA BC002811被发现在胃癌组织呈明显的表达上调，其表达水平与胃癌微血管密度呈正相关，可促进胃癌MKN-45细胞侵袭和迁移等功能，具有重要的临床意义。
目前lncRNA表达水平检测常用的方法有lncRNA表达谱芯片、高通量测序、Northern印迹杂交、实时定量PCR(qPCR)、荧光原位杂交(Fluorescence in situhybridization，FISH)等。其中，lncRNA表达谱芯片、高通量测序以及 Northern印迹杂交技术多用于科研，不适于临床推广。由于循环中稳定存在的lncRNA数量较少，qPCR检测的临床应用受限。而FISH技术则存在评估肿瘤形态学特征比较困难，需要借助荧光显微镜及相应的分析系统，花费较高，荧光信号容易衰减，切片保存困难等缺陷，临床推广困难。因此，现今还未有适合临床推广的检测BC002811表达水平的方法。
上述内容仅用于辅助理解发明的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒和检测方法，旨在解决现有的BC002811检测方法在临床应用受限的技术问题。
为实现上述目的，第一方面，本发明提出一种长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒，该试剂盒包括：
用以显色原位杂交检测长链非编码RNA BC002811的第一探针、第二探针和第三探针中的至少一种；所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
可选地，所述第一探针的5’端和3’端分别连接非荧光标记物；所述第二探针的5’端和3’端分别连接非荧光标记物；所述第三探针的5’端和3’端分别连接非荧光标记物。
可选地，所述第一探针的5’端和3’端分别连接地高辛标记；所述第二探针的5’端和3’端分别连接地高辛标记；所述第三探针的5’端和3’端分别连接地高辛标记。
可选地，所述长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒还包括消化液、保护液、固定液、增效剂、洗脱液、预杂交液、多种缓冲液、封闭液、酶标记的特异性结合非荧光标记物的抗体和显色液。
第二方面，本发明还提出一种长链非编码RNA显色原位杂交检测方法，包括如下步骤：
(1)组织切片与显色原位杂交长链非编码RNA BC002811的第一探针、第二探针和第三探针中的至少一种杂交；
(2)加入酶标记的抗体孵育并清洗，加入显色液染色并清洗；
(3)观察组织切片的染色情况；
其中，所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒包括第一探针、第二探针和第三探针中的至少一种，所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针可以通过显色原位杂交检测长链非编码RNA BC002811；所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；本发明试剂盒操作简便，信号稳定，组织切片可以在室温下长期保存，使用普通光学显微镜即可进行检测，可以用于胃癌的辅助诊断和预后评估，易于在基层医院普及和推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为实施例1组织切片中BC002811显色原位杂交染色结果图；
图2为实施例1组织切片中BC002811表达水平结果分析图；
图3为实施例1的BC002811表达水平与患者中位生存时间的关系图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
需要说明，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，全文中出现的“和/或”的含义为，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案，或B方案，或A和B同时满足的方案。
本发明提出一种长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒。
本发明提出的长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒包括第一探针、第二探针和第三探针中的至少一种，所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针可以通过显色原位杂交检测长链非编码RNA BC002811；所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID No.2 所示；所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明基于BC002811的特异性序列，根据碱基互补配对和引物设计原则，筛选并设计出杂交效率和特异性最高的所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针。三种探针的序列信息请参阅表1。
本发明长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒包括第一探针、第二探针和第三探针中的至少一种，所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针可以通过显色原位杂交检测长链非编码RNA BC002811；所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；本发明试剂盒操作简便，信号稳定，组织切片可以在室温下长期保存，使用普通光学显微镜即可进行检测，可以用于胃癌的辅助诊断和预后评估，易于在基层医院普及和推广。
所述第一探针的5’端和3’端分别连接非荧光标记物；所述第二探针的5’端和3’端分别连接非荧光标记物；所述第三探针的5’端和3’端分别连接非荧光标记物。所述非荧光标记物可以为地高辛标记物，地高辛标记探针是目前应用最广泛的非放射性标记探针，特别适用于检测内源性生物素比较高的组织器官。当然，所述非荧光标记物也可以为生物素。在本发明试剂盒中，所述第一探针的5’端和3’端分别连接地高辛标记；所述第二探针的5’端和3’端分别连接地高辛标记；所述第三探针的5’端和3’端分别连接地高辛标记。
本发明以目前公认的在胃癌中具有癌基因活性的lncRNA GAPLINC作为阳性对照，以lncRNA GAPLINC的基因序列设计出杂交效率和特异性最高的对照探针一、对照探针二和对照探针三，所述对照探针一、所述对照探针二和所述对照探针三的序列请参阅表1，所述对照探针一、所述对照探针二和所述对照探针三的5’端和3’端也分别连接非荧光标记物，例如地高辛标记。
表1显色原位杂交探针序列
| 序列名称 | 序列(5’-3’) |
| SEQ ID No.1 | TAAGGTTCTGAGGATGGATAT |
| SEQ ID No.2 | CTAAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGC |
| SEQ ID No.3 | GTCCCTCAATATTCTTGAATAGGCC |
| 对照探针一 | ACACATCACTGTAAACGTGCCT |
| 对照探针二 | ACTATAACATGATTTTATTGGTTCT |
| 对照探针三 | TTCTTCTAAGTGCCAAGTTTACAAA |
所述长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒还包括消化液、保护液、固定液、增效剂、洗脱液、预杂交液、多种缓冲液、封闭液、抗体和显色液等，具体成分请参阅表2。其中，所述抗体可以为碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体 (Anti-Digoxin Antibody，ADA)。当然所述抗体也可以为辣根过氧化物酶标记的ADA，不做限定。
表2试剂盒成分表
本发明还提出一种长链非编码RNA显色原位杂交检测方法，包括如下步骤：(1)组织切片与显色原位杂交长链非编码RNA BC002811的第一探针、第二探针和第三探针中的至少一种杂交；(2)加入酶标记的抗体孵育并清洗，加入显色液染色并清洗；(3)观察组织切片的染色情况；其中，所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
所述第一探针、所述第二探针和所述第三探针的具体信息请参阅前文，不再赘述。
所述检测方法的具体步骤如下：
(1)样本预处理
A.组织切片经58℃烤片30min，熔化表面石蜡，再用二甲苯脱蜡2次，每次 10min；
B.脱蜡后的组织切片依次经100％、95％、80％、75％乙醇和DEPC水各洗涤一次，每次5min；
C.加入0.2mol/L HCl室温处理5min，PBS洗3次，每次5min；
D.加入80μl消化液，室温孵育20min；
E.以保护液洗涤3次，每次5min，以终止蛋白酶K反应；
F.固定液室温固定10min，PBS洗2次，每次5min；
G.加入增效剂室温孵育10min，以增强阳性杂交强度，PBS洗2次，每次5min。
(2)显色原位杂交检测
A.按12.5μl/cm2切片面积加入预杂交液，53℃预杂交2h；
B.去除预杂交后，加入250μl杂交液(预杂交液中加入相应探针)，53℃杂交过夜；
C.5×SSC 37℃洗2次，每次20min；
D.50％去离子甲酰胺/2×SSC 37℃洗3次，每次20min；
E.TBST洗5次，每次5min；
F.加入封闭液室温封闭1小时；
G.加入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(1:1000)4℃孵育过夜；
H.TBST洗4次，每次10min；
I.BCIP/NBT缓冲液洗2次，每次10min；
J.BCIP/NBT显色液暗处染色8h，TE缓冲液洗1次以终止反应；
K.核固红复染5min；
L.水洗残液，梯度酒精脱水、封片，然后以光学显微镜观察和拍照。
实施例1、显色原位杂交检测BC002811的表达
采用本发明长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒和检测方法，对163例胃癌组织芯片样本进行显色原位杂交检测，从而验证本发明检测方法的有效性。
请参阅图1，左边的图片为部分胃癌组织的BC002811显色原位杂交染色结果，右边的图片为部分癌旁正常胃组织的BC002811显色原位杂交染色结果，BC002811在胃癌组织中的显色原位杂交染色明显强于癌旁正常胃组织。本发明试剂盒和检测方法可以有效区分出胃癌组织和癌旁正常胃组织，说明本发明可以用于胃癌辅助诊断。
本实施例按下列标准对样本中的染色强度评分：细胞无蓝染为阴性，记0 分；细胞染成浅蓝色为弱阳性，记1分；细胞染成蓝色且无背景着色，或细胞染成深蓝色并有浅蓝色背景为中度阳性，记2分；细胞染成深蓝色且无背景着色为强阳性，记3分。采用ImageJ软件(http://rsbweb.nih.gov/ij/)对显微镜照片进行分析，计算阳性染色面积百分率。最后以ISH值(ISH值＝样品的染色强度×样品对应的阳性染色面积百分率)评价BC002811的表达水平。请参阅图2，胃癌(Gastric cancer)组织的ISH值高于癌旁组织(Adjacent tissue)的ISH值，且两者的ISH值具有显著差异(P＜0.01)，再次说明本发明试剂盒和检测方法具有较高的准确性，可以用于胃癌辅助诊断。
应用SPSS 16.0对实验结果进行统计学分析，组间均值比较采用Wilcoxonsigned-rank test方法，相关分析采用Kaplan-Meier analysis和log-rank test方法，差异设置为P＜0.05。请参阅图3，Kaplan-Meier生存分析表明，BC002811高表达患者的中位生存时间明显短于BC002811低表达患者，两者的差异有统计学意义(P＜0.01)。以上结果说明BC002811是一个与胃癌预后相关的分子标志物，BC002811表达越高则患者预后越差。本发明对BC002811表达的准确检测，证明本发明试剂盒和检测方法也可以用于胃癌预后评估。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东医科大学
<120> 长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒和检测方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
taaggttctg aggatggata t 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ctaaggtcag gagttcgaga ccagc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gtccctcaat attcttgaat aggcc 25
Claims (5)
1.一种长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒，其特征在于，包括：
用以显色原位杂交检测长链非编码RNA BC002811的第一探针、第二探针和第三探针中的至少一种；所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.如权利要求1所述的长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒，其特征在于，所述第一探针的5’端和3’端分别连接非荧光标记物；所述第二探针的5’端和3’端分别连接非荧光标记物；所述第三探针的5’端和3’端分别连接非荧光标记物。
3.如权利要求2所述的长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒，其特征在于，所述第一探针的5’端和3’端分别连接地高辛标记；所述第二探针的5’端和3’端分别连接地高辛标记；所述第三探针的5’端和3’端分别连接地高辛标记。
4.如权利要求2所述的长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒，其特征在于，所述长链非编码RNA显色原位杂交试剂盒还包括消化液、保护液、固定液、增效剂、洗脱液、预杂交液、多种缓冲液、封闭液、酶标记的特异性结合非荧光标记物的抗体和显色液。
5.一种长链非编码RNA显色原位杂交检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)组织切片与显色原位杂交长链非编码RNA BC002811的第一探针、第二探针和第三探针中的至少一种杂交；
(2)加入酶标记的抗体孵育并清洗，加入显色液染色并清洗；
(3)观察组织切片的染色情况；
其中，所述第一探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述第二探针的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述第三探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011376094.4A CN112501259A (zh) | 2020-11-30 | 2020-11-30 | 长链非编码rna显色原位杂交试剂盒和检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011376094.4A CN112501259A (zh) | 2020-11-30 | 2020-11-30 | 长链非编码rna显色原位杂交试剂盒和检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112501259A true CN112501259A (zh) | 2021-03-16 |
Family
ID=74969618
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011376094.4A Pending CN112501259A (zh) | 2020-11-30 | 2020-11-30 | 长链非编码rna显色原位杂交试剂盒和检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112501259A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116694820A (zh) * | 2023-05-25 | 2023-09-05 | 卡秋(江苏)生物科技有限公司 | 用于检测cmv病毒的原位杂交探针、探针组、试剂盒及检测方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107109399A (zh) * | 2014-12-22 | 2017-08-29 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 显现单个细胞中的修饰的核苷酸和核酸相互作用 |
| US20170321261A1 (en) * | 2014-09-18 | 2017-11-09 | Universidad De Granada | Method for the detection of circulating tumour cells, both circulating tumour cells of the epithelial phenotype and circulating tumour cells having epithelial-mesenchymal transition (emt) markers, using the mirna-21 as a biomarker |
| CN107937544A (zh) * | 2018-01-02 | 2018-04-20 | 中南大学 | 原位杂交检测长链非编码rna pvt1表达量的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂中的应用 |
| CN110358835A (zh) * | 2019-07-26 | 2019-10-22 | 泗水县人民医院 | 生物标志物在胃癌检测、诊断中的应用 |
-
2020
- 2020-11-30 CN CN202011376094.4A patent/CN112501259A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170321261A1 (en) * | 2014-09-18 | 2017-11-09 | Universidad De Granada | Method for the detection of circulating tumour cells, both circulating tumour cells of the epithelial phenotype and circulating tumour cells having epithelial-mesenchymal transition (emt) markers, using the mirna-21 as a biomarker |
| CN107109399A (zh) * | 2014-12-22 | 2017-08-29 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 显现单个细胞中的修饰的核苷酸和核酸相互作用 |
| CN107937544A (zh) * | 2018-01-02 | 2018-04-20 | 中南大学 | 原位杂交检测长链非编码rna pvt1表达量的试剂在制备鼻咽癌诊断试剂中的应用 |
| CN110358835A (zh) * | 2019-07-26 | 2019-10-22 | 泗水县人民医院 | 生物标志物在胃癌检测、诊断中的应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| YANXIA HUANG等: "LncRNA AK023391 promotes tumorigenesis and invasion of gastric cancer through activation of the PI3K/Akt signaling pathway", 《JOURNAL OF EXPERIMENTAL&CLINICAL CANCER RESEARCH》 * |
| 周方园等: "LncRNA BC002811与血清肿瘤标志物CA125、CA199联合检测在胃癌中的诊断价值", 《中国卫生工程学》 * |
| 朱莹等: "胃癌患者长链非编码RNA的差异表达", 《广东医学》 * |
| 符伟玉等: "lncRNA BC002811慢病毒载体构建及对胃癌细胞增殖的影响", 《安徽医科大学学报》 * |
| 罗荣城等: "《生物标志物与精准医学》", 31 March 2020, 上海交通大学出版社 * |
| 赵艳华等: "长链非编码RNAAFAP1-AS1在消化系统肿瘤中的表达及意义", 《肿瘤》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116694820A (zh) * | 2023-05-25 | 2023-09-05 | 卡秋(江苏)生物科技有限公司 | 用于检测cmv病毒的原位杂交探针、探针组、试剂盒及检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2562821T3 (es) | Método ultrasensible para la detección in situ de ácidos nucleicos | |
| US11591655B2 (en) | Diagnostic transcriptomic biomarkers in inflammatory cardiomyopathies | |
| JP4435259B2 (ja) | 微量胃癌細胞の検出法 | |
| US20090233306A1 (en) | Biomarkers for Inflammatory Bowel Disease and Irritable Bowel Syndrome | |
| TWI682034B (zh) | 用於評估子宮內膜癌的發展風險或診斷子宮內膜癌的方法 | |
| CN108949969B (zh) | 长链非编码rna在结直肠癌中的应用 | |
| US20060008803A1 (en) | Identification of tissue/cell specific marker genes and use thereof | |
| CN112553335A (zh) | 肾细胞癌生物标志物及其应用 | |
| JP4317854B2 (ja) | 微量胃癌細胞の検出法 | |
| EP3196316B1 (en) | METHOD AND DEVICE FOR COMPARATIVE ANALYSIS OF miRNA EXPRESSION LEVEL | |
| CN112501259A (zh) | 长链非编码rna显色原位杂交试剂盒和检测方法 | |
| TW201120449A (en) | Diagnostic methods for determining prognosis of non-small-cell lung cancer | |
| EP3816283A1 (en) | Method for evaluating quality of body fluid specimen | |
| KR20120004286A (ko) | 림프종 진단 또는 예후 마커로서 Ｐｅｌｌｉｎｏ 1 | |
| Bartlett | Approaches to the analysis of gene expression using mRNA: a technical overview | |
| CN107109397B (zh) | 小型rna的表达量的修正方法和装置 | |
| CN110592204A (zh) | 血清miRNA组合作为分子标记物评估非阻塞性无精症 | |
| JP2009544306A (ja) | 拡張型心筋症に共通の遺伝子発現シグネチャー | |
| CN110257521B (zh) | miRNA-30a及其靶基因在肺癌检测中的应用 | |
| CN112239776A (zh) | 一种基于杂交和级联信号放大原理的多重核酸检测方法及试剂盒 | |
| KR20210024986A (ko) | 신장이식 후 항체 매개성 거부반응의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도 | |
| CN112029864A (zh) | 一种乳腺癌miRNA检测试剂盒及其应用 | |
| KR20210024918A (ko) | 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도 | |
| KR101735762B1 (ko) | 유전자의 발현프로필을 이용한 돼지의 산자수 예측방법 | |
| WO2011038763A1 (en) | Method for biomolecular detection of human liver diseases compositions and kits used in said method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210316 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |