添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、「a」、「an」、および「the」などの単数形の単語は、文脈が明確にそうでないと指示しない限り、対応する複数の参照を含む。本明細書で引用されるすべての参考文献は、個々の特許、公開された特許出願、図、図面、配列表、コンパクトディスクなどと同様に、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に参照により組み込まれる。
試薬、キット、酵素、バッファー、生細胞、器具類などを入手できる。例えば、Sigma-Aldrich,St.Louis,MO;Oakwood Chemical,Estill,SC;Epicentre,Madison,WI;Invitrogen,Carlsbad,CA;ProMega,Madison,WI;Life Technologies,Carlsbad,CA;ThermoFisher Scientific,South San Francisco,CA;New England BioLabs,Ipswich,MA;American Type Culture Collection(ATCC),Manassas,VA;Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ;Illumina,San Diego,CA;10X Genomics,Pleasanton,CAを参照されたい。
バーコードゲルビーズ、非バーコードゲルビーズ、およびマイクロ流体チップは、1CellBio,Cambridge,MAから入手可能である。フローサイトメトリーについてのガイダンスおよび機器が利用可能である(例えば、FACSCalibur(登録商標),BD Biosciences,San Jose,CA、BD FACSAria II(登録商標)ユーザーガイド、品番643245、Rev.A、2007年12月、344ページを参照)。
「標識された」組成物は、直接的または間接的に、分光学的、光化学的、蛍光定量的、生化学的、免疫化学的、同位体的、または化学的方法、ならびにプラズモンナノ粒子を伴う方法で検出可能である。例えば、有用な標識には、32P、33P、35S、14C、3H、125I、安定同位体、エピトープタグ、蛍光色素、ラマンタグ、電子密度の高い試薬、基質、または酵素が含まれ、例えば、酵素結合免疫測定法、またはフルオレットで使用される(Rozinov and Nolan(1998)Chem.Biol.5:713-728)。
詳細な記載についての目次
(I)ビーズ
(II)1つのビーズ、1つの化合物(OBOC)
(III)核酸をビーズに結合する
(IV)DNAバーコード
(V)化合物をビーズに結合する
(VI)化合物を作製するために化学モノマーを互いに結合する
(VII)スプリットプール合成および平行合成
(VIII)ピコウェルを製作する
(IX)ビーズをピコウェル内に堆積させる
(X)ピコウェル内のビーズ結合核酸のシーケンシング
(XI)ビーズからのビーズ結合化合物を放出する
(XII化合物の生化学的アッセイ
(XIII)化合物についての細胞系アッセイ
(XIV)細胞での摂動-応答分析
(I)ビーズ
本開示の方法および組成物は、モノサイズのTentaGel(登録商標)M NH2ビーズ(10、20、30マイクロメートルなどの直径)、標準なTentaGel(登録商標)アミノ樹脂(90、130マイクロメートルなどの直径)、TentaGel Macrobeads(登録商標)(280~320マイクロメートルの直径)などのビーズを使用する(上記のすべてが、Rapp Polymere,72072 Tubingen,Germanyから)。これらは、ポリエチレングリコールを用いて誘導体化されたポリスチレンコアを有する(Paulick et al(2006)J.Comb.Chem.8:417-426)。TentaGel(登録商標)樹脂は、ポリエチレングリコール(PEG)がグラフトされている低架橋ポリスチレンマトリックスからなる、グラフトされたコポリマーである。したがって、本開示は、DNAバーコードおよび化合物のうちの一方または両方を含むように改変されたビーズまたは樹脂を提供し、未改変のビーズは、ポリエチレングリコール(PEG)がグラフトされた低架橋ポリスチレンマトリックスからなる、グラフトコポリマーの形態をとる。
TentaGel(登録商標)は、最大20キロダルトンの分子量の「PEG鎖が、官能化され架橋されたポリスチレンに固定化されていることによって特徴付けされる。約2000~3000ダルトンのPEG鎖を有するグラフトコポリマーは、動態速度、移動性、膨潤、および樹脂容量」の点で最適であることが証明されている(Rapp Polymere,Germany)。したがって、本開示は、約2000~3000ダルトンのPEG鎖を有するグラフトコポリマーの形態をとるビーズまたは樹脂を提供する。膨潤に関して、Comellasらは、例えば、DCM、DMF、メチルアルコール、水、または酵素アッセイで使用されるバッファーに浸漬したときのビーズの膨潤能力を測定するためのガイダンスを提供する(Comellas et al(2009)PLoS ONE.4:e6222(12ページ))。膨潤の単位は、ビーズ1グラムあたりのミリリットルである。
代替のビーズの実施形態において、本開示は、PEGスペーサーがアルキル連鎖を介してポリスチレン骨格に付着される樹脂を使用し、樹脂は、微小球およびモノサイズである(TentaGel(登録商標)M樹脂)。
さらに代替のビーズの実施形態において、本開示は、アルキル連鎖を介してポリスチレン骨格に付着されるPEGスペーサーを有する樹脂を使用し、樹脂タイプは2つの二官能性種に存在し、第1の表面改質樹脂は、ビーズの外面の反応部位が、ビーズの内部容積の反応部位に対して直交性に保護されており、第2のハイブリッド樹脂は、切断可能および切断不可能なリガンドが、この支持に存在し、連続的な切断用に開発された(TentaGel(登録商標)B樹脂)。
さらに、別の実施形態において、本開示は、PEGスペーサーが、アルキル連鎖を介してポリスチレン骨格に付着しており、マクロビーズ樹脂が、非常に大きな粒子径および高容量を示す、樹脂を使用する(TentaGel(登録商標)MB樹脂)。また、本開示は、PEGスペーサーが、ベンジルエーテル連鎖を介してポリスチレン骨格に付着される樹脂を使用する。この樹脂は、免疫手順またはPEG修飾誘導体(PEG結合PEG修飾化合物)(TentaGEl(登録商標)PAP樹脂)についての合成に使用できる。
さらに、ビーズは、HypoGel(登録商標)200樹脂であり得る。これらの樹脂は、低架橋ポリスチレンマトリックス(Fluka Chemie GmbH,CH-9471 Buchs,Switzerland)にグラフトされたオリゴエチレングリコール(MW 200)の複合材料である。
いくつかの実施形態において、PEGリンカーのないアミノ官能化ポリスチレンビーズは、例えば、モノサイズのポリスチレンM NH2マイクロビーズ(5、10、20マイクロメートルなどの直径、Rapp Polymere,72072 Tubingen,Germanyから)がさらに使用され得る。
いくつかの実施形態において、化合物は、ビーズへの共有結合の付着なしで、ビーズ内の細孔またはチャンバまたはトンネル内にカプセル化され得る。化合物は、様々な手段によってビーズのかかる細孔内に拡散または強制され得る。いくつかの実施形態において、化合物は、拡散によってビーズ内に負荷し得る。いくつかの実施形態において、高温を使用して、ビーズを膨潤させ、ビーズ内に化合物を負荷し得る。いくつかの実施形態において、高圧を使用して、化合物をビーズに強制し得る。いくつかの実施形態において、ビーズを膨潤させる溶媒を使用して、ビーズ内に化合物を負荷し得る。いくつかの実施形態において、真空または低圧を使用して、化合物をビーズに分割し得る。いくつかの実施形態において、穏やかな、または激しい物理的攪拌を使用して、化合物をビーズに負荷し得る。
化合物が共有結合の付着なしで、ビーズ上に負荷されるかかる実施形態において、化合物は、拡散によってビーズから除荷され得る。いくつかの実施形態において、非限定的な様式で、温度、圧力、溶媒、pH、塩、バッファー、もしくは界面活性剤、またはかかる条件の組み合わせを使用して、かかるビーズから化合物を取り出し得る。いくつかの実施形態において、例えば、非架橋重合ビーズによるビーズの物理的完全性を使用して、かかるビーズ内に含まれる化合物を放出し得る。
除外的な実施形態において、本開示は、上記のビーズの1つを含む、任意のビーズ、およびビーズ-化合物複合体、または任意の方法を除外することができる。
本開示のビーズは、以下をさらに含む。メリフィールド樹脂(クロロメチルポリスチレン);PAM樹脂(4-ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチルポリスチレン);MBHA樹脂(4-メチルベンズヒドリルアミン);臭素化ワング樹脂(アルファ-ブロモプリオピオフェノン);4-ニトロベンゾフェノンオキシム(カイザー)樹脂;ワング樹脂(4ヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン;PHB樹脂(p-ヒドロキシベンジルアルコール;HMPA樹脂(4-ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸));HMPB樹脂(4-ヒドロキシメチル-3-メトキシフェノキシルブタン酸);2-クロロトリチル樹脂;4-カルボキシトリチル樹脂;リンク酸樹脂(4-[(2,4-ジメトキシペヘニル)ヒドロキシメチル)フェノキシメチル);リンクアミド(RAM)樹脂「Knorr」樹脂(4-((2,4-ジメチルフェニル)(Fmox-アミノ)メチル)フェノキシアルキル);PAL樹脂(5-[4-(Fmoc-アミノ)メチル-3,5-ジメトキシフェノキシ]バレルアミドメチルポリスチレン);シーバーアミド樹脂(9-Fmox-アミノ-キサンタン-3-イル-オキシメチル);HMBA樹脂(ヒドロキシメチル安息香酸);4-スルファモイルベンゾイル樹脂「Kennerの安全装置」樹脂(N-(4-スルファモイルベンゾイル)アミノメチル-ポリスチレン);FMP-樹脂(4-(4-ホルミル-3-メトキシフェノキシ)-エチル)(ChemFiles Resins for Solid-Phase Peptide Synthesis Vol.3(32ページ)(Fluka Chemie GmbH,CH-9471 Buchs,Switzerland)を参照されたい)。
本開示のビーズは、化合物の受動的なカプセル化物質として使用される上記のビーズ(化合物への共有結合的な連鎖なしに化合物を受動的に保持する)をさらに含み、非官能化ポリスチレンビーズ;シリカビーズ;アルミナビーズ;多孔性ガラスビーズ;ポリアクリルアミドビーズ;酸化チタンビーズ;アルギン酸ビーズ;セラミックビーズ;PMMA(ポリメチルメタクリレート)ビーズ;メラミンビーズ;ゼオライトベッド;ポリラクチドビーズ;デブロックコポリマーミセル;デキストランビーズなどをさらに含む。この段落に列挙されているビーズの多くは、Microspheres-Nanospheres,Cold Spring,NY 10516,USAなどのベンダーから購入され得る。
ビーズに加えて、小胞または小滴はまた、本開示のいくつかの実施形態のための化合物を送達するためのビヒクルとして使用され得る。脂質、デブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、または他の膜形成材料を使用して、化合物が負荷され得る内部容積が形成され得る。洗剤、機械的攪拌、温度、塩、pH、その他の手段を追加することにより、これらのカプセル化された容積から化合物が放出され得る。油中水滴乳濁液または水中油滴乳濁液は、アッセイ容積に送達され得る化合物を受動的にカプセル化するさらに他の手段である。
受動的カプセル化が化合物を送達するために使用されるすべての実施形態において、DNAタグは、さらに受動的に負荷され得るか、または代替的に、DNAタグは、ビーズ、小胞、または液滴に共有結合的に付着され得る。
除外的な実施形態において、本開示は、上記の化学物質のいずれかで作製された、または上記の化学物質のいずれか1つの誘導体で作製されたビーズまたは樹脂を除外することができる。
実施形態において、ビーズは、球状体であり得、約0.1~1マイクロメートル、約1~5マイクロメートル、約1~10、約5~10、約5~20、約5~30、約10~20、約10~30、約10~40、約10~50、約20~30、約20~40、約20~50、約20~60、約50~100、約50~200、約50~300、約50~400、約100~200、約100~400、約100~600、約100~800、約200~400、約200~600、約200~800マイクロメートルなどの直径を有し得る。
上記の値および範囲の用語において定義可能な非球状体ビーズも提供される。例えば、軸の1つ、または一次寸法の1つ(例えば、側面)、または二次寸法の1つ(例えば、対角線)は、上記の範囲の値を含み得る。除外的な実施形態では、本開示は、上記の値または範囲のうちの1つ以上に該当する球状体ビーズ(または非球状体ビーズ)を包含する任意の試薬、組成物、システム、または方法を除外することができる。
ビーズの鎖。一実施形態において、複数のビーズ二量体が提供され、ビーズ二量体は、互いに付着した2つのビーズの形態をとり、一方のビーズには複数の付着した核酸バーコード(直交性核酸モジュール、または連鎖状核酸モジュールのいずれか)が含まれており、もう一方のビーズには複数の付着された化合物が含まれ、すべての化合物は、互いに実質的に関連している(またはすべての化合物が化学構造において互いに実質的に同一である)。ビーズ二量体は、化合物が付着した第1のビーズを調整し、核酸バーコードが付着した第2のビーズを別々に調整して、次に2つのビーズを連結することで合成され得る。一態様において、ビーズは可逆的リンカーによって互いに付着され、別の態様において、ビーズは非可逆的リンカーによって互いに付着される。
ビーズ透過性。実施形態において、本開示は、様々な範囲または程度の透過性を有するビーズを提供する。透過性は、溶媒によって到達可能なビーズの容積の割合として測定でき、測定の単位は、形態もしくは細孔をとるビーズの表面の割合であり、または測定の単位は、ビーズの表面(および外部媒体)と流体連通しているチャネル、ネットワーク、もしくはチャンバの形態をとるビーズの内部の割合である。本開示は、多孔性ビーズを包含することができるか、または代替的に、多孔性ビーズを除外することができる。
Rothbergの米国特許第9,062,304号は、外部および内部領域を有するビーズを開示する。「内部表面(細孔表面)」、「より大きな分子を排除するであろう好適な細孔」、任意で「内および外面の開発した差次的な機能化」さまざまな細孔径、ポリ(スチレンスルホン酸)およびポリスチレンなどのポリマーが示される。Rothbergの図1は、ビーズの表面およびビーズの細孔の写真を提供する。Bedreの米国特許第9,745,438号は、多孔性ビーズの透過性電子顕微鏡画像を提供する。Smithの米国特許第5,888,930号は、多孔性ビーズの断面の走査型電子顕微鏡写真を提供する。表面に小さな細孔、および内部に大きな細孔を有する球状ビーズが示され、ビーズは、例えば、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、セルロース、またはポリウレタンから作製される。Cookeの米国特許第5,047,437号は、スキンレス表面(図1)および表面に外部スキンを有するビーズ(図5)を備えた球状ポリ(アクリロニトリル)コポリマーの細孔形態を開示する。Tsaoの米国特許第4,090,022号は、セルロースビーズの多孔性開口および内部空間を開示する。
すべての図を含む上述される特許の各々は、それぞれが全体として参照により個々に組み込まれるように、その全体が本明細書に組み込まれる。
いかなる限定も意味することなく、ビーズまたは微粒子の外面は、ビーズまたは微粒子全体を弾性フィルムでしっかりと包むことによって決定することができる。ビーズもしくは微粒子は、思考実験を介して包むことができるか、または包まれたビーズは、図もしくは写真で描くことができるか、またはビーズは、実際に包むことができるいかなる限定も意味することなく、ビーズの外面は、包みに物理的に接触するビーズの部分である。
例えば、本開示は、表面積の少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%を占める細孔を有するビーズを提供する。また、本開示は、内部チャネルまたはネットワークの容積が、ビーズの総容積の少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%を占めるビーズを提供し、内部チャネルまたはネットワークは、ビーズの外面(および外部媒体)と流体連通している。
さらに、本開示は、表面積の1%未満、2%未満、5%未満、10%未満、15%未満、20%未満、30%未満、40%未満を占める細孔を有するビーズを提供する。また、本開示は、内部チャネルまたはネットワークの容積が、ビーズの総容積の1%未満、2%未満、5%未満、10%未満、15%未満、20%未満、30%未満、40%未満、50%未満、60%未満、70%未満、80%未満を占めるビーズを提供し、内部チャネルまたはネットワークは、ビーズの外面(および外部媒体)と流体連通している。
鉄心ビーズ。本開示は、鉄心ビーズまたは磁気ビーズを包含する。これらのビーズは、磁石を用いて操作し、それらを1つの反応容器から別の反応容器に、または1つの容器から別の容器に移動する。これらのビーズを使用することにより、ロボット工学による操作を強化できる。磁気ビーズの製造および使用方法が利用可能である(Szymonifka and Chapman(1994)Tetrahedron Letters.36:1597-1600;Liu,Qian,Xiao(2011)ACS Comb.Sci.13:537-546;Alam,Maeda,Sasaki(2000)Bioorg.Med.Chem.8:465-473)。
除外的な実施形態において、本開示は、任意のビーズまたは任意のビーズの集団を除外することができ、ビーズまたは集団は、上記の値または範囲の一方を満たす。
ビーズへの化合物の負荷
多くの実験において、事前に合成された化合物をビーズに負荷することが有利であり、ビーズは、化合物をアッセイに送達するためのビヒクルとして使用できる。生体標本への薬物送達に使用される標準的な技術の多くは、化合物をアッセイに送達するために適合され得る(Wilczewska et al(2012)Nanoparticles as drug delivery systems.Pharmacological Reports.64:1020-1037、Kohane DS(2007)Microparticles and nanoparticles for drug delivery.Biotechnol.Bioeng.96:203-209、Singh et al(2010)Microencapsulation:A promising technique for controlled drug delivery.Res Pharm Sci.5:65-77を参照されたい)。
事前に合成された化合物が、ビーズに負荷される、かかる実施形態において、化合物は、従来の96、385、または1536ウェルのマイクロタイタープレートに保持され得る。これらのプレートにビーズが追加され得、拡散または他の活性な負荷法によって化合物が負荷される。好ましい実施形態において、含浸用に選択されたビーズは、母液から除去される際に化合物がすぐに枯渇するのを防ぐ細孔サイズまたは浸透形状を有する。ビーズの外部への拡散は、必要に応じて、熱、圧力、添加剤、または他の刺激剤によって強化される。いくつかの実施形態において、化合物を負荷したビーズは、外部衝撃によって引き起こされるまで内部内容物の漏出を防ぐ様式でキャップされ得る。多孔性ビーズの外側をキャップする1つの方法は、脂質または両親媒性分子をビーズ化合物溶液に追加して、ビーズの表面に露出した空洞が両親媒性分子によって形成された二重層によって密封されるようにすることである。いくつかの実施形態において、事前に形成された小胞は、薬物を負荷したビーズと混合され得、その結果、攪拌すると、小胞は破裂し、膜は薬物を負荷したビーズの表面上で再形成され、それによってそれらを密封する。かかるビーズの密封を実行する方法が記載される(Tanuj Sapra et al(2012)Nature Scientific Reports volume 2,Article No.:848を参照されたい)。シリカビーズを密封するためのさらなる実験プロトコルは、Sandia Laboratories のRyan Davis et al,Nanoporous Microbead Supported Bilayers:Stability,Physical Characterization,and Incorporation of Functional Transmembrane Proteins,SAND2007-1560による報告の公表において利用可能であり、bSUM法は、Hui Zheng et al(bSUM:A bead-supported unilamellar membrane system facilitating unidirectional insertion of membrane proteins into giant vesicles)、J.Gen.Physiol.(2016)147:77-93に記載される。
事前に合成された化合物を利用するいくつかの実施形態において、ビーズは、適切な試薬の追加により、例えば、脂質またはジブロックコポリマーを追加し、続いて攪拌することにより、化合物から生成され、それにより、小胞が形成され、それらの内部または二重層膜内に化合物を含む。いくつかの実施形態において、化合物は、マイクロ流体T接合部を介して押し出され、油相に水相の液滴を作製し、化合物は、水相内、または水相および油相の間の界面に含まれる。いくつかの実施形態において、形成された液滴は、さらに重合され、非重合水性相液滴よりも頑丈で取り扱いに対して安定なヒドロゲルを生成し得る。液滴系カプセル化およびアッセイは、Oliver et al(2013)Droplet Based Microfluidics,SLAS Discovery Volume:19 issue:4,page(s):483-496に開示される。ゾルゲルカプセル化プロセスは、ビーズ内に化合物をカプセル化するためにさらに利用され得る。ゾルゲルビーズの形成は、Sol-gel Encapsulation of Biomolecules and Cells for Medicinal Applications,Xiaolin Wang et al(2015)Current Topics in Medicinal Chemistry.15:223に記載される。
1つのビーズ、1つの化合物(OBOC)
コンビナトリアルライブラリの製造に使用される方法は、(1)ライブラリの調整、(2)ライブラリ内の化合物のスクリーニング、(3)化合物の構造、例えば、すべての化合物またはスクリーニングで興味深い結果が提供された化合物のみ構造を決定する3つのステップを含む(Lam et al(1997)The One-Bead-One-Compound Combinatorial Library Method.Chem.Rev.97:411-448を参照されたい)。ビーズ結合合成を介した化合物の合成の利点は、「スプリットプール」法によって化合物を迅速に作製できることである。
コード戦略と組み合わせたOBOC。OBOCの別の特徴は、各ビーズに、化合物だけでなくコード戦略をさらに含むことである。ビーズ結合核酸が、同じビーズと結合している化合物をコードするために使用される場合、「コードする」という用語は遺伝コードを指さない。代わりに、「コードする」という用語は、ユーザーが数千の短い核酸配列の各々を単一のビーズ結合化合物と関連付けるレジェンド、キー、またはコードを所有していることを意味する。
核酸が関連化合物をコードする、ビーズ結合化合物およびビーズ結合核酸を有するビーズの使用の劇的なバリエーションは、以下のとおりである。劇的なバリエーションは、複合体のライブラリを製造することであり、ライブラリの各メンバーは、小分子とDNA部分との複合体の形態をとり、DNA部分は、小分子をコードする)。この複合体は、可溶性であり、ビーズ結合ではない。細胞または精製されたタンパク質でスクリーニングした後、複合体は、細胞または精製されたタンパク質と結合したままであり、それにより複合体を単離し、複合された核酸をシーケンシングすることで最終的に化合物を特定できる(Satz et al(2015)Bioconjugate Chemistry.26:1623-1632を参照されたい)。
ここで、この特許文書の大部分と同様に、「コードする」という用語は、遺伝コードを指すのではなく、代わりに、研究者が特定の核酸配列を使用して、それに付着している化合物の特定の既知の構造を示すという事実を指す。
DNAバーコードの使用などのコード戦略を使用する代わりに、陽性をスクリーニングする(それにより陽性をスクリーニングする化合物を示す)ビーズは、エドマン分解または質量分析に供して、ビーズ結合化合物を特定できる(Shih et al(2017)Mol.Cancer Ther.16:1212-1223を参照されたい)。ビーズ結合化合物がペプチドの場合、MALDI質量分析を使用して、陽性スクリーニングペプチド化合物の配列を直接的に決定できる。レーザー照射下で切断およびイオン化が同時に起こるため、直接的なシーケンシングが可能である(Song,Lam(2003)J.Am.Chem.Soc.125:6180-6188)。
コンビナトリアルライブラリのスプリットプール合成を実行する際の1つの微細なポイントは、すべての化合物が共通のモチーフを共有するように化合物を製造できることである。この戦略は、「化合物のライブラリではなく、モチーフのライブラリの生成」として記載されている(Sepetov et al(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92:5426-5430;Lam et al、418の前述を参照されたい)。
大きなビーズの典型的な例を提供するために、ビーズは、0.1mmの直径であり、同じ化合物の約1013コピーを保持できる(Lam et al、前述)。ビーズ結合化合物のライブラリの調製後、各ビーズは、個々のアッセイで使用でき、アッセイは、生化学的活性、または代替的に、結合活性を測定する。アッセイは、「ビーズ上」アッセイであるか、または代替的に、化合物をビーズから切り離して、液相アッセイで使用することができる(Lam et al、前述)。
任意のタイプのビーズのパラメータは、所定のアッセイ培地で膨潤する傾向が含まれ、ビーズのポリマーは、疎水性または親水性であり、各化合物を付着させるためのビーズ上の付着部位の特定、ポリエチレングリコールなどのスペーサーかどうかの問題を使用して、ビーズの表面から各化合物をいくらか分離し、ビーズの内部容積を提供する。
ビーズに化合物を付着させる必要性を考慮するが、ビーズの疎水性表面から遠く離れていることは、前述にLamらが、ポリオキシエチレングラフト化スチレン(TentaGel(登録商標))が、官能化可能基がポリオキシエチレン鎖の末端にあり、したがって疎水性ポリスチレンから遠く離れているという利点を有することを開示する。水溶性リンカーを有するビーズには、TentaGel、およびポリジメチルアクリルアミドビーズ(PepSyn(登録商標)gel,Cambridge Research Biochemicals,Northwitch,UK)が含まれる。
内部容積のパラメータは利点を提供でき、ビーズ結合DNAバーコードおよびビーズ結合化合物の標的の間の相互作用を防ぐ必要がある。この利点を活用するために、DNAバーコードがビーズの内側に位置するようにビーズを製造することができ、これに対して、スクリーニングされる化合物はビーズの表面に付着される(Lam et al、前述、438~439で)。内部容積のこの利点は、ビーズ結合化合物が切断可能なリンカーによって付着されている場合、および化合物のアッセイが、切断および放出されている化合物に対してのみ行われる場合、無関係であり得る。
Appellらは、化学ライブラリを合成し、続いてスクリーニングを行って活性化合物を検出するためのスプリットプール法の非限定的な例を提供する(Appell et al(1996)J.Biomolecular Screening.1:27-31)。ライブラリビーズは、第1のマイクロウェルプレート、ナノウェルプレート、またはピコウェルプレート上のウェルのアレイにおける各ウェルに1つずつ配置される。ビーズは、ビーズ結合化合物の約50%を切断するために光に曝露され、ウェル内の溶液に放出される。次に、放出された化合物は、第2のマイクロウェルプレートに移され、活性化合物を含むウェルを検出するためのアッセイを行い、それにより第1のプレートのどのビーズが活性なビーズ結合化合物を含むかを特定する。次に、「活性[化合物]が単一ビーズから特定されると、ビーズが回収されて解読され、したがって、活性化合物の合成履歴および構造が得られる」(Appell et al、前述)。
ビーズ結合化合物をスクリーニングする細胞系スクリーニングアッセイでは、Shihらは新しいタイプのビーズを提供する(Shih et al(2017)Mol.Cancer Ther.16:1212-1223)。この新しいタイプのビーズは、「卵巣癌に指向する合成的な死リガンド」のライブラリのメンバーであるビーズ結合化合物を含む。ビーズはビオチンでさらに装飾されており、サンドイッチを作製する2つの化学物質が追加され、サンドイッチは細胞とビーズの接着を維持する。サンドイッチは、ストレプトアビジンとビオチン-LXY30複合体とが含まれるこのサンドイッチは、ビーズをLXY30の受容体に接続し、これは、細胞表面上の周知であるタンパク質、すなわち、インテグリンである。前述のShihらの方法は、がん細胞を殺傷できる新しい分子(「LLS2」)の発見をもたらした。上記の方法では、ビーズ結合化合物を使用し、化合物は、細胞と結合する(化合物が依然としてビーズ結合を介する場合であっても)。Choらは、同様の1つのビーズ、1つの化合物ライブラリを作製し、スクリーニングされる化合物は、細胞と結合するのに十分であった(上述されるサンドイッチについての任意の必要性なしに)(Cho et al(2013)ACS Combinatorial Science.15:393-400)。Choらの報告の目的は、がん細胞によって発現されるインテグリンと結合するRGD含有ペプチドを発見することであった。上記に開示された試薬および方法は、本開示に有用である。
核酸をビーズに結合する(直交性式;連鎖状式)
連鎖状バーコードおよび直交性バーコードのトピックを理解する1つの方法は、一方が他方を超えて有する有意性に注意することである。連鎖状バーコード化を超える直交性バーコード化の利点は、以下のとおりである。成長する化合物の各モノマーの付着で、平行して付着されるのは、DNAバーコードモジュールである。連鎖状バーコード化では、所定のモジュールの付着が不完全である場合(つまり、すべての付着部位が必要とされるモジュールと正常に結合されなかった場合)、完成されたバーコードの配列は、正確ではないであろう。「正確ではない」という表現は、不完全なカップリングを意味し、完成された正しいDNAバーコードであると想定された小さな塊から欠落し得る塊を意味する。ここで、すべてのモジュールの付着に失敗したため、完成されたバーコード配列は誤りを含むであろう。対照的に、直交性バーコード化は、各個々のモジュールがビーズ上の独自の固有の付着部位に共有結合的に結合する。また、モジュールがビーズ上の所定の部位に付着されると、すでに付着されているモジュールにさらなるモジュールは接続されないであろう。
本開示は、ビーズ結合DNAバーコードへの損傷を低減するため、および部分的に合成されたビーズ結合DNAバーコードへの損傷を低減するための試薬および方法を提供する。各DNAバーコードモジュールは、成長するビーズ結合DNAバーコードに付着する前に、二本鎖DNA(dsDNA)の形態をとることができ、このdsDNAは、マイトマイシンCなどのDNA架橋剤で処理される。dsDNA形態のDNAバーコードの合成の完了後、このdsDNAはssDNAに変換される。dsDNAからssDNAへの変換は、DNA鎖の1つにウラシル(U)残基を有する場合に有効であり、ウラシル残基の位置でのDNAの切断は、ウラシル-N-グリコシダーゼによって触媒される(2017年9月25日に出願されたシリアル番号第62/562,905号の図5を参照されたい。シリアル番号第62/562,905号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。上記は、ビーズ結合化合物を作製するために使用される試薬によって、成長するDNAバーコードに与えられる損傷について言及する。
ビーズ結合DNAバーコードへの損傷を低減し、部分的に合成されたDNAバーコードへの損傷を低減するための別の方法は、DNAバーコードを二本鎖DNAの形態で合成することであり、相互に付着されているDNAバーコードモジュールの各々は、dsDNAの形態をとり、二本鎖の各々は、DNAヘッドピースを介して安定化される。完成されたDNAバーコードの最終的なシーケンシングのために、鎖の1つは、DNAヘッドピースから切断され、除去される。上記は、ビーズ結合化合物(この化合物が化学ライブラリのメンバーである場合)を作製するために使用される試薬によって、成長するDNAバーコードに与えられる損傷について言及する。
ビーズ結合DNAバーコードへの損傷を低減するためのさらに別の方法は、ヘアピンを形成するための自己組織化を介してDNAバーコードを合成することであり、このDNAバーコードは、ヘアピンの第1の突起がヘアピンの第2の突起にアニールすることで自己組織化する。
合成されるDNAバーコードが二本鎖DNA(dsDNA)の形態をとる場合、DCM、DMF、DMAなどの溶媒は、DNAバーコードを変性できる。上記の方法および試薬は、変性を防ぐことができる。
上述されるように、「DNAバーコード」という用語は、化合物全体を特定するポリヌクレオチドを指すことができ、対照的に、「DNAバーコードモジュール」は、化合物を構成するモノマーの1つのみを指すことができる。
ビーズ結合DNAバーコードへの損傷を低減し、部分的に合成されたDNAバーコードへの損傷を低減するための別の方法は、二本鎖DNA(dsDNA)を使用し、7-aza-dATPおよびdGTPを介してこのdsDNAの末端を密封することである。
代替の実施形態において、方法は、「連鎖状DNAバーコード化」および「直交性DNAバーコード化」の間の中間体を使用することができ、この中間体は、DNAバーコードのブロックを伴い、つまり、各ブロックは、2つのDNAモジュールを含むか、または3つのDNAモジュールを含むか、または4つのDNAモジュールを含むか、または5つのDNAモジュールなどを含む(しかし、完全長の化合物を特定するすべてのDNAモジュールは含まれない)。
図1は、連鎖状構造化ビーズの例示的および非限定的な図を開示する。ビーズは、複数のDNAバーコード(各々がDNAバーコードモジュールで作製される)および複数の化合物(各々が化学ライブラリモノマーで作製される)を含む。話を簡単にするために、「DNAバーコード」という用語は、「DNAバーコードモジュール」であるすべての核酸、およびいくつかの機能を提供するすべての核酸を含むポリマーを指すために使用される。機能は、シーケンシングプライマーについてのアニーリング部位にすることができるか、または、機能を使用して、ビーズ結合化合物の化学合成のステップを特定できる。図1は、ビーズ結合化合物をさらに示しており、各化合物は、いくつかの化学ライブラリメンバーで作製されており、各化学ライブラリメンバーは、四角形、円、または三角形で表される。図1は、各DNAバーコードモジュールに1から8まで連続して付番されることを示しており、これらの番号は、それぞれの8つの形状(四角形、円、三角形)に対応する。明確にするために、機能を果たす(および特定の化学単位を表さないまたは「コードしない」)核酸は、図には示されていない。
図2は、直交性構造化ビーズの例示的および非限定的な実施形態を開示する。ビーズは、複数のDNAバーコード(各々がDNAバーコードモジュールで作製される)を含むが、各DNAバーコードモジュールは、ビーズ上の別々の連結部位に付着される。DNAバーコード全体は、8つのDNAバーコードモジュールからなり、図では、1~8に付番される。特定のDNAバーコードからの情報が読み取られ、同じビーズと結合された化合物を特定するために使用される場合、別々に付着される各DNAバーコードモジュールの各々でDNAシーケンシングを実行する必要がある。図2において、ビーズは、8つの形状(円、四角形、三角形)によって示されるように、各々が8つのユニットを有する複数の付着した化学化合物を含む。
図2において、明確にするために、各DNAバーコードモジュールに付着された機能性核酸は示されていない。当然であるが、DNAバーコードモジュールの各々は、完成された完全長の化合物における化学ライブラリモノマーの位置を特定する核酸が必要である。図2に示す例では、位置は、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、または第8である必要がある。
一実施形態において、化学モノマーが最初に付着され、次に、対応するDNAバーコードモジュールが付着される。代替的な実施形態において、DNAバーコードモジュールが最初に付着され、次に、対応する化学モノマーが付着される。また、「一実施形態」を使用することもあれば、「代替的な実施形態」を使用することもある有機合成の手順に従うことができる。さらに別の代替的な実施形態において、本方法は、いくつかのDNAバーコードモジュールのブロックの付着と平行して、ビーズに付着したいくつかの化学モノマーのブロックのブロックごとの追加を提供する。
除外的な実施形態において、除外できるものは、ビーズへの化学モノマー、DNAバーコードモジュール、または化学モノマーおよびDNAバーコードモジュールの両方のブロックごとの追加を使用した試薬、組成物、および方法である。
これは、ビーズ結合ポリヌクレオチドに存在し得る核酸に関係し、ビーズ結合化合物のモノマーを「コードする」または特定するのに役立つ核酸を含む。除外的な実施形態において、本開示は、「ステップ特異的DNAシーケンシングプライマー部位」をコードする核酸を除外することができる。この状況では、化合物に存在する化学モノマーごとに、対応するDNAバーコードモジュールが存在する。各DNAバーコードモジュールは、少なくとも1つの対応するプライマー結合部位、つまり「ステップ特異的DNAシーケンシングプライマー部位」が隣接する。また、除外できるのは、ステップ1、ステップ2、ステップ3、またはステップ4など、化合物の化学合成における特定のステップをコードまたは指定する核酸である。
さらに、本開示は、スペーサーとして機能する核酸を含み得る。例えば、スペーサーは、シーケンシングプライマーのアニーリング部位である第1の部位および化学モノマーを特異する第2の部位の間に、ポリヌクレオチド鎖に沿った距離を作製できる。また、本開示は、別の核酸によって提供される情報を繰り返しまたは確認する核酸を使用することができる。また、本開示は、PCRプライマー結合部位をコードする核酸を使用することができる。PCRプライマー結合部位を有するポリヌクレオチドは2つのPCRプライマー結合部位を有し、これらの部位の両方が同じ融点(PCRプライマーがPCRプライマー結合部位にアニーリングするときの融点)を有するように設計されているため、PCRプライマー結合部位は、シーケンシングプライマーと区別できる。
除外的な実施形態において、本開示は、スペーサーとして、または単独のスペーサーとして機能する核酸を除外することができる。また、本開示は、別の核酸によって提供される情報を繰り返しまたは確認する核酸を除外することができる。さらに、本開示は、PCRプライマー結合部位として機能する核酸を除外することができ、PCRプライマーではないプライマーのための結合部位として機能する核酸を除外することができる。
さらに、本開示は、化学ライブラリが作製された日付を特定する、または特定の化合物の化学合成におけるステップを特定する、またはプライマーアニーリング配列として機能する核酸を除外することができる。
特定のDNAバーコードモジュールに対するシーケンシングプライマーの提供。本開示は、DNAバーコードモジュールおよび1つ以上のシーケンシングプライマーアニーリング部位を含むDNAバーコードを提供する。各DNAバーコードモジュールは、それ独自の専用のシーケンシングプライマー結合部位を有し得る。代替的に、ビーズ結合DNAバーコード上に存在し得るように、1つの特定のシーケンシングプライマー結合部位を使用して、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の連続したDNAバーコードモジュールがシーケンシングされ得る。
以下に、各DNAバーコードモジュールが、それ独自の専用のシーケンシングプライマー結合部位を有する状況を記載する。本開示は、DNAシーケンシングプライマーを結合することが可能なプライマー結合部位を含むビーズ結合連鎖状バーコードを提供し、該プライマー結合部位は、第1のDNAバーコードモジュール、第2のDNAバーコードモジュール、第3のDNAバーコードモジュール、第4のDNAバーコードモジュール、第5のDNAバーコードモジュール、および第6のDNAバーコードモジュールのうちの1つ以上のシーケンシングを指示することが可能であり、プライマー結合部位は、第1のDNAバーコードモジュールおよびプライマー結合部位の間に他のDNAバーコードモジュールを有しない第1のDNAバーコードモジュールに対して3プライム、間に他のDNAバーコードモジュールを有しない第2のDNAバーコードモジュールに対して3プライム、間に他のDNAバーコードモジュールを有しない第3のDNAバーコードモジュールに対して3プライム、間に他のDNAバーコードモジュールを有しない第4のDNAバーコードモジュールに対して3プライム、間に他のDNAバーコードモジュールを有しない第5のDNAバーコードモジュールに対して3プライム、または間に他のDNAバーコードモジュールを有しない第6のDNAバーコードモジュールに対して3プライムに位置する。
コード配列およびコード配列に相補的な配列。本開示は、本文書における上述または他の場所に開示されたコード配列のいずれか1つ、いずれかの組み合わせ、またはすべてを包含することができる。除外的な実施形態において、除外することができるものは、本文書における上述または他の場所に開示されたコード配列のいずれか1つ、いずれかの組み合わせ、またはすべてである。また、本文書の上述または他の場所に記載されるコード配列のいずれか1つ、いずれかの組み合わせ、またはすべてをコードする二本鎖核酸を除外できることをさらに含む。
直交性式DNAバーコード(各DNAバーコードモジュールがビーズ上の別々の位置に付着される)
直交性式ビーズの合成。直交性合成では、各DNAモジュールが、ビーズ上の別々の部位に共有結合的に付着され、その結果、DNAバーコード全体が複数のDNAモジュールによって提供される。DNAバーコードが直交性構造を有する場合、DNAバーコードモジュールは、相互に付着されておらず、代わりに、DNAバーコード分子の各々すべては、その特定のDNAバーコードモジュール専用のそれ独自のビーズ付着部位を有する。
各DNAバーコードモジュールの合成ステップ数を特定する核酸。実施形態において、直交性DNAバーコードは、化合物合成の第1のステップを特定する短い核酸を含む。この実施形態の場合、第1の化学モノマーおよび第1のDNAバーコードモジュールの平行な付着より、第1のDNAバーコードモジュールは、実際には、[第1のDNAバーコードモジュール]に接続された[「ステップ1」を意味する短い核酸]の2つの核酸の複合体の形態をとる。この複合体のすべてのヌクレオチドは、互いにインフレームであり、シーケンシングアッセイで読み取ることができるが、第1の短い核酸は、スペーサー核酸を介して第1のDNAバーコードモジュールに任意で付着され得る。
以下は、直交性DNAバーコードの上記の記載の続きである直交性DNAバーコードは、化合物合成の第2のステップを特定する短い核酸を含む。この実施形態の場合、第2の化学モノマーおよび第2のDNAバーコードモジュールの平行な付着より、第2のDNAバーコードモジュールは、実際には、[第2のDNAバーコードモジュール]に接続された[「ステップ2」を意味する短い核酸]の2つの核酸の複合体の形態をとる。この複合体のすべてのヌクレオチドは、互いにインフレームであり、シーケンシングアッセイで読み取ることができるが、第2の短い核酸は、スペーサー核酸を介して第2のDNAバーコードモジュールに任意で付着され得る。
上述される方法は、任意の所定のビーズについて、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、および最後のDNAバーコードモジュールならびに最後の化学モノマーまで繰り返される。上記の方法は、スプリットプール合成を使用して、ビーズ結合したDNAバーコードおよび化合物を作製する場合に使用できる。
直交性構造は、連鎖状構造を超えて次の利点を提供する。連鎖状合成(すべてのDNAバーコードモジュールが1つの連続したポリマーで相互に付着されている)の場合、中間体カップリングステップのいずれかの合成の達成を失敗すると、最終的に完成された連鎖状DNAバーコードの意味が損なわれる可能性がある。対照的に、直交性合成(ビーズ上の専用サイトに付着された各々すべてのDNAバーコードモジュール)では、DNAバーコードモジュールのいずれかの付着に失敗した場合、ビーズ上の付着部位が空になるだけの結果となり、他の付着されたDNAバーコードモジュールのいずれの意味も損なわれないであろう。好ましい実施形態において、各付着されたDNAバーコードモジュールは、付着された第2の核酸を含み、この第2の核酸は、ステップ(DNAバーコードおよび化合物の平行合成中のステップ)を特定する。
直交性合成の場合、ビーズ上のすべての付着部位を使い切ることが許容される(成長する化学ライブラリメンバーを付着するための部位)。しかしながら、直交性合成の場合、化学反応は、多くのDNAバーコードモジュールの第1の付着により、ビーズ上の付着部位の集団全体が部分的にしか使用されないように設計する必要がある。以下は、直交性バーコードの化学合成中に部位を消耗する任意の限定を提供する。非修飾ビーズの場合、DNAバーコードモジュールを付着するために使用可能な部位の総数は100%である。
直交性構成ビーズの合成(第1のDNAバーコードに関して)による、所定のビーズ上の付着部位を消耗する程度。以下は、第1のDNAバーコードモジュールを付着することに関する。実施形態において、第1のDNAバーコードモジュールの付着により、ビーズ上のDNAバーコード付着部位の約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、または約50%が消耗される。他の実施形態において、ビーズ上のDNAバーコード付着部位の約2%未満、約5%未満、約10%未満、約20%未満、約30%未満、約40%未満、または約50%未満が消耗される。さらに他の実施形態において、第1のDNAバーコードモジュールの付着により、DNAバーコード付着部位の2~4%の間、2~6%の間、2~8%の間、2~10%の間、2~12%の間、2~14%の間、2~16%の間、2~18%の間、2~20%の間、10~20%の間、10~25%の間、10~30%の間、10~35%の間、10~40%の間が消耗される。
限定については、特定のDNAバーコードを構成する最後のDNAバーコードモジュールを付着すると、部位の20%未満が消耗され、部位の30%未満、40%未満、50%未満、60%未満、70%未満、80%未満、90%未満、95%未満、または98%未満が消耗される。
除外的な実施形態は、上記の値または範囲のいずれかと適合するビーズまたは方法を除外することができる。また、除外的な実施形態は、上記の値または範囲のいずれにも適合しないビーズまたは方法を除外することができる。
以下は、各々がDNAバーコードである1つ以上の核酸を含むポリマー、および2つ以上の核酸を含むポリマーに関するものであり、いくつかの核酸は、プライマーアニーリング部位またはスペーサーとして機能するなどの生化学的機能を有し、他の核酸は、情報機能を有し、かつDNAバーコードである。除外的な実施形態において、本開示は、ソラレンなどのDNA架橋剤を含むDNAバーコードを除外することができる。また、除外できるのは、DNAバーコードモジュールよりも高い融解温度(または低い融解温度)のプライマー結合領域を有するDNAバーコードである。この温度は、単に「より高く」または「より低く」することができるか、または、少なくとも2度高く、少なくとも4度高く、少なくとも6度高く、少なくとも8度高く、もしくは少なくとも2度低く、少なくとも4度低く、少なくとも6度低く、少なくとも8度低くすることができる。
また、除外できるのは、DNAリガーゼを使用したDNAバーコードを作製する方法である。また、除外できるのは、ヘアピン(ssDNAがループ状に屈曲し、ssDNAの一部が同じssDNAの別の部分とハイブリダイズする)を構成するDNAバーコードおよび方法である。さらに、除外できるのは、核酸ヘアピンを含む組成物であり、核酸ヘアピンは、例えば、化学リンカーで共有結合的に閉じられている。さらに、除外できるのは、「ヘッドピース」に直接的、または「ヘッドピース」に間接的(DNAバーコードおよびヘッドピースの間に存在する1つ以上の化学物質への共有結合を介して間接的に)のどちらかで共有結合的に連結されているDNAバーコードである。
他の除外的な実施形態において、除外できるのは、ビーズ結合DNAバーコードであり、完成されたDNAバーコードは、任意の二本鎖DNA(dsDNA)を含まず、一本鎖DNA(ssDNA)のみを含む。
直交性構成ビーズの合成(第2のDNAバーコードに関して)による、所定のビーズ上の付着部位を消耗する程度。以下は、第2のDNAバーコードモジュールを付着することに関する。実施形態において、第2のDNAバーコードモジュールの付着により(直交性構成ビーズの作製の場合)、ビーズ上の残存する自由なDNAバーコード付着部位の約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、または約50%が消耗される。他の実施形態において、ビーズ上の残存する自由なDNAバーコード付着部位の約5%未満、約10%未満、約20%未満、約30%未満、約40%未満、または約50%未満が消耗される。さらに他の実施形態において、第1のDNAバーコードモジュールの付着により、残存する自由なDNAバーコード付着部位の2~4%の間、2~6%の間、2~8%の間、2~10%の間、2~12%の間、2~14%の間、2~16%の間、2~18%の間、2~20%の間、10~20%の間、10~25%の間、10~30%の間、10~35%の間、10~40%の間が消耗される。
除外的な実施形態は、上記の値または範囲のいずれかと適合するビーズまたは方法を除外することができる。また、除外的な実施形態は、上記の値または範囲のいずれにも適合しないビーズまたは方法を除外することができる。
上記の実施形態は、上記の除外的な実施形態と同様に、第3のDNAモジュールバーコードを付着することを伴う、または第4のDNAモジュールバーコードを付着することを伴う、または第5のDNAバーコードモジュールを付着することを伴う方法などにも適用できる。
連鎖状式DNAバーコード(すべてのDNAバーコードモジュールは1つの鎖またはポリマーに存在し、鎖またはポリマー全体がビーズ上の1つの位置に付着される)。
ビーズ結合連鎖状式DNAバーコードの合成。本開示は、ビーズ結合連鎖状式DNAバーコードを提供し、ビーズは、複数の連鎖状式DNAバーコードを含み、複数の連鎖状式DNAバーコードのほとんどまたはほとんどすべては、本質的に同じ構造を有する。連鎖状式DNAバーコードは、1つ以上のDNAバーコードモジュールを含むことができ、DNAバーコード全体に沿ったこれらのDNAバーコードモジュール(ビーズ付着末端から遠位末端への)の順序は、ビーズ結合連鎖状式DNAバーコードが合成される時間と同じ順序をとる。また、DNAバーコード全体に沿ったこれらのDNAバーコードモジュールの順序は、対応する化学ライブラリモノマーが成長するビーズ結合化合物に結合される時間と同じ順序をとる。
連鎖状式DNAバーコードは、この順序で、連鎖状式DNAバーコード全体をビーズに結合するために使用されるリンカーを含むことができる。また、それは、この順序で、第1のDNAバーコードモジュール、第1のアニーリング部位、第2のDNAバーコードモジュール、第2のアニーリング部位、第3のDNAバーコードモジュール、および第3のアニーリング部位を含むことができる。
ビーズ結合DNAバーコード内のシーケンシングプライマーをハイブリダイズする部位の1つの順序。シーケンシングプライマーをハイブリダイズする部位の実施形態において、連鎖状式DNAバーコードは、この順序で、リンカー、第1のDNAバーコードモジュール、第1のアニーリング部位、第1のシーケンシングプライマー結合部位、第2のDNAバーコードモジュール、第2のアニーリング部位、第2のシーケンシングプライマー結合部位、第3のDNAバーコードモジュール、第3のアニーリング部位、第3のシーケンシングプライマー結合部位などを含むことができる。
ビーズ結合DNAバーコード内で発生する、シーケンシングプライマーをハイブリダイズする部位の別の順序。別のシーケンシングプライマーをハイブリダイズする部位の実施形態において、連鎖状式DNAバーコードは、この順序で、リンカー、第1のDNAバーコードモジュール、第1のシーケンシングプライマー結合部位、第1のアニーリング部位、第2のDNAバーコードモジュール、第2のシーケンシングプライマー結合部位、第2のアニーリング部位、第3のDNAバーコードモジュール、第3のシーケンシングプライマー結合部位、第3のアニーリング部位などを含むことができる。
「アニーリング部位」という用語。「アニーリング部位」という用語は、スプリントオリゴヌクレオチド(スプリントオリゴ)の一部であるアニーリング部位を指し、また、成長するビーズ結合DNAバーコード上に存在する対応するビーズ結合アニーリング部位を指すためにも使用される。当業者は、スプリントオリゴ上の「アニーリング部位」が、成長するビーズ結合DNAバーコード上の対応する「アニーリング部位」と同じDNA配列を有しないことを理解する。換言すれば、当業者は、1つの配列が、他の配列に相補的であることを理解する。したがって、ここでの記載では、両方のアニーリング部位が同じ名前を有することは重要ではない。換言すれば、スプリントオリゴ上の第2のアニーリング部位が、成長するビーズ結合DNAバーコード上の第2のアニーリング部位にハイブリダイズするものとして開示されることは重要ではない。
ブロックでの合成。代替的な実施形態において、成長する化合物および成長するDNAバーコードモジュールの配列は、ブロックで合成することができる。例えば、2化学ライブラリ単位で構成されるブロックは、対応する2-DNAバーコードモジュールで構成されるブロックの付着と平行して、ビーズに付着できる。同様に、3化学ライブラリ単位で構成されるブロックは、対応する3 DNAバーコードで構成されるブロックの付着と並行して、ビーズに付着できる。4個のブロック、5個のブロック、6個のブロック、7個のブロック、8個のブロック、9個のブロック、10個のブロックなどを伴うブロック合成も提供される。これらのブロック転移の実施形態の各々は、本開示によって除外することもできる。DNAバーコードモノマーのブロックごとの転移は、直交的に行うことができ、DNAバーコードモノマーの連続するブロックの各々を受け取るための固有の付着ポイントを有する。代替的に、DNAバーコードモノマーのブロックごとの転移を行って、コンカテマー構造を生成することもできる(すべてのDNAバーコードモジュールは、1つの連続した直鎖状ポリマーとしてのみ発生する)。
また、ビーズ結合DNAバーコードおよびビーズ結合化合物を平行してスプリットプール合成する場合、ブロックでの合成が発生する可能性がある。ブロックは、2つ以上の化学ライブラリモノマーの形態をとることができ、かつブロックは、2つ以上のDNAバーコードモジュールの形態をとることができる。
スプリットプール合成の位置。スプリットプール合成は、ビーズ結合化合物およびビーズ結合連鎖状DNAバーコードの平行合成に使用できる。また、スプリットプール合成は、ビーズ結合化合物およびビーズ結合直交性DNAバーコードの平行合成に使用できる。連鎖状DNAバーコードは、「スプリントオリゴ」法によって作製することができる。代替的に、連鎖状DNAバーコードは、クリックケミストリーによって作製することもできる。また、「スプリントオリゴ」法およびクリックケミストリーを組み合わせて使用することもできる。スプリットプール合成は、96ウェルプレートで行うことができ、各ウェルは、0.25マイクロメートルのフィルターで作製された床を有する。通常の重力条件下では、水溶液は、このフィルターを通過しない。しかしながら、例えば、第1の水溶液を第2の水溶液で置き換える必要がある場合、吸引を適用して、96ウェルのすべてから任意の水溶液を除去することができる。この吸引法は、ビーズが第1の試薬セットに曝露された場合、または第1の試薬セットを洗い流す必要がある場合、またはだい1の試薬セットを第2の試薬セットで置き換える必要がある場合に使用される。マニホールドは、96ウェルプレートを保持するために使用され(Resprep VM-96マニホールド)、ポンプを使用してすべてのフィルターの底部から流体を引き出すことができる(BUCHI Vac V-500ポンプ)。フィルター底部を有する96ウェルプレートは、AcroPrep Advance 96ウェル、350uL、0.45um、REF 8048(Pall Corp.,Multi-Well Plates,Ann Arbor,MI)であった。
プライマーアニーリング部位からDNAバーコードモジュールまでの距離。ビーズ結合DNAバーコードをシーケンシングする目的、つまり、DNAバーコードを形成するすべてのDNAバーコードモジュールをシーケンシングする目的で、シーケンシングプライマーのアニーリング部位である第1の核酸を含むポリヌクレオチド、およびDNAバーコードモジュールである第2の核酸、第1の核酸は、第2の核酸のすぐ上流にあり得る。代替的に、第1の核酸は、第2の核酸の上流であり得、第1および第2の核酸は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、またはそれ以上のヌクレオチドによって、または約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、または約15ヌクレオチドによって互いに分離される。分離は、単にスペーサーとして機能する核酸を用いることができるか、または代替的に、分離は、有機合成の多段階経路におけるステップ数、または化合物のクラスの数、またはビーズ結合化合物で治療できる可能性のある疾患、または日付、またはロット番号などの情報をコードする第3の核酸を用いることができる。
クリックケミストリーを使用するビーズ結合連鎖状DNAバーコードの合成
クリックケミストリーは、DNAバーコードの段階的な合成に使用できる。ここで、結合できるのは、ビーズに直接的に結合された第1のDNAバーコードモジュール、またはビーズ結合リンカーに結合された第1のDNAバーコードモジュールである。
また、結合できるのは、第1のシーケンシングプライマー結合部位である第2の核酸に付着した、第1のDNAバーコードモジュールである第1の核酸の形態をとるポリヌクレオチドである。このシーケンシングプライマー結合部位により、オペレーターは第1のDNAバーコードモジュールの配列を決定できる。
別の例を提供すると、結合できるのは、第1のDNAバーコードモジュールに直接的に結合された第2のDNAバーコードモジュールである。代替的に、結合できるのは、第2のシーケンシングプライマー結合部位である第2の核酸に付着した、第2のDNAバーコードモジュールである第1の核酸の形態をとるポリヌクレオチドである。このシーケンシングプライマー結合部位により、オペレーターは第2のDNAバーコードモジュールの配列を決定できる。第1のDNAバーコードモジュールへのリードスルーがある場合、決定できるのは、これらのDNAバーコードモジュールの両方の配列である。
さらに別の例を提供するために、結合できるのは、第1のDNAバーコードモジュールである第1の核酸、およびDNAバーコードおよび化合物の多段階平行合成におけるステップを特定する第2の核酸を含むポリヌクレオチドである。さらに、または代替的に、第2の核酸は、スプリットプール合成によって作製される化合物の一般的なクラスを特定することができる。さらに、または代替的に、第2の核酸は、スクリーニングされる化合物によって治療される疾患を特定することができる。さらに、第2の核酸は、日付または化学者の名前などを特定できる。
DNAバーコードを合成するための好ましい方法を以下に示し、各DNAバーコードモジュールを徐々に付着させる、同じ反応サイクルを使用する。
ステップ1.TCO基が付着されたビーズを提供する。実際には、ビーズは、数百または数千の同様に付着されたTCO基を有し、各TCO基は、ビーズ上の異なる部位に付着される。また、実際には、スプリットプール法を使用し、クリックケミストリーにより多数のビーズを同時に修飾する。
ステップ2.[テトラジン]-[第1のDNAバーコードモジュール]-[アジド]をビーズに追加し、TCO基をテトラジン群と縮合させる。結果は、以下の構築物である:BEAD-TCO-テトラジン-第1のDNAバーコードモジュール-アジド。実際には、この構築物は任意のTCOまたはテトラジンは含まれていないが、TCOがテトラジンと縮合した際に生成される縮合生成物が含まれる。
ステップ3.任意の洗浄。
ステップ4.アジドをキャップし、TCO末端を作製するためにDBCO-TCOを追加する。結果は以下の構造である。
BEAD-TCO-テトラジン-第1のDNAバーコードモジュール-アジド-DBCO-TCO
ステップ5.任意の洗浄。
ステップ6.第2のDNAバーコードモジュールを付着する以下の試薬を追加する。付着は、成長するDNAバーコードの遠位末端にある。試薬は:
ビーズに対して[テトラジン]-[第2のDNAバーコードモジュール]-[アジド]であり、TCO基をテトラジン群と縮合させる。結果は以下の構築物である:
BEAD-TCO-テトラジン-第1のDNAバーコードモジュール-アジド-DBCO-TCO-[テトラジン]-[第2のDNAバーコードモジュール]-[アジド]
上記のスキームは、より多くのDNAバーコードモジュールを段階的に追加するための一連のステップを含み、これらの追加は、より多くの化学モノマーの追加と平行する。他で述べたように、この「平行」合成は、化学モノマーを付着した後、そのモノマーを特定するDNAバーコードモジュールを接続するか、あるいは、DNAバーコードモジュールを付着した後、その特定の化学モノマーによって特定される化学モノマーを付着することを伴うことができる。
DNAバーコードのクリックケミストリー合成のための化合物
図17は、DNAバーコードモジュール、最終的にはDNAバーコード全体の合成中にデオキシシチジン残基(dC)を接続するのに好適な化合物の化学合成を開示する。開始物質は、N4-アセチル-2’-デオキシ-5’-O-DMTシチジンである。「DMT」という略称は、4,4-ジメトキシトリチルを表す。この有機合成の多段階経路の最終生成物は、シトシン部分、三リン酸基、およびリボース基の3’位置に付着しているプロパルギル基を有する。プロパルギル基は、クリックケミストリーに使用され、アジド基と縮合して共有結合を生成する。縮合後の結果は、残った化学物質(核酸において自然には決して存在しない)が、実行されているクリックケミストリーからの「痕跡」として発生することである。利用可能なのは、クリックケミストリーによって作製されたDNAバーコードの合成によるシーケンシング(sequencing-by-synthesis)について使用できるDNAポリメラーゼであり、DNAポリメラーゼは、痕跡をわたって移動でき、痕跡は、シーケンシングのエラーを引き起こさない。TBAIは、ヨウ化テトラブチルアンモニウムである。
連鎖状形状DNAバーコードの合成
以下の記載では、DNAバーコードを作製するために、DNAバーコードモジュールが一列に組み立てられている。しかしながら、以下に示すテキスト中の図は、テキスト中の図をページに合わせるために、「DNAバーコードモジュール」の代わりに「DNAバーコード」という用語が使用される。図7は、ここに示されるのと同じステップを示すが、ビーズの図などの詳細が追加される。各追加のDNAバーコードモジュールを追加するために、繰り返される一連の反応を使用できる。
DNAヘアピンをコードする末端核酸を含むDNAバーコードを作製するオプション。これは、3プライム末端、シーケンシングプライマーのアニーリング部位を有する核酸、塩基対でない約4塩基の形態をとる屈曲、およびシーケンシングプライマーのアニーリング部位および屈曲して塩基対を形成することが可能なシーケンシングプライマーを含むDNAバーコードに関係する。繰り返すが、シーケンシングプライマーは、シーケンシングプライマーのアニーリング部位にアニーリングし、実際のシーケンシング反応は、アニールされたシーケンシングプライマーの3’末端から開始する。
DNAバーコードを合成する最終的なステップを実行する際、および最終的なDNAバーコードモジュールを成長するビーズ結合DNAバーコードに結合する際、「スプリントオリゴ」は、DNAヘアピンを包括する配列を含むことができる(DNAヘアピンは、この順序で、シーケンシングプライマーのアニーリング部位、相互にまたは任意の塩基の近くの配列と塩基対でない、いくつかのヌクレオチド、およびシーケンシングプライマーを含む)。「スプリントオリゴ」をアニーリングした後、次にDNAポリメラーゼおよびdNTPを追加し、重合は、成長するDNAバーコードの3’末端で起こり、スプリントオリゴを鋳型として使用して重合するものは、次の順序で、(1)シーケンシングプライマーのアニーリング部位、(2)他への教授を伴う塩基対を形成しない4つまたは5つのデオキシリボヌクレオチドの形態をとるヘアピンにおける屈曲、(3)シーケンシングプライマーである。
ヘアピンシーケンシングプライマーの3’末端にある可逆的ターミネーター基。本開示は、ヌクレオチド/可逆的ターミネーター基の予め形成された複合体を、アニールされたシーケンシングプライマーの3’末端に付着させるための試薬、組成物、および方法を提供する。可逆的ターミネーター基は、ヘアピンシーケンシングプライマーの任意の成分であり、ビーズ結合DNAバーコードの一部である。
ステップ1.最初に、ピコウェル内にビーズが配置され、ビーズは、結合したポリヌクレオチドを有し、ポリヌクレオチドの5’末端は、任意でリンカーを用いてビーズに結合される。図7は、ビーズ結合ポリヌクレオチドが、第1のDNAバーコードおよび第1のアニーリング部位を含むことを示す。リンカーは、核酸から作製することができるか、またはそれは、いくつかの他の化学的に作製することができる。好ましくは、リンカーは疎水性であり、好ましくは、リンカーは、ビーズ結合DNAバーコードを疎水性ポリスチレンビーズ、例えば、TentaGel(登録商標)ビーズから分離する。
便宜上、ビーズ結合DNAバーコードの一部である第1のアニーリング部位、および可溶性「スプリントオリゴ」の一部である第1のアニーリング部位は、同じ塩基の配列を有しないが、どちらも「第1のアニーリング部位」と称される(代わりに、塩基の配列は互いに相補的であり、その結果、スプリントオリゴは、ビーズ結合DNAバーコードの第1のアニーリング部位にハイブリダイズでき、したがって、DNAポリメラーゼの鋳型として機能し、スプリントオリゴ上にあるものをコピーすることにより、ビーズ結合DNAバーコードを伸長する。
また、便宜上、ビーズ結合DNAバーコードの一部である第2のアニーリング部位、および可溶性「スプリントオリゴ」の一部である第2のアニーリング部位は、同じ配列を有しないが(しかし代わりに相補的な塩基を有する)、どちらも「第2のアニーリング部位」と称される。
5’末端から3’末端までのビーズ結合DNAバーコードは、以下の順序で、核酸を含み得る:
ビーズ/第1のDNAバーコード/第1のアニーリング部位/
代替的に、5’末端から3’末端までのビーズ結合成長DNAバーコードは、ステップ数をコードする核酸を含み得、ビーズ結合成長DNAバーコードは、以下の順序で、核酸を有する:
ビーズ/第1のDNAバーコード/ステップ数をコードする核酸/第1のアニーリング部位/
代替的に、ビーズ結合成長DNAバーコードは、以下に示すように、機能性核酸(シーケンシングプライマーアニーリング部位)である核酸を含むことができる:
ビーズ/第1のDNAバーコード/シーケンシングプライマーアニーリング部位/第1のアニーリング部位/
これらのテキスト中の図に示されていないのは、ビーズへのDNAバーコードのカップリングを媒介する任意のリンカーである。リンカーは、核酸の形態をとることができるか、またはいくつかの他の有機化学物質で作製できる。
ステップ2.可溶性スプリントオリゴヌクレオチド(スプリントオリゴ)を追加し、このスプリントオリゴは、第1のアニーリング部位、および第2のDNAバーコードモジュール、および第2のアニーリング部位で構成される。
図7はまた、ハイブリダイズされたスプリントオリゴが鋳型として使用されるステップを示しており、DNAポリメラーゼは、第2のDNAバーコードモジュール、および第2のアニーリング部位のビーズ結合成長DNAバーコードへの付着を触媒する。図7は、DNAポリメラーゼがスプリントオリゴを鋳型として使用し、その結果、ビーズ結合DNAバーコードが少し長く成長する(第2のDNAバーコードおよび第2のアニーリング部位の共有結合的な付着による成長。テキストのすぐ下に示されているのは、ビーズ結合成長DNAバーコードにハイブリダイズしたスプリントオリゴの複合体である。
ビーズ/第1のDNAバーコード/第1のアニーリング部位/
第1のアニーリング部位/第2のDNAバーコード/第2のアニーリング部位
図7に示されているいくつかの情報を繰り返すと、すぐ下に示されているのは、スプリントオリゴである:
「第1のアニーリング部位/第2のDNAバーコード/第2のアニーリング部位」
ステップ3.DNAポリメラーゼおよびdNTPを追加して、ビーズ結合DNAバーコードを伸長する。以下は、ビーズ結合DNAバーコードであり、スプリントオリゴは、依然としてハイブリダイズされ、「第2のDNAバーコードモジュール」である核酸および「第2のアニーリング部位」である核酸が付着されているため、ビーズ結合成長バーコードは以前より長くなる。図7はさらにこのステップを示す。スプリントオリゴは、ビーズ結合バーコードの下に表示される:
ビーズ/第1のDNAバーコード/第1のアニーリング部位/第2のDNAバーコード/第2のアニーリング部位
第1のアニーリング部位/第2のDNAバーコード/第2のアニーリング部位
ステップ4.スプリントオリゴを洗浄する。スプリントオリゴは、加熱することにより、すなわち、ピコウェルプレート全体を、例えば、約60度、約65度、約70度、約75度、約80度に約10分間加熱することによりビーズ結合成長バーコードから解離するように促すことができ、または、代替的に、希釈NaOHをピコウェルアレイに追加して中和する。
ステップ5.第2のスプリントオリゴを追加し、これは、ビーズ結合成長スプリントオリゴにハイブリダイズした後、第3のDNAバーコードおよび第3のアニーリング部位のDNAポリメラーゼ触媒による付着を媒介するための鋳型として使用できる。第2のスプリントオリゴは、可溶性試薬であり、以下に示す(しかし、図7には示していない)。
第2のアニーリング部位/第3のDNAバーコード/第3のアニーリング部位/
ステップ6.このオリゴヌクレオチドが対応するビーズ結合「第2のアニーリング部位」にアニーリングできるようにし、DNAポリメラーゼがビーズ結合オリゴヌクレオチドを伸長できるようにし、これにより、以下の補足物を含む:「第3のDNAバーコード/第3のアニーリング部位/
ステップ7.第2のスプリントオリゴを洗浄する。
ステップ4.以下のスプリントオリゴを追加する(この特定の追加は図7には示されていない)。
第3のアニーリング部位/第4のDNAバーコード/第4のアニーリング部位/
この可溶性オリゴヌクレオチドは、ビーズ結合オリゴヌクレオチドの「第3のアニーリング部位」にアニーリングできる核酸を有する。アニールすると、4つのdNTPを有するDNAポリメラーゼが利用され、ビーズ結合オリゴヌクレオチドを伸長して、さらに別のDNAバーコードモジュール(第4のDNAバーコード)をコードするために使用される。上記のステップのサイクルは、化合物のライブラリおよび関連するDNAバーコードを平行して作製するスプリットプール手順全体で繰り返され、各DNAバーコードは、所定の化合物に関連付けされる(各DNAバーコードは、関連する化合物の化学合成の履歴を通知する)。化合物のライブラリの化学合成が完了されている場合、上記のステップのサイクルが停止される。完成されたビーズ結合DNAバーコード化学ライブラリを制御して、次にビーズは、ピコウェルアレイのピコウェルに分配できる。
各ビーズのDNAバーコードは、各ピコウェルに関連付けられたDNAバーコードをさらに構成する。DNAバーコードは、ビーズ結合化合物を特定できる。本開示の配列シーケンシング法は、ビーズが依然としてピコウェル内にある間にピコウェル内で行われる。除外的な実施形態において、本開示は、任意のシーケンシング法を除外することができ、かつシーケンシングに使用される任意の試薬を除外することができ、シーケンシングは、ビーズ結合したDNA鋳型では実行されず、またはシーケンシングは、ピコウェル内で固定化されたビーズ結合DNA鋳型では実行されない。
シーケンシングプライマーのアニーリング部位。一実施形態において、完成されたDNAバーコード内の各DNAバーコードモジュールは、独自のシーケンシングプライマーのアニーリング部位と機能的に連結され、したがって、オペレーターに各DNAバーコードモジュール上で別々のシーケンシング手順を実行する機能を提供する(この実施形態において、各DNAバーコードモジュールは、DNAバーコード全体の合成のステップを特定する(コードする)独自の核酸とも機能的に連結されていることが好ましい。
別の実施形態において、各DNAバーコードは、1つのみのシーケンシングプライマーのアニーリング部位を有し、これは、ビーズ結合DNAバーコードの3’末端またはその近くに配置でき、シーケンシングプライマー自体は可溶性であり、ピコウェルに追加され、次にシーケンシングプライマーのアニーリング部位にハイブリダイズできる。代替的に、シーケンシングプライマーが、DNAヘアピンの一部である場合、このDNAヘアピンは、ビーズ結合DNAバーコードを作製する最終的なステップで「スプリントオリゴ」を介して追加される。図7には、シーケンシングプライマーのアニーリング部位が示されていない。
核酸の3’末端を介してビーズに結合した核酸
本発明で開示される様々な実施形態は、DNAの5’末端を介してDNAをビーズにカップリングすることに関し、他の実施形態では、DNAバーコードまたはDNAタグなどのDNAは、それらの3’末端を介してビーズに結合され得る。DNAの3’ヒドロキシル基は、特定の化学合成条件下(例えば、光延変換)で反応する可能性があり、3’末端をレンダリングすると、損傷し、伸長、連結、または他のステップに関与できなくなる。したがって、DNAタグは、3’末端を介してビーズに付着し、不要な化学反応を防ぎ、DNAバーコードへの損傷を防ぎ得る。
本開示のビーズ結合DNAバーコードに関する除外的な実施形態。除外できるのは、任意のビーズ、微粒子、細粒、樹脂、またはポリマー組成物の物質であり、連鎖状DNAバーコードは、光切断可能なリンカーまたは切断可能なリンカーを介してビーズに連結される。
除外できるのは、ビーズ、微粒子、細粒、樹脂、またはポリマー組成物の物質であり、(1)ビーズ上の第1の位置に結合された連鎖状DNAバーコード、(2)ビーズ上の第2の位置に結合され、第1の位置が第2の位置と同じではない化合物の両方を含まない。好ましい実施形態において、この「化合物」は、複数の化学ライブラリモノマーで作製される。
除外できるのは、ビーズ、微粒子、細粒、樹脂、またはポリマー組成物の物質であり、外面(または外面)および内面(または内面、または内部領域)を有さず、ビーズは、ビーズに結合された少なくとも10,000の実質的に同一の連鎖状DNAバーコードを含まず、少なくとも10,000の実質的に同一の連鎖状DNAバーコードの少なくとも90%は、外面に結合される。換言すると、除外できるのは、結合され連鎖状DNAバーコードの少なくとも90%が、外面に結合されていない任意のビーズである。
除外できるのは、ビーズ、微粒子、細粒、樹脂、またはポリマー組成物の物質であり、実質的にポリアクリルアミドで作製されるか、または任意のポリアクリルアミドを含む。
除外できるのは、ビーズ、微粒子、細粒、ヒドロゲル、樹脂、またはポリマー組成物の物質であり、T7プロモーターなどのプロモーターを含むか、またはポリA領域を含むか、またはプロモーターおよびポリA領域を含む。
2つのDNAバーコードモジュールを有するビーズ結合DNAバーコードを生成する、1サイクルのみのアニーリング/重合を用いた方法。本開示は、ビーズ結合DNAバーコードがアニーリング/重合ステップを1つのみ含む、システム、試薬、および方法を包含する。この実施形態は、以下の図によって表され、第1の図は、スプリントオリゴのアニーリングを示し、第2の図は、DNAポリメラーゼを使用した充填を示す。最終結果は、2つのDNAバーコードモジュールを含む、ビーズ結合DNAバーコードである。この特定の手順では、ビーズ結合開始材料は、任意でリンカー(しかし好ましくは、任意の切断可能なリンカーではない)、任意で、化合物の特定以外の情報をコードする核酸、および任意で、シーケンシングプライマーまたはDNAヘアピンなどの機能性核酸を含むことができる。2つの図がテキスト内で示される(すぐ下を参照されたい):
ビーズ/第1のDNAバーコード/第1のアニーリング部位/
第1のアニーリング部位/第2のDNAバーコード/第2のアニーリング部位
ビーズ/第1のDNAバーコード/第1のアニーリング部位/第2のDNAバーコード/第2のアニーリング部位
第1のアニーリング部位/第2のDNAバーコード/第2のアニーリング部位
3つのDNAバーコードモジュールを有するビーズ結合DNAバーコードを生成する、2サイクルのアニーリング/重合を用いた方法。本開示は、ビーズ結合組成物、システム、および方法を包含し、2つの異なるスプリットオリゴが使用される(第1のスプリントオリゴ;第2のスプリントオリゴ)。この状況では、第1のスプリントオリゴは、第1のアニーリング部位/第2のDNAバーコード/第2のアニーリング部位の構造からなり、第2のスプリントオリゴは、第2のアニーリング部位/第3のDNAバーコード/第3のアニーリング部位の構造からなる。
4つのDNAバーコードモジュールを有するビーズ結合DNAバーコードを生成する、3サイクルのアニーリング/重合を用いた方法。本開示は、ビーズ結合組成物、システム、および方法を包含し、3つの異なるスプリットオリゴが使用される(第1のスプリントオリゴ;第2のスプリントオリゴ;第3のスプリントオリゴ)。この状況では、第1のスプリントオリゴは、第1のアニーリング部位/第2のDNAバーコード/第2のアニーリング部位の構造からなり、第2のスプリントオリゴは、第2のアニーリング部位/第3のDNAバーコード/第3のアニーリング部位の構造からなり、第3のスプリントオリゴは、第3のアニーリング部位/第4のDNAバーコード/第4のアニーリング部位の構造からなる。
5つのDNAバーコードモジュールを有するビーズ結合DNAバーコードを生成する、4サイクルのアニーリング/重合を用いた方法。本開示は、ビーズ結合組成物、システム、および方法を包含し、4つの異なるスプリットオリゴが使用される(第1のスプリントオリゴ;第2のスプリントオリゴ;第3のスプリントオリゴ;第4のスプリントオリゴ)。この状況では、第1のスプリントオリゴは、第1のアニーリング部位/第2のDNAバーコード/第2のアニーリング部位の構造からなり、第2のスプリントオリゴは、第2のアニーリング部位/第3のDNAバーコード/第3のアニーリング部位の構造からなり、第3のスプリントオリゴは、第3のアニーリング部位/第4のDNAバーコード/第4のアニーリング部位の構造からなり、第4のスプリントオリゴは、第4のアニーリング部位/第5のDNAバーコード/第5のアニーリング部位の構造からなる。
複数のDNAバーコードモジュールを有するビーズ結合DNAバーコードを生成するための、複数のステップのアニーリング/重合を用いた実施形態。本開示は、連鎖状バーコードに関連し、1つのスプリントオリゴのみを使用する(2モジュールDNAバーコードを作製する)、2つのスプリントオリゴのみを使用する(3モジュールのDNAバーコードを作製する)、3つのスプリントオリゴのみを使用する(4モジュールのDNAバーコードを作製する)、4つのスプリントオリゴのみを使用する(5モジュールのDNAバーコードを作製する)、5つのスプリントオリゴのみを使用する(6モジュールのDNAバーコードを作製する)、6つのスプリントオリゴのみを使用する(7モジュールのDNAバーコードを作製する)などのビーズ結合組成物、システム、および方法を包含する。
包含されるのは、少なくとも1つのスプリントオリゴ、少なくとも2つのスプリントオリゴ、少なくとも3つのスプリントオリゴ、少なくとも4つのスプリントオリゴ、少なくとも5つのスプリントオリゴ、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも20のスプリントオリゴ、または20未満、15未満、10未満、8未満、6未満、4未満、3未満、2未満のスプリントオリゴを使用するビーズ結合組成物、システム、および方法である。これらの数は、スプリントオリゴ自体、ならびにスプリントオリゴを追加するステップの数、および成長するビーズ結合DNAバーコードに追加されるDNAモジュールの数を示す。
DNAバーコードへの損傷を低減する
直交性DNAバーコードを使用して損傷を低減する(連鎖状DNAバーコードの代わりに)。連鎖状DNAバーコードおよび直交性DNAバーコードのトピックを理解する1つの方法は、一方が他方を超えて有する有意性に注意することである。連鎖状バーコード化を超える直交性バーコード化の利点は、以下のとおりである。成長する化合物の各モノマーの付着で、平行して付着されるのは、化学ライブラリを作製するための化合物ライブラリモノマー、および完成された完全長DNAバーコードを作製するDNAバーコードモジュールである。
連鎖状バーコード化では、任意の所定のモジュールの付着が不完全である場合(つまり、すべての付着部位が必要とされるモジュールと正常に結合されなかった場合)、完成されたバーコードの配列は、正確ではないであろう。「正確ではない」という表現は、不完全なカップリングにより塊が欠落し、完成された生成物が、完成された正しいDNAバーコードであるとユーザーが想定していたことを意味する。ここで、すべてのDNAモジュールの付着に失敗したため、完成されたDNAバーコード配列は誤りを含むであろう。対照的に、直交性バーコード化は、各個々のDNAモジュールがビーズ上の独自の固有の付着部位に共有結合的に結合する。また、DNAモジュールが、ビーズ上の所定の部位に付着されると、すでにビーズに結合されているDNAモジュールに、さらにDNAモジュールを結合する必要はない。
架橋剤を使用することにより損傷を低減する。本開示は、ビーズ結合DNAバーコードへの損傷を低減するため、および部分的に合成されたビーズ結合DNAバーコードへの損傷を低減するための試薬および方法を提供する。各DNAバーコードモジュールは、成長するビーズ結合DNAバーコードに付着する前に、二本鎖DNA(dsDNA)の形態をとることができ、このdsDNAは、マイトマイシンCなどのDNA架橋剤で処理される。dsDNA形態のDNAバーコードの合成の完了後、このdsDNAはssDNAに変換される。dsDNAからssDNAへの変換は、DNA鎖の1つにウラシル(U)残基を有する場合に有効であり、ウラシル残基の位置でのDNAの切断は、ウラシル-N-グリコシダーゼによって触媒される(2017年9月25日に出願されたシリアル番号第62/562,905号の図5を参照されたい。シリアル番号第62/562,905号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。上記は、ビーズ結合化合物を作製するために使用される試薬によって、成長するDNAバーコードに与えられる損傷について言及する。
DNAバーコードを作製するために二本鎖DNA(dsDNA)を使用して損傷を低減する。ビーズ結合DNAバーコードへの損傷を低減し、部分的に合成されたDNAバーコードへの損傷を低減するための別の方法は、DNAバーコードを二本鎖DNAの形態で合成することであり、相互に付着されているDNAバーコードモジュールの各々は、dsDNAの形態をとり、二本鎖の各々は、DNAヘッドピースを介して安定化される。完成されたDNAバーコードの最終的なシーケンシングのために、鎖の1つは、DNAヘッドピースから切断され、除去される。上記は、ビーズ結合化合物(この化合物が化学ライブラリのメンバーである場合)を作製するために使用される試薬によって、成長するDNAバーコードに与えられる損傷について言及する。
ヘアピンを含むことにより損傷を低減する。ビーズ結合DNAバーコードへの損傷を低減するためのさらに別の方法は、ヘアピンを形成するための自己組織化を介してDNAバーコードを合成することであり、このDNAバーコードは、ヘアピンの第1の突起がヘアピンの第2の突起にアニールすることで自己組織化する。
合成されるDNAバーコードが二本鎖DNA(dsDNA)の形態をとる場合、DCM、DMF、DMAなどの溶媒は、DNAバーコードを変性できる。上記の方法および試薬は、変性を防ぐことができる。
dsDNAの密封された末端を使用することにより損傷を低減する。ビーズ結合DNAバーコードへの損傷を低減し、部分的に合成されたDNAバーコードへの損傷を低減するための別の方法は、二本鎖DNA(dsDNA)を使用し、7-aza-dATPおよびdGTPを介してこのdsDNAの末端を密封することである。
タンパク質性溶媒を回避、強酸および強塩基を回避、強力な還元剤および酸化剤を回避することにより損傷を低減する。化学物質の種類は、デオキシリボ核酸(DNA)の存在と互換性があり、ビーズ結合DNAまたはビーズ結合でないDNAは、タンパク質性溶媒の欠如が必要であり得、強酸性条件を回避し、t-ブチルリチウムのような強塩基を回避し、水素化アルミニウムリチウムなどの強力な還元剤を回避し、いくつかのハロゲン化アルキルなどのDNA塩基と反応する試薬を回避し、いくつかの酸化剤を回避する(Luk and Sats(2014)DNA-Compatible Chemistry(4章)、A Handbook for DNA-Encoded Chemistry,1st ed.John Wiley and Sons,Inc.を参照されたい)。
他で述べたように、「DNAバーコード」という用語は、化合物全体を特定するポリヌクレオチドを指すことができ、対照的に、「DNAバーコードモジュール」は、化合物を構成するモノマーの1つのみを指すことができる。
DNA互換性のある化学物質を使用することにより核酸への損傷を低減する。Satzらは、ビーズ結合核酸と互換性のある様々な化学物質を開示する(Satz et al(2015)Bioconjugate Chemistry.26:1623-1632;Satz et al(2016)BioconjugateChem.27:2580-2580で補正)。前述のSatzらの記載は、DNA/化学ライブラリメンバー複合体で実行される化学反応に関するものであるが、記載されるDNA互換性のある化学物質の種類も関連し、有機化学は、ビーズ結合化合物およびビーズ結合DNAを含むビーズ上で実行される。
ベンズイミダゾール化合物、イミダゾリジノン化合物、キナゾリノン化合物、イソインドリノン化合物、チアゾール化合物、およびイミダゾピリジン化合物の形成のためのDNA互換性のある反応が開示される(Satzら、表1、エントリー1~6を参照されたい)。
さらに、DNA互換性のある保護基には、alloc脱保護、BOC脱保護、t-ブチルエステル加水分解、メチル/エチルエステル加水分解、ならびにヒドラジンおよびラネーニッケルによるニトロ還元が含まれると開示される(Satzら、表1、エントリー7~11を参照されたい)。
さらに、試薬をDNAにカップリングする方法が開示されており、結合は、すでにDNAに付着されている官能基で起こる。方法には、アルキンおよびハロゲン化アリールの間の薗頭カップリングの最適化された手順であるスズキカップリング、ジメチル-1-ジアゾ-2-オキソプロピルホスホネートを使用したアルデヒドのアルキンへの変換、精製されたアルキンから直接的にトリアゾールを付加する新しい方法、pH9.4バッファーでイソシアネート試薬を用いると改善された反応が発生する、イソシアネート構成要素とアミン官能基化DNAとの反応について改善された方法が含まれる(Satzら、表1、エントリー12~15を参照されたい)。
試薬をDNAにカップリングする追加の方法が開示されており、カップリングは、すでにDNAに付着されている官能基で起こる。これらには、第一級アミンをDNAに結合させる方法、DNA複合化チオ尿素を形成するための最適化された手順、アミン官能化DNA複合体と反応できる構成要素としてヘタリルハライドを使用した、第二級アミンをアルキル化および脂肪族第一級アミンをビスアルキル化、一級アミンDNA複合体をモノアルキル化する方法、ならびにWittig反応の方法が含まれる(Satzら、表1、エントリー16~20を参照されたい)。
DNA修復酵素を介して損傷されたDNAを低減する。酵素、DNA損傷結合タンパク質、およびヘリカーゼを含む、様々なタンパク質は、DNA損傷の修復に利用可能である。市販されているのは、酸化による損傷、放射線誘導性損傷、紫外線誘導性損傷、ホルムアルデヒド付加物からの損傷、およびアルキル基付加物の形態をとる損傷を修復できるDNA修復タンパク質である。損傷した塩基を除去するグリコシド酵素(ssDNAまたはdsDNAを切断しない)は、5-ホルミルウラシル、デオキシウリジン、および5-ヒドロキシメチルウラシルの修復に利用可能である。T4PDGは、ピリミジン二量体の修復に利用可能である。hNEIL1およびFpgは、酸化ピリミジン、酸化プリン、アプリン部位、およびピリミジン部位の修復に利用可能である。EndoVIIIは、酸化ピリミジンおよびピリミジン部位の修復に利用可能である。EndoVは、ミスマッチの修復に利用可能である。HaaGは、アルキル化プリンの修復に利用可能なグリコシラーゼである。DNA修復酵素がギャップを残す場合、二本鎖DNAは、ギャップを有し、1つ以上の連続したデオキシリボヌクレオチドは、鎖の1つを欠損しており、ギャップを埋めるために様々なDNAポリメラーゼが利用可能である(Catalog(2018)New England BioLabs,Ipswich,MAを参照されたい)。
様々なDNA修復酵素およびDNA修復システムは、哺乳動物、酵母、および細菌から単離されている。これらには、ヌクレオチド除去修復(NER)、直接修復、塩基除去修復、転写共役DNA修復、および組換え修復を媒介するものが含まれる。鎖間DNA架橋は、NERおよび相同組換えを組み合わせて使用することで修復できる。直接修復には、フォトリアーゼ酵素を介したシクロブタンピリミジンダイマーおよび6~4生成物の修復が含まれる。直接修復には、DNAメチルトランスフェラーゼによるO6-メチルグアニンからのO6-メチルの除去も含まれる。Sancar et al(2004)Ann.Rev.Biochem.73:39-85;Hu,Sancar(2017)J.Biol.Chem.292:15588-15597を参照されたい。
本開示は、DNA修復酵素での処理によって、またはDNA修復タンパク質の複合体などによって、ビーズ結合DNAバーコードへの損傷を修復するためのシステム、試薬、および方法を提供する。
DNAをそれらの3’末端を介してビーズにカップリングすることにより、損傷を低減する。特定の化学変換は、核酸の露出した3’-ヒドロキシル基を損傷し得る。例えば、光延反応は、一級および二級アルコールからエステル、フェニルエーテル、チオエーテル、および様々な他の化合物への変換を可能にし、これにより、露出した3’末端が、後続の処理ステップに反応しなくなるか、または現在変更されている3’末端が、さらなる化学反応に関与する可能性がある。いくつかの実施形態において、DNAタグは、それらの3’末端を介してビーズに付着され得、したがって5’末端のみが溶液に曝露される。
本開示の試薬、システム、および方法は、ビーズ結合DNAまたはビーズ結合DNAタグなどのビーズ結合核酸を包含し、ビーズへのカップリングは、DNAの3’末端(terminus)(または3’末端(end))を伴う。DNAバーコードを構成するssDNAがssDNAの3’末端を介して結合されている場合、1つのシーケンシングプライマーのみをハイブリダイズすることによりシーケンシングを開始でき、このシーケンシングプライマーは、DNAバーコード全体の上流にハイブリダイズし、このハイブリダイズは、結合されたssDNAのビーズ結合末端であるか、またはその近くである。1つのシーケンシングプライマーのみを使用する代わりに、複数のシーケンシングプライマーを使用することができ、各シーケンシングプライマーは、上流で特定のDNAバーコードモジュールにハイブリダイズする。例えば、所定のDNAバーコードに5つのDNAバーコードモジュールが含まれている場合、DNAは、3’末端を介してビーズに結合され、DNAバーコードは、5つの異なるプライマーアニーリング部位を含むことができ、各プライマーアニーリング部位は、所定のDNAバーコードモジュールのまさに上流、またはすぐ上流に位置される。
二本鎖DNA(dsDNA)カップリングの実施形態。他の実施形態において、ビーズに結合されるのは、dsDNAであり、dsDNA中の鎖の1つのみの3’末端が、ビーズに結合される。dsDNAを伴う5’カップリングの実施形態において、結合できるのはdsDNAであり、dsDNAの鎖の1つのみの5’末端が、ビーズに結合される。
(V)化合物とビーズとのカップリング
本開示は、(1)化学ライブラリメンバーをビーズなどの基質に付着させるリンカー、(2)核酸バーコードをビーズなどの基質に付着させるリンカー、(3)例えば、UV光により切断可能、プロテアーゼなどの酵素により切断可能である、切断可能なリンカー、(4)切断不可能なリンカー、(5)二官能性リンカー、(6)多機能性リンカー、(7)連鎖に使用される複数のビーズを提供する。例えば、利用可能なものは、4-ヒドロキシメチル安息香酸(HMBA)リンカー、4-ヒドロキシメチルフェニル酢酸リンカーである(Camperi,Marani,Cascone(2005)Tetrahedron Letters.46:1561-1564を参照されたい)。
「切断不可能なリンカー」は、所定の有機化学手順のステップ中に使用される任意の試薬、条件、または環境によって検出可能に切断されないリンカーとして特徴付けされ得る。代替的に、「切断不可能なリンカー」は、所定の有機化学手順の他の反応物、生成物、または試薬に対して許容できないほど破壊的である試薬、条件、または環境を除いて、切断できないリンカーとして特徴付けされ得る。
二官能性リンカー、または他の多機能性リンカーは、フォーク(ヒトが食物を消費するために使用するフォーク)の形態をとることができ、フォークのハンドルは、ビーズに付着されたおり、フォークの各尖叉は、さまざまな化学物質の1つに連結される。例えば、1つの尖叉は、化学ライブラリメンバーに連結できる。別の尖叉は、DNAバーコードに連結できる。さらに別のフォークの尖叉は、金属イオンに連結できる。
複数のビーズの使用に関して、本開示は、(1)第2のビーズに連結された付着された核酸バーコードを含む第1のビーズであって、第2のビーズが、付着された化学ライブラリメンバーを含む、第1のビーズ、(2)第2のビーズに連結された付着された核酸バーコードを含む第1のビーズであって、第2のビーズが、付着された化学ライブラリメンバーを含み、第3のビーズが、付着され(第1のビーズおよびだい2のビーズの一方または両方に)、第3のビーズが、共有結合的に付着される試薬を含む、第1のビーズなどの複数のビーズの実施形態を提供する。付着された試薬は、酵素であることができ、酵素は、付着された化学ライブラリメンバーの活性をアッセイするために使用される。
(VI)化合物を作製するためにモノマーを結合する
例示的な化学モノマー。本開示の組成物および方法のための化学モノマーとしての使用に好適なアミノ酸誘導体を図4に示す。図は、例えば、AnaSpec EGT Group,Fremont,CA;Sigman-Aldrich,St.Louis,MO;Acros Organics(ThermoFisher Scientificの一部)、またはCombi-Blocks,San Diego,CAなどの化学物質の供給元を示す。
追加の化学モノマーは、図22~27に示される。図22~27の各々は、構造、化学名、および関連するDNAモジュールバーコードを提供する。図の化合物1~6(図22)に開示されているように、それぞれのバーコードは、ACGT、ACTC、AGAC、AGCG、AGTA、およびATATである。化合物7~10(図23)の場合、それぞれのバーコードは、ATGA、CACG、CAGC、およびCATAである。化合物11~16(図24)の場合、それぞれのバーコードは、CGAG、CGCT、CGTC、CTAC、CTGT、およびGACTである。化合物17~21(図25)の場合、それぞれのバーコードは、GAGA、GCAC、GCTG、GTAG、およびGTCAである。化合物22~26(図26)の場合、それぞれのバーコードは、GTGC、TAGT、TATC、TCAG、およびTCGCである。また、化合物27~30(図27)の場合、それぞれのバーコードは、TCTA、TGAT、TGCA、およびTGTGである。これらのバーコードは、単なる例示である。任意の所定の化合物のライブラリについて、DNAバーコードの異なるコレクションを使用して、そのライブラリで化合物を構築するために使用される化学モノマーの各々を特定し得る。
カップリング反応。以下は、化学モノマーをビーズに、および互いにカップリングすることを記載しており、すなわち、第1のステップは、切断可能なリンカーを介してビーズに第1の化学モノマーを直接的にカップリングし、その後、後続の化学モノマーは、1つずつ相互に接続される。以下に示す条件は、DNA互換である。
Tentagel(登録商標)ビーズ上で3つのアミノ酸化合物を作製する方法について記載する。Fmoc-Photo-Linker、4-{4-[1-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ)エチル]-2-メトキシ-5-ニトロフェノキシ}ブタン酸)で修飾されたFmoc保護樹脂(1 mg、Rapp Polymere GmbH、10 um、TentaGel M-NH2、0.23 mmol/g)、またはFmoc保護を備えた別の適切なリンカーは、DMA(150 uL)の反応プレート(Merck Millipore Ltd、0.45 um疎水性PTFE)の各ウェル内に懸濁された。Resprep VM-96真空マニホールドを用いて、プレートの底部を真空にして溶剤を除去した。Fmoc保護基は、DMF中の5%ピペラジン、2%DBUの混合物150 uLに樹脂を懸濁することで除去した。プレートをExcel Scientific Alumna Sealで密封し、40℃で15分間振とうした。真空を適用して溶媒を除去し、脱保護手順を5分間繰り返した。濾過後、各ウェルを2XDMA、3XDCM、1XDMAの各150uLで洗浄し、各洗浄の間に真空を適用して溶媒を除去した。次に、室温で2分間放置した60mMのFmoc-アミノ酸、80mMのOxyma、200mMのDIC、および80mMの2,4,6-トリメチルピリジンの前活性化混合物150μLを添加して、樹脂の各ウェルを適切なアミノ酸でアシル化した。プレートを再度密封し、40度で1時間振盪した。濾過後、各ウェルを2XDMAおよび3XDCMの各々150μLで洗浄した。各ウェル内のビーズを150ulのDCMに再懸濁し、各ウェルの内容物をピペット操作を介して1つの容器に組み合わせた。組み合わせたビーズを完全に混合し、適切なウェル(1mg/ウェル)内に等量でピペッティングしてプレートに再分配する。真空を適用することにより溶媒を除去することで、各ウェルは次の適切なステップの準備ができる。追加のアミノ酸カップリングごとに、最初にFmoc脱保護ステップが繰り返され、続いて目的のアミノ酸とのカップリングステップが繰り返される。スプリットプールが必要な場合は、結合および再分配の方法が繰り返される。
ビーズ上でスプリットプール法により3量体アミノ酸を作製する方法を記載する。Fmoc-Photo-Linker、4-{4-[1-(9-フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ)エチル]-2-メトキシ-5-ニトロフェノキシ}ブタン酸)で修飾されたFmoc保護樹脂(1 mg、Rapp Polymere GmbH、10 um、TentaGel M-NH2、0.23 mmol/g)、または任意の他の適切なリンカーは、DMA(150 uL)の反応プレート(Merck Millipore Ltd、0.45 um疎水性PTFE)の各ウェル内に懸濁された。Resprep(登録商標)VM-96真空マニホールドを用いて、プレートの底部を真空にして溶剤を除去した。Fmoc保護基は、DMF中の5%ピペラジン、2%DBUの混合物150 uLに樹脂を懸濁することで除去した。プレートをExcel Scientific Alumna Sealで密封し、40℃で15分間振とうした。真空を適用して溶媒を除去し、脱保護手順を5分間繰り返した。濾過後、各ウェルを2XDMA、3XDCM、1XDMAの各150uLで洗浄し、各洗浄の間に真空を適用して溶媒を除去した。次に、室温で2分間放置した60mMのFmoc-アミノ酸、80mMのOxyma、200mMのDIC、および80mMの2,4,6-トリメチルピリジンの前活性化混合物150μLを添加して、樹脂の各ウェルを適切なAAでアシル化した。プレートを再度密封し、40℃で1時間振盪した。濾過後、各ウェルを2XDMA、3XDCM、1XDMAの各々150uLで洗浄した。追加のAAカップリングごとに、最初にFmoc脱保護ステップが繰り返され、続いて目的のAAとのカップリングステップが繰り返される。各連続するカップリングを分析するために、1mgのビーズの部分を100uLのDMSOに懸濁し、365nm LEDの全出力に2時間曝露した。樹脂を濾過し、濾液をAgilent Poroshell SB-C-18、3.0X50mm、2.7umカラムを備えたAgilent 1100シリーズLCMSに注入する。1.2mL/minの流量で、4分間にわたって水中の0.1%TFA中の5%CH3CNから0.1%TFA中の100 CH3CNへの勾配、および220nmでモニタリングを行った。
レナリドマイド(Revlimid(登録商標))を付着させた非アミノ酸ペンダントを作製する実験。これは、脱保護後の最終的なアミノ酸に付着する。これもスピン中で行われた。樹脂の各ウェルを、DMA中の40mMのクロロ酢酸、40mMのOxyma、80mMのDIC、および40mMのTMPの5分間前処理した混合物150uLでアシル化した(Fmoc脱保護後)。プレートを密封し、40℃で1時間振盪した。各ウェルを3XDMA、3XDCM、および2XDMAの各々150μLで洗浄した。次に、樹脂をDMA中の100mMのK2CO3、および100mMのRevの懸濁液に再懸濁した。プレートを密封し、室温で3時間振盪した。樹脂を、2X50/50 DMA/水、3XDMA、3XDCM、および2XDMAの各150uLで洗浄した。
所定のビーズに付着された化合物の合成の忠実度の程度を定義する。これは完成された化合物に関係し、化合物は、化学ライブラリのメンバーである。各化学化合物は、部分的または完全に、化学モノマーから作製され得る。以下は、所定のビーズに付着された化合物の特徴である。この所定のビーズは、化合物のライブラリのスプリットプール系合成の生成物であり得、各ビーズは、固有の化合物を有する。
化学ライブラリのメンバーは、固相合成を介して、ビーズ上などの固体担体上で合成できる。ペプチド結合を有する化学物質の固相合成は、以下の2つの化学基の1つを使用して特徴付けされる。第1の化学基は、N-アルファ-9-フルオレニル-メチルオキシカルボニル(Fmoc、塩基不安定)である。第2の化学基は、tert-ブチルオキシカルボニル(tBoc、酸不安定)(Vagner,Barany,Lam(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:8194-8199を参照されたい)である。FmocおよびtBocは、ペプチド基質を保護するために使用できる保護基であり、Fmoc基またはtBoc基は、アルファ-アミノ基に付着される(Sigler,Fuller,Verlander(1983)Biopolymers.22:2157-2162)。
好ましくは、所定のビーズに結合した化学ライブラリのメンバーの少なくとも99.5%、少なくとも99.0%、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも85%、または少なくとも80%は、合成が完了した後、完全に同じ化学構造を有する。化学ライブラリメンバーの多段階合成における1つ以上のステップで発生する可能性がある不完全なカップリングが起こり得る。この理由で、本開示の組成物は、以下の限定または範囲のうちの1つによって特徴付けられ、限定され得る。
本開示によってさらに提供されるのは、所定のビーズに結合された化学ライブラリのメンバーの少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、または少なくとも70%、または少なくとも80%、または少なくとも90%、または少なくとも95%、または少なくとも99%が、完全な合成後、正確に同じ化学構造を有する方法および試薬である(これらの数値は、固相合成中に発生する可能性のあるエラー、例えば、1つの成長する化合物が化学モノマーの1つを受け取ることができないことを考慮し、反映している。また、これらの数値は、固相合成中に発生する可能性のある任意のモノマーへの化学的損傷を考慮し、反映している)。
除外的な実施形態において、本開示は、「正確に同じ構造」についての上記のカットオフ値の1つを満たさない任意の方法または試薬を除外することができる。
代替の実施形態において、2個のビーズ、3個のビーズ、4個のビーズ、5個のビーズ、約5~10個のビーズ、約10~20個のビーズ、約20~40個のビーズ、約40~80個のビーズは、ビーズの集団に、同様の等しい化合物を含む(固相合成中の化学モノマーの取り込みの任意のエラーを考慮せず、有機合成中に化学モノマーに発生する化学的損傷を考慮せずに)。
クリックケミストリーの導入。Jewettらにより、「クリック反応が定義されている。それらは、選択的であり、高収率であり、良好な反応速度を有する。成分が周囲の生物学的環境に対して不活性であるクリック反応のサブクラスは、双直交と称される(Jewett and Bertozzi(2010)Chem.Soc.Rev.39:1272-1279)。「クリックケミストリー」は、炭素-X-炭素などのヘテロ原子連結と一緒に、小単位を連結するために使用できる。クリックケミストリーは、薬物または薬物候補の合成のために、単独で、または他の種類の化学反応と組み合わせて使用できる。クリックケミストリーは、コンビナトリアルケミストリーに使用される手順でうまく機能する。クリックケミストリーの反応は、高収率、不可逆的、酸素または水に反応しないことを特徴とする。「クリックケミストリー」で使用される化学反応のクラスには、(1)環状付加反応、特に1,3-双極性ファミリーおよびヘテロ-ディールスアルダー反応から、(2)エポキシド、アジリジン、および環状硫酸塩などの歪んだ複素環式分子と同様の求核開環反応、(4)非アルドール型のカルボニル化学、ならびに(5)酸化反応およびいくつかのマイケル付加反応と同様に、炭素-炭素多重結合への付加が含まれる。クリックケミストリー反応は、通常20kcal/molを超える高い熱力学的な駆動する力によって区別されるが、対照的に、非クリックケミストリー反応は、適度な熱力学的な駆動する力のみで結合を形成することを伴う(Kolb and Sharpless(2003)Drug Discovery Today.8:1128-1137,Kolb,Finn,Sharpless(2001)Angew.Chem.Int.Ed.40:2004-2021)。
テトラジンおよびトランスシクロオクテン(TCO)。1,2,4,5-テトラジンなどのテトラジンは、Diels-Alderシクロ付加を介して、trans-シクロオクテン(TCO)と反応できる(Devaraj,Haun,Weissleder(2009)Angew.Chem.Intl.48:7013-7016)。
バックワルド・ハートウィッグアミノ化。バックワルド・ハートウィッグアミノ化反応は、医薬品の固相合成に使用できる。このアミノ化反応は、炭素-窒素結合を合成するために使用され、反応は、ハロゲン化アリールとアミン(R1-NH-R2)が、パラジウムによって触媒され、アミンが、ハロゲン化物に置き換わるアリール生成物を生成し、アミノ基の窒素が、芳香環に直接的に付着されることを伴う。最終的な結果は、炭素(アリール基の)と窒素(アミノ基の)の結合を伴う生成物である。別の言い方をすれば、この反応は、ハロゲン化アリールを対応するアニリンに変換する。バックワルド・ハートウィッグアミノ化は、様々なアミンと互換性があり、コンビナトリアルケミストリーに好適である(Zimmermann and Brase(2007)J.Comb.Chem.9:1114-1137)。
ヒュスゲン環化付加。ヒュスゲン1,3-双極性環化付加反応は、アルキンおよび有機アジドを伴う。アルキンは、R-C=CHの構造を有する。アジドは、R-N+=N=N-の構造を有する。銅触媒は、ヒュスゲン環化付加反応の速度を加速する。ヒュスゲン反応は、「クリックケミストリー」または「クリック反応」を介して機能する。ヒュスゲン反応は、銅で触媒されると、小分子剤を作製するのに好適な1,2,3-トリアゾール核を生成できる。ヒュスゲン反応は、少なくとも保護された形態の場合、アミノ酸側鎖の存在と互換性がある。1,2,3-トリアゾールで作製された分子は、ポリペプチドのアミド結合と同様の結合を有し得、したがってこれらの分子は、ペプチド結合の代替となり得る(Angell and Burgess(2007)Chem.Soc.Rev.36:1674-1689)。
ペプチド核酸(PNA)。本開示は、ペプチド核酸を合成するためのスプリットプール、コンビナトリアルケミストリー、または固相化学の方法を提供する。ペプチド核酸は、オリゴヌクレオチドの類似体である。それらは、ヌクレアーゼによる加水分解に抵抗性である。それらは、それらの標的RNA配列に強く結合することができる。ペプチド核酸の細胞への取り込みは、「細胞透過性ペプチド」によって強化できる(Turner,Ivanova,Gait(2005)Nucleic Acids Res.33:6837-6849;Koppelhus(2008)Bioconjug.Chem.19:1526-1534)。ペプチド核酸は、固相合成およびコンビナトリアル合成によって作製できる(Quijano,Bahal,Glazer(2017)YaleJ.Biology Medicine.90:583-598;Domling(2006)Nucleosides Nucleotides.17:1667-1670を参照されたい)。
本開示は、ビーズ結合化合物を包含し、化合物は、1つのみのモノマーの形態をとる。例えば、このビーズ結合化合物は、レナリドマイドの形態をとることができるか、またはカルボン酸基が付着されたレナリドマイドの形態、またはアミノ基が、カルボン酸基を有する小さな化学部分で修飾されているレナリドマイドの形態をとることができ、またはこの化合物は、レナリドマイドの立体異性体もしくは鏡像異性体であるレナリドマイド類似体である。
(VII)スプリットプール合成および平行合成
これは、化合物のライブラリを合成するための「スプリットプール」法の使用、ならびにビーズ結合化合物およびビーズ結合DNAバーコードの同時合成に「スプリット「プール」法が使用される方法に関する。これは、化合物の混合セットを作製するためのスプリット化およびプール化についても記載する。後のある時点で、以下に開示されているのは、非アミノ酸のカップリング、およびポリエチレングリコール(PEG)で修飾されたビーズの調整である。
本開示は、化学ライブラリを生成するためのスプリットプール合成を提供する。一実施形態において、この方法は、(a)ビーズを異なる容器に分割する、(b)各容器に異なる構成要素を追加するステップを伴う。例えば、3つの容器が使用されている場合、第1の含有物に種A、第2の容器に種B、第3の容器に種Cを追加して反応させ、種は、容器内のビーズの付着部位に共有結合的に結合し、(c)すべてのビーズを1つの容器にプールし、(d)ビーズを3つの容器に分割し、(e)各容器に異なる構成要素を追加し、種Aは、第1の容器に追加され、種Bは、第2の容器に追加され、種Cは、第3の容器に追加され、種は、以前に付着されていた第1の種に共有結合的に結合する(Stockwell(2000)Trends Biotechnol.18:449-455を参照されたい)。
本開示のスプリットプール合成は、各化学的カップリングステップ(化学ライブラリメンバーを作製する)の前または後のいずれかに、DNAバーコードカップリングステップを含み、このDNAバーコードは、そのステップで結合されている化学物質を特定する。
除外的な実施形態において、本開示は、平行合成の所定のステップについて、化学物質を付着させる前にバーコードが付着される方法および試薬を除外することができる。逆に、本開示は、平行合成の所定のステップについて、バーコードを付着させる前に化学物質が付着される方法および試薬を除外することができる。
スプリットプール法で調整されるビーズ結合化学ライブラリの特徴の1つは、各ビーズに1種類の化合物のみが付着することである。カップリングが不完全な場合、例えば、所定のスプリットプールステップで、5,000付着部位のうち、4,000のみが目的の化学種と正常にカップリングされた場合、いくつかの不均一性が発生するであろう。
平行合成。本開示の好ましい実施形態において、化合物および関連するDNAバーコードの有機合成に平行合成を使用することができる。実際には、1つ以上の化学モノマーによるビーズの修飾および1つ以上のDNAバーコードモジュールによる同じビーズの修飾は、厳密に平行しているわけではない。実際には、ビーズは、1つ以上の化学単位(化学モノマー)を受け取り、続いてその特定の化学単位をコードするDNAバーコードモジュールを受け取る。「平行」という用語は、化学ライブラリモノマーのポリマーが成長するにつれて、DNAバーコードモジュールのポリマーも成長するという事実を指す。すべてのDNAバーコードモジュールがビーズに付着されており、連鎖状構造または直交性構造を形成する場合、完全長DNAバーコードは、「DNAバーコード」と称される(DNAバーコードモジュールだけではない)。
付着された化学ライブラリメンバーの総数に対する、外部に付着されたDNAバーコードの数の比率。
これは、ビーズの外面および内面に関する。外部に付着されたDNAバーコード(内部に付着されたDNAバーコードの数を考慮せず)、および付着された化学ライブラリメンバー(外部表面および内部表面の両方に付着された)を有する所定のビーズの場合、外部に付着されたDNAバーコード数と、付着された化学ライブラリメンバーの総数との比率は、例えば、約0.1:100、約0.2:100、約0.5:100、約1.0:100、約2:100、約5:100、約10:100、約20:100、約30:100、約40:100、約50:100、約60:100、約70:100、約80:100、約90:100、約1:1、約100:150、約100:200、約100:400、約100:600などであり得る。除外的な実施形態において、本開示は、上記の値の1つに適合する任意のビーズ、または任意のビーズの集団を除外することができる。
典型的なビーズのDNAバーコードの均一性;典型的なビーズの化学ライブラリメンバーの均一性
本開示は、任意の所定のビーズ(または任意のビーズの集団)について、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99.5%などである「化学ライブラリの均一性」を提供する。
厳密性の低い実施形態において、本開示は、任意の所定のビーズ、または代替的に、任意の所定のビーズ集団について、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%である「化学ライブラリの均一性を提供する。
同様に、本開示は、DNAバーコードなどのバーコードの均一性を評価するための上記のカットオフ値を提供する。
DNAバーコードの均一性および化学ライブラリメンバーの均一性は、実験室マニュアルまたはノートの方法項で計画され、所望されるとおりの正確な配列に一致する総集団の割合で定義され得る。
除外的な実施形態において、本開示は、上記のカットオフ値の1つ以上に適合しない任意の試薬、組成物、または方法を除外することができる。
ビーズの集団の均一性を評価する場合、ビーズの集団全体にわたって均一性が所望される状況では、ビーズ#1、ビーズ#2、ビーズ#3、ビーズ#4、ビーズ#5、ビーズ#6、ビーズ#7などの合計の均一性を考慮する必要がある。
除外的な実施形態において、本開示は、任意のビーズ、または任意のビーズの集団を除外することができ、DNAバーコードの均一性は、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99.5%などではない。また、除外的な実施形態において、本開示は、任意のビーズ、または任意のビーズの集団を除外することができ、化学ライブラリメンバーの均一性は、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも94%、少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99.5%などではない。
内部に付着されたDNAバーコードと外部に付着されたDNAバーコードの比率
本開示のいくつかの実施形態において、DNAバーコードが主に外面に付着されているビーズを製造および使用することが所望される場合がある。内部DNAバーコードを伴うビーズを作製および使用しない1つの理由は、内部空間へのDNAオリゴマーの浸透が低く、内部空間へのDNAリガーゼ(完成されたDNAバーコードを作製するためにDNAモジュールを相互に接続するためのリガーゼ)の浸透が低いことである。シーケンシングの目的で、内部DNAバーコードを作製および使用しない理由は、バーコードの最終的なシーケンシングに必要なDNAを増幅するために必要な酵素の浸透が低いことである。内部DNAバーコードを伴うビーズを作製および使用しない、さらなる別の理由は、化学ライブラリのメンバーを付着させるための内部空間に費用がかかるためである。
本開示は、DNAバーコードに関連するビーズを提供し、内部に付着されたDNAバーコードと外部に付着されたDNAバーコードの比率は、約0.1:100、約0.2:100、約0.4:100、約0.8:100、約1:100、約2:100、約4:100、約8:100、約10:100、約20:100、約40:100、約50:100、約60:100、約70:100、約80:100、約90:100、約1:1などである。
また、本開示は、DNAバーコードに関連するビーズを提供し、内部に付着されたDNAバーコードと外部に付着されたDNAバーコードの比率は、0.1:100を下回る、0.2:100を下回る、0.4:100を下回る、0.8:100を下回る、1:100を下回る、2:100を下回る、4:100を下回る、8:100を下回る、10:100を下回る、20:100を下回る、40:100を下回る、50:100を下回る、60:100を下回る、70:100を下回る、80:100を下回る、90:100を下回る、1:1を下回るなどである。
水性懸濁液中のビーズの集団は、ピコウェルアレイなどの基板に接触させることができ、その結果、ビーズがピコウェルに入り、ピコウェルを占有する。懸濁液中のビーズの数および基板中のピコウェルの数の比率を調整して、目的の占有率を達成できる。例えば、懸濁液が1つのみのビーズを含む場合、ビーズを含むすべてのピコウェルはビーズを1つのみ含み、残りのピコウェルは、いかなるビーズも含まないであろう。懸濁液が20,000個のビーズを含み、基板が200,000個のピコウェルを含む場合、少なくとも180,000個のピコウェルは、完全にビーズが空になり、ビーズを含むほとんどのピコウェルは、1つのみのビーズを含む。占有されたピコウェルのごく一部は、2つのビーズを含むであろう。
価値のある実施形態において、懸濁液中のビーズ数とピコウェル数の比率は、約0.2:100、約0.4:100、約0.6:100、約0.8:100、約1:100、約2:100、約4:100、約6:100、約8:100、約10:100、約20:100、約30:100、約40:100、約50:100、約60:100、80:100、約100:100(1:1と同じ)、約2:1、約4:1、約6:1、約8:1、約10:1などであり得る。
除外的な実施形態において、本開示は、上記の値または範囲の1つに該当する任意の方法またはシステムを除外することができる。
範囲の実施形態において、懸濁液中のビーズ数とピコウェル数の比率は、約0.2:100~約0.4:100、約0.4:100~約0.6:100、約0.6:100~約0.8:100、約0.6:100~約1:100、約1:100~約2:100、約2:100~約4:100、約4:100~約6:100、約0.6:100~約8:100、約8:100~約10:100、約10:100~約20:100、約20:100~約30:100、約30:100~約40:100、約40:100~約50:100、約50:100~約60:100、約60:100~80:100、約80:100~約100:100(1:1と同じ)、約100:100(1:1と同じ)~約2:1、約2:1~約4:1、約4:1~約6:1、約6:1~約8:1、約8:1~約10:1などであり得る。
除外的な実施形態において、本開示は、上記の値または範囲の1つに該当する任意の方法またはシステムを除外することができる。
(VIII)ピコウェルを製作する
ピコウェルアレイプレートを作製するためのUV光、フォトマスク、フォトレジストの組み合わせ。多くのマイクロウェルまたはピコウェルを含むプレートは、本開示で使用するために以下のように作製することができる。簡単に述べると、3層のサンドイッチが組み立てられる。上部層は、フォトレジストである。中間層は、ガラスウエハである。底部層は、フォトマスクである。ピコウェルは、UV光によりフォトレジストから切り分けられるであろう。ピコウェルがフォトレジストの平らなシートから切り分けられた後、フォトレジストは、マフィンを焼くためのカップを含む一般的な金属製の皿に類似し、マフィンバッターを保持するために使用される皿のカップは、傾いた側面を有する。UV光は、フォトレジストのポリマーを分解するため、「非架橋剤」として機能する。UV処理後、溶剤が追加され、UV処理されたフォトレジストが洗い流され、清潔に見えるピコウェルが残る。
傾けて回転させ、傾いた壁を作製する。傾いた壁を有するピコウェルは、以下のように作製される。フォトマスクは多くの穴を有し、各穴は、ピコウェルの所望される底部の寸法に対応する。底部の寸法は、円周、直径、および形状、つまり円形形状を含むことができる。ウェルの上部の寸法は、光源を回転するか、またはサンドイッチ(フォトマスク/ガラスウエハ/フォトレジストサンドイッチ)を保持するステージを回転させたりしながら、傾いたUV光をフォトマスクの穴に向けることによって作製される。回転では、光源は、フォトマスク/ウエハ/フォトレジストサンドイッチに対して90度の角度ではなく、代わりに、各ピコウェルの傾いた壁を切り分けるために、90度の位置から少し傾けられる。多くのピコウェルを含む、得られるピコウェルアレイプレートは、そのまま使用できる。代替的に、このピコウェルアレイプレートは、多くのピコウェルアレイプレートを安価に作製するための型として使用できる。
Hanらは、マイクロウェルが傾いた壁を有するマイクロウェルプレートを製造するための機器および試薬について記載する(Han et al(2002)J.Semiconductor Technology and Science.2:268-272を参照されたい)。記載されるのは、UV光源、接触ステージ、傾斜ステージ、およびSU-8フォトレジストである。製造は、片面研磨シリコンウエハから開始する。SU-8フォトレジストを、ウエハ上に約0.10~0.15mmの厚さでコーティングする。次に、フォトレジストを、65度のホットプレート上で10分間、穏やかに焼き、次に、95度のホットプレート上で30分間、穏やかに焼く。得られたフォトレジスト/ウエハサンドイッチは、接触ステージを使用してUVマスクと接触する。「傾斜および回転UVリソグラフィ」という用語は、マイクロウェルアレイプレートまたはピコウェルアレイプレートを製造する方法を指し、各ウェルは、傾いた壁を有する。ここでは、ウェルの床は、小さな直径を有し、ウェルの上部(ウェルの上部端が、プレートの平らな表面と接触する部分)は、幅広の直径を有する。UV光で露出するために、回転台が使用され、UV光が傾斜される(Han et al、前述)。マスクは、マスクの穴の各々が円形であるフォトレジストと接触する。前述のHanらの図8は、UV光の方向、UVマスク、フォトレジスト構造、ウエハ基板、および回転台の写真を提供する。Hanらは、円錐台の製造方法を記載する。PDMS(ポリジメチルシロキサン)などの柔らかい材料を、円錐形アレイにわたって注ぎ、硬化させると、PDMS層が剥がれ、円錐形ウェルを形成する。
ピコウェルアレイプレートの大量生産に使用する型を作製する。ピコウェルアレイプレートが製造されている場合は、エポキシをプレートにわたって注ぎ、すべてのピコウェルを充填し、充填されたすべてのピコウェルをエポキシのプラットフォームに接触できる。エポキシが固化したら、ピコ突起のアレイの付着した固体プラットフォームを除去する(ピコ突起は、目的のピコウェルの逆である)。ピコ突起を伴う固体プラットフォームは、多くのピコウェルアレイプレートの製造に使用できる再利用可能な成形である。
エポキシ型(または任意の硬質な材料で作製された円錐形アレイ型から複製を作製する手順は、「ホットエンボス」と称される。簡単に述べると、基板材料を、そのガラス転移温度または軟化温度に加熱し、その時点でピコ突起を有する型が熱軟化材料に均一に押し付けられる。ピコ突起が、ピコ陥入として基材材料に移された後、型を基材から分離することができる。この開示は、好ましくは、型および基板のそれぞれのパターンとしてピコ円錐形およびピコウェルを開示する。
ホットエンボス、エポキシマスター、およびSU-8フォトレジストなどのフォトレジストについて記載する(Bohl et al(2005)J.Micromechanics and Microengineering.15:1125-1130、Jeon et al(2011)Biomed Microdevices.13:325-333、Liu,Song,Zong(2014)J.Micromechanics and Microengineering.24:記事ID:035009、del Campo and Greiner(2007)J.Micromechanics and Microengineering.17:R81-R95を参照されたい)。
他のマイクロウェルプレートの実施形態。プラスチックマイクロウェルアレイは、シリコン型を使用した熱成形を介して製造でき、シリコン型は、マイクロウェルのアレイ、例えば、800,000マイクロウェルのアレイを有する。テーパ形状、および滑らかな側壁、およびサブミクロンの許容誤差をもたらす高度な制御は、非パルス式ドライエッチングプロセスを使用して作製できる。対照的に、Boschプロセスなどのパルス式ドライエッチングプロセスを使用する方法では、側壁が粗くなり、エッチング中に横方向の寸法を制御できない場合がある。
非パルス式ドライエッチングプロセスを使用して、クロムマスクを使用した非パルス式等方性ドライエッチングプロセスによって作製されたシリコンマスター上にプラスチックを熱成形することにより、プラスチックアレイを製造する。このプロセスは、Ar、SF6、C4F8の3つのガスを使用する。このプロセスは、1200~2000ワットのRF電力、および150ワットのバイアスで行われる。3つのガス間のガスフローを変化させることにより、シリコン型のテーパを微調整して、滑らかな側壁を作製できる。変更されるは、SF6とC4F8との比率であり、比率を変更した結果は、例えば、18度(非常に傾斜した壁)、9度(わずかに傾斜した壁)、または2度(基板にほぼ垂直な壁)の傾きで存在する型(シリコンピラー)のテーパ壁である(Perry,Henley,and Ramsey(Oct.26-30,2014)Development of Plastic Microwell Arrays for Improved Replication Fidelity.18th Int.Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences.San Antonio,TX(1700~1703ページを参照されたい)。
実施形態において、本開示は、マイクロウェルのアレイを含む、基板、アレイ、グリッド、マイクロ流体デバイスなどを提供する。一実施形態において、すべてのマイクロウェルは、本質的に同じ容積を有する。この容積は、約1フェムトリットル、約2、約4、約6、約8、約10、約20、約40、約60、約80、約100、約200、約400、約600、約800、または約1,000フェムトリットルであることができる。
さらに、容積は、約40フェムトリットル~約60フェムトリットルの範囲など、上記の2つの隣接する値のいずれかの間の範囲の形態をとることができる。また、容積は、上記のリストで互いに直接的に隣接していない、上記の2つの値の間の範囲の形式をとることができる。
さらに、容積は、約1ピコリットル、約2、約4、約6、約8、約10、約20、約40、約60、約80、約100、約200、約400、約600、約800、または約1,000、約2,000、約5,000、約10,000、約20,000、約50,000、約100,000、約200,000、約500,000、または約1,000,000ピコリットルであることができる。また、容積は、上記のリスト内で互いに直接的に隣接していない、上記の2つの値の間の範囲の形式をとることができる。
除外的な実施形態において、本開示は、マイクロウェルを含む任意の基板、またはマイクロウェルを含む任意のアレイを除外することができ、各マイクロウェルの容積は、上記の値の1つによって定義可能であるか、または互いに隣接する上記の2つの値のいずれかの範囲によって定義可能であるか、またはリスト内で互いに隣接していない上記の2つの値のいずれかの範囲によって定義可能である。
ピコウェル上の球状栓(キャップ化ビーズとしても知られる)。本開示は、球状栓、または代替的に、ピコウェルアレイの各ウェルごと、または実質的にすべてのウェル用の多孔性球状栓を提供する。栓の目的は、薬物、候補薬物、細胞内容物、代謝産物をウェル内に保持することである。栓は、ピコウェルの内容物を互いに単離するのにも役立つ。球状栓は、ピコウェルの上部(または開口、または口)を覆うという目的が満たされ得る限り、完全な球状である必要はない場合がある。ウェルは、上部直径および底部直径を有することができる。ウェルをキャップする前の球状栓の直径は、約10マイクロメートル、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約70、約90、約120、または約200マイクロメートルである。栓を追加して、ピコウェルアレイのそれにわたって簡素に流すことによりピコウェルを覆い得る。遠心分離、圧力、攪拌、または他の方法を使用して、ピコウェルの上部(または口または穴)にビーズを詰め込み、しっかりと密封することができる。いくつかの実施形態において、溶媒を使用して、キャップ化ビーズの膨潤および/またはサイズを変更することができる。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、ビーズを収縮させる溶媒に負荷され、アッセイバッファーまたは異なる溶媒に置き換えられると、キャップ化ビーズは、それらの元のサイズに戻るか、または膨潤して、それにより、ピコウェルをしっかりと密封する。いくつかの実施形態において、温度を使用して、キャップ化ビーズを膨潤または細断し、ピコウェルの口でより良好な密封を得ることができる。必要に応じて、キャップ化ビーズをその位置に保持し、ステップ付きピコウェルアレイにおけるステップの1つによって、ピコウェル内にさらに落下することを防ぎ得る。
キャップ化ビーズは、本開示の化合物を運ぶ同じ種類のビーズであり得るか、または異なる種類のビーズであり得る。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、実際には、ビーズ自体を有する化合物であり得る。キャップ化ビーズは、ピコウェルからの分子の拡散を防止または遅延させる受動的キャップとして機能し得るか、またはビーズは、活性ビーズであり得、キャップ化ビーズに付着された機能的な部分を使用して、ピコウェルから試薬を捕捉し得る。いくつかの実施形態において、多孔性キャップ化ビーズは、ピコウェル内で実行される細胞系アッセイから放出された代謝産物を受動的に捕捉し得る。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、脂質、タンパク質、炭水化物、および核酸などの細胞物質を非特異的に捕捉し得る。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、抗体を用いて機能化し、健康、疾患、溶解、または固定された細胞から放出されたタンパク質を特異的に捕捉し得る。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、細胞の核酸を特異的に捕捉するDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドを用いて機能化され得る。いくつかの実施形態において、DNAまたはRNA機能化されたキャップ化ビーズを使用して、キャップされたピコウェル内の細胞から放出されたマイクロRNAを捕捉し得る。いくつかの実施形態において、ピコウェルは、2つのビーズ、ピコウェル内部の化合物含有ビーズ、およびピコウェルの口を覆うキャップ化ビーズを含む。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズはまた、化合物を有するビーズである。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、複合ビーズから放出された材料を捕捉する。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、複合ビーズから放出された化合物の試料を捕捉する。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、複合ビーズから放出されたDNAバーコードを捕捉する。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズは、それらがキャップするピコウェル内から放出される異なる種類の分析物を捕捉する。
キャップおよびピコウェルの相対的な硬度。好ましい装置は、マイクロタイタープレートであり、各マイクロタイターは、その底面に何千ものピコウェルを含む。キャップが適切に位置する能力、または各ピコウェルを密封する能力は、キャップの硬度に対する、ピコウェルの穴およびピコウェルの内壁を構成するプラスチックの硬度の機能であり得る。
プラスチックの硬度は、「デュロメータ」の値の観点において定義できる。硬度は、圧入に対する材料の耐性として定義され、試験される。球状栓の硬度、およびピコウェルの壁の硬度は、その「デュロメータ」の観点において定義できる。硬度は、例えば、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、または約100であり得る。これらのデュロメータ値のいずれかをプラスチック物質または他の物質に帰する場合、使用されるスケールも明記する必要がある。例えば、スケールは、より柔らかい材料に使用されるASTM D2240タイプAスケール、またはより硬い材料に使用されるASTM D2240タイプDスケールにすることができる(Silicon Design Manual,6th ed.,Albright Technologies,Inc.,Leominster,MAを参照されたい)。
ピコウェルの形状。いくつかの実施形態において、ピコウェルは、ピコウェルの上部および底部で円筒の直径がほぼ同じである円筒形ピコウェルであり得る。いくつかの実施形態において、ピコウェルはわずかなテーパを有し得、ピコウェルの上部は、ピコウェルの底部よりもわずかに大きい。いくつかの実施形態において、ピコウェルは、円錐ピコウェルであり得、角度は1度~30度の間のどこかで法線から外れている。いくつかの実施形態において、ピコウェルは、ステップ付きピコウェルであり、ピコウェルは、上部の直径から底部の直径まで不連続なステップを有する(直径が上部から底部に滑らかに変化する円錐ピコウェルとは対照的に)。いくつかの実施形態において、ステップ付きピコウェルは、ピコウェルの開口の近くに幅広い円筒、およびピコウェルの底部の近くに狭い円筒を有する。いくつかの実施形態において、ステップ付きピコウェルは、上部から底部への複数の不連続なステップを有し得る。多ステップ付きピコウェルのいくつかの実施形態において、すべての段の直径は、その下の段の直径より大きくてもよい。いくつかの実施形態において、小さなビーズは、ステップ付きピコウェルの底部に堆積され得、キャップ化ビーズは、ステップ付きピコウェルの最上部の開口に堆積され得る。いくつかの実施形態において、ピコウェルは、2つを超えるビーズを含み得る。
ステップ付きピコウェルを作製する方法。図29は、ステップ付きピコウェルを開示した。示される実施形態は、3つの区画および2つのステップを有する。上部区画は最も広く、ピコウェルがキャップされている状況で、上部区画の大部分がキャップで占められ、キャップを受け入れるように構成される。中央区画は、主に試薬によって、または試薬単独で占められるように構成される。試薬は、バッファー、酵素基質、1つ以上の塩、およびジチオトレイトール、RNAse阻害剤、グリセロール、もしくはDMSOなどの防腐剤または安定剤を含むことができる。最下部区画は、ビーズ、すなわち、DNAライブラリおよび放出可能な化合物の両方が結合したビーズで占められるように構成される。DNAバーコードおよび解放可能な化合物を有することに加えて、同じビーズは、「応答捕捉要素」を有することもできる。キャップ化ビーズをその位置に保持し、ステップ付きピコウェルにおけるステップの1つによって、ピコウェル内にさらに落下することを防ぐ。図29では、構造1は、キャップであり、構造2は、ビーズであり、構造3は、第1のステップのすぐ上に位置する上部領域である。構造4は、中央領域であり、アッセイ試薬を配置するのに使用できる。中央領域は、第2のステップのすぐ上である。中央領域内のアッセイ試薬は、最も低い領域に拡散できる。構造5は、最も低い領域であり、ビーズを配置し、かつ1つ以上の細胞を配置するのに使用できる。
ビーズが占める最も低い区画の空間について(ピコウェル内にビーズが1つのみ存在すると仮定する)、ビーズの直径は、最も低い区画の直径の約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、または約98%であり得る(ピコウェルが円形ウェルであると仮定する)。ピコウェルが円形ウェルでない場合、上記の値は、ウェルの最も広い寸法を参照できる。除外的な実施形態において、本開示は、上記のパラメータのいずれも満たさないシステムまたはビーズを除外することができる。
さらに、ビーズが占める空間について(ピコウェル内にビーズが1つのみ存在すると仮定する)、ビーズの約50%は、最も低い区画にあり、および同じビーズの約50%は、中央区画にあり、これらのパラメータはまた、約55%が最も低いおよび約65%が中央、約60%が最も低いおよび約40%が中央、65%が最も低いおよび約45%が中央、約70%が最も低いおよび約30%が中央、約75%が最も低いおよび約25%が中央、約80%が最も低いおよび約20%が中央、約85%が最も低いおよび約15%が中央、約90%が最も低いおよび約10%が中央、約95%が最も低いおよび約5%が中央、ならびに約100%が最も低い区画であり得る。これらの計算を行うために、ビーズが占める空間は、ビーズが多孔性ではないと(仮説的に)仮定する。除外的な実施形態において、本開示は、上記のパラメータのいずれも満たさないシステムまたはビーズを除外することができる。
円錐および円筒ピコウェルと同様に、成形システムの使用は、ステップ付きピコウェルを作製するための1つの好ましい実施形態である。この目的のために、多層柱のアレイを含む型が所望され、熱可塑性または他の硬化性ポリマー基板に打ち込むと、ステップ付きピコウェルの跡が形成され得る。複数のステップを備えた層状柱アレイ、異なる直径の各ステップは、(上に行くほど小さくなる)、多層リソグラフィプロセスで形成され得る。簡単に述べると、マイクロピラーアレイの第1の層を架橋するために、第1のフォトレジストの第1の層が、第1のマスクを介して曝露される。フォトレジストの第2の層は、第1の層(以前に曝露された)に直接的に堆積され得、第2のフォトマスクを使用して、後に第2のフォトレジストの第2のパターンが架橋され得る。多層パター化の最後に、レジストの積層は、架橋されていない領域を洗い流すために開発され、多層柱のアレイを残すことができる。多層柱アレイを作製するための詳細なプロトコルは、Francisco Perdigones et al.,(January 8th,2011).Microsystem Technologies for Biomedical Applications,Biomedical Engineering,Trends in Electronics Anthony N.Laskovski,IntechOpenに見出され得る。多層柱アレイのアレイが作製されると、標準のプロセスが使用され、型を使用してステップ付きピコウェルアレイをインプリントし得る。
キャップ化ビーズを除去する。多くの実施形態において、ピコウェル内の化学的摂動に対する反応、分析物、または細胞応答を研究するためにキャップ化ビーズを採取することが有利である。いくつかの実施形態において、ピコウェルアレイを反転させ、機械的攪拌を使用することにより、キャップ化ビーズをピコウェルの口から取り除くことができる。いくつかの実施形態において、ピコウェルを収縮させるために溶媒を使用して、ピコウェルの口から容易に取り除くことができる。いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズよりも高い密度の液体をピコウェルアレイの上部に追加し、浮力によってキャップ化ビーズを上昇させ、高密度媒体の上部に浮遊させることができる。
いくつかの実施形態において、キャップ化ビーズを互いに架橋して、キャップ化ビーズをピコウェルアレイの上部から剥離することができるキャップ化シートに変換することができる。いくつかの実施形態において、架橋ゲルをキャップされたピコウェル上に注ぐことができ、架橋ゲルは、キャップ化ビーズおよびそれら自体に架橋し、キャップビーズが、剥離することができる架橋シートに埋め込まれるようにする。
ピコウェルの相対的な位置を、剥離した層の形態で保持する。キャップ化ビーズが、剥離することができるゲル層に噛み合わされるような実施形態では、互いに対するおよびピコウェルに対するキャップ化ビーズの相対的な位置は、剥離された層に保持されることを理解されたい。これにより、ピコウェル、ピコウェルでのアッセイ、ピコウェル内のビーズ、およびキャップ化ビーズに捕捉されたあらゆる材料を直接的に接続できる。
いくつかの実施形態において、位置合わせマーカーを使用して、ピコウェルアレイの相対的な特徴を、剥離された層のキャップ化ビーズに向けることができる。
ピコウェルの位置合わせおよび整列を可能にする基準マーカー。ピコウェルを不規則なアレイに配置すると、ピコウェルアレイのイメージング中にシフトおよびドリフトを簡単に特定できる。いくつかの実施形態において、イメージング中に光学的および機械的ドリフトの検出を容易にするために、ピコウェルは不規則な順序で配置される。いくつかの実施形態において、ピコウェルアレイは、イメージング中のシフトおよびドリフトを特定するのを助けるための基準マーカーを含む。いくつかの実施形態において、基準マーカーは、ピコウェルアレイのピコウェル間に散在する、容易に特定可能な形状、パターン、または特徴である。いくつかの実施形態において、少数のピコウェルは、それ自体が容易に特定可能なパターンで配置され、イメージング中の光学的または機械的ドリフトの場合に容易な位置合わせを可能にすることができる。いくつかの実施形態において、蛍光ビーズなどの外部マーカーをピコウェルアレイ上に霧状にして、基準パターンを提供することができる。
キャップフリーマットの実施形態。キャップフリーマットの実施形態は、少なくともいくつかの形態または例では、「キャップレスフィルム」の形態をとることができる。ピコウェルの上部にある開口を密封する代わりに、例えば、ピコウェル内にあり得る任意の細胞培養培地または酵素アッセイ培地の蒸発を防止するために、マットを介して密封することができる。好ましくは、マットは、所定のピコウェルアレイ内のすべてのピコウェルを覆うようなサイズである。代替的に、マットは、アレイ内のピコウェルの所定の区画を覆うようなサイズにすることができる。マットは、ピコウェルプレートの上部に固定して、ピコウェルを覆い、ピコウェルの間にあるピコウェルプレートのほぼ平坦な上面も覆うことができる。確実な接触は、(i)例えば、マットの上部に置かれ、マットの上部の重りとして機能する硬いゴム製プラテンによって、一定の圧力を維持すること、(ii)硬いゴム製プラテンなどの重りに接続されたマットを使用すること、(iii)マット全体に適用できるリバーシブル化学接着剤(マットが吸収マットではない場合)のうちの1つ以上によって達成できる。マットが吸収マットになる場合、マットには、可逆的な化学接着剤で囲まれた円形の吸収パッドが含まれる。ここで、マットはピコウェルアレイと接触して整列し、円形の吸収パッドが各ピコウェルの開口のみを覆い、開口から「こぼれ出して」ピコウェルプレートの平面に接触しないようにする。
ピコウェルプレートの実質的な平面と接触するためのマットとして使用するための、およびピコウェルのキャップレス密封化で使用するための膜が利用可能である。Dow Film Tex、GE Osmonics、Microdyn Nadir、Toray、TriSep、Synder、Novamem、Evonik、およびAquaporinフラットシート膜などのフラットシート膜は、ワシントン州ケントのSterlitech Corpから入手可能である。これらには、ポリアミド-TFC、セルロースアセテート、ポリアミド-尿素-TFC、セルロースアセテートブレンド、ポリピペラジン-アミド-TFC、PES、複合ポリアミド-TFC、PES、PAN、PVDF、PSUH、RC、PESH、ポリエーテルエーテルケトン、およびポリイミドなどで作製された膜が含まれる。分子量カットオフの観点での細孔サイズには、150Da、200Da、300Da、500Da、900Da、600Da、1,000Da、2,000Da、3,000Da、5,000Da、10,000Da、50,000Da、20,000Da、30,000Da 70,000Da、100,000Da、200,000Da、300,000Da、400,000Da、500,000Da、800,000Da、3500Da、0.005マイクロメートル、0.030マイクロメートル、0.05マイクロメートル、0.10マイクロメートル、0.20マイクロメートルなどが含まれる。本開示のシステム、組成物、試薬、および方法に関して、これらのカットオフ値は、他のクラスの化合物を除外して、特定のクラスの化合物の選択的な収集を可能にすることができる。例えば、上記の膜のいくつかは、小分子代謝産物が通過して吸収性マットによって吸収されることを可能にする一方で、タンパク質および他の高分子を除外することができる。水、金属イオン、塩、代謝産物、タンパク質、および核酸を含むすべての分子に対して不透過性であるフラットシート膜も、本開示のシステム、組成物、および方法での使用に利用可能である。
可逆的な接着は、「分子ベルクロ」、例えば、メタロポルフィリン含有ポリマーとピリジン含有ポリマーとによって媒介さる(Sievers,Namyslo,Lederle,Huber(2018)eXPRESS Polymer Letters.12:556-568)。他の分子ベルクロ接着剤は、L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン、ssDNAの相補鎖(ピコウェルプレートの平らな上面に共有結合的に付着された1種類のssDNA、およびマットに共有結合的に付着された他の種類のssDNA)、カテコール側鎖を含むコポリマーなどを伴う(Sieversらの前述を参照されたい)。また、可逆的な接着は、ガリウム接着剤によって媒介でき、接着の程度は、温度のわずかな変化によって制御できる(Metin Sitti(May 18,2016)Switch and Stick.The chemical element gallium could be used as a new reversible adhesive that allows its adhesive effect to be switched on and off with ease.Max-planck-Gesellschaft)。さらに別のリバーシブル接着剤は、オランダのズウォルのDSM-Niaga Technologyから入手可能である。
吸収性物質(非特定の吸収剤;特定の吸収剤)。マットに組み込んで吸収特性を提供できる吸収性物質には、Sepharose(登録商標)、Sephadex(登録商標)、Agarose(登録商標)などの「分子ふるい」ビーズ、およびDEAEセルロース、カルボキシメチルセルロース、ホスホセルロースで作製されたイオン交換ビーズ、または上記の任意の組み合わせが含まれ、すべて1つの吸収性マットに組み合わされる。吸収性リガンドには、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)で使用されるものが含まれる(BioRadカタログ,Hercules,CAを参照されたい)。特定の吸収剤には、polyAテールとのハイブリダイズによってmRNAを捕捉できるpoly(dT)などの応答捕捉要素が含まれる。また、応答捕捉要素には、エクソン標的化RNAプローブ、抗体、およびアプタマーが含まれる。これらのいずれか、または任意の組み合わせをマットに共有結合的に付着させ、吸収性マットを作製することができ、吸収性マットをピコウェルの上面に接触させると、ピコウェルの内側にある可能性のある水性アッセイ培地または水性細胞培養培地を捕捉できる。
(IX)ピコウェルにビーズを堆積させる
ピコウェルを伴うプレートは、96ウェルプレートの形態をとることができ、これらの96ウェルの各々は、何千ものピコウェルを含む。また、ピコウェルを伴うプレートは、24ウェルプレートの形態をとることができ、これらの24ウェルの各々は、何千ものピコウェルを含む。96ウェルプレートの場合、各ウェルは、水または水溶液中のビーズの懸濁液0.1~0.2mLを使用して充填できる。24ウェルプレートの場合、各ウェルは、水または水溶液中のビーズの懸濁液0.5mLを使用して充填できる。懸濁液は、使い捨てチップ付きの通常のピペットを使用して追加できる。懸濁液中にあるビーズの数は、1つのビーズのみを含むピコウェルの約3分の1、2つのビーズを含むピコウェルの約3分の1、およびビーズを含まないか、または2つ以上ビーズのいずれかを含むビーズの約3分の1をもたらすことができる。また、懸濁液中のビーズの数は、状況に起因することができ、1つ以上のビーズを含むウェルの少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%は、これらのウェルの1つのみのビーズを含む。
ビーズが定着した後、あらゆる余分な液体は、96ウェルプレートの各ウェルの壁にピペットチップを接触させるか、24ウェルプレートの各ウェルの壁にピペットチップを接触させて、余分な液体を取り除くことで除去できる。
アッセイ試薬に関しては、ピコウェルが反応の実行に使用される場合、例えば、DNAシーケンシング、生化学アッセイ、または培養細胞のアッセイの場合、すでに沈降したビーズを含むピコウェルにアッセイ試薬を追加できる。ビーズ懸濁液の最初の追加について上述したように、アッセイ試薬の追加はピペットを使用する。アッセイ試薬がすでに各ピコウェルにある溶液と平衡化されている後、96ウェルプレートの96ウェルの各々にある、あらゆる余分な溶液、または24ウェルプレートの24ウェルの各々にある、あらゆる余分な溶液は、96ウェルプレートの96ウェルの各々の壁に接触するか、または24ウェルプレートの24ウェルの各々の壁に接触するピペットチップで抜き取ることができる。
ピコウェルアレイのフローセルの実施形態。ピコウェルアレイは、フローセルの一部であり得、入口および出口を備えた流体チャンバが、ピコウェルアレイの上部に取り付けられている。かかる実施形態において、本開示のビーズ、細胞、および他のアッセイ材料は、入口から流入し、出口を通って流出し得る。重力または遠心力を使用して、ビーズがフローセルを通って流れるときに、ビーズをピコウェルに留める。
(X)ピコウェル内のビーズ結合核酸のシーケンシング
ビーズ結合核酸は、ビーズに付着したままシーケンシングできる。代替的に、または追加的に、ビーズ結合核酸は、ビーズからのDNAバーコードの切断後にシーケンシングされ得る。
シーケンシングの前にビーズからDNAバーコードを切断する。いくつかの実施形態において、本開示は、ビーズ結合DNAバーコードがビーズから切断され、それにより、増幅の前、またはシーケンシングの前、または核酸プローブとのハイブリダイズなどの任意の種類の配列同定技術の前に、可溶性形態でDNAバーコードを放出する方法を包含することができる。
除外的な実施形態。実施形態において、本開示は、任意の方法、関連する試薬、システム、組成物、またはビーズを除外することができ、ビーズ結合DNAバーコードは、増幅の前、またはシーケンシングの前、または核酸プローブとのハイブリダイズなどの任意の種類の配列同定技術の前に切断される。また、本開示は、DNAバーコードを含むポリヌクレオチドが切断されるか、または、DNAバーコードの一部のみを含む核酸が、増幅の前、シーケンシングの前、もしくは核酸プローブとのハイブリダイズなどの任意の種類の配列同定技術の前に切断される任意の方法を除外することができる。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR);定量的PCR(qPCR)。PCR法およびqPCR法は、(1)高温でDNA鋳型を変性させ、低減された温度でプライマーをアニーリングし、最後にDNAポリメラーゼによって触媒されるように、DNA合成を介してプライマーを伸長させる、3ステップの方法に依存する(Gadkar and Filion(2014)Curr.Issues Mol.Biol.16:1-6)。qPCRは、「リアルタイムPCR」とも称される(Kralik and Ricchi(2017)Frontiers Microbiology.8(9ページ)。
PCR法およびqPCR法の最近の変更または改善には、ヘリカーゼ依存(HDA)増幅の使用、内部増幅標準の使用、ロックド核酸(LNA)の使用、および阻害剤に結合する添加剤の使用が含まれる(Gadkar and Filion(2014)Curr.Issues Mol.Biol.16:1-6)。ロックド核酸は、その標的を極めて正確に認識して結合するという利点を提供する。
qPCRは、標的DNA分子の増幅および定量を同時に行うことができる。qPCR法は、応答曲線が特定の蛍光しきい値に到達するために必要な増幅サイクルの数を比較する(Pabinger,Rodiger,Kriegner(2014)Biomolecular Detection Quantification.1:23-33)。Refslandらは、qPCRを実施するための明らかに典型的な条件の簡潔な記載を提供する(Refsland,Stenglein,Harris(2010)Nucleic Acids Res.38:4274-4284)。
PCRプライマーの設計および検証、ならびにアニーリング温度(Ta)、融解温度(Tm)、伸長ステップの温度、バッファーの種類などの変数に関するガイダンスが利用可能である(Bustin and Huggett(2017)Biomolecular Detection Quantification.14:19-28)。
ローリングサークル増幅(RCA)。DNAは、ビーズに付着させたまま増幅できる。増幅された形態のDNAは、増幅されていないDNAの配列よりも簡単である。ローリングサークル増幅法では、DNAタグ(DNAバーコード)を一本鎖に作製する。一本鎖になると、スプリントオリゴが、タグDNAの末端を架橋するために追加され、その後スプリントオリゴの伸長およびライゲーションが続く。DNAポリメラーゼ(マイナス5’→3’エキソヌクレアーゼ活性)を使用すると、DNAが、スプリントオリゴの伸長を触媒した後、連結可能な接合部が保証される。次いで、環状化されたDNAは、phi29 DNAポリメラーゼなどの鎖置換DNAポリメラーゼを加えることにより、ローリングサークル増幅に供され得る。DNAバーコードタグでローリングサークル増幅(RCA)を実行する機能により、任意の生き残ったDNA分子を簡単にシーケンシングできる十分な量に熱増幅できるため、DNAに損傷を与え得る合成化学物質を使用できる。DNAは、エキソヌクレアーゼ消化、ニッキング、および高温での融解、または水酸化ナトリウムでの処理によって一本鎖を作製することができる。
ローリングサークル増幅(RCA)の詳細は、RCAの実施に使用できる次の手順で明らかになる。
ステップ1:ビーズ結合ssDNAで開始される。ビーズ結合DNAが最初に(dsDNA)から二本鎖になっている場合、RCAに使用しない鎖は、チミン(T)の残基が、ビーズ結合末端またはそのすぐ近くで、ウラシル(U)の残基に置き換えられるように調整できる。この方法でdsDNAを調製すると、ウラシルNグリコシダーゼを使用して、ウラシル残基を切断し、それによって不安定な糖リン酸を(DNA骨格の一部として)残すことができ、この不安定な位置は、ヌクレアーゼ処理によって切断することができる(Ostrander et al(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89:3419-3423)。
ステップ2:「スプリントオリゴ」をビーズ結合ssDNAに追加する。スプリントオリゴは、ビーズに共有結合的に結合されているssDNAの末端(5’末端)で約10~20塩基対にハイブリダイズするように設計されており、ビーズ結合ssDNAのフリー末端(3’末端)で約10~20塩基対にもハイブリダイズする。スプリントオリゴは、ssDNAのビーズ結合端をビーズ結合ssDNAのフリー末端に近接させる必要はない。必要なのは、巨大なループを形成するために、ビーズ結合ssDNA配列の遠端をつなぎ合わせることのみである。
ステップ3:スルホロブスDNAポリメラーゼIVを追加して、このポリメラーゼがssDNAの巨大なループを鋳型として使用し、片端でスプリントオリゴに共有結合的に付着される相補的な巨大なループを作製する。
ステップ4:DNAリガーゼを使用して、相補的な巨大なループを共有結合的に閉鎖し、環状のssDNAが生成される。RCAの間に「ローリング」を行うのは、この閉鎖されたssDNAの輪である。
ステップ5:鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを追加し、dNTPを追加する。追加されたDNAポリメラーゼは、dNTPをビーズ結合ssDNAに共有結合的に付着させ、ビーズ結合ssDNAの遠位末端は、「ローリングサークル」上にあるものの相補的なコピーを作製するために伸長され、次にさらに伸長され、「ローリングサークル」上にあるもののさらに別の相補的なコピーを作製し、さらに伸長され、「ローリングサークル」上にあるもののさらに別の相補的なコピーを作製する。潜在的に無限の増幅のこのプロセスの間、DNAポリメラーゼの鎖置換活性により、DNAポリメラーゼの継続的な活性が可能になる。
任意に、本開示の方法は、蛍光分子ビーコンを介したローリングサークル増幅(RCA)のリアルタイムモニタリングを含む(Nilsson,Gullberg,Raap(2002)Nucleic Acids Res.30:e66(7ページ))。RCA用試薬は、Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)、Sygnis TruePrime Technology(TruePrime(登録商標)RCAキット)、Heidelberg、Germany、およびGE Healthcare(TempliPhi 500(登録商標)増幅キット)から入手可能である。フルオロフォアおよびクエンチャは、ThermoFisher Scientific(Carlsbad,CA)、Molecular Probes(Eugene,OR)、Cayman Chemical(Ann Arbor,MI)、およびSigma-Aldrich(St.Louis,MO)から入手可能である。
ステップ6.RCAによって増幅されたssDNAを、PCR増幅の鋳型として使用し、プライマーが追加され、熱安定性DNAポリメラーゼが追加され、PCR産物は、その後、次世代シーケンシングによってシーケンシングされる。
本開示の一態様では、RCA増幅されたssDNAは、PCR産物を作製するPCR増幅の前にビーズから切断される。本開示の別の態様において、PCR産物を作製するPCR増幅は、ビーズからRCA増幅されたssDNAを切断することなく作製できる。
Banerらが記載したように、「RCA反応により、環状分子への補体のタンデムコピーの多くを表す鎖を生成できる」(Baner,Nilsson,Landegren(1998)Nucleic Acids Res.26:5073-5078)。枯草菌相phi29 DNAポリメラーゼは、その鎖置換活性および高い処理能力のため、好適な酵素である。RCAは、Liらによって同様に特徴付けされ、「RCAでは、環状鋳型は、鎖置換特性を有するDNAポリメラーゼphi29によって等温で増幅される。長い一本鎖DNA産物は、何千もの配列反復を含む:(Li and Zhong(2007)Anal.Chem.79:9030-9038)。
本開示のDNAバーコードのシーケンシングは、いかなる限定を意味することなく、Vander Hornの米国特許第8,632,975号の方法を用いることができ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、本開示のDNAバーコードは、例えば、サンガーシーケンシング法などの合成によるシーケンシングを使用する方法によって、または「次世代シーケンシング」を使用する方法によってシーケンシングすることができる。
DNAシーケンシングのためのイルミナ法。DNAシーケンシングのためのイルミナ法は、以下のとおりである。DNAは、超音波処理により100~400塩基対(bp)のサイズ範囲に断片化できる(Hughes,Magrini,Demeter(2014)PLoS Genet.10:e1004462)。イルミナ法では、DNAライブラリが作製され、細胞からのDNAの断片または細胞から、DNAアダプタ(断片の末端に付着される)によって修飾される。反応生成物はサンドイッチの形態をとり、シーケンシングされるDNAはサンドイッチの中央にある。反応生成物は、(第1のアダプタ)-(シーケンシングされるDNA)-(第2のアダプタ)の形態をとる。アダプタ-DNA-アダプタ複合体は、さらに別のアダプタに関連付けられ、この他のアダプタは、固体表面に共有結合的に付着される。固体表面は、平らなプレートであり得る。固体表面は、平面から突き出る多くのアダプタの芝生を有する。アダプタは、サンドイッチ内であるアダプタの1つに相補的なDNA配列を有する。実際に、芝生は、2種類のアダプタを含み、1つのアダプタは、複合体内のアダプタの1つに結合(ハイブリダイズ)し、複合体をプレートに非共有結合的に係留する。これらは、「第1の芝生結合アダプタ」および「第2の芝生結合アダプタ」と称され得る。DNAポリメラーゼの第1の課題は、係留された(ただし非共有結合的に結合した)DNAを鋳型として使用して、娘鎖を作製することであり、DNA重合が発生すると、娘鎖は「第1の芝生結合アダプタ」に共有結合的に付着した形態になる。この共有結合的な連結は、DNAポリメラーゼの触媒作用によって生成される。娘鎖が完全に合成された後、遠位末端(媒体に突き出る末端)は、上記で称されたサンドイッチにおける第2のアダプタに相補的なDNA配列を含む。この相補的なDNA配列により、新しく合成された娘DNAの遠位末端が屈曲し、「第2の芝生結合アダプタ」にハイブリダイズすることができる。上記で記載されているのは、サンドイッチの両方のアダプタがどのように使用されるか、ならびに「第1の芝生結合アダプタ」および「第2の芝生結合アダプタ」の両方がどのように使用されるかである。
その後、反応のサイクルが何度も実行され、その結果、元のdsDNAの増幅されたバージョンのクラスターになる。実際に、クラスターは共有結合的に付着された(係留された)ssDNA分子の形態をとり、これらのssDNA分子のすべては、元のdsDNA(生細胞または組織から単離されたdsDNA)の鎖の1つのみに対応する。係留されたssDNA分子のこのクラスターは、「ポロニー(polony)」と称される。ポロニーの生成は、「ブリッジ増幅」と称される手法によるものである。最後に、ブリッジ増幅およびポロニーの作製後、固体表面に共有結合的に付着されたリバース鎖は、その係留から切断され、洗い流されて廃棄され、フォワード鎖のみが残る。
イルミナ(登録商標)法に関する情報は、Goodwin,McPherson,McCombie(2016)Nature Rev.Genetics.17:333-351、Gierahn,Wadsworth,Hughes(2017)Nature Methods.14:395-398、Shendure and Hanlee(2008)Nature Biotechnology.26:1135-1145、Reuter,Spacek,Snyder(2015)Molecular Cell.58:586-597、Illumina Sequencing by Synthesis(YouTubeでの5分間のビデオ)から入手可能である。
オリゴヌクレオチド連結および検出によるシーケンシング(SOLiDシーケンシング)。SOLiDは、色素標識された分子からの蛍光強度を測定して、DNA断片の配列を決定する。DNA断片のライブラリは、シーケンシングされる試料から調製され、クローンビーズ集団の調整に使用される(各磁気ビーズの表面に1種類の断片のみ)。ビーズに付着された断片には、すべての断片の開始配列が既知および同一の両方であるように、付着された普遍的なP1アダプタ配列が与えられる。PCRが行われ、ビーズに付着したPCR産物がスライドに共有結合的に結合する。
次に、プライマーは、ライブラリ鋳型内のP1アダプタ配列にハイブリダイズする。4つの蛍光標識された二塩基プローブのセットは、シーケンシングプライマーへの連結について競合する。二塩基プローブの特異性は、各連結反応の第1および第2のすべての塩基を調査することによって達成される。連結、検出、および切断の複数のサイクルは、最終的な読み取りの長さを決定するサイクルの数を伴って実行される。一連の連結サイクルに続いて、伸長産物が除去され、鋳型は、2巡目の連結サイクルのn-1位置に相補的なプライマーでリセットされる(Wu et al(2010)Nature Methods.7:336-337を参照されたい)。
pH系DNAシーケンシング。pH系DNAシーケンシングは、ポリメラーゼ触媒による伸長反応の副産物として生成される水素イオンを測定することにより、塩基の取り込みが決定されるシステムおよび方法である。作動可能に結合したプライマーおよびポリメラーゼをそれぞれ有するDNA鋳型を反応チャンバまたはマイクロウェルに負荷し、その後、デオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)の追加および洗浄の繰り返しサイクルを行う。DNA鋳型は、鋳型がクローン集団として固体支持体に付着される。各かかる取り込みにより、水素イオンが放出され、水素イオンを放出する鋳型の集団が集合し、反応チャンバの局所pHに検出可能な変化を引き起こす(Pourmand(2006)Proc.Nat’l.Acad.Sci.103:6466-6470を参照されたい)。本開示は、pH系DNAシーケンシングを除外することができる。
連鎖状DNAバーコードに関しては、連鎖状DNAバーコード全体を1回の実行でシーケンシングできる(連鎖状DNAバーコード全体のシーケンシングには1つのシーケンシングプライマーのみが必要である)。代替的に、連鎖状DNAバーコードを構成する一部またはすべてのDNAバーコードモジュールを、別々にシーケンシングに供することができる(別々にシーケンシングされたDNAバーコードモジュールの各々は、その独自のシーケンシングプライマーを取得する)。直交性DNAバーコードに関しては、DNAバーコードモジュールの各々が、ビーズ上の独自の部位に付着されるため、直交性DNAバーコードを構成するDNAバーコードモジュールの各々は、それ独自の専用のシーケンシングプライマーが必要である。
除外的な実施形態。実施形態において、本開示は、マイクロフルイディクス、油媒体中に存在する水性液滴、水性試薬を含む第1のチャネルが、オイルを含む第2のチャネルと連結され、連結領域から始まる第3のチャネルを介して油媒体を移動する水性液滴を生成することにより作製される水性液滴を伴う、任意のシステム、デバイス、デバイスの組み合わせ、および方法を除外することができる。マイクロフルイディクスデバイスおよび試薬が記載される(例えば、Brouzes,Medkova,Savenelli(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.106:14195-14200、Guo,Rotem,Hayman(2012)Lab Chip.12:2146-2155、Debs,Utharala,Balyasnikova(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.109:11570-11575、Sciambi and Abate(2015)Lab Chip.15:47-51を参照されたい)。
他の除外的な実施形態において、除外できるのは、「DNAヘッドピース」を構成する任意の試薬、組成物、核酸、もしくはビーズ、または「DNAヘッドピース」に共有結合的に付着される試薬、組成物、核酸、もしくはビーズである。MacConnell,Price,Paegel(2017)ACS Combinatorial Science.19:181-192は、DNAヘッドピースの例を提供し、ビーズは、アジドDNAヘッドピースを伴って機能化される。
シーケンシング法およびシーケンシング試薬に関する追加の除外的な実施形態。実施形態において、本開示は、DNAシーケンシングにおける「可逆的ターミネータ」の使用を伴わない試薬、システム、または方法を除外することができる。また、除外できるのは、メトキシ保護基を含まない任意の試薬、システム、または方法である。さらに、除外できるのは、DNAシーケンシングを伴うが、シーケンシングされているDNAが、ポリヌクレオチドの順序に関する情報が検出および収集されているときに、ビーズに共有結合的に付着されていない、任意の試薬、システム、または方法である。さらに、除外できるのは、シーケンシング反応を行う前にDNA鋳型を増幅する、例えば、PCR技術またはローリングサークル技術により増幅する任意の試薬、システム、または方法である。実施形態において、除外できるのは、例えば、連結される(1つの単一の核酸上に存在する化学ライブラリのメンバーの合成に関するすべての情報)核酸バーコード化のようなバーコード化の任意の方法である。別の態様において、除外できるのは、例えば、直交する(ビーズ上の複数の付着位置に分散している化合物ライブラリの所定のモノマーの合成に関する情報)核酸バーコード化のようなバーコード化の任意の方法である。DNAリガーゼに関する除外的な実施形態において、本開示は、核酸バーコードのモジュールを接続するためにDNAリガーゼを使用する任意の試薬、システム、または方法を除外することができる。
フルオロフォア、クエンチャ、およびFRET系アッセイ。本開示は、化学ライブラリのメンバーをスクリーニングするため、または化学ライブラリの単離されたメンバーを特徴付けするためのフルオロフォアおよびクエンチャを提供する。FRETは、フェルスター共鳴エネルギー移動である。
アッセイは、ビーズ結合化学ライブラリ上で実行できる。また、アッセイは、ビーズからの切断後すぐに、フリー化学ライブラリメンバーで実行でき、すなわち、ビーズと同じマイクロウェルで、またはビーズと同じヒドロゲルマトリックスの近傍で実行される。さらに、アッセイは、あらゆるビーズに付着されていないか、またはビーズから切断されて次に精製されている、可溶性の化学ライブラリメンバーで実行できる。
本開示の試薬として好適なフルオロフォアには、Alexa 350、Alexa 568、Alexa 594、Alexa 633、A647、Alexa 680、フルオレセイン、Pacific Blue、クマリン、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 660、ATTO655、ATTO647n、Setau-665(SETA Biochemicals、Urbana、IL)、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、テトラメチルローダミン(TMR)、テキサスレッド、テトラクロロフルオレセイン(TET)、ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、およびジョー色素(4’-5’-ジクロロ-2’,7’-ジメトキシ-6-カルボキシフルオレセイン)、SYBRグリーンI(497nmを吸収、520 nmを発光)、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)(492nmを吸収、518nmを発光)、5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM)(492nmを吸収、518nmを発光)、FITC、およびローダミンが含まれる。クエンチャには、TAMRAクエンチャ、ブラックホールクエンチャ-1(BHQ1)、ブラックホールクエンチャ-2(BHQ2)、およびDABCYLクエンチャが含まれる。この特許文書における他の場所で開示されているように、TAMRAは、フルオロフォアであり得、クエンチャでもあり得ることに注意されたい。
ガイダンスは、FRET系アッセイ用の試薬で利用可能であり、FRET試薬は、フルオロフォアおよびクエンチャが含まれる(Johansson(2006)Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching.Methods Mol.Biol.335:17-29を参照されたい)。FRET系アッセイの例は、「SceDペプチド」の基質を用いたシグナルペプチダーゼ(SpsB)の活性測定を含む。ペプチドに付着したFRETペアは、4-(4-ジメチルアミノフェニルアゾ)5-((2-アミノエチル)アミノ)-1-ネフタレンスルホン酸である(Rao et al(2009)FEBSJ.276:3222-3234を参照されたい)。別の例は、KVSLNFPILのペプチド基質を用いたHIV-1プロテアーゼのアッセイに由来する。ドナー/アクセプタFRETペアは、EDANS(ドナー)およびDABCYL(アクセプタ)であった。EDANS蛍光は、非蛍光DABCYLへの共鳴エネルギー移動を介してDABCYLによって消光され得る(Meng et al(2015)J.Biomolecular Screening.20:606-615を参照されたい)。さらに別の例は、ボツリヌス毒素のアッセイに由来する。SNAP-25の活性は、BoNT-Aの基質を使用して測定できる。FRET系アッセイでは、基質は、N末端に連結したフルオレセインイソチオシアネート(FITC)を有し、およびC末端に連結したクエンチャは、4-(4-ジメチルアミノフェニル)ジアゼニル安息香酸(DABSYL)である。ペプチド基質は、SNAP-25のアミノ酸190~201に対応される(Rasooly and Do(2008)Appl.Environ.Microbiol.74:4309-4313を参照されたい)。
本開示は、酵素阻害剤、酵素活性剤を発見および同定し、所定のタンパク質の生体内分解の速度を増強することができる化合物を発見するために、化合物のライブラリをスクリーニングするための試薬、組成物、ならびに方法を提供する。これらの試薬、組成物、および方法は、FRET系アッセイを使用でき、代替的に、FRET系アッセイ以外のアッセイを使用することもできる。
分子ビーコンが記載される(Baruch,Jefferey,Bogyo(2004)Trends Cell Biology.14:29-35を参照されたい)。分子ビーコンは、フルオロフォアがリンカーを介してクエンチャに結合している試薬である。リンカーは、ヌクレアーゼによって切断可能であり得、したがって、ヌクレアーゼ活性を測定する。本開示は、ヌクレアーゼ阻害因子を特定するために、代替的に、ヌクレアーゼ活性化因子を特定するために、化学ライブラリをスクリーニングするための方法を提供する。Fengらは、様々なヌクレアーゼの活性を測定するための分子ビーコンの使用およびFRET系アッセイの使用についてを記載した(Feng,Duan,Liu(2009)AngewChem.Int.Ed.Engl.48:5316-5321)。Fengらは、様々な制限酵素の活性を測定するためのFRET系アッセイの使用を示した。
(XI)ビーズ結合化合物を放出する
切断可能なリンカー。提供されるのは、切断できないリンカーである。また、提供されるのは、切断可能なリンカーである(Holmes and Jones((1995)J.Org.Chem.60:2318-2319、Whitehouse et al(1997)Tetrahedron Lett.38:7851-7852、およびYoo and Greenberg((1995)J.Org.Chem.60:3358-3364を参照されたく、Gordon et al(1999)J.Chem.Technology Biotechnology.74:835-851により引用される)。切断可能なリンカーには、アルカリ加水分解に存在するアシルスルホンアミドリンカー、ならびに穏やかな条件下で切断される活性化N-アルキル誘導体、およびアリール-シリコン結合に基づくトレースレスリンカー、およびシリルエーテル連結に基づくトレースレスリンカーも含まれる(Gordon et al(1999)J.Chemical Technology Biotechnology.74:835-851の839および842ページき記載される)。さらに、提供されるのは、切断時にC末端アルデヒドを生成する酒石酸に基づくリンカーであり、切断は、過ヨウ素酸酸化によるものであるPaulick et al(2006)J.Comb.Chem.8:417-426を参照されたい)。
図3は、本開示の組成物および方法に好適な様々な切断可能なリンカーを開示する。図3は、Yinliang Yang(2014)Design of Cleavable Linkers and Applications in Chemical Proteomicsの表1から複製される。Technische Universitat Munchen Lehrstuhl fur Chemie der Biopolymere。図3から、本開示に好ましい切断可能なリンカーは、a、c、d、p、q、r、およびtのリンカーである。リンカーpが、本明細書に開示される実験結果で使用された。これらの切断条件は、DTT(リンカーa)、Na2SO4(リンカーc)、Na2SO4(リンカーd)、UV光(リンカーp)、UV光(リンカーq)、UV光(リンカーr)、およびTEVプロテアーゼ(リンカーt)である。これらの特定の切断条件は穏やかであり、ビーズを損傷したり、ビーズ結合化合物を損傷したり、ビーズ結合化合物の化学ライブラリメンバー(単位)を損傷したりすることはない。
クリックケミストリーと互換性のある化学的に切断可能なリンカー。Qianら(2013)は、クリックケミストリーと互換性のある多くの切断可能なリンカーについて記載する(Qian,Martell,Pace(2013)ChemBioChem.14:1410-1414)。これらには、アゾ結合を有するリンカーが含まれ、アゾ結合は、亜ジチオン酸塩で切断可能である。このリンカーの構造は以下のとおりである:R1-ベンゼン1-N=N-ベンゼン2-R2。第1のベンゼン環は、R1に対してパラの水酸基を有し、第2のベンゼン環は、R2に連結するカルボニル基を有し、このカルボニル基は、アゾ部分に対してパラである。
光切断可能なリンカー本開示は、o-ニトロベンジル基を有する光切断可能なリンカーを包含する。この基は、330~370nmでの照射により切断できる(Saran and Burke(2007)BioconjugateChem.18:275-279、Mikkelsen,Grier,Mortensen(2018)ACS Combinatorial Science.DOI:10.1021を参照されたい)。o-ニトロベンジルリンカーよりも光分解時間が短いリンカーは、2-(2-ニトロフェニル)-プロピルオキシカルボニル(NPPOC)リンカーである。o-ニトロベンジルリンカーのバリエーションは、o-ニトロベンジルアミノリンカーである。ペプチド鎖に付着し、その後切断されると、このリンカーはアミドを放出する。o-ニトロベラトリル基を有するリンカーが利用可能であり、これらは非置換o-ニトロベンジルリンカーよりも短い光分解時間、およびより大きな放出収率を有する。フェナシルリンカー、ベンゾインリンカー、およびピバロイルリンカーも利用可能である(Mikkelsen et al(2018)ACS Combinatorial Science.DOI:10.1021を参照されたい)。
光切断可能なエーテル結合を有するリンカーが利用可能である。この光切断可能なリンカーは、リンカーがビーズに付着されており、切断可能な基が「R基」である場合に使用でき、切断後、解放された基は、ROHの形態をとる(Glatthar and Giese(2000)Organic Letters.2:2315-2317を参照されたい)。光切断可能なエステル結合を有するリンカーも利用可能である(Rich et al(1975)97:1575、Renil and Pillai(1994)Tetrahedron Lett.35:3809-3812、Holmes(1997)J.Org.Chem.62:2370-2380を参照されたく、Glatthar and Giese、前述によって引用される)。リンカーのエーテル結合は、酸、塩基、酸化、還元、およびフッ化物感受性シリル-酸素結合、および光分解によって切断できる(Glatthar and Giese、前述)。
ペプチド(R1)および核酸(R2)を連結するために使用されている別の光切断可能なリンカーは、以下のとおりである。R1は、ベンジル基のメチレン部分に直接的に接続される。メチレン基に対するパラは、環が付着したニトロ基である。メチレン部分に対するメタは、環が付着したエチル基である。エチル基の1炭素は、リン酸を有する。このリン酸の酸素原子にR2基が付着される(Olejnik et al(1999)Nucleic Acids Res.27:4626-4631)。
Akerblomらは、アミノ、ヒドロキシル、ブロモ、およびメチルアミノ基、ならびに4-ニトロフェノキシカルボニル活性化ヒドロキシルおよびアミノ基を含む、アルファ-メチル2-ニトロベンジルタイプの光不安定性リンカーを開示する(Akerblom and Nyren(1997)Molecular Diversity.3:137-148を参照されたい)。カテプシンBは、標的配列である「バリン-シトルリン」を有するリンカーを切断できる(Dal Corso,Cazzamalli,Neri(2017)Bioconjugate Chemistry.28:1826-1833)。
酵素切断可能なリンカー。プロテアーゼなどの酵素によって切断可能なリンカーが利用可能である(Leriche,Chisholm,Wagner(2012)Bioorganic MedicinalChem.20:571-582を参照されたい)。ヒドロキシメチルフェノキシリンカーは、キモトリプシンで切断することができる(Maltman,Bejugam,Flitsch(2005)Organic BiomolecularChem.3:2505-2507)。タバコエッチウイルスプロテアーゼで切断可能なリンカーが利用可能である(Weerapana,Speers,Cravatt(2007)Nature Protocols.2:1414-1425、Dieterich,Link,Graumann(2006)Proc.Nat’l.Acad.Sci.103:9482-9487を参照されたい)。LVPRGおよびLVPRGSのリンカー配列は、トロンビンによって切断できる(Jenny,Mann,Lundblad(2003)Protein Expression Purification.31:1-11)。プラスミン切断可能なリンカーが利用可能である(Devy,Blacher,Noel(2004)FASEBJ.18:565-567)。
ビーズ結合放出モニター。本開示は、ビーズ結合化合物の放出を評価することが可能な新規かつ固有の放出モニターを提供する。放出モニターは、フルオロフォアおよびクエンチャのビーズ結合複合体の形態をとり、フルオロフォアは、切断可能なリンカーを介してビーズに接続される。好ましくは、切断可能なリンカーは、光切断可能なリンカーである。好ましくは、ビーズ結合放出モニターは、専用のピコウェル内に配置され、そのピコウェルは、他の種類のビーズを含まない。光切断可能なリンカーが切断されると、フルオロフォアはビーズから放出され、ピコウェル内の媒体に拡散し、ビーズ結合クエンチャからある程度の距離を達成し、その結果、放出量に比例する蛍光が増強する。蛍光の増強により、ピコウェル内にある遊離フルオロフォアの濃度の計算が可能になり、さらに重要なことに、他のウェル内にある他のビーズから放出される化合物の量の計算が可能になる。
要約すると、ビーズ結合放出モニターは、それ独自の専用のウェル内に位置し、他のウェルは、薬物候補であるビーズ結合化合物を含む。
図8は、ビーズ結合放出モニターの好ましい非限定的な例の簡易化されたバージョンを開示する。放出モニターは、フルオロフォアの近くに保持されるクエンチャの形態をとり、フルオロフォアのクエンチングをもたらす。実施形態において、クエンチングは、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.8%、少なくとも99.9%、少なくとも99.95%などである。ピコウェルにおいて、1つのビーズは、放出モニター専用であり、もう1つのビーズまたは複数のビーズは、化合物を付着することおよびDNAライブラリを付着することに使用される。ピコウェル内のすべてのビーズをUV光に曝露すると、フルオロフォアおよび化合物が同時に切断される。QSY7は、好ましいクエンチャである。QSY7の構造およびCAS番号は、以下のとおりである(下記を参照されたい):
CAS名/番号:キサンチリウム,9-[2-[[4-[[(2,5-ジオキソ-1-ピロリジニル)オキシ]カルボニル]-1-ピペリジニル]スルホニル]フェニル]-3,6-ビス(メチルフェニルアミノ)-,塩化物304014-12-8
クエンチャからのフルオロフォアの分離に起因する蛍光の増加を使用して、同時に放出される化合物のピコウェル内の濃度を推測することができる。また、クエンチャからのフルオロフォアの分離に起因する蛍光の増加を使用して、ピコウェル内に遊離形態で存在する分子(以前はビーズ結合化合物であった化合物の形態をとる分子)の数を推測できる。より好ましい実施形態において、放出モニターは、クエンチャおよびフルオロフォアを含み、切断は、フルオロフォアの放出を生じる(クエンチャの放出はない)。この実施形態は、以下のあまり好ましくない実施形態よりも低いバックグラウンドノイズを提供する。あまり好ましくない実施形態では、切断によりクエンチャが放出され、読み出しは、ビーズ結合フルオロフォアからの蛍光の増強の形態をとる。
放出モニターは、ユーザーに可溶性化合物の濃度の測定値、続いてビーズからの化合物のUV誘発放出を提供する。好ましい実施形態では、一形式のビーズは、放出モニターであること専用である。「専用」とは、このビーズがビーズ結合化合物も含まず、ビーズ結合DNAライブラリも含まないことを意味する。
一般的な命題として、化合物が感光性リンカーの切断によってビーズから放出されたからといって、その化合物が可溶性化合物になっていると推測されるべきではない。まず、化合物が「疎水性」または「水不溶性」と見なされるからといって、分子が溶媒中で自由に移動しないという意味ではないことに注意されたい。例えば、コレステロールでさえ、水への溶解度は測定可能である(Saad and Higuchi(1965)Water Solubility of Cholesterol.J.Pharmaceutical Sciences.54:1205-1206を参照されたい)。さらに、ビーズ結合水不溶性化合物の生化学的有効性は、界面活性剤、洗浄剤、DMSOなどの添加剤、またはヒト血清アルブミンなどの担体によって増加させることができる。したがって、放出モニターを使用して、ピコウェルに上記の薬剤の1つが含まれる条件下で、水溶性が制限されるか、もしくは水溶性でない化合物の全体的な濃度を評価でき、または代替的に、水不溶性化合物は、ピコウェルの内部で培養される生細胞の原形質膜の近くに放出される。
図9は、ビーズ結合放出モニターの好ましい実施形態の簡略的なバージョンを開示し、図10は、ビーズ結合放出モニターのこの好ましい実施形態の完全かつ詳細な構造を開示する。
図30は、ビーズ放出モニターの使用を示すデータを提供し、ビーズは、ピコウェル内にある。光切断可能なリンカーを使用して結合されるビーズ結合フルオロフォアは、TAMRA(励起波長530 nm、発光波長570 nm)である。図は、ビーズからのフルオロフォアの放出の時間経過を示す。これは、ビーズ結合放出モニターの作動、t=0秒、t=1秒、t=11秒、t=71秒での蛍光データの取得を示す。図30はまた、4つの小さい図のうちの2つについて、小さい図の拡大を示す差し込み図を含む。図30は、アスパルチルプロテアーゼであるカテプシン-Dと「ペプチドQ-フルオロ基質」およびビーズとのインキュベーションから得られた。試薬を4度でウェル内に配置した。365nmの紫外光を使用して、フルオロフォアをビーズから切断し、それによりフルオロフォアを放出し、それをクエンチャから分離した。このアッセイの目的は、別のウェルで行われた放出の時間経過を評価することであり、別のウェルは、異なる種類のビーズを含む。異なる種類のビーズは、同じ光切断可能なリンカーを有していたが、この光切断可能なリンカーは、ペプスタチン-Aに付着していた。ペプスタチン-Aの放出は、同じアッセイ培地内にあるアスパルチルプロテアーゼと結合して阻害することができる。ビーズ結合ペプスタチン-Aおよびアスパルチルプロテアーゼを用いたこの設定は、陽性対照として機能する。
UVは、20倍の対物レンズを通して曝露された。画像は、Gain=5で取得され、曝露は、400msであった。TAMRAで、530nmで励起する。TAMRAは、570nmで発光する。
図35は、酵素アッセイに関するさらなる詳細を開示し、ビーズ結合ペプスタチン-Aは放出され、放出されたペプスタチン-Aは、酵素阻害をもたらす。光切断可能なペプスタチン-A(陽性対照)および共有結合Cy5ラベルを表示する10μmのTentaGelビーズを、PBSTバッファーで光切断可能なFmoc-バリン(陰性対照)を表示する10μmのTentaGelビーズと混合した。このビーズ集団はピコウェルに導入され、その後、バッファーがカテプシンDプロテアーゼおよびペプチドQ-蛍光基質(λex=480nm、λem=525 nm)を含むプロテアーゼ阻害アッセイに交換された。ウェルを空気でカプセル化し、スライド全体をUV(365nm、77J/cm2)に曝露し、光不安定性リンカーを切断し、化合物を放出して約13μMに到達させた。フローセルを、インキュベートした(30分、37℃)。陽性対照ビーズを含むウェルは、カテプシン-Dによるペプチドタンパク質分解を阻害すべきであり、蛍光シグナルが低くなる。陰性対照ビーズを含むウェルは、いかなるカテプシン-D阻害も示すべきではなく、蛍光強度が空のウェルと同様であるべきである。
クエンチャおよびフルオロフォアの用語は、所定の化学物質について、すぐ近傍で発生する他の化学物質に応じて変化できる。ビーズ結合型放出モニターの実験室データで使用されるTAMRAは、フルオロフォアであるが、他の状況下では、TAMRAは、クエンチャであり得る。TAMRAは、FAMおよびTAMRAを含むTaqMan(登録商標)プローブのクエンチャとして機能する。
実験の設定および実験室データの追加説明。本開示は、空気で区分された充填済みピコウェル内のリン酸バッファー(10mMリン酸、154mMナトリウム、pH8.0)中の制御された5(6)-カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)濃度に関するデータを提供する。捕捉された蛍光画像(10ms、2 msの曝露)および平均ピクセル強度(n≧100)によって定量化されたウェル領域は、濃度対蛍光強度の検量線を生成する。上記のデータは、標準曲線の形態をとり、遊離TAMRAの様々な所定の濃度(2、10、30、60、100mMのTAMRA)での蛍光を示す。この標準曲線は、2つの異なる条件下で調整され、すなわち、写真画像は、2ミリ秒の曝露または10ミリ秒の曝露で撮影された。標準曲線を調整するのに使用した実験は、ピコウェル内で行われたが、この実験においていかなるビーズも使用していない(既知の量のTAMRA)。データは単に、検量線とも称され得る標準曲線の形態をとるため、写真画像は、この特許文書には示されていない。
実験の設定は、以下を含む。スキームX)の場合、TentaGel-Lys(PCL1-Tamra)-QSY7ビーズ構造。QSY7(灰)は、Tamraフルオロフォア(オレンジ)をクエンチするが、光切断可能なリンカー(紫)を介してビーズに共有結合的に付着する。UV(365nm)からの照射により、本来の場所で化合物の定量的な放出を提供する。
図31は、クエンチャ-フルオロフォア基質に対するアスパルチルプロテアーゼの触媒作用後の発光データを開示する。より高い蛍光は、酵素がより触媒的に活性であることを意味する。蛍光が低いことは、酵素が、触媒的に活性が低いことを意味し、すなわち、酵素は、遊離阻害剤によってより阻害され、阻害剤は、ビーズから遊離し、遊離は、光切断可能なリンカーの切断によって得られる。画像は、UV放出およびカテプシン-Dアッセイのインキュベーション後に捕捉した(λex=480nm、λem=525nm)。陽性対照ビーズを含むウェルは、Cy5フルオロフォアによってスペクトル的に特定できる(λex=645nm、λem=665nm、オレンジの偽色)。切片を、開口ウェル容積にわたるラインプロットで分析し、陰性対照ビーズを含むウェルは、カテプシン-D阻害を誘発しない。陽性対照ビーズを含むウェル内のアッセイ容積は暗く、強い阻害を示す。空のウェル内のアッセイ容積は、陰性対照ビーズを含むウェルに匹敵する。
図32は、以下の手順を示す。さらにスキームX)に関しては、ピコウェル基質(1ウェルあたり46pL)をフローセルに封入し、ウェルを真空下で湿らせ、TentaGel-Lys(PCL1-TAMRA)-QSY7ビーズの懸濁液を導入し、フローセルにわたって空気を引き込み、各ウェルを区画化する(上)。放出された化合物(TAMRA)濃度(下)を定量化するために蛍光顕微鏡画像を撮影する前に、フローセルを、制御された光束でUV LED(λ平均値365nm)によって照射し、平衡化する(20分)(図32)。詳細には、図32は、ピコウェルの断面図を示し、フローセル内でピコウェルが湿潤するステップ、懸濁液中のビーズがピコウェルを覆って導入され、ピコウェルごとに1つのビーズをもたらすステップ、過剰な分散液を減らし、メニスカスがピコウェルプレートの平らな上面の表面の下に落ちるようにするために、フローセル全体に空気を引き込むステップ、制御されたUV曝露(365 nm)、一部のTAMRAの放出をもたらすステップ、蛍光顕微鏡で蛍光シグナルを検出してTAMRAからの発光を誘発するステップ(531/40 nmで励起)(594/40 nmで発光)を示す。「スラッシュ40」という表記は帯域幅を指し、すなわち、これは、カットオフフィルターが531nmプラス20nmおよびマイナス20nmの範囲、ならびに594nm、プラス20nmおよびマイナス20nmの範囲に光を制限したことを意味する(このスラッシュ表記は、励起波長および発光波長にも使用できる)。
本発明者らは、以下のデータを示す写真を取得した(図33を参照されたい)。フルオロフォア(TAMRA)の蛍光発光(λex531/40nm、λem593/40)は、ピコウェルフローセル内でUV LED(365nm)に曝露した後、10μmのTentaGel-Lys(PCL1-TAMRA)-QSY7ビーズから放出された。A)QSY7のFRETクエンチング効果により、UV曝露前(0J/cm2)のバックグラウンドを上回る有意な発光はない。TAMRA放出は、(B)25J/cm2、(C)257J/cm2、(D)489J/cm2、(E)721J/cm2、(F)953J/cm2のUV曝露に続いて平衡(20分)に達することができ、次に、適切な曝露時間を使用して画像化した。TAMRA濃度を測定するために、各ビーズを囲う容積内で蛍光発光を測定した(図33)。「スラッシュ40」という表記は帯域幅を指し、すなわち、これは、カットオフフィルターが531nmプラス20nmおよびマイナス20nmの範囲に光を制限したことを意味する(このスラッシュ表記は、励起波長および発光波長にも使用できる)。
以下は、本発明者らによる、ビーズ結合放出モニターのUV曝露(365 nm)後のピコウェル(45pL)内のビーズ放出TAMRAの濃度試験および使用からの蛍光データのいくつかの解釈である(図34を参照されたい)。使用した画像解析は、ビーズ充填ウェル(n≧14)を囲う溶液の平均ピクセル強度であり、画像の曝露時間に対して正規化され、ピコウェル内の既知のTAMRA濃度の標準曲線と相関した。エラーバーは、RSD%から計算された1σを表す。UV放出化合物濃度は、1.1μM(8.9のRSD%)、54.3μM(5.2のRSD%)、142μM(4.2のRSD%)、174μM(7.7のRSD%)、197.3μM(10.1のRSD%)であった(図34)。
(XII)化合物の生化学的アッセイ(細胞系ではないアッセイ)
ピコウェル内のビーズを使用して、様々な生化学的アッセイが可能である。非限定的な例には、結合アッセイ、酵素アッセイ、触媒アッセイ、蛍光系アッセイ、発光系アッセイ、散乱系アッセイなどが含まれる。以下に例を示す。
プロテアーゼおよびペプチダーゼの阻害剤に感受性である生化学的アッセイ。目的は、プロテアーゼを阻害する薬物を検出および開発すること、特定のプロテアーゼまたはペプチダーゼの混合物、好適な切断可能な基質を使用することができるアッセイ、および候補薬物化合物による阻害の程度に感受性な色系アッセイまたは蛍光系アッセイをスクリーニングすることである。例えば、1つの試薬は、ビーズ結合化合物であることができ、化合物は、活性についてまだ試験されていない。別の試薬は、ビーズ結合ペプスタチン(HIV-1プロテアーゼの確立された阻害剤)の形態をとることができる(Hilton and Wolkowicz(2010)PLoS ONE.5:e10940(7ページ))。さらに別の試薬は、HIV-1プロテアーゼの切断可能な基質であり得、HIV-1プロテアーゼによる切断は、色の変化または蛍光の変化が生じる。特定のアッセイ(所定のマイクロウェルにおいて)で色の違い(または蛍光の違い)が生じる陽性クリーニング薬物候補が特定される。切断可能な基質は、クエンチャおよび蛍光剤に共有結合的に結合して隣接する感受性ペプチドの形態をとる。切断前は、クエンチャが近くにあるため、フルオロフォアは蛍光を発しないが、切断後、蛍光が生じる(Lood et al(2017)PLoS ONE.12:e0173919(11ページ)、Ekici et al(2009)Biochemistry.48:5753-5759、Carmona et al(2006)Nature Protocols.1:1971-1976を参照されたい)。本開示の試薬および方法は、上記に開示された技術を包含する。
ユビキチンリガーゼを阻害する化合物の酵素系スクリーニングアッセイは、試薬が、MDM2(酵素)およびp53(基質)を含む。出願人は、以下の技術に基づいて実用試験を実施した。MDM2は、細胞内のp53の量を制御する。MDM2は、いくつかのがんで過剰発現される。MDM2は酵素であり、「生体内研究は、精製されたMDM2が示されており、p53のユビキチン化に十分である」(Leslie et al(2015)J.Biol.Chem.290:12941-12950)。出願人の目的は、MDM2の阻害剤を発見することであり、これらの阻害剤は、p53のユビキチン化を低減し、それによりその後のp53の分解を低減することが予想される。細胞におけるp53の予想される増加を考慮すると、上記の特性を有する阻害剤は、がんの治療に有用であると予想される。
出願人らは、MDM2/HDM2によって媒介されるp53のユビキチン化に対するレナリドマイドの影響を評価するために、以下の酵素系アッセイを使用した。出願人は、以下のキットからの試薬を使用した:MDM2/HDM2ユビキチンリガーゼキット-p53基質(Boston Biochem,Cambridge,MA)。アッセイで使用した試薬の1つは、共有結合的に結合した抗体を含むビーズであった。ビーズは、TentaGel(登録商標)M NH2(カタログ番号M30102,Rapp Polymere GmbH,Germany)であり、抗体は、マウスで生合成された抗ヒトp53モノクローナル抗体であった。MDM2は、p53を基質として使用できるE3リガーゼであり、MDM2は、p53のユビキチン化を触媒する。
がんを低減するためにp53を活性化する目的。MDM2、「p53」と称される転写因子、および抗がん療法の関係が、以下の記載により提案される。記載は、「MDM2は、p53をユビキチン化するE3ユビキチンリガーゼであり、プロテアソーム分解の標的とする」である(Ortiz,Lozano(2018)Oncogene.37:332-340)。p53は、腫瘍抑制活性を有する。p53活性は、MDM2により阻害さる。Wuらによれば、MDM2は、「p53結合タンパク質」である(Wu,Buckley,Chernov(2015)Cell Death Disease.6:e 2035を参照されたい)。例えば、MDM2およびp53の間の相互作用を遮断することにより、化合物がp53のユビキチン化を妨げ、化合物は、抗がん剤として機能することが予測される。
スクリーニングアッセイの目的。スクリーニングアッセイの目的は、p53のユビキチン化に影響を与える化合物、例えば、p53のユビキチン化を刺激する化合物およびp53のユビキチン化を阻害する化合物を発見することである。詳細には、目的は、阻害または活性化する化合物を発見することであり、それらの効果は、MDM-2、およびE1リガーゼ、E2リガーゼ、またはE3リガーゼのいずれかを介する。MDM2は、「マウス二重微小染色体」を意味する。MDM2は、「E3ユビキチンリガーゼ」と称されている。MDM2が細胞内で生じる場合、証拠により、p53のユビキチン化を触媒する活性には、CUL4A、DDB1、RoC1などの多くの他のタンパク質が必要であることを示唆する(Banks,Gavrilova(2006)Cell Cycle.5:1719-1729、Nag et al(2004)Cancer Res.64:8152-8155を参照されたい)。Banksらは、p53およびMDM2を伴う物理的相互作用を記載しており、「L2DTL、PCNA、およびDDB1/CUL4A複合体が、p53腫瘍抑制因子およびその制御因子MDM2/HDM2と物理的に相互作用することを見出した」(Banks,Gavrilova(2006)Cell Cycle.5:1719-1729)。Nagらは、p53およびMDM2を伴う物理的相互作用をさらに記載しており、「Cul4Aは、E3リガーゼとして機能し、ユビキチン-プロテアソーム経路を介していくつかの制御性タンパク質のタンパク質分解に関与する。ここでは、Cul4Aが、MDM2およびp53と関連することを示す」(Nag et al(2004)Cancer Res.64:8152-8155)。
p53ユビキチン化の修飾因子のビーズ系アッセイからの所望される読み出し。化合物をスクリーニングして、陽性スクリーニングヒットが生じた場合、すなわち、AF488蛍光が多く生じた場合、これは活性剤が発見されたことを意味する。化合物をスクリーニングして、陽性クリーニングヒットが生じた場合、蛍光が減少する場合、これは阻害剤が発見されたことを意味する。p53のユビキチン化を阻害する化合物は、化合物が、がんの治療に使用できることを示唆する。また、化合物は、p53のユビキチン化を特異的に阻害し、すなわち、化合物は、他のタンパク質のユビキチン化を阻害しない、または化合物は、他のタンパク質のユビキチン化を阻害するが、p53よりも重度ではなく、さらに、化合物が、がんを治療するのに使用できることも示唆する。
材料。材料には、Boston BiochemからのE3リガーゼキットK-200Bが含まれる。Boston Biochemカタログは、Mdm2/HDM2ユビキチンリガーゼキット-p53基質のようなキットを記載する。以下は、このキットの一部であるMdm2に関するものである。このキットには、セレブロンは含まれない。レナリドマイドおよび類似の化合物は、セレブロンまたはMdm2のいずれかと結合でき、最終結果は、ユビキチンリガーゼの活性化である。材料は、Diamond White Glass顕微鏡スライド、25mmx75mm(Globe Scientific,Paramus,NJ)をさらに含む。Corning撹拌機/ホットプレート(0~10の設定)698ワット、モデルPC-420。N-ヒドロキシ-スクシンイミド(NHS)。メチルテトラジン(mTET)。AlexaFluor488(AF488)(ThermoFisher Scientific)。TentaGelビーズM NH2(カタログ番号M30102)(Rapp Polymere GmbH)。パラフィルム(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。図8は、Alexa Fluor(登録商標)488の構造を示す。Alexa Fluor 488(AF488)の構造は、AlexaFluor488-Nanogold-Streptavidin(Nanoprobes,Inc.,Yaphank,NY)の製品情報に示される。
(XIII)化合物についての細胞系アッセイ
ピコウェル内で行われる細胞系アッセイは、ヒト細胞、非ヒト細胞、ヒトがん細胞、非ヒトがん細胞、細菌細胞、マラリア原虫細胞などの寄生虫の細胞を使用することができる。また、細胞系アッセイは、「殺傷されたが代謝的に活性な」ヒト細胞または非ヒト細胞を用いて行うことができ、すなわち、それらのゲノムは、代謝を可能にするが細胞分裂を防ぐために架橋されている(Dubenskyの米国特許公開番号第2007/0207170号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。さらに、細胞系アッセイは、アポトーシス性の細胞、ネクローシス性の細胞、または死細胞で行うことができる。細菌細胞を用いた細胞系アッセイは、抗生物質のスクリーニングに使用できる。ウイルスに感染したヒト細胞は、抗ウイルス剤のスクリーニングに使用できる。細胞の組み合わせは、細胞系アッセイについて提供される。例えば、樹状細胞およびT細胞の組み合わせは、抗原提示を刺激するか、または代替的に、抗原提示を損なう化合物をスクリーニングおよび同定するために提供される。
細胞系アッセイは、例えば、正常組織の生検、固形腫瘍、または血液がんからの生検、または循環固形腫瘍細胞から得られる細胞の初代培養に基づくことができる。また、細胞系アッセイは、1回以上継代されている細胞に基づくことができる。
ピコウェル内で行われる細胞系アッセイは、1つの細胞のみを含む、または2つの細胞、3つの細胞、4つの細胞、5つの細胞、または約2つの細胞、約3つの細胞、約4つの細胞、約5つの細胞、または複数の細胞、または3つ未満の細胞、4つ未満の細胞、5つ未満の細胞などを含む培養を使用できる。
出願人は、以下の技術に基づいて実用試験を実施した。これは、レナリドマイド(試験化合物)が転写因子のユビキチン媒介性タンパク質分解を阻害する例示的な実施形態の化合物をスクリーニングするための細胞系アッセイを記載する。転写因子は、イカロスおよびアイオロスを含む。
本開示は、ビーズ結合化合物上の化合物をスクリーニングする細胞系アッセイを提供し、スクリーニングは、多くのピコウェルを有するプレートで行われる。細胞系アッセイの構成要素は、ビーズ結合化学ライブラリを保持するためのピコウェルを含み、各ビーズは、実質的に1つのみの均一な種類の化合物が付着している。化合物は、切断可能なリンカーを介して放出される。哺乳動物細胞は、ピコウェル内で培養される。ピコウェルは、培養培地をさらに含む。現在開示されているレナリドマイドの非限定的な例は、所定の標的タンパク質のユビキチン化を制御する他の化合物を発見するための化学ライブラリをスクリーニングするために使用できる原理証明の例である。
細胞系アッセイの短い記載。組換え細胞は、緑色蛍光タンパク質(GFP)のタンパク質分解を誘発する化合物を検出およびスクリーニングするための試薬として使用され、陽性スクリーニング化合物を特定する読み出しは、緑色の細胞が無色の細胞になるか、または緑色が低下した細胞になる状況である。この細胞系アッセイのメカニズムに関して、緑色の細胞が無色の細胞になるか、または緑色が低下した細胞が生じるレナリドマイドの作用メカニズムは、レナリドマイドが「セレブロン」と称されるタンパク質と結合することである。細胞内では、セレブロンは、「E3ユビキチンリガーゼ」と称されるタンパク質の複合体の一部である。セレブロンは、レナリドマイド、サリドマイド、およびポマリドマイドの抗がん剤の直接的な標的である。E3ユビキチンリガーゼの通常の構成的活性、およびセレブロンとのその関係は、「セレブロンは、E3ユビキチンリガーゼを結合することにより、[標的タンパク質の]プロテオソーム分解を促進する」と記載されている(Akuffo et al(2018)J.Biol.Chem.293:6187-6200を参照されたい)。E3ユビキチンリガーゼの通常の活性とは対照的に、レナリドマイド、サリドマイド、またはポマリドマイドなどの薬剤を追加した場合、その結果、「レナリドマイド、サリドマイド、およびポマリドマイドは、E3ユビキチンリガーゼによる基質のユビキチン化および分解を促進(複数可)し、これらの薬剤の各々は、転写因子IKZF1およびIKZF3の分解を誘発する」(Kronke et al(2015)Nature.523:183-188)。
用語に関して、セレブロンは、「E3リガーゼ」と称され、また「E3ユビキチンリガーゼ」とも称されるタンパク質の複合体の一部であると記載されている。一般に、セレブロン自体は、「E3リガーゼとは称されない。次の抜粋は、「セレブロン」という単語の使用方法を示す。Akuffo et al(2018)J.Biol.Chem.293:6187-6200によると、「サリドマイドがE3リガーゼ基質受容体セレブロンと結合すると、DDB1-CUL4A-Roc1-RBX1 E3ユビキチンリガーゼが関与することにより、[基質の]プロテオソーム破壊が促進される。」一貫して、Yang et al(2018)J.Biol.Chem.293:10141-10157は、「セレブロンは、タンパク質[基質]ユビキチン化を媒介するために、cullin-4 RING E3リガーゼの基質受容体として機能する」と開示する。Zhu et al(2014)Blood.124:536-545では、「サリドマイドはCRBN [セレブロン]と結合して、CRBN、DDB1、およびCUL4で構成されるE3ユビキチンリガーゼ複合体の機能を変化させる」と述べている。Lopez-Girona et al(2012)Leukemia.26:2326-2335では、「研究により、E3リガーゼタンパク質セレブロン(CRBN)がサリドマイドの直接的な分子標的であることが特定され、CRBNおよびDDB1は、Cul4AおよびRoc1と機能的なE3リガーゼ複合体を形成する」と述べている。
出願人によって考案および使用された細胞系アッセイの全体像を見るには、第1のステップは、レナリドマイドを細胞に追加する。最終的なステップは、IKZF1およびIKZF3が機能低下することである。IKZF1が、GFPとの融合タンパク質として生じる場合、最終的なステップは、融合タンパク質全体が、プロテアソームによって分解されることである。同様に、IKZF3が、GFPとの融合タンパク質として生じる場合、最終的なステップは、融合タンパク質全体が、プロテアソームによって分解されることである。GFP分解の結果、以前は緑色の蛍光を発していた細胞が、蛍光を発しない細胞に転換する。
細胞系アッセイの長い記載。これは、E3ユビキチンリガーゼ(タンパク質の複合体)のタンパク質の名称、この複合体と結合するタンパク質の名称、およびこの複合体の標的であるタンパク質の名称に関連する。これらの名称については、公開されている文献は一貫していない。タンパク質をタンパク質の名称で参照することもあれば、タンパク質をコードする遺伝子の名称を使用してタンパク質を参照することもある。このため、以下の報告では、「セレブロン」(タンパク質の名称)および「CRBN」(遺伝子の名称)など、タンパク質名と遺伝子名とを一緒に使用している。また、「イカロス」は、タンパク質の名称であり、遺伝子の名称は、IKZF1である。また、「アイオロス」はタンパク質の名称であり、IKZF3は、遺伝子の名称である。「Cullin-ringフィンガーリガーゼ-4」は、タンパク質の名称であり、遺伝子の名称は、CRL4である。「cullin-1の制御因子」はタンパク質の名称であり、遺伝子の名称は、ROC1である。ROC1は、RBX1(Jia and Sun(2009)Cell Division.4:16.DOI:10.1186としても知られている。「Cullin-4A」はタンパク質の名称であり、遺伝子の名称は、CUL4Aである。Schafer,Ye,Chopra(2018)Ann.Rheum.Dis.DOI:10.1136、Chen,Peng,Hu(2015)Scientific Reports.5:10667、Matyskiela et al(2016)Nature.535:252-257、Akuffo et al(2018)J.Biol.Chem.293:6187-6200を参照されたい)。
E3ユビキチンリガーゼは、ユビキチン残基の標的タンパク質への転移を触媒し、その結果、標的タンパク質は分解のためにプロテアソームに移送される。E3リガーゼは、標的タンパク質の1つ以上のリジン残基へのユビキチンの結合を触媒する。ヒトは、約617の異なるE3ユビキチンリガーゼ酵素を発現する(Shearer et al(2015)Molecular Cancer Res.13:1523-1532を参照されたい)。E3ユビキチンリガーゼは、Cullin-4(CUL4AまたはCUL4B)、Cullins-1(RoC1)の制御因子、およびRING Boxドメインタンパク質(RBX1)のタンパク質の複合体である。上述されるように、RoC1は、RBX1と同じタンパク質である(Jia and Sun(2009)Cell Division.4:16.DOI:10.1186を参照されたい)。セレブロン(CRBN)がE3ユビキチンリガーゼ複合体に連結されると、生じるより大きな複合体は、CRL4CRBNと称される(Matyskiela et al(2016)Nature.535:252-257)。「CRL4」という用語は、「Cullin-4 RINGリガーゼ」を意味する(Gandhi et al(2013)Brit.J.Haematol.164:233-244、Chamberlain et al(2014)Nature Struct.Mol.Biol.21:803-809)。セレブロンの文献を読む際には、上記の命名法の不一致を考慮する必要がある。
以下は、上記で開示された短い抜粋のより長いバージョンである。以下に示すのは、さらに別の形式の命名法、つまり、「CRL4CRBN E3ユビキチンリガーゼ」という用語である。より長い報告は、様々な名称および細胞性事象をより完全に統合する。「セレブロン(CRBN)およびE3ユビキチンリガーゼ複合体の間の関係は、「DDB1-CUL4A-Roc1-RBX1 E3ユビキチンリガーゼを利用することにより、[標的タンパク質の]プロテオソーム分解を促進する」と記載されている(Akuffo et al(2018)J.Biol.Chem.293:6187-6200)。抗がん剤に関しては、「レナリドマイド、サリドマイド、およびポマリドマイドは、E3ユビキチンリガーゼによる基質のユビキチン化および分解を促進する。これらの化合物は、CRBNと結合し、CRL4CRBN E3ユビキチンリガーゼの基質アダプタであり、これらの薬剤の各々は、転写因子IKZF1およびIKZF3の分解を誘導する」(Kronke et al(2015)Nature.523:183-188)。
これは、任意の所定のマイクロウェル、ナノウェル、またはピコウェルがビーズを含む、細胞系アッセイに関連し、ビーズは、共有結合的に連結された化合物を有し、化合物は、切断可能なリンカーを介して付着され、ウェルは、1つ以上の培養された哺乳動物細胞を含む。本開示の化合物および薬物候補に対する応答は、1つ以上のバイオマーカーによって評価され得る。
バイオマーカーには、診断バイオマーカー、所定の患者が所定の薬物に対して応答する(より良くなる)かを予測するバイオマーカー、および所定の患者が所定の薬物に対して許容できない毒性を経験するかを予測するバイオマーカーが含まれる(Brody,T.(2016)Clinical Trials:Study Design,Endpoints and Biomarkers,Drug Safety,and FDA and ICH Guidelines,2nd ed.,Elsevier,San Diego,CA)。本開示は、さらに別の種類のバイオマーカー、つまり、薬物療法が開始されている後に、所定の薬物に対する患者の応答をモニタリングするバイオマーカーを使用する。一例を挙げると、以下は、バイオマーカー「ペルオキシレドキシン6(PRDX6)」および肺癌に関するものである。Hughesらによると、「細胞株からの細胞培地のPRDX6レベルは、ゲフィチニブ治療対ビヒクルPRDX6の経時的な蓄積後に増加し、ゲフィチニブ感受性と正の相関があった。血清PRDX6レベルは、ゲフィチニブ療法の過程で血清PRDX6の療法変更の最初の24時間に著しく増加し、抗EGFR剤に対する応答をモニタリングするための画像化系戦略よりも優れている。」バイオマーカーは、応答の有効性のより直接的な測定、つまり、腫瘍サイズおよび数の低減を検出するための「画像化」の使用よりも優れていることに注意されたい(Hughes et al(2018)Cancer Biomarkers.22:333-344)。抗がん剤に対する応答をモニタリングする他のバイオマーカーには、卵巣癌のプラチン療法に対する応答をモニタリングするためのCA125、および卵巣癌の化学療法に対する応答をモニタリングするための血清HSPB1が含まれる(Rohr et al(2016)Anticancer Res.36:1015-1022、Stope et al(2016)Anticancer Res.36:3321-3327を参照されたい)。
サイトカイン発現。応答は、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-ガンマ、TNF-アルファなどの発現されるサイトカインを測定することにより評価できる。これらの特定のサイトカインは、これらのサイトカインの1つを特異的に認識する抗体を有する金ナノ構造を使用して同時に測定でき、検出は、プラズモン共鳴を伴う(Spackova,Wrobel,Homola(2016)Proceedings of the IEEE.104:2380-2408、Oh et al(2014)ACS Nano.8:2667-2676)。単一のT細胞などの単一の細胞により発現されるサイトカインは、マイクロウェルを含むデバイスで、蛍光抗体を介して測定できる(Zhu,Stybayeva(2009)Anal.Chem.81:8150-8156)。上記の方法は、本開示のための試薬および方法として有用である。
いくつかの実施形態において、サイトカインに対する抗体をピコウェルの壁に付着させることができ、薬物曝露の機能として細胞から放出されるか、または差次的に放出されるサイトカインは、ピコウェルの壁に結合した抗体により捕捉することができる。捕捉されたサイトカインは、標識された抗体の第2のセットによって特定され得る。いくつかの実施形態において、サイトカインに対する抗体をキャップ化ビーズに付着させることができる。次いで、キャップ化ビーズは、剥離され、例えば、ELISA、質量分析計、または他の分析技術によるさらなる分析に供され得る、架橋ヒドロゲルシートに埋め込まれ得る。
アポトーシス。アポトーシスでのリアルタイムデータ、および単一細胞のアポトーシスにおける初期事象は、表面増強ラマン分光(SERS)および局在表面プラズモン共鳴(LSPR)を使用して測定できる(Stojanovic,Schasfoort(2016)Sensing Bio-Sensing Res.7:48-54、Loo,Lau,Kong(2017)Micromachines.8:338.DOI:10.3390を参照されたい)。前述のStajanovicは、チトクロムC、EpCam、およびCD49eの細胞からの放出を検出する。前述のLooらは、チトクロムCの細胞からの放出を測定し、検出は、DNAアプタマーを伴う(このDNAアプタマーは、抗体のように機能する)。Zhouらは、SERSを使用して単一細胞の初期アポトーシスを検出し、測定されるのは、細胞膜上のホスファチジルセリンである(Zhou,Wang,Yuan(2016)Analyst.141:4293-4298を参照されたい)。アポトーシスに関するデータの収集に加えて、SERSは、有糸分裂の段階、代謝産物の放出、原形質膜と結合した生体分子の発現に関するデータを収集することにより、薬物活性を評価するために使用できる(Cialla-May et al(2017)Chem.Soc.Rev.46:3945-3961を参照されたい)。プラズモン共鳴は、アポトーシスで生じるタンパク質変性およびDNA断片化を測定できる(Kang,Austin,El-Sayed(2014)ACS Nano.8:4883-4892を参照されたい)。プラズモン共鳴(SERS)は、アルファヘリックス形態およびベータシート形態における有糸分裂タンパク質の割合を測定することにより、がん細胞および正常細胞を識別できる(Panikkanvalappil,Hira,El-Sayed(2014)J.Am.Chem.Soc.136:159-15968)。上記の方法は、本開示のための試薬および方法として好適である。
アポトーシスは、プラズモン共鳴を使用しないが、その代わりに、抗切断カスパーゼ3抗体を使用した免疫細胞化学を使用する方法において培養された細胞で測定することもできる(Shih et al(2017)Mol.Cancer Ther.16:1212-1223)。
細胞系アッセイに関する一般的な情報。本開示の細胞系アッセイは、ヒトがん細胞、固形腫瘍からの細胞、血液性がんからの細胞、ヒト幹細胞、ヒト肝細胞、病原菌、感染性細菌、細菌に感染したヒト細胞、ウイルスに感染したヒト細胞などからの応答を試験するために使用され得る。アッセイは、遊走などの細胞の形態学的応答、ならびに遺伝的応答および生化学的応答を検出することができる。
本開示のアッセイは、ピコウェルの内側に位置する細胞の応答を検出するように、またはピコウェルのアレイの上部の層として位置する栄養培地中など、ピコウェルの外側に位置する細胞の応答を検出するように設計され得る。また、本開示のアッセイは、細胞の応答を検出するように設計することができ、細胞およびビーズは培地内に位置し、細胞は、培地内に位置し、ビーズは、培地の上部または下部にあり、細胞は、培地の上部に位置し、ビーズは、培地の上部または中部または下部に位置する。
本開示は、ピコウェルアレイに細胞の集団を提供する。実施形態において、細胞集団の少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約40%、少なくとも約60%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約100%が、ピコウェルの内側に存在する(ピコウェルの上部に位置するいかなる領域にも存在しない)。実施形態において、ウェルの内側に存在する細胞の割合であり、残りは、ウェルのアレイの上部に存在する栄養培地の層に位置し、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約100%、または「約60%~約90%」の範囲など、これらの数値の2つによって定義される範囲であり得る。
細胞のマトリックス。細胞の生物学的活性のアッセイでは、細胞は、ビーズから放出された化合物に曝露されるか、または細胞は、ビーズに結合化合物に曝露され、好適なマトリックスには、ポリ-D-リジン(PDL)、ポリ-L-リジン(PLL)、ポリ-L-オルニチン(PLO)、ビトロネクチン、オステオポンチン、コラーゲン、RGD配置を含むペプチド、RGD配置を含むポリペプチド、ラミニン、ラミニン/フィブロネクチン複合体、ラミニン/エンタクチン複合体などの1つ以上を含むものが含まれる。好適なマトリックスには、PuraMatrix(登録商標)Peptide Hydrogel(登録商標)、Cell-Tak(登録商標)細胞および組織接着剤、Matrigel(登録商標)など、Corning,Inc.から入手可能な製品も含まれる。Corning Life Sciences(2015)Corning Cell Culture Surfaces,Tewksbury,MA(20ページ),De Castro,Orive,Pedraz(2005)J.Microencapsul.22:303-315を参照されたい。除外的な実施形態において、本開示は、上記のマトリックスの1つまたは上記のポリマーの1つを含む任意の組成物または方法を除外することができる。
実施形態において、本開示は、アレイを提供し、個々のピコウェルは、ビーズ、1つ以上の細胞、ならびに溶液(いかなるマトリックスも含まない)、またはマトリックス、または溶液およびマトリックスの組み合わせのいずれかを含む。マトリックスは、ヒドロゲル、ポリリジン、ビトロネクチン、MatriGel(登録商標)などであり得る。
ビーズ結合化合物またはビーズ放出化合物の活性が、実行され得る。活性を評価するためのアッセイには、酵素の活性化または阻害、細胞シグナル伝達カスケードまたは個々の細胞シグナル伝達タンパク質の活性化または阻害、抗体(または抗体の相補性決定領域(CDR)、抗体の可変領域)との結合、リガンドまたは基質の酵素(または抗体、または抗体の可変領域)との結合の阻害が含まれる。
上記のアッセイについて、読み出しは、例えば、クエンチャ(F-Q)に連鎖状フルオロフォアを含む蛍光アッセイで決定することができる。リンカーは、エンドプロテアーゼ、DNAse、RNAse、またはホスホリパーゼにより切断可能となるように設計できる(Stefflova,Zheng(2007)Frontiers Bioscience.12:4709-4721を参照されたい)。「分子ビーコン」という用語は、この種類のF-Q分子を指すが、「分子プローブ」は、TaqMan(登録商標)アッセイのように、ハイブリダイゼーションによってFおよびQの分離が誘導される構築物を指すことにも使用されている(Tyagi and Kramer(1996)Nature Biotechnol.14:303-308、Tsourkas,Behlke,Bao(2003)Nucleic Acids Res.15:1319-1330)。
薬物曝露に応じた転写プロファイリング。本開示のDNAバーコードは、応答捕捉要素を含むように改変され得、応答捕捉要素は、バーコードのコード化部分によりてコードされる摂動に対する細胞の応答を捕捉する。いくつかの実施形態において、DNAバーコードは、ポリT部分(チミジンヌクレオチドの複数の繰り返し)で終結し得、ポリT配列を使用して、溶解された細胞から放出されるポリA終結mRNA分子を捕捉し得る。いくつかの実施形態において、応答捕捉配列は、目的の遺伝子に相補的であり得、それにより、この実施形態のビーズへのハイブリダイゼーションを介して所望される遺伝子の発現プロファイルを捕捉する。いくつかの実施形態において、ピコウェルは、転写プロファイルがビーズ上に捕捉される単一細胞ピコウェルを含み得る。他のいくつかの実施形態において、複数の細胞は、転写プロファイルが捕捉されているピコウェル内に含まれ得る。
1つの例示的なワークフローにおいて、以下の手順は、薬物に対する細胞の転写応答を追跡し得る。(a)ウェルあたり単一の細胞を捕捉するように設計されたピコウェルを提供する。(b)化合物を負荷したDNAバーコードビーズをピコウェルに導入し、1つのビーズが、ピコウェルごとに存在するようする。(c)化合物を、適切な方法により各ピコウェル内のビーズから放出する(実施形態のビーズに適切な、UV切断可能リンカーを介して付着される化合物のUV処理剤、ビーズを酸切断可能、塩基切断可能、温度切断可能な化合物に浸漬した場合の拡散など)。(d)ピコウェルを、ピコウェル内に内容物を保持するキャップ化ビーズを介して、またはピコウェルの上部にあるエアバリアまたは油バリアなどの他の手段によって、互いに単離し得る。(e)ピコウェル内の細胞を、ビーズから放出された化合物の存在下で一定時間インキュベートする。(f)好適な時間の後、例えば、1時間、2時間、5時間、9時間、12時間、15時間、18時間、1日間、3日間、1週間、2週間、1か月、またはアッセイに基づいた別の適切な時間で、細胞を、溶解方法により溶解する。溶解方法は、洗浄剤の添加、凍結および解凍の繰り返しサイクル、加熱、膜破壊ペプチドの添加、機械的攪拌、または他の好適な手段を伴い得る。(g)溶解すると、細胞の内容物がピコウェル内のビーズに曝露され、その時点でピコウェルのビーズ上の応答捕捉要素は、それらが意図する応答の捕捉を可能とする。いくつかの実施形態において、応答捕捉は、各ピコウェル内の細胞(または複数の細胞)の完全なmRNAプロファイルを捕捉するポリT配列である。いくつかの実施形態において、応答捕捉要素は、細胞から特定のDNAまたはRNA配列を捕捉するように設計される。いくつかの実施形態において、細胞の転写応答は、化合物の用量(または濃度)の機能として捕捉され得る。
(XIV)細胞での摂動-応答分析
本明細書に記載される方法は、摂動ライブラリおよび細胞のライブラリを含み得る。いくつかの実施形態において、摂動および細胞は、制限された環境でインキュベートされる。インキュベーション中または後に、摂動を特定するバーコード(「摂動バーコード」)が、それがインキュベーションされている細胞に移行され得る。本方法は、摂動から細胞を放出する(すなわち、分離または除去する)こと、および摂動バーコードと共に細胞内容物が捕捉される第2の制限に細胞を供することをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、第2の制限は、細胞特異的なバーコードを含み得、その後、細胞内容物および摂動バーコードを研究するために使用され得、それにより摂動を細胞応答に関連付ける。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、2つの応答、摂動バーコードによりコードされた摂動反応および測定応答を含み得る。摂動応答において、細胞は、摂動に供され得る。測定応答において、摂動の結果としての細胞応答が、測定され得る。いくつかの実施形態において、測定応答は、測定バーコードを含み得る。他の実施形態において、方法は、摂動バーコードを測定応答に引き継ぐこと、および測定応答に含まれる測定バーコードおよび摂動バーコードの両方を捕捉することにより、摂動を細胞応答に関連付けることを含み得る。
本明細書に記載される方法は、摂動バーコードによりコードされる摂動応答を含み得る。摂動応答は、細胞を摂動に供し、続いて、供された摂動に対する細胞の細胞応答を測定することを含む。摂動バーコードは、細胞応答を測定する前または後のいずれかに解読され、したがって、摂動の同一性を測定された細胞応答に関連付けし得る。
いくつかの実施形態において、本方法は、DNAコードされた、ビーズ結合化合物ライブラリを提供することを含み、化合物は、ビーズから放出され得、DNAコードされた、ビーズ結合化合物ライブラリと細胞のライブラリを接触させ、接触は、第1の制限された容積内に1つ以上の細胞と共にビーズを制限し、ビーズから化合物を放出し、第1の制限された容積内で細胞と共に化合物をインキュベートすることにより実行され得る。いくつかの実施形態において、同時またはインキュベーション後のいずれかで、化合物を特定するDNAバーコードは、ビーズから放出され、細胞に付着され得る。DNAバーコードが付着された細胞は、第1の制限された容積から放出され、第2の制限された容積内に再び制限され、第2の制限された容積は、細胞を溶解する試薬、ならびに細胞内容物および細胞によって運搬されるビーズ特異的バーコードを捕捉するメカニズムを有する。いくつかの実施形態において、細胞内容物およびバーコードを捕捉するために使用されるメカニズムは、捕捉バーコードを使用することを伴い得、単一細胞または細胞の小さなクラスターを固有に特定するように機能し得る。いくつかの実施形態において、捕捉バーコードおよびビーズ特異的バーコードは、連結され得る。いくつかの実施形態において、個々にバーコード化された材料を含む制限された容積のすべてを併合し、細胞およびビーズに特異的であるバーコード化された細胞内容物およびバーコードのプールを作製し得る。バーコード化された材料のプールは、個々の細胞応答を研究し、細胞応答を引き起こした摂動にそれらを連結するためにシーケンシングより分析され得る。
いくつかの実施形態において、方法は、液滴内の個々の細胞を捕捉することを含む。細胞は、細胞が経験する摂動を固有に特定するために、それらの細胞膜上に核酸バーコードを含み得る。細胞は、液滴内で溶解され得、細胞のmRNAおよび細胞膜に結合された核酸バーコードは、バーコード化された捕捉オリゴヌクレオチド(「捕捉バーコード」)のセットで捕捉され得る。各液滴は、異なる固有のバーコード化された捕捉オリゴヌクレオチドを含み得、1つの液滴内のバーコードは、実質的に同一の配列の区間を有する。mRNAおよび細胞膜に結合されたバーコードは、逆転写酵素を使用して液滴バーコード化されたオリゴヌクレオチドにコピーされ得る。核酸材料は、液滴を破壊することにより、液滴から一緒にプールされ得る。すべての核酸材料は、個々の細胞の転写プロファイルを研究し、それを転写プロファイルに関連する摂動に関連付けるために、シーケンシングされ得る。
本明細書に記載される方法は、細胞のライブラリを2つのバーコード化された制限、摂動制限および溶解制限に供することを含み得る。細胞は個別に、または小さなクラスターとして制限され得る。バーコードは、細胞を摂動させながら細胞に導入されたバーコード、および細胞を溶解させながら導入されたバーコードを含み得る。いくつかの実施形態において、摂動バーコードは、細胞により溶解ステップに運搬され得る。いくつかの実施形態において、溶解バーコードは、細胞内容物および/または摂動バーコードに適用され得、細胞内容物を細胞が経験する摂動に関連付ける、バーコード化された細胞内容物の確立をもたらす。いくつかの実施形態において、摂動ビーズは、応答捕獲プローブをさらに含み得る。この場合、2つの区画化ステップの代わりに、単一のピコウェル区画化ステップで十分であり得る。かかる実施形態において、複合バーコードは、細胞応答を捕捉することができるように機能化され得る。いくつかの実施形態において、摂動バーコードは、mRNA分子のポリ(A)テールがハイブリダイズし得るポリ(T)セグメントで終わる。
いくつかの実施形態において、単一細胞の摂動応答分析のワークフローは以下のとおりである:(1)機能化された摂動ビーズを提供し、摂動バーコードは、捕捉配列で終了し、捕捉配列は、mRNAの捕捉のためのポリ(T)ヌクレオチド、または他の細胞応答を捕捉するための他の適切な捕捉プローブのセットを含み得、(2)ピコウェルアレイ内の細胞のライブラリを捕捉し、(3)機能化された摂動のライブラリを、同じピコウェル内に捕捉し、ここで、いくつかの実施形態では、単一細胞および単一機能化されたビーズがウェルごとに捕捉され、他の実施形態では、細胞のクラスターがピコウェル内に捕捉され得、(4)任意で、ピコウェルを油媒体で覆い、ウェル間の試薬の相互汚染を防止し、(5)摂動ビーズから化合物を放出し、摂動ビーズから放出された化合物と共に各ウェル内の細胞をインキュベートし、(6)ピコウェルを覆って溶解バッファーを流すことにより、ピコウェル内の細胞を溶解し、(7)摂動バーコードの先端に直接的に、mRNAまたは他の細胞応答を捕捉し、(8)ポリメラーゼまたは逆転写酵素を使用して、細胞応答を摂動バーコードにコピーし、(9)超音波処理によりピコウェルからビーズを放出し、次に、放出されたビーズから伸長された摂動バーコードを切断するか、または単純に、ビーズが依然としてピコウェル内にある間に摂動バーコードをビーズから切断し、(10)切断されたヌクレオチド(伸長された摂動バーコード)を適切なライブラリ調製方法に供し、調製されたヌクレオチドをシーケンシングする。いくつかの実施形態において、シーケンシングされたヌクレオチドは、細胞が供された摂動/化合物を特定する摂動バーコード、および摂動バーコードにより特定された摂動/化合物に供された細胞のmRNA発現に対応する応答区域の2つの区域を含む。このワークフローは、図36に示され、任意で、プロセスのQCのためのイメージングステップを伴う。逆転写酵素法は、捕捉されたRNAをビーズ付着DNA上に伸長し、それにより細胞内容物情報を機能化されたビーズに転送するのに機能し得る。その後、ビーズをプールし、抽出し、シーケンサーで分析できる。いくつかの実施形態において、単一細胞からのDNAは、機能化されたビーズ上の特異的なプライマーにさらに捕捉され得る。かかる実施形態において、ポリメラーゼは、逆転写酵素を置き換えてもよい。
いくつかの実施形態において、摂動および細胞応答の捕捉は、図37に記載されるように、2つの異なる制限において起こり得る。摂動バーコードは、細胞応答捕獲制限に供される前に、細胞表面に移行され得る。細胞応答捕獲はまた、細胞表面上で運搬される摂動バーコードを捕獲することを伴い、それにより細胞応答を細胞が曝露される摂動に直接的に関連付ける。いくつかの実施形態において、細胞応答の捕捉は、Drop-seq法により達成することができる。いくつかの実施形態において、細胞応答の捕捉は、10X Genomics単一細胞機器、Raindance単一細胞分析プロトコル、BioRad単一細胞単離機器、Mission Bio単一細胞分析プロトコル、GigaGen機器およびプロトコル、ならびに/または任意の他の市販の単一細胞分析機器もしくはサービスなどの任意の市販の単一細胞分析機器で生じ得る。
いくつかの実施形態において、細胞懸濁液は、摂動ビーズにより制限を受ける細胞の開始点として使用され得る。細胞を水性培地に懸濁する方法または細胞を懸濁液で培養する方法は、当業者に周知である。細胞を懸濁する方法および細胞を懸濁液で培養する方法もまた、当技術分野において記載される。例えば、いくつかの実施形態において、球状体細胞培養は、単離において単一細胞よりも多くの細胞間相互作用シグネチャを捕捉するので、摂動の開始点として使用され得る(例えば、Edmondson et al.,Assay Drug Dev Technol.12:207-218,2014、Fennema et al.,Trends Biotechnol.31:108-115,2013、Han et al.,Sci Reports 5:11891,2015、Zanoni et al.,Sci Reports 6:19103,2016を参照されたく、それらの開示のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。いくつかの実施形態において、ハイスループット摂動を受けるために単一細胞の代わりにオルガノイドが使用され得る(例えば、Foley,Nat Methods 14:559-562,2017、Liu et al.,Front Pharmacol.7:334,2016、Neugebauer et al.,BioRxiv April 2017、Skardal et al.,Drug Discov Today 21:1399-1411,2016、Boehnke et al.,J Biomol Screen 21:931-941,2016を参照されたく、それらの開示のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
いくつかの実施形態において、細胞は、疾患モデルから得られる。本明細書に記載される方法は、疾患モデル細胞にわたる化合物の大規模なハイスループットスクリーニングを可能にし、摂動/化合物ライブラリ内の1つ以上の化合物への曝露により治療応答が得られるかを確認する。他の実施形態において、細胞は、様々な系統の健康な細胞である。本明細書に記載される方法は、様々な化合物に対する細胞応答の大規模ハイスループットマッピングを可能にする。いくつかの実施形態において、細胞上のコンビナトリアル化合物ライブラリの不偏的なスクリーニングにより収集されたデータは、薬物-細胞の相互作用の既知のマップに基づく新規薬物予測を可能にする。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法において使用される制限は、液滴制限を含む。いくつかの実施形態において、液滴は、油マトリックス中に水性液滴を含む。いくつかの実施形態において、液滴は、水相および油相の混合を含むマイクロ流体接合部で生成される。いくつかの実施形態において、マイクロ流体接合部は、細胞、摂動ビーズ、および油相を含む。細胞およびビーズを用いて液滴を作製するためのマイクロ流体構築の一実施形態は、「Drop-Seq」法により示される(例えば、Macosko et al.,Cell 161:1202-1214,2015を参照されたい)。
いくつかの実施形態において、方法は、ヒドロゲル制限を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法において使用される制限は、ヒドロゲル制限を含み、細胞およびビーズは、それらの自由拡散を防止するヒドロゲルマトリックスに包埋される。いくつかの実施形態において、細胞およびビーズが互いに近接するように共局在化することは、偶然に生じる。いくつかの実施形態において、ビーズは、細胞に接着する結合部分を含み、その後、細胞-ビーズ二重鎖は、ヒドロゲルに包埋される。いくつかの実施形態において、細胞へのビーズの近接は、そのビーズから放出された化合物が、拡散誘発交差反応性を伴わずにその細胞のみを摂動させることを確実にする(細胞間隔は、ヒドロゲル中の化合物の拡散半径よりも遠い)。いくつかの実施形態において、摂動後、細胞は、溶解バッファーをヒドロゲルに通すことによって溶解され、放出された細胞内容物は、細胞に近接するビーズ上に捕捉される。いくつかの関連する刊行物は、Zhu and Yang,Acc.Chem.Res.50:22,2017、Sung and Shuler,Lab Chip 9:1385-1394,2009、Gurski et al.,Biomaterials 30:6076,2009,Microfluidic Immunophenotyping Assay Platform for Immunomonitoring of Subpopulations of Immune Cells,1761~1763ページ、17th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences,MicroTAS,2013、および米国特許公開番号第US20030175824 A1号であり、それらの開示のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法において使用される制限は、ピコウェル制限を含み、個々のビーズおよび細胞は、微細加工されたピコウェル内に捕捉され、アッセイは、ピコウェルのアレイ内で実行され得る。細胞およびビーズをピコウェルのアレイに負荷するための詳細な手順は、例えば、Yuan and Sims,Sci Rep.6:33883,2016に記載される。いくつかの実施形態において、摂動ビーズは、応答捕捉プローブをさらに含み、2つの区画化ステップの代わりに、単一のピコウェル区画化ステップで十分である。かかる実施形態において、摂動バーコードは、細胞応答を捕捉することができるように機能化され得る。いくつかの実施形態において、摂動バーコードは、mRNA分子のポリ(A)テールがハイブリダイズし得るポリ(T)セグメントで終わる。
いくつかの実施形態において、単一細胞の摂動応答分析のワークフローは以下のとおりである(例えば、図36を参照されたい):(1)機能化された摂動ビーズを提供し、摂動バーコードは、捕捉配列で終了し、捕捉配列は、mRNAの捕捉のためのポリ(T)ヌクレオチド、または他の細胞応答を捕捉するための他の適切な捕捉プローブのセットを含み得、(2)ピコウェルアレイ内の細胞のライブラリを捕捉し、(3)機能化された摂動のライブラリを、同じピコウェル内に捕捉し、ここで、いくつかの実施形態では、単一細胞および単一機能化されたビーズがウェルごとに捕捉され、他の実施形態では、細胞のクラスターがピコウェル内に捕捉され得、(4)任意で、ピコウェルを油媒体で覆い、ウェル間の試薬の相互汚染を防止し、(5)摂動ビーズから化合物を放出し、摂動ビーズから放出された化合物と共に各ウェル内の細胞をインキュベートし、(6)ピコウェルを覆って溶解バッファーを流すことにより、ピコウェル内の細胞を溶解し、(7)摂動バーコードの先端に直接的に、mRNAまたは他の細胞応答を捕捉し、(8)ポリメラーゼまたは逆転写酵素を使用して、細胞応答を摂動バーコードにコピーし、(9)超音波処理によりピコウェルからビーズを放出し、次に、放出されたビーズから伸長された摂動バーコードを切断するか、または単純に、ビーズが依然としてピコウェル内にある間に摂動バーコードをビーズから切断し、(10)切断されたヌクレオチド(伸長された摂動バーコード)を適切なライブラリ調製方法に供し、調製されたヌクレオチドをシーケンシングする。いくつかの実施形態において、シーケンシングされたヌクレオチドは、細胞が供された摂動/化合物を特定する摂動バーコード、および摂動バーコードにより特定された摂動/化合物に供された細胞のmRNA発現に対応する応答区域の2つの区域を含む。
いくつかの実施形態において、細胞応答は、形態学的応答として光学的に測定される。いくつかの実施形態において、細胞応答は、摂動後の測定されたシグナルの差異を研究するために、特定の細胞の特性を標識することにより測定される。いくつかの実施形態において、細胞応答は、細胞内に操作された応答であり、好ましい刺激は、細胞に操作された応答を発現させる。いくつかの実施形態において、操作された応答は、レポーター遺伝子である。いくつかの実施形態において、操作された応答は、蛍光タンパク質の発現である。
いくつかの実施形態において、細胞応答は、細胞のトランスクリプトームを含む。いくつかの実施形態において、転写応答は、細胞のmRNA含有量を捕捉し、mRNA転写物の発現レベルを分析することにより測定される(例えば、Bacher et al.,Genome Biol 17:63,2016、Svensson et al.,Nat Methods 14:381,2017、Miao and Zhang,Quantitative Biol 4:243,2016を参照されたく、それらの開示のすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。いくつかの実施形態において、細胞応答は、細胞内のタンパク質または酵素の発現および/または翻訳後活性化状態を含む。いくつかの実施形態において、細胞応答を捕捉することは、ポリ(T)オリゴヌクレオチドを使用して細胞からポリ(A)mRNAを捕捉することを含む。いくつかの実施形態において、細胞応答は、細胞内のエンハンサRNAの発現レベルを含む(例えば、Rahman et al.,Nucleic Acid Res.45:3017,2017を参照されたく、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。いくつかの実施形態において、細胞応答は、細胞内の新生転写物のレベルを含む。いくつかの実施形態において、新生転写応答は、Global Run-Onシーケンシング(GRO-Seq)により捕捉される(例えば、Gardini,Meth Mol Biol 1468:111-120,2017、およびDanko et al.,Nat Methods 12:433,2015を参照されたく、開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。いくつかの実施形態において、細胞応答は、タンパク質濃度を含み、タンパク質は、DNAタグ付き抗体により特定され、さらに適切なタグがビーズに移行される。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、細胞応答は、イメージング、ゲノム分析、または分子生物学およびシーケンシングにおける任意の他の手段により捕捉され得る。
実施例1.第1のワークフロー
本開示は、以下に「第1のワークフロー」および「第2のワークフロー」として概説される方法を含む方法を提供する。
第1のワークフローは、(1)DELBを生成する、(2)ビーズをピコウェル内へ、(3)アッセイ試薬をピコウェル内へ負荷する、(4)ビーズ結合化合物を放出する、(5)アッセイの読み出しを測定する、(6)アッセイの読み出しをランク付けする、および(7)DELBの新しいセットを生成するステップを含む。
DELBを生成する。第1に、ビーズ(DELB)にDNAコード化ライブラリを作製する。各ビーズは、完全に同じ化合物の集団を含むが、製造された化合物の一部が不完全なカップリングを有する、または偶発的な酸化などの化学的損傷を受けていると、これとは少し異なるものが生じ得る。
ビーズをピコウェル内へ。次に、ビーズをピコウェル内に堆積する。好ましい実施形態において、各ピコウェルは、1つのビーズのみを得る。各ピコウェルは、円形上端、円形下端、固体円形底部、開口上部、および壁を有することができる。壁の底部は、円形上端および円形下端により画定する。好ましい実施形態において、壁は、傾いており、円形上端の直径は、円形下端の直径よりも大きい。このように、壁(単独で表示)は、逆円錐台の切片に類似する。ピコウェルアレイを調整し得るため、ビーズの冗長性が存在する。つまり、ピコウェル内に配置された数千のビーズのうちの2つのビーズが完全に同じ化合物を含むように、アレイを調整できる。冗長性は、例えば、2ビーズ、3ビーズ、4ビーズ、5ビーズ、10ビーズ、20ビーズ、40ビーズ、60ビーズ、80ビーズ、100ビーズなど、または約2、約3、約4、約10、約20、約40、約60、約80、約100、約200、約500、約1,000ビーズなど、または2超、5超、10超、20超、40超、60超、80超、100超、200超、500超、1,000超ビーズなどであり得る。
アッセイ試薬をピコウェル内へ負荷する。各ビーズ結合化合物の生化学的活性を評価するために使用できる試薬を各ピコウェルに導入する。生化学的活性は、結合活性、酵素阻害活性、酵素活性化活性、生哺乳動物細胞の活性(分子標的が即知でない)、生哺乳動物細胞の活性(分子標的が即知である)などの形態をとることができる。試薬は、FRET試薬および酵素の形態をとることができる。FRET試薬は、プロテアーゼ基質を介してクエンチャに連結されたフルオロフォアであり得る。酵素は、そのプロテアーゼの基質であり得、プロテアーゼにより切断可能である。ビーズ結合化合物は、プロテアーゼを阻害する能力について試験されている。
アッセイ材料を負荷した後、各ピコウェルをフィルムによりキャップすることができ、またはピコウェルの多くもしくはすべてを1つのフィルムによりキャップすることができ、またはピコウェルの多くもしくはすべてを、ピンプルを有するフィルムによりキャップすることができ、各ピンプルは、ピコウェルにフィットし、または各ピコウェルは、多孔性球を用いてフィットさせる。実施形態において、球の容積の約5%、容積の約10%、容積の約20%、容積の約30%、または球の体積の約40%が、ピコウェルにフィットする(残りは、表面と同じ高さか、または表面の上に存在する)。実施形態において、ピンプルの約5%、約10%、約20%、約40%、約60%、約80%、約90%、または約100%が、ピコウェルにフィットする。
ビーズ結合化合物を放出する。ビーズ結合化合物の放出をもたらすステップを実行する。実施形態において、ステップは、所定のビーズに付着された化合物の約0.1%、約0.2%、約0.1%、約0.2%、約2%、約5%、約10%、約20%、約40%、約60%、約80%、約99%、または約100%の放出をもたらし得る。放出は、光により、化学試薬により、酵素により、温度の変動により、それらの任意の組み合わせになどによりもたらされ得る。
放出は、(i)単一放出、(ii)複数放出、(iii)連続的放出の形態をとることができる。例えば、複数放出は、紫外光のいくつかの発光の形態をとることができ、各発光は、その光発光の開始時にビーズへの付着を生じるビーズ結合化合物の約10%を切断するのに十分である。例えば、連続的放出は、1時間にわたって連続的に光を発光する形態をとることができ、遊離化合物の濃度が着実な増加をもたらす。この状況では、遊離化合物(切断された化合物)の濃度が着実に増加することは、その化合物の標的を滴定する目的のためであり得る。この種の滴定実験は、所定の化合物の効力を評価するために使用できる。非限定的な例を提供するために、単一放出法では、露光期間の後に、読み出しが行われる次の期間が続き、連続的放出法では、読み出しが行われる期間の一部、ほとんど、またはすべての期間、露光が連続する。
除外的な実施形態において、本開示は、単一放出を使用する、複数放出を使用する、または連続的放出を使用する任意の方法、試薬、組成物、またはシステムを除外することができる。
アッセイの読み出しを測定する。上記で開示された生化学的活性、およびその活性に対する放出された化合物の影響を検出する。この生化学的活性は、酵素活性、レポーター遺伝子の活性、遺伝的活性(例えば、転写または翻訳の速度)、結合活性(例えば、抗原に対する抗体)、細胞活性(例えば、遊走の変化、細胞シグナル伝達経路の変化、形態学の変化)の形態をとることができる。活性は、蛍光、発色活性、発光、光学顕微鏡、TaqMan(登録商標)アッセイ、分子ビーコン、質量分析、ラマン分光法、局在表面プラズモン共鳴(LSPR)、表面プラズモン結合発光(SPCE)、表面増強ラマン散乱(SERS)などにより検出できる。検出は、蛍光検出もしくは光学顕微鏡などの完全に遠隔の方法を用いて、または代替的に、ピコウェルから試料を取得することを伴う方法を用いることができる。一実施形態において、反応物質および生成物の混合物を含む試料は、ピコウェルの1つに部分的に挿入された球状の多孔性スポンジを介して分析のために回収することができる。
アッセイの読み出しをランク付けする。このステップにおいて、複数の異なる化合物(1つの特定のビーズに関連する各種類の化合物)からのアッセイ読み出しは、生化学的活性を活性化、阻害、または何らかの方法で調節する能力に関してランク付けする。
DELBの新しいセットを生成する。上術されるステップは、生化学的活性を示す様々な化合物をユーザーに対して情報を与える。情報は、最大活性を有する1つの化合物の形態をとり得、残りは、約半分の最大活性またはそれ以下を有する。代替的に、情報は、類似の最大活性を有するいくつかの化合物の形態をとり得、他の化合物は、約半分の最大活性またはそれ以下を有する。DELBの新しいセットは、以下のように作製できる。以下の非限定的な戦略のうちの1つ以上に基づいて、DELBの新しいセットを製造するための基盤として、1つ以上の最高ランクの化合物(リード化合物)を使用できる:(i)脂肪族鎖を同族体で置き換える、例えば、プロパノール側鎖をブタノール側鎖で置き換えるなど(ii)脂肪族鎖を異性体で置換する、例えば、プロパノール側鎖をイソプロパノール側鎖で置き換えるなど、(iii)ペプチド結合をペプチド結合の類似体で置き換える、例えば、ペプチダーゼにより加水分解できない結合を用いてなど、(iv)ある種類の荷電基を別の種類の荷電基で置き換える、例えば、リン酸基をホスホン酸、硫酸塩、スルホン酸、またはカルボキシル基で置き換えるなど。
実施例2.第2のワークフロー
代2のワークフローは、キャップで密封されたピコウェルを伴う。キャップは、ピコウェルの直径よりわずかに大きい直径の球の形態をとることができ、この直径は、ピコウェルの上部の縁で測定される(ピコウェルの底部では測定されない)。ピコウェルプレート全体を穏やかな重力遠心に供することにより、キャップをピコウェルの上部にぴったりとフィットさせることができる。第2のワークフローでは、キャップは、リンカーを含むビーズの形態をとり、各リンカーは、化合物に連結される。リンカーは、切断可能なリンカーであり、切断すると化合物が放出され、細胞への拡散が可能になる。この種類のキャップは、「能動的キャップ」と称される。第2のワークフローは、(1)DELBを生成する、(2)アッセイ試薬をピコウェル内へ負荷する、(3)DELBでピコウェルをキャップする、(4)キャップとして機能するビーズからビーズ結合化合物を放出する、(5)アッセイの読み出しを測定する、(6)ビーズ上にあるDNAバーコードの配列を決定する、(7)アッセイの読み出しをランク付けする、および(8)DELBの新しいセットを生成するステップを含む。
実施例3.放出制御
これは、ビーズ結合化合物の放出の制御およびモニタリングに関連する。出願人は、ビーズ結合放出モニターを合成するために以下の手順を考案した。図11および以下のテキストを参照されたい。
図11は、ビーズ結合放出モニターの上記の例示的な実施形態の有機合成におけるステップを記載する。
ステップ1.樹脂を提供する
TentaGel(登録商標)樹脂(M30102、10μm NH2、0.23mmol/g、10mg;MB160230、160μm RAM、0.46mmol/g、2mg)を、チューブ(1.5 mL Eppendorf)に量り入れ、膨潤(400μL、DMA)した。
樹脂をフリットスピンカラム(MoBiCol(登録商標)スピンカラム、Fisher Scientific)に移行し、溶媒を真空でフィルターを通して除去し、ペンダントFmocを脱保護した(DMA内に2%DBUを含む5%ピペラジン、400μL;40°Cで2x10分)。MoBiColスピンカラムは、10マイクロメートルの大きなフリットおよびルアーロックキャップを有する。
樹脂を真空で濾過し、洗浄した(2xDMA、400μL;3xDCM、400μL;1xDMA、400μL)。
ステップ2.樹脂へのリジンリンカーの結合
L-Fmoc-Lys(Mtt)-OH(21μmole、6.6eq.)、DIEA(42μmole、13.3eq.)、COMU(21μmole、6.6eq.)を含む溶液を調整し、DMA(350μL)内で混合し、インキュベートし(1分、室温)、次に、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に加え、ボルテックスし、インキュベートし(15分、40°C)、遊離アミンをアミド化する。樹脂を真空で濾過し、この反応を1回繰り返した。
樹脂を真空で濾過し、洗浄した(2xDMA、400μL;3xDCM、400μL;1xDMA、400μL)。
ステップ3.Fmoc保護基を除去する
ペンダントFmocを脱保護した(DMA内に2%DBUを含む5%ピペラジン、400μL;40°Cで2x10分)。
樹脂を真空で濾過し、洗浄した(2xDMA、400μL;3xDCM、400μL;1xDMA、400μL)。
ステップ4.クエンチャを結合する
QSY7-NHS(4.9μmole、1.55eq.)、Oxyma(9.5eq、3.3eq.)、DIC(21μmole、6.6eq.)、TMP(3.5μmole、1.1eq.)を含む溶液を調整し、DMA(350μL)内で混合し、インキュベートし(1分、室温)、次に、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に加え、ボルテックスし、インキュベートし(14時間、40°C)、遊離アミンをアミド化する。
樹脂を真空で濾過し、洗浄した(2xDMA、400μL;3xDCM、400μL;1xDMA、400μL)。
無水酢酸(80μmole、25.3eq.)、TMP(80μmole、25.3eq.)を含む溶液を調整し、DMA(400μL)内で混合し、次いで、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に加え、ボルテックスし、インキュベートした(20分、室温)。
樹脂を真空で濾過し、洗浄し(2xDMA、400μL;3xDCM)、DCM内でインキュベートし(1時間、室温)、次いで、真空で濾過し、真空チャンバ内で乾燥した(30分、2.5PSI)。
ステップ5.Mtt保護基を除去する
TFA(96μL)、メタノール(16μL)を含む、Mtt脱保護カクテルを調製し、DCM(1488μL)内で混合し、6:1:93%のTFA:メタノール:DCM溶液を得た。
Mtt脱保護カクテルを完全に乾燥した樹脂(400μL)に加え、混合し、真空で濾過することにより溶出し、その後順次に、Mtt脱保護カクテル(4x 400μL)のアリコートを加え、混合し、インキュベートし(5分、室温)、室温で20分の合計インキュベーション時間で溶出した。
樹脂を真空で濾過し、洗浄した(3xDCM、400μL;1xDMA、400μL;2%DIEAを含む1x DMA、400μL;3xDMA、400μL)。
ステップ6.光切断可能なリンカーをリジンのイプシロン-アミノに結合する
Fmoc-PCL-OH(32μmole、10eq.)、Oxyma(32μmole、10eq.)、DIC(50μmole、15.8eq.)、TMP(32μmole、10eq.)を含む溶液を調整し、DMA(400μL)内で混合し、インキュベートし(1分、室温)、次に、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に加え、ボルテックスし、インキュベートし(14時間、40℃)、遊離ε-アミンをアミド化する。
樹脂を真空で濾過し、洗浄した(2xDMA、400μL;3xDCM、400μL;1xDMA、400μL)。
ステップ7.以前に結合された光切断可能なリンカーからFmoc保護基を除去する
ペンダントFmocを脱保護した(DMA内に2%DBUを含む5%ピペラジン、400μL;40°Cで2x10分)。
樹脂を真空で濾過し、洗浄した(2xDMA、400μL;3xDCM、400μL;1xDMA、400μL)。
ステップ8.フルオロフォアを結合する
TAMRA(6μmole、1.9eq.)、TMP(24μmole、7.6eq.)、COMU(16μmole、5eq.)を含む溶液を調整し、DMA(400μL)内で混合し、インキュベートし(1分、室温)、次に、フリットスピンカラム内の乾燥樹脂に加え、ボルテックスし、混合しながらインキュベートし(2時間、40℃、800RPM)、遊離アミンをアミド化する。
樹脂を真空で濾過し、洗浄し(2xDMA、400μL;3xDCM、400μL;2xDMA、400μL;2xDMSO)、DMSO内で混合しながらインキュベートした(16時間、40°C)。
以下は、上記で開示された検査手法のより広範な説明を提供する。
ビーズに付着された二官能性リンカー。二官能性リンカーを溶液中で合成し、アミン官能化ビーズに付着した。図11は、リジンから開始する有機合成の経路を開示する。リジン-BocをTCOリンカーで接続した。リンカーの主要部分は、一端に窒素を伴うポリエチレングリコール(PEG)の形態をとる。Bocは、この連結反応において脱離基であった。使用されたTCAは、実際にはヒドロキシ-TCOのラセミ体であった。このTCO誘導体のヒドロキシル基を、二重結合の片側から4つの炭素原子に位置する炭素原子に接続した(これは、二重結合の他方の側から3つの炭素原子に位置するのと同じである)。図11に示すように、多段階合成における第1の生成物は、Boc-リジン-リンカー-TCOの形態をとった。かつてヒドロキシ-TCOの一部であったヒドロキシル基は、TCO基に依然として付着しており、アミノ化ポリエチレングリコール基とTCO基との間に位置する(図11)。
合成経路の第2のセットは、HClによる処理および光切断可能なリンカー(PCL)の追加を伴う。この第2のステップの生成物は、Boc基が光切断可能なリンカーで置き換えられていることを除いて、第1のステップの生成物と同じである。リジン部分は、第2のステップの生成物において中心的な位置をとる。リジン部分に関して、このリジン部分は、遊離カルボキシル基を有し、手順の第3のステップでは、アミノ化されたビーズは、この遊離ヒドロキシル基に接続され、ビーズ結合試薬が合成され、試薬は、2つの分岐の形態をとり、一方の分岐の末端は、TCOタグであり、他方の分岐の末端は、切断可能な結合を有する芳香環である。化学モノマーを光切断可能なリンカーの遠位端に付着させるには、最初にFmoc基を除去し、ここで、Fmoc基を水素原子に置き換える。
Fmocを除去する。Isidro-Llobetらによれば、「Fmocは、除去中に生成されたジベンゾフルベンを捕捉するのに優れているため、主に第二級アミンにより除去される」(Isidro-Llobet et al(2009)Chem.Rev.109:2455-2504)。代替的に、Fmocは、Pd/BaSO4を用いた触媒水素化分解により、または液体アンモニアおよびモルホリンもしくはピペリジンにより除去できる。
Fmoc基の除去に続いて、化学モノマーを付着する。次に、出願人は、カルボン酸基を有する化学モノマーを縮合させ、その結果、アミド結合を生成した。
実施例4.活性化合物についてのセレブロン系アッセイ
化合物の細胞系アッセイ(セレブロン系アッセイ)から結果。細胞系アッセイのための試薬および方法。出願人は、ATCC(American Type Culture Collection,Manasses,VA)から入手したCCL-2 HeLa細胞を使用した。細胞培地は、HEPESで緩衝されたGibco DMEM高グルコース培地であった。細胞培養の上の大気は、37度のインキュベーターで、5%の二酸化炭素が補充された大気である。細胞培地は、DMEM + 10%ウシ胎児血清に、GlutaMAX(登録商標)(Gibco Thermofisher)を追加、ならびにさらに非必須アミノ酸およびペニシリン+ストレプトマイシン(Gibco Thermofisher,Waltham,MA)を追加したものである。HeLa細胞に、LTR-CTCF-プロモーター-IKZF1(またはIKZF3)-mNeon-P2A-mScar-LTR-CTCFの形態をとる構築物をトランスフェクトした。mScarletは、陽性対照として使用される要素である。mScarletは、「mScarlet」と称される赤い蛍光タンパク質をコードする(Bindels et al(2017)Nature Methods.14:53-56を参照されたい)。プロモーターは、基質の迅速な開始誘導および滴定を可能にするドキシサイクリン可換プロモーターである。P2Aは、2つの他のポリペプチドの間に位置する要素である。P2Aは、翻訳中に2つの別々のポリペプチドを生成するように機能するため、mScarポリペプチドが、IKZF1/緑色蛍光タンパク質(GFP)からなる融合タンパク質のユビキチン化および分解による影響を受けることなく、赤色光を生成する陽性対照として機能できる。mNeonGreenは、ナメクジウオのニシナメクジウオの多量体黄色蛍光タンパク質(Allele Biotechnology,San Diego,CA)に由来する。P2Aは、P2Aタンパク質内のある部位で自己切断を可能にする領域である。より正確には、P2Aペプチドは、リボソームに2AペプチドのC末端でのグリシル-プロリルペプチド結合の合成をスキップさせ、2Aペプチドおよびそのすぐ下流のペプチドの間の切断をもたらす(Kim,Lee,Li,Choi(2011)PLoS ONE.6:e18556(8ページ)。
試験化合物についての細胞系アッセイの有効性を示す。以下は、レナリドマイドおよびレナリドマイドの類似体の形態をとる試験化合物についての細胞系アッセイの使用を示す。図5は、レンチウイルスベクターを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞からの結果を開示し、ベクターは、緑色蛍光タンパク質(GFP)および赤色蛍光タンパク質(mScarlet)を発現した。追加したレナリドマイドの濃度を上げると、緑色蛍光が次第に少なくなり、最高濃度で緑色蛍光が消えた。しかし、レナリドマイドは、実質的に赤色蛍光を減少させなかった。上:IKZF1/GFP融合タンパク質の発現。下:mScarlett対照の発現。レナリドマイドは、0、0.1、1.0、または10マイクロモルで追加された。
図6は、レンチウイルスベクターを用いてトランスフェクトされたHeLa細胞からの結果を開示し、ベクターは、緑色蛍光タンパク質(GFP)および赤色蛍光タンパク質(mScarlet)を発現した。追加したレナリドマイド濃度を上げると、緑色蛍光が次第に少なくなり、最高濃度で緑色蛍光が消えた。しかし、レナリドマイドは、実質的に赤色蛍光を減少させなかった。上:IKZF3/GFP融合タンパク質の発現。下:mScarlett対照の発現。レナリドマイドは、0、0.1、1.0、または10マイクロモルで追加された。
レナリドマイドが、融合タンパク質のタンパク質分解をもたらす経路を要約するには、最初にレナリドマイドをHeLa細胞に追加する。次に、レナリドマイドをこれらの細胞内で自然に生じるセレブロンに結合する。このセレブロンは、E3ユビキチンリガーゼとの複合体で生じる。E3ユビキチンリガーゼは、組換えIKZF1融合タンパク質(または組換えIKZF3融合タンパク質)にユビキチンをタグ付けすることにより、レナリドマイドに応答する。最終的な結果は、ユビキチンタグ付き融合タンパク質が、細胞のプロテアソームで分解されることである。
ピコウェルプレートのコーティング。これは、ピコウェルプレートの上面に適用される溶液について記載するが、必ずしもピコウェルの内部に入り、コートするわけではない。これは、ピコウェルプレートの上面に適用され、ピコウェルに入る溶液、およびピコウェルの底面をコーティングする溶液についても当てはまる。出願人は、乾燥プラスチックにPluronic(登録商標)127(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)の溶液を追加した。その結果、表面は親水性であり、もはや疎水性ではない。その後、表面を水で洗浄した。次に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を追加し、このPBSは、ピコウェルの内部に入る。移動する空気は、真空により適用され、その結果、ピコウェル内の小さな気泡が膨張し、気泡は、PBSに置き換わり、最終結果は、ピコウェルの多くがPBSで満たされることである。次に、PBSをビトロネクチンコーティング溶液(AF-VMB-220)(PeproTech,Rocky Hill,New Jersey)で置き換えた。Pluronics(登録商標)127は、H(OCH2CH2)x(OCH2CHCH3)y(OCH2CH2)ZOHである。ビトロネクチンコーティング溶液を適用した後、37度で30分間インキュベートし、コーティング溶液をピコウェルに入れた。Pluronic 127は、ピコウェルを分離する隆起をコーティングし、ビトロネクチンは、ピコウェルの底部にある。HeLa細胞は、ビトロネクチンに付着し、ビトロネクチンに付着すると、ピコウェルの底部に接着する。
HeLa細胞を、フローサイトメトリーを介して正常にトランスフェクトされた細胞についてスクリーニングした。トランスフェクションの成功を判断するために、2つの基準を同時に使用した。まず、レナリドマイドをフローサイトメトリーによる選別の2日前に細胞培地に追加した。陽性細胞は、赤色陽性および緑色陰性であり、赤色陽性は、細胞にmScarをコードする遺伝子がトランスフェクトされたことを意味し、緑色陰性は、レナリドマイドが、実際に、融合タンパク質IKZF1/mNeon(または融合タンパク質IKZF3/mNeon)のユビキチン化および分解を促進したことを意味する。ドキシサイクリンに関して、レンチウイルスベクター構築物の発現を誘導するために、ドキシサイクリンを3マイクロモルで使用した。ドキシサイクリンによる濃度/誘導曲線は、Go and Ho(2002)J.Gene Medicine.4:258-270)により示される。レンチウイルスベクターを用いてトランスフェクションした後、以下の条件を使用して、成長細胞でのIKZF1の発現を最小限に抑えた。条件は、ドキシサイクリンを培地の外に残すこと、および構築物に「絶縁配列」を使用することである。絶縁配列は、構築物の外側のプロモーターからのリードスルーを防ぐ。絶縁配列が記載されている(Anton et al(2005)Cancer Gene Therapy.12:640-646、Carr et al(2017)PLoS ONE.12:e0176013を参照されたい)。絶縁配列は、構築物の外側にあるプロモーターが、構築物の一部であるオープンリーディングフレーム(ORF)の発現を駆動するのを防ぐ。細胞をピコウェルに入れるために、細胞は、ピコウェルプレートの上面に、[細胞数]/[ピコウェル数]の比率で移行できる。この比率は、例えば、約1細胞/40ウェル、約1細胞/20ウェル、約1細胞/10ウェル、約2細胞/10ウェル、約4細胞/10ウェル、約8細胞/10ウェル、約16細胞/10ウェル、約32細胞/10ウェル、約50細胞/10ウェル、約100細胞/10ウェルなどであり得る。細胞は、ピコウェルの底部をコートするビトロネクチンに付着するとすぐに、ピコウェルでのアッセイに使用できる。
レンチウイルス構築物および細胞培養の詳細。これは、IKZF1/3のレポーター細胞株の構築、ピコウェルでのそれらの培養、およびバルクレナリドマイドでのアッセイに関するものである。レポーター構築物を運搬するプラスミドを、Gibsonアセンブリを使用してパーツから組み立てた(添付の地図を参照されたい)。レポーター構築物を有するレンチウイルス、およびUbC駆動rtTA-M2.2を、LentiX HEK293T細胞(Clontech,Palo Alto,CA)で、第3世代パッケージングシステム(キメラCMVプロモーター、tatタンパク質なし)を使用して作製した。プラスミドは、カルシウム沈殿法によりトランスフェクトした。ウイルス上清を、推奨されるLentiX培地および1%ウシ血清アルブミン(BSA)内で回収し、0.45um低タンパク質結合フィルター(Millipore)で濾過した。宿主HeLa細胞は、標準的な条件で培養されたATCCから入手した。ウイルス上清を、サブコンフルエントなHeLa培養に適用し、24時間後にドキシサイクリンを含むLentiX培地に交換した。クローン選択の2日前に、レナリドマイドを培養物に追加した。クローンを、蛍光活性化細胞選別(FACS)を介して選択し、AlexaFluor 488(陰性)およびCy3チャネル(陽性)の両方でゲーティングした。アッセイの前にレナリドマイドなしでクローンを10日間増殖した。最も安定した発現レベルのクローンを、スクリーニングに使用した。
これは、ビーズで細胞を密封し、多孔性ビーズを通して細胞を溶解する実験を説明している。ピコウェルのパターン化された底部を有する96ウェルプレート(MuWells)を、ウェルの上部を不動態化するために真空を適用せずに、Pluronic F127洗浄剤(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)を用いて処理した。30分間のインキュベーション後、過剰な洗浄剤を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または蒸留H2Oで洗い流す。ウェルをエタノールで洗い流し、気流を伴うバイオセーフティキャビネットで乾燥させた。ウェルを強力な真空下でPBSで完全に湿らせ、PBSをVirtonectinコーティング試薬(Preprotech)と置き換えた。プレートを37℃で30分間インキュベートする。ビトロネクチンコーティング試薬を除去し、レポーター細胞を所望される密度で播種した。細胞播種の瞬間から、アッセイの間中、培地はディッシュに留まる。光切断可能な化合物を運搬するTentaGel(登録商標)ビーズは、ビトロネクチンコーティングの前、または細胞播種後に播種できる。PEGポリマービーズを、ウェル数を超えて過多に培養物の上部に負荷する。
プレートを400rcfで1分間スピンする。365nm LED光源を使用して、適切な時間、ビーズから化合物を光放出する。イメージング(蛍光レポーターの読み出し)までCO2インキュベーターでインキュベートする。
構築物。図20および図21は、関連する構築物を開示する。これらの図の各々は、HeLa細胞ゲノムに組み込まれる配列を開示し、図の各々は、担体配列(レンチウイルスに属する配列)を開示する。レンチウイルスに属する配列は、約1時から約9時までであり、この配列は、2つの長い末端反復(LTR)で囲まれる。約9時から約1時までの配列を、HeLa細胞ゲノムに組み込む。詳細には、最初にプラスミドを、プロデューサー細胞(HEK93T)(Clontech,Palo Alto,CA)にトランスフェクトする。プロデューサー細胞は、レンチウイルスを産生し、その後放出する。その後、放出されたレンチウイルスは、HeLa細胞に感染し、核酸をHeLa細胞ゲノムに組み込む。
光学。現在の細胞培養実験では、出願人は、HBO 100に接続されたEBQ100絶縁水銀ランプ(Carl Zeiss Microscopy,GmbH,Germany)を使用し、Ludl Electronic Productsステージ付きのAxiovert 200-M Carl Zeiss顕微鏡(Ludl Electronic Products,Ltd.,Hawthorne,NY)に接続されていた。出願人らはまた、水銀ランプを備えたフィルターキューブを使用し、フィルターキューブは励起の波長を制御し、発光の検出の波長も制御した。画像は、Basler ACA2440-35UM(Basler AG,22926,Ahrensburg,Germany)で捕捉した。水銀ランプの代替としてハロゲンランプを使用した。マイクロウェルプレート、ピコウェルプレートなどを、プレートホルダーおよびコントローラー付きの「XYステージ」で所定の位置に保持した。光学用のXYステージおよび他の正確な位置決めステージは、Newmark Systems,Inc.,Rancho Santa Margarita,CA、Aerotech,Inc.,Pittsburgh,PA,Physik Instrumente GmBH,76228 Karlsruhe,Germanyから入手可能である。
実施例5.活性化合物についてのMDM2系アッセイ
アミノ基を含むようにガラスを修飾する。シリカ基質は、複数の「官能性シラン」の1つ以上を介して、アミノ基を含むように修飾できる。これらの「官能性シラン」は、3-アミノプロピル-トリエトキシシラン(APTES)、3-アミノプロピル-トリメトキシシラン(APTMS)、N-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピルトリエトキシシラン(AEAPTES)、N-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピルトリメトキシシラン(AEAPTMS)、およびN-(6-アミノヘキシル)アミノメチルトリエトキシシラン(AHAMTES)である。これらの試薬とガラスとの反応は、気相または液相で行うことができる(Zhu,Lerum,Chen(2012)28:416-423を参照されたい)。
化合物の生化学的アッセイの結果(MDM2系アッセイ)。実験方法。以下の試薬をガラススライドに適用した。ガラススライドをアミノ基を有するように修飾した。試薬は、NHS-PEG-mTETであった。NHSは、N-ヒドロキシ-スクシンイミドである。NHSは、活性化エステルの一種である。NHSは、マイクロビーズまたはマイクロアレイスライドの表面活性化などの生体共役反応反応に有益である(Klykov and Weller(2015)Analytical Methods.7:6443-6448)。
PEGは、ポリエチレングリコールである。mTETは、メチルテトラジンである。この試薬をDMSOと混合し、次に、2マイクロリットルの容量をスライドガラスに適用した。混合物は、10マイクロリットルの50mM NHS-PEG-mTETを30マイクロリットルのDMSOと混合することにより作製した。NHS基を、スライドガラスのアミノ基と反応させ、その結果、mTET基をスライドガラスに固定した。mTETの目標は、スライドとビーズとの間に共有結合的な連結を作製することである。
TCOおよびテトラジンは、「クリックケミストリー」反応を媒介できる。これらのクリックケミストリー反応の例は、テトラジンで官能化された抗体を使用して、TCOで官能化されたDNAと結合することである。または、TCOで修飾された抗体を使用して、テトラジン修飾ビーズと結合する(van Buggenum et al(2016)Scientific Reports.6:22675(DOI:10.1038)、Rahim et al(2015)Bioconjug.Chem.18:352-360、Haun et al(2010)Nature Nanotechnol.5:660-665を参照されたい)。
詳細には、スライドガラスを、パラフィルムのシートをスライドの上部に適用することにより調整し、パラフィルムは、中央から切り取られた穴を有し、上記の混合物の液滴を、スライドガラスに対して直接的に穴に適用した。混合物を適用する前に、パラフィルムにおける開口領域(穴)に混合物を適用した後の液体の浸出を防ぐために、パラフィルムとスライドとの間に密着したシールを作製するために、パラフィルムを上に置いたスライドガラスを完全な熱で90秒間加熱した。2マイクロリットルの液滴が、パラフィルムのカットされた穴に位置するスライドガラスを、室温で一晩インキュベートした。インキュベーション中、スライドガラスは、ペトリ皿の内側にあり、ディッシュは、ペトリ皿の上部および側面を覆うカバーガラスで覆われた。一晩のインキュベーションの前に、水が液滴から蒸発するのを防ぐために、正方形のパラフィルムを、液滴を覆っておよびパラフィルム周囲を覆って配置した。
スライド/ビーズ/抗体の複合体を作製するための独創的な方法。出願人の方法は、TCOにより官能化されたビーズを使用した。ビーズのTCO基は、メチルテトラジン官能化スライドのビーズへの共有結合的な付着を媒介した。また、ビーズのTCO基は、メチルテトラジン官能化抗p53抗体のビーズへの共有結合的な付着を媒介した。
驚くべきことに、出願人らは、第1のステップが、スライドおよびビーズを接触させることである場合に、その後の抗体の追加は、抗体のビーズへの共有結合的な付着をもたらさないであろうことを見出した。また、驚くべきことに、出願人は、第1のステップが、ビーズを抗体と接触させることである場合に、その後この混合物をスライドに移しても、ビーズのスライドへの共有結合的な付着をもたらさないであろうことを見出した。好ましい方法において、これらの3つの試薬すべて、スライド、ビーズ、および抗体は、同時に互いの接触をもたらす。別の好ましい実施形態において、ビーズおよび抗体を最初に混合して、ビーズと抗体の共有結合的な連結を開始し、次にすぐに、または数分以内に、この混合物をスライドに適用し、結果は、スライドへのビーズの共有結合的な連結である。
酵素系スクリーニングアッセイの性質。アッセイは、ビーズが付着したスライドガラスの形態をとる。ビーズは、転写因子p53への結合に特異的である付着抗体を含む。この抗体は、ヒトp53およびユビキチン化ヒトp53に結合できる。これまでのところ、アッセイ方法は以下の試薬間のサンドイッチを伴うことを理解できる:
スライド/共有結合的に結合するビーズ/ビーズ結合抗p53 Ab/ユビキチン化p53
このアッセイからの読み出しは、ユビキチン化p53であり、ユビキチン化p53は、ユビキチンに特異的である蛍光抗体により検出される。詳細には、抗体は、ヤギで作製されたポリクローナル抗体であり、抗体は、フルオロフォア(AF488)でタグ付けされている。図8は、AF488の構造を開示する。この蛍光抗体は、ユビキチンに結合する。したがって、ユビキチン化p53が検出された場合、以下のサンドイッチが存在する:
スライド/共有結合的に結合するビーズ/ビーズ結合結合抗p53 Ab/ユビキチン化p53/蛍光Ab
実施例6.ピコウェル内においてDNAをシーケンシングする
ビーズ結合DNAバーコードのシーケンシングを実行し、ビーズは、ピコウェルごとに1つのビーズをピコウェル内に位置した。アッセイ法は、蛍光ヌクレオチドの一過性結合を介した一度に1つずつのビーズ結合DNAバーコード上の各位置を調査することを伴う。各ビーズは、約100アトモルの結合DNAバーコードを含み、結合は、クリックケミストリーによるものであった。この数は、ビーズごとに結合した約6,000万のオリゴヌクレオチドに相当する。DNAバーコード上の各塩基について、アッセイは、同時に4つすべての蛍光dNTPを追加する。いかなる限定を意味することなく、4つの蛍光dNTPは、AF488-dGTP、CY3-dATP、TexasRed-dUTP、およびCY5-dCTPであった。蛍光シグナルを取得し、次にImageJソフトウェア(国立衛生研究所、NIH)により処理し、対応する数値を提供する。データは、ビーズ結合DNAバーコードの一部であった5つの連続したヌクレオチド(すべて連続)のシーケンシングからである。ビーズ結合DNAバーコードは、DNAヘアピン領域を含む。DNAヘアピン領域の塩基は、それ自体にアニールしてヘアピンが形成され、DNAヘアピンの3’末端ヌクレオチドは、シーケンシングプライマーとして機能した。一過性結合によるシーケンシングは、この3’末端で開始した。シーケンシングアッセイを3回、つまり3つの異なるビーズを使用して実施し、1つのDNAバーコード配列を3つのビーズの各々に使用した。換言すると、3つのビーズの各々は、他の2つのビーズにより提供されるものと同一の読み出しをシーケンシングすることを提供することが期待される。
図28は、シーケンシング結果を開示し、シーケンシングは、ビーズ結合DNAバーコード上で行った。示されるのは、第1の塩基、第2の塩基、第3の塩基、第4の塩基、および第5の塩基を調査した結果である。これらの塩基の各々について、別々のヒストグラムバーを介して別々に示されているのは、それぞれAF488-dGTP、CY3-dATP、TexasRed-dUTP、およびCY5-dCTPを用いた調査により生成された蛍光発光である。4つのヒストグラムバーの各々は、AF488-dGTP(黒色の輪郭、灰色の内部)、CY3-dATP(黒色の輪郭、白色の内部)、TexasRed-dUTP(黒色一色のヒストグラムバー)、およびCY5-dCTP(灰色一色のヒストグラムバー)の異なるグラフィックスを有する。水溶液で膨潤させた後、ビーズの直径は、10~14マイクロメートルであった。ピコウェルの容積は、12ピコリットルであった。
調査した鋳型配列は、5’-CTCACATCCCATTTTCGCTTTAGT-3’であった。この特定のシーケンシングアッセイでは、5つの連続した塩基を調査し、最大の蛍光シグナルを与えた蛍光dNTPは、蛍光dGTP、dATP、dGTP、dUTP、およびdGTPであり、dC、dT、dC、dA、およびdCである鋳型上の配列に対応する。したがって、シーケンシング結果は、100%正確であった。結果は、ビーズ結合DNAバーコードをシーケンシングできること、つまり、DNAバーコードが依然としてビーズに結合していることを示す。換言すると、ビーズ結合DNAバーコードは、シーケンシング可能である。
実施例7.細胞のバーコード化
バーコード化の概念についての導入。これは、バーコード化の概念を導入する。一般的なバーコード化技術は、所定の単一細胞のトランスクリプトームをバーコード化することである。図36および図37は、将来のシーケンシングに備えて、トランスクリプトームが捕捉および増幅される手順のステップを示す。図36は、mRNAを放出するための細胞の溶解、その後の逆転写を示す。図37は、固定化されたポリ(dT)を介したmRNAの捕捉、その後の逆転写、および最終的なシーケンシングを示す。シーケンシングは、次世代シーケンシング(NGS)を使用できる。
所定の細胞からのメッセンジャーRNA(mRNA)分子の一部または大部分は、共通のバーコードを用いてタグ付けでき、このタグ付けにより、研究者は、任意の所定のmRNA配列について、所定の細胞に関するそのコード化配列の起源を特定できる。例えば、100の異なる単一細胞からの別々のトランスクリプトームの各々を表す核酸が、一緒に混合され、100の異なる単一細胞の各々からの核酸は、その独自のバーコードを有し、次に、以下の利点が生じるであろう。利点は、すべてのトランスクリプトームからの核酸を1つの試験管で一緒に混合し、次に、次世代シーケンシングに供することができることであり、バーコードにより、ユーザーは同じ細胞からの情報を特定できる。
上記の利点は、以下のように別の方法で記載される。mRNAバーコードを使用する場合、所定の単一の細胞は、その細胞からのmRNA分子の一部または大部分からの情報がcDNAの対応する分子に変換されるように処理され、これらのcDNA分子の各々は、完全に同じDNAバーコードを有する。このバーコード化手順は、10、20、100、数百、または1,000を超える異なる細胞で繰り返すことができ、これらの細胞の各々からのcDNA分子は、固有の細胞特異的なバーコードを有することにより識別される。この方法により、研究者は、すべての細胞からのすべてのバーコード化されたcDNA分子のプールから、すべて1回のシーケンシングでDNAシーケンシングを実行できる(シーケンシング前に、すべてのバーコード化されたcDNA分子が混合される)(Avital,Hashimshony,Yanai(2014)Genome Biology.15:110を参照されたい)。
原形質膜にタグを付けるバーコードと比較した、核酸にタグを付けるバーコード。化学物質のライブラリを調整するためのガイダンスが利用可能であり、各化学物質、または化学物質の各クラスのすべてのメンバーは、固有のDNAバーコードに関連付けられる(Brenner and Lerner(1992)Proc.Nat’l.Acad.Sci.89:5381-5383、Bose,Wan,Carr(2015)Genome Biology.16:120.DOI 10.1186を参照されたい)。上記のバーコード化の例を念頭に置いて、以下は、特定の単一細胞にも適用できる別の種類のバーコード化を提供する。本開示は、細胞の原形質膜に安定して付着されるタグの形態をとる細胞関連バーコード化を提供する。
原形質膜結合に付着する少なくとも2種類のバーコードの選択肢。所与の細胞の原形質膜にタグを付けるために使用されるバーコードは、細胞の種類を特定する第1のバーコード、および細胞に曝露された摂動因子を特定する第2のバーコードを含み得る。例えば、第1のバーコードは、健康なヒト対象、臨床研究番号7からのヒト対象番号38、ヒト原発性結腸直腸がん細胞株、5回継代されたヒト原発性結腸直腸がん細胞株、多発性骨髄腫を有する多発性骨髄腫ヒト対象、多発性骨髄腫を有する未治療ヒト対象番号23、または多発性骨髄腫を有する治療経験のあるヒト対象番号32に由来するものとして細胞を特定できる。
また、バーコードは、その特定の単一細胞に与えられた「摂動因子」を特定できる(バーコードの前または後に与えられる)。「摂動因子」は、抗がん剤、抗がん剤の組み合わせ、組み合わせて生成された化合物、または抗体薬剤および小分子剤の組み合わせであり得る。バーコード化を、所定の単一細胞を追跡するために使用でき、かつその細胞を、1つ以上の細胞シグナル伝達経路による活性化または阻害、遊走の増加または減少、アポトーシス、ネクローシス、1つ以上のCDタンパク質(CD;分化クラスター)の発現の変化、1つ以上のがん遺伝子の発現の変化、1つ以上のマイクロRNA(miRNA)の発現の変化などのその後の挙動と相関させるために使用できる。発現は、転写速度、細胞内の所与のポリペプチドのレベル、所与のタンパク質の位置の細胞質ゾルから膜結合型への変化などに関してであり得る。
膜結合糖タンパク質の細胞表面オリゴ糖のタグ付け。方法および試薬は、DNAバーコードなどのタグを生細胞の原形質膜に接続することが可能である。タグ付けは、膜結合型糖タンパク質のオリゴ糖鎖を攻撃して共有結合的に結合する反応性部分を有するDNAバーコードの共有結合複合体からなる試薬で達成できる。文献では、ヒドラジドビオシチンを使用して、ビオチンを膜結合糖タンパク質上の炭水化物に接続できることが確立されている。本開示は、ビオチンがDNAバーコードで置き換えられている場合を除いて、この試薬を使用する。炭水化物は、アルデヒドを形成するために酸化される必要がある。ヒドラジドは、アルデヒドと反応してヒドラジ連結を形成する。オリゴ糖上のシアル酸成分は、1mMのメタ過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)で簡単に酸化される。酸化ステップ、およびヒドラジド連結ステップを実行する場合、一級アミン基を有するバッファーは避ける必要がある。例えば、「EZ-LinkHydrazide Biocytin.番号28020.ThermoScientific(2016)の指示書(4ページ)、Bayer(1988)Analyt.Biochem.170:271-281、Reisfeld(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.142:519-526、Wollscheid,Bibel,Watts(2009)Nature Biotechnol.27:378-386を参照されたい。
生細胞上の糖タンパク質のオリゴ糖部分にタグ付けする別の方法は、過ヨウ素酸酸化およびアニリン触媒オキシム連結を使用することである。この方法では、シアル酸の穏やかな過ヨウ素酸酸化を使用してから、次に、アニリンの存在下でアミノキシタグと連結する。この方法のバリエーションでは、ガラクトースオキシダーゼを使用して、オリゴ糖の末端ガラクトース残基および末端N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基にアルデヒドを導入できる。ガラクトースオキシダーゼは、炭素6で酸化を触媒して、アルデヒドを生成する。アルデヒドの生成後、アニリン触媒による連結を使用してアミノキシビオチンと結合できる(Ramya,Cravatt,Paulson(2013)Glycobiology.23:211-221を参照されたい)。本開示は、ビオチンをDNAバーコードで置き換え、アミノキシ-DNAバーコードのアニリン触媒による連結を提供する。
細胞表面に結合した抗体により媒介されるタグ付け。本開示は、細胞の原形質膜にバーコードを付着させるための方法および試薬を提供し、付着は、膜結合タンパク質に特異的に結合する抗体により媒介される。抗体は、トランスシクロオクテン(TCO)で共有結合的に修飾でき、この修飾は、4度で一晩インキュベートして実施できる(Devaraj,Haun,Weissleder(2009)Angew.Chem.Intl.48:7013-7016のサポート情報(5ページ)を参照されたい)。抗体のこの共有結合的な修飾は、試薬、トランス-シクロオクテンスクシンイミジルカーボネートを用いて実行できる(Devaraj,Haun,Weissleder(2009)Angew.Chem.Intl.48:7013-7016)。次に、抗体-テトラジン複合体を細胞と接触させて、膜結合抗体を得ることができる。膜結合抗体は、テトラジン部分をそれぞれ有しており、これにより、抗体をDNAバーコード-テトラジン複合体に曝露するなど、クリックケミストリーを介して抗体のタグ付けを可能にする。
テトラジンは、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS)試薬を使用して、抗体の遊離アミノ基に導入できる(van Buggenum,Gerlach,Mulder(2016)Scientific Reports.6:22675を参照されたい)。抗体に1つ以上のテトラジン基が含まれると、TCO-DNAバーコードである試薬を介してDNAバーコードを付加することにより、抗体をさらに修飾できる。この修飾抗体を手に入れれば、抗体は、タグ付け生細胞に使用でき、抗体は、細胞の膜結合タンパク質に結合する。
テトラジン-DNAバーコードの複合体が調整できる。次に、この複合体を細胞培地に導入することができ、培地は、細胞を含み、細胞は、付着された抗体-TCO複合体を有する。テトラジン-DNAバーコードが、膜結合抗体-TCO複合体と接触すると、クリックケミストリー反応をもたらし、細胞は、DNAバーコードでタグ付けされる。このクリックケミストリー反応は、37度で30分間実行できる。
上記の手順における使用に好ましい抗体は、原形質膜の膜結合タンパク質にしっかりと特異的に結合するものであり、膜結合タンパク質は、例えば、細胞膜あたり50,000コピーを超える高い存在量で生じ、膜結合タンパク質は、細胞表面で安定しており、細胞の内部にそれほど再循環せず、膜結合膜は、培養培地内にそれほど脱落しない。
膜結合タンパク質にアジドでタグ付け、続いて、オクチン複合体を用いたクリックケミストリー。アジドは、リポ酸リガーゼ酵素を介して生細胞の膜結合タンパク質上に導入し、その後、DNAバーコードに複合されたフッ素化オクチン化合物を付着できる。フッ素化オクチン化合物のフルオロフォアへの複合が記載される(Jewett and Bertozzi(2010)Chem.Soc.Rev.39:1272-1279、Fernandez-Suarez,Bertozzi,Ting(2007)Nature Biotechnol.25:1483-1487を参照されたい)。繰り返すが、「Tingおよび同僚は、リポ酸リガーゼを使用して哺乳動物細胞表面タンパク質にアジドを導入し、その後、タンパク質をフッ素化シクロオクチン複合化蛍光色素-複合化蛍光色素で標識化できた」(Jewett et al、前述)。
実施例7.ピコウェルを覆うキャップ
キャップ化ピコウェル。各ピコウェルは球でキャップされ、各ピコウェルに1つの球があり、球はピコウェルの穴(上部開口)にフィットする。球をピコウェルプレートに適用するには、球を成長培地に入れて懸濁し、次に、ピコウェルプレートの上面に適用し、球を沈降させる。次に、各ピコウェルの穴に球をしっかりと固定するために、プレート全体を遠心機に入れ、低重力で回転させる。
能動的キャップおよび受動的キャップ図18Aは、ピコウェルの上部に挿入された能動的キャップを示し、図18Bは、ピコウェルの上部に挿入された受動的キャップを示す。好ましくは、キャップは、ピコウェルプレートを作製するために使用される材料よりも柔らかい材料で作製され、その結果、ピコウェルの穴に押し込まれた際にキャップがわずかに変形し、その結果、漏れを防ぎぴったりとフィットする。実施形態において、本開示は、能動的キャップ、受動的キャップ、または能動的キャップおよび受動的キャップの両方のうちの1つ以上を提供する。各キャップは、独立しており、他のキャップのいずれにも接続されていない。代替的な実施形態において、例えば、プレートの上面に置くことが可能なポリマーのシートを介して、より多くのキャップを一緒に接続し得、複数のキャップは、ポリマーのシートの底部から突出しており、突出したキャップは、各ピコウェルにフィットするように一定の間隔である。ピコウェルの床に位置することが可能なビーズの代わりに能動的キャップを使用し得る。能動的キャップは、実質的に同一の化合物の多くの付着されたコピーを含み、各化合物は、能動的キャップ(ここでは球状ビーズの試料において示される)に付着され、切断により、ピコウェル内に存在する溶液への化合物の放出が生じる(図18A)。
受動的キャップに関しては、受動的キャップは、多孔性であり、それはスポンジのように機能する。生化学反応から生成物を吸収するため、ユーザーの目的が、ピコウェル内の培養物である生きている生物細胞に対する所定の化合物の影響を決定することである場合、生成物の収集を容易にする。換言すると、化合物は、細胞を刺激して応答し、応答は、1つ以上の代謝物の発現の増加(または減少)の形態をとり、いくつかの代謝物は、受動的キャップに向かって拡散し、受動的キャップにより吸収される。次に、ユーザーは、受動的キャップを収集し、受動的キャップに吸収されている代謝物を分析できる(図18B)。
キャップのアレイに付着するポリマーマット。図19は、多孔性キャップのアレイの各キャップに接着することが可能なポリマーマットを示す。接着したら、ポリマーマットを剥がして除去し、アレイ内のその各多孔性キャップを共に運ぶことができる。その結果として、多孔性キャップを伴うポリマーマットは、多孔性キャップに関連する代謝物または他の化学物質を測定するアッセイに使用できる。
段階的な例を提供するために、数千のピコウェルのアレイにおける各ウェルは、1つのビーズを含むことができ、各ビーズは、1種類の化合物を含み、化合物は、切断可能なリンカーを介して付着される。ピコウェルは、溶液および培養された細胞も含む。ピコウェルは、多孔性キャップで密封されており、多孔性キャップは、溶液と接触し、培養された細胞から放出された代謝物を捕捉(試料;吸収;吸収)できる。代謝物は、化合物の代謝物であるか、または代謝産物は、サイトカイン、インターロイキン、中間代謝物の生成物、マイクロRNA分子、エキソソームなどの形態をとることができる。最後に、ポリアクリルアミドの溶液をピコウェルプレートを覆って注ぎ、ポリアクリルアミドを何千もの多孔性キャップに浸漬し、次に、キャップの各々およびすべてにしっかりと接着されるマットの形態で固化する。次に、固化したマットを除去し、各キャップを吸収された代謝物について別々に分析する。
好ましい実施形態において、ポリアクリルアミドゲルを使用して、キャップ化ビーズを噛み合わせ層またはマットに架橋する。ポリアクリルアミド溶液の20%溶液を作製するプロトコルは、ピコウェルアレイを覆って注ぎ、キャップ化ビーズを硬化および噛み合わせることができる。4mlの40%ビス-アクリルアミド溶液および2mlの1.5MトリスpH 8.8を、1.8mlの蒸留脱イオン水に追加する。キャップされたピコウェルアレイを覆ってこの混合物を注ぐ直前に、80マイクロリットルのフリーラジカル初期化過硫酸アンモニウム(APS、10%ストック溶液)、および8マイクロリットルのフリーラジカル安定剤N,N,N′,N′-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を追加して、ゲルの架橋を開始する。完全に架橋する前にゲル層を注ぎ、キャップされたピコウェルアレイを覆って完全に架橋させる。完全に架橋されると(操作に十分な硬さ、またはおよそ60分の硬化)、ピンセットを使用してポリアクリルアミド層を剥がすことができる。キャップ化ビーズをピコウェルの上部から持ち上げ、ポリアクリルアミド層に付着していることがわかる。この挙動は、ポリアクリルアミドビーズ、Tentagelビーズ、ポリスチレンビーズ、およびシリカビーズを含む多数のビーズ種で観察できる。
漏れを防止するキャップの有効性を測定する。実施形態において、キャップの有効性は、光切断可能なリンカーを有するビーズを使用することにより決定できる。ピコウェルの画像、または1つの特定のピコウェルアレイ内のいくつかのピコウェルの画像は、ピコウェルをUV光に曝露する直前、およびピコウェルをUV光に曝露した後の時間枠で捕捉できる。例えば、画像は、t=マイナス10秒で、ならびにt=10秒、20秒、40秒、60秒、2分、4分、8分、15分、60分、90分、2時間、3時間、および4時間で捕捉できる。2時間での所定のウェルの蛍光が、t=10秒で見られる蛍光の少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または約100%に等しい場合に、優れた有効性を示すことができ、背景画像のサブトラクションは、t=マイナス10秒で取得した。ピコウェルの外側のピコウェルプレートの領域、例えば、キャップのすぐ近くの画像を撮影することもできる。プレートの表面(ピコウェルの外側)の領域とおよびキャップのすぐ近くの領域の蛍光が、1%未満、0.5%未満、0.1%未満、0.05未満、0.01%未満、0.005%未満、または0.001%未満の場合に、優れた有効性を示すことができる。この比較は、ウェル内の流体の体積に関係なく、かつプレートの上部およびキャップの外側にあるいかなる流体の体積に関係なく行うことができ、ここでは、比較は、光検出器により捕捉された視野全体を単に考慮に入れてもよい。代替的、流体の深さ(ピコウェルの深さ、ピコウェルプレート上部の流体の深さ)を修正して比較を行うこともできる。また、代替的に、比較は、ピコウェルプレートの表面全体にわたる任意の漏出性のフルオロフォアの拡散を考慮に入れてもよい。
バーコードが本開示の試薬および方法にどのようにフィットするのか。以下は、本開示の試薬および方法のさらなる実施形態を提供する。
試薬および能力。微視的ビーズが、提供される。微視的ビーズは、複数の第1のリンカーにより共有結合的に修飾することができ、各々が、モノマーとの固相合成によりカップリングすることが可能であり、固相合成の完了により、化学ライブラリのメンバーが作製される。化学ライブラリのこのメンバーは、ビーズ結合である。同じ微視的ビーズは、第2のリンカーにより共有結合的に修飾され得、各々が、複数のDNAバーコードと結合することが可能である。DNAバーコードのこのメンバーは、ビーズ結合である。
実施例9.現在の開示のDNAバーコード
これは、紙に印刷する、またはコンピュータ言語で保存することのできる、一連の情報に関し、DNA配列と化合物ライブラリメンバーとを関連付ける「DNAバーコード」を提供する。このDNAバーコードは、「レジェンド」または「キー」と称され得る。DNAバーコードは、特定のFDA承認抗がん剤の類似体など、特定のクラスの化合物を特定できる核酸も提供し、またはユーザーの名前を特定する、またはビーズ結合化学ライブラリで試験する特定の疾患を特定できる。
実施例10.レナリドミド類似体
図13、14、および15は、レナリドマイドの3つの異なる誘導体への変換を開示しており、各誘導体は、カルボン酸基を有する。これらのカルボン酸基の各々は、その後、ビーズ-リンカー複合体と縮合するために使用することができる。この状況では、カルボン酸基が、ビーズ-リンカー複合体に縮合され、それは、以前にFmocで占められていた位置に付着する。
第一級アミンから開始し、それをカルボン酸に変換する(図13)。出願人は、第一級アミンを有する化合物をカルボキシル基を有する化合物に変換することにより、化合物のライブラリを生成するアプローチをとる。図13は、レナリドマイドから開始することを開示する。レナリドマイドは、第一級アミンを有する。これに、4-ジメチルアミノピリジン(DMA)およびアセトニトリル(ACN)中の無水コハク酸を追加する。無水コハク酸は、第一級アミノ基と縮合し、カルボン酸基を有するレナリドマイドをもたらす。図における「cat.」という用語は、触媒的であることを意味する。
その後、このカルボン酸基をビーズに連結することができる。したがって、もたらされる複合体は、以下である:BEAD-コハク酸部分-レナリドマイド
図14は、リナリドマイドから開始して、t-ブチル-ブロモ酢酸を追加して、中間体を与えることを開示する。次に、中間体をFmocOSu(o-スクシンイミド)で処理し、レナリドマイドのカルボン酸誘導体である最終生成物を生成する。次いで、カルボン酸部分は、遊離アミノ基、例えば、付着されたFmoc基を有していた遊離アミノ基と縮合することができる。代替的に、カルボン酸は、ビーズ上に存在する化学モノマーの遊離アミノ基と縮合することができ、縮合の結果は、互いに付着された2つの化学モノマーである。
図15は、レナリドマイドを開始物質として開示する。レナリドミドは、3-カルボキシベンズアルデヒドと反応し、アルデヒド基は、アミノ基と縮合し、レナリドイミドのさらに別の種類のカルボン酸誘導体をもたらす。
図16A、図16B、および図16Cは、新規かつ固有のビーズ結合化合物のライブラリを生成するための、出願人のさらに別のアプローチを開示し、化合物は、ビーズから放出され、次いで細胞系アッセイまたは無細胞アッセイでの活性が試験される。3つの化合物の各々は、レナリドマイド類似体であり、第一級アミンは、ベンゼン環の固有の位置にある。
実施例11.結合応答捕捉要素を有するビーズと一緒に細胞を含むピコウェル
本開示は、化合物に対する細胞の応答を評価するための試薬、システム、および方法を提供し、測定される応答は、トランスクリプトームの変化の形態をとる。「トランスクリプトームの変化」とは、いかなる限定も意味せずに、細胞内の各々およびすべての種類の固有のmRNAの量の変化、ならびに細胞内の予め決定された一連のmRNA分子の量の変化を指すことができる。「トランスクリプトームの変化」は、検出下限未満から検出可能になるまでの変化、ならびに検出可能から検出下限未満に低下するまでの変化が含まれ、これらの変化は、ビーズ結合化合物の放出に関連する。
ピコウェルアレイに洗浄剤または界面活性剤を追加することにより、細胞を溶解できる。例えば、洗浄剤を含むバッファーの体積は、その中に何千ものピコウェルを含むマイクロウェルに分注できる。洗浄剤をすべてのピコウェルに拡散させ、細胞内の溶解を引き起こし、mRNAを放出させ、最終的にビーズ結合「捕捉応答要素」により結合することができる。
細胞溶解。細胞は、凍結および解凍の1回以上のサイクルにより溶解できる(Bose,Wan,Carr(2015)Genome Biology.16:120.DOI 10.1186)。細胞はまた、振盪しながらペルフルオロ-1-オクタノールで溶解することもできる(Macosko,Basu,Satija(2015)Cell.161:1202-1214、Ziegenhain(2017)Molecular Cell.65:631-643、Eastburn,Sciambi,Abate(2014)Nucleic Acids Res.42:e128)。また、細胞は、界面活性剤(Tween-20(登録商標))およびプロテアーゼの組み合わせにより溶解できる(Eastburn,Sciambi,Abate(2013)Anal.Chem.85:8016-8021)。細胞の溶解は、mRNAの放出をもたらす。mRNAは、溶解した細胞と同じピコウェルに存在するビーズにより捕捉される。ビーズは、膨大な数のビーズ結合ポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、2つの核酸を含み、第1の核酸は、共通のDNAバーコードを含み、第2の核酸は、「応答捕捉要素」を含む。目的は、細胞内のすべてのmRNAを無差別に捕捉することであり、「応答捕捉要素」は、ポリ(dT)の形態をとることができる。このポリ(dT)は、mRNA分子のポリ(A)テールに結合する。
より多くの細胞溶解条件。細胞溶解は、ナトリウム塩を含む洗浄剤、例えば、15mM NaCl、25mM NaCl、50mM NaCl、75mM NaCl、100mM NaClを含む0.05%Triton X-100、15mM NaCl、25mM NaCl、50mM NaCl、75mM NaCl、100 mMNaClを含む0.1%Triton X-100、15mM NaCl、25mM NaCl、50mM NaCl、75mM NaCl、100mM NaClを含む0.2%Triton X-100、もしくは15mM NaCl、25mM NaCl、50mM NaCl、75mM NaCl、100mM NaClを含む0.5%Triton X-100、またはカリウム塩を含む洗浄剤、例えば、15mM KCl、25mM KCl、50mM KCl、75mM KCl、100mM KClを含む0.05%Triton X-100、15mM KCl、25mM KCl、50mM KCl、75mM KCl、100mM KClを含む0.1%Triton X-100、15mM KCl、25mM KCl、50mM KCl、75mM KCl、100mM KClを含む0.2%Triton X-100、もしくは15mM KCl、25mM KCl、50mM KCl、75mM KCl、100mM KClを含む0.5% Triton X-100への曝露により影響され得る。曝露は、約4度、または室温(23度)で10分間、20分間、40分間、または60分間などで行うことができる。
本開示は、発現プロファイルに対する化合物の影響を評価することができる。ビーズ結合捕捉要素は、目的の1つ以上のmRNA分子に特異的にハイブリダイズできる1つ以上のデオキシリボヌクレオチドの形態をとることができ、1つ以上のmRNA分子は、特定の疾患に関連する。例えば、結腸がんなど、様々な疾患の発現プロファイルが利用できる(Llarena(2009)J.Clin.Oncol.25:155(e22182)、ovarian cancer(Spentzos(2005)J.Clin.Oncol.23:7911-7918)、およびlung adenocarcinoma(Takeuchi(2006)J.Clin.Oncol.11:1679-1688)。同様の例を挙げると、特徴付けされるのは、肝臓に転移している非肝腫瘍細胞に関連するmRNAに対して放出された化合物の影響である(Barshack,Rosenwald,Bronfeld(2008)J.Clin.Oncol.26:15 Suppl.11026、Barshack(2010)Int.J.Biochem.Cell Biol.42:1355-1362を参照されたい)。
トランスクリプトームを捕捉する。それらのポリA基を固定化されたポリ(dT)にハイブリダイズすることによりmRNAを捕捉する方法が利用可能である(Dubiley(1997)Nucleic Acids Res.25:2259-2265、Hamaguchi,Aso,Shimada(1998)ClinicalChem.44:2256-2263、D.S.Hage(2005)Handbook of Affinity Chromatography,2nd ed,CRC Press,549ページを参照されたい)。
溶解された細胞から放出されたmRNA分子を捕捉した後、ビーズ結合ポリヌクレオチドは、mRNAからの逆転写を支持するプライマーとして機能し、ビーズ結合相補的DNA(cDNA)をもたらし、このビーズ結合cDNAは、シーケンシングできる。代替的に、ビーズ結合cDNAは、ビーズから放出させることができ、ビーズ結合「応答捕捉要素」は、光切断可能なリンカーなどの切断可能なリンカーを用いてビーズに結合される。光切断可能なリンカーを使用する場合、ビーズ結合化合物(化学モノマーライブラリから作製された化合物)を放出するための条件を切断するが、ビーズ結合「応答捕捉要素」をさらに切断しない。
細胞が、ビーズ結合化合物またはビーズから放出された化合物に曝露される場合、例えば、化合物への曝露の有無にかかわらずトランスクリプトームの変化を特徴付けることにより、細胞を遺伝的応答についてスクリーニングすることができる。また、表現型応答、例えばアポトーシス、1つ以上の細胞シグナル伝達タンパク質の活性の変化、または1つ以上のCDタンパク質の細胞表面発現の変化について細胞をスクリーニングすることができる。CDは、分化クラスターである(Lal(2009)Mol.Cell Proteomics.8:799-804、Belov(2001)Cancer Res.61:4483-4489、IUIS/WHO Subcommittee on CD Nomenclature(1994)Bull.World Health Org.72:807-808、IUIS-WHO Nobenclature Subcommittee(1984)Bull.World Health Org.62:809-811を参照されたい)。いくつかの表現型応答アッセイでは、細胞を溶解してはいけない。
本開示は、例えば、単一細胞をピコウェル内で曝露が生じる1つの種類の薬物に曝露することにより、異なる薬物を異なる細胞に分配するという満たされていない必要性に対処する。
本開示はまた、バーコード化されたmRNAを調製する必要性を排除し、mRNAは、細胞から放出され、続いてcDNAを調製する(この種類のバーコードでは、トランスクリプトームが、対応するcDNAのライブラリにカバーされると、所定の細胞からのすべてのmRNAが、同じバーコードを受け取る)。
摂動因子を伴う細胞インキュベーション中のパラメータ。任意の所定の化合物またはいくつかの他の種類の摂動因子について、光、温度、細胞培地のpH、音、濃度、および試薬への曝露時間(試薬は、ビーズから放出された化合物、酵素基質、サイトカイン、既に確立された薬物である化合物、塩であり得る)、機械的攪拌、細胞表面タンパク質に対する抗体などを変動または制御できるパラメータである。
細胞をバーコード化する。細胞は、ビーズ結合化合物と、またはビーズ結合切断可能なリンカーからの切断後の化合物とインキュベートすることができる。インキュベーション中または後に、細胞は、摂動因子を特定する膜結合バーコードを用いてバーコード化できる。この膜結合バーコードは、細胞膜のオリゴ糖、細胞膜のポリペプチド、または細胞膜のリン脂質に結合することができる。
ポリ(dT)以外の応答捕捉要素。メッセンジャーRNAは、5プライムの7メチルグアノシンキャップを介して捕捉できる。この方法は、ポリAテールが短い場合に特に有益である(Blower,Jambhekar(2013)PLOS One.8:e77700を参照されたい)。また、mRNAは、mRNAのコード化領域に特異的な固定化されたDNAを使用して捕捉できる。この方法は、「RNAエクソーム捕捉」と称され、この名前のバリエーションである。Cieslikらによれば、「トランスクリプトミクスを捕捉するために固有なのは、エクソン標的化RNAプローブを使用した一晩の捕捉反応(RNA-DNAハイブリダイゼーション)である」(Cieslik(2015)Genome Res.25:1372-1381)。
マイクロRNA(miRNA)。本開示は、所定の細胞内のmiRNAの発現プロファイル、または代替的に、所定の種のmiRNAにより特異的に結合されるmRNAの集団の発現プロファイルに対する、放出されたビーズ結合化合物の影響を評価することができる(Jain,Ghosh,Barh(2015)Scientific Reports.5:12832)。例えば、本開示は、(1)ビーズ結合化合物、(2)ビーズ結合DNAバーコード、および(3)ビーズ結合応答捕捉要素を含むビーズを提供し、応答捕捉要素は、miRNAを捕捉するか、または応答捕捉要素が、miRNAの種(応答捕捉要素の一部として)を含むかのいずれかである。マイクロRNAの発現プロファイルは、様々な種類のがん、例えば、乳がん、乳がんで見出されている(Tanja(2009)J.Clin.Oncol.27:15 Suppl.538)。
トランスクリプトーム全体からmRNAの選択された集団を捕捉する方法が利用可能である。選択性は、miR-34aなどの1種類のマイクロRNAを「プルダウン」アッセイの架橋化合物として使用することにより付与できる。簡単に言えば、「miR-34aでプルダウンされた転写産物は、成長因子のシグナル伝達および細胞周期の進行におけるその役割について豊富である」(Lal,Thomas,Lieberman(2011)PLOS Genetics.7:e1002363)。捕獲されるmRNA分子は、miR-34Aに結合するものである。
mRNAを捕捉し、発現レベルを分析するためのさらなる方法が、利用可能である(Bacher(2016)Genome Biology.17:63、Svensson(2017)Nature Methods.14:381、Miao and Zhang(2016)Quantitative Biol.4:243、Gardini(2017)Nature Methods.12:443)。エンハンサーRNAにおいて変化の形態をとる細胞応答を測定できる(Rahman(2017)Nucleic Acid Res.45:3017を参照されたい)。
本発明は、本開示の組成物、試薬、方法、システム、診断、実験室データなどにより限定されるべきではない。また、本発明は、本明細書に開示される、あらゆる好ましい実施形態により限定されるべきではない。