TW202340479A - Ｄｎａ編碼化資料庫之評價方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供將在DNA鏈中包含能夠切割之部位之DNA編碼化資料庫(DEL)衍生成交聯劑修飾雙股DEL並進行評價之方法。 本發明係藉由在DNA鏈中導入諸如去氧尿苷之能夠切割之部位，而兼顧髮夾鏈DEL與雙股DEL的優點。再者，本發明係藉由簡便地衍生成交聯劑修飾DEL，而提供兼具「簡便的DEL合成手法」與「DEL評價手法的擴展/改善」之化合物篩選技術。

Description

ＤＮＡ編碼化資料庫之評價方法
本發明係關於DNA編碼化資料庫之評價方法。
所謂化合物資料庫，係醫藥品候補化合物等系統性地收集有可能具有特定的活性之化合物而得之化合物衍生物群組。此化合物資料庫在多數情況係基於組合化學合成技術及方法論所合成。所謂組合化學，係用於以系統性的合成路徑有效率地多品種合成出基於組合論所列舉並設計之一連串的化合物資料庫之實驗手法及與其相關之研究領域。 作為基於組合化學之化合物資料庫之一種，有DNA編碼化資料庫。以下，將DNA編碼化資料庫適宜略記為DEL。在DEL中，係對經資料庫化之各化合物附加DNA的標籤。DNA的標籤係以可鑑定各化合物的各結構之方式設計序列，作為化合物的標識而發揮機能(專利文獻1至3)。
迄今為止，藉由使用DEL之篩選，已發現複數種在醫藥品開發中有力的化合物。使用DEL之篩選係例如依以下方式實施(非專利文獻1至3)。 1)將標的蛋白質固定化於固定化用擔體 2)使標的與DEL進行接觸 3)將與標的之親和性較低的DEL洗淨除去 4)使標的蛋白質發生變性，使親和性較高的DEL溶出 5)將所溶出之DEL中所包含之DNA序列進行增幅，特定出序列 然而，如上述之篩選手法有數個課題。首先，由於必須將成為標的之蛋白質加以固定化，因而取決於蛋白質，在固定化操作後，立體結構會發生變化。在該種情況，藉由篩選所獲得之化合物不會結合至目標的未經固定化之標的蛋白，DEL的標的適應範圍變得受到限制(專利文獻4及5、非專利文獻4及5)。此外，在上述篩選手法中，雖然可回收親和性較高的結合劑，但中程度親和性的結合劑(例如Kd值為μM等級者)係與標的蛋白質之複合體的動力學安定性較低，在洗淨除去後難以回收。熟習該項技術者周知，此種中程度親和性的結合劑亦有用於作為成為創造藥物的起點之命中化合物(hit compound)，此外，亦有益於作為結構活性相關情報(非專利文獻6)。
作為解決上述課題之努力，最近已報導複數種使用經交聯劑修飾之DEL之篩選手法。如後所示，已報導數種不同的手法，但所有手法的共通點為使已接近有親和性之資料庫分子之標的與交聯劑進行反應，形成共價鍵。根據此手法，即便在未將標的蛋白加以固定化之情形下(或在固定化前)，亦能夠進行DEL的篩選，因而有用(專利文獻4及5、非專利文獻4及5、7至9)。
關於DEL的DNA鏈結構，在此處一次進行說明。以往所知之DEL的DNA鏈結構係以髮夾鏈及雙股2種為代表。 以下，針對雙股DEL及髮夾鏈DEL的概要及優缺點進行概述。 (1)髮夾鏈DEL 採用髮夾鏈DNA之DEL為互補的2條DNA鏈連接而得之單股結構，其係使用具有用於導入多種建構組元之官能基之髮夾型DNA作為起始原料(頭段(headpiece))予以合成(專利文獻3、非專利文獻1及2)。 (A)優點 (a)可使用較短的DNA標籤。 在本手法中，在多數情況係使用具有2mer的黏著末端之9~13mer左右的比較短的雙股DNA標籤，雙股DNA標籤係藉由經由DNA連接酶之接合反應導入。此種較短的DNA標籤的使用係由於髮夾鏈DNA在分子內形成較強的雙鏈，黏著末端以外之DNA部位不會干擾DNA標籤而變得可能。較短的雙股DNA標籤的使用在DEL合成中具有數個好處。作為一項好處，可列舉在DNA標籤的合成上所花費之成本較低。此外，作為另一項好處，可列舉更短的DNA標籤的使用在編碼相同的反應循環數之情況，DEL的全長可壓制得較短。即，將DEL的全長壓制至即便編碼更多的循環數，亦能夠藉由次世代定序儀有效率地讀取DNA序列之範圍中。實際上，在非專利文獻3中，係藉由採用髮夾鏈DNA，而達成採用編碼多達6個循環的反應之髮夾鏈DNA之DEL的構築。 (b)化學安定性較高 與雙股不同，在髮夾鏈中，即便在加熱反應中雙鏈結構融解，亦在隨後之再黏合條件下，在未發生鏈交換之情形下，在原本的分子內之雙鏈會再形成。從而，採用髮夾鏈DNA之DEL具有能夠在更廣泛的化學條件下使用之好處(非專利文獻2)。此外，一般而言，核酸鏈只要是相同的鏈長，則髮夾鏈會形成相較於雙股而言更強的雙鏈(Tm值較高)。從而，在導入建構組元時之多種化學條件下，髮夾鏈DNA的各化學結構，特定而言，鹼基部的結構，應該比起雙股更抵抗結構轉換。 (B)缺點 髮夾鏈DNA在分子內形成雙鏈，難以重新與另一寡核苷酸鏈形成雙股。從而，難以藉由重新賦予經交聯劑修飾之寡核苷酸而轉換成交聯劑修飾雙股DEL。 (2)雙股DEL 採用雙股DNA之DEL係以具有用於導入多種建構組元之官能基之單股DNA(非為髮夾鏈之單股DNA)或雙股DNA作為起始原料(頭段)予以合成。 (A)缺點 與採用髮夾鏈DNA之DEL相對照，在多數情況係使用具有4~10mer的黏著末端之20~30mer左右的比較長的單股或雙股DNA標籤(專利文獻2、非專利文獻10)，一般是編碼3個循環左右的反應之DEL。 (B)優點 雙股DNA能夠藉由變性而使其成為單股DNA，或者實施鏈交換反應，可轉換成適合各式各樣的用途之DNA結構，此方面實屬有利。從而，能夠藉由重新賦予經交聯劑修飾之單股寡核苷酸而轉換成交聯劑修飾雙股DEL(非專利文獻7、8及11)。
如此，雖然髮夾鏈DNA及雙股DNA分別在DEL的合成時、評價時具有優點，但兼顧優點之技術卻仍未知。
作為關於使用經交聯劑修飾之DEL之篩選之報導例，已知下列者。
在非專利文獻7及8中，係合成在5’末端具有資料庫分子之單股DEL，使其與在3’末端具有光反應性交聯劑之DNA形成雙股，實施篩選，取得中程度親和性的結合劑。在另一方面，在本手法中，與光反應性交聯劑進行連結之DNA不包含編碼序列，因而若為了除去非特異性結合劑等而暴露於較強的分離或溶出條件，則雙股會分開，會有無法獲得編碼出期望的結構之序列之可能性。此外，由於使用單股DEL，因而成為無法在合成中活用髮夾鏈DEL的優點之手法。
Xiaoyu Li等人已報導利用交聯劑修飾DEL之篩選手法(專利文獻5、非專利文獻4、5及12)。在非專利文獻5中，係藉由合成在3’末端具有資料庫分子之單股DEL，使其與在5’末端具有光反應性交聯劑之短鏈DNA形成雙股，而製成光反應性交聯劑修飾DEL。作為本手法的好處，可列舉由於光反應性交聯劑存在於5’末端，因而藉由經由DNA聚合酶之伸長反應，而使編碼序列與標的藉由共價鍵進行連結。從而，在篩選中能夠包含較強的分離或溶出條件。然而，簡便地合成在3’末端具有資料庫分子之單股DEL之手法尚未被報導。此外，同樣地，成為無法在合成中活用髮夾鏈DEL的優點之手法。
專利文獻4已記載具有與交聯劑之連結部位之髮夾鏈DEL。本手法雖然解決如上述非專利文獻5之課題，但具有另一課題：需要在不損及用於交聯劑連結之官能基之情形下實施資料庫合成，能夠使用之反應及/或資料庫分子結構受到限制。
在專利文獻6中，已記載關於經可逆的共價鍵交聯而得之雙股DEL(就雙鏈形成能力等觀點而言，被認為具有與髮夾鏈DEL同等的特性)的合成，以及向經交聯劑修飾之DEL之轉換。作為可逆的共價鍵，已揭示經由氰基乙烯基咔唑等特殊鹼基與嘧啶鹼基之[2+2]光環化之共價鍵。然而，已知經光環化之嘧啶鹼基會失去芳香族性，此種喪失芳香族性之嘧啶鹼基在化學上不安定，在鹼性條件下會進行分解(非專利文獻13)。從而，在本手法中，在DEL合成時，能夠使用之反應受到限制，能夠構築之資料庫分子結構亦受到限制。
如此，與以往的髮夾鏈DEL同水準，具有在合成面之優點，且能夠簡便地適應藉由經交聯劑修飾之DEL之篩選之技術仍未知。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第93/20243號 [專利文獻2]國際公開第2004/039825號 [專利文獻3]國際公開第2005/058479號 [專利文獻4]國際公開第2019/149198號 [專利文獻5]國際公開第2019/157692號 [專利文獻6]CN112760720 [非專利文獻]
[非專利文獻1]Nature Chemical Biology，2009年，第5卷，第647-654頁 [非專利文獻2]A Handbook for DNA-Encoded Chemistry, Robert A. Goodnow，Jr.編，John Wiley & Sons, Inc. [非專利文獻3]Progress in Medicinal Chemistry，2020年，第59卷，第181-249頁，章節4-An overview of DNA-encoded libraries: A versatile tool for drug discovery [非專利文獻4]Angevante Chemie International Edition，2014年，第53卷，第10056-10059頁 [非專利文獻5]ACS Combinatorial Science，2019年，第21卷，第345-349頁 [非專利文獻6]Chem Biochem，2019年，第20卷，第955-962頁 [非專利文獻7]ACS Combinatorial Science，2020年，第22卷，第204-212頁 [非專利文獻8]Chemistry: A European Journal，2021年，第27卷，第7160-7167頁 [非專利文獻9]Accounts of Chemical Research，2021年，第54卷，第3491-3503頁 [非專利文獻10]Nature Chemistry，2018年，第10卷，第441-448頁 [非專利文獻11]Annual Review of Biochemistry，2018年，第87卷，第479-502頁 [非專利文獻12]Bioconjugate Chemistry，2017年，第28卷，第2293-2301頁 [非專利文獻13]美國化學會誌，2014年，第136卷，第12938-12946頁
[發明所欲解決之課題]
本發明係提供將在DNA鏈中包含能夠切割之部位之DEL衍生成交聯劑修飾雙股DEL並進行評價之方法。 [解決課題之手段]
作為DNA等核酸化學之一，有核酸的切割技術。例如，若在DNA鏈中導入去氧尿苷，則可藉由USER(註冊商標)酵素選擇性地切割。 本發明者致力研究之結果，發現藉由例如在DNA鏈中導入諸如去氧尿苷之能夠切割之部位，便可兼顧髮夾鏈DNA與雙股DNA的優點，再者，藉由簡便地衍生成交聯劑修飾DEL，而解決上述課題。 從而，本發明係如下。
[1]一種衍生自具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DNA編碼化資料庫(DEL)之交聯劑修飾雙股DEL之評價方法，其係由以下步驟所構成： (1)使該DEL與生物學標的在適於該DEL的至少1個資料庫分子與生物學標的進行結合之條件下進行接觸， (2)使已與生物學標的進行結合之資料庫分子的交聯劑與生物學標的進行交聯， (3)從未進行交聯之資料庫分子中分離出經交聯之資料庫分子與生物學標的之複合體， (4)鑑定所回收而得之複合體中之資料庫分子所具有之寡核苷酸的序列， (5)使用(4)中所決定之序列，鑑定與生物學標的進行結合之1種以上化合物的結構。 [2]如[1]所記載之方法，其中，前述交聯劑修飾雙股DEL的交聯劑係與具有編碼序列之寡核苷酸經由共價鍵進行連結。 [3]如[1]或[2]所記載之方法，其中，前述交聯劑修飾雙股DEL的交聯劑係直接結合至寡核苷酸的5’末端，或者經由2官能性間隔子進行結合。 [4]如[1]~[3]中任一項所記載之方法，其中，衍生成交聯劑修飾雙股DEL包含以下步驟： (i)切割具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL的至少一個「能夠選擇性地切割之部位」，轉換成雙股DEL； (ii)除去(i)所獲得之雙股DEL中，資料庫分子未結合之寡核苷酸，轉換成單股DEL； (iii)藉由使(ii)所獲得之單股DEL與交聯劑修飾DNA進行雙股形成，而衍生成交聯劑修飾雙股DEL。 [5]如[1]~[3]中任一項所記載之方法，其中，衍生成交聯劑修飾雙股DEL包含以下步驟： (i)切割具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL的至少一個「能夠選擇性地切割之部位」，轉換成雙股DEL； (ii)除去(i)所獲得之雙股DEL中，資料庫分子未結合之寡核苷酸，轉換成單股DEL； (iii)使(ii)所獲得之單股DEL與具有用於交聯劑修飾之反應基之DNA進行雙股形成； (iv)藉由使用於交聯劑修飾之反應基與交聯劑單元進行反應，而衍生成交聯劑修飾雙股DEL。 [6]如[1]~[3]中任一項所記載之方法，其中，衍生成交聯劑修飾雙股DEL包含以下步驟： (i)切割具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL的至少一個「能夠選擇性地切割之部位」，轉換成雙股DEL； (ii)除去(i)所獲得之雙股DEL中，資料庫分子未結合之寡核苷酸，轉換成單股DEL； (iii)對(ii)所獲得之單股DEL賦予交聯劑修飾引子，使所賦予之引子伸長，衍生成交聯劑修飾雙股DEL。 [7]如[1]~[3]中任一項所記載之方法，其中，衍生成交聯劑修飾雙股DEL包含以下步驟： (i)切割具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL的至少一個「能夠選擇性地切割之部位」，轉換成雙股DEL； (ii)除去(i)所獲得之雙股DEL中，資料庫分子未結合之寡核苷酸，轉換成單股DEL； (iii)對(ii)所獲得之單股DEL賦予具有用於交聯劑修飾之反應基之修飾引子，使所賦予之引子伸長，衍生成具有用於交聯劑修飾之反應基之雙股DEL； (iv)藉由使用於交聯劑修飾之反應基與交聯劑單元進行反應，而衍生成交聯劑修飾雙股DEL。 [8]如[1]~[3]中任一項所記載之方法，其中，衍生成交聯劑修飾雙股DEL包含以下步驟： (i)切割具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL的至少一個「能夠選擇性地切割之部位」，轉換成雙股DEL； (ii)對(i)所獲得之雙股DEL賦予交聯劑修飾引子，使所賦予之引子伸長，衍生成交聯劑修飾雙股DEL。 [9]如[1]~[3]中任一項所記載之方法，其中，衍生成交聯劑修飾雙股DEL包含以下步驟： (i)切割具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL的至少一個「能夠選擇性地切割之部位」，轉換成雙股DEL； (ii)對(i)所獲得之雙股DEL賦予具有用於交聯劑修飾之反應基之修飾引子，使所賦予之引子伸長，藉由使用於交聯劑修飾之反應基與交聯劑單元進行反應，而衍生成交聯劑修飾雙股DEL。 [10]如[6]或[8]所記載之方法，其係以下列者為特徵： (I)使用至少一個「能夠選擇性地切割之部位」存在於從資料庫分子所結合之部位起3’方向之髮夾型DEL； (II)使用交聯劑直接結合至寡核苷酸的5’末端，或者經由2官能性間隔子進行結合之交聯劑修飾引子。 [11]如[7]或[9]所記載之方法，其係以下列者為特徵： (I)使用至少一個「能夠選擇性地切割之部位」存在於從資料庫分子所結合之部位起3’方向之髮夾型DEL； (II)使用用於交聯劑修飾之反應基直接結合至寡核苷酸的5’末端，或者經由2官能性間隔子進行結合之具有用於交聯劑修飾之反應基之修飾引子。 [12]如[4]~[7]中任一項所記載之方法，其中，在前述(ii)的步驟中，資料庫分子未結合之寡核苷酸具有機能性分子，且其係藉由因應於該機能性分子的機能之處理而被除去。 [13]如[12]所記載之方法，其中，機能性分子為生物素。 [14]如[4]~[7]中任一項所記載之方法，其中，在前述(ii)的步驟中，資料庫分子未結合之寡核苷酸的除去為核酸外切酶所引發之分解。 [15]如[14]所記載之方法，其中，核酸外切酶為λ核酸外切酶。 [16]如[1]~[15]中任一項所記載之方法，其中，交聯劑包含至少一個疊氮基、二氮雜環丙烯基、磺醯氟基、重氮基、桂皮醯基或丙烯酸酯。 [17]如[1]~[15]中任一項所記載之方法，其中，交聯劑包含至少一個疊氮基、二氮雜環丙烯基或磺醯氟基。 [18]如[1]~[15]中任一項所記載之方法，其中，交聯劑包含式(AA)~(AE)中之任一結構： (式中，＊係意味與雙股DEL的5’末端或與該5’末端進行結合之2官能性間隔子側之結合位置)。 [19]如[1]~[15]中任一項所記載之方法，其中，交聯劑為式(AA)~(AE)中之任一結構： (式中，＊係意味與雙股DEL的5’末端或與該5’末端進行結合之2官能性間隔子側之結合位置)。 [20]如[1]~[15]中任一項所記載之方法，其中，交聯劑包含式(BA)或(BB)中之任一結構： (式中，＊係意味與雙股DEL的5’末端或與該5’末端進行結合之2官能性間隔子側之結合位置)。 [21]如[1]~[15]中任一項所記載之方法，其中，交聯劑為式(BA)或(BB)中之任一結構： (式中，＊係意味與雙股DEL的5’末端或與該5’末端進行結合之2官能性間隔子側之結合位置)。 [22]如[5]、[7]、[9]或[11]中任一項所記載之方法，其中，用於交聯劑修飾之反應基為用於點擊反應之反應基。 [23]如[5]、[7]、[9]或[11]所記載之方法，其中，用於交聯劑修飾之反應基為炔基、烯基、疊氮基或四嗪基。 [24]如[5]、[7]、[9]或[11]所記載之方法，其中，用於交聯劑修飾之反應基為式(CA)~(CL)中之任一結構： (式中，＊係意味與雙股DEL的5’末端或與5’末端進行結合之2官能性間隔子側之結合位置)。 [25]如，[1]~[19]中任一項所記載之方法，其中，(2)的「使已與生物學標的進行結合之資料庫分子的交聯劑與生物學標的進行交聯」步驟為「藉由光照射使已與生物學標的進行結合之資料庫分子的交聯劑與生物學標的進行交聯」步驟。 [26]如[25]所記載之方法，其中，光照射的條件為波長250~500nm的光照射。 [27]如[25]所記載之方法，其中，光照射的條件為波長365nm的光照射。 [28]如[25]~[27]中任一項所記載之方法，其中，光照射的條件為10秒~180分鐘的光照射。 [29]如[25]~[27]中任一項所記載之方法，其中，光照射的條件為30秒~30分鐘的光照射。 [30]如[1]~[24]中任一項所記載之方法，其中，(2)的「使已與生物學標的進行結合之資料庫分子的交聯劑與生物學標的進行交聯」步驟為「藉由保溫培養使已與生物學標的進行結合之資料庫分子的交聯劑與生物學標的進行交聯」步驟。 [31]如[1]~[30]中任一項所記載之方法，其中，(3)的「從未進行交聯之資料庫分子中分離出經交聯之資料庫分子與生物學標的之複合體」步驟為「藉由電泳從未進行交聯之資料庫分子中分離出經交聯之資料庫分子與生物學標的之複合體」步驟。 [32]如[31]所記載之方法，其中，電泳為凝膠電泳。 [33]如[31]所記載之方法，其中，電泳為毛細管電泳。 [34]如[1]~[30]中任一項所記載之方法，其中，(3)的「從未進行交聯之資料庫分子中分離出經交聯之資料庫分子與生物學標的之複合體」步驟為「藉由將生物學標的固定化至固定化用擔體及洗淨除去未進行交聯之資料庫分子而分離出經交聯之資料庫分子與生物學標的之複合體」。 [35]如[1]~[34]中任一項所記載之方法，其中，具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL為式(I)所示之化合物： (式中， X及Y為寡核苷酸鏈， E及F各自獨立地為由核苷酸或核酸類似物所構成之寡聚物， 惟，E及F包含彼此互補的鹼基序列，形成雙鏈寡核苷酸， LP為環部位， L為連結子， D為源自反應性官能基之2價基， Sp為鍵結或2官能性間隔子， An為由至少1個建構組元所構成之部分結構)， 其中， X與Y具有至少一部分可形成雙鏈之序列， X以5’末端結合至E， Y以3’末端結合至F， 在E、F或LP中之至少任1個部位，具有至少1個能夠選擇性地切割之部位)。 [36]如[35]所記載之方法，其中，具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL為式(III)所示之DEL： An-Sp-C-Bn   (III) (式中， An及Sp表示與[35]相同的意義， Bn表示由寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y所形成之雙股寡核苷酸標籤， C為式(I)： (式中，E、LP、L、D及F表示與[35]相同的意義，惟，D係與An直接結合，或者經由2官能性間隔子進行結合，E及F結合至雙股寡核苷酸標籤Bn的各對應末端側))。 [37]如[35]或[36]所記載之方法，其中，An係與[35]相同，且為由n個建構組元α1~αn(n為1~10的整數)所構築之部分結構， Bn為由寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y所形成之雙股寡核苷酸標籤，且為包含含可鑑定An的結構之鹼基序列之寡核苷酸之部分結構。 [38]如[35]~[37]中任一項所記載之方法，其中，LP為(LP1)p-LS-(LP2)q所示之環部位， LS為從以下(A)至(C)所記載之化合物群組中選出之部分結構： (A)核苷酸， (B)核酸類似物， (C)可具有取代基之C1~14的3價基； LP1為從以下(1)及(2)所記載之化合物群組中單獨地或不同地選出p個之各部分結構： (1)核苷酸， (2)核酸類似物； LP2為從以下(1)及(2)所記載之化合物群組中單獨地或不同地選出q個之各部分結構： (1)核苷酸， (2)核酸類似物； p及q的總數為0~40。 [39]如[38]所記載之方法，其中，p及q的總數為2~20。 [40]如[38]所記載之方法，其中，p及q的總數為2~10。 [41]如[38]所記載之方法，其中，p及q的總數為2~7。 [42]如[38]所記載之方法，其中，p及q的總數為0。 [43]如[38]~[42]中任一項所記載之方法，其中，LP1、LP2及LS各自為從以下結構中單獨地或不同地選出之結構： (A)核苷酸，或 (B)以下列(B11)至(B15)為要件之核酸類似物： (B11)具有磷酸(或相當部位)及羥基(或其相當部位)， (B12)由碳、氫、氧、氮、磷或硫所構成， (B13)分子量為142至1500， (B14)殘基間原子數為3~30， (B15)殘基間之原子的結合樣式全部皆為單鍵，或者包含1至2個雙鍵且其餘為單鍵。 [44]如[38]~[43]中任一項所記載之方法，其中，LP1、LP2及LS各自為從以下結構中單獨地或不同地選出之結構： (A)核苷酸，或 (B)以下列(B21)至(B25)為要件之核酸類似物： (B21)具有磷酸及羥基， (B22)由碳、氫、氧、氮或磷所構成， (B23)分子量為142至1000， (B24)殘基間原子數為3~15， (B25)殘基間之原子的結合樣式全部皆為單鍵。 [45]如[38]~[44]中任一項所記載之方法，其中，LP1、LP2及LS各自為從以下結構中單獨地或不同地選出之結構： (A)核苷酸，或 (B)以下列(B31)至(B35)為要件之核酸類似物： (B31)具有磷酸及羥基， (B32)由碳、氫、氧、氮或磷所構成， (B33)分子量為142至700， (B34)殘基間原子數為4~7， (B35)殘基間之原子的結合樣式全部皆為單鍵。 [46]如[38]~[45]中任一項所記載之方法，其中，LP1及LP2各自為以下中之任一者： (B41)d-Spacer， (B5)聚烷二醇磷酸酯。 [47]如[38]~[46]中任一項所記載之方法，其中，LP1及LP2各自為二乙二醇磷酸酯或三乙二醇磷酸酯。 [48]如[38]~[47]中任一項所記載之方法，其中，LP1及LP2各自為三乙二醇磷酸酯。 [49]如[38]~[46]中任一項所記載之方法，其中，LP1及LP2各自為d-Spacer。 [50]如[38]~[45]中任一項所記載之方法，其中，LP1及LP2各自為核苷酸。 [51]如[38]~[50]中任一項所記載之方法，其中，LS為式(a)~式(g)中之任一者： (式中，＊係意味與連結子之結合位置，＊＊係意味與LP1或LP2之結合位置，R為氫原子或甲基)。 [52]如[38]~[50]中任一項所記載之方法，其中，LS為式(h)： (式中，＊係意味與連結子之結合位置，＊＊係意味與LP1或LP2之結合位置)。 [53]如[38]~[50]中任一項所記載之方法，其中，LS為聚烷二醇磷酸酯。 [54]如[38]~[50]中任一項所記載之方法，其中，LS為式(i)~式(k)： (式中，n1、m1、p1及q1各自獨立地為1~20的整數，＊係意味與連結子之結合位置，＊＊係意味與LP1或LP2之結合位置)。 [55]如[38]~[50]中任一項所記載之方法，其中，LS為式(l)： (式中，＊係意味與連結子之結合位置，＊＊係意味與LP1或LP2之結合位置)。 [56]如[38]~[50]中任一項所記載之方法，其中，LS為(B42)、(B43)或(B44)中之任一者： (B42)Amino C6 dT， (B43)mdC(TEG-Amino)， (B44)Uni-Link(註冊商標)Amino Modifier。 [57]如[38]~[50]中任一項所記載之方法，其中，LS為核苷酸。 [58]如[38]~[42]及[46]~[50]中任一項所記載之方法，其中，LS為(C)可具有取代基之C1~14的3價基，(C)為以下結構中之任一者： (1)可具有取代基且可經1~3個雜原子置換之C1~10脂肪族烴， (2)可具有取代基之C6~14芳香族烴， (3)可具有取代基之C2~9芳香族雜環，或 (4)可具有取代基之C2~9非芳香族雜環。 [59]如[38]~[42]及[46]~[50]中任一項所記載之方法，其中，LS為(C)可具有取代基之C1~14的3價基，(C)為以下結構中之任一者： (1)可具有取代基之C1~6脂肪族烴， (2)可具有取代基之C6~10芳香族烴，或 (3)可具有取代基之C2~5芳香族雜環。 [60]如[38]~[42]及[46]~[50]中任一項所記載之方法，其中，LS為(C)可具有取代基之C1~14的3價基，(C)為以下結構中之任一者： (1)C1~6脂肪族烴， (2)苯，或 (3)C2~5含氮芳香族雜環， 在此處，前述(1)~(3)係未經取代，或可經從取代基群組ST1中單獨地或不同地選出之1~3個取代基取代，取代基群組ST1為由C1~6烷基、C1~6烷氧基、氟原子及氯原子所構成之群組，惟，在取代基群組ST1對脂肪族烴進行取代之情況，不從取代基群組ST1中選出烷基。 [61]如[38]~[42]及[46]~[50]中任一項所記載之方法，其中，LS為(C)可具有取代基之C1~14的3價基，(C)為以下結構中之任一者： (1)C1~6烷基，或 (2)未經取代或者經1個或2個C1~3烷基或C1~3烷氧基取代之苯。 [62]如[38]~[42]及[46]~[50]中任一項所記載之方法，其中，LS為(C)可具有取代基之C1~14的3價基，(C)為以下結構： (1)C1~6烷基。 [63]如[35]~[62]中任一項所記載之方法，其中，E及F各自獨立地為由核苷酸或核酸類似物所構成之寡聚物， E及F的鏈長各自為3至40。 [64]如[35]~[63]中任一項所記載之方法，其中，E及F各自獨立地為由核苷酸或核酸類似物所構成之寡聚物， E及F的鏈長各自為4至30。 [65]如[35]~[64]中任一項所記載之方法，其中，E及F各自獨立地為由核苷酸或核酸類似物所構成之寡聚物， E及F的鏈長各自為6至25。 [66]如[35]~[65]中任一項所記載之方法，其中，E及F各自獨立地為由核苷酸或核酸類似物所構成之寡聚物， E及F包含彼此互補的鹼基序列，形成雙鏈寡核苷酸， E及F之雙鏈寡核苷酸為突出末端。 [67]如[66]所記載之方法，其中，前述突出末端的突出部為2個鹼基以上的長度。 [68]如[35]~[65]中任一項所記載之方法，其中，E及F各自獨立地為由核苷酸或核酸類似物所構成之寡聚物， E及F包含彼此互補的鹼基序列，形成雙鏈寡核苷酸， E及F之雙鏈寡核苷酸為平滑末端。 [69]如[35]~[68]中任一項所記載之方法，其中，E及F中所包含之彼此互補的鹼基序列的鏈長各自為3個鹼基以上。 [70]如[35]~[69]中任一項所記載之方法，其中，E及F中所包含之彼此互補的鹼基序列的鏈長各自為4個鹼基以上。 [71]如[35]~[70]中任一項所記載之方法，其中，E及F中所包含之彼此互補的鹼基序列的鏈長各自為6個鹼基以上。 [72]如[35]~[71]中任一項所記載之方法，其中，E及F各自獨立地為由核苷酸所構成之寡聚物。 [73]如[35]~[72]中任一項所記載之方法，其中，核苷酸為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸。 [74]如[35]~[73]中任一項所記載之方法，其中，核苷酸為去氧核糖核苷酸。 [75]如[35]~[74]中任一項所記載之方法，其中，核苷酸為去氧腺苷、去氧鳥苷、胸苷或去氧胞苷。 [76]如[35]~[71]中任一項所記載之方法，其中，E及F各自獨立地為由核酸類似物所構成之寡聚物。 [77]如[35]~[76]中任一項所記載之方法，其中，L為 (1)可具有取代基且可經1~3個雜原子置換之C1~20脂肪族烴，或 (2)可具有取代基之C6~14芳香族烴。 [78]如[35]~[77]中任一項所記載之方法，其中，L為可具有取代基之C1~6脂肪族烴、可經1或2個氧原子置換之C1~6脂肪族烴或可具有取代基之C6~10芳香族烴。 [79]如[35]~[78]中任一項所記載之方法，其中，L為可經取代基群組ST1取代之C1~6脂肪族烴或可經取代基群組ST1取代之苯，在此處，取代基群組ST1為由C1~6烷基、C1~6烷氧基、氟原子及氯原子所構成之群組(惟，在取代基群組ST1對脂肪族烴進行取代之情況，不從取代基群組ST1中選出烷基)。 [80]如[35]~[79]中任一項所記載之方法，其中，L為C1~6烷基，或未經取代或者經1個或2個C1~3烷基或C1~3烷氧基取代之苯。 [81]如[35]~[80]中任一項所記載之方法，其中，L為C1~6烷基。 [82]如[35]~[81]中任一項所記載之方法，其中，D的反應性官能基為可構成C-C、胺基、醚、羰基、醯胺、酯、脲、硫醚、二硫醚、亞碸、磺醯胺或磺醯鍵之反應性官能基。 [83]如[35]~[82]中任一項所記載之方法，其中，D的反應性官能基為具有脫離基之C1烴、胺基、羥基、羰基的前驅物、硫醇基或醛基。 [84]如[35]~[83]中任一項所記載之方法，其中，D的反應性官能基為具有鹵素原子之C1烴、具有磺酸系脫離基之C1烴、胺基、羥基、羧基、鹵化羧基、硫醇基或醛基。 [85]如[35]~[84]中任一項所記載之方法，其中，D的反應性官能基為-CH 2Cl、-CH 2Br、-CH 2OSO 2CH 3、     -CH 2OSO 2CF 3、胺基、羥基或羧基。 [86]如[35]~[85]中任一項所記載之方法，其中，D的反應性官能基為一級胺基。 [87]如[35]~[86]中任一項所記載之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為並非去氧腺苷、去氧鳥苷、胸苷及去氧胞苷中之任何者之去氧核糖核苷。 [88]如[35]~[87]中任一項所記載之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為去氧尿苷、溴去氧尿苷、去氧肌苷、8-羥基去氧鳥苷、3-甲基-2’-去氧腺苷、N6-亞乙烯基-2’-去氧腺苷、7-甲基-2’-去氧鳥苷、2’-去氧黃苷或5,6-二羥基-5,6-二氫去氧胸苷。 [89]如[35]~[88]中任一項所記載之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為去氧尿苷或去氧肌苷。 [90]如[35]~[89]中任一項所記載之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為去氧尿苷。 [91]如[35]~[89]中任一項所記載之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為去氧肌苷。 [92]如[35]~[86]中任一項所記載之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為從去氧肌苷起朝3’方向第2個磷酸二酯鍵。 [93]如[35]~[86]中任一項所記載之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為核糖核苷。 [94]如[35]~[93]中任一項所記載之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為1個。 [95]如[35]~[93]中任一項所記載之方法，其中，在E或(LP1)p中包含至少1個能夠切割之部位，且在F或(LP2)q中包含至少1個能夠切割之部位。 [96]如[95]所記載之方法，其中，E或(LP1)p中所包含之能夠切割之部位與F或(LP2)q中所包含之能夠切割之部位能夠在不同的條件下進行切割。 [97]如[35]~[96]中任一項所記載之方法，其中，An為由n個建構組元α1~αn(n為1~10的整數)所構築之部分結構。 [98]如[35]~[97]中任一項所記載之方法，其中，An為低分子有機化合物。 [99]如[35]~[98]中任一項所記載之方法，其中，An的建構組元為分子量500以下的化合物。 [100]如[35]~[99]中任一項所記載之方法，其中，An的建構組元為分子量300以下的化合物。 [101]如[35]~[100]中任一項所記載之方法，其中，An的建構組元為分子量150以下的化合物。 [102]如[35]~[101]中任一項所記載之方法，其中，An為由從H、B、C、N、O、Si、P、S、F、Cl、Br及I所組成之元素群組單獨地或不同地選出之元素所構成之有機化合物。 [103]如[35]~[102]中任一項所記載之方法，其中，An為具有從芳基、非芳香族環基、雜芳基及非芳香族雜環基所組成之取代基群組單獨地或不同地選出之取代基之低分子有機化合物。 [104]如[35]~[103]中任一項所記載之方法，其中，An為分子量5000以下。 [105]如[35]~[104]中任一項所記載之方法，其中，An為分子量800以下。 [106]如[35]~[105]中任一項所記載之方法，其中，An為分子量500以下。 [107]如，[35]~[97]中任一項所記載之方法，其中，An為多肽。 [108]如[35]~[107]中任一項所記載之方法，其中，Sp為2官能性間隔子。 [109]如[1]~[107]中任一項所記載之方法，其中，2官能性間隔子各自為SpD-SpL-SpX， SpD為源自可構成C-C、胺基、醚、羰基、醯胺、酯、脲、硫醚、二硫醚、亞碸、磺醯胺或磺醯鍵之反應性基之2價基， SpL為聚烷二醇、聚乙烯、可任意地經雜原子置換之C1~20脂肪族烴、胜肽、寡核苷酸或此等之組合， SpX為源自形成胺基、羰基、醯胺、酯、脲或磺醯胺鍵之反應基之2價基。 [110]如[1]~[107]中任一項所記載之方法，其中，2官能性間隔子各自為SpD-SpL-SpX， SpD為源自一級胺基之2價基， SpL為聚乙二醇或聚乙烯， SpX為源自羧基之2價基。 [111]如[35]~[110]中任一項所記載之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y為能夠形成雙鏈之序列。 [112]如[35]~[111]中任一項所記載之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y包含互補的鹼基序列。 [113]如[35]~[112]中任一項所記載之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y各自為1~200個鹼基的長度。 [114]如[35]~[113]中任一項所記載之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y各自為3~150個鹼基的長度。 [115]如[35]~[114]中任一項所記載之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y各自為30~150個鹼基的長度。 [116]如[35]~[115]中任一項所記載之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y具有平滑末端。 [117]如[35]~[115]中任一項所記載之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y具有突出末端。 [118]如[117]所記載之方法，其中，突出末端的突出部為1~30個鹼基的長度。 [119]如[117]或[118]所記載之方法，其中，突出末端的突出部為2~5個鹼基的長度。 [120]如[117]~[119]中任一項所記載之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y具有突出末端，在該突出末端進一步結合有特定分子識別序列。 [121]如[35]~[120]中任一項所記載之方法，其中，在X及Y中之任一者結合有機能性分子。 [122]如[35]~[120]中任一項所記載之方法，其中，在X及Y中之任一者結合有生物素。 [123]如[35]~[107]中任一項所記載之方法，其中，Sp為鍵結。 [發明效果]
在本發明中，係提供將在DNA鏈中包含能夠切割之部位之DEL衍生成交聯劑修飾雙股DEL並進行評價之方法。即，提供相較於以往而言，兼具「簡便的DEL合成手法」與「DEL評價手法的擴展/改善」之化合物篩選技術。從而，根據本發明，可取得在醫藥品、農藥、醫療材料開發中有用的命中化合物之機會得以擴展。
如前述，此外，屬熟習該項技術者所周知的概念，在本發明中，所謂化合物資料庫，係意味醫藥品候補化合物等系統性地收集有可能具有特定的活性之化合物而得之化合物衍生物群組。此化合物資料庫在多數情況係基於組合化學合成技術及方法論所合成。所謂組合化學，係用於以系統性的合成路徑有效率地多品種合成出基於組合論所列舉並設計之一連串的化合物資料庫之實驗手法及與其相關之研究領域。
如前述，此外，熟習該項技術者所周知，作為基於組合化學之化合物資料庫之一種，有DNA編碼化資料庫。DNA編碼化資料庫係適宜略記為DEL。此外，DEL亦與DNA編碼化化合物資料庫在本質上同義。 在本發明中，DNA編碼化資料庫係意味對經資料庫化之各化合物附加DNA的標籤而得之資料庫。DNA的標籤係以可鑑定各化合物的各結構之方式設計序列，作為化合物的標識而發揮機能。
所謂核苷酸，一般可理解為磷酸基結合至核苷而得之物質。核苷酸或核苷屬熟習該項技術者所周知的用語，作為一個一般態樣，核苷可理解為嘌呤鹼基或嘧啶鹼基等核酸鹼基醣苷結合至五單醣等醣的1位而得之物。核苷或核苷酸亦為構成DNA或RNA等核酸之單元。 此外，核酸亦屬熟習該項技術者所周知的概念，作為一般態樣，可理解為核苷酸的聚合物。 作為一態樣，本發明之所謂核酸，係後述之由核苷酸及核酸類似物所構成之聚合物。
此外，在本說明書中，除了由核苷酸或核酸類似物所構成之核酸聚合物以外，核苷酸或核酸類似物等核酸單體有時亦簡記為核酸。後者的用法亦屬依照技術常識之用法，只要是熟習該項技術者，即可適宜依照上下文來理解。
在廣義的核苷酸中，除了天然的核苷酸(原始的核苷酸)以外，亦包含人工的核苷酸(各種核酸類似物)。 本發明中之廣義的核苷酸包含以下態樣。 (A)天然的核苷的核苷酸 (作為該核苷之例，可列舉腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、去氧腺苷、去氧尿苷、去氧鳥苷、去氧胞苷、肌苷或二胺基嘌呤去氧核糖苷。) (B)具有核酸鹼基的類似物之核苷的核苷酸 (作為該具有核酸鹼基類似物之核苷之例，可列舉2-胺基腺苷、2-硫基胸苷、吡咯并嘧啶去氧核糖苷、3-甲基腺苷、C5-丙炔基胞苷、C5-丙炔基尿苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-甲基胞苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-側氧基腺苷、8-側氧基鳥苷、6-O-甲基鳥苷或2-硫基胞苷。) (C)具有經插入之核酸鹼基之核苷酸 (D)具有核糖或2’-去氧核糖之非天然的核苷酸 (E)在醣部分具有經修飾之醣之核苷酸 (作為該經修飾之醣之例，可列舉經修飾之核糖、經修飾之2’-去氧核糖、2’-O-甲基核糖、2’-氟核糖、D-蘇胺醇、阿拉伯糖、酮己醣、脫水己糖醇、阿卓糖醇或甘露糖醇。) (F)核酸類似物 (作為該核酸類似物之例，可列舉環己基核酸、環己烯基核酸、N-嗎啉基核酸(PMO)、鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)、二醇核酸(glycol nucleic acid，GNA)、蘇糖核酸(TNA)、絲胺醇核酸(SNA)、無環蘇胺醇核酸(aTNA)或核糖中之氧經置換而得之核酸。) 以下，針對各核酸類似物詳細地進行說明。 (F1)PMO PMO為在醣部具有嗎啉環，在磷酸二酯部位具有不帶電荷之磷醯二胺結構之核酸類似物。 (F2)LNA LNA為在醣部分具有架橋結構之核酸類似物，作為最典型之例，核糖的2’-羥基藉由C1~6伸烷基或C1~6雜伸烷基架橋至相同的核糖糖的4’-碳。作為架橋結構之例，可列舉亞甲基、伸丙基、醚或胺基架橋結構。 作為典型的LNA，可列舉2’,4’-BNA(2’-O,4’-C-甲醇架橋核酸)。 (F3)GNA 二醇核酸亦稱為GNA。可列舉例如R-GNA或S-GNA。在此情況，核糖被結合至磷酸二酯鍵之二醇單元所置換。 (F4)TNA 蘇糖核酸亦稱為TNA。在此情況，核糖被α-L-蘇呋喃糖基-(3’→2’)所置換。 (F5)SNA 絲胺醇核酸亦稱為SNA。在此情況，核糖被結合至磷酸二酯鍵之絲胺醇單元所置換。 (F6)aTNA 無環蘇胺醇核酸亦稱為aTNA。可列舉例如D-aTNA或L-aTNA。在此情況，核糖被結合至磷酸二酯鍵之蘇胺醇單元所置換。 (F7)核糖中之氧經置換而得之糖 作為具體例，可列舉氧與S、Se或伸烷基(可列舉例如亞甲基或伸乙基)之置換體。 (G)骨架經修飾之核苷酸 (作為該骨架經修飾之核苷酸之例，可列舉胜肽核酸(該胜肽核酸亦稱為PNA。在此情況，2-胺基乙基-甘胺酸連結取代核糖及磷酸二酯骨架)。) (H)磷酸基經修飾之核苷酸 (作為該磷酸基經修飾之核苷酸之例，可列舉硫代磷酸酯、5’-N-胺基磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸、硼代磷酸酯、氫膦酸酯、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯、磷酸三酯、交聯胺基磷酸酯、交聯硫代磷酸酯或交聯亞甲基-膦酸酯等。) 以下說明中之本發明之寡核苷酸、寡核苷酸鏈、雙股寡核苷酸、雙股寡核苷酸鏈及雙股DNA為上述定義的核苷酸。
在本發明中，在沒有特定限定之情形下，在記載為核苷酸之情況，係意味天然的核苷酸。天然的核苷酸屬熟習該項技術者所周知的用語，只要是在本質上天然存在之核苷酸，即無特別限定。作為一態樣，本發明中之天然的核苷酸為前述(A)所記載之核苷酸。 (核酸類似物) 所謂核酸類似物，屬熟習該項技術者所周知的用語，本發明中之核酸類似物的結構在具有本發明的效果之前提下，並無限定。 作為一態樣，所謂核酸類似物，係前述(B)至(H)的態樣的化合物。 作為一態樣，本發明中之所謂核酸類似物，係具有核酸單體中之磷酸相當部位及羥基相當部位之化合物。核酸類似物更佳為具有磷酸部位及羥基之化合物。 作為一態樣，本發明中之所謂核酸類似物，係在核酸合成機中能夠利用作為單體之化合物。熟習該項技術者所周知，在核酸合成機中，可藉由作為將核酸類似物的磷酸(或相當部位)進行胺基磷酸酯化，並將羥基(或其相當部位)以保護基進行保護而得之單體加以利用，而合成核酸寡聚物。 此外，核酸類似物中之磷酸部位(或相當部位)及羥基(或相當部位)以外之部分結構可稱為核酸類似物殘基。核酸類似物殘基的結構在具有本發明的效果之前提下，並無限定，在此處，作為參照，若確認天然的核酸(去氧腺苷、胸苷、去氧胞苷、去氧鳥苷)的各結構特徵，則可列舉分子量為322(胸苷一磷酸)至347(去氧鳥苷一磷酸)左右，且構成核酸鏈之3’位的羥基氧原子至5’位的磷原子之間之原子數(包含氧原子及磷原子。以下亦稱為殘基間原子數)為6個。此外，作為能夠利用於核酸合成機之核酸類似物，已知下列者。 Amino C6 dT分子量：476，殘基原子數：6 mdC(TEG-Amino)分子量：526，殘基原子數：6 Uni-Link(註冊商標)Amino Modifier分子量：227，殘基原子數：6 (參照文獻Nucleic Acid Research，1992年，第20卷，第6253-6259頁) d-Spacer分子量：198，殘基原子數：6 三乙二醇磷酸酯(Spacer9)分子量：230，殘基原子數：11
作為參考，將各核酸類似物的結構記載於下。
從而，作為一態樣，核酸類似物為以下列者為特徵之化合物(B1)。 (B11)具有磷酸(或相當部位)及羥基(或其相當部位)。 (B12)由碳、氫、氧、氮、磷或硫所構成。 (B13)分子量為142至1500。 (B14)殘基間原子數為5~30。 (B15)殘基間之原子的結合樣式全部皆為單鍵，或者包含1至2個雙鍵且其餘為單鍵。
作為一態樣，核酸類似物為以下列者為特徵之化合物(B2)。 (B21)具有磷酸及羥基。 (B22)由碳、氫、氧、氮或磷所構成。 (B23)分子量為142至1000。 (B24)殘基間原子數為5~20。 (B25)殘基間之原子的結合樣式全部皆為單鍵。
作為一態樣，核酸類似物為以下列者為特徵之化合物(B3)。 (B31)具有磷酸及羥基。 (B32)由碳、氫、氧、氮或磷所構成。 (B33)分子量為142至700。 (B34)殘基間原子數為5~12。 (B35)殘基間之原子的結合樣式全部皆為單鍵。
作為一態樣，核酸類似物為以下化合物(B41)、(B42)、(B43)、(B44)、(B5)、(B51)或(B52)。 (B41)d-Spacer (B42)Amino C6 dT (B43)mdC(TEG-Amino) (B44)Uni-Link(註冊商標)Amino Modifier (B5)聚烷二醇磷酸酯 (B51)二乙二醇磷酸酯或三乙二醇磷酸酯 (B52)三乙二醇磷酸酯
在本發明中，所謂寡核苷酸及寡核苷酸鏈，係意味在5’末端及3’末端，及5’末端與3’末端之間之內部位置具有1個以上核苷酸之核苷酸的聚合物。
所謂彼此互補的鹼基序列，係意味可在核酸的2條寡核苷酸之間，做出腺嘌呤與胸腺嘧啶(或尿嘧啶)，或鳥嘌呤與胞嘧啶之固定組合，形成以氫鍵連接之所謂的互補的鹼基對之核苷酸的序列。互補的鹼基對的形成亦稱為雜交。 另外，互補的鹼基對係一般被稱為「Watson-Crick型鹼基對」、「天然型鹼基對」之概念。惟，鹼基對可為Watson-Crick型，亦可為Hoogsteen型鹼基對，或經由其他氫鍵基序(例如二胺基嘌呤與T、5-甲基C與G、2-硫基胸腺嘧啶與A、6-羥基嘌呤與C、假異胞嘧啶與G)形成之鹼基對等。2條寡核苷酸為可組成雙股之序列，在可利用於本發明之目的之前提下，「彼此互補的鹼基序列」的序列並無限制，對2個序列的同源性亦無限制。同源性依更佳的順序係以99%以上、98%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、70%以上、60%以上或50%以上為佳。
重複地，在本發明中，所謂雜交，係意味包含彼此互補的鹼基序列之寡核苷酸或寡核苷酸鏈互相形成雙股之行為，及包含互補的序列之寡核苷酸或寡核苷酸鏈互相形成雙鏈之現象。
在本發明中，所謂雙鏈，係意味2個核酸鏈形成互補的鹼基對(雜交)之狀態。2個核酸鏈可源自於2條核酸鏈，亦可源自於1條核酸鏈分子內之2個核酸序列。
在本發明中，所謂雙股寡核苷酸及雙股寡核苷酸鏈，係意味藉由2個以上不同的寡核苷酸鏈進行雜交所形成之二級結構體。2個寡核苷酸的鏈長可不同，亦可具有未進行雜交之區域。 另外，雙股進行雜交之區域為雙鏈。
在本發明中，所謂雙股DNA，係意味藉由2個不同的DNA鏈進行雜交所形成之二級結構體。各DNA鏈的鏈長可不同，亦可具有未進行雜交之區域。DNA鏈並不限定於天然存在之去氧核糖核苷酸，係意味能夠藉由DNA聚合酶進行增幅之所有寡核苷酸鏈。
在本發明中，所謂「形成雙鏈」，只要在例如4~40℃的溫度、水性溶媒、pH4~10之處置寡核苷酸時標準的條件下形成雙鏈即可。例如，即便有取決於特定的溶媒、條件而不形成雙鏈之情況，只要該核酸在標準的條件下形成雙鏈，該核酸即為形成雙鏈之核酸。
在本發明中，所謂Tm值，係指半數DNA分子與互補鏈進行黏合時之溫度。
在本發明中，所謂平滑末端，係意味雙股寡核苷酸的末端皆成對而未突出。
在本發明中，所謂突出末端，係意味雙股寡核苷酸的末端中之其中一條鏈具有突出部。突出末端的突出部可為任意的長度，較佳為1~50個鹼基，更佳為1~30個鹼基，再佳為1~15個鹼基，最佳為2~6個鹼基的長度。在特定態樣中，前述突出部能夠使用作為實施黏著末端的接合時之雜交區域。
所謂PCR，係意味聚合酶連鎖反應。PCR為寡核苷酸鏈的增幅手段，屬熟習該項技術者所周知的技術。若對PCR的流程的概要進行說明，則在PCR中，(1)藉由加熱處理等使增幅對象的雙股寡核苷酸鏈解離成2個單股，(2)在調整成適於酵素反應之溫度之後，藉由存在於反應系統中之酵素(DNA聚合酶等)合成對各單股互補的鏈。即，1個雙股寡核苷酸可增幅成2個。在PCR中，藉由溫度調整重複進行(1)及(2)的流程，藉此可以較高的效率增幅寡核苷酸鏈。
在本發明中，所謂引子，係意味可黏合至成為模板之寡核苷酸鏈，並藉由聚合酶而模板依存性地伸長之寡核苷酸。
在本發明中，所謂PCR用的引子序列，係意味在寡核苷酸鏈中，引子所黏合之部分的序列，較佳為該領域中公知的適於PCR之序列，較佳係存在於寡核苷酸鏈的末端。
在本發明中，所謂缺口(nick)，係意味在雙股寡核苷酸鏈中，缺乏核苷酸間結合，寡核苷酸鏈斷裂之部分。此缺乏部的5’側可具有磷酸基，亦可不具有磷酸基。
在本發明中，所謂間隙(gap)，係意味在雙股寡核苷酸鏈中，1個以上連續的核苷酸發生缺失，寡核苷酸鏈分開之部分。在缺失部的5’側可具有磷酸基，亦可不具有磷酸基。
在本發明中，所謂髮夾鏈，係互補的2條核酸鏈連接而得之單股結構，髮夾鏈或髮夾鏈DEL的特徵係如前述。本發明中所使用之「髮夾部位」、「髮夾結構」、「髮夾型」之用語可理解為源自於與前述「髮夾鏈」同概念的髮夾之用語。
在本發明中，所謂核酸連結反應及接合，係意味將核酸的末端互相連結之反應。
所謂酵素所引發之核酸連結反應及酵素接合，係意味使用酵素將核酸的末端互相連結之反應。
可用於核酸連結反應之酵素係例如為DNA連接酶、RNA連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶或拓樸異構酶。
作為一態樣，DNA連接酶為將DNA鏈的末端以磷酸二酯鍵互相連接之酵素。作為一態樣，DNA連接酶可理解為隸屬於EC編號：6.5.1.1或6.5.1.2之連接酶。DNA連接酶亦稱為聚去氧核糖核苷酸合酶或聚核苷酸連接酶等。作為DNA連接酶之例，可列舉DNA連接酶I、II、III、IV或T4 DNA連接酶等。
作為一態樣，RNA連接酶為將RNA鏈的末端以磷酸二酯鍵互相連接之酵素。作為一態樣，RNA連接酶可理解為隸屬於EC編號：6.5.1.3之連接酶。此外，作為一態樣，RNA連接酶係隸屬於聚(核糖核苷酸)：聚(核糖核苷酸)連接酶的系統。RNA連接酶亦稱為聚核糖核苷酸合酶或聚核糖核苷酸連接酶。
在本發明中，所謂化學接合，係意味在未使用酵素之情形下將核酸的末端互相結合之反應。
在化學接合中，藉由具有成為化學反應對之官能基之核酸的末端互相反應而形成連結部。成為化學反應對之官能基係例如為可經取代之炔基與可經取代之疊氮基之對、具有4π電子系統之可經取代之二烯(可列舉例如可經取代之1,3-不飽和化合物，例如可經取代之1,3-丁二烯、1-甲氧基-3-三甲基矽烷基氧基-1,3-丁二烯、環戊二烯、環己二烯或呋喃)與具有2π電子系統之可經取代之親二烯體或可經取代之雜親二烯體(可列舉例如可經取代之烯基或可經取代之炔基)之對、可經取代之胺基與羧酸基之對、硫代磷酸酯基與碘基(可列舉例如3’末端的硫代磷酸酯基與5’末端的碘基)之對，或磷酸基與羥基之對(可列舉例如5’末端的磷酸基與3’末端的羥基之對，或5’末端的羥基與3’末端的磷酸基之對)。 化學接合屬熟習該項技術者所周知的概念，熟習該項技術者可基於技術常識而適宜達成化學接合。除上述以外，亦可參照Artificial DNA；PNA＆XNA，2014年，第5卷，e27896、Current Opinion in Chemical Biology，2015年，第26卷，第80-88頁等。
在本發明中，所謂「選擇性地切割可能」，係意味在某一化合物中，可在不會對化合物的其他分子結構帶來變化之情形下，在指定的條件下僅選擇性地切割特定的部位。
在本發明中，所謂「能夠選擇性地切割之部位」，係意味在某一化合物中，可在指定的條件下選擇性地切割之部位。
作為一態樣，本發明中之「能夠選擇性地切割之部位」的較佳結構為「能夠選擇性地切割之核酸」。該部位可為由複數個核酸所構成且特定的序列發揮功效而被切割之部位，亦可為由單一的核酸所得之部位。在能夠切割之部位為核酸之情況，就下列觀點而言係較佳：(1)可利用核酸合成機等已確立之製造方法，製造效率佳，(2)DEL的建構組元構築的反應條件必須是DNA標籤部分的核酸不會分解，因而只要能夠切割之部位為核酸，仍不會分解等。
前述「能夠選擇性地切割之核酸」的更佳結構為包含不包括在DEL的DNA標籤的序列中之核苷酸之核酸。只要能夠切割之部位為不包括在DNA標籤的序列中之核苷酸，為了避免DNA標籤部分的切割，能夠在不限定DNA標籤的序列之情形下加以利用。
作為使用於DNA標籤的序列之核酸，較佳為去氧腺苷、去氧鳥苷、胸苷及去氧胞苷。從而，能夠選擇性地切割之部位的較佳結構為並非去氧腺苷、去氧鳥苷、胸苷及去氧胞苷中之任何者之核酸。
作為「能夠選擇性地切割之部位」之例，可列舉「具有能夠切割之鹼基之核苷酸」。例如，DEL中之「具有能夠切割之鹼基之核苷酸」係藉由DNA醣苷酶的作用，鹼基部與糖部之間之N-醣苷鍵被切割，留下脫鹼基部位。脫鹼基部位所鄰接之磷酸二酯鍵係受到化學條件變化(例如溫度上升、鹼性水解等)或者具有脫嘌呤/脫嘧啶(AP)內核酸酶活性或AP裂解酶活性之酵素(例如內核酸酶III、內核酸酶IV、內核酸酶V、內核酸酶VI、內核酸酶VII、內核酸酶VIII、APE1(源自人類之AP內核酸酶)、Fpg(甲醯胺吡啶-DNA醣苷酶)等)所切割，形成1個鹼基份的間隙或缺口。
作為「具有能夠切割之鹼基之核苷酸」之例，可列舉去氧尿苷、溴去氧尿苷、去氧肌苷、8-羥基去氧鳥苷、3-甲基-2’-去氧腺苷、N6-亞乙烯基-2’-去氧腺苷、7-甲基-2’-去氧鳥苷、2’-去氧黃苷、5,6-二羥基去氧胸苷等。其他具有能夠切割之鹼基之核苷酸對熟習該項技術者而言是顯而易見的。藉由將此等「具有能夠切割之鹼基之核苷酸」組入DEL中，並使用特異性地辨識該結構之DNA醣苷酶，DEL便選擇性地脫鹼基。
在本發明中，所謂DNA醣苷酶，係具有醣苷酶活性之任意的酵素，其係辨識寡核苷酸中之任意的核酸鹼基部，切割該鹼基部與醣部之間之N-醣苷鍵，製作出脫鹼基部位之酵素。可列舉例如尿嘧啶DNA醣苷酶(辨識去氧尿苷)、烷基腺嘌呤DNA醣苷酶(辨識3-甲基-2’-去氧腺苷、7-甲基-2’-去氧鳥苷及去氧肌苷)、Fpg(辨識8-羥基去氧鳥苷)、內核酸酶VIII(辨識5,6-二羥基去氧胸苷或尿嘧啶二醇等經分解之嘧啶鹼基)、SUMG1(單股選擇性尿嘧啶DNA醣苷酶的簡稱，辨識去氧尿苷)等。
在本發明中，作為「能夠選擇性地切割之部位」的更佳例，可列舉去氧肌苷、去氧尿苷。
在本發明中，作為「能夠選擇性地切割之部位」的特佳例，可列舉去氧尿苷。
作為一態樣，本發明中之「能夠選擇性地切割之部位」較佳係使用酵素加以切割。酵素一般而言係基質特異性較高，不會辨識DEL的DNA標籤部分及由複數個建構組元所構築而得之化合物部分作為基質，僅辨識「能夠選擇性地切割之部位」而發揮作用，因而較佳。此外，使用前述酵素之切割亦可在藉由酵素使「能夠選擇性地切割之部位」發生結構變化之後，藉由使化學條件發生變化而達成。作為該酵素之例，可列舉醣苷酶及核酸酶。
在本發明中，所謂醣苷酶，係具有將醣苷鍵(醣分子與另一有機化合物進行脫水縮合所形成之共價鍵)進行水解之機能之酵素。該等之中，DNA醣苷酶係如前述，為辨識寡核苷酸中之核酸鹼基部並將該醣苷鍵進行水解之酵素。
在本發明中，所謂核酸酶，係具有將核酸的醣與磷酸之間之磷酸二酯鍵進行水解之機能之酵素。在核酸酶中，包含例如AP內核酸酶、缺口內核酸酶、核糖核酸酶。
AP內核酸酶係如前述，切割由任意的DNA醣苷酶的作用所生成之脫鹼基部位所鄰接之磷酸二酯鍵。從而，在本發明中，較佳係併用DNA醣苷酶與AP內核酸酶。
缺口內核酸酶(例如Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI等)辨識特定的DNA序列，僅雙股中之其中一條鏈產生磷酸二酯鍵被切割而得之缺口。此外，內核酸酶V能夠產生從去氧肌苷起朝3’方向第2個磷酸二酯鍵被切割而得之缺口，在本發明的實施中實屬有用。
核糖核酸酶為分解RNA之酵素。在本發明中，係將核糖核苷用作「能夠選擇性地切割之部位」，能夠藉由使核糖核酸酶發揮作用而加以利用。屬於核糖核酸酶的一種之RNaseHII能夠產生組入DNA序列中之核糖核苷酸的5’側的磷酸二酯鍵被切割而得之缺口，在本發明的實施中實屬有用。
在本發明中，所謂USER(註冊商標)，係意味「Uracil-Specific Excision Reagent」Enzyme。USER為包含尿嘧啶DNA醣苷酶(UDG)及內核酸酶VIII之除去尿嘧啶之內核酸酶混合物。USER除去雙股DNA中之尿嘧啶而產生1個鹼基的間隙，切割DNA鏈。在經由USER之流程中，首先，UDG除去尿嘧啶鹼基而創造出脫鹼基部位。接著，內核酸酶分解磷酸二酯鍵並游離出無鹼基之去氧核糖，創造出1個鹼基份的間隙。 本說明書的說明中之USER(註冊商標)酵素及USER(註冊商標)Enzyme為上述定義的USER(註冊商標)。
在本發明中，所謂核酸外切酶，係具有從核酸的5’末端或3’末端起依次地水解磷酸二酯鍵之機能之酵素。在核酸外切酶中，包含例如λ核酸外切酶、核酸外切酶III、T7核酸外切酶。
λ核酸外切酶為分解雙股DNA中之5’末端被磷酸化之DNA之酵素。在本發明中，在將雙股DEL轉換成單股DEL之情況實屬有用。
在本發明中，所謂建構組元，係具有官能基且可構成化合物的一部分之部分，亦可為化合物的形態。
在本發明中，所謂可鑑定各建構組元之鹼基序列，係意味以對應於各建構組元的結構之方式設計而得之特定的鹼基序列。所謂設計序列，係意味例如以對建構組元結構A分配核酸鹼基序列AAA，對結構B分配核酸鹼基序列TTT，對結構C分配核酸鹼基序列CGC之方式對每一結構分配核酸鹼基序列。序列可在達到本發明之目的之前提下自由地設計。例如，可將任意的數量的鹼基序列分配至1個建構組元。
在本發明中，所謂寡核苷酸標籤，係包含寡核苷酸之部分結構，該寡核苷酸包含可鑑定藉由建構組元所構築之部分結構的結構之鹼基序列。在本發明中，所謂寡核苷酸標籤，可為對應於各建構組元之寡核苷酸，亦可為包含對應於複數個建構組元之寡核苷酸之更長鏈的寡核苷酸。 構成本發明之寡核苷酸標籤之核苷酸在達成本發明的效果之前提下並無限制，就經由PCR之增幅或經由定序儀之解析的容易度之觀點而言，較理想為適應此等操作之核苷酸。作為此種較佳核苷酸之例，可列舉具有前述之天然的核酸鹼基作為鹼基部，並具有前述之核糖或2’-去氧核糖作為醣部之核苷酸，作為更佳例，可列舉去氧腺苷、胸苷、去氧胞苷或去氧鳥苷。
(頭段) 在本發明中，所謂頭段，係意味用於製造DEL等化合物資料庫之起始化合物。本發明之頭段的結構在達成本發明之目的之前提下並未受到限定，作為最典型的態樣，係具有可連結建構組元之至少1個部位，及可連結寡核苷酸標籤之至少1個部位，並進一步在結構中包含至少一個能夠選擇性地切割之部位。 如後述，DNA標籤較佳為雙股寡核苷酸鏈，可連結寡核苷酸標籤之部位較佳為2個。
作為一態樣，頭段為下述模式圖所示之化合物。
作為一態樣，頭段較理想為化學上安定。 此外，作為一態樣，頭段較佳為可在適切的空間配置DNA標籤及建構組元之結構。 作為一態樣，頭段較佳係具有適度的可撓性。 在此處，進一步針對適度的空間配置或可撓性(頭段的結構特性)進行說明。另外，在此處所說明之頭段的結構特性可藉由頭段單質來達成，亦可藉由使頭段與2官能性間隔子進行結合而達成。 作為一態樣，較佳頭段的結構特性為頭段或DNA標籤不會阻礙建構組元的形成反應，反之，頭段或建構組元不會阻礙DNA標籤的伸長反應之結構特性。 作為一態樣，較佳頭段的結構特性為對於建構組元化合物(資料庫化合物)與目標物(標的蛋白質等)之相互作用，頭段或DNA標籤部分不會帶來影響之結構特性。 作為一態樣，較佳頭段的結構特性為將DNA標籤與建構組元部位朝相反側(例如90度以上相反側)進行配向之結構特性。 作為一態樣，較佳頭段的結構特性為將頭段的環部位與建構組元以有機化合物的骨架換算分隔數個原子至十數個原子之結構特性。 作為一態樣，頭段較佳係與DNA標籤部分、建構組元部分具有適度的親和性。所謂適度的親和性，係意味例如為了實施本發明，可在所期望的條件下形成、維持、切割結合之化學反應性及安定性。 另外，在本發明中，所謂2官能性間隔子，係意味具有能夠進行建構組元部位與頭段之結合之至少2個反應基之間隔子部分。
在本發明的說明中，「頭段」、「頭段化合物」、「用於頭段之化合物」之用語為表示同概念的化合物之用語。 在本發明的說明中，「用作頭段之化合物」若從使用之觀點而言，可在本質上同樣地理解為「作為化合物的頭段之使用」，若從方法之觀點而言，可在本質上同樣地理解為「將化合物用作頭段之方法」。針對化合物資料庫亦相同。
以下，對較佳頭段的結構進行說明，頭段的結構在達成本發明的效果之前提下並無限定。
作為一態樣，頭段係由下列者所構成： (D)具有可與建構組元直接進行連結，或者經由2官能性間隔子間接地進行連結之至少1個部位之反應性官能基， (L)從反應性官能基伸長之連結子， (E)具有可與寡核苷酸標籤中之一條鏈進行連結之1個結合部位之第1寡核苷酸鏈， (F)具有可與寡核苷酸標籤中之另一條鏈進行連結之1個結合部位之第2寡核苷酸鏈，以及 (LP)結合至前述連結子及2個寡核苷酸鏈之環部位， 在E、F或LP中之至少任1個部位，具有至少1個能夠選擇性地切割之部位。
作為一態樣，頭段為下列式(I)所示之化合物。 (式中，E及F各自獨立地為由核苷酸或核酸類似物所構成之寡聚物， 惟，E及F包含彼此互補的鹼基序列，形成雙鏈寡核苷酸， LP為環部位， L為連結子， D為反應性官能基) 所示之化合物， 在E、F或LP中之至少任1個部位，具有至少1個能夠選擇性地切割之部位化合物。
另外，在本發明中，有時將環部位中之與連結子進行結合之部位的部分結構稱為連結部位或(LS)。 此外，在本發明中，有時將E-LP-F合併稱為髮夾部位。
(第1及第2寡核苷酸鏈) 以下，針對第1寡核苷酸鏈(E)及第2寡核苷酸鏈(F)的較佳態樣進行說明。
第1寡核苷酸鏈(E)及第2寡核苷酸鏈(F)較佳係經由環部位(LP)在分子內形成雙鏈，頭段形成髮夾結構。就在分子內形成雙鏈而言，所謂較佳鏈長，係3個鹼基以上，更佳為4個鹼基以上，再佳為6個鹼基以上。 作為一態樣，E及F的鏈長各自為3至40。 作為一態樣，E及F的鏈長各自為4至40。 作為一態樣，E及F的鏈長各自為6至25。
可連結寡核苷酸標籤之部位較佳為適於酵素接合或化學接合之結構。作為一態樣，頭段與寡核苷酸標籤之連結係藉由使用酵素之雙股接合來實施。在該情況，第1及第2寡核苷酸鏈較佳係形成用於接合之突出末端。前述該突出末端的鏈長較佳為2個鹼基以上，更佳為2至10個鹼基，再佳為2至5個鹼基。從而，第1及第2寡核苷酸鏈中之一者較佳係比另一條鏈長出突出末端的鏈長份。此外，為了進行經由DNA連接酶之接合，第1及第2寡核苷酸鏈中之具有頭段的5’末端之鏈的5’末端較佳係被磷酸化。
此外，第1及第2寡核苷酸鏈亦可包含用於PCR之引子結合序列的一部分或全部。作為引子結合序列適切的鏈長為17至25個鹼基。
(連結子) 以下，針對連結子(L)的較佳態樣進行說明。 連結子係如前述，為從反應性官能基伸長，與連結部位進行結合之部位。典型地，連結子為源自於以下態樣之2價基(-L-)。
作為一態樣，連結子為以下態樣(L1)。 (L1)可具有取代基且可經1~3個雜原子置換之C1~20脂肪族烴，或(2)可具有取代基之C6~14芳香族烴。
作為其他態樣，L為以下態樣(L2)、(L3)、(L4)或(L5)。 (L2) 可具有取代基之C1~6脂肪族烴，可經1或2個氧原子置換之C1~6脂肪族烴，或可具有取代基之C6~10芳香族烴。 (L3) 可經取代基群組ST1取代之C1~6脂肪族烴，或可經取代基群組ST1取代之苯。在此處，取代基群組ST1為由C1~6烷基、C1~6烷氧基、氟原子及氯原子所構成之群組。惟，在取代基群組ST1對脂肪族烴進行取代之情況，不從取代基群組ST1中選出烷基。 (L4) C1~6烷基，或未經取代或者經1個或2個C1~3烷基或C1~3烷氧基取代之苯。 (L5) C1~6烷基。
(反應性官能基) 以下，針對反應性官能基(D)的較佳態樣進行說明。 反應性官能基係如前述，為具有可與建構組元直接進行連結，或者經由2官能性間隔子間接地進行連結之至少1個部位，並與連結子基進行結合之部位。典型地，反應性官能基在頭段中成為一價基(D-)，在DEL中成為基於前述(D-)之「源自反應性官能基之2價基」(-D-)。 例如，在D為胺基之情況，(D-)的具體結構為(R-HN-)(R為以下所說明之取代基)。例如，與活化羧基、反應性磺醯基或異氰酸酯基進行反應，分別形成醯胺鍵、磺醯胺鍵或脲鍵。此時，(-D-)的具體結構成為(-NR-)。 R在達成本發明的效果之前提下並無限定，在以下(D1)~(D5)的態樣中，R較佳為(1)氫原子，或(2)未經取代或經從C1~6烷氧基、氟原子及氯原子所組成之取代基群組中單獨地或不同地選出之1~3個取代基取代之C1~6烷基。 R更佳為氫原子或C1~3烷基，再佳為氫原子。 此外，例如在(D-)為具有脫離基(X-)之亞甲基之情況，(D-)的具體結構為(X-CH 2-)，例如與胺基、羥基或硫醇基之類的親核試劑進行反應，形成碳-氮鍵、碳-氧鍵或碳-硫鍵。此時，(-D-)的具體結構成為(-CH 2-)。此外，例如在(D-)為醛基之情況，(D-)的具體結構為(HOC-)。醛基係藉由例如與胺基之還原性胺基化反應而形成碳-氮鍵，此時，(-D-)成為-CH 2-，藉由例如與磷葉立德基(phosphorous ylide)之反應而形成碳-碳雙鍵，此時，(-D-)成為-CH=，藉由例如與α-重氮膦酸酯基進行反應而形成碳-碳三鍵，此時，(-D-)成為-C≡。
作為一態樣，部位(D-)為以下態樣(D1)。 (D1) 可構成C-C、胺基、醚、羰基、醯胺、酯、脲、硫醚、二硫醚、亞碸、磺醯胺或磺醯鍵之官能基。 (如字義，在此情況，(-D-)成為C-C、胺基、醚、羰基、醯胺、酯、脲、硫醚、二硫醚、亞碸、磺醯胺或磺醯鍵。)
作為其他態樣，(D-)為以下態樣(D2)、(D3)、(D4)或(D5)。 (D2) 具有脫離基之C1烴、胺基、羥基、羰基的前驅物、硫醇基或醛基。 另外，在此情況，(-D-)可成為-(C1烴)-、-NR-、 -O-、-(C=O)-、-S-、-CH 2-、-CH=或-C≡等。 (D3) 具有鹵素原子之C1烴、具有磺酸系脫離基之C1烴、胺基、羥基、羧基、鹵化羧基、硫醇基或醛基。 另外，在此情況，(-D-)可成為-(C1烴)-、-NR-、    -O-、-(C=O)-、-S-、-CH 2-、-CH=或-C≡等。 (D4) -CH 2Cl、-CH 2Br、-CH 2OSO 2CH 3、-CH 2OSO 2CF 3、胺基、羥基或羧基。 另外，在此情況，(-D-)分別成為-CH 2-、-NR-、-O-或-(C=O)-。 (D5) 一級胺基。 另外，在此情況，(-D-)成為-NH-。
以下，針對環部位(LP)的較佳態樣進行說明。 環部位(LP)較佳係以第1寡核苷酸鏈(E)及第2寡核苷酸鏈(F)在分子內形成雙鏈，頭段能夠形成髮夾結構之方式進行設計。即，環部位(LP)較佳係具有環結構在熱力學上安定之鏈長及結合的柔軟性。 從而，作為一態樣，環部位(LP)為下列者。 LP為(LP1)p-LS-(LP2)q所示之環部位， LS為從以下(A)至(C)所記載之化合物群組中選出之部分結構： (A)核苷酸， (B)核酸類似物， (C)可具有取代基之C1~14的3價基； LP1為從以下(1)及(2)所記載之化合物群組中單獨地或不同地選出p個之各部分結構： (1)核苷酸， (2)核酸類似物； LP2為從以下(1)及(2)所記載之化合物群組中單獨地或不同地選出q個之各部分結構： (1)核苷酸， (2)核酸類似物； p及q的總數為0~40。
環部位的更佳態樣係如前述說明。 以下，進一步針對環部位的結構進行補充。
在此處，核苷酸為前述說明之天然核苷酸，核酸類似物係如前述說明。
在此處，LP1為從以下(1)及(2)所記載之化合物群組中單獨地或不同地選出p個之各部分結構，LP2為從以下(1)及(2)所記載之化合物群組中單獨地或不同地選出q個之各部分結構。 (1)核苷酸 (2)核酸類似物 所謂單獨地或不同地選出p個，例如，在p為4之情況，LP1可從諸如AATG、ATCG、TC(d-Spacer)G或A(d-Spacer)(d-Spacer)C之(1)及(2)所記載之化合物群組中單獨地或不同地選出。LP2亦相同。
此外，環部位亦可包含用於PCR之引子結合序列的一部分或全部。
(針對LS) 作為一態樣，LS為(A)核苷酸或(B)核酸類似物。 在LS為(A)核苷酸或(B)核酸類似物之情況，環部位成為核酸寡聚物。本發明之所謂核酸寡聚物，係以核苷酸或核酸類似物作為單體進行連結而得之寡聚物。寡聚物亦可稱為鏈狀化合物。 從而，本發明之所謂核酸寡聚物，為寡核苷酸鏈、核酸類似物鏈或核苷酸與核酸類似物之混合鏈中之任一者。
在LS為(A)核苷酸或(B)核酸類似物之情況，環部位成為核酸寡聚物。在該情況，頭段可藉由核酸合成機予以製造，實務上顯著地較佳。
在LS為(A)核苷酸或(B)核酸類似物之情況，在頭段的製造中，作為一態樣，可調製連結子部位(L)及反應性官能基部位(D)與LS進行結合而得之核酸合成用單體，然後合成核酸寡聚物。 作為該種核酸合成單體之例，可列舉前述Amino C6 dT、mdC(TEG-Amino)、Uni-Link(註冊商標)Amino Modifier等。 在此態樣之情況，例如屬於該單體之mdC(TEG-Amino)的結構中之核苷酸部分係相當於連結部位(LS)，從鹼基伸長之側鏈部分係相當於連結子部位(L)及反應性官能基部位(D)。 在調製中，反應性官能基(D)亦可經保護基所保護。
在該情況，作為一態樣，核酸類似物為以下化合物(B6)。 (B6)在核苷酸的鹼基部結合有前述(-L-D)之化合物。
作為一態樣，核酸類似物為以下化合物(B61)、(B62)、(B63)、(B64)或(B65)。 (B61)(-L-D)為(-L1-D1)之(B6) (B62)(-L-D)為(-L2-D2)之(B6)。 (B63)(-L-D)為(-L3-D3)之(B6)。 (B64)(-L-D)為(-L4-D4)之(B6)。 (B65)(-D)為(-D5)之(B61)~(B64)中任一項所記載之化合物。
在LS為(A)核苷酸或(B)核酸類似物之情況，在頭段的製造中，作為一態樣，可先合成核酸寡聚物，然後使前述連結子部位(L)及反應性官能基部位(D)進行結合。 在該情況，較佳係將連結子部位所結合之對象的「特定的核酸類似物」作為連結部位(LS)預先置入髮夾部位(核酸類似物寡聚物)之中。作為該「特定的核酸類似物」之例，可列舉前述Amino C6 dT、mdC(TEG-Amino)、Uni-Link(註冊商標)Amino Modifier。 在此態樣之情況，例如mdC(TEG-Amino)本身係相當於連結部位(LS)，從鹼基側鏈起進一步進行結合之附加部位係相當於連結子部位(L)及反應性官能基部位(D)。
(針對p及q) 如前述，前述環部位的鏈長較佳為第1寡核苷酸鏈(E)及第2寡核苷酸鏈(F)在分子內形成雙股，且頭段形成髮夾結構之鏈長。 作為一態樣，p及q的總數為1~40。 作為一態樣，p及q的總數為2~20。 作為一態樣，p及q的總數為2~10。 作為一態樣，p及q的總數為2~7。
作為一態樣，本發明之環部位係由下列者所構成： (A)核苷酸，及 以下核酸類似物(B41)、(B42)、(B43)，(B44)或(B52)。 (B41)d-Spacer (B42)Amino C6 dT (B43)mdC(TEG-Amino) (B44)Uni-Link(註冊商標)Amino Modifier (B52)三乙二醇磷酸酯
作為一態樣，LS較佳為B42、B43或B44。 作為又一態樣，LP1及LP2較佳為A、B41或B52。
作為一態樣，環部位為以下(X1)至(X9)所記載之序列所得之核酸寡聚物。 (X1)A-B41-B42-B41-A (X2)A-B41-B43-B41-A (X3)A-B41-B44-B41-A (X4)B41-B41-B42-B41-B41 (X5)B41-B41-B43-B41-B41 (X6)B41-B41-B44-B41-B41 (X7)B52-B42-B52 (X8)B52-B43-B52 (X9)A52-A44-A52
在前述頭段中，能夠切割之部位的數量較佳為5個以內，更佳為1至2個。
在前述頭段中，在能夠切割之部位為2個以上之情況，較佳係至少1個能夠切割之部位在第1寡核苷酸鏈中，或者在第1寡核苷酸鏈與連結子結合部位之間，且至少1個能夠切割之部位在第2寡核苷酸鏈中，或者在第2寡核苷酸鏈與連結子結合部位之間。
作為一態樣，在前述頭段中，能夠切割之部位的位置以環部位與第1寡核苷酸鏈或第2寡核苷酸鏈之結合部分作為起點，較佳為20個鹼基以內，更佳為10個鹼基以內，再佳為3個鹼基以內。
作為一面向，本發明係提供將在DNA鏈中包含能夠切割之部位之DEL衍生成交聯劑修飾雙股DEL並進行評價之方法中之適切的條件。 作為一態樣，在前述頭段中，能夠切割之部位的位置以環部位與第1寡核苷酸鏈或第2寡核苷酸鏈之結合部分作為起點，存在於3’方向，較佳為20個鹼基以內，更佳為10個鹼基以內，再佳為3個鹼基以內，最佳為1個鹼基以內。
為了慎重起見而說明，「能夠選擇性地切割之部位」的較佳態樣與例如E、F或LP等的較佳態樣各自為不同的概念。即，即便是「能夠選擇性地切割之部位」的位置包含在E中之情況，E的較佳態樣亦不適用於「能夠選擇性地切割之部位」。
作為一態樣，構成本發明之DEL之化合物為下列式(II)所示之化合物。 (式中， X及Y為寡核苷酸鏈， E及F各自獨立地為由核苷酸或核酸類似物所構成之寡聚物， 惟，E及F包含彼此互補的鹼基序列，形成雙鏈寡核苷酸， LP為環部位， L為連結子， D為源自反應性官能基之2價基， Sp為鍵結或2官能性間隔子， An為由至少1個建構組元所構成之部分結構) 所示之化合物， X與Y具有至少一部分可形成雙鏈之序列， X以5’末端結合至E， Y以3’末端結合至F， 在E、F或LP中之至少任1個部位，具有至少1個能夠選擇性地切割之部位化合物。
作為一態樣，前述式(II)所示之化合物中之E、F、LP、L及D的較佳態樣係與關於前述式(I)所說明之E、F、LP、L及D的較佳態樣相同。 X、Y、Sp及An的較佳態樣係另行說明。
(2官能性間隔子) 如前述，2官能性間隔子為具有能夠進行化合物資料庫的部分結構An與頭段之結合之至少2個反應基之間隔子部分。作為一態樣，2官能性間隔子為SpD-SpL-SpX。 SpX為與頭段的反應性官能基形成共價鍵之反應基。 SpD為與化合物資料庫的部分結構An形成共價鍵之反應基。 SpL為化學上惰性的間隔部分。 另外，與反應性官能基(D)同樣地，反應基(SpX)在2官能性間隔子單質(與頭段進行結合前之試劑的狀態)中成為一價基(-SpX)，在DEL(與頭段進行結合之狀態)中成為基於前述(-SpX)之「源自反應基之2價基」(-SpX-)。 此外，同樣地，反應基(SpD)在與An進行結合前之狀態下成為一價基(SpD-)，在DEL(與An進行結合之狀態)中成為基於前述(SpD-)之「源自反應基之2價基」(-SpD-)。
SpX的較佳態樣為形成胺基、羰基、醯胺、酯、脲或磺醯胺鍵之反應性基。作為一態樣，SpX為以下(SpX1)、(SpX2)或(SpX3)的結構，其係適於頭段的反應性官能基為胺基之情況之反應性基。 (SpX1)：羧基、鹵化羧基、醛基或鹵化磺醯基 (SpX2)：羧基或鹵化磺醯基 (SpX3)：羧基
SpD的較佳態樣係與前述D相同。 作為一態樣，SpD為前述(D1)、(D2)、(D3)、(D4)或(D5)。
SpL的較佳態樣為下述態樣。 作為一態樣，SpL為前述(L1)、(L2)、(L3)、(L4)或(L5)。 作為一態樣，SpL為以下(SpL1)、(SpL2)或(SpL3)。 (SpL1)聚烷二醇、聚乙烯、可任意地經雜原子置換之C1~20脂肪族烴、胜肽、寡核苷酸或此等之組合。 (SpL2)聚烷二醇、聚乙烯、C1~10脂肪族烴或胜肽 (SpL3)聚乙二醇或聚乙烯
作為一態樣，2官能性間隔子係如下。 (Sp1)：(D4)-(SpL1)-(SpX1) (Sp2)：(D4)-(SpL2)-(SpX2) (Sp3)：(D4)-(SpL3)-(SpX3) (Sp4)：(D5)-(SpL1)-(SpX1) (Sp5)：(D5)-(SpL2)-(SpX2) (Sp6)：(D5)-(SpL3)-(SpX3)
作為一態樣，構成DEL之化合物的(Sp-D-L)部分係如以下(SpDL1)、(SpDL2)、(SpDL3)(SpDL4)、(SpDL5)、(SpDL6)、(SpDL7)、(SpDL8)、(SpDL9)或(SpDL10)般所構成。 (SpDL1)：(D4)-(L1) (SpDL2)：(D5)-(L1) (SpDL3)：(D4)-(L2) (SpDL4)：(D5)-(L2) (SpDL5)：(Sp1)-(D5)-(L5) (SpDL6)：(Sp2)-(D5)-(L5) (SpDL7)：(Sp3)-(D5)-(L5) (SpDL8)：(Sp4)-(D5)-(L5) (SpDL9)：(Sp5)-(D5)-(L5) (SpDL10)：(Sp6)-(D5)-(L5) 另外，在(SpDL1)、(SpDL2)、(SpDL3)、(SpDL4)中，Sp係意味鍵結。
在本發明的實施中，若頭段可藉由核酸合成裝置予以合成，則實屬有利。在該實施中，係如前述，作為一態樣，可調製連結子部位(L)及反應性官能基部位(D)與LS進行結合而得之核酸合成用單體，然後合成核酸寡聚物。作為該種核酸合成單體之例，可列舉前述Amino C6 dT、mdC(TEG-Amino)、Uni-Link(註冊商標)Amino Modifier等。 另一方面，在使用如上述之市售的核酸合成單體或能夠在核酸合成機中使用之核酸類似物之情況，會有連結子部位的長度受到限制之可能性。在該種情況，作為一態樣，能夠藉由導入適切的2官能性間隔子而調整頭段與An之距離，在發明的實施中實屬有利。
在本發明的說明中，「C1~C6的烷基」或「C1~6烷基」之用語中之所謂「C1~C6的」或「C1~6」，係意味碳數為1至6個。同樣地，在m、n為整數之情況，在記載有「Cm~Cn的」或「Cm~n」之情況，該記載係意味碳數為m~n個。從而，所謂「C1~C6的烷基」或「C1~6烷基」，係意味碳數為1至6個之烷基，所謂「C1~C6的伸烷基」或「C1~6伸烷基」，係意味碳數為1至6個之伸烷基。
在本發明中，所謂「C1~6烷基」，係意味碳原子數為1至6個之直鏈或分枝鏈狀的烷基。作為具體例，可列舉甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、戊基、己基等。
在本發明中，所謂「C1~3烷基」，係意味碳原子數為1至3個之直鏈或分枝鏈狀的烷基。具體例為甲基、乙基、丙基、異丙基。
在本發明中，所謂「C1~6烷氧基」，係意味碳原子數為1至6個之直鏈或分枝鏈狀的烷氧基。作為具體例，可列舉甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、戊氧基、己氧基等。
在本發明中，所謂「C1~3烷氧基」，係意味碳原子數為1至3個之直鏈或分枝鏈狀的烷氧基。具體例為甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基。
在本發明中，所謂「烴」，係意味僅由碳原子及氫原子所構成之鏈狀、分枝鏈狀或環狀的飽和或不飽和化合物。
在本發明中，所謂「脂肪族烴」，係意味烴中之非芳香族者。「脂肪族烴」可為鏈狀、分枝鏈狀或環狀，此外，亦可為飽和或不飽和。作為結構的具體例，可列舉烷基、烯基、炔基、環烷基或環烯基，或者此等之組合所得之結構。 在本發明中，所謂「C1~20脂肪族烴」，係意味碳原子數為1至20個之脂肪族烴。 在本發明中，所謂「C1~10脂肪族烴」，係意味碳原子數為1至10個之脂肪族烴。 在本發明中，所謂「C1~6脂肪族烴」，係意味碳原子數為1至6個之脂肪族烴。
在本發明中，所謂「芳香族烴」，係意味烴中之芳香族者。 在本發明中，所謂「C6~14芳香族烴」，係意味碳原子數為6至14個之芳香族烴。作為具體例，可列舉苯、萘、蒽。 在本發明中，所謂「C6~10芳香族烴」，係意味碳原子數為6至10個之芳香族烴。具體例為苯或萘。
本發明之芳香族雜環為在環結構內具有從氮、氧及硫所組成之群組中單獨地或不同地選出之元素作為雜原子之芳香族的雜環。 作為一態樣，芳香族雜環為具有1~9個碳原子之「C1~9芳香族雜環」，作為一態樣，「C1~9芳香族雜環」為「5~10員芳香族雜環」。 作為一態樣，芳香族雜環為具有1~5個碳原子之「C1~5芳香族雜環」，作為一態樣，「C1~5芳香族雜環」為「5~6員芳香族雜環」。 作為一態樣，芳香族雜環為具有2~9個碳原子之「C2~9芳香族雜環」，作為一態樣，「C2~9芳香族雜環」為「5~10員芳香族雜環」。 作為一態樣，芳香族雜環為具有2~5個碳原子之「C2~5芳香族雜環」，作為一態樣，「C2~5芳香族雜環」為「5~6員芳香族雜環」。
本發明之含氮芳香族雜環為在環結構內具有氮作為雜原子之芳香族的雜環。 作為一態樣，含氮芳香族雜環為具有1~5個碳原子之「C1~5含氮芳香族雜環」，作為一態樣，「C1~5含氮芳香族雜環」為「5~6員芳香族雜環」。 作為一態樣，含氮芳香族雜環為具有2~5個碳原子之「C2~5含氮芳香族雜環」，作為一態樣，「C2~5含氮芳香族雜環」為「5~6員芳香族雜環」。
本發明之非芳香族雜環為在環結構內具有從氮、氧及硫所組成之群組中單獨地或不同地選出之元素作為雜原子之非芳香族的雜環。 非芳香族雜環亦可包含部分不飽和鍵。 作為一態樣，非芳香族雜環為具有2~9個碳原子之「C2~9非芳香族雜環」，作為一態樣，「C2~9非芳香族雜環」為「5~10員非芳香族雜環」。
在本發明中，所謂「C1~14的3價基」，係意味源自於碳原子數為1至14個之化合物之3價基。在達成本發明的效果之前提下，結構並無限定。
在本發明中，在記載有「可經雜原子置換」之情況，所謂雜原子，係意味碳及氫以外之原子。 該雜原子較佳為氧原子、氮原子、矽原子、磷原子或硫原子，更佳為氧原子、氮原子或硫原子。 從而，例如，若列舉丙基(-CH 2-CH 2-CH 3)作為烴之例，則所謂「可經雜原子置換之丙基」，係含有烷基中之亞甲基(-CH 2-)置換成氧而得之醚((-CH 2-O-CH 3)或(-O-CH 2-CH 3))或者置換成氮而得之胺((-CH 2-NH-CH 3)或(-NH-CH 2-CH 3))等結構之概念。
在本發明中，在記載有「可具有取代基」之情況，該取代基在達成本發明之目的之前提下並無限定。 該取代基較佳為C1~6烷基，C1~6烷氧基、胺基、羥基、硝基、氰基、側氧基或鹵素原子。 該取代基更佳為C1~6烷基、C1~6烷氧基、氟原子或氯原子。
在本發明中，所謂多肽及胜肽，係意味胺基酸進行連接所形成之化合物或部分結構。所謂胺基酸，係持有胺基及羧基兩種官能基之有機化合物的總稱。構成本發明之多肽及胜肽之胺基酸並無特別限定，包含修飾胺基酸等。依照生命科學領域中之一般用法，在本發明中，脯胺酸(被分類成亞胺基酸)亦包含在胺基酸中。構成本發明之多肽及胜肽之胺基酸較佳為α胺基酸，更佳為「構成蛋白質之胺基酸」。
本發明之鹵素原子可列舉氟原子、氯原子、溴原子及碘原子。
所謂C-C、胺基、醚、羰基、醯胺、酯、脲、硫醚、二硫醚、亞碸、磺醯胺及磺醯鍵，係具有可由各自的名稱加以理解之化學結構之化學鍵結。熟習該項技術者將理解，例如，醚鍵為一般可以“-O-”表達之鍵結，羰基鍵為一般可以“-C(=O)-”表達之鍵結。胺基、醯胺及脲鍵在氮原子上具有氫原子或其他取代基，在具有本發明的效果之前提下，氮原子上之結構並無限定。前述氮原子上之取代基較佳為C1~6烷基或氫原子，更佳為氫原子。此外，無須多言，所謂C-C鍵，係意味碳-碳鍵。在C-C鍵中，包含單鍵、雙鍵及三鍵。作為一態樣，在本發明之製造方法的步驟a及/或c中，係構築從上述11種中適宜選出之鍵結。此等11種鍵結為有機化學中之特別基本的結合樣式，用於構築該等之反應亦屬熟習該項技術者所周知。從而，在設計/構築本發明之化合物資料庫的部分結構An時，只要是熟習該項技術者，即可適宜組合使用此等11種結合。
所謂由從H、B、C、N、O、Si、P、S、F、Cl、Br及I所組成之元素群組單獨地或不同地選出之元素所構成之有機化合物，係由前述12種元素的結合所構築之有機化合物。
作為一態樣，本發明之化合物資料庫的部分結構An係由上述12種元素所構築。此等12種元素為有機化合物中之特別基本的元素，用於構築該等之反應亦屬熟習該項技術者所周知。從而，在設計/構築本發明之化合物資料庫的部分結構An時，只要是熟習該項技術者，即可適宜組合使用此等12種元素。
所謂具有從芳基、非芳香族環基、雜芳基及非芳香族雜環基所組成之取代基群組單獨地或不同地選出之取代基之低分子有機化合物，係具有可由各自的名稱加以理解之化學結構之低分子有機化合物。低分子化合物屬熟習該項技術者所周知的概念，本發明中之低分子化合物的較佳分子量之例係另行描述。
本發明之芳基較佳為C6~10芳基，更佳為苯基。
本發明之非芳香族環基較佳為5員至8員非芳香族環基，更佳為5員或6員非芳香族環基。該非芳香族環基亦可包含部分不飽和鍵。
本發明之雜芳基及非芳香族雜環基為在環結構內具有從氮、氧及硫所組成之群組中單獨地或不同地選出之元素作為雜原子之基。本發明之雜芳基、非芳香族雜環基較佳為5員至8員之基，更佳為5員或6員之基，非芳香族雜環基亦可包含部分不飽和鍵。
作為一態樣，本發明之化合物資料庫的部分結構An具有上述4種基。此等4種基為有機化合物中之特別基本的部分結構，用於將該等構築於化合物中之反應亦屬熟習該項技術者所周知。從而，在設計/構築本發明之化合物資料庫的部分結構An時，只要是熟習該項技術者，即可適宜組合此等4種基。
前述較佳態樣，即，由11種鍵結、12種元素及/或4種基所構築之化合物資料庫具有特別的核心價值。從而，熟習該項技術者將理解，排除此等較佳態樣所構築而得之化合物資料庫一般而言用途受到限定，在多數情況，商業價值亦受到限定。
所謂An的合成履歷，係意味直至合成出An為止所施行之所有操作的記錄，特定而言，係意味直至合成出An為止所使用之建構組元的結構及其順序。例如，在於2個以上個別的反應容器中，藉由各自不同的建構組元的使用及/或不同的反應條件實行反應之情況，係在反應之前或之後，使預先決定之序列的寡核苷酸鏈連結至各反應容器中之生成物，藉此作為寡核苷酸的序列情報賦予合成履歷。在直至構築出An為止之間重複施行此種操作，藉此構築具有An的合成履歷之Bn的寡核苷酸。
所謂拆分及合併合成，係Geisen等人在組合化學的創建期作為利用固相合成法之胜肽資料庫的組合化學構築法所開發而得之合成法。拆分及合併合成亦稱為拆分/混合法等。
依照上述原委，若以利用固相合成法之胜肽資料庫的合成為例進行說明，則在拆分及合併合成中，並不在胜肽增端的每一階段從使胺基酸進行胜肽結合而得之固相擔體切出樣品，而是一旦使N種擔體混合均一化後，加以等分並使接下來的N種胺基酸進行增端。
即，每一擔體將會生成1種胜肽鏈，只要在各階段應用所有20種天然胺基酸，便將會構築針對特定長度的胜肽而言所有能夠組合之胜肽資料庫。
若此胜肽資料庫係以抗原提示或受體結合進行篩選，只要利用ELISA法等，即可利用固相擔體上之胜肽來實施檢驗。亦即，並不需要從擔體切出試料的胜肽，而是在檢驗中挑出已進行反應之擔體粒子(例如以光學顯微鏡挑出0.1mm程度的經螢光標識之擔體粒子)。又，可藉由機器分析裝置(胜肽分析儀等)對該粒子的胜肽決定目標胜肽序列，或者藉由其他組合化學鑑定方法(例如標籤法)等間接地決定成為篩選的候補之胜肽序列。
再者，以在本發明之製造方法中，m為2時，以拆分及合併合成來合成v種結構，在m為3之情況，合成w種結構之情況為例進行說明。另外，在本說明中，係以(c)(d)的順序重複步驟。 (m=2) m=2的步驟係對A1-Sp-C-B1，分別在步驟(c)中附加α2，在步驟(d)中附加β2，製造A2-Sp-C-B2。 在此處，準備v種結構的α2(α2(a-v))及其所對應之v種β2(β2(a-v))，若針對各結構各自施行步驟(c)(d)，則可獲得v種A2-Sp-C-B2(A2(a)-Sp-C-B2(a)、A2(b)-Sp-C-B2(b)...A2(v)-Sp-C-B2(v)：即A2(a-v)-Sp-C-B2(a-v))。在拆分及合併合成中，將v種A2-Sp-C-B2進行混合之後，分割成w個。所謂分割，最具體而言係意味細分成w個反應容器。 (m=3) m=3的步驟係對A2-Sp-C-B2，分別在步驟(c)中附加α3，在步驟(d)中附加β3，製造A3-Sp-C-B3。 在此處，準備w種結構的α3(α3(a-w))及其所對應之w種β3(β2(a-w))，各自對w個(A2(a-v)-Sp-C-B2(a-v)混合物)實施步驟(c)(d)。於是，便可通過n=2及3的步驟，在(v+w)次合成中效率佳地合成(v×w)種A3-Sp-C-B3。
(生物評價) 若將所獲得之w個生成物進行混合，則可獲得(v×w)種A3-Sp-C-B3化合物資料庫的混合物。例如，只要對此混合物施行藥物受體的結合試驗，即可1次施行(v×w)種化合物的篩選。藉由洗掉未結合至藥物受體之化合物，便可僅單離出已結合之化合物。在如本發明之DEL中，將所單離出之A3-Sp-C-B3化合物的DNA增幅至能夠解讀序列之量，藉由其序列情報便可掌握A3的結構。
另外，化合物資料庫、建構組元、拆分及合併等屬組合化學等領域中熟習該項技術者所周知之用語，可將以下文獻等當作參考而適時施行。 (1)高橋孝志、土井隆行「Combinatorial Chemistry」，有機合成化學協會誌，2002年，第60卷，第426-433頁 (2)Combinatorial Chemistry研究會編，「Combinatorial Chemistry」，化學同人
所謂DNA編碼化資料庫(或DEL)，係由DNA或具有與DNA實質上同等的機能之寡核苷酸所標識而得之化合物(DNA編碼化化合物)的群組所組成之化合物資料庫。藉由如上述所記載之拆分及合併合成，在標識DNA上被賦予各化合物的結構或合成履歷作為序列情報。由於此種特性，DNA編碼化資料庫係以10 2~10 20種化合物的混合物的形態進行篩選，藉由以該技術領域中所知之手法(例如次世代定序儀的使用及/或微陣列的使用)鑑定所取得之化合物中所包含之DNA序列，便能夠鑑定化合物的結構。作為前述篩選手法的一態樣，可選擇使蛋白質等標的與DNA編碼化資料庫進行接觸並分選出已與標的進行結合之化合物之手法。
所謂「生物學標的」，屬熟習該項技術者所周知的用語，作為一態樣，在本發明中，所謂「生物學標的」，係在以醫農藥為代表之藥劑等的開發中可成為標的之生物學的物質群組，包含例如酵素(例如激酶、磷酸酶、甲基化酶、去甲基化酶、蛋白酶及DNA修復酵素)、蛋白質：蛋白質相互作用相關之蛋白質(例如受體的配位子)、受體標的(例如GPCR)、離子通道、細胞、細菌、病毒、寄生蟲、DNA、RNA、普立昂蛋白(prion)或醣質。 所謂「生物活性評價」，屬熟習該項技術者所周知的用語，作為一態樣，在本發明中，所謂「生物活性評價」，係評價化合物所具有之生物活性(例如與生物學標的之結合能力、酵素活性的阻礙機能、酵素活性的促進機能等)的有無或強弱。作為生物活性評價的具體例，亦可參照前述專利文獻2及3、非專利文獻1~6等。 所謂「機能性評價」，屬熟習該項技術者所周知的用語，作為一態樣，在本發明中，所謂「機能性評價」，係評價化合物所具有之特定的機能(例如結合能力、生物活性、發光特性等)的有無或強弱。
本發明係藉由使用具有能夠切割之部位之DNA鏈，而提供關於DEL及DEL的製造方法具有數個好處之複數種手法。以下詳細地記述樣式1至7。
樣式1 本發明係提供使用前述「具有能夠切割之部位之髮夾型頭段」之DEL。
如圖1所例示，在樣式1中，以包含在DNA鏈中包含能夠切割之部位之第1寡核苷酸鏈、環部位及第2寡核苷酸鏈之頭段作為起始原料，重複進行建構組元的結合及對應於該建構組元之寡核苷酸標籤的雙股接合(在圖1中為3次)，進一步依所期望藉由進行包含引子區域之寡核苷酸標籤的雙股接合，而達成DEL的製造。
如圖2所例示，在樣式1中，對於在頭段的第1寡核苷酸鏈中包含能夠切割之部位之DEL，使用酵素等切割手段切割能夠切割之部位，衍生成未以環部位進行結合之雙股寡核苷酸，藉此可以較高的效率施行PCR。
(針對樣式2) 如圖3所例示，在使用「具有能夠切割之部位之髮夾型頭段」之DEL中，能夠切割之部位亦可存在於第2寡核苷酸鏈。樣式2的特徵係除了能夠切割之部位以外，與樣式1相同。
(針對樣式3) 如圖4所例示，在使用「具有能夠切割之部位之髮夾型頭段」之DEL中，能夠切割之部位亦可存在於第1及第2寡核苷酸鏈兩者。在本態樣中，藉由從寡核苷酸鏈兩者切割環部位，便可期待進一步提升PCR效率。
(針對樣式4) 如圖5所例示，在本發明中，能夠切割之部位亦可存在於第1寡核苷酸鏈(E)及第2寡核苷酸鏈(F)兩者，再者，能夠切割之部位的結構亦可不同。在該種情況，可利用2個(或其以上)能夠切割之部位的特性之差異，控制切割部位。 例如，可使用去氧尿苷作為在第1寡核苷酸鏈(E)之能夠切割之部位，使用去氧肌苷作為在第2寡核苷酸鏈(F)之能夠切割之部位。 在此情況，若使用USER酵素，則可選擇性地切割第1寡核苷酸鏈(E)的去氧尿苷。 另一方面，若使用烷基腺嘌呤DNA醣苷酶及內核酸酶VIII，則可在第2寡核苷酸鏈(F)中，選擇性地切割以去氧肌苷作為起點之切割部位。 如此，藉由依所期望選擇切割部位，便能夠進行更廣泛的DEL的修飾，隨後之評價亦能夠適應更廣泛的手法。
(針對樣式5) 如圖6所例示，在本發明中，在DNA標籤部分(例如寡核苷酸鏈(Y))中亦可具有能夠切割之部位。在DNA標籤的末端附近設置能夠切割之部位，依所期望切割該部位，藉此可生成新的突出末端。 該突出末端可利用作為黏著末端，接合所期望的核酸序列，例如UMIs(特定分子識別序列)等。 生物評價之後，對所選定之DEL化合物如上述般賦予UMIs區域，進行DNA定序，藉此能夠進行已減少PCR所引發之增幅偏差之解析。 如此，在本發明中，藉由在核酸序列中具有能夠選擇性地切割之部位，便可在製造或使用DEL化合物之局面下賦予以往所沒有之性能。
在此處，所謂UMIs(特定分子識別序列)，係藉由賦予至某一樣品中所包含之DNA，而對DNA分子一個一個地給予個別的DNA序列之分子識別子(參照文獻Nature Method，2012年，第9卷，第72-74頁)。藉由在PCR增幅前賦予此種分子識別子，便能夠在對樣品中之具有特定序列之DNA分子數進行定量時，識別出PCR重複(源自同一分子之序列)，並能夠進行已減少PCR增幅偏差之定量。
(針對樣式6) 如圖7所例示，在本發明中，可將能夠切割之部位與修飾基或機能性分子組合使用，例如，能夠調製將髮夾鏈DNA轉換成單股DNA而得之DEL。 依照圖7，係列舉使用在E部分具有能夠切割之部位之頭段之DEL化合物為例。 (步驟A)對於所合成之DEL化合物，接合在3’末端具有能夠除去固相擔持之修飾基(例如生物素)之雙股寡核苷酸鏈。 (步驟B)切割能夠切割之部位。 (步驟C)施加因應於修飾基的機能之處理。例如，在生物素之情況，使用具有生物素親和性之鏈黴親和素珠粒等，選擇性地從系統中除去結合有生物素之寡核苷酸鏈。藉此，能夠取得具有單股DNA之DEL。
在此處，所謂機能性分子，係具有特定的化學或生物學機能(例如溶解性、光反應性、基質特異性反應性、標的蛋白分解誘導特性)之分子，藉由賦予至DEL，便能夠進行因應於機能之DEL的評價或精製。
在此處，所謂生物素，係意味與親和素進行結合之所有生物素類，不僅是維生素B 7，亦包含例如脫硫生物素。
作為一面向，本發明係提供將在DNA鏈中包含能夠切割之部位之DEL衍生成交聯劑修飾雙股DEL並進行評價之方法中之適切的條件。 作為調製將髮夾鏈DNA轉換成單股DNA而得之DEL之另一方法，亦可列舉下列使用核酸外切酶之方法。 (步驟A)將具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型使用例如USER(註冊商標)Enzyme等在切割反應後以切割部位的5’末端被磷酸化之狀態受到切割之酵素進行切割。 (步驟B)藉由例如經由λ核酸外切酶之處理，分解並除去5’末端被磷酸化之另一寡核苷酸鏈。藉此，取得具有單股DNA之DEL(單股DEL)。
上述所取得之單股DEL較佳為朝寡核苷酸鏈的3’方向具有資料庫分子之單股DEL。該單股DEL能夠使用朝5’末端具有交聯劑之交聯劑修飾引子，實施引子伸長反應。藉由本手法，能夠輕易地合成交聯劑與具有編碼序列之寡核苷酸經由共價鍵進行連結之「交聯劑修飾雙股DEL」。
在取得上述朝3’方向具有資料庫分子之單股DEL之情況，成為原料之髮夾型DEL的「能夠選擇性地切割之部位」係存在於從資料庫分子所結合之部位起3’方向。
如圖8所例示，使具有單股DNA之DEL與具有所期望的機能部位之修飾寡核苷酸(例如光反應性交聯劑等交聯劑修飾DNA，或光反應性交聯劑等交聯劑修飾引子)形成雙股，藉此能夠賦予新的機能。 再者，在使用交聯劑修飾引子之情況，亦可將任意地賦予之引子進行伸長，衍生成交聯劑修飾雙股DEL化合物。該種交聯劑修飾雙股DEL化合物在篩選後，會在生物學標的與編碼序列之間形成共價鍵，因而在本發明中實屬有用。
(針對樣式7) 如圖9所例示，在本發明中，可利用能夠切割之部位，導入交聯劑。 依照圖9，係列舉使用在E部分具有能夠切割之部位之頭段之DEL化合物為例。 (步驟A)對於所合成之DEL化合物，切割能夠切割之部位。 (步驟B)賦予具有所期望的機能部位之修飾引子(例如光反應性交聯劑等交聯劑修飾引子)。 (步驟C)將所賦予之引子進行伸長，合成交聯劑修飾雙股DEL化合物。 在DEL評價之情況，交聯劑修飾雙股DEL化合物在建構組元化合物(資料庫低分子化合物)結合至標的蛋白時，可進一步使交聯劑結合至標的蛋白，可顯著地提升檢測感度(參照非專利文獻7、11等)。在評價非常多資料庫化合物之DEL技術的實務上，增強資料庫化合物的親和力、提升檢測感度實屬非常有用。 本發明係提供嶄新且高效率的交聯劑修飾雙股DEL化合物的製造法，非常有用。
作為一面向，本發明係提供將在DNA鏈中包含能夠切割之部位之DEL衍生成交聯劑修飾雙股DEL並進行評價之方法中之適切的條件。 作為一態樣，交聯劑修飾雙股DEL化合物較佳係交聯劑與具有編碼序列之寡核苷酸經由共價鍵進行連結。此種「交聯劑修飾雙股DEL化合物」在篩選後，會在標的與編碼序列之間形成共價鍵，即便為了非特異性結合劑的除去等而在相較於以往而言較強的分離或溶出條件下亦有耐性，實屬非常有用。
(交聯劑) 作為一態樣，在本發明中，所謂「交聯劑」，係意味具有能夠藉由與蛋白質或核酸分子等生物學標的進行反應而形成共價鍵之反應性之反應性基。例如，已知如Thermo Scientific Crosslinking Technical Handbook所揭載之交聯劑。
本發明中所使用之交聯劑較佳為包含至少一個疊氮基、二氮雜環丙烯基、磺醯氟基、重氮基、桂皮醯基或丙烯酸酯之反應性基，更佳為包含至少一個疊氮基、二氮雜環丙烯基或磺醯氟基之反應性基。
作為一態樣，在本發明中，所謂「具有交聯劑」及「交聯劑修飾」，係意味具有包含交聯劑之部分結構作為取代基。
作為一較佳態樣，「交聯劑修飾雙股DEL」、「交聯劑修飾DNA」及「交聯劑修飾引子」係交聯劑分別直接結合至「雙股DEL」、「DNA」及「引子」的5’末端，或者經由2官能性間隔子進行結合。 此時，交聯劑較佳為下列式(AA)~(AE)或(BA)或(BB)中之任一結構。 (式中，＊係意味與「雙股DEL」、「DNA」或「引子」的5’末端，或者與該5’末端進行結合之2官能性間隔子側之結合位置)
作為一較佳態樣，本發明中所使用之交聯劑較佳為光反應性交聯劑。在本發明中，所謂光反應性交聯劑，係意味藉由光照射而變化成反應活性較高的反應性基(例如氮烯及碳烯)並與附近的生物學標的形成共價鍵之反應性基。例如，已知疊氮基及二氮雜環丙烯基，並已知前述式(AA)~(AE)的結構。
此外，作為一較佳態樣，本發明中所使用之交聯劑較佳為包含至少一個磺醯氟基之反應性基。磺醯氟基係例如與生物學標的蛋白中之絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、離胺酸、半胱胺酸及組胺酸等殘基進行反應，形成共價鍵。例如，已知前述式(BA)~(BB)的結構。
在本發明中，交聯劑與生物學標的之交聯反應較佳係在生物學標的所期望的高次結構不會大幅變化之溫度範圍中實施。較佳溫度係例如為4~40℃的範圍。
(交聯劑的2官能性間隔子) 如前述，2官能性間隔子為具有能夠進行化合物資料庫的部分結構An與頭段之結合之至少2個反應基之間隔子部分。 再者，在本發明中，2官能性間隔子為具有能夠進行交聯劑與「雙股DEL」、「DNA」或「引子」之結合之2個反應基之間隔子部分。有時將此態樣的2官能性間隔子稱為「交聯劑的2官能性間隔子」。作為對照，有時將結合至前述的化合物資料庫之2官能性間隔子稱為「化合物資料庫的2官能性間隔子」。 作為一態樣，「交聯劑的2官能性間隔子」的較佳態樣係與前述「化合物資料庫的2官能性間隔子」中之較佳態樣相同。 此外，作為一態樣，「交聯劑的2官能性間隔子」在篩選時，較佳為適於化合物資料庫與生物學標的進行結合時，使交聯劑與生物學標的進行反應之分子鏈長，較佳為與「化合物資料庫的2官能性間隔子」同等的分子鏈長。
(編碼序列) 在本發明中，所謂「編碼序列」，係DEL中所包含之寡核苷酸的序列中，具有能夠鑑定資料庫分子的結構之序列之寡核苷酸的序列部分。
所謂「用於交聯劑修飾之反應基」，只要是可與後述交聯劑單元進行反應之反應基，即無特別限制。 作為一態樣，「用於交聯劑修飾之反應基」為與交聯劑持有反應選擇性之反應基。藉由與交聯劑持有反應選擇性，便可將本發明應用於交聯劑先進行反應並接受結構轉換等無法應用交聯劑之反應條件。即，將具有用於交聯劑修飾之反應基之單元導入本發明之製成中，將無法應用交聯劑之反應條件用於本發明之製成中，然後使其與交聯劑單元進行反應，藉此可將本發明所需之交聯劑導入本發明之交聯劑修飾DEL中。
作為一態樣，「用於交聯劑修飾之反應基」及「與用於交聯劑修飾之反應基成對之反應基」為持有結合反應中之較高的親和性之一對反應基。在分別具有此對之2個化合物進行結合之情況，即便在化合物中有各式各樣的其他官能基，亦會持有較高的選擇性，該對會優先進行反應，形成結合。
作為上述對之例，可列舉點擊反應中之官能基之對。 「點擊反應」屬熟習該項技術者所周知的概念。(參照H. C. Kolb, M. G. Finn & K. B. Sharpless : Angew. Chem. Int. Ed., 40, 2004(2001)等) 作為一態樣，「點擊反應」可理解如下。 「點擊反應」係指具有至少以下特徵之反應：(1)呈現出官能基的正交性(即，官能性部分僅與對該官能性部分互補的反應性部位進行反應，而不與其他反應性部位進行反應)，及(2)所獲得之結合為不可逆的(即，若反應物進行反應而形成生成物，則生成物難以分解成反應物)，或者在某一情況，所獲得之結合可為可逆的(即，在適切的條件下恢復成反應物)。任意選擇性地，「點擊」化學可進一步具有以下一或複數個特徵：(1)立體特異性，(2)未伴隨嚴密的精製、環境控制等之反應條件，(3)能夠輕易地利用之起始材料及試劑，(4)可利用無害的溶媒或完全不利用溶媒來完成，(5)藉由晶出或蒸餾而單離出生成物，(6)生理安定性，(7)熱力學驅動力較大(例如10~20kcal/mol)，(8)單一的反應生成物，及(9)較高的化學產率(例如超過50%)。
作為一態樣，「用於交聯劑修飾之反應基」及「與用於交聯劑修飾之反應基成對之反應基」較佳為用於點擊反應之反應基，更佳為炔基、烯基、疊氮基或四嗪基，再佳為式(CA)~(CL)中之任一者。
在此處，作為「用於交聯劑修飾之反應基」及「與用於交聯劑修飾之反應基成對之反應基」之對，較佳係可列舉針對於炔基之疊氮基、針對於烯基之四嗪基。此等對呈所謂的螺栓與螺帽之關係，能夠相互交換。例如，在將炔基用於「用於交聯劑修飾之反應基」之情況，可使用疊氮基作為「與用於交聯劑修飾之反應基成對之反應基」。該等的選擇屬熟習該項技術者所周知。 作為「用於交聯劑修飾之反應基」及「與用於交聯劑修飾之反應基成對之反應基」的較佳例，可列舉前述(CA)與(CH)、(CB)與(CH)、(CC)與(CH)、(CE)與(CI)、(CE)與(CJ)、(CE)與(CK)、(CE)與(CL)、(CF)與(CI)、(CF)與(CJ)、(CF)與(CK)、(CF)與(CL)、(CG)與(CI)、(CG)與(CJ)、(CG)與(CK)、(CG)與(CL)等。
所謂「交聯劑單元」，只要是具有前述「與用於交聯劑修飾之反應基成對之反應基」及交聯劑之單元，即無特別限制。
作為一態樣，「交聯劑單元」係由「與用於交聯劑修飾之反應基成對之反應基」、「2官能間隔子」及「交聯劑」所構成。「2官能間隔子」的態樣係如前述。
所謂「具有用於交聯劑修飾之反應基之DNA」，只要是具有前述「用於交聯劑修飾之反應基」之化合物，即無特別限制。
作為一態樣，「具有用於交聯劑修飾之反應基之DNA」係由「用於交聯劑修飾之反應基」、「2官能間隔子」及「DNA」所構成。「2官能間隔子」的態樣係如前述。
「具有用於交聯劑修飾之反應基之修飾引子」的態樣可參照前述「交聯劑修飾引子」。惟，將「交聯劑」與「用於交聯劑修飾之反應基」進行替換來加以參照。
以下示出實施例，進一步詳細地說明本發明，但本發明並不限定於此等實施例。 另外，實施例中之各種序列的核酸可例如藉由核酸自動合成機依照常法予以調製。作為核酸自動合成機之例，可列舉nS-8II(GeneDesign公司製)等。此外，在核酸的調製中，亦可利用委託合成或合同實驗室等。作為熟習該項技術者所周知之合同實驗室，可列舉GeneDesign公司或LGC Biosearch Technologies公司等。一般而言，此等合同實驗室係基於保密契約，調製委託者所指定之序列的核酸，交付予委託者。
實施例1 [包含去氧尿苷之髮夾型DEL的部分結構經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應的驗證] 使用核酸自動合成機nS-8II(GeneDesign公司製)調製表1所示之序列的化合物。另外，在表1中之序列標記中，對熟習該項技術者而言顯而易見，各序列單元間係以磷酸二酯鍵進行結合，「A」係意味去氧腺苷，「T」係意味胸苷，「G」係意味去氧鳥苷，「C」係意味去氧胞苷，「(dU)」係意味去氧尿苷，「(p)」係意味磷酸，「(amino-C6-dT)」係意味下列式(1)所示之修飾核酸， 「(amino-NC6-dT)」係意味下列式(2)所示之修飾核酸， 「(dSpacer)」係意味下列式(3)所示之基， 「(aminoC7)」係意味下列式(4)所示之基。 此外，amino-NC6-dT係使用按照(美國化學會誌，1993年，第115卷，第7128-7134貢)所記載之方法所合成而得之下列式(5)的核酸合成試劑進行導入。
表1中，左欄的“No.”表示序列編號，右欄的“Seq.” 表示序列。序列係左側表示5’側，右側表示3’側。此外，與各序列編號(No.)相應之化合物的名稱係如下。 No.1：U-DEL1-sh      No.2：U-DEL2-sh No.3：U-DEL3-sh      No.4：U-DEL4-sh No.5：U-DEL5-HP No.6：U-DEL6-HP No.7：U-DEL7-HP No.8：U-DEL8-HP No.9：U-DEL9-HP No.10：U-DEL10-HP
[表1]
各自調製表1所示之序列的化合物0.1mM水溶液，依以下程序施行經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應的檢討。
在PCR管中加入1μL的表1所示之序列的化合物0.1mM水溶液；10μL的CutSmart(註冊商標)Buffer(New England BioLabs製，目錄編號B7204S)及79μL的去離子水。在溶液中加入10μL的USER(註冊商標)enzyme(New England BioLabs製，目錄編號M5505S)，將所獲得之溶液於37℃開始進行保溫培養。
將各反應溶液開始進行保溫培養後，經過1小時及3小時後，各自取樣20μL。U-DEL1-sh、U-DEL5-HP、U-DEL6-HP、U-DEL7-HP、U-DEL8-HP、U-DEL9-HP及U-DEL10-HP係經過20小時後亦各自取樣20μL。U-DEL8-HP及U-DEL9-HP係進一步於90℃保溫培養1小時後，各自取樣20μL。
取樣而得之溶液中，U-DEL1-sh、U-DEL2-sh、U-DEL3-sh及U-DEL4-sh係在以下所示之分析條件1下施行分析，U-DEL5-HP、U-DEL6-HP、U-DEL7-HP、U-DEL8-HP、U-DEL9-HP及U-DEL10-HP係在以下所示之分析條件2下施行分析。
分析條件1： 裝置：maXis(Bruker製)，UltiMate 3000(Dionex製) 管柱：ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 Column(130Å，1.7μm，2.1×50mm) 管柱溫度：50℃ 溶媒： A液：水(0.75%v/v六氟異丙醇；0.038%v/v三乙基胺；5μM乙二胺四醋酸) B液：90%v/v甲醇水溶液(0.75%v/v六氟異丙醇；0.038%v/v三乙基胺；5μM乙二胺四醋酸) 梯度條件： 流速0.36mL/min，將A液與B液之混合比固定於95/5(v/v)來開始進行測定，在0.56分鐘後以5.5分鐘將A液與B液之混合比線性改變成40/60(v/v)。 檢測波長：260nm
分析條件2： 裝置：Waters ACQUITY UPLC/SQ Detector 管柱：ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 Column(130Å，1.7μm，2.1×50mm) 管柱溫度：50℃ 溶媒： A液：水(0.75%v/v六氟異丙醇；0.038%v/v三乙基胺；5μM乙二胺四醋酸) B液：90%v/v甲醇水溶液(0.75%v/v六氟異丙醇；0.038%v/v三乙基胺；5μM乙二胺四醋酸) 梯度條件： 流速0.36mL/min，將A液與B液之混合比固定於95/5(v/v)來開始進行測定，在0.56分鐘後以5.5分鐘將A液與B液之混合比線性改變成40/60(v/v)。 檢測波長：260nm
將在各反應溶液中所假定之生成物(去氧尿苷部分的脫鹼基體及經切割之片段)的序列及理論分子量，以及在各反應溶液中所檢測而得之分子量示於表2、表3。另外，表2、表3中，各管柱的標記係如下。
“Entry”(最左)： 表示實驗編號，與各實驗編號(Entry)相應之基質係如下。 Entry.1：U-DEL1-sh      Entry.2：U-DEL2-sh Entry.3：U-DEL3-sh      Entry.4：U-DEL4-sh Entry.5：U-DEL5-HP      Entry.6：U-DEL6-HP Entry.7：U-DEL7-HP      Entry.8：U-DEL8-HP Entry.9：U-DEL9-HP      Entry.10：U-DEL10-HP
“No.”(從左起第2個)： 表示序列編號。另外，各序列編號(No.)中，No.1、2、3、4、5、6、7、8、9及10為各反應溶液的基質，No.11、14、17、20、22、25、29 、31、33及35為各基質的去氧尿苷部分的脫鹼基體，其餘的序列編號為各基質被切割而得之片段。
“Seq.”(從左起第3個)： 表示序列，左側表示5’側，右側表示3’側。 另外，在序列標記中，「(B)」係意味下列式(6)所示之基(脫鹼基部位)， 其他標記係與表1相同。
“Expected MW.”(從左起第4個)： 表示各序列的理論分子量(Da)的數值。
“Observed MW.”(最右)： 表示鑑定為各序列並檢測而得之分子量(Da)的數值。另外，「-」標記表示未檢測。
[表2]
[表3]
由與所檢測而得之各序列相應之峰的面積比，算出脫鹼基反應及切割反應的轉化率。脫鹼基反應在所有基質中，於37℃，1小時的階段轉化99%以上(基質的峰為未滿1%，其餘的峰僅為脫鹼基體及經切割之片段)。 此外，將表示切割反應的轉化率之圖表示於圖10。如圖表所示，U-DEL8-HP及U-DEL9-HP除外，在所有基質中，於37℃，在20h之前已進行95%以上切割反應，在U-DEL8-HP及U-DEL9-HP中，亦藉由追加90℃，1小時的保溫培養，切割反應已完成100%。
由以上結果，顯示出各種包含去氧尿苷之髮夾型DEL的部分結構係在去氧尿苷部位進行經由USER(註冊商標)enzyme之脫鹼基反應，接著，切割反應。
實施例2 [以往型髮夾DEL與能夠切割之髮夾DEL(包含去氧尿苷之髮夾型DEL)的PCR效率的比較]
如圖11所示之概略圖，依以下程序合成表4所示之序列的化合物(髮夾DEL)。另外，在表4中之序列標記中，「S」係意味下列式(7)所示之基， 其他標記係與表1相同。 與各序列編號(No.)相應之化合物的名稱係如下。 No.37：U-DEL1      No.38：U-DEL2 No.39：U-DEL4      No.40：U-DEL7 No.41：U-DEL8      No.42：U-DEL9 No.43：U-DEL10     No.44：H-DEL [表4] 另外，用於合成各髮夾DEL之原料頭段的化合物名係分別如下。 髮夾DEL：原料頭段 U-DEL1：U-DEL1-HP U-DEL2：U-DEL2-HP U-DEL4：U-DEL4-HP U-DEL7：U-DEL7-HP U-DEL8：U-DEL8-HP U-DEL9：U-DEL9-HP U-DEL10：U-DEL10-HP H-DEL：H-DEL-HP 再者，U-DEL1-HP、U-DEL2-HP、U-DEL4-HP及H-DEL-HP的序列編號“No.”及序列“Seq”係如以下表5。 [表5]
與實施例1同樣地使用核酸自動合成機nS-8II(GeneDesign公司製)調製表5所示之原料頭段。
在PCR管中加入2.0μL的各種原料頭段的1mM水溶液；2.4μL的Pr_TAG的1mM水溶液(黏接並調製與實施例1同樣地進行合成而得之Pr_TAG_a及Pr_TAG_b，將序列示於表6)；0.8μL的10X連接酶緩衝液(500mM Tris鹽酸，pH7.5；500mM氯化鈉；100mM氯化鎂；100mM二硫蘇糖醇；20mM腺苷三磷酸)及2.0μL的去離子水。在溶液中加入0.8μL的T4 DNA連接酶(Thermo Fisher製，目錄編號EL0013)的10倍稀釋水溶液，將所獲得之溶液於16℃保溫培養24小時。另外，表6中之序列標記係與表1相同。此外，與各序列編號(No.)相應之化合物的名稱係如下。 No.49：Pr_TAG_a      No.50：Pr_TAG_b [表6]
將反應溶液藉由0.8μL的5M氯化鈉水溶液及17.6μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置2小時。離心分離後，去除上清液，將所獲得之團粒進行風乾。在各團粒中加入2.0μL去離子水，調製溶液。
在所獲得之各溶液中加入2.4μL的CP的1mM水溶液(黏接並調製與實施例1同樣地進行合成而得之CP_a及CP_b，將序列示於表7)；0.8μL的10X連接酶緩衝液(500mM Tris鹽酸，pH7.5；500mM氯化鈉；100mM氯化鎂；100mM二硫蘇糖醇；20mM腺苷三磷酸)及2.0μL的去離子水。在溶液中加入0.8μL的T4 DNA連接酶(Thermo Fisher製，目錄編號EL0013)的10倍稀釋水溶液，將所獲得之溶液於16℃保溫培養24小時。另外，表7中之序列標記係與表1相同。此外，與各序列編號(No.)相應之化合物的名稱係如下。 No.51：CP_a      No.52：CP_b [表7]
將反應溶液藉由0.8μL的5M氯化鈉水溶液及17.6μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置2小時。離心分離後，去除上清液，將所獲得之團粒進行風乾。在團粒加入10μL去離子水，製成溶液。
對所獲得之溶液中之1.0μL進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例1的分析條件2的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標物(將各序列的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表4中)。將剩餘的溶液進行凍結乾燥後，各自加入去離子水，調製成20μM。
上述所獲得之8種髮夾型DEL中，H-DEL為以往型髮夾DEL，其餘的7種為包含去氧尿苷之能夠切割之髮夾DEL。為了比較各種髮夾型DEL經由USER(註冊商標)enzyme之處理前之PCR效率及處理後之PCR效率，實施即時PCR解析。此外，使用表7所示之DS-DEL(黏接並調製序列No.47及No.48的化合物)作為比較對象的雙股DEL。另外，在表8中之序列標記中，「(amino-C6-L)」係意味下列式(8)所示之基， 其他標記係與表1相同。 [表8]
＜經由USER(註冊商標)enzyme之處理步驟＞ 依以下程序施行8種髮夾DEL，及雙股DEL(DS-DEL)經由USER(註冊商標)enzyme之處理。
在PCR管中加入1μL的各種DEL 20μM水溶液；1μL的CutSmart(註冊商標)Buffer(New England BioLabs製，目錄編號B7204S)及7μL的去離子水。在溶液中加入1μL的USER(註冊商標)enzyme(New England BioLabs製，目錄編號M5505S)，將所獲得之溶液於37℃保溫培養1小時。
＜DEL試料的調製＞ 將各種DEL的USER(註冊商標)enzyme處理前之樣品及處理後之反應溶液各自以去離子水進行稀釋，調製0.05 pM、0.5pM及5pM的DEL試料。
＜經由即時PCR之Ct值的測定＞ 對上述所獲得之各種DEL試料藉由即時PCR測定Ct值，比較PCR效率。條件係如下，將結果示於圖12。另外，所謂Ct值，係在即時PCR中，隨著DNA的增幅所產生之螢光信號到達任意的閾值之循環數。即，在初期的DNA分子數同等之情況，PCR效率越高，Ct值越低。
裝置：7500即時PCR系統(Applied Biosystems公司製) 盤：MicroAmp 96-Well盤(Applied Biosystems公司製，目錄編號N8010560) PCR反應溶液： ・TB Green Premix Ex taqII(Takara Bio公司製，目錄編號RR820)：10μL ・正向引子(表9，序列編號55)：0.80μL ・反向引子(表9，序列編號56)：0.80μL ・ROX Refference DyeII(Takara Bio公司製，目錄編號RR39LR)：0.40μL ・各種DEL試料的水溶液(0.05pM、0.5pM、5pM)＊1：2.0μL ・去離子水：6.0μL ＊1：DEL試料的莫耳數成為0.1amol、1amol、10amol。 溫度條件： ・於95℃保持2分鐘後，重複進行35個循環的以下循環。 ・95℃，5秒 ・52℃，30秒 ・72℃，30秒 [表9] 另外，表9中之序列標記係與表1相同。
如圖12所示，以往型髮夾DEL(H-DEL)在USER(註冊商標)enzyme處理之前後，Ct值並未變化，包含去氧尿苷之能夠切割之髮夾DEL(U-DEL1、U-DEL2、U-DEL4、U-DEL7、U-DEL8、U-DEL9及U-DEL10)在USER(註冊商標)enzyme處理後，Ct值降低至與屬於雙股DEL之DS-DEL同等。
本結果顯示出藉由USER(註冊商標)enzyme所切割而得之DEL相較於切割前而言PCR效率提升，以及包含去氧尿苷之能夠切割之髮夾DEL可藉由USER(註冊商標)enzyme高效率且高選擇性地切割。
實施例3 [包含去氧尿苷之髮夾DEL經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應的驗證] ＜4種髮夾DEL(U-DEL5、U-DEL11、U-DEL12及U-DEL13)的合成＞ 依以下程序合成表10所示之序列的化合物(髮夾DEL)。另外，在表10中之序列標記中，「[mdC(TEG-amino)]」係意味下列式(9)所示之基， 其他標記係與表4相同。 與各序列編號(No.)相應之化合物的名稱係如下。 No.57：U-DEL5      No.58：U-DEL11 No.59：U-DEL12     No.60：U-DEL13 [表10] 另外，用於合成各髮夾DEL之原料頭段的化合物名係分別如下。 髮夾DEL：原料頭段 U-DEL5：U-DEL5-HP U-DEL11：U-DEL11-HP U-DEL12：U-DEL12-HP U-DEL13：U-DEL13-HP 再者，U-DEL11-HP、U-DEL12-HP及U-DEL13-HP的序列編號“No.”及序列“Seq”係如以下表11。另外，表11中之標記係與表10相同。
[表11]
表11所示之原料頭段中，U-DEL12-HP及U-DEL13-HP係與實施例1同樣地使用核酸自動合成機nS-8II(GeneDesign公司製)予以調製。U-DEL11-HP亦同樣地依照常法予以調製。
與實施例2同樣地，使用各種原料頭段，實施與雙股寡核苷酸Pr_TAG及CP之2階段雙股接合。
對所獲得之溶液的一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在以下所示之分析條件3下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標物(將各序列的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表10中)。將剩餘的溶液進行凍結乾燥後，各自加入去離子水，調製成20μM。
分析條件3： 裝置：Waters ACQUITY UPLC/SQ Detector 管柱：ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 Column(130Å，1.7μm，2.1×50mm) 管柱溫度：60℃ 溶媒： A液：水(0.75%v/v六氟異丙醇；0.038%v/v三乙基胺；5μM乙二胺四醋酸) B液：90%v/v甲醇水溶液(0.75%v/v六氟異丙醇；0.038%v/v三乙基胺；5μM乙二胺四醋酸) 梯度條件： 流速0.36mL/min，將A液與B液之混合比固定於95/5(v/v)來開始進行測定，在0.56分鐘後以5.5分鐘將A液與B液之混合比線性改變成40/60(v/v)。 檢測波長：260nm 解卷積： 使用ProMass for MassLynx Software(Waters製)解析離子信號。
＜經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應＞ 依以下程序施行6種包含去氧尿苷之髮夾DEL(U-DEL5、U-DEL7、U-DEL9、U-DEL11、U-DEL12及U-DEL13)經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應的檢討。
在PCR管中加入2μL的各種髮夾DEL 20μM水溶液；2μL的CutSmart(註冊商標)Buffer(New England BioLabs製，目錄編號B7204S)及14μL的去離子水。在溶液中加入2μL的USER(註冊商標)enzyme(New England BioLabs製，目錄編號M5505S)，將所獲得之溶液於37℃保溫培養16小時後，進一步於90℃保溫培養1小時。
＜經由LC-MS測定之切割後之生成物的確認＞ 對所獲得之反應溶液中之5.0μL進行取樣，以去離子水稀釋之後，在分析條件3下，施行經由ESI-MS之質量分析。將在各反應溶液中所假定之切割後之生成物的序列及理論分子量，以及在各反應溶液中所檢測而得之分子量示於表12。另外，與各實驗編號(Entry)相應之基質係如下，其他標記係與表10相同。 Entry.1：U-DEL5      Entry.2：U-DEL7 Entry.3：U-DEL9      Entry.4：U-DEL11 Entry.5：U-DEL12     Entry.6：U-DEL13
[表12]
所有樣品皆未檢測到基質的MS，觀測到切割後之生成物的MS作為主峰。
＜經由凝膠電泳之切割反應的確認＞ 此外，對所獲得之反應溶液中之一部分進行取樣，在以下所示之條件下，施行經由變性聚丙烯醯胺凝膠電泳之分析。由圖13所示之結果，確認所有基質皆以高產率進行切割反應。另外，圖13的各泳道的樣品係如下。 泳道1：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) 泳道2：U-DEL5 泳道3：U-DEL5的切割反應實施後樣品 泳道4：U-DEL7 泳道5：U-DEL7的切割反應實施後樣品 泳道6：U-DEL9 泳道7：U-DEL9的切割反應實施後樣品 泳道8：U-DEL11 泳道9：U-DEL11的切割反應實施後樣品 泳道10：U-DEL12 泳道11：U-DEL12的切割反應實施後樣品 泳道12：U-DEL13 泳道13：U-DEL13的切割反應實施後樣品 變性聚丙烯醯胺凝膠電泳： 凝膠：Novex(商品商標)10%TBE-脲凝膠(Invitrogen by ThermoFisher SCIENTIFIC製，目錄編號EC68755BOX) 加樣緩衝液：Novex(商品商標)10%TBE-Urea Sample Buffer(2×)(Invitrogen by ThermoFisher SCIENTIFIC製，目錄編號LC6876) 溫度：60℃ 電壓：180V 泳動時間：30分鐘 染色試劑：SYBER(商品商標)GreenII Nucleic Acid Gel Stain(Takara Bio公司製，目錄編號5770A)
由以上結果，顯示出各種包含去氧尿苷之髮夾型DEL係在去氧尿苷部位進行經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應。
實施例4 [包含去氧肌苷之髮夾DEL經由內核酸酶V之切割反應的驗證] ＜4種包含去氧肌苷之髮夾DEL(I-DEL1、I-DEL2、I-DEL3及I-DEL4)的合成＞ 依以下程序合成表13所示之序列的化合物(髮夾DEL)。另外，在表13中之序列標記中，「I」係意味去氧肌苷，其他標記係與表2相同。 與各序列編號(No.)相應之化合物的名稱係如下。 No.73：I-DEL1      No.74：I-DEL2 No.75：I-DEL3      No.76：I-DEL4 [表13] 另外，用於合成各髮夾DEL之原料頭段的化合物名係分別如下。 髮夾DEL：原料頭段 I-DEL1：I-DEL1-HP I-DEL2：I-DEL2-HP I-DEL3：I-DEL3-HP I-DEL4：I-DEL4-HP 再者，I-DEL1-HP、I-DEL2-HP、I-DEL3-HP及I-DEL4-HP的序列編號“No.”及序列“Seq”係如以下表14。另外，表14中之標記係與表13相同。
[表14]
表14所示之原料頭段係依照常法予以調製。
與實施例2同樣地，使用各種原料頭段，實施與雙股寡核苷酸Pr_TAG及CP之2階段雙股接合。
對所獲得之溶液的一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在分析條件3下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標物(將各序列的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表13中)。將剩餘的溶液進行凍結乾燥後，各自加入去離子水，調製成20μM。
＜經由內核酸酶V之切割反應＞ 依以下程序施行4種包含去氧肌苷之髮夾DEL(I-DEL1、I-DEL2、I-DEL3、I-DEL4)經由內核酸酶V之切割反應的檢討。
在PCR管中加入1μL的各種髮夾DEL 20μM水溶液；2μL的NEBuffer(註冊商標)4(New England BioLabs製，目錄編號B7004)及15μL的去離子水。在溶液中加入2μL的Endnuclease V(New England BioLabs製，目錄編號M0305S)，將所獲得之溶液於37℃保溫培養24小時。
＜經由LC-MS測定之切割後之生成物的確認＞ 對所獲得之反應溶液中之8.0μL進行取樣，以去離子水稀釋之後，在分析條件3下，施行經由ESI-MS之質量分析。將在各反應溶液中所假定之切割後之生成物的序列及理論分子量，以及在各反應溶液中所檢測而得之分子量是示於表15。另外，與各實驗編號(Entry)相應之基質係如下，其他標記係與表13相同。 Entry.1：I-DEL1      Entry.2：I-DEL2 Entry.3：I-DEL3      Entry.4：I-DEL4
[表15]
所有樣品皆未檢測到基質的MS，觀測到切割後之生成物的MS作為主峰。
＜經由凝膠電泳之切割反應的確認＞ 此外，對所獲得之反應溶液中之一部分進行取樣，在與實施例3相同的條件下，施行經由變性聚丙烯醯胺凝膠電泳之分析。由圖14所示之結果，確認所有基質皆以高產率進行切割反應。另外，圖14的各泳道的樣品係如下。 泳道1：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) 泳道2：I-DEL1 泳道3：I-DEL1的切割反應實施後樣品 泳道4：I-DEL2 泳道5：I-DEL2的切割反應實施後樣品 泳道6：I-DEL3 泳道7：I-DEL3的切割反應實施後樣品 泳道8：I-DEL4 泳道9：I-DEL4的切割反應實施後樣品
由以上結果，顯示出各種包含去氧肌苷之髮夾型DEL被內核酸酶V切割從去氧肌苷朝3’方向第2個磷酸二酯鍵。
實施例5 [包含核糖核苷之髮夾DEL經由RNaseHII之切割反應的驗證] ＜包含核糖核苷之髮夾DEL(R-DEL1)的合成＞ 依以下程序合成表16所示之序列的化合物(髮夾DEL)。另外，在表16中之序列標記中，「u」係意味尿苷，其他標記係與表2相同。 與序列編號(No.)相應之化合物的名稱係如下。 No.87：R-DEL1 [表16] 另外，用於合成各髮夾DEL之原料頭段的化合物名係如下。 髮夾DEL：原料頭段 R-DEL1：R-DEL1-HP 再者，R-DEL1-HP的序列編號“No.”及序列“Seq”係如以下表17。另外，表17中之標記係與表16相同。
[表17]
表17所示之原料頭段係依照常法予以調製。
與實施例2同樣地，使用原料頭段，實施與雙股寡核苷酸Pr_TAG及CP之2階段雙股接合。
對所獲得之溶液的一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在分析條件3下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標物(將各序列的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表16中)。將剩餘的溶液進行凍結乾燥後，各自加入去離子水，調製成200μM。
＜經由RNaseHII之切割反應＞ 依以下程序施行包含核糖核苷之髮夾DEL(R-DEL1)經由RNaseHII之切割反應的檢討。
在PCR管中加入0.5μL的髮夾DEL 200μM水溶液；4.9μL的ThermoPol(註冊商標)Reaction Buffer Pack(New England BioLabs製，目錄編號B9004)及43.6μL的去離子水。在溶液中加入1μL的RNase HII(New England BioLabs製，目錄編號M0288S)，將所獲得之溶液於37℃保溫培養8小時。
＜經由LC-MS測定之切割後之生成物的確認＞ 對所獲得之反應溶液中之10μL進行取樣，在分析條件3下，施行經由ESI-MS之質量分析。將所假定之切割後之生成物的序列及理論分子量以及所檢測而得之分子量示於表18。另外，與實驗編號(Entry)相應之基質係如下，其他標記係與表16相同。 Entry.1：R-DEL1
[表18]
所有樣品皆未檢測到基質的MS，觀測到切割後之生成物的MS作為主峰。
＜經由凝膠電泳之切割反應的確認＞ 此外，對所獲得之反應溶液中之一部分進行取樣，在與實施例3相同的條件下，施行經由變性聚丙烯醯胺凝膠電泳之分析。由圖15所示之結果，確認所有基質皆以高產率進行切割反應。另外，圖15的各泳道的樣品係如下。 泳道1：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) 泳道2：R-DEL1 泳道3：R-DEL1的切割反應實施後樣品
由以上結果，顯示出包含核糖核苷之髮夾型DEL被RNaseHII切割核糖核苷酸的5’側的磷酸二酯鍵。 實施例6 [以U-DEL9-HP作為原料之模型資料庫的製作] 如圖16所示之概略圖，以U-DEL9-HP作為原料，藉由拆分及合併合成，使用以下試劑實施包含3×3×3(27)化合物種之模型資料庫的合成。 ・U-DEL9-HP ・建構組元3種(BB1、BB2及BB3)： ・雙股寡核苷酸標籤10種(表19的標籤編號：Pr、A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1、C2及C3)
表19中，“Tag No.”(最左)表示標籤編號，“No.”(從左起第2個)表示序列編號，“Seq.”(從左起第3個)表示序列。另外，序列標記係與表1相同。
另外，各雙股寡核苷酸標籤係如表19中所示，黏接並調製對應於各標籤編號之序列編號2種的寡核苷酸。
[表19]
＜化合物「AOP-U-DEL9-HP」的合成＞ 依以下程序合成表20中所示之序列的化合物「AOP-U-DEL9-HP」。另外，在表20中之序列標記中，「(AOP-AminoC7)」係意味下列式(10)所示之基， 其他標記係與表2相同。
[表20]
在4個Violamo離心管中加入冷卻至10℃之硼酸鈉緩衝液(150mM，pH9.4)的U-DEL9-HP的溶液(2.5mL，1mM)。在各管中加入40當量的N-Fmoc-15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十八烷酸(250μL，0.4M N,N-二甲基乙醯胺溶液)，接著，40當量的氯化4-(4,6-二甲氧基[1.3.5]三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓水合物(DMTMM)(200μL，0.5M水溶液)，將所獲得之溶液於10℃搖晃5小時。
將上述溶液各自藉由295μL的5M氯化鈉水溶液及9.7mL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置整夜。離心分離後，去除上清液，將所獲得之團粒進行風乾。在團粒中各自加入2.75mL的去離子水，進行溶解，於0℃加入306μL的哌啶，於10℃搖晃3小時。將混合物進行離心分離後，藉由過濾除去沉澱物，以1.47mL的去離子水洗淨2次。將所獲得之濾液各自藉由600μL的5M氯化鈉水溶液及19.8mL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置整夜。離心分離後，去除上清液，將所獲得之團粒進行風乾。
在所獲得之團粒中加入10mL的去離子水，製成溶液。對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水進行稀釋後，在實施例1的分析條件2的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標物(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表20中)。將剩餘的溶液進行凍結乾燥後，加入去離子水，製成5mM。
＜雙股寡核苷酸標籤「Pr」的導入＞ 藉由將化合物「AOP-U-DEL9-HP」與雙股寡核苷酸標籤「Pr」進行接合而依以下程序合成表21中所示之序列的化合物「AOP-U-DEL9-HP-Pr」。另外，表21中之序列標記係與表20相同。
[表21]
在Violamo離心管中加入40μL的化合物「AOP-U-DEL9-HP」的5mM水溶液；160μL的100mM碳酸氫鈉水溶液水；240μL的雙股寡核苷酸標籤「Pr」的1mM水溶液；80μL的10X連接酶緩衝液(500mM Tris鹽酸，pH7.5；500mM氯化鈉；100mM氯化鎂；100mM二硫蘇糖醇；20mM腺苷三磷酸)及272μL的去離子水。在溶液中加入8.0μL的T4 DNA連接酶(Thermo Fisher製，目錄編號EL0013)，將所獲得之溶液於16℃保溫培養24小時。
將反應溶液藉由80μL的5M氯化鈉水溶液及2640μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置2小時。離心分離後，去除上清液，在所獲得之團粒中加入400μL的去離子水。將所獲得之溶液藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(30kD截留)進行濃縮。對所獲得之溶液的一部分進行取樣，在分析條件2的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標物(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表21中)。藉由以上步驟，獲得純度84.5%的化合物「AOP-U-DEL9-HP-Pr」133nmol。在所獲得之化合物「AOP-U-DEL9-HP-Pr」中加入100mM碳酸氫鈉水溶液水，調製成1mM。
＜循環A＞ 在3根各PCR管中加入20μL的上述所獲得之化合物「AOP-U-DEL9-HP-Pr」的1mM溶液；30μL的雙股寡核苷酸標籤A1~A3中之一者的1mM水溶液；8.0μL的10X連接酶緩衝液(500mM Tris鹽酸，pH7.5；500mM氯化鈉；100mM氯化鎂；100mM二硫蘇糖醇；20mM腺苷三磷酸)及21.6μL的去離子水。在溶液中加入0.4μL的T4 DNA連接酶(Thermo Fisher製，目錄編號EL0013)，將所獲得之溶液於16℃保溫培養18小時。
將反應溶液各自藉由8.0μL的5M氯化鈉水溶液及264μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，使所獲得之團粒各自溶解於20μL的150mM硼酸鈉緩衝液(pH9.4)中。
在各管中加入40當量的建構組元BB1~ BB3(4.0μL，200mM N,N-二甲基乙醯胺溶液)中之一者，接著，40當量的氯化4-(4,6-二甲氧基[1.3.5]三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓水合物(DMTMM)(4.0μL，200mM水溶液)，於10℃搖晃2小時。再者，在各管中加入20當量的建構組元(2.0μL，200mM N,N-二甲基乙醯胺溶液)，接著，20當量的DMTMM(2.0μL，200mM水溶液)，於10℃搖晃30分鐘。
將反應溶液各自藉由3.2μL的5M氯化鈉水溶液及106μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，在所獲得之團粒中各自加入18μL的去離子水之後，將3種溶液混合於1根PCR管中。
在已混合之溶液中於0℃加入6.0μL的哌啶，於室溫搖晃1小時。將反應溶液藉由6.0μL的5M氯化鈉水溶液及198μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置18小時。離心分離後，去除上清液，在所獲得之團粒中加入400μL的去離子水。將所獲得之溶液藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(30kD截留)進行濃縮，加入100mM碳酸氫鈉水溶液，調製成1mM，使用作為下一步驟的起始原料。
＜循環B＞ 在3根各PCR管中加入13.7μL的循環A所獲得之起始原料1mM溶液；20.6μL的雙股寡核苷酸標籤B1~B3中之一者的1mM水溶液；5.5μL的10X連接酶緩衝液(500mM Tris鹽酸，pH7.5；500mM氯化鈉；100mM氯化鎂；100mM二硫蘇糖醇；20mM腺苷三磷酸)及14.8μL的去離子水。在溶液中加入0.3μL的T4 DNA連接酶(Thermo Fisher製，目錄編號EL0013)，將所獲得之溶液於16℃保溫培養16小時。
將反應溶液各自藉由5.5μL的5M氯化鈉水溶液及181μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，使所獲得之團粒各自溶解於13.7μL的150mM硼酸鈉緩衝液(pH9.4)中。
在各管中加入80當量的建構組元BB1~BB3(5.5μL，200mM N,N-二甲基乙醯胺溶液)中之一者，接著，80當量的DMTMM(5.5μL，200mM水溶液)，於10℃搖晃1小時。再者，在各管中加入40當量的建構組元(2.3μL，200mM N,N-二甲基乙醯胺溶液)，接著，40當量的DMTMM(2.3μL，200mM水溶液)，於10℃搖晃2小時。
將反應溶液各自藉由2.5μL的5M氯化鈉水溶液及81.4μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，在所獲得之團粒中各自加入12.3μL的去離子水之後，將3種溶液混合於1根PCR管中。
在已混合之溶液中於0℃加入4.1μL的哌啶，於室溫搖晃3小時。將反應溶液藉由4.1μL的5M氯化鈉水溶液及136μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置3小時。離心分離後，去除上清液，在所獲得之團粒中加入400μL的去離子水。將所獲得之溶液藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(30kD截留)進行濃縮，加入100mM碳酸氫鈉水溶液，調製成0.48mM，使用作為下一步驟的起始原料。
＜循環C＞ 在3根各PCR管中加入14.5μL的循環B所獲得之起始原料0.48mM溶液；10.5μL的雙股寡核苷酸標籤C1~C3中之一者的1mM水溶液；及2.8μL的10X連接酶緩衝液(500mM Tris鹽酸，pH7.5；500mM氯化鈉；100mM氯化鎂；100mM二硫蘇糖醇；20mM腺苷三磷酸)。在溶液中加入0.14μL的T4 DNA連接酶(Thermo Fisher製，目錄編號EL0013)，將所獲得之溶液於16℃保溫培養16小時。
將反應溶液各自藉由2.8μL的5M氯化鈉水溶液及92μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，使所獲得之團粒各自溶解於7.0μL的150mM硼酸鈉緩衝液(pH9.4)中。
在各管中加入80當量的建構組元BB1~ BB3(2.8μL，200mM N,N-二甲基乙醯胺溶液)中之一者，接著，80當量的DMTMM(2.8μL，200mM水溶液)，於10℃搖晃1小時。再者，在各管中加入40當量的建構組元(1.4μL，200mM N,N-二甲基乙醯胺溶液)，接著，40當量的DMTMM(1.4μL，200mM水溶液)，於10℃搖晃2小時。
將反應溶液各自藉由1.3μL的5M氯化鈉水溶液及41.4μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，在所獲得之團粒中各自加入6.3μL的去離子水之後，將3種溶液混合於1根PCR管中。
在已混合之溶液中於0℃加入2.1μL的哌啶，於室溫搖晃2小時。將反應溶液藉由2.1μL的5M氯化鈉水溶液及69μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置3小時。離心分離後，去除上清液，在所獲得之團粒中加入400μL的去離子水。將所獲得之溶液藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(30kD截留)進行濃縮，加入100mM碳酸氫鈉水溶液，調製成0.41mM，使用作為下一步驟的起始原料。
＜CP的接合＞ 在PCR管中加入12.2μL的循環C所獲得之起始原料0.41mM溶液；6.0μL的CP的1mM水溶液(與實施例2中所使用者相同)；2.1μL的10X連接酶緩衝液(500mM Tris鹽酸，pH7.5；500mM氯化鈉；100mM氯化鎂；100mM二硫蘇糖醇；20mM腺苷三磷酸)及0.7μL的去離子水。在溶液中加入0.1μL的T4 DNA連接酶(Thermo Fisher製，目錄編號EL0013)，將所獲得之溶液於16℃保溫培養16小時。
將反應溶液藉由2.1μL的5M氯化鈉水溶液及69.6μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，在所獲得之團粒中加入400μL的去離子水。將所獲得之溶液藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(30kD截留)進行濃縮，加入去離子水，調製成20μM。
＜結果＞ 將各循環的雙股寡核苷酸標籤的接合後之樣品使用2.2%瓊脂糖凝膠(Lonza製，FlashGel(註冊商標)盒，目錄編號57031)藉由電泳進行分析。由圖17所示之結果，確認在各循環中，經由雙股寡核苷酸標籤之編碼化係以高效率達成。另外，圖17的各泳道的樣品係如下。 泳道1：AOP-U-DEL9-HP-Pr 泳道2：循環A的雙股寡核苷酸標籤A1接合後之樣品 泳道3：循環A的雙股寡核苷酸標籤A2接合後之樣品 泳道4：循環A的雙股寡核苷酸標籤A3接合後之樣品 泳道5：循環B的雙股寡核苷酸標籤B1接合後之樣品 泳道6：循環B的雙股寡核苷酸標籤B2接合後之樣品 泳道7：循環B的雙股寡核苷酸標籤B3接合後之樣品 泳道8：循環C的雙股寡核苷酸標籤C1接合後之樣品 泳道9：循環C的雙股寡核苷酸標籤C2接合後之樣品 泳道10：循環C的雙股寡核苷酸標籤C3接合後之樣品 泳道11：CP接合後之樣品 泳道12：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330)
將循環C完成後之樣品在分析條件3下施行分析。圖18示出層析及質譜的結果。藉由所獲得之質譜的解卷積，觀測到35532.4作為平均分子量。此結果係與循環C完成後所預期之平均分子量(35514.2)一致，顯示出用於資料庫合成之反應(雙股寡核苷酸標籤的接合及建構組元的導入)係以高效率達成。
藉由以上，在上述合成程序中，達成以U-DEL9-HP作為原料之包含3×3×3(27)化合物種之模型資料庫的合成。
＜所獲得之模型資料庫經由USER(註冊商標)enzyme之切割＞ 依以下程序實施上述所獲得之模型資料庫經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應。
在PCR管中加入2.0μL的模型資料庫20μM水溶液；2μL的CutSmart(註冊商標)Buffer(New England BioLabs製，目錄編號B7204S)及14μL的去離子水。在溶液中加入2μL的USER(註冊商標)enzyme(New England BioLabs製，目錄編號M5505S)，將所獲得之溶液於37℃保溫培養16小時後，進一步於90℃保溫培養1小時。
對所獲得之反應溶液中之一部分進行取樣，在與實施例3相同的條件下，施行經由變性聚丙烯醯胺凝膠電泳之分析。由圖19所示之結果，確認以U-DEL9-HP作為原料之模型資料庫係藉由USER(註冊商標)enzyme以高效率進行切割反應。另外，圖19的各泳道的樣品係如下。 泳道1：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) 泳道2：模型資料庫 泳道3：模型資料庫經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應實施後樣品
實施例7 [由DEL化合物的髮夾DNA向單股DNA之轉換，及新的機能的賦予] ＜DEL化合物的原料頭段(AAZ-DEL-HP)的合成＞ 依以下程序合成表22中所示之序列的AAZ-DEL-HP。另外，在表22中之序列標記中，「(AAZ-AOP-AminoC7)」係意味下列式(11)所示之基， 其他標記係與表2相同。 [表22]
在8根PCR管中各自加入二甲基亞碸(599μL)、4-側氧基-4-[(5-胺磺醯基-1,3,4-噻二唑-2-基)胺基)丁酸(37.5μL，0.2M二甲基亞碸溶液)、1-羥基-2,5-二側氧基吡咯啶-3-磺酸鈉(60μL，0.33M二甲基亞碸/去離子水(2：1，v/v)溶液)，接著，1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(72μL，0.1M二甲基亞碸溶液)，將所獲得之溶液於30℃搖晃30分鐘。又，在各溶液中加入150μL的三乙基胺鹽酸緩衝液(500mM，pH10)，接著，AOP-U-DEL9-HP(實施例6中所合成)的水溶液(75μL，0.67mM)，於37℃搖晃6小時。
將反應溶液收集至1根Violamo離心管中，藉由800μL的5M氯化鈉水溶液及26.3mL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，將所獲得之團粒進行風乾。使團粒溶解於去離子水中，藉由使用Phenomenex Gemini C18管柱之逆相HPLC進行精製。使用二元移動相梯度曲線，使用50mM醋酸三乙基銨緩衝液(pH7.5)及乙腈/水(100：1，v/v)，溶出目標物。各自收集包含目標物之部分，進行混合，加以濃縮。將所獲得之溶液藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(3kD截留)進行脫鹽，實施乙醇沉澱後，在團粒中加入去離子水，製成1mM水溶液。
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例2的分析條件2的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標物的AAZ-DEL-HP(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表22中)。
＜3種DEL化合物的原料頭段(SABA-DEL-HP、ClSABA-DEL-HP、mSABA-DEL-HP)的合成＞ 依以下程序合成表23中所示之序列的化合物。另外，在表23中之序列標記中，「(SABA-AOP-AminoC7)」係意味下列式(12)所示之基， 「(ClSABA-AOP-AminoC7)」係意味下列式(13)所示之基， 「(mSABA-AOP-AminoC7)」係意味下列式(14)所示之基， 其他標記係與表2相同。 與各序列編號(No.)相應之化合物的名稱係如下。 No.114：SABA-DEL-HP No.115：ClSABA-DEL-HP No.116：mSABA-DEL-HP [表23] 另外，用於合成各化合物之原料羧酸係分別如下。 化合物：原料羧酸 SABA-DEL-HP：4-胺磺醯基安息香酸 ClSABA-DEL-HP：4-氯-3-胺磺醯基安息香酸 mSABA-DEL-HP：3-胺磺醯基安息香酸
在各PCR管中加入原料羧酸(50μL，0.2M N,N-二甲基乙醯胺溶液)。在各管中加入3-羥基三唑并[4,5-b]吡啶(16.7μL，0.6M N,N-二甲基乙醯胺溶液)、N,N’-二異丙基碳二亞胺(16.7μL，0.6M N,N-二甲基乙醯胺溶液)，接著，N,N-二異丙基乙基胺(16.7μL，0.6M N,N-二甲基乙醯胺溶液)，將所獲得之溶液於25℃搖晃30分鐘。又，在各溶液中加入硼酸鈉緩衝液(250mM，pH9.4)的AOP-U-DEL9-HP(實施例6中所合成)的溶液(100μL，1mM)，於25℃搖晃90分鐘。
將上述溶液各自藉由20μL的5M氯化鈉水溶液及660μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，將所獲得之團粒進行風乾。使團粒各自溶解於50mM醋酸三乙基銨緩衝液(pH7.5)中，藉由使用Phenomenex Gemini C18管柱之逆相HPLC進行精製。使用二元移動相梯度曲線，使用50mM醋酸三乙基銨緩衝液(pH7.5)及乙腈/水(100：1，v/v)，溶出目標物。各自收集包含目標物之部分，進行混合，加以濃縮。將所獲得之各溶液藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(3kD截留)進行脫鹽，實施乙醇沉澱後，在團粒中加入去離子水，製成1mM水溶液。
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例2的分析條件2的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定各目標物(將各化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表23中)。
＜5種在3’末端具有生物素之DEL化合物(「AAZ-BIO-DEL」、「SABA-BIO-DEL」、「ClSABA-BIO-DEL」、「mSABA-BIO-DEL」及「Amino-BIO-DEL」)的合成＞ 依以下程序合成表24所示之序列的DEL化合物。另外，在表24中之序列標記中，「(BIO)」係意味下列式(15)所示之基， 其他標記係與表2、表20、表22及表23相同。 與各序列編號(No.)相應之化合物的名稱係如下。 No.117：AAZ-BIO-DEL No.118：SABA-BIO-DEL No.119：ClSABA-BIO-DEL No.120：mSABA-BIO-DEL No.121：Amino-BIO-DEL [表24] 另外，用於合成各DEL化合物之原料頭段的化合物名係分別如下。 DEL化合物：原料頭段 AAZ-BIO-DEL：AAZ-DEL-HP SABA-BIO-DEL：SABA-DEL-HP ClSABA-BIO-DEL：ClSABA-DEL-HP mSABA-BIO-DEL：mSABA-DEL-HP Amino-BIO-DEL：AOP-U-DEL9-HP
在PCR管中加入10μL的各種原料頭段的1mM水溶液；12μL的Pr_TAG2_CP-BIO的1mM水溶液(黏接並調製與實施例1同樣地進行合成而得之Pr_TAG2_CP_a與Pr_TAG2_CP-BIO_b，將序列示於表25)；4μL的10X連接酶緩衝液(500mM Tris鹽酸，pH7.5；500mM氯化鈉；10mM氯化鎂；100mM二硫蘇糖醇；20mM腺苷三磷酸)及10μL的去離子水。在溶液中加入4μL的T4 DNA連接酶(Thermo Fisher製，目錄編號EL0013)的10倍稀釋水溶液，將所獲得之溶液於16℃保溫培養整夜。另外，表25中之序列標記係與表24相同。此外，與各序列編號(No.)相應之化合物的名稱係如下。 No.122：Pr_TAG2_CP_a No.123：Pr_TAG2_CP-BIO_b [表25]
將反應溶液藉由4μL的5M氯化鈉水溶液及132μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，將所獲得之團粒進行風乾，使團粒溶解於去離子水中。將所獲得之溶液藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(3kD截留)進行脫鹽。
對所獲得之上清液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定各目標物(將各化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表24中)。
＜5種在3’末端具有生物素之DEL化合物(AAZ-BIO-DEL、SABA-BIO-DEL，ClSABA-BIO-DEL、mSABA-BIO-DEL、Amino-BIO-DEL)經由USER(註冊商標)enzyme之切割＞ 依以下程序施行上述所獲得之5種DEL化合物「AAZ-BIO-DEL」、「SABA-BIO-DEL」、「ClSABA-BIO-DEL」、「mSABA-BIO-DEL」及「Amino-BIO-DEL」經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應，分別轉換成具有表26所示之序列之雙股核酸之DEL化合物「DS-AAZ-BIO-DEL」、「DS-SABA-BIO-DEL」、「DS-ClSABA-BIO-DEL」、「DS-mSABA-BIO-DEL」及「DS-Amino-BIO-DEL」。另外，表26中之序列標記係與表24相同，意味5種化合物係由序列編號124與序列編號125、序列編號126與序列編號127、序列編號128與序列編號129、序列編號130與序列編號131及序列編號132與序列編號133的寡核苷酸鏈的雙股所形成。
[表26]
在PCR管中加入10μL的各種DEL化合物100μM水溶液；100μL的CutSmart(註冊商標)Buffer(New England BioLabs製，目錄編號7240S)及860μL的去離子水。在溶液中各自加入30μL的USER(註冊商標)enzyme (New England BioLabs製，目錄編號5505S)，將所獲得之溶液於37℃保溫培養1小時。
將所獲得之反應溶液各自藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(3kD截留)進行脫鹽濃縮，實施乙醇沉澱後，在各自所獲得之團粒中加入去離子水，製成水溶液。
對所獲得之溶液的一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3下，施行經由ESI-MS之質量分析，各自鑑定具有目標雙股核酸之DEL化合物「DS-AAZ-BIO-DEL」、「DS-SABA-BIO-DEL」、「DS-ClSABA-BIO-DEL」、「DS-mSABA-BIO-DEL」及「DS-Amino-BIO-DEL」(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表26中)
此外，對所獲得之反應溶液中之一部分進行取樣，在與實施例3相同的條件下，施行經由變性聚丙烯醯胺凝膠電泳之分析。由圖20所示之結果，確認「AAZ-BIO-DEL」、「SABA-BIO-DEL」、「ClSABA-BIO-DEL」、「mSABA-BIO-DEL」及「Amino-BIO-DEL」係以高產率被切割，分別轉換「DS-AAZ-BIO-DEL」、「DS-SABA-BIO-DEL」、「DS-ClSABA-BIO-DEL」、「DS-mSABA-BIO-DEL」及「DS-Amino-BIO-DEL」。另外，圖20的各泳道的樣品係如下。此外，濃度1及濃度2係分別意味以DEL化合物的加樣量成為約40ng及約80ng之方式調製樣品。 泳道1：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) 泳道2：AAZ-BIO-DEL(濃度1) 泳道3：AAZ-BIO-DEL(濃度2) 泳道4：AAZ-BIO-DEL經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應實施後之樣品(濃度1) 泳道5：AAZ-BIO-DEL經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應實施後之樣品(濃度2) 泳道6：SABA-BIO-DEL(濃度1) 泳道7：SABA-BIO-DEL(濃度2) 泳道8：SABA-BIO-DEL經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應實施後之樣品(濃度1) 泳道9：SABA-BIO-DEL經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應實施後之樣品(濃度2) 泳道10：ClSABA-BIO-DEL(濃度1) 泳道11：ClSABA-BIO-DEL(濃度2) 泳道12：ClSABA-BIO-DEL經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應實施後之樣品(濃度1) 泳道13：ClSABA-BIO-DEL經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應實施後之樣品(濃度2) 泳道14：mSABA-BIO-DEL(濃度1) 泳道15：mSABA-BIO-DEL(濃度2) 泳道16：mSABA-BIO-DEL經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應實施後之樣品(濃度1) 泳道17：mSABA-BIO-DEL經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應實施後之樣品(濃度2) 泳道18：Amino-BIO-DEL(濃度1) 泳道19：Amino-BIO-DEL(濃度2) 泳道20：Amino-BIO-DEL經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應實施後之樣品(濃度1) 泳道21：Amino-BIO-DEL經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應實施後之樣品(濃度2) 泳道22：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330)
＜使用鏈黴親和素珠粒之具有單股DNA之DEL的調製＞ 將上述所獲得之具有雙股核酸之DEL化合物「DS-AAZ-BIO-DEL」、「DS-SABA-BIO-DEL」、「DS-ClSABA-BIO-DEL」、「DS-mSABA-BIO-DEL」及「DS-Amino-BIO-DEL」各自以鏈黴親和素珠粒進行處理，依以下程序調製具有單股DNA之DEL化合物「SS-AAZ-DEL」、「SS-SABA-DEL」、「SS-ClSABA-DEL」、「SS-mSABA-DEL」及「SS-Amino-DEL」。另外，5種化合物分別為表26中之序列編號125、127、129、131及133的寡核苷酸鏈。
在5根PCR管中各自加入450μL的Magnosphere(商品商標)MS160/Streptavidin(JSR Life Sciences，目錄編號J-MS-S160S)，藉由磁性分離除去上清液後，加入900μL的1×結合緩衝液(10mM Tris鹽酸，pH7.5；0.5mM乙二胺四醋酸；1M氯化鈉；0.05%v/v Tween20)，藉由磁性分離除去上清液。在所獲得之粒子中各自加入「DS-AAZ-BIO-DEL」、「DS-SABA-BIO-DEL」、「DS-ClSABA-BIO-DEL」、「DS-mSABA-BIO-DEL」或「DS-Amino-BIO-DEL」的水溶液(各自為700pmol，450μL)，及450μL的2×結合緩衝液(20mM Tris鹽酸，pH7.5；1mM乙二胺四醋酸；2M氯化鈉；0.1%v/v Tween20)並進行混合，於室溫搖晃20分鐘。
藉由磁性分離從各混合物中除去上清液，各自重複進行2次使用900μL的1×結合緩衝液(10mM Tris鹽酸，pH7.5；0.5mM乙二胺四醋酸；1M氯化鈉；0.05%v/v Tween20)之粒子的洗淨及經由磁性分離之上清液的除去。隨後，各自加入900μL的變性溶液(0.1M氫氧化鈉；0.1M氯化鈉)，藉由磁性分離回收上清液。
在所獲得之上清液中各自加入900μL的3-( N-N-嗎啉基)丙烷磺酸緩衝液(1.0M，pH7.0)，藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(3kD截留)進行脫鹽。將所獲得之上清液各自實施乙醇沉澱後，在團粒中加入去離子水，製成溶液。
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，結果觀測到分子量24255.3、24170.5、24208.8、24176.7及23984.8，鑑定具有目標單股DNA之DEL化合物「SS-AAZ-DEL」、「SS-SABA-DEL」、「SS-ClSABA-DEL」、「SS-mSABA-DEL」及「SS-Amino-DEL」。
＜光反應性交聯劑修飾引子的合成＞ 依以下程序合成表27所示之序列的光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr」。另外，在表27中之序列標記中，「X」係意味下列式(16)所示之基， 其他標記係與表2相同。 [表27]
在PCR管中加入冷卻至10℃之硼酸鈉緩衝液(150mM，pH9.4)的L-Pr(與實施例1同樣地進行合成，將序列示於表28)的溶液(200μL，1mM)。在管中加入40當量的N-Fmoc-15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十八烷酸(20μL，0.4M N,N-二甲基乙醯胺溶液)，接著，40當量的氯化4-(4,6-二甲氧基[1.3.5]三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓水合物(DMTMM)(16μL，0.5M水溶液)，將所產生之混合物於10℃搖晃4小時。另外，表28中之序列標記係與表8相同。 [表28]
將反應液藉由23.6μL的5M氯化鈉水溶液及778.8μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置整夜。離心分離後，去除上清液，將所獲得之團粒進行風乾。在團粒中加入180μL的去離子水，製成溶液後，加入20μL的哌啶，於10℃搖晃3小時。
將所獲得之溶液藉由20μL的5M氯化鈉水溶液及660μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，在所獲得之團粒中加入200μL的去離子水，製成1mM的溶液。
在上述所獲得之溶液100μL中加入75μL的三乙基胺鹽酸緩衝液(500mM，pH10)，接著，50當量的，1-((3-(3-甲基-3 H-二氮雜環丙烯-3-基)丙醯基)氧基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-磺酸鈉(Sulfo-SDA)(25μL，200mM水溶液)，於37℃搖晃2小時。
將所獲得之溶液藉由20μL的5M氯化鈉水溶液及660μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，在所獲得之團粒中加入100μL的去離子水，接著，加入75μL的三乙基胺鹽酸緩衝液(500mM，pH10)，50當量的Sulfo-SDA(25μL，200mM水溶液)，於37℃搖晃1小時20分鐘。再者，加入50當量的Sulfo-SDA(25μL，200mM水溶液)，於37℃搖晃40分鐘。
將所獲得之溶液藉由22.5μL的5M氯化鈉水溶液及743μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置整夜。離心分離後，去除上清液，在所獲得之團粒中加入100μL的去離子水，接著，加入75μL的三乙基胺鹽酸緩衝液(500mM，pH10)，接著，50當量的Sulfo-SDA(25μL，200mM水溶液)，於37℃搖晃3小時。
將所獲得之溶液藉由20μL的5M氯化鈉水溶液及660μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置整夜。離心分離後，去除上清液，將所獲得之團粒進行風乾。使團粒溶解於50mM醋酸三乙基銨緩衝液(pH7.5)中，藉由使用Phenomenex Gemini C18管柱之逆相HPLC進行精製。使用二元移動相梯度曲線，使用50mM醋酸三乙基銨緩衝液(pH7.5)及乙腈/水(100：1，v/v)，溶出目標物。收集包含目標物之部分，進行混合，加以濃縮。將所獲得之溶液藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(3kD截留)進行脫鹽，實施乙醇沉澱後，在團粒中加入100μL的去離子水，製成溶液。
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標物的光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr」(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表27中)。
＜光反應性交聯劑修飾雙股DEL的合成＞ 以上述所獲得之具有單股DNA之DEL化合物(「SS-AAZ-DEL」、「SS-SABA-DEL」、「SS-ClSABA-DEL」、「SS-mSABA-DEL」及「SS-Amino-DEL」)作為模板DNA，各自依以下程序施行使用「PXL-Pr」之引子伸長反應，合成表29所示之序列的光反應性交聯劑修飾雙股DEL化合物(「PXL-DS-AAZ-DEL」、「PXL-DS-SABA-DEL」、「PXL-DS-ClSABA-DEL」、「PXL-DS-mSABA-DEL」及「PXL-DS-Amino-DEL」)。另外，表29中之序列標記係與表26及表27相同，意味5種化合物係分別由序列編號136與序列編號125、序列編號136與序列編號127、序列編號136與序列編號129、序列編號136與序列編號131及序列編號136與序列編號133的寡核苷酸鏈的雙股所形成。 [表29]
在PCR管中加入30μL的各種具有單股DNA之DEL化合物的10μM水溶液；0.505μL的「PXL-Pr」594μM水溶液；60μL的10×NEBuffer(註冊商標)2(New England BioLabs製，目錄編號B7002S)及476μL的去離子水。在溶液中加入6μL的DNA Polymerase I，Large(Klenow) Fragment(New England BioLabs製，目錄編號M0210)及12μL的Deoxynucleotide(dNTP)Solution Mix(New England BioLabs製，目錄編號N0447)，將所獲得之溶液於25℃保溫培養90分鐘。
將所獲得之溶液藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(3kD截留)進行脫鹽。在所獲得之上清液中加入去離子水，製成60μL的溶液，隨後藉由6μL的5M氯化鈉水溶液及198μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於 -78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，將所獲得之團粒進行風乾。在團粒中加入30μL的去離子水，製成溶液。
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標物的光反應性交聯劑修飾雙股DEL「PXL-DS-AAZ-DEL」、「PXL-DS-SABA-DEL」、「PXL-DS-ClSABA-DEL」、「PXL-DS-mSABA-DEL」及「PXL-DS-Amino-DEL」(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表29中)。
此外，對所獲得之反應溶液中之一部分進行取樣，在以下所示之條件下，施行經由聚丙烯醯胺凝膠電泳之分析。由圖21所示之結果，確認藉由引子的伸長反應，係以高產率分別轉換成「PXL-DS-AAZ-DEL」、「PXL-DS-SABA-DEL」、「PXL-DS-ClSABA-DEL」、「PXL-DS-mSABA-DEL」及「PXL-DS-Amino-DEL」。另外，圖21的各泳道的樣品係如下。此外，濃度1及濃度2係分別意味以DEL化合物的加樣量成為約40ng及約80ng之方式調製樣品。 泳道1：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) 泳道2：DS-AAZ-BIO-DEL(濃度1) 泳道3：SS-AAZ-DEL(濃度1) 泳道4：SS-AAZ-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-AAZ-DEL)(濃度1) 泳道5：DS-AAZ-BIO-DEL(濃度2) 泳道6：SS-AAZ-DEL(濃度2) 泳道7：SS-AAZ-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-AAZ-DEL)(濃度2) 泳道8：DS-SABA-BIO-DEL(濃度1) 泳道9：SS-SABA-DEL(濃度1) 泳道10：SS-SABA-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-SABA-DEL)(濃度1) 泳道11：DS-SABA-BIO-DEL(濃度2) 泳道12：SS-SABA-DEL(濃度2) 泳道13：SS-SABA-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-SABA-DEL)(濃度2) 泳道14：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) 泳道15：DS-ClSABA-BIO-DEL(濃度1) 泳道16：SS-ClSABA-DEL(濃度1) 泳道17：SS-ClSABA-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-ClSABA-DEL)(濃度1) 泳道18：DS-ClSABA-BIO-DEL(濃度2) 泳道19：SS-ClSABA-DEL(濃度2) 泳道20：SS-ClSABA-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-ClSABA-DEL)(濃度2) 泳道21：DS-mSABA-BIO-DEL(濃度1) 泳道22：SS-mSABA-DEL(濃度1) 泳道23：SS-mSABA-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-mSABA-DEL)(濃度1) 泳道24：DS-mSABA-BIO-DEL(濃度2) 泳道25：SS-mSABA-DEL(濃度2) 泳道26：SS-mSABA-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-mSABA-DEL)(濃度2) 泳道27：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) 泳道28：DS-Amino-BIO-DEL(濃度1) 泳道29：SS-Amino-DEL(濃度1) 泳道30：SS-Amino-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-Amino-DEL)(濃度1) 泳道31：DS-Amino-BIO-DEL(濃度2) 泳道32：SS-Amino-DEL(濃度2) 泳道33：SS-Amino-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-Amino-DEL)(濃度2)
聚丙烯醯胺凝膠電泳： 凝膠：SuperSep(商品商標)DNA15%TBE凝膠(富士Film和光純藥製，目錄編號190-15481) 加樣緩衝液：6× Loading Buffer(Takara Bio公司製，目錄編號9156) 溫度：室溫 電壓：200V 泳動時間：50分鐘 染色試劑：SYBER(商品商標)GreenII Nucleic Acid Gel Stain(Takara Bio公司製，目錄編號5770A)
實施例8 [光反應性交聯劑修飾雙股DEL在有無光交聯反應下之結合劑回收效率的比較] ＜DEL試料的調製＞ 將上述所獲得之5種光反應性交聯劑修飾雙股DEL各自以去離子水進行稀釋，調製50nM的DEL試料。
＜光交聯反應＞ 裝置：CL-1000 Ultraviolet Crosslinker(UVP，INC公司製) 反應管：96孔用底部小瓶(Techno Lab Bossy股份有限公司製，目錄編號96-V050FB) 光交聯反應溶液： ・Salmon Sperm DNA，sheared(Invitrogen，目錄編號AM9680)：1.6μL ・1MNaCl水溶液：5.0μL ・D-PBS(-)(FUJIFILM公司製9，目錄編號045-29795)：32.4μL ・Carbonic Anhydrase IX/CA9(Sino Biological公司製，目錄編號10107-H08H)：10.0μL ・各種DEL試料的50nM水溶液：1.0μL 反應條件： 將上述組成的CA9蛋白質與DEL溶液混合而得之物在冰上保溫培養1小時。隨後，回收溶液的一部分(溶液S)。將其餘的溶液維持於冰上，施行365nm的UV照射20分鐘。
＜與蛋白進行交聯而得之DEL的回收＞ ・Dynabeads Histag isolation ＆ pulldown(Invitrogen公司製，目錄編號10104D)：10.0μL ・Tween20(Sigma公司製，目錄編號P7949-100ML) ・10%SDS(NIPPON GENE公司製，目錄編號311-90271) ・Wash buffer(將D-PBS(-)以Tween20及10%SDS進行稀釋，調製成0.2%)
將UV照射後之反應溶液與Dyanebeads his-tag pulldown進行混合，於室溫保溫培養30分鐘。固定於磁性支架，靜置2分鐘後去除掉上清液，加入200μL的Wash buffer，將Dynabeads進行懸浮。再者，重複進行此洗淨操作5次。在洗淨後之Dybabeads中加入80μL的D-PBS(-)，於95℃使其進行反應10分鐘。反應後，將Dynabeads設置於磁性支架，在2分鐘後回收上清液(溶液E)。
＜未進行光交聯反應之樣品的調製＞ 在未進行UV照射的操作下實施上述一連串操作，各自調製溶液S、溶液E作為樣品。
＜經由即時PCR之Ct值的測定＞ 對上述所獲得之各種DEL試料藉由即時PCR測定Ct值，比較PCR效率。條件係如下，將結果示於圖22。
裝置：7500即時PCR系統(Applied Biosystems公司製) 盤：MicroAmp 96-Well盤(Applied Biosystems公司製，目錄編號N8010560) PCR反應溶液： ・TaqMan Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems公司製，目錄編號4369016)：10.0μL ・正向引子1(表30，序列編號137)：1.0μL ・反向引子1(表30，序列編號138)：1.0μL ・Taqman MGB探針(Thermo Fisher公司製，製品編號4316034，在表30的序列編號139的鹼基序列的5’末端藉由FAM(註冊商標)螢光色素，在3’末端藉由NFQ及MGB進行標識而得之TaqMan(註冊商標)探針)：0.50μL ・各種DEL試料的水溶液(S，E樣品)：2.0μL ・去離子水：5.5μL 溫度條件： ・於50℃保持2分鐘後，於95℃保持10分鐘，重複進行40個循環的以下循環。 ・95℃，15秒 ・59℃，1分鐘 [表30]
作為CA9蛋白與各化合物之結合劑之親和性的強度係假定為下述順序(非專利文獻6及7)。 「PXL-DS-AAZ-DEL」＞「PXL-DS-SABA-DEL」＞「PXL-DS-ClSABA-DEL」＞「PXL-DS-mSABA-DEL」＞「PXL-DS-Amino-DEL(陰性對照)」
如圖22的圖表所示，在未經UV照射之溶液E中，具有較高親和性的結合劑之「PXL-DS-AAZ-DEL」及「PXL-DS-SABA-DEL」與陰性對照相比較，Ct值優勢性地降低。然而，具有中程度親和性的結合劑之「PXL-DS-ClSABA-DEL」及「PXL-DS-mSABA-DEL」與陰性對照相比較，並未確認到優勢的Ct值變化。本結果暗示在DEL篩選中，在未實施光交聯反應之情況，可期待取得較高親和性的結合劑，但難以取得中程度親和性的結合劑。
在另一方面，在經實施UV照射之溶液E中，所有化合物與陰性對照相比較，皆呈Ct值優勢性地降低之結果。即，本結果暗示在DEL篩選中，在實施光交聯反應之情況，亦可期待取得中程度親和性的結合劑。
本結果係意味由具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL所衍生出之光反應性交聯劑修飾雙股DEL在利用光交聯反應之DEL篩選中實屬有用。
實施例9 [使用Lambda Exonuclease之具有單股DNA之DEL的調製] 依以下程序施行具有雙股核酸之DEL化合物「DS-Amino-BIO-DEL」經由Lambda Exonuclease處理之向具有單股DNA之DEL化合物「SS-Amino-DEL」之轉換。
在PCR管中加入DS-Amino-BIO-DEL(500 pmol)的水溶液；5μL的10×Lambda Exonuclease Reaction Buffer(New England BioLabs製，目錄編號B0262)；1μL的Lambda Exonuclease(New England BioLabs製，目錄編號M0262)後，藉由去離子水以總液量成為50μL的溶液之方式進行調製。將所獲得之溶液於37℃保溫培養30分鐘。
對所獲得之反應溶液中之10μL進行取樣，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，結果觀測到24024.9，鑑定具有目標單股DNA之DEL化合物「SS-Amino-DEL」。
未檢測到DS-Amino-BIO-DEL中所包含之一條寡核苷酸鏈(序列編號132)的MS，觀測到單股化後之生成物的MS作為主峰，確認以高產率進行單股鏈化反應。
實施例10 [連結子結構係與實施例8中所使用之光反應性交聯劑修飾雙股DEL不同的光交聯劑修飾雙股DEL的合成] ＜5種具有單股DNA之DEL的調製＞
與實施例7同樣地，調製5種具有單股DNA之DEL化合物(「SS-AAZ-DEL」、「SS-SABA-DEL」、「SS-ClSABA-DEL」、「SS-mSABA-DEL」及「SS-Amino-DEL」。惟，在實施例7的記載中之＜5種在3’末端具有生物素之DEL化合物的合成＞步驟中，使用Pr_TAG2_CP(黏接並調製與實施例1同樣地進行合成而得之Pr_TAG2_CP_a與Pr_TAG2_CP_b，將序列示於表31)來代替Pr_TAG2_CP-BIO，以與實施例9同樣的程序來代替＜使用鏈黴親和素珠粒之具有單股DNA之DEL的調製＞步驟實施具有單股DNA之DEL的調製。另外，表31中之序列標記係與表25相同。此外，與各序列編號(No.)相應之化合物的名稱係如下。 No.122：Pr_TAG2_CP_a No.140：Pr_TAG2_CP_b [表31]
＜光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr2」的合成＞ 依以下程序合成表32所示之序列的光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr2」。另外，在表32中之序列標記中，「(X2)」係意味下列式(17)所示之基， 其他標記係與表2相同。 [表32]
在PCR管中加入3-(3-甲基-3H-二氮雜環丙烯-3-基)丙烷酸(5μL，0.2M N,N-二甲基乙醯胺溶液)。在管中加入1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(2.5μL，0.4M N,N-二甲基乙醯胺溶液)，接著，N,N-二異丙基乙基胺(2.5μL，0.4M N,N-二甲基乙醯胺溶液)，將所獲得之溶液於4℃搖晃10分鐘。又，在所獲得之溶液中加入硼酸鈉緩衝液(250mM，pH9.5)的L-Pr(將序列示於表28)的溶液(100μL，1mM)，於10℃搖晃30分鐘。
將上述溶液藉由11μL的5M氯化鈉水溶液及363μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置整夜。離心分離後，去除上清液，將所獲得之團粒進行風乾。將所獲得之團粒以去離子水進行溶解後，將溶液藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(3kD截留)進行脫鹽。
對所獲得之上清液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr2」(將各化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表32中)。
＜光反應性交聯劑修飾雙股DEL的合成＞ 以上述所獲得之具有單股DNA之DEL化合物(「SS-AAZ-DEL」、「SS-SABA-DEL」、「SS-ClSABA-DEL」、「SS-mSABA-DEL」及「SS-Amino-DEL」)作為模板DNA，以與實施例7同樣的程序施行使用「PXL-Pr2」之引子伸長反應，合成表33所示之序列的光反應性交聯劑修飾雙股DEL化合物(「PXL-DS-AAZ-DEL2」、「PXL-DS-SABA-DEL2」、「PXL-DS-ClSABA-DEL2」、「PXL-DS-mSABA-DEL2」及「PXL-DS-Amino-DEL2」)。另外，表33中之序列標記係與表26及表32相同，意味5種化合物係分別由序列編號142與序列編號125、序列編號142與序列編號127、序列編號142與序列編號129、序列編號142與序列編號131及序列編號142與序列編號133的寡核苷酸鏈的雙股所形成。 [表33]
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標光反應性交聯劑修飾雙股DEL「PXL-DS-AAZ-DEL2」、「PXL-DS-SABA-DEL2」、「PXL-DS-ClSABA-DEL2」、「PXL-DS-mSABA-DEL2」及「PXL-DS-Amino-DEL2」(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表33中)。
此外，對所獲得之反應溶液中之一部分進行取樣，在實施例7所示之條件下，施行經由聚丙烯醯胺凝膠電泳之分析。由圖23所示之結果，確認藉由引子的伸長反應，係以高產率分別轉換成「PXL-DS-AAZ-DEL2」、「PXL-DS-SABA-DEL2」、「PXL-DS-ClSABA-DEL2」、「PXL-DS-mSABA-DEL2」及「PXL-DS-Amino-DEL2」。另外，圖23的各泳道的樣品係如下。另外，以各DEL化合物的加樣量各自成為約40ng之方式調製樣品。 泳道1：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) 泳道2：SS-AAZ-DEL 泳道3：SS-AAZ-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-AAZ-DEL2) 泳道4：SS-SABA-DEL 泳道5：SS-SABA-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-SABA-DEL2) 泳道6：SS-ClSABA-DEL 泳道7：SS-ClSABA-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-ClSABA-DEL2) 泳道8：SS-mSABA-DEL 泳道9：SS-mSABA-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-mSABA-DEL2) 泳道10：SS-Amino-DEL 泳道11：SS-Amino-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-Amino-DEL2) 泳道12：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330)
＜具有單股DNA之DEL化合物「SS-Amino-DEL3」的調製＞ 與實施例1同樣地使用核酸自動合成機nS-8II (GeneDesign公司製)調製具有單股DNA之DEL化合物「SS-Amino-DEL3」(將序列示於表34)。另外，「SS-Amino-DEL3」係以「U-DEL12-HP」(將序列示於表11)作為原料頭段，與藉由與上述＜5種具有單股DNA之DEL的調製＞相同的程序所衍生出之寡核苷酸為相同的結構。此外，表34中之序列標記係與表10相同。 [表34]
＜具有單股DNA之DEL化合物「SS-AAZ-DEL3」的合成＞ 依以下程序合成具有表35所示之序列之單股DNA之DEL化合物「SS-AAZ-DEL3」。另外，在表35中之序列標記中，「[AAZ-mdC(TEG-amino)]」係意味下列式(18)所示之基， 其他標記係與表10相同。 [表35]
與實施例7＜DEL化合物的原料頭段(AAZ-DEL-HP)的合成＞同樣地，使用「SS-Amino-DEL3」當作原料，實施與4-側氧基-4-[(5-胺磺醯基-1,3,4-噻二唑-2-基)胺基)丁酸之縮合反應。
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定具有目標單股DNA之DEL化合物「SS-AAZ-DEL3」(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表35中)。
＜3種具有單股DNA之DEL化合物(「SS-SABA-DEL3」、「SS-ClSABA-DEL3」及「SS-mSABA-DEL3」)的合成＞ 依以下程序合成表36所示之序列的3種具有單股DNA之DEL化合物(「SS-SABA-DEL3」、「SS-ClSABA-DEL3」及「SS-mSABA-DEL3」)。另外，在表36中之序列標記中，「[SABA-mdC(TEG-amino)]」係意味下列式(19)所示之基， 「[ClSABA-mdC(TEG-amino)]」係意味下列式(20)所示之基， 「[mSABA-mdC(TEG-amino)]」係意味下列式(21)所示之基， 其他標記係與表10相同。與各序列編號(No.)相應之化合物的名稱係如下。 No.145：SS-SABA-DEL3 No.146：SS-ClSABA-DEL3 No.147：SS-mSABA-DEL3 [表36] 另外，用於合成各化合物之原料羧酸係分別如下。 化合物：原料羧酸 SABA-DEL-HP：4-胺磺醯基安息香酸 ClSABA-DEL-HP：4-氯-3-胺磺醯基安息香酸 mSABA-DEL-HP：3-胺磺醯基安息香酸
在PCR管中加入原料羧酸(4μL，0.2M N,N-二甲基乙醯胺溶液)。在管中加入1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(2μL，0.4M N,N-二甲基乙醯胺溶液)，接著，N,N-二異丙基乙基胺(2μL，0.4M N,N-二甲基乙醯胺溶液)，將所獲得之溶液於10℃搖晃30分鐘。又，在所獲得之溶液中加入硼酸鈉緩衝液(250mM，pH9.5)的SS-Amino-DEL3的溶液(50μL，1mM)，於10℃搖晃2小時。
將上述溶液藉由5.8μL的5M氯化鈉水溶液及192μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，將所獲得之團粒進行風乾。
使所獲得之團粒溶解於50mM醋酸三乙基銨緩衝液(pH7.5)中，藉由使用Phenomenex Gemini C18管柱之逆相HPLC進行精製。使用二元移動相梯度曲線，使用50mM醋酸三乙基銨緩衝液(pH7.5)及乙腈/500mM醋酸三乙基銨緩衝液(9：1，v/v)，溶出目標物。收集包含目標物之部分，進行混合，加以濃縮。將所獲得之溶液藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(3kD截留)進行脫鹽，實施乙醇沉澱後，在團粒中加入去離子水，製成溶液。
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標「SS-SABA-DEL3」、「SS-ClSABA-DEL3」及「SS-mSABA-DEL3」(將各化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表36中)。
＜光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr3」的合成＞ 以與上述＜光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr2」的合成＞同樣的程序合成表37所示之序列的光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr3」。惟，使用「L-Pr3」(與實施例1同樣地進行合成，將序列示於表38)來代替「L-Pr」當作原料。另外，表37中之序列標記係與表32相同。此外，表38中之序列標記係與表8相同。 [表37]
[表38]
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr3」(將各化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表37中)。
＜5種光反應性交聯劑修飾雙股DEL「PXL-DS-DEL3」的合成＞ 以上述所獲得之具有單股DNA之DEL化合物(「SS-AAZ-DEL3」、「SS-SABA-DEL3」、「SS-ClSABA-DEL3」、「SS-mSABA-DEL3」及「SS-Amino-DEL3」)作為模板DNA，以與實施例7同樣的程序施行使用「PXL-Pr3」之引子伸長反應，合成表39所示之序列的5種光反應性交聯劑修飾雙股DEL化合物(「PXL-DS-AAZ-DEL3」、「PXL-DS-SABA-DEL3」、「PXL-DS-ClSABA-DEL3」、「PXL-DS-mSABA-DEL3」及「PXL-DS-Amino-DEL3」)。另外，表39中之序列標記係與表34~37相同，意味5種化合物係分別由序列編號150與序列編號144、序列編號150與序列編號145、序列編號150與序列編號146、序列編號150與序列編號147及序列編號150與序列編號143的寡核苷酸鏈的雙股所形成。 [表39]
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，各自鑑定目標光反應性交聯劑修飾雙股DEL化合物「PXL-DS-AAZ-DEL3」、「PXL-DS-SABA-DEL3」、「PXL-DS-ClSABA-DEL3」、「PXL-DS-mSABA-DEL3」及「PXL-DS-Amino-DEL3」(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表39中)。
此外，對所獲得之反應溶液中之一部分進行取樣，在實施例7所示之條件下，施行經由聚丙烯醯胺凝膠電泳之分析。由圖24所示之結果，確認藉由引子的伸長反應，係以高產率分別轉換成「PXL-DS-AAZ-DEL3」、「PXL-DS-SABA-DEL3」、「PXL-DS-ClSABA-DEL3」、「PXL-DS-mSABA-DEL3」及「PXL-DS-Amino-DEL3」。另外，圖24的各泳道的樣品係如下。另外，以各DEL化合物的加樣量各自成為約40ng之方式調製樣品。 泳道1：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) 泳道2：SS-AAZ-DEL3 泳道3：SS-AAZ-DEL3的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-AAZ-DEL3) 泳道4：SS-SABA-DEL3 泳道5：SS-SABA-DEL3的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-SABA-DEL3) 泳道6：SS-ClSABA-DEL3 泳道7：SS-ClSABA-DEL3的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-ClSABA-DEL3) 泳道8：SS-mSABA-DEL3 泳道9：SS-mSABA-DEL3的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-mSABA-DEL3) 泳道10：SS-Amino-DEL3 泳道11：SS-Amino-DEL3的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-Amino-DEL3) 泳道12：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330)
實施例11 [實施例10所合成之光反應性交聯劑修飾雙股DEL在有無光交聯反應下之結合劑回收效率的比較] ＜DEL試料的調製＞ 將實施例10所獲得之4種光反應性交聯劑修飾雙股DEL(PXL-DS-mSABA-DEL2、PXL-DS-Amino-DEL2、PXL-DS-mSABA-DEL3及PXL-DS-Amino-DEL3)各自以去離子水進行稀釋，調製50nM的DEL試料。
＜光交聯反應＞ 裝置：CL-1000 Ultraviolet Crosslinker(UVP，INC公司製) 微管：1.5mL矽化微管，圓底(Watson股份有限公司製，目錄編號131-615CH) 反應管：96孔用底部小瓶(Techno Lab Bossy股份有限公司製，目錄編號96-V050FB) 光交聯反應溶液： ・Salmon Sperm DNA，sheared(Invitrogen，目錄編號AM9680)：1.6μL ・1MNaCl(FUJIFILM公司製，目錄編號191-01665)：5.0μL ・D-PBS(-)(FUJIFILM公司製，目錄編號045-29795)：32.4μL ・Carbonic Anhydrase IX/CA9(Sino Biologocal公司製，目錄編號10107-H08H)：10.0μL ・各種DEL試料的水溶液(50nM)：1.0μL 反應條件： 在微管中混合上述組成的CA9蛋白質與DEL溶液，在冰上使其進行反應1小時。將全量分注於反應管中，維持於冰上，施行365nm的UV照射20分鐘。
＜與蛋白進行交聯而得之DEL的回收＞ ・Dynabeads Histag isolation ＆ pulldown(Invitrogen公司製，目錄編號10104D)：10.0μL ・Tween20(Sigma公司製，目錄編號P7949-100ML) ・10%SDS(NIPPON GENE公司製，目錄編號311-90271) ・Wash buffer(將D-PBS(-)以Tween20及10%SDS進行稀釋，調製成0.2%) ・咪唑(FUJIFILM公司製，目錄編號097-05391) ・Elution buffer(以成為200mM之方式將咪唑溶解於D-PBS(-)中，調製成pH7.4)
在UV照射後之反應溶液中加入D-PBS(-)。隨後，將其餘的溶液與Dyanebeads his-tag pulldown進行混合，於室溫保溫培養30分鐘。固定於磁性支架，靜置2分鐘後去除掉上清液，加入200μL的Wash buffer，將Dynabeads進行懸浮。再者，重複進行此操作5次。在洗淨後之Dynabeads中加入100μL的Elution buffer，於室溫靜置10分鐘。反應後，將Dynabeads設置於磁性支架，在2分鐘後回收上清液作為樣品。
＜未進行光交聯反應之樣品的調製＞ 在未進行UV照射的操作下實施上述一連串操作，各自回收樣品。
＜經由即時PCR之Ct值的測定＞ 對上述所獲得之各種DEL試料，與實施例8同樣地，藉由即時PCR測定Ct值。將比較ΔCt值(與陰性對照的Ct值之差)而得之結果示於圖25。
如實施例8所記載，CA9蛋白與「PXL-DS-mSABA-DEL2」及「PXL-DS-mSABA-DEL3」之親和性的強度各自假定為中程度(非專利文獻6及7)。
如圖25的圖表所示，在未經UV照射之樣品中，所有ΔCt值皆較小，與實施例8的結果同樣地，暗示在DEL篩選中，在未實施光交聯反應之情況，難以取得中程度親和性的結合劑。
在另一方面，在經實施UV照射之樣品中，與未經UV照射之樣品相比較，呈所有ΔCt值皆上升之結果。暗示在本實施例中所使用之光反應性交聯劑修飾雙股DEL(連結子結構皆與實施例8所使用之光反應性交聯劑修飾雙股DEL不同)中，亦可期待取得中程度親和性的結合劑。
本結果係意味由具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL所衍生出之具有各式各樣的連結子結構之光反應性交聯劑修飾雙股DEL在利用光交聯反應之DEL篩選中實屬有用。
實施例12 [「在交聯劑與編碼序列之間具有共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」與「在交聯劑與編碼序列之間無共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」之結合劑回收效率(DNA檢測感度)的比較]
＜在交聯劑與編碼序列之間無共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL的合成＞ 使用實施例10所獲得之具有單股DNA之DEL化合物(「SS-SABA-DEL3」、「SS-ClSABA-DEL3」、「SS-mSABA-DEL3」及「SS-Amino-DEL3」)，依以下程序施行使用「PXL-Pr3」之黏接，合成表40所示之序列的4種光反應性交聯劑修飾雙股DEL化合物(「PXL-DS-SABA-DEL4」、「PXL-DS-ClSABA-DEL4」、「PXL-DS-mSABA-DEL4」及「PXL-DS-Amino-DEL4」)。另外，表40中之序列標記係與表34、表36及表37相同，意味4種化合物係分別由序列編號148與序列編號145、序列編號148與序列編號146、序列編號148與序列編號147及與序列編號148與序列編號143的寡核苷酸鏈的雙股所形成。 [表40]
在PCR管中加入30μL的各種具有單股DNA之DEL化合物的10μM水溶液；3.77μL的「PXL-Pr3」159μM水溶液。在所獲得之水溶液中加入去離子水，使總液量成為60μL。隨後，於90℃保溫培養2分鐘後，耗費30分鐘冷卻至室溫。
＜DEL試料的調製＞ 將上述所獲得之4種「在交聯劑與編碼序列之間無共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」(「PXL-DS-SABA-DEL4」、「PXL-DS-ClSABA-DEL4」、「PXL-DS-mSABA-DEL4」及「PXL-DS-Amino-DEL4」)，以及實施例10所獲得之4種「在交聯劑與編碼序列之間具有共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」(「PXL-DS-SABA-DEL3」、「PXL-DS-ClSABA-DEL3」、「PXL-DS-mSABA-DEL3」及「PXL-DS-Amino-DEL3」)各自以去離子水進行稀釋，調製50nM的DEL試料。
＜光交聯反應＞ 裝置：CL-1000 Ultraviolet Crosslinker(UVP，INC公司製) 微管：1.5mL矽化微管，圓底(Watson股份有限公司製，目錄編號131-615CH) 反應管：96孔用底部小瓶(Techno Lab Bossy股份有限公司製，目錄編號96-V050FB) 光交聯反應溶液： ・Salmon Sperm DNA， sheared(Invitrogen，目錄編號AM9680)：1.6μL ・1MNaCl(FUJIFILM公司製，目錄編號191-01665)：5.0μL ・D-PBS(-)(FUJIFILM公司製9，目錄編號045-29795)：32.4μL ・Carbonic Anhydrase IX/CA9(Sino Biologocal公司製，目錄編號10107-H08H)：10.0μL ・各種DEL試料的水溶液(50nM)：1.0μL 反應條件： 將上述組成的CA9蛋白質與DEL溶液混合而得之物在冰上保溫培養2小時。隨後，維持於冰上，施行365nm的UV照射20分鐘。
＜與蛋白進行交聯而得之DEL的回收＞ ・Dynabeads Histag isolation ＆ pulldown(Invitrogen公司製，目錄編號10104D)：10.0μL ・Tween20(Sigma公司製，目錄編號P7949-100ML) ・10%SDS(NIPPON GENE公司製，目錄編號311-90271) ・Wash buffer(將D-PBS(-)以Tween20及10%SDS進行稀釋，調製成0.2%) ・咪唑(FUJIFILM公司製，目錄編號097-05391) ・Elution buffer(以成為200mM之方式將咪唑溶解於D-PBS(-)中，調製成pH7.4)
將UV照射後之反應溶液與Dynabeads his-tag pulldown進行混合，於室溫保溫培養30分鐘。固定於磁性支架，靜置2分鐘後去除掉上清液，加入200μL的Wash buffer，將Dynabeads進行懸浮。再者，重複進行此操作5次。在洗淨後之Dynabeads中加入100μL的Elution buffer，於室溫使其進行反應10分鐘。反應後，將Dynabeads設置於磁性支架，在2分鐘後回收上清液作為樣品。
＜未進行光交聯反應之樣品的調製＞ 在未進行UV照射的操作下實施上述一連串操作，各自回收樣品。
＜經由即時PCR之Ct值的測定＞ 對上述所獲得之各種DEL試料，與實施例8同樣地，藉由即時PCR測定Ct值。將比較ΔCt值(與陰性對照的Ct值之差)而得之結果示於圖26。
與實施例8同樣地，作為CA9蛋白與各化合物之結合劑之親和性的強度係假定為下述順序(非專利文獻6及7)。 「PXL-DS-SABA-DEL3」、「PXL-DS-SABA-DEL4」＞「PXL-DS-ClSABA-DEL3」、「PXL-DS-ClSABA-DEL4」＞「PXL-DS-mSABA-DEL3」、「PXL-DS-mSABA-DEL4」＞「PXL-DS-Amino-DEL3(陰性對照)」、「PXL-DS-Amino-DEL4(陰性對照)」 如圖26的圖表所示，在經實施UV照射之樣品中，在所有結合劑中皆呈「在交聯劑與編碼序列之間具有共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL(PXL-DS-DEL3)」相較於「在交聯劑與編碼序列之間無共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL(PXL-DS-DEL4)」而言ΔCt值優勢性地較高之結果。即便結合劑的種類相同，由於光反應性交聯劑修飾雙股DEL的結構的差別，ΔCt值亦不同，暗示「在交聯劑與編碼序列之間具有共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」係結合劑回收效率(DNA檢測感度)較高。
本結果係意味由具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL所衍生出之「在交聯劑與編碼序列之間具有共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」在利用光交聯反應之DEL篩選中，相較於「在交聯劑與編碼序列之間無共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」而言較有用。
實施例13 [藉由適用於較強的分離、溶出條件之光反應性交聯劑修飾雙股DEL的光交聯反應之結合劑回收效率的驗證]
＜DEL試料的調製＞ 與實施例12同樣地，將4種「在交聯劑與編碼序列之間無共價鍵之光架反應性交聯劑修飾雙股DEL」(「PXL-DS-SABA-DEL4」、「PXL-DS-ClSABA-DEL4」、「PXL-DS-mSABA-DEL4」及「PXL-DS-Amino-DEL4」)，以及4種「在交聯劑與編碼序列之間具有共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」(「PXL-DS-SABA-DEL3」、「PXL-DS-ClSABA-DEL3」、「PXL-DS-mSABA-DEL3」及「PXL-DS-Amino-DEL3」)各自以去離子水進行稀釋，調製50nM的DEL試料。
＜光交聯反應＞ 裝置：CL-1000 Ultraviolet Crosslinker(UVP，INC公司製) 反應管：96孔用底部小瓶(Techno Lab Bossy股份有限公司製，目錄編號96-V050FB) 光交聯反應溶液： ・Salmon Sperm DNA，sheared(Invitrogen，目錄編號AM9680)：1.6μL ・1MNaCl(FUJIFILM公司製，目錄編號191-01665)：5.0μL ・D-PBS(-)(FUJIFILM公司製9，目錄編號045-29795)：39.4μL ・Carbonic Anhydrase IX/CA9(Sino Biologocal公司製，目錄編號10107-H08H)：3.0μL ・各種DEL試料的水溶液(50nM)：1.0μL 反應條件： 將上述組成的CA9蛋白質與DEL溶液混合而得之物在冰上保溫培養2小時。隨後，維持於冰上，施行365nm的UV照射20分鐘。
＜與蛋白進行交聯而得之DEL的回收＞ ・Dynabeads Histag isolation ＆ pulldown(Invitrogen公司製，目錄編號10104D)：10.0μL ・Tween20(Sigma公司製，目錄編號P7949-100ML) ・將Wash buffer(D-PBS(-)以Tween20進行稀釋，調製成0.2%) ・200mM咪唑溶液(FUJIFILM公司製，目錄編號097-05391)
將UV照射後之反應溶液與Dynabeads his-tag pulldown進行混合，於室溫保溫培養30分鐘。固定於磁性支架，靜置2分鐘後去除掉上清液，加入200μL的Wash buffer，將Dynabeads進行懸濁，於90℃使其進行反應10分鐘。再者，重複進行此操作3次。在洗淨後之Dynabeads中加入30μL的200mM咪唑溶液，於室溫使其進行反應10分鐘。反應後，將Dynabeads設置於磁性支架，在2分鐘後回收上清液作為樣品。
＜未進行光交聯反應之樣品的調製＞ 在未進行UV照射的操作下實施上述一連串操作，各自回收樣品。
如上述＜與蛋白進行交聯而得之DEL的回收＞所記載，在回收與蛋白進行交聯而得之DEL時，在加熱條件下，成為較強的分離、溶出條件。
＜經由即時PCR之Ct值的測定＞ 對上述所獲得之各種DEL試料，與實施例8同樣地，藉由即時PCR測定Ct值。將比較ΔCt值(與陰性對照的Ct值之差)而得之結果示於圖27。
如圖27的圖表所示，在經實施UV照射之樣品中，在所有結合劑中皆呈「在交聯劑與編碼序列之間具有共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL(PXL-DS-DEL3)」相較於「在交聯劑與編碼序列之間無共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL(PXL-DS-DEL4)」而言ΔCt值優勢性地較高之結果。即便結合劑的種類相同，由於光反應性交聯劑修飾雙股DEL的結構的差別，ΔCt值亦不同，暗示「在交聯劑與編碼序列之間具有共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」係結合劑回收效率(DNA檢測感度)較高。
本結果係意味由具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL所衍生出之「在交聯劑與編碼序列之間具有共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」在利用光交聯反應之DEL篩選中，相較於「在交聯劑與編碼序列之間無共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」而言較有用。
此外，本結果暗示由具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL所衍生出之「在交聯劑與編碼序列之間具有共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」亦能夠適應於以除去非特異性結合劑等為目的而在較強的分離條件或溶出條件下之DEL篩選。
實施例14 [以U-DEL-13-HP作為原料之由髮夾DNA向單股DNA之轉換，及新的機能的賦予] ＜DEL化合物的原料頭段(「mSABA-DEL-HP5」)的合成＞ 使用「U-DEL13-HP」當作原料，以與實施例10＜3種具有單股DNA之DEL化合物(「SS-SABA-DEL3」、「SS-ClSABA-DEL3」及「SS-mSABA-DEL3」)的合成＞同樣的程序合成表41中所示之序列的「mSABA-DEL-HP5」。另外，表41中之標記係與表36相同。 [表41]
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標「mSABA-DEL-HP5」(將各化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表41中)。
＜髮夾DEL化合物(「mSABA-DEL5」)的合成＞ 與實施例10同樣地，藉由原料頭段「mSABA-DEL-HP5」與Pr_TAG2_CP之雙股接合來合成表42所示之序列的髮夾DEL化合物(「mSABA-DEL5」)。另外，表42中之序列標記係與表36相同。 [表42]
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標「mSABA-DEL5」(各化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表42中)。
＜髮夾DEL化合物(「mSABA-DEL5」)經由USER(註冊商標)enzyme之切割＞ 以與實施例7＜5種在3’末端具有生物素之DEL化合物(AAZ-BIO-DEL、SABA-BIO-DEL、ClSABA-BIO-DEL、mSABA-BIO-DEL、Amino-BIO-DEL)經由USER(註冊商標)enzyme之切割＞同樣的程序施行上述所獲得之髮夾DEL化合物「mSABA-DEL5」經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應，轉換成具有表43所示之序列之雙股核酸之DEL化合物「DS-mSABA-DEL5」。另外，表43中之序列標記係與表36相同，意味由序列編號153與序列編號154的寡核苷酸鏈的雙股所形成。 [表43]
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標具有雙股核酸之DEL化合物「DS-mSABA-DEL5」(將各化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表43中)。
此外，對所獲得之反應溶液中之一部分進行取樣，在與實施例3相同的條件下，施行經由變性聚丙烯醯胺凝膠電泳之分析。由圖28所示之結果，確認「mSABA-DEL5」係以高產率被切割，轉換成「DS-mSABA-DEL5」。另外，圖28的各泳道的樣品係如下。 泳道1：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) 泳道2：mSABA-DEL5 泳道3：mSABA-DEL5經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應實施後之樣品 泳道4：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330)
＜具有雙股核酸之DEL化合物「DS-mSABA-DEL5」經由Lambda Exonuclease之向單股DEL之轉換＞ 將上述所獲得之具有雙股核酸之DEL化合物「DS-mSABA-DEL5」與實施例9同樣地藉由Lambda Exonuclease進行處理，調製具有單股DNA之DEL化合物「SS-mSABA-DEL5」。另外，「SS-mSABA-DEL5」為表43中之序列編號154的寡核苷酸鏈。
對所獲得之上清液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，結果觀測到分子量23825.8，鑑定具有目標單股DNA之DEL化合物「SS-mSABA-DEL5」。
＜光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr5」的合成＞ 以與實施例10＜光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr2」的合成＞同樣的程序合成表44所示之序列的光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr5」。惟，使用「L-Pr5」(與實施例1同樣地進行合成，將序列示於表45)來代替「L-Pr」當作原料。另外，表44中之序列標記係與表32相同。此外，表45中之序列標記係與表8相同。 [表44]
[表45]
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr5」(將各化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表44中)。
＜光反應性交聯劑修飾雙股DEL化合物(「PXL-DS-mSABA-DEL5」)的合成＞ 以上述所獲得之具有單股DNA之DEL化合物「SS-mSABA-DEL5」作為模板DNA，以與實施例7同樣的程序施行使用「PXL-Pr5」之引子伸長反應，合成表46所示之序列的光反應性交聯劑修飾雙股DEL化合物「PXL-DS-mSABA-DEL5」。另外，表46中之序列標記係與表36及表44相同，意味由序列編號157與序列編號154的寡核苷酸鏈的雙股所形成。 [表46]
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標光反應性交聯劑修飾雙股DEL「PXL-DS-mSABA-DEL5」(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表46中)。
此外，對所獲得之反應溶液中之一部分進行取樣，在實施例7所示之條件下，施行經由聚丙烯醯胺凝膠電泳之分析。由圖29所示之結果，確認藉由引子的伸長反應，係以高產率轉換成「PXL-DS-mSABA-DEL5」。另外，圖29的各泳道的樣品係如下。另外，以各DEL化合物的加樣量各自成為約40ng之方式調製樣品。 泳道1：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) 泳道2：DS-mSABA-DEL5 泳道3：SS-mSABA-DEL5 泳道4：SS-mSABA-DEL5的引子伸長反應實施後之樣品(PXL-DS-mSABA-DEL5) 泳道5：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330)
實施例15 [交聯劑修飾雙股DEL的合成] ＜3種交聯劑修飾引子(PA-Pr、TPD-Pr、ACA-Pr)的合成＞ 依以下程序合成表47所示之序列的各種交聯劑修飾引子。另外，在表47中之序列標記中，「(PA)」係意味下列式(22)所示之基， 「(TPD)」係意味下列式(23)所示之基， 「(ACA)」係意味下列式(24)所示之基， 其他標記係與表2相同。 [表47] 另外，用於合成各化合物之原料活性酯係分別如下。 化合物：原料活性酯 PA-Pr： 4-疊氮安息香酸N-琥珀醯亞胺基 TPD-Pr：4-(3-(三氟甲基)-3H-二氮雜環丙烯-3-基)安息香酸N-琥珀醯亞胺酯 ACA-Pr：丙烯酸N-琥珀醯亞胺酯
在PCR管中加入冷卻至10℃之硼酸鈉緩衝液(250mM，pH9.4)的L-Pr(記載於實施例7)的溶液(1mM)。在管中加入50當量的原料活性酯(25μL，0.2M二甲基亞碸溶液)，將所產生之混合物於10℃搖晃30分鐘。
將反應液藉由12μL的5M氯化鈉水溶液及396μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，將所獲得之團粒進行風乾。
使所獲得之團粒溶解於50mM醋酸三乙基銨緩衝液(pH7.5)中，藉由使用Phenomenex Gemini C18管柱之逆相HPLC進行精製。使用二元移動相梯度曲線，使用50mM醋酸三乙基銨緩衝液(pH7.5)及乙腈/500mM醋酸三乙基銨緩衝液(9：1，v/v)，溶出目標物。收集包含目標物之部分，進行混合，加以濃縮。將所獲得之溶液藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(3kD截留)進行脫鹽，實施乙醇沉澱後，在團粒中加入去離子水，製成溶液。
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定各目標物(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表47中)。
＜化合物「AOP-L-Pr」的合成＞ 依以下程序合成表48所示之序列的化合物「AOP-L-Pr」。另外，在表48中之序列標記中，「(AOP-aminoC6-L)」係意味下列式(25)所示之基， 其他標記係與表2相同。 [表48]
在PCR管中加入冷卻至10℃之硼酸鈉緩衝液(150mM，pH9.4)的L-Pr(與實施例1同樣地進行合成，將序列示於表28)的溶液(200μL，1mM)。在管中加入40當量的N-Fmoc-15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十八烷酸(20μL，0.4M N,N-二甲基乙醯胺溶液)，接著，40當量的氯化4-(4,6-二甲氧基[1.3.5]三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓水合物(DMTMM)(16μL，0.5M水溶液)，將所產生之混合物於10℃搖晃4小時。
將反應液藉由23.6μL的5M氯化鈉水溶液及778.8μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置整夜。離心分離後，去除上清液，將所獲得之團粒進行風乾。在團粒中加入180μL的去離子水，製成溶液後，加入20μL的哌啶，於10℃搖晃3小時。
將所獲得之溶液藉由20μL的5M氯化鈉水溶液及660μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，在所獲得之團粒中加入200μL的去離子水，製成1mM的溶液。
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例1的分析條件2的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標物(將各序列的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表48中)。
＜交聯劑修飾引子(BMP-Pr)的合成＞ 依以下程序合成表49所示之序列的交聯劑修飾引子(BMP-Pr)。另外，在表49中之序列標記中，「(BMP)」係意味下列式(26)所示之基， 其他標記係與表2相同。 [表49]
在PCR管中加入冷卻至10℃之磷酸鈉緩衝液(125mM，pH9.4)的AOP-L-Pr的溶液(40μL，0.5mM)。在管中加入50當量的3-馬來醯亞胺丙酸N-琥珀醯亞胺酯(5μL，0.2M二甲基亞碸溶液)，將所產生之混合物於10℃搖晃40分鐘。隨後，加入二甲基亞碸20μL，將所產生之混合物進一步於10℃搖晃25分鐘。
將反應液藉由5μL的5M氯化鈉水溶液及215μL的經冷卻(-20℃)之乙醇進行處理，於-78℃靜置30分鐘。離心分離後，去除上清液，將所獲得之團粒進行風乾。將所獲得之團粒以去離子水進行溶解後，將溶液藉由Amicon(註冊商標)Ultra Centrifugal過濾器(3kD截留)進行脫鹽。
對所獲得之上清液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標交聯劑修飾引子「BMP-Pr」(將各化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表49中)。
＜交聯劑修飾雙股DEL(「TPD-DS-mSABA-DEL」)的合成＞ 以實施例10所獲得之具有單股DNA之DEL化合物「SS-mSABA-DEL」作為模板DNA，依以下程序施行使用上述＜3種交聯劑修飾引子的合成＞所獲得之交聯劑修飾引子「TPD-Pr」之引子伸長反應，合成表50所示之序列的交聯劑修飾雙股DEL化合物「TPD-DS-mSABA-DEL」。另外，表50中之序列標記係與表26及表47相同，表示「TPD-DS-mSABA-DEL」係由序列編號163與序列編號131的寡核苷酸鏈的雙股所形成。 [表50]
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標交聯劑修飾雙股DEL「TPD-DS-mSABA-DEL」(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表50中)。
＜交聯劑修飾雙股DEL(「ACA-DS-ClSABA-DEL」)的合成＞ 以實施例10所獲得之具有單股DNA之DEL化合物「SS-ClSABA-DEL」作為模板DNA，以與實施例7同樣的程序施行使用上述所獲得之交聯劑修飾引子「ACA-Pr)之引子伸長反應，合成表51所示之序列的交聯劑修飾雙股DEL化合物「ACA-DS-ClSABA-DEL」。另外，表51中之序列標記係與表26及表47相同，表示「ACA-DS-ClSABA-DEL」係由序列編號164與序列編號129的寡核苷酸鏈的雙股所形成。 [表51]
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標交聯劑修飾雙股DEL「ACA-DS-ClSABA-DEL」(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表51中)。
＜經由凝膠電泳之引子伸長反應的確認＞ 對上述＜交聯劑修飾雙股DEL(「TPD-DS-mSABA-DEL」)的合成＞及＜交聯劑修飾雙股DEL(「ACA-DS-ClSABA-DEL」)的合成＞所獲得之溶液中之一部分進行取樣，在實施例7所示之條件下，施行經由聚丙烯醯胺凝膠電泳之分析。由圖30所示之結果，確認藉由引子的伸長反應，係以高產率轉換成「TPD-DS-mSABA-DEL」及「ACA-DS-ClSABA-DEL」。另外，圖30的各泳道的樣品係如下。另外，以各DEL化合物的加樣量各自成為約40ng之方式調製樣品。 泳道1：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) 泳道2：SS-mSABA-DEL 泳道3：SS-mSABA-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(TPD-DS-mSABA-DEL) 泳道4：SS-ClSABA-DEL 泳道5：SS-ClSABA-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(ACA-DS-ClSABA-DEL) 泳道6：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330)
實施例16 [使用具有用於交聯劑修飾之反應基之雙股DEL之交聯劑修飾雙股DEL的合成] ＜具有用於交聯劑修飾之反應基之引子(「BCN-Pr」)的合成＞ 依以下程序合成具有表52所示之序列的用於交聯劑修飾之反應基之引子「BCN-Pr」。另外，在表52中之序列標記中，「(BCN)」係意味下列式(27)所示之基， 其他標記係與表2相同。
[表52]
與實施例15同樣地，使用「AOP-L-Pr」當作原料，使用碳酸琥珀醯亞胺基(1R,8S,9s)-雙環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲酯當作原料活性酯，實施「BCN-Pr」的合成。
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標「BCN-Pr」(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表52中)。
＜具有用於交聯劑修飾之反應基之雙股DEL的合成＞ 以實施例10所獲得之「SS-mSABA-DEL」作為模板DNA，以與實施例7同樣的程序施行使用「BCN-Pr」之引子伸長反應，合成具有表53所示之序列的用於交聯劑修飾之反應基之雙股DEL化合物「BCN-DS-mSABA-DEL」。另外，表53中之序列標記係與表26及表52相同，表示「BCN-DS-mSABA-DEL」係由序列編號166與序列編號131的寡核苷酸鏈的雙股所形成。 [表53]
對所獲得之溶液中之一部分進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定具有目標用於交聯劑修飾之反應基之雙股DEL「BCN-DS-mSABA-DEL」(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表53中)。
此外，對所獲得之反應溶液中之一部分進行取樣，在實施例7所示之條件下，施行經由聚丙烯醯胺凝膠電泳之分析。由圖31所示之結果，確認藉由引子的伸長反應，係以高產率轉換成「BCN-DS-mSABA-DEL」。另外，圖31的各泳道的樣品係如下。另外，以各DEL化合物的加樣量各自成為約40ng之方式調製樣品。 泳道1：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) 泳道2：SS-mSABA-DEL 泳道3：SS-mSABA-DEL的引子伸長反應實施後之樣品(BCN-DS-mSABA-DEL) 泳道4：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330)
＜經由與具有用於交聯劑修飾之反應基之雙股DEL之點擊反應之交聯劑修飾雙股DEL(「PSF-DS-mSABA-DEL」)的合成＞ 對上述所獲得之「BCN-DS-mSABA-DEL」，藉由點擊反應導入交聯劑，合成表54所示之序列的交聯劑修飾雙股DEL化合物「PSF-DS-mSABA-DEL」。將合成程序示於下。另外，在表54中之序列標記中，「(PSF-t)」係意味下列式(28)所示之基， 其他標記係與表26相同，表示「PSF-DS-mSABA-DEL」係由序列編號131與序列編號167的寡核苷酸鏈的雙股所形成。 [表54]
在PCR管中加入2-疊氮醋酸N-琥珀醯亞胺酯(125μL，0.2M二甲基亞碸溶液)。在管中加入N,N-二異丙基乙基胺(5.2μL)，接著，4-(2-胺基乙基)苯磺醯氟鹽酸鹽(30mg)，將所獲得之混合物於10℃搖晃1小時。
在所獲得之混合物中加入二甲基亞碸，進行10倍稀釋(稀釋液)。
在PCR管中加入磷酸鈉緩衝液(250mM，pH7.0)的BCN-DS-mSABA-DEL溶液(2μL，0.1mM)，接著，加入二甲基亞碸1.8μL。隨後，加入上述所獲得之稀釋液0.2μL，將所獲得之溶液於25℃搖晃2小時。
對所獲得之溶液內之1μL進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標點擊修飾雙股DEL「PSF-DS-mSABA-DEL」(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表54中)。
＜經由與具有用於交聯劑修飾之反應基之雙股DEL之點擊反應之交聯劑修飾雙股DEL(「BMP-DS-mSABA-DEL」)的合成＞ 對上述所獲得之「BCN-DS-mSABA-DEL」，藉由點擊反應導入交聯劑，合成表55所示之序列的交聯劑修飾雙股DEL化合物「BMP-DS-mSABA-DEL」。將合成程序示於下。另外，在表55中之序列標記中，「(BMP-t)」係意味下列式(29)所示之基， 其他標記係與表26相同，表示「BMP-DS-mSABA-DEL」係由序列編號131與序列編號168的寡核苷酸鏈的雙股所形成。 [表55]
在PCR管中加入3-疊氮丙基胺(4.8mg，0.2M二甲基亞碸溶液)。在管中加入3-馬來醯亞胺丙酸N-琥珀醯亞胺酯(30mg)，將所獲得之混合物於10℃搖晃1小時。
在所獲得之混合物中加入二甲基亞碸，進行10倍稀釋(稀釋液)。
在PCR管中加入磷酸鈉緩衝液(250mM，pH7.0)的BCN-DS-mSABA-DEL溶液(2μL，0.1mM)，接著，加入二甲基亞碸1.8μL。隨後，加入上述所獲得之稀釋液0.2μL，將所獲得之溶液於25℃搖晃2小時。
對所獲得之溶液內之1μL進行取樣，以去離子水稀釋之後，在實施例3的分析條件3的條件下，施行經由ESI-MS之質量分析，鑑定目標點擊修飾雙股DEL「BMP-DS-mSABA-DEL」(將化合物的理論分子量及所檢測而得之分子量示於表55中)。
實施例17 [以U-DEL9-HP作為原料之由模型資料庫向單股DNA之轉換，及新的機能的賦予] ＜使用Lambda Exonuclease之模型資料庫向具有單股DNA之DEL化合物之轉換＞ 使用模型資料庫經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應實施後樣品(實施例6所合成)，以與實施例9同樣的程序實施模型資料庫向具有單股DNA之DEL化合物之轉換。又，將所獲得之溶液作為下一步驟的起始原料。
＜轉換成具有單股DNA之DEL之模型資料庫向交聯劑修飾雙股DEL之轉換＞ 以上述所獲得之轉換成具有單股DNA之DEL之模型資料庫作為模板DNA，以與實施例7同樣的程序實施使用「PXL-Pr」(實施例7所合成)及「BCN-Pr」(實施例16所合成)之引子伸長反應。
＜結果＞ 各自對由上述2種引子伸長反應所獲得之反應溶液中之一部分進行取樣，在實施例7所示之條件下，施行經由聚丙烯醯胺凝膠電泳之分析。由圖32所示之結果，確認藉由引子的伸長反應，係以高產率將經單股DEL化之模型資料庫轉換成光反應性交聯劑修飾雙股DEL及具有用於交聯劑修飾之反應基之雙股DEL。另外，圖32的各泳道的樣品係如下。另外，以各DEL化合物的加樣量各自成為約40ng之方式調製樣品。 泳道1：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) 泳道2：模型資料庫經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應實施後樣品 泳道3：模型資料庫經由Lambda Exonuclease之單股DEL化反應實施後之樣品 泳道4：經單股DEL化之模型資料庫與PXL-Pr之引子伸長反應實施後之樣品 泳道5：經單股DEL化之模型資料庫與BCN-Pr之引子伸長反應實施後之樣品 泳道6：20bp DNA Ladder(Lonza製，Lonza 20bp DNA Ladder，目錄編號50330) [產業上之可利用性]
在本發明中，係提供利用包含能夠選擇性地切割之部位之核酸化合物之方法。再者，在本發明中，係提供將在DNA鏈中包含能夠切割之部位之DEL衍生成交聯劑修飾雙股DEL並進行評價之方法，相較於以往而言，能夠進行兼具「簡便的DEL合成手法」與「DEL評價手法的擴展/改善」之化合物篩選。
[圖1]示出樣式1的例示性DEL製造方法。以包含在DNA鏈中包含能夠切割之部位之第1寡核苷酸鏈、環部位及第2寡核苷酸鏈之頭段作為起始原料，重複進行建構組元的結合及對應於該建構組元之寡核苷酸標籤的雙股接合(在圖1中為3次)，進一步依所期望藉由進行包含引子區域之寡核苷酸標籤的雙股接合，而達成DEL的製造。 [圖2]示出樣式1的例示性DEL的使用方法。對於在頭段的第1寡核苷酸鏈中包含能夠切割之部位之DEL，使用酵素等切割手段切割能夠切割之部位，衍生成未以環部位進行結合之雙股寡核苷酸，藉此可以較高的效率施行PCR。 [圖3]示出樣式2的例示性DEL的使用方法。對於在頭段的第2寡核苷酸鏈中包含能夠切割之部位之DEL，使用酵素等切割手段切割能夠切割之部位，衍生成未以環部位進行結合之雙股寡核苷酸，藉此可以較高的效率施行PCR。 [圖4]示出樣式3的例示性DEL的使用方法。對於在頭段的第1寡核苷酸鏈中及第2寡核苷酸鏈中包含能夠切割之部位之DEL，使用酵素等切割手段切割能夠切割之部位兩者，衍生成未結合有環部位之雙股寡核苷酸，藉此可以較高的效率施行PCR。 [圖5]示出樣式4的例示性DEL的使用法。對於在頭段的第1寡核苷酸鏈中及第2寡核苷酸鏈中包含彼此不同的2種能夠切割之部位之DEL，選擇切割條件，藉此可選擇性地切割第1寡核苷酸鏈或第2寡核苷酸鏈中之一者。 [圖6]示出樣式5的例示性DEL的使用法。在DNA標籤的末端附近設置能夠切割之部位，依所期望切割該部位，藉此可生成新的突出末端。該突出末端可利用作為黏著末端，接合所期望的核酸序列，例如UMIs(特定分子識別序列)等，可賦予新的機能。 [圖7]示出樣式6的例示性DEL的使用法。在本發明中，可將能夠切割之部位與修飾基或機能性分子組合使用，例如，能夠調製將髮夾鏈DNA轉換成單股DNA而得之DEL。 例如，對於所合成之DEL化合物，接合在3’末端具有機能性分子(例如生物素)之雙股寡核苷酸鏈(A)，切割能夠切割之部位(B)，施加因應機能性分子的機能之處理(C)。例如，在機能性分子為生物素之情況，使用具有生物素親和性之鏈黴親和素珠粒等，選擇性地從系統中除去結合有生物素之寡核苷酸鏈。藉此，能夠取得具有單股DNA之DEL。 [圖8]示出樣式6所取得之DEL的例示性使用法。使樣式6所取得之具有單股DNA之DEL與具有所期望的機能部位之修飾寡核苷酸(例如光反應性交聯劑等交聯劑修飾DNA)形成雙股，藉此能夠賦予新的機能。 [圖9]示出樣式7的例示性DEL的使用法。在本發明中，可利用能夠切割之部位，導入交聯劑。 對於所合成之DEL化合物，切割能夠切割之部位(A)，賦予修飾引子(B)，可依據所賦予之引子，合成交聯劑修飾雙股DEL化合物(C)。交聯劑修飾雙股DEL化合物可在DEL資料庫的篩選中顯著地提升檢測感度(參照非專利文獻7、11等)。 [圖10]顯示出在實施例1中，實施包含去氧尿苷之髮夾型DEL的部分結構(U-DEL1-sh、U-DEL2-sh、U-DEL3-sh、U-DEL4-sh、U-DEL5-HP、U-DEL6-HP、U-DEL7-HP、U-DEL8-HP、U-DEL9-HP及U-DEL10-HP共10種)經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應的驗證時，在各保溫培養時間之切割反應的轉化率之圖表。 [圖11]示出在實施例2、3、4、5及7中，各種髮夾DEL(U-DEL1、U-DEL2、U-DEL4、U-DEL7、U-DEL8、U-DEL9、U-DEL10、H-DEL、U-DEL5、U-DEL11、U-DEL12、U-DEL13、I-DEL1、I-DEL2、I-DEL3、R-DEL1及BIO-DEL)的合成程序之概略圖。以對應於各者之頭段作為原料，藉由與雙股寡核苷酸Pr_TAG及CP之2階段雙股接合而達成髮夾DEL合成。 [圖12]示出在實施例2中，8種髮夾DEL(U-DEL1、U-DEL2、U-DEL4、U-DEL7、U-DEL8、U-DEL9、U-DEL10及H-DEL)及雙股DEL(DS-DEL)藉由即時PCR所測定而得之Ct值之按樣品量計之圖表。將藉由USER(註冊商標)enzyme對各種DEL進行處理而得之試料表示為“USER(+)”，未處理之試料表示為“USER(-)”。包含去氧尿苷之能夠切割之髮夾DEL(U-DEL1、U-DEL2、U-DEL4、U-DEL7、U-DEL8、U-DEL9及U-DEL10)在USER(註冊商標)enzyme處理後顯示出與雙股DEL(DS-DEL)同等的Ct值。 [圖13]示出在實施例3中，6種包含去氧尿苷之髮夾DEL(U-DEL5、U-DEL7、U-DEL9、U-DEL11、U-DEL12及U-DEL13)經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應的進行之藉由變性聚丙烯醯胺凝膠電泳所獲得之凝膠的影像。另外，圖中之數字表示各泳道的編號。 [圖14]示出在實施例4中，4種包含去氧肌苷之髮夾DEL(I-DEL1、I-DEL2、I-DEL3及びI-DEL4)經由內核酸酶V之切割反應的進行之藉由變性聚丙烯醯胺凝膠電泳所獲得之凝膠的影像。另外，圖中之數字表示各泳道的編號。 [圖15]示出在實施例5中，包含核糖核苷之髮夾DEL(R-DEL1)經由RNaseHII之切割反應的進行之藉由變性聚丙烯醯胺凝膠電泳所獲得之凝膠的影像。另外，圖中之數字表示各泳道的編號。 [圖16]示出以U-DEL9-HP作為原料之包含3×3×3(27)化合物種之模型資料庫的合成程序之概略圖。在實施例6中，以U-DEL9-HP作為原料，藉由3次(循環A、B、C)拆分及合併(split-and-pool)步驟而達成模型資料庫的合成。此外，在各循環中，包含雙股寡核苷酸標籤的接合反應及用於導入建構組元之化學反應。 [圖17]示出實施例6的模型資料庫合成中之各循環的接合反應的進行之藉由瓊脂糖凝膠電泳所獲得之凝膠的影像。另外，圖中之數字表示各泳道的編號。 [圖18]圖18A為實施例6的模型資料庫合成中之從完成循環C後之樣品中所獲得之層析圖。圖18B為實施例6的模型資料庫合成中之從完成循環C後之樣品中所獲得之MS圖譜的解卷積(deconvolution)結果。 [圖19]示出在實施例6中，模型資料庫經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應的進行之藉由變性聚丙烯醯胺凝膠電泳所獲得之凝膠的影像。另外，圖中之數字表示各泳道的編號。 [圖20]示出在實施例7中，5種在3’末端具有生物素之DEL化合物(「AAZ-BIO-DEL」、「SABA-BIO-DEL」、「ClSABA-BIO-DEL」、「mSABA-BIO-DEL」及「Amino-BIO-DEL」)經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應的進行之藉由變性聚丙烯醯胺凝膠電泳所獲得之凝膠的影像。另外，圖中之數字表示各泳道的編號。 [圖21]示出在實施例7中，使用具有單股DNA之DEL化合物(「SS-AAZ-DEL」、「SS-SABA-DEL」、「SS-ClSABA-DEL」、「SS-mSABA-DEL」及「SS-Amino-DEL」)及光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr」實施引子伸長反應而得之結果之藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所獲得之凝膠的影像。另外，圖中之數字表示各泳道的編號。 [圖22]示出在實施例8中，為了在有無光交聯反應下比較各種光反應性交聯劑修飾雙股DEL的結合劑回收效率，藉由即時PCR測定回收量而得之Ct值及ΔCt值(與陰性對照的Ct值之差)之圖表。將未經UV照射之試料表示為“UV(-)”，將經實施UV照射之試料表示為“UV(+)”。此外，將「溶液S」表示為“S”，將「溶液E」表示為“E”。另外，圖表中之各標記係如下述般對應於各樣品。 圖表中標記：樣品 AAZ：「PXL-DS-AAZ-DEL」 SABA：「PXL-DS-SABA-DEL」 ClSABA：「PXL-DS-ClSABA-DEL」 mSABA：「PXL-DS-mSABA-DEL」 Amino：「PXL-DS-Amino-DEL」 [圖23]示出在實施例10中，使用具有單股DNA之DEL化合物(「SS-AAZ-DEL」、「SS-SABA-DEL」、「SS-ClSABA-DEL」、「SS-mSABA-DEL」及「SS-Amino-DEL」)及光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr2」實施引子伸長反應而得之結果之藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所獲得之凝膠的影像。另外，圖中之數字表示各泳道的編號。 [圖24]示出在實施例10中，使用具有單股DNA之DEL化合物(「SS-AAZ-DEL3」、「SS-SABA-DEL3」、「SS-ClSABA-DEL3」、「SS-mSABA-DEL3」及「SS-Amino-DEL3」)及光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr3」實施引子伸長反應而得之結果之藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所獲得之凝膠的影像。另外，圖中之數字表示各泳道的編號。 [圖25]示出在實施例11中，為了在有無光交聯反應下比較連結子結構不同的各種光反應性交聯劑修飾雙股DEL的結合劑回收效率，使用藉由即時PCR所測定而得之Ct值所算出之ΔCt值(與陰性對照之差)之圖表。將未經UV照射之試料表示為“UV(-)”，將經實施UV照射之試料表示為“UV(+)”。此外，圖表中之各標記係如下述般對應於各樣品。 圖表中標記：樣品 mSABA-DEL2：「PXL-DS-mSABA-DEL2」 mSABA-DEL3：「PXL-DS-mSABA-DEL3」 [圖26]示出在實施例12中，為了比較各種「在交聯劑與編碼序列之間具有共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」及各種「在交聯劑與編碼序列之間無共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」的結合劑回收效率，使用藉由即時PCR所測定而得之Ct值所算出之ΔCt值(與陰性對照之差)之圖表。另外，圖表中之各條柱從左起依序如下述般對應於各樣品。 最左的條柱：未經UV照射之「PXL-DS-SABA-DEL3」 從左起第2個條柱：未經UV照射之「PXL-DS-ClSABA-DEL3」 從左起第3個條柱：未經UV照射之「PXL-DS-mSABA-DEL3」 從左起第4個條柱：經實施UV照射之「PXL-DS-SABA-DEL3」 從左起第5個條柱：經實施UV照射之「PXL-DS-ClSABA-DEL3」 從左起第6個條柱：經實施UV照射之「PXL-DS-mSABA-DEL3」 從左起第7個條柱：未經UV照射之「PXL-DS-SABA-DEL4」 從左起第8個條柱：未經UV照射之「PXL-DS-ClSABA-DEL4」 從左起第9個條柱：未經UV照射之「PXL-DS-mSABA-DEL4」 從左起第10個條柱：經實施UV照射之「PXL-DS-SABA-DEL4」 從左起第11個條柱：經實施UV照射之「PXL-DS-ClSABA-DEL4」 最右的條柱：經實施UV照射之「PXL-DS-mSABA-DEL4」 [圖27]示出在實施例13中，為了比較各種「在交聯劑與編碼序列之間具有共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」及各種「在交聯劑與編碼序列之間無共價鍵之光反應性交聯劑修飾雙股DEL」的結合劑回收效率，使用藉由即時PCR所測定而得之Ct值所算出之ΔCt值(與陰性對照之差)之圖表。另外，圖表中之各條柱從左起依序如下述般對應於各樣品。 最左的條柱：未經UV照射之「PXL-DS-SABA-DEL3」 從左起第2個條柱：未經UV照射之「PXL-DS-ClSABA-DEL3」 從左起第3個條柱：未經UV照射之「PXL-DS-mSABA-DEL3」 從左起第4個條柱：經實施UV照射之「PXL-DS-SABA-DEL3」 從左起第5個條柱：經實施UV照射之「PXL-DS-ClSABA-DEL3」 從左起第6個條柱：經實施UV照射之「PXL-DS-mSABA-DEL3」 從左起第7個條柱：未經UV照射之「PXL-DS-SABA-DEL4」 從左起第8個條柱：未經UV照射之「PXL-DS-ClSABA-DEL4」 從左起第9個條柱：未經UV照射之「PXL-DS-mSABA-DEL4」 從左起第10個條柱：經實施UV照射之「PXL-DS-SABA-DEL4」 從左起第11個條柱：經實施UV照射之「PXL-DS-ClSABA-DEL4」 最右的條柱：經實施UV照射之「PXL-DS-mSABA-DEL4」 [圖28]示出在實施例14中，髮夾DEL化合物(「mSABA-DEL5」)經由USER(註冊商標)enzyme之切割反應的進行之藉由變性聚丙烯醯胺凝膠電泳所獲得之凝膠的影像。另外，圖中之數字表示各泳道的編號。 [圖29]示出在實施例14中，使用具有單股DNA之DEL化合物(「SS-mSABA-DEL5」)及光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr5」實施引子伸長反應而得之結果之藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所獲得之凝膠的影像。另外，圖中之數字表示各泳道的編號。 [圖30]示出在實施例15中，使用具有單股DNA之DEL化合物「SS-mSABA-DEL」及交聯劑修飾引子「TPD-Pr」，以及「SS-ClSABA-DEL」及「ACA-Pr」實施引子伸長反應而得之結果之藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所獲得之凝膠的影像。另外，圖中之數字表示各泳道的編號。 [圖31]示出在實施例16中，使用具有單股DNA之DEL化合物(「SS-mSABA-DEL」)及用於交聯劑修飾之反應基修飾引子「BCN-Pr」實施引子伸長反應而得之結果之藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所獲得之凝膠的影像。另外，圖中之數字表示各泳道的編號。 [圖32]示出在實施例17中，使用經單股DEL化之模型資料庫、光反應性交聯劑修飾引子「PXL-Pr」及用於交聯劑修飾之反應基修飾引子「BCN-Pr」實施引子伸長反應而得之結果之藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳所獲得之凝膠的影像。另外，圖中之數字表示各泳道的編號。

Claims (123)

  1. 一種衍生自具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DNA編碼化資料庫(DEL)之交聯劑修飾雙股DEL之評價方法，其係由以下步驟所構成： (1)使該DEL與生物學標的在適於該DEL的至少1個資料庫分子與生物學標的進行結合之條件下進行接觸， (2)使已與生物學標的進行結合之資料庫分子的交聯劑與生物學標的進行交聯， (3)從未進行交聯之資料庫分子中分離出經交聯之資料庫分子與生物學標的之複合體， (4)鑑定所回收而得之複合體中之資料庫分子所具有之寡核苷酸的序列， (5)使用(4)中所決定之序列，鑑定與生物學標的進行結合之1種以上化合物的結構。
  2. 如請求項1之方法，其中，前述交聯劑修飾雙股DEL的交聯劑係與具有編碼序列之寡核苷酸經由共價鍵進行連結。
  3. 如請求項1或2之方法，其中，前述交聯劑修飾雙股DEL的交聯劑係直接結合至寡核苷酸的5’末端，或者經由2官能性間隔子進行結合。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中，衍生成交聯劑修飾雙股DEL包含以下步驟： (i)切割具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL的至少一個「能夠選擇性地切割之部位」，轉換成雙股DEL； (ii)除去(i)所獲得之雙股DEL中，資料庫分子未結合之寡核苷酸，轉換成單股DEL； (iii)藉由使(ii)所獲得之單股DEL與交聯劑修飾DNA進行雙股形成，而衍生成交聯劑修飾雙股DEL。
  5. 如請求項1至3中任一項之方法，其中，衍生成交聯劑修飾雙股DEL包含以下步驟： (i)切割具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL的至少一個「能夠選擇性地切割之部位」，轉換成雙股DEL； (ii)除去(i)所獲得之雙股DEL中，資料庫分子未結合之寡核苷酸，轉換成單股DEL； (iii)使(ii)所獲得之單股DEL與具有用於交聯劑修飾之反應基之DNA進行雙股形成； (iv)藉由使用於交聯劑修飾之反應基與交聯劑單元進行反應，而衍生成交聯劑修飾雙股DEL。
  6. 如請求項1至3中任一項之方法，其中，衍生成交聯劑修飾雙股DEL包含以下步驟： (i)切割具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL的至少一個「能夠選擇性地切割之部位」，轉換成雙股DEL； (ii)除去(i)所獲得之雙股DEL中，資料庫分子未結合之寡核苷酸，轉換成單股DEL； (iii)對(ii)所獲得之單股DEL賦予交聯劑修飾引子，使所賦予之引子伸長，衍生成交聯劑修飾雙股DEL。
  7. 如請求項1至3中任一項之方法，其中，衍生成交聯劑修飾雙股DEL包含以下步驟： (i)切割具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL的至少一個「能夠選擇性地切割之部位」，轉換成雙股DEL； (ii)除去(i)所獲得之雙股DEL中，資料庫分子未結合之寡核苷酸，轉換成單股DEL； (iii)對(ii)所獲得之單股DEL賦予具有用於交聯劑修飾之反應基之修飾引子，使所賦予之引子伸長，衍生成具有用於交聯劑修飾之反應基之雙股DEL； (iv)藉由使用於交聯劑修飾之反應基與交聯劑單元進行反應，而衍生成交聯劑修飾雙股DEL。
  8. 如請求項1至3中任一項之方法，其中，衍生成交聯劑修飾雙股DEL包含以下步驟： (i)切割具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL的至少一個「能夠選擇性地切割之部位」，轉換成雙股DEL； (ii)對(i)所獲得之雙股DEL賦予交聯劑修飾引子，使所賦予之引子伸長，衍生成交聯劑修飾雙股DEL。
  9. 如請求項1至3中任一項之方法，其中，衍生成交聯劑修飾雙股DEL包含以下步驟： (i)切割具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL的至少一個「能夠選擇性地切割之部位」，轉換成雙股DEL； (ii)對(i)所獲得之雙股DEL賦予具有用於交聯劑修飾之反應基之修飾引子，使所賦予之引子伸長，藉由使用於交聯劑修飾之反應基與交聯劑單元進行反應，而衍生成交聯劑修飾雙股DEL。
  10. 如請求項6或8之方法，其係以下列者為特徵： (I)使用至少一個「能夠選擇性地切割之部位」存在於從資料庫分子所結合之部位起3’方向之髮夾型DEL； (II)使用交聯劑直接結合至寡核苷酸的5’末端，或者經由2官能性間隔子進行結合之交聯劑修飾引子。
  11. 如請求項7或9之方法，其係以下列者為特徵： (I)使用至少一個「能夠選擇性地切割之部位」存在於從資料庫分子所結合之部位起3’方向之髮夾型DEL； (II)使用用於交聯劑修飾之反應基直接結合至寡核苷酸的5’末端，或者經由2官能性間隔子進行結合之具有用於交聯劑修飾之反應基之修飾引子。
  12. 如請求項4至7中任一項之方法，其中，在前述(ii)的步驟中，資料庫分子未結合之寡核苷酸具有機能性分子，且其係藉由因應於該機能性分子的機能之處理而被除去。
  13. 如請求項12之方法，其中，機能性分子為生物素。
  14. 如請求項4至7中任一項之方法，其中，在前述(ii)的步驟中，資料庫分子未結合之寡核苷酸的除去為核酸外切酶所引發之分解。
  15. 如請求項14之方法，其中，核酸外切酶為λ核酸外切酶。
  16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中，交聯劑包含至少一個疊氮基、二氮雜環丙烯基、磺醯氟基、重氮基、桂皮醯基或丙烯酸酯。
  17. 如請求項1至15中任一項之方法，其中，交聯劑包含至少一個疊氮基、二氮雜環丙烯基或磺醯氟基。
  18. 如請求項1至15中任一項之方法，其中，交聯劑包含式(AA)~(AE)中之任一結構： (式中，＊係意味與雙股DEL的5’末端或與該5’末端進行結合之2官能性間隔子側之結合位置)。
  19. 如請求項1至15中任一項之方法，其中，交聯劑為式(AA)~(AE)中之任一結構： (式中，＊係意味與雙股DEL的5’末端或與該5’末端進行結合之2官能性間隔子側之結合位置)。
  20. 如請求項1至15中任一項之方法，其中，交聯劑包含式(BA)或(BB)中之任一結構： (式中，＊係意味與雙股DEL的5’末端或與該5’末端進行結合之2官能性間隔子側之結合位置)。
  21. 如請求項1至15中任一項之方法，其中，交聯劑為式(BA)或(BB)中之任一結構： (式中，＊係意味與雙股DEL的5’末端或與該5’末端進行結合之2官能性間隔子側之結合位置)。
  22. 如請求項5、7、9或11中任一項之方法，其中，用於交聯劑修飾之反應基為用於點擊反應之反應基。
  23. 如請求項5、7、9或11中任一項之方法，其中，用於交聯劑修飾之反應基為炔基、烯基、疊氮基或四嗪基。
  24. 如請求項5、7、9或11中任一項之方法，其中，用於交聯劑修飾之反應基為式(CA)~(CL)中之任一結構： (式中，＊係意味與雙股DEL的5’末端或與5’末端進行結合之2官能性間隔子側之結合位置)。
  25. 如請求項1至19中任一項之方法，其中，(2)的「使已與生物學標的進行結合之資料庫分子的交聯劑與生物學標的進行交聯」步驟為「藉由光照射使已與生物學標的進行結合之資料庫分子的交聯劑與生物學標的進行交聯」步驟。
  26. 如請求項25之方法，其中，光照射的條件為波長250~500nm的光照射。
  27. 如請求項25之方法，其中，光照射的條件為波長365nm的光照射。
  28. 如請求項25至27中任一項之方法，其中，光照射的條件為10秒~180分鐘的光照射。
  29. 如請求項25至27中任一項之方法，其中，光照射的條件為30秒~30分鐘的光照射。
  30. 如請求項1至24中任一項之方法，其中，(2)的「使已與生物學標的進行結合之資料庫分子的交聯劑與生物學標的進行交聯」步驟為「藉由保溫培養使已與生物學標的進行結合之資料庫分子的交聯劑與生物學標的進行交聯」步驟。
  31. 如請求項1至30中任一項之方法，其中，(3)的「從未進行交聯之資料庫分子中分離出經交聯之資料庫分子與生物學標的之複合體」步驟為「藉由電泳從未進行交聯之資料庫分子中分離出經交聯之資料庫分子與生物學標的之複合體」步驟。
  32. 如請求項31之方法，其中，電泳為凝膠電泳。
  33. 如請求項31之方法，其中，電泳為毛細管電泳。
  34. 如請求項1至30中任一項之方法，其中，(3)的「從未進行交聯之資料庫分子中分離出經交聯之資料庫分子與生物學標的之複合體」步驟為「藉由將生物學標的固定化至固定化用擔體及洗淨除去未進行交聯之資料庫分子而分離出經交聯之資料庫分子與生物學標的之複合體」。
  35. 如請求項1至34中任一項之方法，其中，具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL為式(I)所示之化合物： (式中， X及Y為寡核苷酸鏈， E及F各自獨立地為由核苷酸或核酸類似物所構成之寡聚物， 惟，E及F包含彼此互補的鹼基序列，形成雙鏈寡核苷酸， LP為環部位， L為連結子， D為源自反應性官能基之2價基， Sp為鍵結或2官能性間隔子， An為由至少1個建構組元所構成之部分結構)， 其中， X與Y具有至少一部分可形成雙鏈之序列， X以5’末端結合至E， Y以3’末端結合至F， 在E、F或LP中之至少任1個部位，具有至少1個能夠選擇性地切割之部位。
  36. 如請求項35之方法，其中，具有「能夠選擇性地切割之部位」之髮夾型DEL為式(III)所示之DEL： An-Sp-C-Bn   (III) (式中， An及Sp表示與請求項35相同的意義， Bn表示由寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y所形成之雙股寡核苷酸標籤， C為式(I)： (式中，E、LP、L、D及F表示與請求項35相同的意義，惟，D係與An直接結合，或者經由2官能性間隔子進行結合，E及F結合至雙股寡核苷酸標籤Bn的各對應末端側)。
  37. 如請求項35或36之方法，其中，An係與請求項35相同，且為由n個建構組元α1~αn(n為1~10的整數)所構築之部分結構， Bn為由寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y所形成之雙股寡核苷酸標籤，且為包含含可鑑定An的結構之鹼基序列之寡核苷酸之部分結構。
  38. 如請求項35至37中任一項之方法，其中，LP為(LP1)p-LS-(LP2)q所示之環部位， LS為從以下(A)至(C)所記載之化合物群組中選出之部分結構： (A)核苷酸， (B)核酸類似物， (C)可具有取代基之C1~14的3價基； LP1為從以下(1)及(2)所記載之化合物群組中單獨地或不同地選出p個之各部分結構： (1)核苷酸， (2)核酸類似物； LP2為從以下(1)及(2)所記載之化合物群組中單獨地或不同地選出q個之各部分結構： (1)核苷酸， (2)核酸類似物； p及q的總數為0~40。
  39. 如請求項38之方法，其中，p及q的總數為2~20。
  40. 如請求項38之方法，其中，p及q的總數為2~10。
  41. 如請求項38之方法，其中，p及q的總數為2~7。
  42. 如請求項38之方法，其中，p及q的總數為0。
  43. 如請求項38至42中任一項之方法，其中，LP1、LP2及LS各自為從以下結構中單獨地或不同地選出之結構： (A)核苷酸，或 (B)以下列(B11)至(B15)為要件之核酸類似物： (B11)具有磷酸(或相當部位)及羥基(或其相當部位)， (B12)由碳、氫、氧、氮、磷或硫所構成， (B13)分子量為142至1500， (B14)殘基間原子數為3~30， (B15)殘基間之原子的結合樣式全部皆為單鍵，或者包含1至2個雙鍵且其餘為單鍵。
  44. 如請求項38至43中任一項之方法，其中，LP1、LP2及LS各自為從以下結構中單獨地或不同地選出之結構： (A)核苷酸，或 (B)以下列(B21)至(B25)為要件之核酸類似物： (B21)具有磷酸及羥基， (B22)由碳、氫、氧、氮或磷所構成， (B23)分子量為142至1000， (B24)殘基間原子數為3~15， (B25)殘基間之原子的結合樣式全部皆為單鍵。
  45. 如請求項38至44中任一項之方法，其中，LP1、LP2及LS各自為從以下結構中單獨地或不同地選出之結構： (A)核苷酸，或 (B)以下列(B31)至(B35)為要件之核酸類似物： (B31)具有磷酸及羥基， (B32)由碳、氫、氧、氮或磷所構成， (B33)分子量為142至700， (B34)殘基間原子數為4~7， (B35)殘基間之原子的結合樣式全部皆為單鍵。
  46. 如請求項38至45中任一項之方法，其中，LP1及LP2各自為以下中之任一者： (B41)d-Spacer， (B5)聚烷二醇磷酸酯。
  47. 如請求項38至46中任一項之方法，其中，LP1及LP2各自為二乙二醇磷酸酯或三乙二醇磷酸酯。
  48. 如請求項38至47中任一項之方法，其中，LP1及LP2各自為三乙二醇磷酸酯。
  49. 如請求項38至46中任一項之方法，其中，LP1及LP2各自為d-Spacer。
  50. 如請求項38至45中任一項之方法，其中，LP1及LP2各自為核苷酸。
  51. 如請求項38至50中任一項之方法，其中，LS為式(a)~式(g)中之任一者： (式中，＊係意味與連結子之結合位置，＊＊係意味與LP1或LP2之結合位置，R為氫原子或甲基)。
  52. 如請求項38至50中任一項之方法，其中，LS為式(h)： (式中，＊係意味與連結子之結合位置，＊＊係意味與LP1或LP2之結合位置)。
  53. 如請求項38至50中任一項之方法，其中，LS為聚烷二醇磷酸酯。
  54. 如請求項38至50中任一項之方法，其中，LS為式(i)~式(k)： (式中，n1、m1、p1及q1各自獨立地為1~20的整數，＊係意味與連結子之結合位置，＊＊係意味與LP1或LP2之結合位置)。
  55. 如請求項38至50中任一項之方法，其中，LS為式(l)： (式中，＊係意味與連結子之結合位置，＊＊係意味與LP1或LP2之結合位置)。
  56. 如請求項38至50中任一項之方法，其中，LS為(B42)、(B43)或(B44)中之任一者： (B42)Amino C6 dT， (B43)mdC(TEG-Amino)， (B44)Uni-Link(註冊商標)Amino Modifier。
  57. 如請求項38至50中任一項之方法，其中，LS為核苷酸。
  58. 如請求項38至42及46至50中任一項之方法，其中，LS為(C)可具有取代基之C1~14的3價基，(C)為以下結構中之任一者： (1)可具有取代基且可經1~3個雜原子置換之C1~10脂肪族烴， (2)可具有取代基之C6~14芳香族烴， (3)可具有取代基之C2~9芳香族雜環，或 (4)可具有取代基之C2~9非芳香族雜環。
  59. 如請求項38至42及46至50中任一項之方法，其中，LS為(C)可具有取代基之C1~14的3價基，(C)為以下結構中之任一者： (1)可具有取代基之C1~6脂肪族烴， (2)可具有取代基之C6~10芳香族烴，或 (3)可具有取代基之C2~5芳香族雜環。
  60. 如請求項38至42及46至50中任一項之方法，其中，LS為(C)可具有取代基之C1~14的3價基，(C)為以下結構中之任一者： (1)C1~6脂肪族烴， (2)苯，或 (3)C2~5含氮芳香族雜環， 在此處，前述(1)~(3)係未經取代，或可經從取代基群組ST1中單獨地或不同地選出之1~3個取代基取代，取代基群組ST1為由C1~6烷基、C1~6烷氧基、氟原子及氯原子所構成之群組，惟，在取代基群組ST1對脂肪族烴進行取代之情況，不從取代基群組ST1中選出烷基。
  61. 如請求項38至42及46至50中任一項之方法，其中，LS為(C)可具有取代基之C1~14的3價基，(C)為以下結構中之任一者： (1)C1~6烷基，或 (2)未經取代或者經1個或2個C1~3烷基或C1~3烷氧基取代之苯。
  62. 如請求項38至42及46至50中任一項之方法，其中，LS為(C)可具有取代基之C1~14的3價基，(C)為以下結構： (1)C1~6烷基。
  63. 如請求項36至62中任一項之方法，其中，E及F各自獨立地為由核苷酸或核酸類似物所構成之寡聚物， E及F的鏈長各自為3至40。
  64. 如請求項35至63中任一項之方法，其中，E及F各自獨立地為由核苷酸或核酸類似物所構成之寡聚物， E及F的鏈長各自為4至30。
  65. 如請求項35至64中任一項之方法，其中，E及F各自獨立地為由核苷酸或核酸類似物所構成之寡聚物， E及F的鏈長各自為6至25。
  66. 如請求項35至65中任一項之方法，其中，E及F各自獨立地為由核苷酸或核酸類似物所構成之寡聚物， E及F包含彼此互補的鹼基序列，形成雙鏈寡核苷酸， E及F之雙鏈寡核苷酸為突出末端。
  67. 如請求項66之方法，其中，前述突出末端的突出部為2個鹼基以上的長度。
  68. 如請求項35至65中任一項之方法，其中，E及F各自獨立地為由核苷酸或核酸類似物所構成之寡聚物， E及F包含彼此互補的鹼基序列，形成雙鏈寡核苷酸， E及F之雙鏈寡核苷酸為平滑末端。
  69. 如請求項35至68中任一項之方法，其中，E及F中所包含之彼此互補的鹼基序列的鏈長各自為3個鹼基以上。
  70. 如請求項35至69中任一項之方法，其中，E及F中所包含之彼此互補的鹼基序列的鏈長各自為4個鹼基以上。
  71. 如請求項35至70中任一項之方法，其中，E及F中所包含之彼此互補的鹼基序列的鏈長各自為6個鹼基以上。
  72. 如請求項35至71中任一項之方法，其中，E及F各自獨立地為由核苷酸所構成之寡聚物。
  73. 如請求項35至72中任一項之方法，其中，核苷酸為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸。
  74. 如請求項35至73中任一項之方法，其中，核苷酸為去氧核糖核苷酸。
  75. 如請求項35至74中任一項之方法，其中，核苷酸為去氧腺苷、去氧鳥苷、胸苷或去氧胞苷。
  76. 如請求項35至71中任一項之方法，其中，E及F各自獨立地為由核酸類似物所構成之寡聚物。
  77. 如請求項35至76中任一項之方法，其中，L為 (1)可具有取代基且可經1~3個雜原子置換之C1~20脂肪族烴，或 (2)可具有取代基之C6~14芳香族烴。
  78. 如請求項35至77中任一項之方法，其中，L為可具有取代基之C1~6脂肪族烴、可經1或2個氧原子置換之C1~6脂肪族烴或可具有取代基之C6~10芳香族烴。
  79. 如請求項35至78中任一項之方法，其中，L為可經取代基群組ST1取代之C1~6脂肪族烴或可經取代基群組ST1取代之苯，在此處，取代基群組ST1為由C1~6烷基、C1~6烷氧基、氟原子及氯原子所構成之群組(惟，在取代基群組ST1對脂肪族烴進行取代之情況，不從取代基群組ST1中選出烷基)。
  80. 如請求項35至79中任一項之方法，其中，L為C1~6烷基，或未經取代或者經1個或2個C1~3烷基或C1~3烷氧基取代之苯。
  81. 如請求項35至80中任一項之方法，其中，L為C1~6烷基。
  82. 如請求項35至81中任一項之方法，其中，D的反應性官能基為可構成C-C、胺基、醚、羰基、醯胺、酯、脲、硫醚、二硫醚、亞碸、磺醯胺或磺醯鍵之反應性官能基。
  83. 如請求項35至82中任一項之方法，其中，D的反應性官能基為具有脫離基之C1烴、胺基、羥基、羰基的前驅物、硫醇基或醛基。
  84. 如請求項35至83中任一項之方法，其中，D的反應性官能基為具有鹵素原子之C1烴、具有磺酸系脫離基之C1烴、胺基、羥基、羧基、鹵化羧基、硫醇基或醛基。
  85. 如請求項35至84中任一項之方法，其中，D的反應性官能基為-CH 2Cl、-CH 2Br、-CH 2OSO 2CH 3、-CH 2OSO 2CF 3、胺基、羥基或羧基。
  86. 如請求項35至85中任一項之方法，其中，D的反應性官能基為一級胺基。
  87. 如請求項35至87中任一項之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為並非去氧腺苷、去氧鳥苷、胸苷及去氧胞苷中之任何者之去氧核糖核苷。
  88. 如請求項35至87中任一項之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為去氧尿苷、溴去氧尿苷、去氧肌苷、8-羥基去氧鳥苷、3-甲基-2’-去氧腺苷、N6-亞乙烯基-2’-去氧腺苷、7-甲基-2’-去氧鳥苷、2’-去氧黃苷或5,6-二羥基-5,6-二氫去氧胸苷。
  89. 如請求項35至88中任一項之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為去氧尿苷或去氧肌苷。
  90. 如請求項35至89中任一項之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為去氧尿苷。
  91. 如請求項35至89中任一項之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為去氧肌苷。
  92. 如請求項35至86中任一項之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為從去氧肌苷起朝3’方向第2個磷酸二酯鍵。
  93. 如請求項35至86中任一項之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為核糖核苷。
  94. 如請求項35至93中任一項之方法，其中，能夠選擇性地切割之部位為1個。
  95. 如請求項35至93中任一項之方法，其中，在E或(LP1)p中包含至少1個能夠切割之部位，且在F或(LP2)q中包含至少1個能夠切割之部位。
  96. 如請求項95之方法，其中，E或(LP1)p中所包含之能夠切割之部位與F或(LP2)q中所包含之能夠切割之部位能夠在不同的條件下進行切割。
  97. 如請求項35至96中任一項之方法，其中，An為由n個建構組元α1~αn(n為1~10的整數)所構築之部分結構。
  98. 如請求項35至97中任一項之方法，其中，An為低分子有機化合物。
  99. 如請求項35至98中任一項之方法，其中，An的建構組元為分子量500以下的化合物。
  100. 如請求項35至99中任一項之方法，其中，An的建構組元為分子量300以下的化合物。
  101. 如請求項35至100中任一項之方法，其中，An的建構組元為分子量150以下的化合物。
  102. 如請求項35至101中任一項之方法，其中，An為由從H、B、C、N、O、Si、P、S、F、Cl、Br及I所組成之元素群組單獨地或不同地選出之元素所構成之有機化合物。
  103. 如請求項35至102中任一項之方法，其中，An為具有從芳基、非芳香族環基、雜芳基及非芳香族雜環基所組成之取代基群組單獨地或不同地選出之取代基之低分子有機化合物。
  104. 如請求項35至103中任一項之方法，其中，An為分子量5000以下。
  105. 如請求項35至104中任一項之方法，其中，An為分子量800以下。
  106. 如請求項35至105中任一項之方法，其中，An為分子量500以下。
  107. 如請求項35至97中任一項之方法，其中，An為多肽。
  108. 如請求項35至107中任一項之方法，其中，Sp為2官能性間隔子。
  109. 如請求項1至107中任一項之方法，其中，2官能性間隔子各自為SpD-SpL-SpX， SpD為源自可構成C-C、胺基、醚、羰基、醯胺、酯、脲、硫醚、二硫醚、亞碸、磺醯胺或磺醯鍵之反應性基之2價基， SpL為聚烷二醇、聚乙烯、可任意地經雜原子置換之C1~20脂肪族烴、胜肽、寡核苷酸或此等之組合， SpX為源自形成胺基、羰基、醯胺、酯、脲或磺醯胺鍵之反應基之2價基。
  110. 如請求項1至107中任一項之方法，其中，2官能性間隔子各自為SpD-SpL-SpX， SpD為源自一級胺基之2價基， SpL為聚乙二醇或聚乙烯， SpX為源自羧基之2價基。
  111. 如請求項35至110中任一項之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y為能夠形成雙鏈之序列。
  112. 如請求項35至111中任一項之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y包含互補的鹼基序列。
  113. 如請求項35至112中任一項之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y各自為1~200個鹼基的長度。
  114. 如請求項35至113中任一項之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y各自為3~150個鹼基的長度。
  115. 如請求項35至114中任一項之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y各自為30~150個鹼基的長度。
  116. 如請求項35至115中任一項之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y具有平滑末端。
  117. 如請求項35至115中任一項之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y具有突出末端。
  118. 如請求項117之方法，其中，突出末端的突出部為1~30個鹼基的長度。
  119. 如請求項117或118之方法，其中，突出末端的突出部為2~5個鹼基的長度。
  120. 如請求項117至119中任一項之方法，其中，寡核苷酸鏈X及寡核苷酸鏈Y具有突出末端，在該突出末端進一步結合有特定分子識別序列。
  121. 如請求項35至120中任一項之方法，其中，在X及Y中之任一者結合有機能性分子。
  122. 如請求項35至120中任一項之方法，其中，在X及Y中之任一者結合有生物素。
  123. 如請求項35至107中任一項之方法，其中，Sp為鍵結。
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