TWI659751B - 用以治療腦部疾病之可重複裝載之改良水膠系統 - Google Patents
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Abstract
一種藥物傳輸系統,及其於將一聚乙二醇化修飾之治療藥劑輸送至腦部的用途。該藥物傳輸系統包含一可結合至聚乙二醇之抗體,其中該抗體包埋在水膠中,該水膠包含一或多種生物降解性聚合物,且至多約60%之該一或多種生物降解性聚合物包含鏈間或鏈內共價交聯。在該藥物傳輸系統中的抗體量可約為每微升水膠1至2微克。
Description
本揭示內容是關於一種藥物傳輸系統。更具體來說,本揭示內容是關於一種可重複裝載之藥物傳輸系統及其於治療腦部疾病之用途。
由於多種因素使然,使得將治療藥劑輸送至腦部以治療腦部病狀諸如腦部腫瘤一事備受挑戰。血腦障壁會阻斷全身性輸送的藥劑使其無法進入腦部。局部注射,諸如輸送治療藥劑至顱內間隙,會非常具有侵入性且頻繁的注射可帶來多種併發症。
因此,研發新穎且有效的藥物傳輸系統以輸送治療藥劑至腦部來治療腦部病狀,例如,神經膠瘤(glioma),至關重要。
本揭示內容至少一部分係基於發明人研發一種包含水膠的藥物傳輸系統,其包含能夠吸引治療藥劑至腦部之抗體。
在一態樣中,本揭示內容提供一種用以將一治療藥劑吸引至腦部的藥物傳輸系統,該藥物傳輸系統包含一包埋在一水膠中的抗體,其中該水膠包含一或多種生物降解性聚合物(例如玻尿酸(hyaluronic acid,HA)分子)。該抗體是與聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)結合。該水膠每微升可含有約1至2微克抗體。在某些實例中,至多約60%(例如約25%至約50%)之該一或多種生物降解性聚合物包含鏈間(inter-chain)及/或鏈內(intra-chain)共價交聯(covalent crosslink)。
用於本揭示內容之抗-PEG抗體可為人類抗體或人源化抗體(humanized antibody)。在某些實施方式中,該抗體為免疫球蛋白分子,舉例來說,IgG或IgM分子。
在另一態樣中,本揭示內容提供一種用以將一治療藥劑輸送至腦部之套組。該套組可包含:(i) 任一種本揭示內容之藥物傳輸系統;以及(ii) 一種用以治療腦部病症之治療藥劑,其中該治療藥劑係與聚乙二醇(PEG)接合。該治療藥劑可為一種用以治療腦部癌症之藥物,舉例來說,微脂體多柔比星(liposomal doxorubicin)、微脂體阿德力黴素(liposomal adriamycin)、替莫唑胺(temozolomide)、紫杉醇(paclitaxel)、泛艾黴素(epirubicin)、順-二胺二氯鉑(cisplantin)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、精胺酸酶(arginase)、精胺酸脫亞胺酶(arginine deiminase)、天冬醯胺酶(aspariginase)、抗體(例如抗-VEGF抗體),或細胞激素(cytokines)(例如干擾素)。
在再另一態樣中,本揭示內容提供一種用以將一治療藥劑輸送至腦部之方法,包含:(i) 對一罹患腦部病症之個體的腦部(例如顱內)投予任一種本揭示內容之藥物傳輸系統;以及(ii) 對該個體全身性地投予一用以治療該腦部病症之治療藥劑,其中該治療藥劑係與PEG接合。可對該個體多次投予藥物傳輸系統。或者是,僅對該個體投予一次藥物傳輸系統。在任一種本揭示內容之方法中,每次對該個體投予約1至2毫升之藥物傳輸系統。
接受本揭示內容所述方法治療之個體可為一罹患腦部腫瘤的人類病患。該與PEG接合之治療藥劑可為一抗-癌症藥劑,舉例來說,微脂體多柔比星、微脂體阿德力黴素、替莫唑胺、紫杉醇、泛艾黴素、順-二胺二氯鉑、愛萊諾迪肯、精胺酸酶、精胺酸脫亞胺酶、天冬醯胺酶、抗體(例如抗-VEGF抗體),及/或細胞激素(例如干擾素)。
本揭示內容之範圍亦涵蓋一種包埋如本揭示內容所述之抗-PEG抗體的水膠,其與用以治療腦部病症之聚乙二醇化(pegylated)治療藥劑共同使用時,可將該治療藥劑輸送至腦部,進而治療腦部病症。本揭示內容亦提供本揭示內容之藥物傳輸系統(連同聚乙二醇化修飾之治療藥劑)於製備用以治療特定疾病之藥物的用途。
本揭示內容一或多個實施方式的詳細內容陳述於下文說明書中。根據下列圖式及若干實施方式的詳細說明亦及隨附申請專利範圍,本揭示內容的其他特徵或優點將顯而易見。
由於不同的器官有不同的生理條件,需要不同的藥物傳輸系統以增強治療藥劑之輸送效率及滯留時間,以治療特殊器官相關的疾病,例如腦部。
由於血腦障壁的緣故使輸送治療藥劑至腦部一事備受挑戰,該轉移的病理-生理考量,及/或由注射藥劑至該有限的顱內間隙所帶來的潛在併發症。所有此等因素呈現了獨特的挑戰性在配置對腦部疾病,諸如腦部腫瘤(例如神經膠瘤)可達到最高的治療效益的藥物傳輸系統。
本揭示內容提供了改良的藥物傳輸系統以增強藥物輸送至腦部之效率及/或延長藥物在腦部區帶之滯留。本揭示內容之藥物傳輸系統包含包埋一種適當的抗-PEG抗體之水膠。可設計該藥物傳輸系統之特徵,舉例來說,用於該水膠之生物降解性聚合物類型、交聯含量、該抗-PEG抗體之特徵、在該藥物傳輸系統中相對於水膠之抗體量等,以使該藥物傳輸系統特別適於輸送治療藥劑至腦部。
舉例來說,該藥物傳輸系統可包含非常高的抗體含量,例如每微升1至2微克。由於僅有小量體積可注入腦部及/或治療藥劑不良進入至腦部的緣故,高抗體濃度特別適於利用本揭示內容之藥物傳輸系統來輸送治療藥劑至腦部。在該藥物傳輸系統中高濃度的抗-PEG抗體使其能夠捕獲有限量的進入腦部的聚乙二醇化修飾的治療藥劑,從而增強期望的治療功效。
或是或除此外,該藥物傳輸系統含有具有適當交聯程度(例如至多約60%)之生物降解性聚合物。發明人意外地觀察到,生物降解性聚合物(諸如玻尿酸)較高的交聯程度導致較低的抗體滯留,而較低的交聯程度導致較高的抗體滯留。
可有效利用藥物傳輸系統來輸送聚乙二醇化修飾的治療藥劑至腦部及/或延長該治療藥劑在腦部區帶之滯留,從而有益於腦部病症諸如腦部腫瘤之治療(例如神經膠瘤)。
包含水膠的藥物傳輸系統
本揭示內容之包含水膠的藥物傳輸系統包含一或多種可形成基質結構的生物降解性聚合物,用以包埋一能夠結合至聚乙二醇(PEG)的抗體。
(i) 水膠
本揭示內容之藥物傳輸系統所使用的水膠可為一種至少由親水性聚合物所形成的網狀物。在某些實例中,該水膠可為含有以水作為分散介質的膠態凝膠形式。在某些實施例中,該水膠可含有大於50%(例如50%、60%、70%、80%或90%)的水。由於含水量高的緣故,水膠可具備某種程度與天然組織相似的可撓性。
本揭示內容之水膠可包含一或多種天然或合成(非天然)生物降解性聚合物。在某些實例中,該聚合物可不含有交聯。或者,該聚合物可含有某種程度的鏈內及/或鏈間交聯,舉例來說,至多約60%、至多約50%、至多約40%、至多約30%、至多約25%或至多約20%。在一實施例中,水膠中約25%至約50%的聚合物含有鏈間及/或鏈內交聯。如本揭示內容所使用的,「交聯」(crosslink)一詞係指將一聚合物支鏈鏈接至另一支鏈的一或多種鍵結。該些鍵結可為共價鍵或離子鍵。
在某些實施方式中,水膠包含一或多種天然生物降解性聚合物,舉例來說,玻尿酸(hyaluronan、hyaluronic acid或HA)或玻尿酸衍生物、膠原(collagen)、明膠(gelatin)、纖網蛋白(fibronectin)、纖維蛋白原(fibrinogen)、藻酸鹽(alginate)、幾丁聚醣(chitosan)、由纖維蛋白原及凝血酶(thrombin)所製備的纖維蛋白膠。
HA為一種由D-葡萄糖醛酸及D-N-乙醯葡萄糖胺所組成之雙醣單元的聚合物,其經由交替的β1,4-及β1,3-糖苷鍵鏈接。公開文獻指出HA在細胞間基質扮演多種生理角色,包括細胞移動、增生,以及分化、組織修復及流體力學,以及免疫調節。天然HA通常含有10,000或更多個雙醣單元,其可分子量達到4百萬道爾頓(daltons)或更高。可經由酵素、化學或物理方法降解該些高分子量HA分子以製備解聚(depolymerized)HA產物。用於製備本揭示內容之藥物傳輸系統HA分子可具有一適當的分子量範圍,舉例來說,約20千道爾頓至約200千道爾頓、約50千道爾頓至約100千道爾頓、約100千道爾頓至約200千道爾頓、約200千道爾頓至約300千道爾頓、約200千道爾頓至約500千道爾頓、約300千道爾頓至約400千道爾頓、約500千道爾頓至約1,000千道爾頓、約800千道爾頓至約1,000千道爾頓、約1,000千道爾頓至約2,000千道爾頓、約1,000千道爾頓至約1,500千道爾頓、約1,500千道爾頓至約2,000千道爾頓、約2,000千道爾頓至約5,000千道爾頓,以及約5,000千道爾頓至約10,000千道爾頓。在一特定實施例中,用於製備本揭示內容之藥物傳輸系統HA分子可具有一分布自約50千道爾頓至約75千道爾頓的分子量(舉例來說,具有60千道爾頓的平均分子量)。
玻尿酸衍生物包括,但不限於,玻尿酸(hyaluronic acid)、經己二酸二醯肼修飾的玻尿酸(adipic dihydrazide-modified hyaluronan)、玻尿酸醯胺(amides of hyaluronan)、交聯玻尿酸(crosslinked hyaluronic acid)、玻尿酸的重金屬鹽類(heavy metal salts of hyaluronic acid)、硫化玻尿酸(sulphated hyaluronic acid)、N-硫化玻尿酸(N-sulphated hyaluronic acid)、經胺類修飾的玻尿酸(amine-modified hyaluronic acid)、經雙胺修飾的玻尿酸(diamine-modified hyaluronic acid)及玻尿酸組合物(例如玻尿酸及絲的組合物,以及與其他天然或合成物質交聯的玻尿酸)的部分酯類或全酯類。可利用本所屬領域普通技術人員所熟知的化學方法來修飾玻尿酸的一或多個功能基(例如羧酸基、氫氧基、還原端基及N-乙醯基)及/或將玻尿酸與其他分子交聯來製備玻尿酸衍生物。
在某些實施例中,水膠是由纖維蛋白原及凝血酶所製備的纖維蛋白膠,其中該凝血酶可在短時間內(例如10至60秒)將該纖維蛋白原轉換為纖維素單體(fibrin monomer),從而產生一種三維(three-dimension)的類膠狀結構。
在其他實施方式中,水膠可包含一或多種合成聚合物,其可選自由聚乙醇酸(poly(glycolic acid),PGA)、聚乳酸(poly(lactic acid),PLA)、聚胺酯(polyurethane,PU)、聚E-己內酯(poly(E-caprolactone),PCL)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)、聚氰基丙烯酸酯(polycyanoacrylate,PCA)、聚丙烯醯胺(polyacrylamide)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate,PMMA)、共聚乳酸-甘醇酸(poly(lactide-co-glycolide),PLGA)、聚二亞甲基碳酸酯(poly(trimethylene carbonate),PTMC)、聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)、共聚乙烯-乙酸乙烯酯(poly(ethylene-co-viny;acetate,PEVA)、共聚乙交酯-己內酯(poly(glycolide-co-caprolactone),PGCL),以及共聚丙交酯-己內酯(poly(lactide-co-caprolactone,PLCL)所組成的群組。
在某些實施方式中,水膠可包含天然聚合物及合成聚合物之組合。在國際專利申請第2016/007856號可找到用於本揭示內容之藥物傳輸系統的適當水膠的其他資訊,該相關揭示內容在此引入作為參考。
(ii) 抗-PEG抗體
本揭示內容之藥物傳輸系統抗體可用以結合PEG。抗體(與複數形式可交替使用)為免疫球蛋白分子或包含能夠通過位於該免疫球蛋白分子的變異區中的至少一個抗原識別位點專一結合至標的,如糖、多核苷酸、脂類、多肽等之部分。如本揭示內容所使用的,「抗體」(antibody)一詞不僅涵蓋完整的(亦即全長的)多株或單株抗體,也涵蓋其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、雙功能抗體(diabodies)、納體(nanobodies)、線性抗體(linear antibodies)、單鏈抗體(single chain antibodies)、多重專一性抗體(multispecific antibodies(例如雙專一性抗體(bispecific antibodies)))及包含具有所需要的專一性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任意其它經修飾的構型,包括抗體的醣化修飾變異體、抗體的胺基酸序列變異體,以及共價修飾的抗體。抗體包括任一種類型(class)的抗體,如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亞型),且抗體不必屬於任一種具體類型。取決於抗體重鏈恆定域的胺基酸序列,可將免疫球蛋白分為不同類型。主要有五類型免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,且此等類型中的若干種可進一步分為亞型(同種型),例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl及IgA2。對應於免疫球蛋白不同類型的重鏈恆定域分別稱為阿爾法(alpha)、德爾塔(delta)、艾普塞朗(epsilon)、伽馬(gamma)及穆(mu)。不同類型免疫球蛋白的次單位結構及三維構型是公知的。
本揭示內容所使用之抗-PEG抗體可專一或優先結合具有某種分子量範圍的PEG。抗體「專一性結合」(specifically binds)至抗原或表位為本所屬領域普通技術人員所熟知的術語。分子呈現「專一結合」(specific binding),係指相較於該分子與替代標的反應,若該分子與特定標的抗原反應較為頻繁、較為急速,且具有較持久的期間及/或具有較大的親和力而言。抗體「專一性結合」(specifically binds)至具有特定分子量a的PEG,係指相較於該抗體結合至具有不同分子量的PEG,若該抗體結合至該具有特定分子量a的PEG具有較大的親和力、總結合力(avidity)、較為急速、較為頻繁,及/或具有較持久的期間而言。應當理解本定義係指,舉例來說,專一性結合至具有特定分子量的PEG之抗體不一定可專一或優先結合至具有不同的分子量的PEG。如此,「專一結合」(specific binding)或「優先結合」(preferential binding)並非必然需要(雖然其可包括)排他性結合。在某些實施例中,「專一性結合」(specifically binds)至具有特定分子量的PEG之抗體可能無法結合至具有不同的分子量的PEG。
在某些實施方式中,相較於具有低分子量(例如低於5,000千道爾頓,例如3,000千道爾頓、2,000千道爾頓、1,000千道爾頓、500千道爾頓,或更低)的PEG,該抗-PEG抗體(其可為一IgG或IgM分子)可專一性結合至具有高分子量(例如具有高於10,000千道爾頓的分子量,舉例來說,15,000千道爾頓、20,000千道爾頓、25,000千道爾頓、30,000千道爾頓或更高)的PEG。選擇對具有特定分子量的PEG具有專一結合活性的抗-PEG抗體會取決於與該標的治療藥劑接合的PEG分子量。舉例來說,若將輸送至心臟之標的治療藥劑與具有高分子量的PEG接合,用於該藥物傳輸系統的抗-PEG抗體優選對高分子量PEG具有專一結合活性者。或者,若將輸送至心臟之標的治療藥劑與具有低分子量的PEG接合,用於該藥物傳輸系統的抗-PEG抗體優選對低分子量PEG具有專一結合活性者。
或是或除此外,本揭示內容之抗-PEG抗體對PEG具有適當的結合親和力,例如具有特定分子量的PEG。本揭示內容所使用之「結合親和力」(binding affinity)一詞係指明顯的締合常數(association constant)或KA
。KA
為解離常數(dissociation constant,KD
)的倒數。本揭示內容之抗-PEG抗體對標的抗原或抗原表位可具有至少每升10-5
、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
、10-10
摩爾,或更低的結合親和力(KD
)。增加的結合親和力對應於降低的KD
。相對於第二抗原,抗體對第一抗原的較高親和力結合可由該抗體結合第一抗原具有較高的KA
(或較小數值KD
)表示,相較於該抗體結合第二抗原的KA
(或數值KD
)而言。在此情形下,相對於該第二抗原(例如相同的第一蛋白於第二構象或其模擬物;或第二蛋白),該抗體對該第一抗原(例如第一蛋白於第一構象或其模擬物)具有專一性。在某些實施方式中,相較於對具有不同的分子量的PEG的結合親和力而言,本揭示內容之抗-PEG抗體對具有特定分子量的PEG具有較高的結合親和力(較高的KA
或較小的KD
)。結合親和力的差異(例如對專一性或其他比較)可至少為1.5、2、3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、91、100、500、1000、10,000或105
倍。在某些實施方式中,任一種抗-PEG抗體可進一步進行親和力成熟以增加該抗體對PEG的結合親和力,舉例來說,具有特定分子量的PEG。
可利用包括平衡透析(equilibrium dialysis)、平衡結合(equilibrium binding)、凝膠過濾(gel filtration)、ELISA、表面等離子體共振(surface plasmon resonance)或光譜學(例如使用螢光測定)等方法來確定結合親和力(或結合專一性)。用於評估結合親和力的例示性條件為HBS-P緩衝液(每升10毫摩爾之HEPES,pH7.4、每升150毫摩爾之NaCl、0.005%(體積/體積)之表面活性劑P20)。可利用此等技術來測量該固著的結合蛋白濃度作為標的蛋白濃度的函數。通過下列方程式,該固著的結合蛋白的濃度([固著的])一般係與游離的標的蛋白的濃度([游離的])相關: [固著的] = [游離的]/(Kd+[游離的])
儘管並非必要總是精確測定KA
,但是因為有時足以獲得對例如使用諸如ELISA或FACS分析的方法測定的親和力的定量測量,其與KA
成比例,並且因此可用於比較,諸如確定較高的親和力是否是例如高2倍,以獲得對親和力的定性測量或獲得對親和力的推導,例如通過功能性測定,例如活體外或活體內測定。
通過本所屬領域普通技術人員所熟知的任一種方法可製備本揭示內容之能夠結合PEG的抗體。參照例如,Harlow and Lane, (1998) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York。
在某些實施方式中,可藉由常規融合瘤技術來製備對PEG(例如具有特定分子量的PEG)具有專一性的抗體。可利用PEG抗原(其可非必要性地與KLH等載劑蛋白偶合)來免疫接種(immunize)宿主動物以製備結合至該抗原的抗體。免疫接種宿主動物的途徑及時程通常與已建立及常規的抗體刺激及生產技術一致,如本揭示內容進一步描述。用於製備小鼠、人源化及人類抗體的一般技術為本所屬領域普通技術人員所熟知及/或於本揭示內容描述。應考慮任何哺乳動物個體包括人類或源自該個體的抗體生產細胞可經操作以作為製備哺乳動物(包括人類)融合瘤細胞株的基礎。通常,該宿主動物是經腹膜內(intraperitoneally)、肌肉內(intramuscularly)、經口(orally)、皮下(subcutaneously)、腳掌內(intraplantar)及/或皮內(intradermally)接種一定量的免疫原,包括如本揭示內容所述。
可自淋巴細胞及永生化的骨髓瘤細胞製備融合瘤,使用Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497的常規體細胞雜交技術或由Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982)所修飾的技術。可用的骨髓瘤細胞包括,但不限於,X63-Ag8.653及彼等來自美國加州聖地牙哥沙克研究所細胞發配中心(Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA)的細胞可用來雜交。通常,該技術涉及使用促融劑諸如聚己二醇(PEG)或通過彼等本所屬領域普通技術人員所熟知的電裝置使骨髓瘤細胞與淋巴樣細胞融合。在融合後,使該細胞自融合培養液中分離並於選擇性生長培養液諸如次黃嘌呤-胺喋呤-胸苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine,HAT)培養液中生長以清除未雜交的親本細胞。可用任一種本揭示內容之培養液,無論有否添加血清來培養分泌單株抗體的融合瘤。在細胞融合技術的另一替代技術中,可用EBV永生化的B細胞來生產本揭示內容之抗-PEG單株抗體。若有需要時,擴增及次選殖該種融合瘤,並通過常規的免疫測定方法(例如放射性免疫測定(radioimmunoassay)、酵素免疫測定(enzyme immunoassay)或螢光免疫測定(fluorescence immunoassay))檢測上清液的抗-免疫原活性。
可利用已知方法在活體外或活體內製備用以生產抗-PEG抗體的融合瘤。若有需要時,可利用常規免疫球蛋白純化方法諸如硫酸銨沉澱(ammonium sulfate precipitation)、膠體電泳(gel electrophoresis)、透析(dialysis)、色層分析(chromatography)及超濾(ultrafiltration),可自培養液或體液中單離出該單株抗體。若存在非期望的活性,可將其移除,舉例來說,藉由使該製劑通過由免疫原連接固相所製備的吸附劑,並自該免疫原溶析或釋出該期望的抗體。可以與蛋白接合的標的抗原或含有該標的胺基酸序列的片段免疫接種宿主動物來產生抗體族群(例如單株抗體),其中該蛋白對該待免疫接種的物種具免疫原性,例如鑰孔戚血藍素(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白(serum albumin)、牛甲狀腺球蛋白(bovine thyroglobulin)或大豆膜蛋白酶抑制劑(soybean trypsin inhibitor),其中該接合是利用雙官能性或衍生劑,例如馬來醯亞胺己酸磺基琥珀醯亞胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(經由半胱氨酸殘基接合)、N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide)(經由離胺酸殘基)、戊二醛(glutaraldehyde)、琥珀酸酐(succinic anhydride)、SOCl,或R1N=C=NR,其中R和R1為不同的烷基團。
若有需要時,可定序分析特定(例如通過融合瘤製備)抗體(單株或多株),之後將多核苷酸序列選殖至載體進行表現或增殖。可將用以編碼特定抗體的序列保留於宿主細胞的載體中,並擴增及冷凍該宿主細胞以供後續使用。在一替代方式中,可利用該多核苷酸序列進行基因操作以產生「人源化」抗體或改善該抗體的親和力(親和力成熟)或其他特徵。
在其他實施方式中,可藉由基因工程技術來來製備會表現特定人類免疫球蛋白的小鼠,據以得到全人類抗體。亦可利用轉殖基因動物來製備人源化或人類抗體,其中該基因轉殖動物可用以產生特定需求之抗體(例如全人類抗體)或具有更顯著的免疫反應。該些技術可參見Amgen,Inc.(Fremont,Calif.)的XenomouseRTM
及得自Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)的HuMAb-MouseRTM
及TC MouseTM
。在另一替代例中,可利用噬菌體呈現技術或酵母菌呈現技術以重組方式來製備抗體。例如可參見美國專利第5,565,332號;第5,580,717號;第5,733,743號;及第6,265,150號;及Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455。或者,可使用菌體呈現技術(McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553),利用來自未免疫接種供者的免疫球蛋白變異(V)域基因譜系在活體外製備人類抗體及抗體片段。
或者,可經由常規步驟自適當的抗體庫單離出能夠結合至該本揭示內容之PEG抗原的抗體。可藉由本所屬領域普通技術人員所熟知的常規篩選流程,以包含有複數個抗體組分的抗體庫來確認可結合至特定標的抗原(例如具有某種分子量的PEG分子)的抗體。在該篩選過程中,以標的PEG抗原探測抗體庫,據以單離出可結合至該標的PEG抗原的抗體,其通常滯留在一支撐體上。可執行數次(例如正向及負向選擇)該篩選流程,以增加可結合至該標的PEG抗原的抗體群體(pool)。可由該抗體群體單離出個別選殖株,並進一步確認其結合活性及生物活性。可經由常規方法學決定該重鏈及輕鏈變異域的序列。
有數種本所屬領域普通技術人員所熟知的常規方法來確認及單離出可結合至本揭示內容之標的PEG抗原的抗體,包括噬菌體呈現、酵母菌呈現、核糖體呈現,或哺乳動物細胞呈現技術。
作為實例,噬菌體呈現物通常利用共價鍵結來結合蛋白(例如抗體)組分與噬菌體外套蛋白。該鍵結係因轉譯一編碼該融合至外套蛋白的抗體組分的核酸所導致。該鍵結可包括可撓性胜肽鏈接物、蛋白酶切位點,或併入終止密碼作為抑制結果的胺基酸。公開文獻已記載噬菌體呈現技術,舉例來說,美國專利第5,223,409號;Smith (1985) Science 228:1315-1317;國際專利申請第92/18619號;國際專利申請第91/17271號;國際專利申請第92/20791號;國際專利申請第92/15679號;國際專利申請第93/01288號;國際專利申請第92/01047號;國際專利申請第92/09690號;國際專利申請第90/02809號;de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30;Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20;Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8及Hoet et al. (2005) Nat Biotechnol. 23(3)344-8。可用標準的噬菌體預備方法例如來自生長培養基的PEG沉澱可生長和採收噬菌體呈現蛋白組分。選擇個別呈現噬菌體後,可自感染所選擇的噬菌體的細胞或自擴增後的該噬菌體本身單離出編碼所選擇的蛋白組分的核酸。可選擇個別群落或溶菌斑,將該核酸單離出並進行定序分析。
其它呈現形式包括基於細胞的呈現(參照,例如國際專利申請第03/029456號)、蛋白質-核酸融合(參照,例如美國專利第6,207,446號)和核糖體呈現(參照,例如Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022及Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92;Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30;及Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-35),以及大腸桿菌週質呈現(J Immunol Methods. 2005 Nov 22;PMID: 16337958)。
在單離出可結合至該標的PEG抗原的呈現庫成員後,可測試各單離出之抗體與非標的分子的結合能力,藉以評估其結合專一性。例示性之非標的分子包括鏈黴親和素磁珠(streptavidin on magnetic beads)、阻斷劑諸如牛血清白蛋白、脫脂牛奶、大豆蛋白、任一種捕獲或固定標的的單株抗體,或不表達該標的非轉染細胞,或具有非常不同於該用於篩選抗體的PEG抗原分子量的PEG分子。舉例來說,可利用高通量ELISA篩選以獲得數據。亦可利用ELISA篩選以獲得結合至該標的PEG抗原的每個庫成員的定量數據。比較非標的及標的結合數據(例如使用電腦及軟體)來鑑別專一性結合至該標的的庫成員。
選擇結合至標的PEG抗原的候選庫成員後,可進一步分析每個候選庫成員,例如進一步確認其與標的PEG抗原的結合特性。可對各候選庫成員進行一或多個二次篩選測定。可測定結合特性、催化特性、抑制特性、生理特性(例如細胞毒性、腎臟清除率、免疫原性)、結構特性(例如穩定性、構象、齊聚反應狀態)或另外的功能特性。可反復使用該相同的測定,但以變化的條件,例如以決定pH、離子或熱敏感性。
適當時,該測定可直接用呈現庫成員,自編碼所選擇的多肽的核酸的製備重組多肽,或基於所選擇的多肽的序列合成合成胜肽。在所選擇的Fab情形下,可評估或可修飾該Fab並製備完整的IgG蛋白。結合特性的例示性測定記載如下。
可利用ELISA測定來評估結合抗體。舉例來說,可將每個候選抗體接觸一底部表面已塗佈該標的PEG抗原的微量滴定板,例如該標的的有限量。以緩衝液清洗該滴定板來移除非專一性固著的多肽。接著,通過以可識別該結合抗體的候選抗體探測該滴定板來決定在該滴定板上該結合抗體結合至該標的的量,例如標籤或該結合蛋白的恆定部分。將該抗體鏈接至一檢測系統(例如當提供適當基質時會產生比色產物的酵素諸如鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)或辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP))。
或者,可利用均相測定來分析本揭示內容之結合抗體結合至標的PEG抗原的能力,亦即在加入該測定的所有組分後,不需要額外的液體操作。舉例來說,均相測定可利用螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)(參照,例如Lakowicz et al., 美國專利第5,631,169號;Stavrianopoulos, et al., 美國專利第4,868,103號)。選擇一種在一第一分子上的螢光團標記(例如該留分中所鑑別出的分子),使得其發射的螢光能量由在一第二分子(例如該標的)上的螢光標記吸收,若該第二分子接近該第一分子時。當在該第二分子上的螢光標記吸收該轉移的能量時,在該第二分子上的螢光標記發出螢光。因在該標記間的能量轉移效率與該分離該分子的距離相關,可用於評量該分子間的空間關係。在該分子間發生結合的情況下,該分子標記「受體」(acceptor)的螢光發射在該測定中應為最大值。配合通過FRET來監測的結合情形可通過標準螢光檢測手段方便地測量,例如利用螢光計。通過滴定該第一或第二結合分子的量,可做出結合曲線以估計該平衡結合常數。
可利用表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)來分析結合蛋白與標的抗原的交互作用。SPR或生物分子交互作用分析(Biomolecular Interaction Analysis,BIA)檢測即時性生物專一性交互作用,無須標記任一種反應物。該BIA玻片的結合表面的質量變化(結合情形的指標)導致靠近該表面的光折射率的改變(SPR的光學現象)。該折射率的變化產生一種可檢測的訊號,測量該訊號作為生物分子間即時性反應的指標。公開文獻已記載使用SPR的方法,例如,美國專利第5,641,640號;Raether, 1988, Surface Plasmons Springer Verlag;Sjolander and Urbaniczky, 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345;Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705及由BIAcore International AB (Uppsala, Sweden)提供的線上資源。
可利用來自SPR的資訊來提供平衡解離常數(KD
)及結合蛋白對標的的結合動力參數,包括Kon
及Koff
,的精確且定量的測量。可利用該些數據來比較不同的生物分子。舉例來說,可將選自表達庫的蛋白用來比較來鑑別對標的具有高親和力或具有慢Koff
的蛋白。亦可利用本資訊來研發結構-活性關係(structure-activity relationships,SAR)。舉例來說,可將該親本蛋白成熟版的動力及平衡結合參數該與該親本蛋白的參數相比。可鑑別出與特定結合參數(例如高親和力及慢Koff
)相關的指定位置上的各種胺基酸。可將本資訊結合結構的模型(例如利用同源模型、能量極小化、或通過X射線晶體學或NMR決定結構)。因此,可將在該蛋白及其標的間的物理性交互作用的理解公式化並用於導引其他設計程序。
作為進一步的實例,可利用細胞測定。可以結合至細胞的能力篩選結合蛋白,其中該細胞為瞬時或穩定表達且呈現在該細胞表面上的標的PEG。舉例來說,可將抗-PEG抗體進行螢光標記並在存在或不存在拮抗抗體下、通過利用流式細胞術(例如FACS儀器)分析螢光強度變化,可檢測該抗-PEG抗體與PEG的結合。
可經由常規方法製備完整的抗體(全長的抗體)的抗原-結合片段。舉例來說,可通過胃蛋白酶消化抗體分子來製備F(ab’)2片段,以及可通過還原該F(ab’)2片段的雙硫鍵製備Fab片段。
可經由例如常規重組技術製備基因工程抗體,諸如人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體,以及雙專一性抗體。
本所屬領域普通技術人員熟知建構人源化抗體的方法。參照,例如Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989)。在一實施例中,依本所屬領域普通技術人員所熟知的方法將親本非人類抗體的VH及VL變異區進行三維分子模型分析。其次,利用相同的分子模型分析來鑑別預期對形成正確CDR結構為重要的框架胺基酸殘基。同樣地,自任一種抗體基因資料庫、利用該親本VH及VL序列作為搜索查詢來鑑別具有與親本非人類抗體胺基酸序列同源的人類VH及VL鏈。即可選擇人類VH及VL受體基因。
可用來自原本非人類抗體或其功能性變異體的CDR區替換在選擇的人類受體基因中的CDR區域。必要時,可用預期對與CDR區域的相互作用為重要的親本鏈的框架區域中的殘基(參照上文說明)來替換人類受體基因中相應的殘基。
利用本所屬領域普通技術人員所熟知的方法可將獲得的抗體依本所屬領域普通技術人員所熟知及本揭示內容的方法確認。
在某些實施例中,通過常規重組技術可製備抗-PEG抗體。可利用標準分子生物學技術來製備該重組表達載體、轉染宿主細胞、選擇轉形體、培養該宿主細胞及該自該培養液回收抗體。舉例來說,通過與蛋白A或蛋白G偶合的基質之親和力層析法可單離出某些抗體。
(iii) 藥物傳輸系統
本揭示內容之包含水膠的藥物傳輸系統可具有一種相對於生物降解性聚合物的量的抗-PEG抗體的適當濃度。在某些實施方式中,抗體於水膠中的的濃度約為0.1至10%(重量/體積),舉例來說,約0.5至5%(重量/體積)、約0.5至2%(重量/體積)或約0.5至1.0%(重量/體積)。在某些實施例中,該抗體濃度約為1%(重量/體積)。
本揭示內容所使用之「約」(about)或「大約」(approximately)一詞,係指在本所屬領域普通技術人員所確定的具體值的可接受誤差範圍之內,其將部分取決於如何測量或決定該值,亦即,測量系統的局限性。舉例來說,根據本領域的實務,「約」可意指在可接受的標準差範圍之內。或者,「約」可意指指定值的至多±20%、較佳地,至多10±10%或更佳地,至多±5%的範圍。或者,特別是針對生物學系統或程序,該詞可意指在一定值的量值等級之內,較佳地,在2倍之內。記載在本說明書及申請專利範圍中的特定值,除非另有聲明,該「約」一詞為隱含的,且在上下文中意指在該特定值的可接受誤差範圍之內。
在某些實例中,該藥物傳輸系統包含適當比例的抗-PEG抗體及水膠。舉例來說,該抗-PEG抗體及該水膠的比例可約為1:1至1:100(重量/體積),例如約1:1至1:50(重量/體積)、約1:1至1:20(重量/體積)、約1:3(重量/體積)至約1:5(重量/體積),例如約1:3 (重量/體積)、約1:4(重量/體積)或約1:5(重量/體積)。在某些實施方式中,該抗-PEG抗體及該水膠的比例約為1:4(重量/體積)。在某些實施例中,藥物傳輸系統每微升水膠含有0.1至10微克抗體,舉例來說,每微升水膠0.1至5微克抗體、每微升水膠0.5至5微克抗體、每微升水膠0.2至2微克抗體、每微升水膠0.5至2微克抗體,或每微升水膠0.5至1微克抗體。
輸送治療藥劑至腦部的醫藥組合物及方法
可將包含水膠的藥物傳輸系統與一藥學上可接受的載劑(賦形劑)混和來製備用於治療腦部疾病的醫藥組合物。「可接受的」(acceptable)一詞意指該載劑應與該組合物的活性成分相容(且較佳地,能夠安定該活性成分),且不對待治療個體有害。本所屬領域普通技術人員熟知藥學上可接受的賦形劑(載劑)包括緩衝液。參照,例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover。
用於本揭示內容方法之醫藥組合物可以冷凍乾燥劑型或水溶液的形式包含藥學上可接受的載劑、賦形劑或安定劑(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover)。可接受的載劑、賦形劑或安定劑在所用的劑量及濃度上對接受者為無毒,且可包含緩衝液諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽,以及其他有機酸;抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫胺酸;防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride);氯化六甲銨(hexamethonium chloride);苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、氯化芐乙氧銨(benzethonium chloride);苯酚(phenol)、丁基(butyl)或苯甲醇(benzyl alcohol);對羥基苯甲酸烷基酯(alkyl paraben)諸如甲基(methyl)或丙基(propyl)對羥基苯甲酸酯(paraben);鄰苯二酚(catechol);間苯二酚(resorcinol);環己醇(cyclohexanol);3-戊醇(3-pentanol);及m-甲酚(m-cresol));低分子量(少於約10個殘基)多肽;蛋白,諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白;親水性聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone);胺基酸諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸,或離胺酸;單醣、雙醣,以及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖,或右旋糖酐(dextran);螫合劑諸如EDTA;糖類諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;形成鹽類的相對離子諸如鈉;金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物);及/或非離子表面活性劑諸如聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯(TWEENTM
)、聚氧乙烯聚氧丙烯(PLURONICSTM
)或聚乙二醇(PEG)。
用於活體內投予之醫藥組合物須為無菌。舉例來說,可藉由無菌濾膜過濾來達到此目的。一般將治療的抗體組合物置於具有無菌出入孔的容器中,舉例來說,靜脈注射溶液袋或具有皮下注射針頭可刺穿的瓶塞之小瓶。
本揭示內容之醫藥組合物進行局部投予時可為諸如溶液或懸浮液等單位劑量形式。
為利用本揭示內容之藥物傳輸系統來執行輸送治療藥劑至腦部的方法,可對一有需要治療之個體投予適當量之該藥物傳輸系統,例如經由注射在腦部區帶(腦部),例如顱內間隙內。在某些實例中,每一次對個體給予約0.5至5毫升(例如約1至5毫升、約1至3毫升,或約1至2毫升)之該藥物傳輸系統。在某些實例中,可於進行腦部手術時將該藥物傳輸系統置於與腦部內,舉例來說,移除腦部腫瘤的手術。
可經由全身性投予等方式,將與PEG(亦即聚乙二醇化修飾)接合的標的治療藥劑投予至個體體內。包埋在該藥物傳輸系統的抗-PEG抗體會吸引該聚乙二醇化修飾的治療藥劑標的至該腦部區帶,從而在該腦部內發揮其治療功效。
不受理論約束,在將本揭示內容之包含水膠的藥物傳輸系統置於適當的疾病位點(例如腦部)後,經由將抗體封裝在水膠的基質結構中,於適當的期間內,舉例來說,至少3天(例如5天、7天,或10天)可使該抗-PEG抗體保持在疾病位點。藉由調整用於製備水膠的聚合物類型、聚合物的交聯百分比、抗體與水膠/聚合物之間的比值,及/或在水膠中的抗體百分比等,可達到一特定抗-PEG抗體在腦部的適當滯留時間。需要時,可對個體在相同位點或近處位點給予複數劑量的藥物傳輸系統以利維持抗體的適當局部濃度。鑒於本揭示內容之藥物傳輸系統保留本揭示內容之包埋抗體的能力,無需在短時間間隔內頻繁投予該藥物傳輸系統。舉例來說,當需要複數劑量時,可在前次劑量後至少3至14天投予該藥物傳輸系統每次劑量。在某些實施例中,投予至個體之二連續劑量的間隔時間可至少為3天、至少為7天,或至少為14天。在某些實施方式中,僅需該藥物傳輸系統一劑量。
可在對個體投予該藥物傳輸系統後至少2小時,舉例來說在該投予該藥物傳輸系統後至少4小時、至少8小時、至少12小時、至少24小時,或至少48小時給予該聚乙二醇化修飾的治療藥劑的一或多種劑量。
例示性之用以治療腦部病狀之聚乙二醇化修飾的治療藥劑可為聚乙二醇化修飾的抗-癌症藥劑,舉例來說,聚乙二醇化修飾的多柔比星(其通過微脂體可封裝)、聚乙二醇化修飾的L-天冬醯胺酸酶(L-asparaginase)(例如Pegasparqase®)、聚乙二醇化修飾的腺苷去胺酶(adenosine deaminase)(Pegademase®)。其他實例包括聚乙二醇化修飾的微脂體多柔比星、微脂體阿德力黴素、替莫唑胺、紫杉醇、泛艾黴素、順-二胺二氯鉑、愛萊諾迪肯、精胺酸酶、精胺酸脫亞胺酶、天冬醯胺酶、抗體(例如抗-VEGF抗體諸如貝伐單抗(bevacizumab)),或細胞激素(例如IL-2或IFN-D)。在一較佳實施方式中,該聚乙二醇化修飾的醫藥為聚乙二醇化修飾的多柔比星微脂體。
在某些實例中,該治療藥劑與具有高分子量PEG接合,舉例來說,大於10,000千道爾頓、大於15,000千道爾頓、大於20,000千道爾頓,或大於25,000千道爾頓。在其他實例中,該治療藥劑與具有低分子量PEG接合,舉例來說,小於8,000千道爾頓、小於5,000千道爾頓、小於3,000千道爾頓、小於2,000千道爾頓、小於1,000千道爾頓,或小於500千道爾頓。基於用於治療心腦部病症之聚乙二醇化修飾治療藥劑的PEG大小可選擇能夠結合至具有特定分子量的PEG分子之抗-PEG抗體。
如本揭示內容所使用的,「個體」(subject)一詞係指任一種哺乳動物。在一較佳實施方式中,該個體為人類。在某些實施例中,該個體為罹患或疑似罹患腦部病狀,舉例來說,腦部腫瘤諸如神經膠瘤的人類病患。
如本揭示內容所使用的,「治療」(treating)一詞係指對一個體應用或投予包括一或多種活性藥劑的組合物,其中該個體具有標的疾病或病症,或該個體出現該疾病/病症相關症狀,或易罹患該疾病/病症,以期能治療(cure、remedy)、治癒(heal)、緩解(alleviate)、減輕(relieve)、改變(alter)、減緩(ameliorate)、改善(improve)或影響(affect)該疾病、與該疾病相關的症狀或易罹患該疾病或病症的特性。
緩解標的疾病/病症包括延遲疾病的發展(development)或進展(progression),或減低疾病嚴重度。緩解疾病並非必然需要治療的結果。如本揭示內容所使用的,「延遲」(delaying)標的疾病或病症的發展意旨延緩(defer)、阻止(hinder)、緩慢(slow)、阻滯(retard)、安定(stabilize),及/或延遲(postpone)該疾病的進展。該延遲時間長短不一,取決於該疾病病歷及/或待治療之個體。「延遲」或緩解該疾病發展,或延遲該疾病發病(onset)的方法,為一種相較於非利用該方法時,在一指定時間範圍內減低發展一或多種該疾病症狀的機率及/或在一指定的時間範圍內減低該症狀程度的方法。該比較通常基於利用足以給出統計學上顯著結果的個體數目之臨床研究。
疾病的「發展」或「進展」意旨該疾病的初始表現(manifestation)及/或隨後進展。疾病的發展是可檢測的,其係利用本所屬領域普通技術人員所熟知的標準臨床技術進行評量。然而,發展亦可指可能無法檢測到的進展。為本揭示內容之目的,發展或進展係指該症狀的生物學進程。「發展」包括發生、復發,以及發病。如本揭示內容所使用的,標的疾病或病症的「發病」(onset)或「發生」(occurrence)包括初始發病及/或復發。
輸送治療藥劑至腦部的套組
本揭示內容亦提供用於緩解或治療腦部疾病/病症的套組。該套組可包括一或多種容器,其包含(i) 任一種本揭示內容之藥物傳輸系統,以及(ii) 一醫藥組合物,包含一用以治療腦部疾病之聚乙二醇化修飾的治療藥劑及一藥學上可接受的載劑。在某些實例中,本揭示內容之藥物傳輸系統包含一種專一結合至PEG分子的抗-PEG抗體,其中該PEG分子與聚乙二醇化修飾的治療藥劑中的PEG分子具有相同的或相似的分子量。
在某些實施方式中,該套組可包含依據任一種本揭示內容之方法使用的使用操作說明。該包括的使用操作說明可包含投予該藥物傳輸系統及該聚乙二醇化修飾的治療藥劑來治療、延遲發病,或緩解彼等本揭示內容之標的疾病的記載。該套組可更包含選擇適於治療之個體的記載,其係基於鑑別該個體是否具有該標的疾病。在再其他實施方式中,該使用操作說明包含對一具有該標的疾病風險之個體投予該藥物傳輸系統及該聚乙二醇化修飾的治療藥劑的記載。
有關使用該藥物傳輸系統及該聚乙二醇化修飾的治療藥劑的使用操作說明一般包括對該預定治療之劑量、投藥時程,以及投予途徑的資訊。容器可為單位劑量、大量包裝(bulk packages)(例如複數劑量包裝)或次單位劑量。本揭示內容之套組所提供的使用操作說明通常為標記或仿單(例如包括在該套組中的單張)上的書面使用操作說明,但亦可為機器可讀式的使用操作說明(例如攜帶在磁性或光學存取碟上的使用操作說明)。
該標記或仿單指出用於治療、延遲發病及/或緩解腦部疾病或病症的組合物。使用操作說明可用來實施任一種本揭示內容之方法。
本揭示內容之套組有適當包裝。適當包裝包括,但不限於,小瓶、瓶、罐、可撓性包裝(例如密封於聚酯薄膜(Mylar)或塑膠袋),以及其類似物。亦可考慮與特定裝置,諸如吸入器、鼻腔投予裝置(例如噴霧器)或輸注裝置諸如微量泵,組合使用的包裝。套組可具有無菌出入孔(例如該容器可為靜脈注射溶液袋或靜脈注射溶液袋或具有皮下注射針頭可刺穿的瓶塞之小瓶)。該容器亦可具有無菌出入孔(例如該容器可為靜脈注射溶液袋或靜脈注射溶液袋或具有皮下注射針頭可刺穿的瓶塞之小瓶)。
套組非必要性地可提供額外的組分諸如緩衝液及解釋資訊。正常來說,該套組包含一容器及一附隨該容器上的標記或仿單。在某些實施方式中,本揭示內容提供包含上文記載的套組之含量的製造物。
一般技術
本揭示內容的實施除非另外說明,將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學的常規技術,該些技術均屬於本領域技術範圍之內。該些技術在公開文獻中完整說明,諸如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press;Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984);Methods in Molecular Biology, Humana Press;Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press;Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987);Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press;Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons;Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987);Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987);PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994);Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991);Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999);Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997);Antibodies (P. Finch, 1997);Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989);Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000);Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999);The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)。
在無需過度解讀的情形下,本所屬領域技術人員基於上述的本揭示內容,可完整利用並實踐本發明。因此,下文具體實施方式應解讀為僅作為例示性的作用,而不應將其視為對本揭示內容之可能的其他實施方式之限制。本揭示內容所引用的所有公開文獻,其全文皆視為本揭示內容的一部分。
實施例1:抗-PEG抗體結合至PEG-接合的藥劑
在37 ̊C下,將在每升0.1摩爾之NaHCO3
/Na2
CO3
(pH 8.0)中的抗-PEG抗體或控制抗體IgM(每毫升5微克)塗佈在96-孔ELISA微孔板上4小時,接著在4 ̊C下過夜。在室溫下,利用在PBS中的2%脫脂牛奶封閉該微孔板2小時,然後以PBS清洗三次。將市售(供應商:臺灣東洋藥品工業股份有限公司(TTY Biopharm,Taiwan)(圖式以TTY標示)或臺灣微脂體股份有限公司(Taiwan Liposome Company,Taiwan)(圖式以TLC標示))之聚乙二醇化修飾的微脂體多柔比星(LipoDox)在PBS中的2%脫脂牛奶中進行序列稀釋至不同的濃度並在室溫下與該微孔板作用2小時。在清洗後,將該微孔板與檢測抗體3.3-生物素(每毫升5微克)作用1小時,接著在室溫下與HRP-接合的鏈黴親和素(每毫升0.5微克)作用1小時。在室溫下,將該微孔板與200微升ABTS溶液(每毫升0.4毫克之2,2-聯氮-二(3-乙基-苯並噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2’-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid))、0.003%之H2
O2
、每升100毫摩爾之磷酸鹽檸檬酸鹽、pH 4.0)避光作用15分鐘。利用微孔板光譜分析儀測量405奈米吸光值。
基於ELISA結合測定的結果顯示抗-PEG抗體成功地結合至所測試的多種PEG-接合的藥劑(第1圖)。
實施例2:利用包含水膠的藥物傳輸系統來輸送LipoDox至腦部
將10微升PBS,或1%(重量/體積)玻尿酸水膠含有每毫升0.5微克抗-PEG抗體(HA-Anti-PEG),或每毫升0.5微克非專一性的IgM抗體(HA-非專一性-IgM)以顱內注射方式投予小鼠。注射位點為硬腦膜下深2毫米、人字縫尖後2毫米及距中線右方1.5毫米處。左腦半球作為未經處理的控制組。通過尾靜脈投予每公斤2毫克劑量的LipoDox(臺灣東洋藥品工業股份有限公司)並使其循環30分鐘。30分鐘後,經由心內穿刺取出血液,然後收集腦部、分成二部分、清洗,並萃取LipoDox通過HPLC來定量。將樣本以含有每升0.25摩爾之蔗糖、每升5毫摩爾之Tris-HCl、每升1毫摩爾之MgSO4
、每升1毫摩爾之CaCl2
、pH 7.6的溶解緩衝液進行均質化,且將均質物與酸化異丙醇(70%異丙醇,0.4N HCl)混和,進行凍融循環及30分鐘音波振動處理,然後以6,500轉速離心30分鐘。通過HPLC,利用Waters e2695分離模組及X-bridge的5微米之C18管柱,其動相為35%之每升10豪摩爾之KH2
PO4
及65%之H2
O、流速每分鐘1毫升,以及管柱溫度為40˚C下定量上清液。利用Waters 2475多波長螢光偵測器,激發波長為480奈米及發射波長為600奈米下進行定量。將LipoDox濃度對該用於萃取的腦部組織重量,以及該動物血漿中的LipoDox濃度進行標準化。
結果如第2圖,證明在全身性投予後,接受顱內HA水膠含有抗-PEG抗體至該右腦半球的小鼠保留較高濃度的LipoDox在該右腦半球。該LipoDox的濃度高於接受顱內HA水膠含有非專一性IgM抗體,或顱內PBS的小鼠。
利用自腦部均質物及萃取該組織的LipoDox所做成的標準曲線及利用前述的方法定量LipoDox的回收率。標準曲線在廣泛的濃度範圍之內呈現線性度,且腦部組織及血漿二者的回收率接近100%(第3圖)。
實施例3:LipoDox對腦部腫瘤細胞的抑制效應
在37˚C、5%CO2
下,將DBTRG-05MG細胞常態性地培養在含有10%(體積/體積)之FBS及丙酮酸鈉(sodium pyruvate)RPMI-1640培養液中。為進行MTT分析,在加入重複三次10倍序列稀釋之LDox及TMZ前,使10,000細胞在96-孔微孔板中增生24小時。72小時後,在37˚C下,將每毫升5毫克MTT試劑(Invitrogen)稀釋在培養液中並加至該細胞中作用3小時。移除培養液並加入100微升之DMSO且在60˚C下使該微孔板作用10分鐘。讀取波長540奈米之吸光值。單獨的DMSO作為空白對照組(Blank),且計算存活力為每個治療組(Treated)對比於生長在培養液中不具LDox或TMZ的控制組的百分比。
結果如第4圖,指出相較於TMZ,LDox更有潛力抑制腦部腫瘤細胞生長。
實施例4:水膠的玻尿酸交聯程度對抗體滯留率的效應
本研究目的在於探討本揭示內容之基於HA的水膠的玻尿酸(HA)交聯程度對抗體滯留率的效應。將螢光蛋白標記AlexaFluor®-接合的IgM抗體(源自小鼠)懸浮在具有0%、25%、50%、75%,或100%之玻尿酸交聯程度的基於玻尿酸(HA)的水膠中。將該溶液注射至FVB小鼠的大腿肌肉。在注射後,通過IVIS®光譜活體內影像系統立即定量在該注射位點的螢光強度,之後每天定量。
如第5圖所闡述,具有較高的玻尿酸交聯百分比(例如100%)的水膠意外地顯示較低的抗體滯留率,而較低玻尿酸交聯百分比(例如25%及50%)顯示較高的抗體滯留率。
其他實施方式
可將本說明書所揭示之所有特徵任意組合成任一種組合。可將本說明書所揭示之每一種特徵取代成另一種具有相同的、均等的或相類似的目的的替代特徵。因此,除非本說明書另有明確聲明,本揭示內容所揭示之每一種特徵僅作為一系列通用之均等或相類似特徵的實例。
本所屬領域技術人員可輕易地自上文的敘述中判明本揭示內容的必要特徵,且在不悖離本揭示內容的原理與精神的情形下,當可對其進行各種更動與修飾,以運用在各種用法及條件下。因此,其他實施方式亦在申請專利範圍所界定的範圍內。
均等實施方式
雖然在本揭示內容中已描述並說明了多個本揭示內容的發明實施方式,但是本所屬領域技術人員將容易地構想多種其他方法及/或結構以進行本揭示內容所述的功能及/或獲得本揭示內容所述的結果及/或一或多種優點,並且認為運些變化及/或改變中的每一個均在本揭示內容所述的本揭示內容的範圍內。更一般來說,本所屬領域技術人員將容易理解本揭示內容所述的全部參數、維度、材料和構造意指例示性的,且實際參數、維度、材料及/或構造將取決於本揭示內容的發明教示所使用的具體應用。本所屬領域技術人員將僅僅瞭解或者能夠確定常規實驗,本揭示內容中描述了特定的本揭示內容的發明實施方式的均等實施方式。因此,應當理解,所呈現的前述實施方式僅為例示性的,並且在所述申請專利範圍及其均等實施方式的範圍內,本揭示內容的發明實施方式可以除具體描述和主張申請專利範圍之外地實施本揭示內容發明實施方式。本揭示內容的發明實施方式指向本揭示內容所述之每個獨立特徵、系統、製品、材料、套組及/或方法。此外,只要所運用的特徵、系統、製品、材料、套組及/或方法彼此不相矛盾,則該兩種或者更多種運用的特徵、系統、製品、材料、套組及/或方法包含於本揭示內容的發明範圍內。
應當理解本揭示內容所定義和使用的全部定義優先於專業詞典定義、通過引用併入本揭示內容的定義,及/或所定義術語的常規涵義。
相對於所引用的主題,本揭示內容所揭示的全部參考文獻、專利和專利申請通過引用併入本揭示內容,在某些情況下,可涵蓋該文件的全部內容。
除非明顯呈現矛盾,否則如本說明書及申請專利範圍中所使用的,不定冠詞「一」(a)及「一」(an)一詞應當理解為意指「至少一種」(at least one)。
如本說明書及申請專利範圍中所使用的,「及/或」(and/or)一詞應當理解為意指如此結合的元素「之一或二者」(either or both),亦即元素在某些情況下結合地出現而在另一些情況下分開出現。使用「及/或」列舉的多個元素應當解釋為相同形式,亦即「一或多種」如此結合的元素。無論是否與除具體地限定的彼等元素相關或不相關,除由「及/或」具體限定的元素以外非必要性地可存在其他元素。因此,作為非限制性實施例,參照「A及/或B」(A and/or B),當與開放式詞語如「包含」(comprising)聯合使用時,在一個實施方式中,其可僅指A(非必要性地包括除B以外的元素);在另一實施方式中,僅指B(非必要性地包括除A以外的元素);在另一實施方式中,指A及B二者(非必要性地包括其他元素);等。
如在本說明書及申請專利範圍中所使用的,「或」(or)一詞應當理解為於如上文所定義的「及/或」具有相同涵義。舉例來說,當在列表中分開條目時,「或」或「及/或」應當解釋為包括的,亦即包含元素數目或清單(非必要性地,額外的未列出的條目)中的至少一種,但亦包括多於一種。僅當術語明顯矛盾時,(諸如「...中之僅一」(only one of)或「準確的一種」(exactly one of),或當用於申請專利範圍時,「由...組成」(consisting of))時,係指包含元素數目或清單中的準確地一種元素。一般來說,當排他性術語(諸如「或」(either)、「…中之一」(one of)、「…中之僅一」(only one of)或「準確的一種」(exactly one of))前置時,本揭示內容所使用之「或」一詞僅應當理解為係指排他性替代(亦即,「一種或另一種而非二者」(one or the other but not both))。當用於申請專利範圍中時,「基本由...組成」(consisting essentially of)應當具有如用於專利法領域中的常規涵義。
如在本說明書及申請專利範圍中所使用的,參照一或多種元素的清單,「至少一種」(at least one)應當理解為意指至少一種元素選自元素清單中任意一或多種元素,但非必然地包括元素清單中具體列出的每個元素的至少一種,且不排除元素清單中元素的任意組合。無論與具體限定的彼等元素相關或不相關,該定義亦允許非必要性地可存在除「至少一種」一詞所指的元素清單中具體限定的元素以外的元素。因此,作為非限制性實例,「A及B的至少一種」(at least one of A and B)(或均等地,「A或B的至少一種」(at least one of A or B),或均等地,「A及/或B的至少一種」(at least one of A and/or B))在一個實施方式中至少一種可指,非必要性地包括多於一種,A,不存在B(且非必要性地包括除B以外的元素);在另一實施方式中,至少一種係指,非必要性地包括多於一種,B,不存在A(且非必要性地包括除A以外的元素);在再另一實施方式中,至少一種係指,非必要性地包括多於一種,A,以及至少一種,非必要性地包括多於一種,B(且非必要性地包括其他元素);等。
應當理解,除非明顯矛盾,否則在本揭示內容所請求保護的包括多於一個步驟或行為的任一種方法中,方法的步驟或行為的順序非必然地限於其中所引用的方法的步驟或行為的順序。
無
第1圖之數據闡述IgM及IgG之抗-PEG抗體能夠吸引聚乙二醇化修飾的微脂體多柔比星(LipoDox)至腦部。A:非專一性IgG控制抗體。B及C:抗-PEG之IgG抗體。D至G:抗-PEG之IgM抗體。
第2圖之數據闡述利用本揭示內容之藥物傳輸系統輸送聚乙二醇化修飾的LipoDox至腦部,使用HA水膠及抗-PEG之IgM抗體。
第3圖之數據闡述以HPLC方法學驗證單離自腦部組織之LipoDox的線性標準曲線,以及大於90%的自腦部組織及血漿回收率。A:LipoDox標準曲線;B:LipoDox腦部萃取物標準曲線;及C:LipoDox回收率。
第4圖之數據包括相片(圖A)及圖表(圖B)闡述LipoDox(LDox)對人類神經膠母細胞瘤細胞株(DBTRG-05MG)的IC50
低於替莫唑胺(TMZ)。在此提供細胞培養的代表影像。
第5圖之數據闡述HA交聯(cross-linking)程度對抗體滯留率的效應。
Claims (16)
- 一種用以將一治療藥劑輸送至腦部之藥物傳輸系統,包含一包埋於一水膠中的抗體,其中該抗體可與聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)結合,其中該水膠包含一或多種生物降解性聚合物、其中至多約60%之該一或多種生物降解性聚合物包含鏈間(inter-chain)或鏈內(intra-chain)共價交聯(covalent crosslink),且其中該抗體量約為每微升水膠1至2微克。
- 如請求項1所述之藥物傳輸系統,其中約25%至約50%之該一或多種生物降解性聚合物包含鏈間或鏈內共價交聯。
- 如請求項1所述之藥物傳輸系統,其中該水膠包含玻尿酸(hyaluronic acid,HA)分子。
- 如請求項1所述之藥物傳輸系統,其中該抗體為一人類抗體或一人源化抗體。
- 如請求項1所述之藥物傳輸系統,其中該抗體為一免疫球蛋白分子。
- 如請求項5所述之藥物傳輸系統,其中該免疫球蛋白分子為一IgM分子。
- 一種用以將一治療藥劑輸送至腦部之套組,包含:(i)任一種如請求項1至6所述之藥物傳輸系統;以及(ii)一用以治療一腦部病症之治療藥劑,其中該治療藥劑係與聚乙二醇接合。
- 如請求項7所述之套組,其中該治療藥劑為一用以治療腦癌之藥物。
- 如請求項7所述之套組,其中該治療藥劑為選自由微脂體多柔比星(liposomal doxorubicin)、微脂體阿德力黴素(liposomal adriamycin)、替莫唑胺(temozolomide)、紫杉醇(paclitaxel)、泛艾黴素(epirubicin)、順-二胺二氯鉑(cisplantin)、愛萊諾迪肯(irinotecan)、精胺酸酶(arginase)、精胺酸脫亞胺酶(arginine deiminase)、天冬醯胺酶(aspariginase)、抗體,以及細胞激素(cytokines)所組成的群組。
- 一種如請求項1至6所述之任一種藥物傳輸系統之用途,其係用於製備一藥物以治療一罹患腦部病症之個體,其中該藥物可與一用以治療該腦部病症之治療藥劑共同使用,其中係對該個體的腦部患處投予該藥物,以及將該治療藥劑全身性地投予至該個體體內,其中該治療藥劑係與聚乙二醇接合。
- 如請求項10所述之用途,其中以顱內注射方式投予該藥物。
- 如請求項10所述之用途,其中每次對該個體之腦部投予約1至2毫升之該藥物。
- 如請求項10所述之用途,其中對該個體多次投予該藥物,且其中二連續劑量至少間隔3天。
- 如請求項10所述之用途,其中該個體為一罹患腦部腫瘤的人類病患。
- 如請求項14所述之用途,其中該腦部腫瘤為神經膠瘤(glioma)。
- 如請求項10所述之用途,其中該治療藥劑為選自由微脂體多柔比星、微脂體阿德力黴素、替莫唑胺、紫杉醇、泛艾黴素、順-二胺二氯鉑、愛萊諾迪肯、精胺酸酶、精胺酸脫亞胺酶、天冬醯胺酶、抗體,以及細胞激素所組成的群組。
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