DE10353803A1

DE10353803A1 - Diagnostische, prognostische und therapeutische Verfahren bei der Untersuchung und Therapie maligner Tumoren

Info

Publication number: DE10353803A1
Application number: DE2003153803
Authority: DE
Inventors: Carsten Dr. Denkert; Steffen Prof. Dr. Hauptmann; Wilko Dr. Weichert; Manfred Prof. Dr. Dietel; Sören Pest
Original assignee: OLIGENE GmbH
Current assignee: OLIGENE GmbH
Priority date: 2003-11-14
Filing date: 2003-11-14
Publication date: 2005-06-23
Also published as: WO2005050218A3; WO2005050218A2

Abstract

Die Erfindung betrifft Methoden der Diagnostik maligner Tumoren, der Bestimmung der Prognose eines Tumors sowie der therapeutischen Intervention bei malignen Tumoren unter Nutzung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR. Im Tumorgewebe findet sich abnorme zytoplasmatische Expression von HuR in einem Teil der Tumoren. Für das Ovarialkarzinom z. B. hat die Gruppe der Tumoren mit zytoplasmatischer Hur-Expression eine schlechtere Prognose in der univariaten und multivariaten Überlebensanalyse. Eine zytoplasmatische Expression von HuR ist auch in anderen malignen Tumoren zu beobachten, so dass Protein HuR als molekularer Prognosemarker oder als Target für Ovarialkarzinome, Kolonkarzinome, Prostatakarzinome, Mammakarzinome, Pankreaskarzinome oder Endometriumkarzinome eingesetzt werden kann. Damit lässt sich über die Bestimmung von HuR die Tumorprognose abschätzen. Des Weiteren kann durch therapeutische Inhibition von HuR im Rahmen einer molekularen Tumottherapie in verschiedene tumorbiologisch relevante Signalwege therapeutisch eingegriffen werden.

Description

Die Erfindung betrifft Methoden der Diagnostik maligner Tumoren, der Bestimmung der Prognose eines Tumors sowie der therapeutischen Intervention bei malignen Tumoren unter Nutzung des humanen ELAV-ähnlichen (ELAV: embryonic lethal abnormal vision, homologes Drosophila Protein) Proteins HuR (Hu Antigen R; benannt nach dem Indexpatienten). HuR ist ein zelluläres Regulatorprotein, das die messenger Ribonukleinsäure (mRNA) verschiedener Gene zu stabilisieren vermag und damit an zentraler Stelle die Expression verschiedener Gene steuert. Es handelt sich hier um Gene, die tumorbiologisch bedeutsam sind, wie zum Beispiel die Cyclooxygenase 2 (COX-2), den Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) sowie verschiedene Zytokine und Zellzyklusproteine. Im Tumorgewebe findet sich abnorme zytoplasmatische Expression von HuR in einem Teil der Tumoren. Für das Ovarialkarzinom z.B. hat die Gruppe der Tumoren mit zytoplasmatischer HuR-Expression eine schlechtere Prognose in der univariaten und multivariaten Überlebensanalyse. Eine zytoplasmatische Expression von HuR ist auch in anderen malignen Tumoren zu beobachten. Damit kann über die Bestimmung von HuR die Tumorprognose abgeschätzt werden. Des weiteren kann durch therapeutische Inhibition von HuR im Rahmen einer molekularen Tumortherapie in verschiedene tumorbiologisch relevante Signalwege therapeutisch eingegriffen werden.

Hintergrund

Das Ovarialkarzinom ist die fünf-häufigste maligne Erkrankung der Frau und macht 4,1% aller malignen Erkrankungen von Frauen aus. Eine von 70 Frauen erkrankt im Laufe ihres Lebens an einem Ovarialkarzinom. Das Ovarialkarzinom ist die fünf-häufigste Todesursache in Folge einer Krebserkrankung bei Frauen. Trotz Verbesserungen bei Diagnostik und Therapie dieser Tumoren ist die Prognose des Ovarialkarzinoms noch immer sehr schlecht, es werden nur 26% der Fälle in einem Stadium diagnostiziert, in dem der Tumor noch auf das Ovar beschränkt ist. In 53% der Fälle liegt zum Zeitpunkt der Diagnose bereits eine Tumorausbreitung außerhalb des Beckens oder eine Fernmetastasierung vor. Die Therapie des Ovarialkarzinoms erfolgt zum einen durch chirurgische Intervention, zum anderen durch eine standardisierte Chemotherapie, meist unter Verwendung eines platinhaltigen Chemotherapeutikums.ⁱ

Wesentliche weitere Therapieoptionen stehen derzeit noch nicht zur Verfügung, insbesondere fehlt derzeit noch eine auf molekulare Tumorparameter ausgerichtete Therapie, mit der eine individualisierte Tumortherapie möglich wäre. Die Prognose des Ovarialkarzinoms wird bestimmt von der Tumorausbreitung, der Tumordifferenzierung sowie dem intraoperativen Tumorrest. Für die große Gruppe der Patientinnen mit peritonealem, disseminiertem Tumor bzw. Fernmetastasen stehen bisher keine weiteren prognostischen Marker zur Verfügung.

Tumorbiologische Relevanz von Entzündungsparametern sowie Stressreaktionen

In vielerlei Hinsicht ähneln maligne Tumoren einem entzündlich veränderten Gewebe, in beiden Fällen werden ähnliche zelluläre Signalwege aktiviert. Damit können Schaltstellen, die für Entzündungsreaktion oder Stressreaktion wichtig sind, auch das biologische Verhalten maligner Tumoren beeinflussen (Literaturverzeichnis hinter den Beispielen).^ii,iii

Die Familie der ELAV-ähnlichen Proteine, der Hu-Proteine (benannt nach dem Indexpatienten, ^iv,v), reguliert die posttranskriptionale Stabilisierung von mRNAs (Abkürzungsverzeichnis hinter den Beispielen). Dabei stabilisieren Hu-Proteine mRNAs, die sogenannte Adenin/Uracil-reiche (AU-reiche) Elemente (ARE) in ihrer 3'untranslatierten Region enthalten, dies führt zu einer verlängerten Halbwertzeit der mRNA und zu einer vermehrten Proteinexpression. AU-reiche Elemente finden sich in den mRNAs von Zytokinen, Entzündungsmediatoren sowie von Zellzyklusproteinen. Damit wird hier selektiv eine Gruppe von Proteinen reguliert, die tumorbiologisch bedeutsam sind. Die Inhibition von Hu-Proteinen stellt daher eine interessante therapeutische Alternative dar. Im Rahmen von paraneoplastischen Syndromen werden bei einer kleinen Gruppe von Tumorpatienten Autoantikörper gegen Hu-Proteine gebildet, die einerseits das Tumorwachstum inhibieren, andererseits jedoch auch mit neuralen Strukturen kreuzreagieren. Für mögliche therapeutische Interventionen wären daher Agenzien zu nutzen, die die Blut-Hirnschranke nicht überwinden können. Die Familie der humanen ELAV-ähnlichen Proteine besteht aus vier Mitgliedern, drei davon (Homolog of drosophila neuronal protein 1 (HelN1); Hu Antigen B (HuB); Hu Antigen C (HuC) und Hu Antigen D (HuD)^vi) werden vor allem im Nervengewebe exprimiert, wohingegen das vierte Protein HuR in vielen Zelltypen exprimiert wird. Die Analyse von Tumorgewebe zeigt eine abnorme zytoplasmatische Überexpression von HuR in einem Teil der Tumoren. Diese Tumoren sind mit einer schlechteren Überlebensprognose verbunden. Damit lässt sich durch die Bestimmung von HuR die Prognose abschätzen, andererseits können therapeutische Inhibitionsstrategien die Prognose verbessern.

Grundzüge der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, Tumorerkrankungen besser erkennbar und behandelbar zu machen und der Praxis ein Testbesteck in die Hand zu geben, mit dem sich die weitere Entwicklung besser vorhersagen, die Tumordiagnose erleichtern und die weitere Entwicklung des Tumorgeschehens besser beeinflussen lässt.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen durch Bestimmung abnormer, tumorspezifischer Proteine, insbesondere durch eine Analyse des Expressionsmusters des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR im Tumorgewebe gelöst. Die erfindungsgemäße Lösung macht es möglich, die Prognose der Tumorerkrankung abzuschätzen, die Indikation für eine erweiterte Therapie zu stellen und eine Methode zur molekularen Tumortherapie durch Inhibition des Proteins HuR zu liefern.

Die Hauptmerkmale der Erfindung liegen in einem Verfahren zur Diagnostik maligner Tumoren, zur Bestimmung der Prognose eines Tumors sowie zur therapeutischen Intervention bei malignen Tumoren unter Nutzung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR. Dazu wird Protein HuR als molekularer Prognosemarker oder als Target für Ovarialkarzinome, Kolonkarzinome, Prostatakarzinome, Mammakarzinome, Pankreaskarzinome oder Endometriumkarzinome eingesetzt wird.

Diese Erfindung betrifft damit diagnostische Methoden zur Bestimmung der Prognose maligner Tumoren sowie therapeutische Anwendungen durch Inhibition spezifischer tumorbiologisch relevanter Zielproteine. Im einzelnen betrifft diese Erfindung das humane ELAV-ähnliche Protein HuR, die Bestimmung seiner Expression im Tumorgewebe sowie eine therapeutische Inhibition von HuR. Die Erfindung betrifft die Prognose maligner Tumoren, insbesondere von Ovarialkarzinomen.

Erfindungsgemäß ist mit dem immunhistologischen Nachweis des mRNA-stabilisierenden Proteins HuR eine neue Methode zur Abschätzung der Prognose von malignen Tumoren gefunden worden. Dabei hat sich die zytoplasmatische Expression von HuR in Karzinomen in der multivariaten Überlebensanalyse überraschenderweise als ein unabhängiger Prognosefaktor erwiesen. Es handelt sich um die Erstbeschreibung des mRNA-regulatorischen Proteins HuR als Prognosefaktor in malignen Tumoren. Dem Protein HuR kommt möglicherweise eine zentrale Rolle bei der Steuerung von Tumorwachstum, Angiogenese und der tumor-assoziierten Entzündung zu. Damit stellt es ein interessantes Zielprotein für eine potentielle therapeutische Intervention dar.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht darin, dass eine Analyse der Expressionsmuster des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR in Tumorgeweben vorgenommen wird. Dazu werden durch immunhistologische Färbungen die Expressionen von HuR im Tumorgewebe bestimmt und mittels eines immunoreaktiven Scores separat für die zytoplasmatische und die nukleäre Färbung analysiert.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung liegt darin, dass zur therapeutischen Intervention bei malignen Tumoren eine Festlegung der Indikation zur Therapie mit COX-2-Inhibitoren oder mit Angiogeneseinhibitoren durch Bestimmung der Expression und zellulären Verteilung des Proteins HuR im Tumorgewebe vorgenommen wird. Die Therapie eines Tumors erfolgt durch Inhibition des Proteins HuR. Sie kann auch in Kombination mit chirurgischen Interventionen, standardisierten Chemotherapien oder Chemotherapien unter Verwendung platinhaltiger Chemotherapeutika erfolgen oder als molekulare Tumor-Therapie in Kombination mit pharmakologischen Substanzen, mit Transfektionstechniken oder unter Verwendung von Silencing-RNAs. Die Erfindung eignet sich auch dazu, eine gegen HuR gerichtete Therapie in Kombination mit einem COX-2-Inhibitor oder einem Angiogeneseinhibitor vorzunehmen. Die für eine molekulare Tumor-Therapie eingesetzten pharmakologischen Substanzen zur Herabsetzung von Kreuzreaktionen mit neuralen Strukturen sollen erfindungsgemäß spezifisch für die Isoform HuR oder nicht ZNS-gängig sein.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung liegt darin, dass für das humane ELAV-ähnliche Protein HuR ein neuer Verwendungszweck gefunden wurde. Es eignet sich erfindungsgemäß als molekularer Prognosemarker und als Target für Karzinome. Bezüglich der Verwendung des Proteins HuR als Prognosefaktor in malignen Tumoren handelt sich um die Erstbeschreibung der zytoplasmatischen Expression dieses mRNA-regulatorischen Proteins in Karzinomen und um die Erstbeschreibung als unabhängiger Prognosefaktor bei der multivariaten Überlebensanalyse. Die erfindungsgemäße Verwendung liegt des weiteren darin, dass Protein HuR

– bei der Bestimmung der zytoplasmatischen Expression in Karzinomen und bei der multivariaten Überlebensanalyse als ein unabhängiger Prognosefaktor
– zur Bestimmung der Therapieindikation bei malignen Tumoren
– zur Bestimmung von Therapieindikationen durch Evaluation von HuR in Tumorzellen
– zur Bestimmung von Therapieindikationen für die Therapie mit COX-2-Inhibitoren oder
– zur Bestimmung von Therapieindikationen für die Therapie mit Angiogeneseinhibitoren eingesetzt wird.

Ein weiteres erfinderisches Merkmal der Erfindung besteht in der Verwendung von HuR-Inhibitoren für molekulare Tumortherapien.

Gegenüber dem bekannten Stand

– Hur reguliert die COX-2 und VEGF (bisher nur in Modellzelllinien, nicht in Patiententumoren gezeigt) und
– einige Tumoren exprimieren HuR (z.B. Gehirntumoren) wird nunmehr als neu und als erfinderisch beansprucht
– die Unterscheidung zwischen zytoplasmatischer und nukleärer Expression im Tumorgewebe
– die Betonung, dass die zytoplasmatische Färbung entscheidend ist und
– alle Zusammenhänge zwischen HuR-Expression und schlechterer Prognose.

Die weiteren Ansprüche der Erfindung leiten sich aus der Prognoserelevanz ab: HuR ist prognostisch relevant und daher womöglich auch kausal an der Tumorprogression beteiligt. Deshalb sollte man HuR im Tumor bestimmen und dann ggf die Therapie adaptieren.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Testbestecks (Kits) zur Diagnostik maligner Tumoren und zur Bestimmung der Prognose eines Tumors unter Nutzung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR. Das erfindungsgemäße Kit besteht in einem Teil aus gepuffertem Formaldehyd, Paraffin, immunhistologischen Färbereagenzien und einem gegen HuR gerichteten Primärantikörper und zum anderen aus Gewebeproben des zu untersuchenden Tumors. Nach Einbettung der Probe und Anfärbung erfolgt die Beurteilung unter dem Mikroskop.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht darin, dass das humane ELAV-ähnliche Protein HuR ein Schlüsselregulatorprotein darstellt, das die Expression verschiedener tumorbiologisch relevanter Zielproteine steuert, z.B. der Cyclooxygenase 2 (COX-2) oder des Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und Inhibitoren dieser Zielproteine sich zur molekularen Tumortherapie eignen. Zur Beurteilung, bei welchen Patienten derartige molekulare Therapeutika eingesetzt werden sollen, kann die Expression des Proteins HuR im Tumorgewebe bestimmt werden.

Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Diese Merkmale setzen sich aus bekannten Elementen – dem Protein HuR, Tumorgeweben, COX-2-Inhibitoren oder Angiogeneseinhibitoren – und neuen Elementen – der Unterscheidung zwischen zytoplasmatischer und nukleärer Expression im Tumorgewebe, der Betonung, dass die zytoplasmatische Färbung entscheidend ist sowie alle Zusammenhänge zwischen HuR-Expression und schlechterer Tumor-Prognose – die in ihrer Kombination zu den erfindungsgemäßen Verfahren führen und eine neue Diagnostik für maligne Tumoren, die Bestimmung der Prognose eines Tumors sowie eine therapeutische Intervention bei malignen Tumoren unter Nutzung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR ermöglichen.

Zu den Methoden zur Bestimmung von HuR:

HuR kann, wie in den Beispielen beschrieben, durch immunhistologische Methoden bestimmt werden. Daneben kommen auch andere Methoden, wie zum Beispiel die reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)^v, die in-situ Hybridisierung^vii sowie der Western-Blot^viii zur Bestimmung von HuR in Frage.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.

Ausführungsbeispiele
Beispiel 1:
Bestimmung von HuR im Tumorgewebe
Hierzu werden Gewebeproben aus dem Tumor entnommen, die in 4% gepuffertem Formaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet werden. Durch immunhistologische Standardfärbungen werden geeignete Abschnitte des Tumors identifiziert. Von diesen werden dann immunhistologische Färbungen unter Verwendung eines gegen HuR gerichteten monoklonalen Primärantikörpers angefertigt.^ix
Diese Färbungen können unter dem Mikroskop beurteilt werden. Hierbei wird nach einem definierten Score zum einen der Prozentsatz positiver Zellen, zum anderen auch die Färbeintensität der Tumorzellen bestimmt. Dieser Score wird zum einen für die nukleäre, im Zellkern lokalisierte Expression des Proteins HuR bestimmt. Zum zweiten wird der immunreaktive Score auch für die zytoplasmatische Expression von HuR, die in einem Teil der Krebszellen auftritt, bestimmt. Der immunoreaktive Score gibt in Zusammenschau mit anderen Tumorparametern eine Auskunft über die Prognose, hierbei ist eine erhöhte zytoplasmatische HuR-Expression in Zusammenschau mit einer schlechteren Prognose assoziiert. Durch diese Methode können in einer Patientengruppe selektiv die Patienten identifiziert werden, die eine besonders schlechte Prognose aufweisen.
Damit kann für diese Patienten eine aggressivere Tumortherapie erfolgen. Die Bestimmung von HuR als Prognosemarker ist besonders nützlich für maligne Tumoren, da HuR ubiqitär exprimiert wird und in vielen verschiedenen Tumoren eine erhöhte zytoplasmatische Expression zu finden ist. Daher ist dieses Verfahren zum Beispiel neben Ovarialkarzinomen auch für die Abschätzung der Prognose von Kolonkarzinomen, Prostatakarzinomen, Mammakarzinomen, Pankreaskarzinomen oder Endometriumkarzinomen geeignet.
Beispiel 2:
Bestimmung von Therapieindikationen durch Evaluation von HuR in den Tumorzellen
Das Protein HuR stellt ein Schlüsselregulatorprotein dar, das die Expression verschiedener tumorbiologisch-relevanter Zielproteine steuert.^ix HuR ist besonders gut geeignet für eine immunhistologische Bestimmung, da die in vielen Zellen vorhandene physiologische nukleäre Färbung eine interne Positivkontrolle darstellt, die zusammen mit der pathologischen, zytoplasmatischen Färbung evaluiert werden kann. Zu den durch HuR regulierten tumorbiologisch relevanten Proteinen gehört die Cyclooxygenase 2 (COX-2). COX-2-Inhibitoren stellen eine mögliche Form der molekularen Tumortherapie dar.x Bisher unklar ist noch, über welche molekularen Faktoren die Indikation für eine COX-2-Therapie gestellt werden soll. Neben der Bestimmung der COX-2 selbst im Tumorgewebe stellt auch die in dieser Erfindung beschriebene Bestimmung des COX-2-regulierenden Proteins HuR eine interessante Option zur Indikationsstellung für eine Therapie mit COX-Inhibitoren dar. Ein zweites tumorbiologisch relevantes Zielprotein von HuR ist der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). Die Untersuchung des VEGF regulatorischen Proteins HuR könnte eine mögliche Indikation für eine Therapie mit Angiogenese-Inhibitoren definieren.
Auch bei anderen für die Tumortherapie zukünftig zu entwickelnden Substanzen, deren Wirkmechanismus direkt über die Inhibition von HuR läuft, kann zur Bestimmung der Therapieindikation eine Bestimmung von HuR im Tumorgewebe verwendet werden.
Beispiel 3:
Therapiestrategien
Die prognoserelevante tumorbiologische Funktion von HuR macht es zu einem interessanten Ziel für molekulare Tumortherapien. Dabei kann durch pharmakologische Substanzen oder durch Transfektionstechniken, unter anderem unter Verwendung von silencing-RNAs^xi, die Expression von HuR im Tumorgewebe inhibiert werden. Derartige Substanzen sollten entweder spezifisch für die Isoform HuR sein, oder nicht Zentralnervensystem (ZNS)-gängig sein, um Kreuzreaktionen mit neuralen Strukturen zu minimieren. Diese therapeutischen Optionen sind insbesondere für das Ovarialkarzinom, aber auch für andere Tumoren, zum Beispiel Prostatakarzinome, Mammakarzinome, Kolonkarzinome, Pankreaskarzinome oder Endometriumkarzinome geeignet. Des weiteren lasst sich eine gegen HuR gerichtete Therapie in Ergänzung zum Beispiel mit einem COX-2-Inhibitor oder einer Standardchemotherapie verwenden.
Beispiel 4:
Bestimmung mittels Polymerasekettenreaktion (PCR)
Subkonfluente Ovarialkarzinom-Zellen wurden geerntet, die gesamte RNA mit RNAeasy Kit (Qiagen, Hilden, Germany) präpariert und mittels Reverser Transkription in DNA überführt. Die Bedingungen für die PCR-Zyklen HuR/HuB/HuC waren: 30 Zyklen für die Denaturierung, Annealing und Extension (95°C für 60 Sekunden, 55°C für 60 Sekunden, and 72°C für 60 Sekunden). Für HuD wurde eine Annealing-Temperatur von 60°C verwendet. Die Primer waren humane HuR-sense Primer:
5'-ATACAATGTCTAATGGTTATGAAGACC-3' und antisense
5'-GTTATTTGTGGGACTTG-3' (generiert ein 986bp Band)4, human HuB sense
5'-GTATCCAGGACCGCTAGCT-3' und antisense
5'-TATTAATTCCAGCCAAACTGG-3' (generiert ein 127bp Band), human HuC sense
5'-AACAACCCAAGTCAGAAGAC-3' und antisense
5'-TTGTACACGAAGATGCACCA-3' (generiert ein 235bp Band)16, human HuD sense
5'-CTGCTCTCCCAGCTCTA-3' und antisense
5'-AGGCTTGTCATTCCATC-3' (generiert ein 196bp Band), GAPDH sense
5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' und antisense
5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (generiert ein 452bp Band).
Beispiel 5:
Bestimmung mittels konfokaler Mikroskopie
Konfokale Mikroskopie. Die immunohistochemische Färbung wurde entsprechend den Standard-Prozeduren durchgeführt. Dazu wurden die Zellen wurden in Methanol für 10 Minuten bei 20°C fixiert. Die Objektträger wurden in PBS/10% BSA/1% normalem Ziegenserum für 30 Minuten bei 21°C blockiert und für 90 Minuten bei 21°C mit dem Maus-monoklonalen anti-HuR-Antikörper inkubiert, 1:100 verdünnt in PBS/1% BSA und anschließend durch Inkubation mit einem Cy3-konjugierten Anti-Maus-Antikörper (Dianova, Hamburg, Germany), 1:200 verdünnt in PBS/1% BSA. Die Zellkerne wurden mit DAPI (1:1000) gefärbt. Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie wurde unter Verwendung eines Leica-Konfokalen-Mikroskops durchgeführt.
Beispiel 6:
Bestimmung mittels Immunhistologie
Die immunohistochemische Färbung wurde entsprechend Standard-Prozeduren – wie bereits für COX-2.11 beschrieben – durchgeführt. Für die HuR-Immunohistochemie wurden monoklonale Anti-human HuR-Antikörper (3A2, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 1:1000) benutzt und die Antigen-Demaskierung in Zitrat-Puffer durch 5-minütiges Erhitzen in einem Schnellkochtopf vorgenommen. Die Intensität der Kern- und zytoplasmischen HuR-Immunfärbung in Tumorzellen wurde unabhängig durch zwei Pathologen (W.W. und C.D.) evaluiert, die ohne Kenntnis des Patientenergebnisses diese Werte halbquantitativ als HuR negativ, schwach, moderat oder stark bewerteten. Für statistische Analysen wurden die Fälle mit einer negativen oder schwachen Expression von HuR zu einer Gruppe (HuR-negativ) zusammengefasst, während die Fälle mit einer moderaten bis starken Expression einer HuR-positiven Gruppe zugeordnet wurden. Nachfolgende statistische Analysen wurden durch Vergleichen von positiven und negativen Fällen durchgeführt.
Beispiel 7:
Statistische Analysen
Die statistische Signifikanz des Zusammenhangs zwischen Expression von HuR und einzelnen klinikpathologischen Parametern, wie COX-1 oder COX-2, wurden durch Fisher's exact, Chi-Quadrat-Test oder Chi-Quadrat-Test für Trends bewertet. Die Wahrscheinlichkeit des Gesamt-Überlebens als eine Funktion der Zeit wurde durch die Kaplan-Meier-Methode und den Logrank-Test bestimmt. Multivariate Überlebens-Analysen wurden unter Verwendung des Cox-Regressions-Modells durchgeführt. Generell wurden p-Werte kleiner als 0.05 als signifikant berücksichtigt. Für die statistische Evaluierung wurde die SPSS-Software-Version 10.0 verwendet.
Tabellen
Tabelle 1 zeigt die univariate Überlebensanalyse (Kaplan-Meier) ausgewählter Untergruppen von Patienten entsprechend der zytoplasmatischen HuR-Expression (5)
Tabelle 2 zeigt die Überlebensanalyse (Regressions-Model nach Cox) für das Gesamt-Überleben von 83 Patienten mit invasivem Ovarialkarzinom
Legenden zu den Figuren
1.
A. Expression der HuR-mRNA in Ovarialkarzinomzelllinien (PCR)
B. Alle Zelllinien zeigen zudem eine Expression von HuR-Protein (Western Blot)
C. In OVCAR-3 Zellen ist HuR überwiegend im Zellkern exprimiert (Konfokale Laser Scan Mikroskopie)
2.
Expression des HuR-Proteins in 8 Ovarialkarzinomen und einem Borderline-Tumor.
1: Seröses Ovarialkarzinom Grad 1; 2: Seröser Borderline-Tumor; 3: Seröses Ovarialkarzinom Grad 1; 4: Endometrioides Ovarialkarzinom Grad 2; 5: Seröses Ovarialkarzinom Grad 3; 6: Seröses Ovarialkarzinom Grad 3; 7: Seröses Ovarialkarzinom Grad 2; 8: Seröses Ovarialkarzinom Grad 1; 9: Seröses Ovarialkarziom Grad 2
3.
Immunhistochemie: Expression von HuR in primären humanen Ovarialkarzinomen.
A: Nukleäre Expression in einem Serösen Ovarialkarzinom, Grad 1;
B: Nukleäre Expression in einem Serösen Ovarialkarziom, Grad 2;
C: Starke cytoplasmatische Expression von HuR ein einem Serösen Ovarialkarzinom, Grad 2;
D: Starke cytoplasmatische Expression von HuR ein einem Serösen Ovarialkarzinom, Grad 3;
E,F: Starke Expression der COX-2 (E) im Tumorgewebe, die durch Präinkubation mit einem COX-2 Peptid vollständig inhibiert wird (F)
4. A: Signifikante Korrelation der zytoplasmatischen HuR-Expression der Tumorzellen mit der COX-2-Expression (0=0.025, Fisher's exakter Test.)
B: Signifikante Korrelation der zytoplasmatischen HuR-Expression der Tumorzellen mit dem histologischen Differenzierungsgrad (0=0.008, chi² Test für Trends.)
C: Signifikante Korrelation der zytoplasmatischen HuR-Expression der Tumorzellen mit der mitotischen Aktivität (0=0.002, chi² Test für Trends)
5.
Univariate Überlebensanalyse gesondert für die zytoplasmatische oder nukleäre HuR-Expression.
Die zytoplasmatische Expression ist ein prognostischer Faktor für das progessionsfreie Überleben (A, p=0.03, log rank test) und für das Gesamtüberleben (B, p=0.007) von Patientinnen mit Ovarialkarzinomen.
Im Gegensatz dazu ist die nukleäre Expression kein Prognosefaktor für das progessions-freie Überleben (C, p=0.54) bzw. das Gesamtüberleben (D, p=0.97).
Die zytoplasmatische Expression von HuR ist ein Prognosefaktor in der Unterguppe der Patientinnen mit fortgeschrittenem Ovarialkarzinom (FIGO Stadium III, FIGO: Fédération Internationale de Gynécologie et d' Obstétrique) (E, F) sowie in der Gruppe der Patientinnen mit Serösen Ovarialkarzinomen (G, H), jeweils für das progessions-freie Überleben (E, G) bzw. das Gesamtüberleben (F, H). Gepunktete Linien: HuR-negative Fälle, durchgezogene Linien: HuR-positive Fälle.
Abkürzungsverzeichnis

ARE: AU-reiches Element
AU-reich: Adenin/Uracil-reich
COX-2: Cyclooxygenase 2
ELAV: embryonic lethal abnormal vision, homologes Drosophila Protein
FIGO: Fédération Internationale de Gynécologie et d' Obstétrique
Hel-N1: Homolog of drosophila ELAV-like neuronal protein 1
Hu: Hu Antigen (benannt nach den Indexpatienten, keine weitere Bedeutung)
HuB: Hu Antigen B
HuC: Hu Antigen C
HuD: Hu Antigen D
HuR: Hu Antigen R
mRNA: messenger Ribonukleinsäure
PCR: Polymerase-Kettenreaktion
RNA: Ribonukleinsäure
RT: Reverse Transkriptase
RT-PCR: Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion
siRNA: short interfering RNA
VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor
ZNS: Zentralnervensystem

Literaturverzeichnis

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^iv Graus F. Newonal anti-nuclear antibody in sensory newonopathy from lung cancer, Newology 1985; 35: 538–43.
^v Manley GT, Smitt PS, Dalmau J, Posner JB (1995). Hu antigens: reactivity with Hu antibodies, tumor expression, and major immunogenic sites. Ann Neurol.;38(1):102–10.
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Claims

Verfahren zur Diagnostik maligner Tumoren, zur Bestimmung der Prognose eines Tumors sowie zur therapeutischen Intervention bei malignen Tumoren unter Nutzung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Protein HuR als Prognosemarker oder als Target für Ovarialkarzinome, Kolonkarzinome, Prostatakarzinome, Mammakarzinome, Pankreaskarzinome oder Endometriumkarzinome eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Analyse der Expressionsmuster des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR in Tumorgeweben vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur therapeutischen Intervention bei malignen Tumoren eine Festlegung der Indikation zur Therapie mit COX-2-Inhibitoren oder mit Angiogeneseinhibitoren durch Bestimmung der Expression und zellulären Verteilung des Proteins HuR im Tumorgewebe vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Therapie eines Tumors durch Inhibition des Proteins HuR erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumor-Therapie in Kombination mit chirurgischen Interventionen, standardisierten Chemotherapien oder Chemotherapien unter Verwendung platinhaltiger Chemotherapeutika erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine molekulare Tumor-Therapie in Kombination mit pharmakologischen Substanzen, mit Transfektionstechniken oder unter Verwendung von Silencing-RNAs erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine gegen HuR gerichtete Therapie in Kombination mit einem COX-2-Inhibitor oder einem Angiogeneseinhibitor vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die für eine molekulare Tumor-Therapie eingesetzten pharmakologische Substanzen zur Herabsetzung von Kreuzreaktionen mit neuralen Strukturen spezifisch für die Isoform HuR oder nicht ZNS-gängig sind.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass durch immunhistologische Färbungen die Expression von HuR im Tumorgewebe bestimmt und mittels eines immunoreaktiven Scores separat für die cytoplasmatische und die nukleäre Färbung analysiert wird.
Verwendung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR als molekularer Prognosemarker und als Target für Karzinome.
Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass Protein HuR bei der Bestimmung der zytoplasmatischen Expression in Karzinomen und bei der multivariaten Überlebensanalyse als ein unabhängiger Prognosefaktor eingesetzt wird.
Verwendung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR zur Bestimmung der Therapieindikation bei malignen Tumoren.
Verwendung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR nach Anspruch 13 zur Bestimmung von Therapieindikationen durch Evaluation von HuR in Tumorzellen.
Verwendung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR nach Anspruch 13 und 14 zur Bestimmung von Therapieindikationen für die Therapie mit COX-2-Inhibitoren.
Verwendung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR nach Anspruch 13 und 14 zur Bestimmung von Therapieindikationen für die Therapie mit Angiogeneseinhibitoren.
Verwendung von HuR-Inhibitoren für molekulare Tumortherapien.
Testkit zur Diagnostik maligner Tumoren und zur Bestimmung der Prognose eines Tumors unter Nutzung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR.
Testkit nach Anspruch 18, bestehend in einem Teil aus gepuffertem Formaldehyd, Paraffin, immunhistologischen Standardreagenzien – wie Sekundärantikörper, Färbereagenzien oder Färbesubstrat – sowie einem gegen HuR gerichteten Primärantikörper und zum anderen Teil aus Gewebeproben des zu untersuchenden Tumors.