CN110760587B - Pdia3p1作为胶质瘤预后标志物的应用 - Google Patents

Pdia3p1作为胶质瘤预后标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本公开属于胶质瘤预后标志物技术领域，具体涉及PDIA3P1作为胶质瘤预后标志物的应用。本公开的研究调查了PDIA3P1在低氧诱导的胶质瘤MES转换中的机制，证实了PDIA3P1的表达与胶质瘤患者的肿瘤级别，转录组亚型和预后密切相关。PDIA3P1作为一种ceRNA，通过miR‑124‑3p调节RELA表达并激活下游NF‑κB通路，从而促进胶质瘤细胞的MES转换。另外，本公开还证实低氧诱导因子1直接结合PDIA3P1启动子区并激活其转录。PDIA3P1是通过PDIA3P1‑miR‑124‑3p‑RELA轴起到低氧和胶质瘤MES转变之间的关键连接作用，其可以作为胶质瘤的预后指标和的潜在治疗靶点。

Description

PDIA3P1作为胶质瘤预后标志物的应用
技术领域
本公开属于胶质瘤预后标志物技术领域，具体涉及PDIA3P1作为胶质瘤预后标志物的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
人脑胶质瘤占成人恶性原发性脑肿瘤的75％。尽管包括大范围切除，放射治疗和替莫唑胺辅助治疗在内的治疗方法明显改善了胶质瘤患者的预后，但仍落后于其他肿瘤。由于新的生物标志物的鉴定会影响肿瘤的生物学特征，因此胶质瘤基因型在早期诊断中能够提供更为精确的诊断信息，可靠的预后和富集策略可以提供比组织学表型更多的信息。
长的非编码RNA（lncRNA）是没有蛋白质编码功能的转录物，占人类转录组的98％。迄今为止，大量研究表明lncRNA可作为转录和表观遗传网络的新型调节因子。此外，发现许多lncRNA在肿瘤中异常表达并在肿瘤进展中起关键作用。其中，假基因定义为与其编码同源物相似且缺乏向功能蛋白翻译的基因组基因座。然而，越来越多的证据表明假基因的多功能特征有助于肿瘤进展。
低氧是神经胶质瘤的标志。低氧会改变肿瘤细胞的表达特性，从而激活下游基因，促进肿瘤生长，血管生成和转移。有力的证据表明，低氧与转录组测序中胶质瘤干细胞（GSCs）和间充质（MES）亚型的更新能力维持密切相关。Jin等人研究表明，低氧对GSC的维持至关重要，并与胶质母细胞瘤中的MES特征相关。因此，脑胶质瘤中低氧诱导的MES转变背后的机制是有意义的。 Rius等人证明NF-κB是HIF-1α的关键转录激活因子。反过来，NF-κB活化需要在低氧条件下积累HIF-1α蛋白。还有证据表明NF-κB在几种癌症中促进HIF-1α的转录和活性。此外，针对HIF-1α的干预措施始终导致NF-κB通路同时失活。此外，研究人员发现含有COMM结构域的1（COMMD1）破坏了HIF-1α和HIF-1β的二聚化，从而抑制了NF-κB介导的基因表达和肿瘤细胞的侵袭。然而，HIF-1α如何影响肿瘤进展期间NF-κB活性的详细机制仍然是未知的。
2013年，Bhat等人发现PN GSCs通过NF-κB途径转化为MES状态，CD44和放射抗性表型的表达升高。此后，进行了几项研究，以阐明神经胶质瘤如何通过激活NF-κB转录程序获得MES-特征的潜在机制。此外，还研究了靶向GBM中NF-κB途径的治疗方法，并取得了一些成功。考虑到其在MES胶质瘤中的重要作用以及抗多种治疗的破坏性后果，寻找新的策略来停用NF-κB系统对于改善胶质瘤患者的临床结果至关重要。
另外，越来越多的证据表明，lncRNA在肿瘤发生和恶性肿瘤进展中起重要作用。考虑到人类转录组中大量的lncRNA和胶质瘤的高度异性，人类胶质瘤中lncRNA的功能性景观仍然难以捉摸。由于ceRNA的假设是在2011年开发的，越来越多的研究已经发表，以解码复杂的RNA网络。 2017年，孔等人发现PDIA3P1敲低可通过影响p53通路降低HCC细胞的迁移，侵袭和增殖，但详细机制尚未详细研究。在其他研究中，Sun及其同事证明PDIA3P1在OSCC中过表达并通过吸收miR-185-5p促进肿瘤细胞增殖。
发明内容
此外，发明人之前的研究表明，低氧是肿瘤生长，转移和免疫微环境改变的关键因素。在本公开的研究中，发明人分析了在GEO数据库中的常氧（21％氧）或低氧（1％氧）条件下培养的U87MG胶质母细胞瘤细胞的微阵列数据，并鉴定了蛋白质二硫键异构酶家族A成员3假基因1（ PDIA3P1），一个2099bp区段，定位于染色体1q21.1，据报道在HCC和OSCC中高表达，在低氧条件下上调；并对PDIA3P1的基因表达调控和功能机制进行了深入研究。
本公开通过癌症基因组图谱（TCGA）和中国胶质瘤基因组图谱（CGGA）数据库的进一步分析显示，高PDIA3P1表达代表更恶性的肿瘤类型并且导致胶质瘤患者的较差结果。PDIA3P1过表达或敲低改变了胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力。这通过miR-124-3p的海绵调节RELA的表达，并激活下游NF-κB途径以促进胶质瘤细胞中的MES转变而发生。进一步的研究表明，低氧诱导因子（HIF1）异二聚体直接与PDIA3P1启动子的低氧反应元件（HRE）结合，以促进其在低氧条件下的表达。总的来说，这项研究表明PDIA3P1是低氧和神经胶质瘤MES转换之间的重要联系，因此它可以作为预测预后的潜在候选者，并作为胶质瘤患者治疗的目标。
基于上述研究结果，本公开提供以下技术方案：
本公开第一方面，提供低氧诱导因子/ PDIA3P1/miR-124-3p/RELA/ NF-κB /p65或其中几种的组合作为胶质瘤预后标志物的应用。
优选的，所述胶质瘤为脑胶质瘤，具体的，为神经胶质瘤。
优选的，所述PDIA3P1表达含量高预示着胶质瘤患者不好的预后。
优选的，所述预后包括神经胶质瘤侵袭情况的评估。
本公开研究结果表明，PDIA3P1与胶质瘤细胞间充质型转化、低氧和细胞外基质解体相关，当PDIA3P1高表达时，预示着胶质瘤细胞间充质型转化、低氧和细胞外基质解体的可能性能更大，具有更强的迁移和侵袭能力。
优选的，所述低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)具体为HIF-1α和HIF-1β异二聚体。
优选的，所述低氧诱导因子/RELA/ NF-κB /p65高表达预示着的胶质瘤患者不好的预后，而miR-124-3p低表达预示着胶质瘤患者不好的预后。
本公开第二方面，提供低氧诱导因子作为PDIA3P1/RELA/NF-κB /p65激动剂，或作为miR-124-3p抑制剂的应用。
基于本公开研究结果，低氧诱导因子能够与PDIA3P1启动子区域结合，二者的表达呈现相关性；具体的，所述低氧诱导因子为HIF-1α和HIF-1β异二聚体。
本公开第三方面，提供PDIA3P1作为RELA/NF-κB /p65激动剂，或作为miR-124-3p抑制剂的应用。
本公开第四方面，提供miR-124-3p作为RELA/NF-κB /p65抑制剂的应用。
本公开第五方面，提供RELA作为NF-κB /p65激动剂的应用。
与现有技术相比，本公开的有益效果是：
本公开研究证实了lncRNA PDIA3P1主要定位于细胞质中，表明PDIA3P1可能作为内源性microRNA海绵起作用，另外本公开还提供了miR-124-3p抑制了胶质瘤细胞的恶性特征，这反映在受损的迁移和侵袭能力以及MES标记物的表达降低中。然后，本公开证实了RELA是一种原癌基因，也称为NF-κBP65亚基，是miR-124-3p的新靶标。
另外，本公开还发现HIF-1异二聚体介导PDIA3P1上调，而miR-124-3p下调通过激活NF-κB途径促进胶质瘤的MES转变。 RELA敲低部分逆转了这种作用，表明PDIA3P1是低氧和NF-κB途径之间的重要联系。
总之，本公开揭示了低氧诱导的因子1直接与启动子区域结合并上调PDIA3P1的表达，PDIA3P1通过人脑胶质瘤中的PDIA3P1-miR-124-3p-RELA轴促进细胞迁移和侵袭。这些发现将PDIA3P1鉴定为低氧和NF-κB介导的胶质瘤MES转换之间的新型联系，表明它是胶质瘤患者预后和分子靶向的有希望的候选者。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为实施例1中假基因PDIA3P1与胶质瘤患者预后关系结果图；
其中，图1A MA图显示了低氧处理的U87MG细胞与正常处理的U87MG细胞中假基因的变化；
图1 B低氧处理U87MG细胞中假基因上调的热图；
图1 C Real-time quantitative PCR (qRT-PCR)检测PDIA3P1在正常人星形胶质细胞(NHA)、胶质瘤细胞系(U251、U87MG、A172)和原代GBM细胞(P3)中的相对表达；
图1 D qRT-PCR检测U251、U87MG、A172细胞系和P3原代GBM细胞在常氧和低氧条件下PDIA3P1的相对表达；
图1E为TCGA数据库中不同等级肿瘤标本中PDIA3P1的表达分类结果；
图1F为TCGA数据库中不同转录组亚型肿瘤标本中PDIA3P1的表达分类结果；
图1G为CGGA数据库中不同等级肿瘤标本中PDIA3P1的表达分类结果；
图1H为CGGA数据库中不同转录组亚型肿瘤标本中PDIA3P1的表达分类结果；
I- L根据TCGA和CGGA数据库，gms (I, K)和LGGs (J, L)中PDIA3P1高、低表达患者Kaplan-Meier生存曲线。p值通过log-rank t检验得到；
图1I为TCGA数据库中GBM患者生存曲线图；
图1J为TCGA数据库中LGG患者生存曲线图；
图1K为CGGA数据库中GBM患者生存曲线图；
图1L为CGGA数据库中LGG患者生存曲线图。
图2为PDIA3P1 促进胶质瘤细胞在体内和体外的迁移和侵袭结果图；
其中，图2A火山图，根据TCGA-GBM数据库显示高pdia3p1表达患者(n = 25)与低pdia3p1表达患者(n = 25)的差异表达基因；
图2 B为2 A 中上调基因的生物过程富集分析，y轴为正相关过程；
图2 C GSEA证实高PDIA3P1与低氧和上皮-间质转化(EMT)相关，而低PDIA3P1与神经和脚硬膜亚型相关；
图2 D采用transwell法检测慢病毒和siRNA转染U87MG细胞的迁移和侵袭能力，代表照片所示,比例尺:100μm；
图2 E慢病毒和siRNA转染U87MG细胞后的三维肿瘤球体侵袭实验。代表图像在0h、24小时、48 h, h和96所示,比例尺:200μm；
图2 F western blot检测慢病毒过表达a对照序列或PDIA3P1转染U87MG、A172、U251细胞中MES标志物蛋白水平，β-actin用作标准化控制；
图2 G western blot检测转染si-Nc和si-PDIA3P1的U87MG、A172和P3细胞中MES标志物的蛋白水平，β-actin用作标准化控制。
图2 H异种移植裸鼠体内肿瘤生长第10天荧光成像分析；
图2 I慢nc和ov-PDIA3P1小鼠的发光信号定量；
图2 J转染慢病毒过表达对照序列orPDIA3P1的U87MG细胞的裸鼠原位移植的存活分析；(log-rank分析P = 0.018;数据来自5只动物/组)
图2 K染色的异种移植部分PDIA3P1 overexpressing或消极执行控制U87MG细胞组织在同一天,比例尺:100μm。
L, M为PDIA3P1过表达或敲除的U87MG中，通过IHC染色测定的蛋白质含量,规模酒吧:50μm。p值表示三个独立实验的均值±SE。* P < 0.05;**P < 0.01， ***P < 0.001。
图2L为CD44的蛋白含量；
图2M为Vimentin的含量。
图3为PDIA3P1作为microRNA海绵与miR-124-3p结合结果图；
其中，图3A荧光原位杂交(FISH)是用于检测的位置PDIA3P1 U87MG细胞和A172细胞,比例尺:50μm；
图3 B qRT-PCR检测U87MG和A172细胞胞浆和细胞核中PDIA3P1的相对表达；
图3 C, D为过表达和敲低PDIA3P1的胶质瘤细胞中microRNA的表达，x轴上标记为红色的标题表示ov-PDIA3P1组表达显著下降，si-PDIA3P1组表达显著增加(P < 0.05)；
其中，图3C为U87MG细胞；
图3D为A172细胞；
图3 E利用TCGA-LGG数据集检测miR-124-3p与PDIA3P1在低级别胶质瘤中的表达相关性；
图3 F FISH法使用PDIA3P1探针检测其在miR-124-3p过表达和敲低U87MG细胞中的表达。有代表性的图像显示；
图3 G FISH实验使用miR-124-3p探针检测其在PDIA3P1过表达和敲低U87MG细胞中的表达。代表图像显示比例尺:50μm；
图3 H基于预测的miR-124-3p在PDIA3P1中的结合位点构建野生型(WT)和突变型(MUT)荧光素酶报告载体；
图3 I报告载体与miR-124-3p或miR-Nc共转染U87MG细胞。转染48小时后测定荧光素酶活性。p值表示三个独立实验的均值±SE。* P < 0.05;* * P < 0.01;* * * P <0.001;无显著性差异。
图4为MiR-124-3p在体外靶向RELA，抑制胶质瘤细胞的MES转化结果图；
图4 A形态变化U87MG转染后细胞和A172细胞miR-Nc和mir-124-3p模仿,比例尺:100μm；
图4 B通过transwell实验评估转染miR-Nc、miR-124-3p模拟物和miR-124-3p抑制剂的U87MG细胞的迁移和侵袭，代表照片所示,比例尺:100μm；
图4 C western blot检测转染miR-Nc、miR-124-3p模拟物和miR-124-3p抑制剂的U87MG、A172和U251细胞中MES标志物的蛋白水平，β-actin被用作控制规范化；
图4 D根据TCGA-LGG数据集，microT-CDS、Starbase和数据分析预测了155个miR-124-3p的共同潜在靶点的文氏图；
图4E-G通过qRT-PCR检测过表达和敲低U87MG (E)、A172 (F)和U251 (G)的PDIA3P1细胞中(D)中可能与MES转化相关的靶细胞的相对表达，x轴上红色标记的标题表示ov-PDIA3P1组表达显著增加，si-PDIA3P1组表达显著减少；
图4 H - J为通过qRT-PCR检测过表达和敲低miR-124-3p的细胞中miR-124-3p潜在靶点的相对表达，x轴上红色标记的标题表示miR-124-3p模拟物组表达显著下降，miR-124-3p抑制剂组表达增加；
其中，图4 H为U87MG细胞；
图4 I为A172细胞；
图4 J为U251细胞；
图4 K利用TCGA-LGG数据集检测miR-124-3p在低级别胶质瘤中的表达与RELA的相关性；
图4 L基于预测miR-124-3p在RELA 3’UTR中的结合位点构建野生型(WT)和突变型(MUT)荧光素酶报告载体；
图4 M用报告载体和miR-124-3p或miR-Nc共转染U87MG细胞。转染48小时后测定荧光素酶活性，p值表示三个独立实验的均值±SE，* P < 0.05;* * P < 0.01;* * * P <0.001，无显著性差异。
图5为PDIA3P1诱导胶质瘤MES过渡通过激活NF-κB通路；
图5 A图2上调基因KEGG通路富集分析。A.正相关过程列在y轴上；
图5 B GSEA证实高PDIA3P1表达式与NF-κB通路有关；
图5 C利用TCGA数据集测定了PDIA3P1和RELA在LGG和GBM中表达的相关性；
图5 D P65蛋白水平和磷酸化NF-κB通路中P65 U87MG A172细胞转染和si-Nc si-PDIA3P1被西方墨点法评估；
图5 E P65蛋白水平和磷酸化P65在U87MG NF-κB通路,A172, U251细胞与慢病毒转染overexpressing控制序列或PDIA3P1被西方墨点法评估；
图5 F P65蛋白水平和磷酸化P65在U87MG NF-κB通路,A172,并与miR-Nc U251细胞转染,mir-124-3p模仿,mir-124-3p抑制剂被西方墨点法评估；
图5 G蛋白水平的MES标记,P65,和磷酸化P65 NF-κB U87MG通路,A172, U251细胞转染和si-Nc si-RELA被西方墨点法评估，β-actin被用作控制规范化；
图5 H, I采用transwell法检测转染si-Nc和si-RELA的U87MG和U251细胞的迁移和侵袭能力，代表照片所示,比例尺:100μm肿瘤；
图5H为照片图；
图5I为柱状图；
图5 J 3 d球体入侵分析U87MG细胞转染si-Nc和si-RELA，代表图像在0 h、24小时、48 h, h和96所示,比例尺:200μm；
图5 K通过IHC染色测定PDIA3P1过表达或敲除的U87MG细胞中的蛋白含量，规模酒吧:50μm，p值表示三个独立实验的均值±SE，* P < 0.05;* * P < 0.01;* * * P <0.001，无显著性差异。
图6为HIF-1α和HIF-1β异二聚体结合PDIA3P1促进其表达；
图6 A利用TCGA数据集确定HIF1A和PDIA3P1在LGG和GBM中表达的相关性；
图6 B转染si-Nc和si-HIF1A并在低氧和常氧条件下培养的U251、U87MG、A172和P3细胞中PDIA3P1的相对表达；
图6 C转染si-Nc和si-HIF1A，在低氧和常氧条件下培养的U251和U87MG细胞中相对miR-124-3p表达；
图6 D在低氧条件下，PDIA3P1在过表达HIF1A的pENTER和质粒转染的U251、U87MG、A172和P3细胞中的相对表达；
图6 E低氧条件下转染过表达HIF1A的pENTER和质粒的U251、U87MG、A172和P3细胞中miR-124-3p的相对表达；
图6 F蛋白水平的MES标记,HIF1A, P65,磷酸化NF-κB通路中P65 U87MG U251细胞的暗示疗法；
图6 G HEK-293T细胞双荧光素酶检测显示HIF1A过表达增加了PGL3-1308和PGL3-1108的启动子活性；
图6H为不同表达载体中pENTER和HIF1A的表达含量直方图；
图6 I含有PDIA3P1启动子(PGL3-WT)和缺失结构(PGL3-Del-1/2/3)的荧光素酶报告基因结构示意图，其中推测的HIF1A::ARNT结合位点被删除；
图6 J HEK-293T细胞双荧光素酶检测显示，HIF1A过表达并没有增加PGL3-Del-1和PGL3-Del-3转染细胞的启动子活性，仅在PGL3-Del-2转染细胞中有轻微增加；
图6K ChIP-qPCR分析表明更高倍浓缩的子站点999 - 991年和899 - 891年anti-HIF-1β抗体组U251细胞的免疫球蛋白g组相比,表明HIF-1β可以直接绑定PDIA3P1启动子；
图6 L ChIP-PCR试验表明,在U251细胞系中HIF-1β与预测的PDIA3P1启动子区位点直接结合。免疫共沉淀结果证实，一条特定的，符合扩增产物长度的强条带可与HIF-1β蛋白直接结合，p值表示三个独立实验的均值±SE，* P < 0.05;* * P < 0.01;* * * P <0.001，无显著性差异。
图7为低氧诱导的PDIA3P1通过PDIA3P1- mir -124-3p- rela轴促进胶质瘤MES的转化示意图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本公开提供了PDIA3P1作为胶质瘤预后标志物的应用，在低氧和NF-κB介导的胶质瘤MES转换之间的建立了新型联系。
以下实施例中所涉及的PDIA3P1及miR-124-3p序列如下表1所示：
表1
名称 序列
PDIA3P1 GCAAAGACCUGAAUAUCGU
miR-124-3p TTGGCATTCACCGCGTGCCTTA
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1 1.材料和方法
1.1数据集获取
微阵列数据集利用Illumina Human HT-12 V3.0平台，从基因表达Omnibus (GEO)下载公开的U87MG胶质瘤细胞株微阵列基因图谱数据集GSE45301。肿瘤组织样本的RNA测序数据分别来自TCGA (https://cancergenome.nih.gov)和CGGA (http://www.cgga.org.cn/)。将高、低PDIA3P1表达的截断值设为中值样本的表达水平。临床属性从TCGA数据集中下载。富集分析对TCGA数据集中的基因表达谱进行基因本体论(GO)的生物过程(BP)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)和PDIA3P1的相关分析。用R的DESeq2包被测得差异表达基因(DEGs)，差异显著的基因定义为|log2FC|≥2,p<0.05。使用DAVID web tool(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)对DEGs进行了丰富和分析。利用GSEA (geneset enrichment analysis, http://software.broadinstitute.org/)软件分析了分子签名数据库(MSigDB)中PDIA3P1表达与hallmark基因集之间的关系。
1.2细胞培养
人胶质瘤细胞株U251、U87MG、A172购自中国科学院细胞库。细胞维持如前所述。短串联重复序列分析用于验证所有细胞系。细胞在使用前被证实为支原体阴性。RNA提取和定量逆转录PCR (qRT)使用TRIzol (Invitrogen, USA)按照制造商协议提取总细胞RNA。使用ΔΔCt方法的相对表达水平进行评估。
1.3慢病毒、siRNA、microRNA、质粒构建和细胞转染
选择人全长PDIA3P1质粒，插入plvx-ire-puro载体，稳定过表达。si-PDIA3P1,si-RELA, miR-124-3p mimics, miR-124-3p inhibitor，阴性对照购自Genepharma(上海)。质粒购自生物科学(济南)，人类PDIA3P1启动子序列购自UCSC基因组浏览器(http://genome.ucsc.edu/)。转染时，细胞接种于6孔板中过夜，按照制造商的说明使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen)转染。转染48小时后收集细胞进行PCR和western-blot分析。
1.4荧光素酶报告基因实验
设计合成了双荧光素酶报告质粒(pGL3-PDIA3P1 WT/MUT和pGL3-RELA WT/MUT)和PDIA3P1启动子荧光素酶报告质粒。HEK-293T细胞接种于96孔板中过夜(2×104/孔)。3 'utr测试,双荧光素酶报告质粒(0.1μg) co-transfected miR-Nc和mir-124-3p模仿(20 nM×0.5μl)。对于激发器测试,PDIA3P1发起人荧光素酶报告质粒(0.1μg)和pRL-TK质粒(5ng)与囚禁co-transfected(0.1μg)和HIF1A overexpressing质粒(0.1μg)使用Lipofectamine 3000(ThermoFisher, CA)。采用PRL-TK作为内部控制。使用双荧光素酶报告物检测系统(Promega)按照制造商的说明对细胞进行荧光素酶活性分析。
1.5细胞迁移和侵袭试验
采用96孔3D球BME细胞侵袭试验试剂盒(3500-096-K, Trevigen, USA)，按照制造商协议进行肿瘤球样侵袭试验。总之，将2×105胶质瘤细胞在成球ECM中培养72 h，生成肿瘤球。然后，将浸润基质添加到肿瘤球体中。在徕卡显微镜下分别于0小时、24小时、48小时和72小时拍摄肿瘤球体。
1.6荧光原位杂交(FISH)
将U87MG、A172、U251细胞用4%多聚甲醛固定15min, PBS洗涤，胃蛋白酶处理(10mMHCl处理1%)，70%、85%、100%乙醇脱水。为使细胞变性，将细胞风干，用20 nM的FISH探针在73℃杂交缓冲液中孵育5 min，置于水浴中。37℃杂交12小时。最后将载玻片冲洗、脱水，用DAPI染色检测。RNA FISH探针由上海Genepharma公司设计合成。
1.7 western blotting
以下主要使用抗体:β-actin (Proteintech, 60008 – 1)、Vimentin(细胞信号技术,5741),N-cadherin(细胞信号技术,13116),β-Catenin(细胞信号技术,8480),CD44(Proteintech, 15675 - 1 - ap), MMP14 (abcam ab51047)磷酸化NF-κB p65 (S536)(细胞信号技术,3033),NF-κB p65(细胞信号技术,8242),和HIF-1α(细胞信号技术,36169)。
1.8免疫组织化学(IHC)
主要使用抗体:anti-CD44 (Proteintech, 15675-1-ap), anti-Vimentin(细胞信号技术,5741),anti-NF-κB p65(细胞信号技术,8242),和anti-Phosphorylated NF-κBp65 (S536) (abcam ab86299)。
1.9染色质免疫沉淀(ChIP)实验
HIF-1α的结合位点和HIF-1β异二聚体(HIF1A:: ARNT)发起人的PDIA3P1地区利用JASPAR预测(http://jaspar.genereg.net/)。ChIP实验使用Magna ChIP™A/G染色质免疫沉淀试剂盒(17-10086,Millipore, USA)进行，如前所述为[10]。以下使用抗体:anti-HIF-1α(细胞信号技术,36169)或anti-HIF-1β(细胞信号技术,5537)。采用PCR和qRT-PCR对共沉淀DNA进行定量。
1.10动物研究
将荧光素酶标记并稳定转染过表达PDIA3P1或载体的U87MG细胞，随机分组4周BALB/c裸鼠(5×105/鼠)，建立原位异种移植模型。采用生物发光成像技术，每5天对胶质瘤细胞植入后的小鼠大脑进行一次成像。接下来，本实施例在每组随机选择5只小鼠，并于当天(10 d)对其实施安乐死。其余小鼠(5/组)保存至死亡，进行生存分析。所有涉及小鼠的程序均经山东大学齐鲁医院动物护理与使用委员会批准并符合其要求。
1.11统计分析
将高、低PDIA3P1表达的截断值设为中值样本的表达水平。生存分析采用Kaplan-Meier法，log-rank检验进行比较。双尾χ2测试被用来估计PDIA3P1表达和临床病理特征之间的关系。用Pearson相关分析不同基因表达之间的线性关系。所有其他数据比较均采用GraphPad Prism 7进行单因素方差分析或学生t检验。所有数据均以均数±标准差表示，p值< 0.05为差异有统计学意义。
2.1LncRNA PDIA3P1在低氧处理的胶质瘤细胞中上调，并与预后不良相关
为了鉴定低氧相关的假基因，本实施例首先使用来自GEO的含氧量正常和低氧的U87MG成胶质细胞瘤细胞系（GSE45301）的微阵列数据集来产生差异表达的假基因。本实施例在低氧处理的U87MG细胞中发现了41种上调的假基因（图1A，B）。其中，根据TCGA-LGG和TCGA-GBM数据集，PDIA3P1的表达明显增加，临床样本中也有相对较高的水平。为了证实这一点，进行qRT-PCR以评估正常人星形胶质细胞（NHA），神经毒性细胞系U251，U87MG，A172和在常氧和低氧条件下培养的原代P3GBM细胞系中的PDIA3P1表达。结果显示，胶质瘤细胞系比NHA细胞具有更高的PDIA3P1水平。此外，GBM细胞系U87MG，A172和P3显示出比低级神经胶质瘤（LGG）U251细胞系更高的表达水平（图1C）。另外，低氧增加了所有4种神经胶质瘤细胞系中PDIA3P1的表达（图1D）。
为了评估PDIA3P1在胶质瘤患者中的临床意义，本实施例使用TCGA数据库评估了PDIA3P1表达与患者临床病理特征的相关性。如表2所示,高PDIA3P1表达式与更高的年龄(p< 0.001),第四等级(图1 E)和MES亚型(图1 F),基因改变像IDH野生型(p < 0.001),管理子non-methylation (p < 0.001),叔子突变(p < 0.001)和ATRX野生型(p < 0.001),转录组分数低的绝对纯洁(p = 0.049),高估计基质得分(p < 0.001),和免疫评分(p <0.001)。从CGGA数据库获得的表达和临床资料也证实了上述结论(图1G, 1H)。
表2
Figure 932217DEST_PATH_IMAGE001
这些结果表明，PDIA3P1高水平通常发生在高恶性胶质瘤中，并伴有基质细胞和免疫细胞的浸润。根据TCGA和CGGA数据库(图1I, 1J和1K, 1L)，生存分析显示，PDIA3P1水平较高的LGG和GBM患者的总体生存时间均小于PDIA3P1水平较低的患者(图1I, 1J和1K,1L)。这些结果提示PDIA3P1在低氧条件下上调，导致胶质瘤患者预后不良。该结果预示着神经胶质瘤细胞中的PDIA3P1含量有可能作为患者预后标志物加以应用。
2.2PDIA3P1促进胶质瘤细胞在体内和体外的迁移和侵袭
为了研究PDIA3P1在胶质瘤中的生物学作用，本实施例根据TCGA-GBM数据库中来自顶部(n = 35)和底部(n = 35)的PDIA3P1水平，分析了70个样本。产生差异表达基因(DEGs)，结果显示1700个基因显著上调，250个基因显著下调(图2A)。之后，本实施例对DEGs进行富集分析，确定PDIA3P1可能调控的生物学过程。如图2B所示，高PDIA3P1水平与细胞外基质解体、细胞迁移、低氧等过程有关。此外，GSEA对70个入选样本的分析也证实，PDIA3P1的高表达与上皮-间质转化(EMT)、低氧和细胞外基质解体有关。此外，根据Verhaak构建的基因集，本实施例发现PDIA3P1上调与MES亚型呈正相关，与PN和NE签名呈负相关(图2C)。结果表明，PDIA3P1可能促进GBMs（人脑恶性胶质瘤，glioblastomas）的迁移和侵袭。因此，本实施例在U87MG、A172细胞和P3原代GBM细胞中敲除PDIA3P1，在U251、U87MG和A172细胞中过表达PDIA3P1图1C、1D)。Transwell实验表明，PDIA3P1过表达促进胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力，而PDIA3P1敲低抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力(图2D，图1E-1I)。同样，U87MG细胞中PDIA3P1水平高，在三维肿瘤椭球体侵袭实验中(图2E)，其侵袭面积更大；在创伤愈合实验中，U251细胞的迁移距离更长(图1J)。接下来,本实施例选择EMT基因相关靶点——CD44,β-catenin,N-cadherin,Vimentin和MMP14五种体外标记进行蛋白含量的测。如图2F所示，PDIA3P1上调提高了MES标志物的蛋白水平，而PDIA3P1下调抑制了上述体外标记在胶质瘤细胞中的表达(图2G)。为确定PDIA3P1在体内的功能，将荧光素酶标记的U87MG细胞稳定过表达对照序列或PDIA3P1注入裸鼠大脑。注射后10天的生物荧光成像显示，过表达U87MG细胞的PDIA3P1小鼠的肿瘤存活率明显高于对照组小鼠(图2H, 2I)。正如所料，U87MG细胞中PDIA3P1水平的升高也会缩短异种移植小鼠的总体存活时间(图2J)。为了评估体内肿瘤的性质，本实施例在注射后第10天对每组额外的5只小鼠实施安乐死。H&E染色显示PDIA3P1过表达样本肿瘤边界模糊，ECM稀疏，而对照组肿瘤边界清晰，ECM致密(图2K)。同样，IHC检测显示，与对照组相比，高PDIA3P1异种移植样本中的CD44和Vimentin水平更高(图2L, 2M)。这些结果证实PDIA3P1在体内和体外都促进胶质瘤MES的转化，其表现为肿瘤细胞迁移侵袭能力的增强。
2.3 PDIA3P1在胶质瘤中发挥ceRNA的作用，吸附miR-124-3p
本实施例首先进行FISH和亚细胞分馏，以确定PDIA3P1在胶质瘤细胞中的分布。与Sun CC等人的研究相似，结果显示PDIA3P1主要定位于U87MG和A172细胞的细胞质中(图3A、图3B)，这表明PDIA3P1可能作为一个ceRNA，在转录后水平上海绵microRNAs，调控靶基因的表达。接下来，本实施例使用在线工具Starbase预测PDIA3P1可能与之结合的潜在microRNAs。由于TCGA-GBM数据库缺乏microRNA表达谱，本实施例利用TCGA-LGG数据库对目标microRNA进行筛选。在所有统计相关的microrna中，本实施例筛选出了与ms相关的microrna，并选取了其在临床样本中表达水平最高的5个microrna，包括miR-10a、miR-124-3p、miR-130a-3p、miR-148a-3p、miR-543。采用qRT-PCR检测其在过表达或敲除U87MG和A172细胞中的表达情况。结果显示，过表达胶质瘤细胞的PDIA3P1中，只有miR-124-3p表达降低，而表达下调的PDIA3P1中胶质瘤细胞中miR-124-3p表达升高(图3C, 3D)。此外，相关分析显示miR-124-3p与PDIA3P1表达呈显著负相关(图3E)，表明miR-124-3p可能是PDIA3P1的直接靶点。接下来，FISH实验证实在常氧或低氧条件下，U87MG、A172和U251细胞中PDIA3P1与miR-124-3p呈负相关(图3F、3G)。为了进一步证实该结果，本实施例构建了包含野生型(WT)或突变型(MUT)序列的双荧光素酶报告质粒，基于PDIA3P1中假定的miR-124-3p结合位点(图3H)。正如所料，miR-124-3p过表达显著抑制转染WT质粒的HEK-293T细胞的荧光素酶活性，但这被预测的结合位点突变所消除(图3I)。总之，这表明PDIA3P1在细胞质中富集，并直接在胶质瘤细胞中海绵miR-124-3p。
2.4 MiR-124-3p在体外靶向RELA，抑制胶质瘤细胞的MES转化
Bhaskaran V及Zhang G等人的研究阐明miR-124-3p在胶质瘤中的抑瘤作用。首先，本实施例将miR-124-3p模拟物转染到U87MG和A172细胞中，观察到过表达miR-124-3p的细胞发生了明显的形态学变化。与对照组相比，细胞变平，伪足细胞缩短。此外，当miR-124-3p上调时，先前分散的胶质瘤细胞聚集并相互粘附(图4A)。Transwell实验还表明，miR-124-3p过表达抑制U87MG和A172细胞的迁移和侵袭能力，而miR-124-3p敲低促进了这些特性(图4B)。此外,CD44的蛋白质含量、β-catenin N-cadherin,Vimentin,MMP14也减少mir-124-3p overexpressing神经胶质瘤细胞和增加mir-124-3p剥夺细胞(图4C)。接下来，本实施例通过TCGA-LGG数据库，将Starbase和micro - cds预测的靶基因与高mir -124-3p表达样本中的下调基因结合起来。本实施例筛选出胶质瘤ms相关基因，然后用qRT-PCR检测潜在靶点在PDIA3P1过表达或敲除U87MG、A172细胞和PDIA3P1过表达U251细胞中的表达情况。结果表明，只有RELA、CHD2和VIM的表达出现了预期的变化(图4E-G)。接下来，本实施例在U87MG、A172和U251细胞中过表达或抑制miR-124-3p，并评估RELA、CHD2、TGFB1和VIM的表达。如图4H-I所示，miR-124-3p模拟物促进了RELA、CDH2和VIM的表达，miR-124-3p抑制剂抑制了RELA、CDH2和VIM的表达。RELA,编码NF-κB p65亚基,被称为一个上游分子诱导的神经胶质瘤MES过渡,可能作为一种新颖的目标mir-124-3p。首先，本实施例发现miR-124-3p的表达与RELA呈显著负相关。接下来，基于miR-124-3p结合位点构建包含RELA WT和MUT 3’utr的双荧光素酶报告质粒(图4L)。如图4M所示，miR-124-3p在WT质粒中抑制荧光素酶活性，但在MUT质粒中几乎没有作用，说明miR-124-3p通过直接靶向RELA抑制胶质瘤MES转化，阻碍其活性。
2.5 PDIA3P1诱导胶质瘤MES过渡通过激活NF-κB通路。
NF-κB转录程序中起着至关重要的作用在神经胶质瘤MES过渡。本实施例的研究结果证实,RELA mir-124-3p的直接目标,表明PDIA3P1可能通过激活NF-κB通路诱导胶质瘤MES过渡。图5 A和5 B所示,KEGG浓缩和GSEA分析表明NF-κB通路激活在high-PDIA3P1样本。此外，PDIA3P1的表达与RELA在胶质瘤标本中的表达呈正相关(图5C)。为了进一步证实上述研究结果,本实施例通过Western blotting检测PDIA3P1和mir-124-3p的细胞模型中NF-κBp65和磷酸化p65 (S536)的蛋白质水平。结果证实，PDIA3P1敲低或miR-124-3p过表达抑制了p65蛋白水平及其磷酸化形式，而PDIA3P1过表达或miR-124-3p抑制增加了其在胶质瘤细胞模型中的表达(图5D-F)。考虑的可能性PDIA3P1可能激活NF-κB通路,促进神经胶质瘤MES过渡通过增加RELA表达式,本实施例使用小干扰rna (siRNAs)敲除RELA在U87MG A172,U251细胞和CD44的蛋白质含量,确定β-catenin, N-cadherin,Vimentin和MMP14。正如所料,RELA敲除显著抑制NF-κB活动和中MES标记的下游蛋白质含量(图5 G)。此外，transwell实验结果显示RELA敲除确实抑制了U87MG和U251细胞的迁移和侵袭能力(图5H, 5I)。此外，肿瘤球形浸润实验表明，在RELA抑制的U87MG细胞中，浸润面积减小(图5J)。为了在体内证实上述发现，本实施例进行了IHC实验，以确定异种移植瘤样本中的蛋白水平。如图5K所示,NF-κB,p65和磷酸化p65 (S536)高PDIA3P1 overexpressing样本,表明PDIA3P1通过激活体外和体内的NF-κB通路促进神经胶质瘤MES过渡。
2.6 PDIA3P1 HIF-1α和HIF-1β异二聚体转录激活。
HIF1A是低氧条件下肿瘤存活最重要的转录因子。首先，发明人分析了HIF1A的表达水平与PDIA3P1的相关性。结果显示，GBM样品呈明显的正相关，LGG样品呈微弱但仍显著的正相关(图6A)。接下来，发明人敲除HIF1A，测定PDIA3P1和miR-124-3p在胶质瘤细胞中的表达水平。当HIF1A被抑制时，低氧培养的胶质瘤细胞中PDIA3P1的上调被逆转(图6B)。此外，miR-124-3p在HIF1A低氧处理的胶质瘤细胞中表达显著增加(图6C)。然后，用过表达HIF1A的pENTER或质粒转染U251和U87MG细胞，并在低氧条件下维持。结果显示，HIF1A过表达增加了PDIA3P1水平，miR-124-3p被抑制。此外，免疫印迹试验证实HIF1A过度激活NF-κB通路及其下游MES标记,然而这种效应抑制甚至逆转PDIA3P1 U87MG和U251细胞的抑制作用。为了研究HIF1A是否通过与启动子区HRE结合调控PDIA3P1的表达，发明人根据预测的结合位点构建了TSS上游的一个约1300碱基对(bp)区域和三个截断突变质粒(图6G)。将质粒转染HEK-293T细胞，结果显示HIF1A过表达增加了pGL3-1308/0和pGL3-1108/0转染细胞的相对荧光素酶活性，但没有提高pGL3-887/0和pGL3-631/0转染细胞的相对荧光素酶活性。此外，启动子从1308缺失到1108，荧光素酶活性没有明显下降，说明-1108到-887之间的结合区域是PDIA3P1的功能HRE。由于-1108和-887之间存在两个假定的结合位点，构建了三个缺失位点999-991 (pGL3-Del-1)、899-891 (pGL3-Del-2)和两个缺失位点(pGL3-Del-3)的质粒(图6I)。将缺失质粒与hif1a过表达质粒或对照载体共转染HEK-293细胞。结果表明，过表达pGL3-Del-1的HIF1A组和pGL3-Del-3组相对荧光素酶活性的增加均被抑制，而pGL3-Del-2组仅略有增强，但水平远低于pGL3-1108/0组(图6J)。这一结果表明，这两个位点都可能是PDIA3P1启动子上的功能HRE。为了证实这一点，进行了芯片分析。DNA片段收集从hypoxia-cultured U251细胞和免疫沉淀反应使用anti-IgG anti-HIF-1αanti-HIF-1β。存在分析显示anti-HIF-1β组有接近30倍的上调。而anti-HIF-1α组没有明显的条带在位点999-991,但位点899 – 891存在一个大约8倍上调 (图6 K),琼脂糖凝胶电泳也得到了同样的结果(图6 L),这表明HIF-1α和HIF-1β异二聚体可以直接结合PDIA3P1的启动子区域(图7)。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学齐鲁医院
<120> PDIA3P1 作为胶质瘤预后标志物的应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人 PDIA3P1
<400> 1
gcaaagaccu gaauaucgu 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人 miR-124-3p
<400> 2
ttggcattca ccgcgtgcct ta 22

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1.PDIA3P1作为胶质瘤的预后标志物在制备胶质瘤预后评估的产品中的应用，所述PDIA3P1表达含量高促进神经胶质瘤的转移。
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