WO2005050218A2 - Diagnostische, prognostische und therapeutische verfahren bei der untersuchung und therapie maligner tumoren - Google Patents

Diagnostische, prognostische und therapeutische verfahren bei der untersuchung und therapie maligner tumoren Download PDF

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Carsten Denkert
Steffen Hauptmann
Wilko Weichert
Manfred Dietel
Sören Pest
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Oligene Gmbh
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the invention relates to methods of diagnosing malignant tumors, determining the prognosis of a tumor and therapeutic intervention in malignant tumors using the human ELAV-like (ELAV: embryonic lethal abnormal vision, homologous Drosophila protein) protein HuR (Hu antigen R ; named after the index patient).
  • HuR is a cellular regulatory protein that is able to stabilize the messenger ribonucleic acid (mRNA) of different genes and thus controls the expression of different genes at a central point. These are genes that are important in terms of tumor biology, such as cyclooxygenase 2 (COX-2), the vascular endothelial growth factor (VEGF) and various cytokines and cell cycle proteins.
  • cytoplasmic expression of HuR In the tumor tissue, abnormal cytoplasmic expression of HuR is found in some of the tumors.
  • ovarian cancer e.g. the group of tumors with cytoplasmic HuR expression has a poorer prognosis in the univariate and multivariate survival analysis. Cytoplasmic expression of HuR can also be observed in other malignant tumors. The tumor prognosis can thus be estimated by determining HuR.
  • therapeutic inhibition of HuR as part of a molecular tumor therapy can be used to intervene therapeutically in various signal pathways relevant to tumor biology.
  • Ovarian cancer is the five most common malignancy in women and accounts for 4.1% of all malignancies in women. One in 70 women will develop ovarian cancer during their lifetime. Ovarian cancer is the five most common cause of death as a result of cancer in women. Despite improvements in the diagnosis and therapy of these tumors, the prognosis of ovarian cancer is still very poor, only 26% of cases are diagnosed at a stage in which the tumor is still limited to the ovary. In 53% of cases there was already a tumor spreading outside the pelvis or distant metastasis at the time of diagnosis. Ovarian cancer is treated on the one hand by surgical intervention, on the other hand by standardized chemotherapy, usually using a platinum-based chemotherapy agent.
  • malignant tumors resemble inflammatory tissue; in both cases, similar cellular signaling pathways are activated. Switching points that are important for inflammatory or stress reactions can thus also influence the biological behavior of malignant tumors (list of literatures behind the examples).
  • Hu proteins stabilize mRNAs that contain so-called adenine / uracil-rich (AU-rich) elements (ARE) in their 3 'untranslated region, which leads to an extended half-life of the mRNA and to increased protein expression.
  • AU-rich adenine / uracil-rich
  • AU-rich elements can be found in the mRNAs of cytokines, inflammation mediators and cell cycle proteins. This selectively regulates a group of proteins that are important in terms of tumor biology.
  • the inhibition of Hu proteins is therefore an interesting therapeutic alternative.
  • autoantibodies against Hu proteins are formed in a small group of tumor patients, which on the one hand inhibit tumor growth, but on the other hand also cross-react with neural structures. Agents that cannot cross the blood-brain barrier would therefore have to be used for possible therapeutic interventions.
  • the family of human ELAV-like proteins consists of four members, three of which (Homolog of drosophila neuronal protein 1 (HelNl); Hu Antigen B (HuB); Hu Antigen C (HuC) and Hu Antigen D (HuD) vl ) are proposed all expressed in nerve tissue, whereas the fourth protein HuR is expressed in many cell types.
  • HuR Homolog of drosophila neuronal protein 1 (HelNl); Hu Antigen B (HuB); Hu Antigen C (HuC) and Hu Antigen D (HuD) vl ) are proposed all expressed in nerve tissue, whereas the fourth protein HuR is expressed in many cell types.
  • the analysis of tumor tissue shows an abnormal cytoplasmic overexpression of HuR in some of the tumors. These tumors are associated with a poorer survival prognosis. This means that the prognosis can be estimated by determining HuR; on the other hand, therapeutic inhibition strategies can improve the prognosis.
  • Basics of the invention Basics
  • the invention is based on the object of making tumor diseases more recognizable and treatable and of putting a test set in the hands of the doctor, with which the further development can be better predicted, the tumor diagnosis easier and the further development of the tumor process better can be influenced.
  • This object is achieved by the provision of a method for the diagnosis and therapy of tumor diseases by determining abnormal, tumor-specific proteins, in particular by analyzing the expression pattern of the human ELAV-like protein HuR in the tumor tissue.
  • the solution according to the invention makes it possible to estimate the prognosis of the tumor disease, to provide the indication for an extended therapy and to provide a method for molecular tumor therapy by inhibiting the HuR protein.
  • the main features of the invention are in a method for diagnosing malignant tumors, for determining the prognosis of a tumor and for therapeutic intervention in malignant tumors using the human ELAV-like protein HuR.
  • Protein HuR is used as a molecular prognostic marker or as a target for ovarian carcinomas, colon carcinomas, prostate carcinomas, breast carcinomas, pancreatic carcinomas or endometrial carcinomas.
  • This invention thus relates to diagnostic methods for determining the prognosis of malignant tumors as well as therapeutic applications by inhibiting specific tumor biologically relevant target proteins.
  • this invention relates to the human ELAV-like protein HuR, the determination of its expression in tumor tissue and a therapeutic inhibition of HuR.
  • the invention relates to the prognosis of malignant tumors, in particular of ovarian carcinomas.
  • a new method for estimating the prognosis of malignant tumors has been found with the immunohistological detection of the mRNA-stabilizing protein HuR.
  • the cytoplasmic expression of HuR in carcinomas in the multivariate survival analysis has surprisingly proven to be an independent prognostic factor. It is the first description of the mRNA regulatory protein HuR as a prognostic factor in malignant tumors.
  • the HuR protein may play a central role in controlling tumor growth, angiogenesis and tumor-associated inflammation. It is an interesting target protein for a potential therapeutic intervention.
  • Another feature of the invention is that an analysis of the expression pattern of the human ELAV-like protein HuR is carried out in tumor tissues.
  • the expressions of HuR in the tumor tissue are determined by immunohistological staining and analyzed separately for cytoplasmic and nuclear staining using an immunoreactive score.
  • the indication for therapy with COX-2 inhibitors or with angiogenesis inhibitors is determined by determining the expression and cellular distribution of the protein HuR in the tumor tissue.
  • a tumor is treated by inhibiting the HuR protein. It can also be done in combination with surgical interventions, standardized chemotherapy or chemotherapy using chemotherapy agents containing plat or as molecular tumor therapy in combination with pharmacological substances, with transfection techniques or using silencing RNAs.
  • the invention is also suitable for carrying out a therapy directed against HuR in combination with a COX-2 inhibitor or an angiogenesis inhibitor.
  • the pharmacological substances used for molecular tumor therapy to reduce cross-reactions with neural structures should be specific for the HuR isoform or not common to the CNS.
  • HuR human ELAV-like protein
  • it is suitable as a molecular prognostic marker and as a target for carcinomas.
  • the HuR protein As a prognostic factor in malignant tumors, this is the first description of the cytoplasmic expression of this mRNA regulatory protein in carcinomas and the first description as an independent prognostic factor in the multivariate survival analysis.
  • the use according to the invention is furthermore that protein HuR in the determination of cytoplasmic expression in carcinomas and in multivariate survival analysis as an independent prognostic factor for determining the therapeutic indication for malignant tumors - for determining therapeutic indications by evaluating HuR in tumor cells for determining therapeutic indications is used for therapy with COX-2 inhibitors or for determining therapeutic indications for therapy with angiogenesis inhibitors.
  • Another inventive feature of the invention is the use of HuR inhibitors for molecular tumor therapies. Compared to the known state
  • HuR e.g. brain tumors
  • HuR is prognostically relevant and therefore possibly also causally involved in tumor progression. Therefore, one should determine HuR in the tumor and then adapt the therapy if necessary.
  • kit for diagnosing malignant tumors and for determining the prognosis of a tumor using the human ELAV-like protein HuR.
  • the kit according to the invention consists in part of buffered formaldehyde, paraffin, immunohistological staining reagents and a primary antibody directed against HuR and, on the other hand, tissue samples of the tumor to be examined. After the sample has been embedded and stained, it is assessed under a microscope.
  • the human ELAV-like protein HuR is a key regulatory protein that controls the expression of various tumor-biologically relevant target proteins, for example cyclooxygenase 2 (COX-2) or vascular endothelial growth Factor (VEGF) and inhibitors of these target proteins are suitable for molecular tumor therapy.
  • COX-2 cyclooxygenase 2
  • VEGF vascular endothelial growth Factor
  • the expression of the HuR protein in the tumor tissue can be determined in order to assess in which patients such molecular therapeutic agents are to be used.
  • HuR can, as described in the examples, be determined by immunohistological methods.
  • other methods such as, for example, the reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) V , the in-situ hybridization v "and the Western blot vl " for determining HuR are also possible.
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • tissue samples are taken from the tumor, which are fixed in 4% buffered formaldehyde and embedded in paraffin. Suitable sections of the tumor are identified by standard immunohistological staining. Immunohistological stains are then prepared from these using a monoclonal primary antibody directed against HuR. 1X
  • the percentage of positive cells and the staining intensity of the tumor cells are determined on the one hand according to a defined score. This score is determined on the one hand for the nuclear expression of the protein HuR which is localized in the cell nucleus. Secondly, the immunoreactive score is also determined for the cytoplasmic expression of HuR, which occurs in some of the cancer cells. Together with other tumor parameters, the immunoreactive score provides information about the prognosis; an increased cytoplasmic HuR expression is associated with a poorer prognosis. Through this In a patient group, the method can be used to selectively identify those patients who have a particularly poor prognosis.
  • HuR as a prognostic marker is particularly useful for malignant tumors, since HuR is ubiquitously expressed and an increased cytoplasmic expression can be found in many different tumors. For this reason, this method is suitable, for example, in addition to ovarian cancer, for the assessment of the prognosis of colon cancer, prostate cancer, breast cancer, pancreatic cancer or endometrial cancer.
  • the protein HuR is a key regulatory protein that controls the expression of various tumor biologically relevant target proteins. 1 "HuR is particularly well suited for immunohistological determination, since the physiological nuclear staining present in many cells represents an internal positive control which can be evaluated together with the pathological, cytoplasmic staining. Cyclooxygenase 2 is one of the proteins that are regulated by HuR and relevant to tumor biology (COX-2). COX-2 inhibitors represent a possible form of molecular tumor therapy.x So far it is still unclear which molecular factors the indication for COX-2 therapy should be based on -2 Even in tumor tissue, the determination of the COX-2-regulating protein HuR described in this invention also represents an interesting option for indicating therapy with COX inhibitors.
  • a second tumor-biologically relevant target protein of HuR is the vascular endothelial growth factor (VEGF ) The investigation of the VEGF regulatory protein HuR could be a Define a possible indication for therapy with angiogenesis inhibitors.
  • VEGF vascular endotheli
  • a determination of HuR in the tumor tissue can be used to determine the therapeutic indication.
  • the prognostically relevant tumor biological function of HuR makes it an interesting target for molecular tumor therapies.
  • Pharmacological substances zen or by transfection techniques, including using silencing RNAs xr the expression of HuR in the tumor tissue are inhibited.
  • Such substances should either be specific for the HuR isoform or should not be common to the central nervous system (CNS) in order to minimize cross-reactions with neural structures.
  • CNS central nervous system
  • These therapeutic options are particularly suitable for ovarian cancer, but also for other tumors, for example prostate cancer, breast cancer, colon cancer, pancreatic cancer or endometrial cancer.
  • anti-HuR therapy can be used in addition to, for example, a COX-2 inhibitor or standard chemotherapy.
  • RNAeasy Kit (Qiagen, Hilden, Germany) prepared and converted into DNA by means of reverse transcription.
  • the conditions for the PCR cycles HuR / HuB / HuC were: 30 cycles for denaturation, annealing and extension (95 ° C for 60 seconds, 55 ° C for 60 seconds, and 72 ° C for 60 seconds). An annealing temperature of 60 ° C was used for HuD.
  • the primers were human HuR-sense primers:
  • the immunohistochemical staining was carried out according to standard procedures - as already described for COX-2.11.
  • monoclonal anti-human HuR antibodies (3A2, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 1: 1000) were used and the antigen unmasking in citrate buffer was carried out by heating in a pressure cooker for 5 minutes.
  • the intensity of the nuclear and cytoplasmic HuR immunostaining in tumor cells was independently evaluated by two pathologists (W.W. and CD.), Who without knowledge of the patient's results semi-quantitatively rated these values as HuR negative, weak, moderate or strong.
  • the cases with a negative or weak expression of HuR were grouped together (HuR-negative), while the cases with moderate to strong expression were assigned to a HuR-positive group. The following statistical analyzes were carried out by comparing positive and negative cases.
  • Table 1 shows the univariate survival analysis (Kaplan-Meier) of selected subgroups of patients according to the cytoplasmic HuR expression ( Figure 5) progression-free survival overall survival characteristic No. d. Avg. Uber- Log No. No. d. Avg. About log d. Experience rank d. Life Rank Faleign. (Months iSE Faleign. (Months iSE les) les) Serous carcinomas 0.03 0.009 Cyt. HuR negative 15 8 26.1 ⁇ 5.3 20 7 not reached Cyt. HuR positive 13 10 17.6 ⁇ 4.7 22 17 34.6 ⁇ 4.1 Figo stage III 0.04 0.007 Cyt. HuR negative 18 9 27.4 ⁇ 5.1 26 9 not reached Cyt.
  • HuR positive 14 11 17.6 ⁇ 4.6 24 18 34.6 ⁇ 3.9 G2-3 tumors 0.06 0.04 Cyt. HuR negative 27 13 27.4 ⁇ 4.0 32 13 51.4 Cyt. HuR positive 19 15 18.3 ⁇ 5.9 32 23 34.6 ⁇ 4.1 Age at surgery (y) 0.01 0.02 ⁇ 60 cyt. HuR negative 21 8 not reached 27 6 not reached Cyt. HuR positive 13 11 21.3 ⁇ 7.0 20 12 41.5 ⁇ 6.2 Age at surgery (y) 0.93 0.29> 60 cyt. HuR negative 1 1 5 27.4 19 10 47.5 ⁇ 17.8 cyt. HuR positive 8 4 18.3 ⁇ 0.8 17 13 27.7 ⁇ 1 1.0
  • Table 2 shows the survival analysis (regression model according to Cox) for the overall survival of 83 patients with invasive ovarian cancer.
  • Relative 95% CI of p-value risk RR (RR) Cytoplasmic HuR expression 0.006 negative 1.0 - - positive 2.62 1.32 -5.19 0.006 Histological type 0.32 Serous / non-serous 1.0 - - Undifferentiated 1.51 0.67-3.41 0.32
  • FIGO stage O.0005 I 1.0 - - ⁇ / in 1.42 0.49-4.16 0.52 IV 23.33 5.51-98.76 O.0005 Grade (Silverberg) 0.098 Gl 1.0 - - G2-G3 2.39 0.85-6.72 0.098 Age 0.007 ⁇ 60 y 1.0 - -> 60 y 2.41 1.27-4.55 0.007
  • RR p-value risk
  • FIG. 1 Expression of HuR mRNA in ovarian cancer cell lines (PCR)
  • HuR protein HuR protein (Western blot). In OVCAR-3 cells, HuR is predominantly expressed in the cell nucleus (confocal laser scan microscopy)
  • FIG. 1 Expression of the HuR protein in 8 ovarian carcinomas and a borderline tumor
  • Serous ovarian carcinoma grade 1 Serous ovarian carcinoma grade 1; 2: Serous borderline tumor; 3: Serous ovarian carcinoma grade 1; 4: Grade 2 endometrioid ovarian cancer; 5: Grade 3 serous ovarian cancer; 6: Grade 3 Serous Ovarian Cancer; 7: Serous ovarian cancer grade 2; 8: Grade 1 serous ovarian cancer; 9: Serous ovarian carcinoma grade 2
  • FIG. 3 Immunohistochemistry: HuR expression in primary human ovarian cancer A: Nuclear expression in a serous ovarian cancer, grade 1;
  • E, F Strong expression of COX-2 (E) in tumor tissue, which is completely inhibited by preincubation with a COX-2 peptide (F)
  • Figure 5 Univariate survival analysis separately for cytoplasmic or nuclear HuR expression.
  • the cytoplasmic expression of HuR is a prognostic factor in the subgroup of patients with advanced ovarian cancer (FIGO stage III, FIGO: Federation Internationale de Gynecologie et d 'Obstetrique) (E, F) and in the group of patients with serous ovarian cancer ( G, H) for progression-free survival (E, G) or overall survival (F, H).
  • HuR a RNA stability factor
  • HuR a RNA stability factor
  • HuR a RNA stability factor
  • HuR is expressed in mahgnant brain tumors and binds to Adenine- and uridine- rieh elements within the 3'untranslated regions of cytokine and angiogenic factor mRNAs. Cancer Research, 61, 2154-2161.)
  • Cyclooxygenase 2 a molecular target for cancer prevention and treatment.
  • RNAi-Mediated HuR depletion leads to the inhibition of muscle cell differentiation 9. J Biol Chem. 2003 Aug 27 [Epub ahead ofprint].

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Abstract

Die Erfindung betrifft Methoden der Diagnostik maligner Tumoren, der Bestimmung der Prognose eines Tumors sowie der therapeutischen Intervention bei malignen Tumoren unter Nutzung des humanen ELAV -ähnlichen Proteins HuR. Im Tumorgewebe findet sich abnorme zytoplasmatische Expression von HuR in einem Teil der Tumoren. Für das Ovarialkarzinom z.B. hat die Gruppe der Tumoren mit zytoplasmatischer Hur-Expression eine schlechtere Prognose in der univariaten und multivariaten Überlebensanalyse. Eine zytoplasmatische Expression von HuR ist auch in anderen malignen Tumoren zu beobachten, so dass Protein HuR als molekularer Prognosemarker oder als Target für Ovarialkarzinome, Kolonkarzinome, Prostatakarzinome, Mammakarzinome, Pankreaskarzinome oder Endometriumkarzinome eingesetzt werden kann. Damit lässt sich über die Bestimmung von HuR die Tumorprognose abschätzen. Des weiteren kann durch therapeutische Inhibition von HuR im Rahmen einer molekularen Tumortherapie in verschiedene tumorbiologisch relevante Signalwege therapeutisch eingegriffen werden.

Description

Diagnostische, prognostische und therapeutische Verfahren bei der Untersuchung und Therapie maligner Tumoren
Beschreibung
[0001] Die Erfindung betrifft Methoden der Diagnostik maligner Tumoren, der Bestimmung der Prognose eines Tumors sowie der therapeutischen Intervention bei malignen Tumoren unter Nutzung des humanen ELAV-ähnlichen (ELAV: embryonic lethal abnormal vision, homologes Drosophila Protein) Proteins HuR (Hu Antigen R; benannt nach dem Indexpatien- ten). HuR ist ein zelluläres Regulatorprotein, das die messenger Ribonukleinsäure (mRNA) verschiedener Gene zu stabilisieren vermag und damit an zentraler Stelle die Expression verschiedener Gene steuert. Es handelt sich hier um Gene, die tumorbiologisch bedeutsam sind, wie zum Beispiel die Cyclooxygenase 2 (COX-2), den Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) sowie verschiedene Zytokine und Zellzyklusproteine. Im Tumorgewebe findet sich abnorme zytoplasmatische Expression von HuR in einem Teil der Tumoren. Für das Ovarial- karzinom z.B. hat die Gruppe der Tumoren mit zytoplasmatischer HuR-Expression eine schlechtere Prognose in der univariaten und multivariaten Uberlebensanalyse. Eine zytoplasmatische Expression von HuR ist auch in anderen malignen Tumoren zu beobachten. Damit kann über die Bestimmung von HuR die Tumorprognose abgeschätzt werden. Des weiteren kann durch therapeutische Inhibition von HuR im Rahmen einer molekularen Tumortherapie in verschiedene tumorbiologisch relevante Signalwege therapeutisch eingegriffen werden.
Hintergrund
[0002] Das Ovarialkarzinom ist die fünf-häufigste maligne Erkrankung der Frau und macht 4,1% aller malignen Erkrankungen von Frauen aus. Eine von 70 Frauen ericrankt im Laufe ihres Lebens an einem Ovarialkarzinom. Das Ovarialkarzinom ist die fünf-häufigste Todesursache in Folge einer Krebserkι-ankung bei Frauen. Trotz Verbesserungen bei Diagnostik und Therapie dieser Tumoren ist die Prognose des Ovarialkarzinoms noch immer sehr schlecht, es werden nur 26% der Fälle in einem Stadium diagnostiziert, in dem der Tumor noch auf das Ovar beschränkt ist. In 53% der Fälle liegt zum Zeitpunkt der Diagnose bereits eine Tumorausbreitung außerhalb des Beckens oder eine Fernmetastasierung vor. Die Therapie des Ovarialkarzinoms erfolgt zum einen durch chirurgische Intervention, zum anderen durch eine standardisierte Chemotherapie, meist unter Verwendung eines platinhaltigen Chemotherapeu- tikums.1 [0003] Wesentliche weitere Therapieoptionen stehen derzeit noch nicht zur Verfügung, insbesondere fehlt derzeit noch eine auf molekulare Tumorparameter ausgerichtete Therapie, mit der eine individualisierte Tumortherapie möglich wäre. Die Prognose des Ovarialkarzinoms wird bestimmt von der Tumorausbreitung, der Tumordifferenzierung sowie dem intraoperati- ven Tumorrest. Für die große Gruppe der Patientinnen mit peritonealem, disseminiertem Tumor bzw. Fernmetastasen stehen bisher keine weiteren prognostischen Marker zur Verfügung.
Tumorbiologische Relevanz von Entzündungsparametern sowie Stressreaktionen
[0004] In vielerlei Hinsicht ähneln maligne Tumoren einem entzündlich veränderten Gewebe, in beiden Fällen werden ähnliche zelluläre Signalwege aktiviert. Damit können Schaltstellen, die für Entzündungsreaktion oder Stressreaktion wichtig sind, auch das biologische Verhalten maligner Tumoren beeinflussen (Literataverzeichnis hinter den Beispielen)."'1" [0005] Die Familie der ELAV-ähnlichen Proteine, der Hu-Proteine (benannt nach dem Indexpatienten, 1V'V), reguliert die posttranskriptionale Stabilisierung von mRNAs (Abkürzungsver- zeichnis hinter den Beispielen). Dabei stabilisieren Hu-Proteine mRNAs, die sogenannte A- denin/Uracil-reiche (AU-reiche) Elemente (ARE) in ihrer 3'untranslatierten Region enthalten, dies führt zu einer verlängerten Halbwertzeit der mRNA und zu einer vermehrten Proteinexpression. AU-reiche Elemente finden sich in den mRNAs von Zytokinen, Entzündungsmediatoren sowie von Zellzyklusproteinen. Damit wird hier selektiv eine Gruppe von Proteinen reguliert, die tumorbiologisch bedeutsam sind. Die Inhibition von Hu-Proteinen stellt daher eine interessante therapeutische Alternative dar. Im Rahmen von paraneoplastischen Syndro- men werden bei einer kleinen Gruppe von Tumorpatienten Autoantikörper gegen Hu-Proteine gebildet, die einerseits das Tumorwachstum inhibieren, andererseits jedoch auch mit neuralen Strukturen kreuzreagieren. Für mögliche therapeutische Interventionen wären daher Agenzien zu nutzen, die die Blut-Hirnschranke nicht überwinden können. Die Familie der humanen ELAV-ähnlichen Proteine besteht aus vier Mitgliedern, drei davon (Homolog of drosophila neuronal protein 1 (HelNl); Hu Antigen B (HuB); Hu Antigen C (HuC) und Hu Antigen D (HuD)vl) werden vor allem im Nervengewebe exprimiert, wohingegen das vierte Protein HuR in vielen Zelltypen exprimiert wird. Die Analyse von Tumorgewebe zeigt eine abnorme zy- toplasmatische Überexpression von HuR in einem Teil der Tumoren. Diese Tumoren sind mit einer schlechteren Überlebensprognose verbunden. Damit lässt sich durch die Bestimmung von HuR die Prognose abschätzen, andererseits können therapeutische Inhibitionsstrategien die Prognose verbessern. Grundzüge der Erfindung
[0006] Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, Tumorerlcrankungen besser erkennbar und behandelbar zu machen und der Praxis ein Testbesteck in die Hand zu geben, mit dem sich die weitere Entwicklung besser vorhersagen, die Tumordiagnose erleichtern und die wei- tere Entwicklung des Tumorgeschehens besser beeinflussen lässt.
[0007] Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen durch Bestimmung abnormer, tumorspezifischer Proteine, insbesondere durch eine Analyse des Expressionsmusters des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR im Tumorgewebe gelöst. Die erfindungsgemäße Lösung macht es möglich, die Prog- nose der Tumorerkrankung abzuschätzen, die Indikation für eine erweiterte Therapie zu stellen und eine Methode zur molekularen Tumortherapie durch Inhibition des Proteins HuR zu liefern.
[0008] Die Hauptmerkmale der Erfindung liegen in einem Verfahren zur Diagnostik maligner Tumoren, zur Bestimmung der Prognose eines Tumors sowie zur therapeutischen Intervention bei malignen Tumoren unter Nutzung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR. Dazu wird Protein HuR als molekularer Prognosemarker oder als Target für Ovarialkarzinome, Kolonkarzinome, Prostatakarzinome, Mammakarzinome, Pankreaskarzinome oder Endometriumkarzinome eingesetzt wird. [0009] Diese Erfindung betrifft damit diagnostische Methoden zur Bestimmung der Prognose maligner Tumoren sowie therapeutische Anwendungen durch Inhibition spezifischer tumorbiologisch relevanter Zielproteine. Im einzelnen betrifft diese Erfindung das humane ELAV- ähnliche Protein HuR, die Bestimmung seiner Expression im Tumorgewebe sowie eine therapeutische Inhibition von HuR. Die Erfindung betrifft die Prognose maligner Tumoren, insbesondere von Ovarialkarzinomen. [0010] Erfindungsgemäß ist mit dem immunhistologischen Nachweis des mRNA- stabilisierenden Proteins HuR eine neue Methode zur Abschätzung der Prognose von malignen Tumoren gefunden worden. Dabei hat sich die zytoplasmatische Expression von HuR in Karzinomen in der multivariaten Uberlebensanalyse überraschenderweise als ein unabhängiger Prognosefaktor erwiesen. Es handelt sich um die Erstbeschreibung des mRNA- regulatorischen Proteins HuR als Prognosefaktor in malignen Tumoren. Dem Protein HuR kommt möglicherweise eine zentrale Rolle bei der Steuerung von Tumorwachstum, Angioge- nese und der tumor-assoziierten Entzündung zu. Damit stellt es ein interessantes Zielprotein für eine potentielle therapeutische Intervention dar. [0011] Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht darin, dass eine Analyse der Expressionsmuster des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR in Tumorgeweben vorgenommen wird. Dazu werden durch immunhistologische Färbungen die Expressionen von HuR im Tumorgewebe bestimmt und mittels eines immunoreaktiven Scores separat für die zytoplasmati- sehe und die nukleare Färbung analysiert.
[0012] Ein weiteres Merkmal der Erfindung liegt darin, dass zur therapeutischen Intervention bei malignen Tumoren eine Festlegung der Indikation zur Therapie mit COX-2-Inhibitoren oder mit Angiogeneseinhibitoren durch Bestimmung der Expression und zellulären Verteilung des Proteins HuR im Tumorgewebe vorgenommen wird. Die Therapie eines Tumors erfolgt durch Inhibition des Proteins HuR. Sie kann auch in Kombination mit chirurgischen Interventionen, standardisierten Chemotherapien oder Chemotherapien unter Verwendung plat haltiger Chemotherapeutika erfolgen oder als molekulare Tumor-Therapie in Kombination mit pharmakologischen Substanzen, mit Transfektionstechniken oder unter Verwendung von Silencing-RNAs. Die Erfindung eignet sich auch dazu, eine gegen HuR gerichtete The- rapie in Kombination mit einem COX-2-Inhibitor oder einem Angiogeneseinhibitor vorzunehmen. Die für eine molekulare Tumor-Therapie eingesetzten pharmakologischen Substanzen zur Herabsetzung von Kreuzreaktionen mit neuralen Strukturen sollen erfindungsgemäß spezifisch für die Isoform HuR oder nicht ZNS-gängig sein.
[0013] Ein weiteres Merkmal der Erfindung liegt darin, dass für das humane ELAV-ähnliche Protein HuR ein neuer Verwendungszweck gefunden wurde. Es eignet sich erfindungsgemäß als molekularer Prognosemarker und als Target für Karzinome. Bezüglich der Verwendung des Proteins HuR als Prognosefaktor in malignen Tumoren handelt sich um die Erstbeschreibung der zytoplasmatischen Expression dieses mRNA-regulatorischen Proteins in Karzinomen und um die Erstbeschreibung als unabhängiger Prognosefaktor bei der multivariaten Ü- berlebensanalyse. Die erfindungsgemäße Verwendung liegt des weiteren darin, dass Protein HuR bei der Bestimmung der zytoplasmatischen Expression in Karzinomen und bei der multivariaten Uberlebensanalyse als ein unabhängiger Prognosefaktor zur Bestimmung der Therapieindikation bei malignen Tumoren - zur Bestimmung von Therapieindikationen durch Evaluation von HuR in Tumorzellen zur Bestimmung von Therapieindikationen für die Therapie mit COX-2-Inhibitoren oder zur Bestimmung von Therapieindikationen für die Therapie mit Angiogeneseinhibitoren eingesetzt wird. [0014] Ein weiteres erfinderisches Merkmal der Erfindung besteht in der Verwendung von HuR-Inhibitoren für molekulare Tumortherapien. [0015] Gegenüber dem bekannten Stand
- HuR reguliert die COX-2 und VEGF (bisher nur in Modellzelllinien, nicht in Patienten- tumoren gezeigt) und
- einige Tumoren exprimieren HuR (z.B. Gehirntumoren) wird nunmehr als neu und als erfinderisch beansprucht die Unterscheidung zwischen zytoplasmatischer und nuklearer Expression im Tumorgewebe - die Betonung, dass die zytoplasmatische Färbung entscheidend ist und alle Zusammenhänge zwischen HuR-Expression und schlechterer Prognose.
[0016] Die weiteren Ansprüche der Erfindung leiten sich aus der Prognoserelevanz ab: HuR ist prognostisch relevant und daher womöglich auch kausal an der Tumorprogression betei- ligt. Deshalb sollte man HuR im Tumor bestimmen und dann ggf. die Therapie adaptieren. [0017] Ein weiteres Merkmal der Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Testbestecks (Kits) zur Diagnostik maligner Tumoren und zur Bestimmung der Prognose eines Tumors unter Nutzung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR. Das erfindungsgemäße Kit besteht in einem Teil aus gepuffertem Formaldehyd, Paraffin, immunhistologischen Färberea- genzien und einem gegen HuR gerichteten Primärantikörper und zum anderen aus Gewebe- proben des zu untersuchenden Tumors. Nach Einbettung der Probe und Anfärbung erfolgt die Beurteilung unter dem Mikroskop.
[0018] Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht darin, dass das humane ELAV-ähnliche Protein HuR ein Schlüsselregulatorprotein darstellt, das die Expression verschiedener tumor- biologisch relevanter Zielproteine steuert, z.B. der Cyclooxygenase 2 (COX-2) oder des Vas- cular Endothelial Growth Factor (VEGF) und Inhibitoren dieser Zielproteine sich zur molekularen Tumortherapie eignen. Zur Beurteilung, bei welchen Patienten derartige molekulare Therapeutika eingesetzt werden sollen, kann die Expression des Proteins HuR im Tumorgewebe bestimmt werden. [0019] Die Merlcmale der Erfindung gehen aus den Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Diese Merkmale setzen sich aus bekannten Elementen - dem Protein HuR, Tumorgeweben, COX-2- Inl ibitoren oder Angiogeneseinhibitoren - und neuen Elementen - der Unterscheidung zwi- sehen zytoplasmatischer und nuklearer Expression im Tumorgewebe, der Betonung, dass die zytoplasmatische Färbung entscheidend ist sowie alle Zusammenhänge zwischen HuR- Expression und schlechterer Tumor-Prognose — die in ihrer Kombination zu den erfindungsgemäßen Verfahren führen und eine neue Diagnostik für maligne Tumoren, die Bestimmung der Prognose eines Tumors sowie eine therapeutische Intervention bei malignen Tumoren unter Nutzung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR ermöglichen.
Zu den Methoden zur Bestimmung von HuR:
[0020] HuR kann, wie in den Beispielen beschrieben, durch immunhistologische Methoden bestimmt werden. Daneben kommen auch andere Methoden, wie zum Beispiel die reverse- Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)V, die in-situ Hybridisierungv" sowie der Western-Blotvl" zur Bestimmung von HuR in Frage.
[0021] Die Erfindung soll anhand von Ausfuhrungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1 : Bestimmung von HuR im Tumorgewebe
[0022] Hierzu werden Gewebeproben aus dem Tumor entnommen, die in 4% gepuffertem Formaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet werden. Durch immunhistologische Standardfärbungen werden geeignete Abschnitte des Tumors identifiziert. Von diesen werden dann immunhistologische Färbungen unter Verwendung eines gegen HuR gerichteten monoklona- len Primärantikörpers angefertigt.1X
[0023] Diese Färbungen können unter dem Mikroskop beurteilt werden. Hierbei wird nach einem definierten Score zum einen der Prozentsatz positiver Zellen, zum anderen auch die Färbeintensität der Tumorzellen bestimmt. Dieser Score wird zum einen für die nukleare, im Zellkern lokalisierte Expression des Proteins HuR bestimmt. Zum zweiten wird der immunre- aktive Score auch für die zytoplasmatische Expression von HuR, die in einem Teil der Krebszellen auftritt, bestimmt. Der immunoreaktive Score gibt in Zusammenschau mit anderen Tumorparametern eine Auskunft über die Prognose, hierbei ist eine erhöhte zytoplasmatische HuR-Expression in Zusammenschau mit einer schlechteren Prognose assoziiert. Durch diese Methode können in einer Patientengruppe selektiv die Patienten identifiziert werden, die eine besonders schlechte Prognose aufweisen.
[0024] Damit kann für diese Patienten eine aggressivere Tumortherapie erfolgen. Die Bestimmung von HuR als Prognosemarker ist besonders nützlich für maligne Tumoren, da HuR ubiqitär exprimiert wird und in vielen verschiedenen Tumoren eine erhöhte zytoplasmatische Expression zu finden ist. Daher ist dieses Verfahren zum Beispiel neben Ovarialkarzinomen auch für die Abschätzung der Prognose von Kolonkarzinomen, Prostatakarzinomen, Mamma- karzinomen, Pankreaskarzinomen oder Endometriumkarzinomen geeignet.
Beispiel 2:
Bestimmung von Therapieindikationen durch Evaluation von HuR in den Tumorzellen
[0025] Das Protein HuR stellt ein Schlüsselregulatorprotein dar, das die Expression verschiedener tumorbiologisch-relevanter Zielproteine steuert.1" HuR ist besonders gut geeignet für eine immunhistologische Bestimmung, da die in vielen Zellen vorhandene physiologische nukleare Färbung eine interne Positivkontrolle darstellt, die zusammen mit der pathologischen, zytoplasmatischen Färbung evaluiert werden kann. Zu den durch HuR regulierten tumorbiologisch relevanten Proteinen gehört die Cyclooxygenase 2 (COX-2). COX-2- Inhibitoren stellen eine mögliche Form der molekularen Tumortherapie dar.x Bisher unklar ist noch, über welche molekularen Faktoren die Indikation für eine COX-2-Therapie ge- stellt werden soll. Neben der Bestimmung der COX-2 selbst im Tumorgewebe stellt auch die in dieser Erfindung beschriebene Bestimmung des COX-2-regulierenden Proteins HuR eine interessante Option zur Indikationsstellung für eine Therapie mit COX-Inhibitoren dar. Ein zweites tumorbiologisch relevantes Zielprotein von HuR ist der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). Die Untersuchung des VEGF regulatorischen Proteins HuR könnte eine mög- liehe Indikation für eine Therapie mit Angiogenese-Inhibitoren definieren.
[0026] Auch bei anderen für die Tumortherapie zukünftig zu entwickelnden Substanzen, deren Wirkmechanismus direkt über die Inhibition von HuR läuft, kann zur Bestimmung der Therapieindikation eine Bestimmung von HuR im Tumorgewebe verwendet werden.
Beispiel 3:
Therapiestrategien
[0027] Die prognoserelevante tumorbiologische Funktion von HuR macht es zu einem interessanten Ziel für molekulare Tumortherapien. Dabei kann durch pharmakologische Substan- zen oder durch Transfektionstechniken, unter anderem unter Verwendung von silencing- RNAs xr, die Expression von HuR im Tumorgewebe inhibiert werden. Derartige Substanzen sollten entweder spezifisch für die Isoform HuR sein, oder nicht Zentralnervensystem (ZNS)- gängig sein, um Kreuzreaktionen mit neuralen Strukturen zu minimieren. Diese therapeuti- sehen Optionen sind insbesondere für das Ovarialkarzinom, aber auch für andere Tumoren, zum Beispiel Prostatakarzinome, Mammakarzinome, Kolonkarzinome, Pankreaskarzinome oder Endometriumkarzinome geeignet. Des weiteren lässt sich eine gegen HuR gerichtete Therapie in Ergänzung zum Beispiel mit einem COX-2-Inhibitor oder einer Standardchemotherapie verwenden.
Beispiel 4:
Bestimmung mittels Polymerasekettenreaktion (PCR)
[0028] Subkonfluente Ovarialkarzinom-Zellen wurden geerntet, die gesamte RNA mit
RNAeasy Kit (Qiagen, Hilden, Germany) präpariert und mittels Reverser Transkription in DNA überführt. Die Bedingungen füi- die PCR-Zyklen HuR/HuB/HuC waren: 30 Zyklen für die Denaturierung, Annealing und Extension (95°C für 60 Sekunden, 55°C für 60 Sekunden, and 72 °C für 60 Sekunden). Füi- HuD wurde eine Annealing-Temperatur von 60°C verwendet. Die Primer waren humane HuR-sense Primer:
5'-ATACAATGTCTAATGGTTATGAAGACC-3' und antisense 5 '-GTTATTTGTGGGACTTG-3 ' (generiert ein 986bp Band)4, human HuB sense
5'-GTATCCAGGACCGCTAGCT-3' und antisense
5 '-TATTAATTCCAGCCAAACTGG-3 '(generiert ein 127bp Band), human HuC sense
5'-AACAACCCAAGTCAGAAGAC-3 ' und antisense
5'-TTGTACACGAAGATGCACCA-3'( generiert ein 235bp Band)16, human HuD sense 5 '-CTGCTCTCCCAGCTCTA-3 ' und antisense
5'-AGGCTTGTCATTCCATC-3'( generiert ein 196bp Band) , GAPDH sense
5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' und antisense
5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (generiert ein 452bp Band).
Beispiel 5:
Bestimmung mittels konfokaler Mikroskopie
[0029] Konfokale Mikroskopie. Die immunohistochemische Färbung wurde entsprechend den Standard-Prozeduren dui'chgeführt. Dazu wurden die Zellen wurden in Methanol für 10 Minuten bei 20°C fixiert. Die Objektträger wurden in PBS/10% BSA/1% normalem Ziegenserum für 30 Minuten bei 21°C blockiert und für 90 Minuten bei 21°C mit dem Maus- monoklonalen anti-HuR- Antikörper inlcubiert, 1 :100 verdünnt in PBS/1% BSA und anschließend durch Inkubation mit einem Cy3 -konjugierten Anti-Maus- Antikörper (Dianova, Ham- bürg, Germany), 1:200 verdünnt in PBS/1% BSA. Die Zellkerne wurden mit DAPI (1 : 1000) gefärbt. Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie wurde unter Verwendung eines Leica- Konfokalen-Mikroskops durchgeführt.
Beispiel 6: Bestimmung mittels Immunhistologie
[0030] Die immunohistochemische Färbung wurde entsprechend Standard-Prozeduren - wie bereits für COX-2.11 beschrieben - durchgeführt. Für die HύR-Immunohistochemie wurden monoklonale Anti-human HuR-Antiköiper (3A2, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 1 :1000) benutzt und die Antigen-Demaskierung in Zitrat-Puffer durch 5-minütiges Erhitzen in einem Schnellkochtopf vorgenommen. Die Intensität der Kern- und zytoplasmischen HuR- Immunfärbung in Tumorzellen wurde unabhängig durch zwei Pathologen (W.W. und CD.) evaluiert, die ohne Kenntnis des Patientenergebnisses diese Werte halbquantitativ als HuR negativ, schwach, moderat oder stark bewerteten. Für statistische Analysen wurden die Fälle mit einer negativen oder schwachen Expression von HuR zu einer Gruppe (HuR-negativ) zu- sammengefasst, während die Fälle mit einer moderaten bis starken Expression einer HuR- positiven Gruppe zugeordnet wurden. Nachfolgende statistische Analysen wurden durch Vergleichen von positiven und negativen Fällen durchgeführt.
Beispiel 7: Statistische Analysen
[0031] Die statistische Signifikanz des Zusammenhangs zwischen Expression von HuR und einzelnen klinikpathologischen Parametern, wie COX-1 oder COX-2, wurden durch Fisher's exact, Chi-Quadrat-Test oder Chi-Quadrat-Test für Trends bewertet. Die Wahrscheinlichkeit des Gesamt-Überlebens als eine Funktion der Zeit wurde durch die Kaplan-Meier-Methode und den Log-ranlc-Test bestimmt. Multivariate Überlebens-Analysen wurden unter Verwendung des Cox-Regressions-Modells durchgeführt. Generell wurden p-Werte kleiner als 0.05 als signifikant berücksichtigt. Für die statistische Evaluierung wurde die SPSS-Software- Version 10.0 verwendet. Tabellen
[0032] Tabelle 1 zeigt die univariate Uberlebensanalyse (Kaplan-Meier) ausgewählter Untergruppen von Patienten entsprechend der zytoplasmatischen HuR-Expression (Figur 5) Progressionsfreies Überleben Gesamt- Überleben Charakteristik Nr. Nr. d. Mittl. Uber- Log Nr. Nr. d. Mittl. Uber- Log d. Er- lebenszeit rank d. Er- Iebenszeit rank Faleign. (MonateiSE Faleign. (MonateiSE les ) les ) Serous carcinomas 0.03 0.009 Cyt. HuR negative 15 8 26.1±5.3 20 7 not reached Cyt. HuR positive 13 10 17.6±4.7 22 17 34.6±4.1 Figo stage III 0.04 0.007 Cyt. HuR negative 18 9 27.4±5.1 26 9 not reached Cyt. HuR positive 14 11 17.6±4.6 24 18 34.6±3.9 G2-3 tumors 0.06 0.04 Cyt. HuR negative 27 13 27.4±4.0 32 13 51.4 Cyt. HuR positive 19 15 18.3±5.9 32 23 34.6±4.1 Age at surgery (y) 0.01 0.02 < 60 Cyt. HuR negative 21 8 not reached 27 6 not reached Cyt. HuR positive 13 11 21.3±7.0 20 12 41.5±6.2 Age at surgery (y) 0.93 0.29 > 60 Cyt. HuR negative 1 1 5 27.4 19 10 47.5±17.8 Cyt. HuR positive 8 4 18.3±0.8 17 13 27.7±1 1.0
[0033] Tabelle 2 zeigt die Uberlebensanalyse (Regressions-Model nach Cox) für das Gesamt- Überleben von 83 Patienten mit invasivem Ovarialkarzinom Relatives 95% CI of p-Wert Risiko RR (RR) Cytoplasmic HuR Expression 0.006 negative 1.0 - - positive 2.62 1.32-5.19 0.006 Histological type 0.32 Serous / non-serous 1.0 - - Undifferentiated 1.51 0.67-3.41 0.32 FIGO stage O.0005 I 1.0 - - π /in 1.42 0.49-4.16 0.52 IV 23.33 5.51-98.76 O.0005 Grade (Silverberg) 0.098 Gl 1.0 - - G2-G3 2.39 0.85-6.72 0.098 Age 0.007 <60 y 1.0 - - >60 y 2.41 1.27-4.55 0.007 Legenden zu den Figuren
Figur 1: Expression der HuR-mRNA in Ovarialkarzinomzelllinien (PCR)
[0034] Alle Zelllinien zeigen zudem eine Expression von HuR-Protein (Western Blot) [0035] In OVCAR-3 Zellen ist HuR überwiegend im Zellkern exprimiert (Konfokale Laser Scan Mikroskopie)
Figur 2: Expression des HuR-Proteins in 8 Ovarialkarzinomen und einem Borderline-Tumor
[0036] 1 : Seröses Ovarialkarzinom Grad 1; 2: Seröser Borderline-Tumor; 3: Seröses Ovarial- karzinom Grad 1; 4: Endometrioides Ovarialkarzinom Grad 2; 5: Seröses Ovarialkarzinom Grad 3; 6: Seröses Ovarialkarzinom Grad 3; 7: Seröses Ovarialkarzinom Grad 2; 8: Seröses Ovarialkarzinom Grad 1; 9: Seröses Ovarialkarziom Grad 2
Figur 3: Immunhistochemie: Expression von HuR in primären humanen Ovarialkarzinomen A: Nukleare Expression in einem Serösen Ovarialkarzinom, Grad 1 ;
B: Nukleare Expression in einem Serösen Ovarialkarziom, Grad 2;
C: Starke cytoplasmatische Expression von HuR ein einem Serösen Ovarialkarzinom, Grad 2;
D: Starke cytoplasmatische Expression von HuR ein einem Serösen Ovarialkarzinom, Grad 3;
E,F: Starke Expression der COX-2 (E) im Tumorgewebe, die durch Präinkubation mit einem COX-2 Peptid vollständig inhibiert wird (F)
Figur 4: A: Signifikante Korrelation der zytoplasmatischen HuR-Expression der Tumorzellen mit der COX-2-Expression (0=0.025, Fishe s exakter Test.)
B: Signifikante Korrelation der zytoplasmatischen HuR-Expression der Tumorzellen mit dem histologischen Differenzierungsgrad (0=0.008, chi2 Test für Trends.)
C: Signifikante Korrelation der zytoplasmatischen HuR-Expression der Tumorzellen mit der mitotischen Aktivität (0=0.002, chi2 Test für Trends)
Figur 5: Univariate Uberlebensanalyse gesondert für die zytoplasmatische oder nukleare HuR-Expression.
[0037] Die zytoplasmatische Expression ist ein prognostischer Faktor für das progressionsfreie Überleben (A, p=0.03, log rank test) und für das Gesamtüberleben (B, p=0.007) von Patientinnen mit Ovarialkarzinomen. [0038] Im Gegensatz dazu ist die nukleare Expression kein Prognosefaktor für das progressions-freie Überleben (C, p=0.54) bzw. das Gesamtüberleben (D, p=0.97). [0039] Die zytoplasmatische Expression von HuR ist ein Prognosefaktor in der Untergruppe der Patientinnen mit fortgeschrittenem Ovarialkarzinom (FIGO Stadium III, FIGO: Föderation Internationale de Gynecologie et d' Obstetrique) (E, F) sowie in der Gruppe der Patientinnen mit Serösen Ovarialkarzinomen (G, H), jeweils für das progressions-freie Überleben (E, G) bzw. das Gesamtüberleben (F, H). Gepunktete Linien: HuR-negative Fälle, durchgezogene Linien: HuR-positive Fälle.
Abkürzungsverzeichnis
ARE AU-reiches Element
AU-reich Adenin/Uracil-reich
COX-2 Cyclooxygenase 2
ELAV embryonic lethal abnormal vision, homologes Drosophila Protein
FIGO Föderation Internationale de Gynecologie et d' Obstetrique
Hel-Nl Homolog of drosophila ELAV-like neuronal protein 1
Hu Hu Antigen (benannt nach den Indexpatienten, keine weitere Bedeu- tung)
HuB Hu Antigen B
HuC Hu Antigen C
HuD Hu Antigen D
HuR Hu Antigen R mRNA messenger Ribonukleinsäure
PCR Polymerase-Kettenreaktion
RNA Ribonukleinsäure
RT Reverse Transkriptase
RT-PCR Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion siRNA short interfering RNA
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
ZNS Zentralnervensystem Literaturverzeichnis
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Diagnostik maligner Tumoren, zur Bestimmung der Prognose eines Tumors sowie zur therapeutischen Intervention bei malignen Tumoren unter Nutzung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Protein HuR als Prognosemarker oder als Target für Ovarialkarzinome, Kolonkarzinome, Prostatakarzinome, Mammakarzinome, Pankreaskarzinome oder Endometriumkarzinome eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Analyse der Expressionsmuster des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR in Tumorgeweben vorgenommen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur therapeutischen Intervention bei malignen Tumoren eine Festlegung der Indikation zur Therapie mit COX-2-Inhibitoren oder mit Angiogeneseinhibitoren durch Bestimmung der Expression und zellulären Verteilung des Proteins HuR im Tumorgewebe vorgenommen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Therapie eines Tumors durch Inhibition des Proteins HuR erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Tumor-Therapie in Kombination mit chirurgischen Interventionen, standardisierten Chemotherapien oder Chemotherapien unter Verwendung platinhaltiger Chemotherapeutika erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine molekulare Tumor- Therapie in Kombination mit pharmakologischen Substanzen, mit Transfektionstechniken oder unter Verwendung von Silencing-RNAs erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekeimzeichnet, dass eine gegen HuR gerichtete Therapie in Kombination mit einem COX-2-Inhibitor oder einem Angiogeneseinhibitor vorgenommen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die für eine molekulare Tumor-Therapie eingesetzten pharmakologische Substanzen zur Herabsetzung von Kreuzreaktionen mit neuralen Strukturen spezifisch für die Isoform HuR oder nicht ZNS- gängig sind.
10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass durch immunhistologische Färbungen die Expression von HuR im Tumorgewebe bestimmt und mittels eines immunoreaktiven Scores separat für die cytoplasmatische und die nukleare Färbung analysiert wird.
11. Verwendung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR als molekularer Prognosemarker und als Target für Karzinome.
12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass Protein HuR bei der Bestimmung der zytoplasmatischen Expression in Karzinomen und bei der multivariaten Uberlebensanalyse als ein unabhängiger Prognosefaktor eingesetzt wird.
13. Verwendung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR zur Bestimmung der Therapieindikation bei malignen Tumoren.
14. Verwendung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR nach Anspruch 13 zur Bestimmung von Therapieindikationen durch Evaluation von HuR in Tumorzellen.
15. Verwendung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR nach Anspruch 13 und 14 zur Bestimmung von Therapieindikationen für die Therapie mit COX-2-Inhibitoren.
16. Verwendung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR nach Anspruch 13 und 14 zur Bestimmung von Therapieindikationen für die Therapie mit Angiogeneseinhibitoren.
17. Verwendung von HuR-Inhibitoren für molekulare Tumortherapien.
18. Testkit zur Diagnostik maligner Tumoren und zur Bestimmung der Prognose eines Tumors unter Nutzung des humanen ELAV-ähnlichen Proteins HuR.
9. Testkit nach Anspruch 18, bestehend in einem Teil aus gepuffertem Formaldehyd, Paraffin, immunhistologischen Standardreagenzien - wie Sekundärantikörper, Färbereagenzien oder Färbesubstrat - sowie einem gegen HuR gerichteten Primärantikörper und zum anderen Teil aus Gewebeproben des zu untersuchenden Tumors.
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