KR20130032866A

KR20130032866A - 만성 염증 상태의 치료

Info

Publication number: KR20130032866A
Application number: KR1020127024377A
Authority: KR
Inventors: 지노 루이지 바이로; 존 앨런 해밀턴; 앤드류 데이비드 쿡
Original assignee: 더 유니버시티 오브 멜버른; 씨에스엘 리미티드
Priority date: 2010-02-18
Filing date: 2010-02-18
Publication date: 2013-04-02
Also published as: CN102821815A; CA2789515A1; JP2013519689A

Abstract

본 발명은 환자에서의 인터루킨-3 신호 현상(IL-3 singalling events)을 차단 또는 억제하는 약제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자에서의 만성 염증 상태의 치료 방법을 제공한다.

Description

만성 염증 상태의 치료{TREATMENT OF CHRONIC INFLAMMATORY CONDITIONS}

본 발명은 만성 염증 상태의 치료에 관한 것으로, 상세하게는 환자의 만성 염증 상태의 영향을 감소시키거나 또는 개선시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명은 다수의 염증성 매개인자(inflammatory mediator)의 존재 및 가동관절(diarthrodial joint)의 파괴로 특징지어지는 만성염증질환인 관절염, 특히 류마티스성 관절염에 관한 것이다.

인터루킨-3(IL-3)은 면역체계의 일부로서 질환에 대한 인체의 선천적 반응(natural response)을 향상시킬 수 있는 사이토카인(cytokine)이다. 인터루킨-3은 골수성계(myeloid lineage)에 속하는 모든 세포(적혈구, 혈소판, 과립성 백혈구(granulocyte), 단핵구, 수지상세포(dendritic cells))의 증식을 촉진할 뿐만 아니라, 다분화 조혈줄기세포(전분화능)의 골수성 전구 세포(myeloid progenitor cell)로의 분화를 촉진한다. 이것은 면역반응에서 활성화된 T 세포로부터 분화되어 골수로부터의 T 세포의 분화 및 성장을 도와준다.

인터루킨-3은 인터루킨-3 수용체(Interleukin-3 receptor, IL-3 R)로 알려진 특정 세포 표면 수용체와 결합함으로써 활성을 나타낸다. 인터루킨-3 수용체(IL-3R)은 70kDa IL-3 R 알파(CD123)와 120-140kDa의 IL-3R 베타(CD131)로 구성된 헤테로다이머 구조(heterodimetric structure)이다. IL-3R α사슬(IL-3R alpha chain, IL-3Rα)은 매우 짧은 세포 내 영역(intracellular domain)을 가진데 비해 IL-3R β사슬(IL-3R beta chain, IL-3Rβ)은 매우 큰 세포질 영역(cytoplasmic domain)을 가진다. IL-3R 알파는 인터루킨-3에 대해 비교적 낮은 친화성으로 결합한다. 그러나 IL-3R 베타의 존재하에서 IL-3R 알파는 인터루킨-3에 매우 높은 친화성으로 결합한다. 인터루킨-3 결합 이후에, 신호전달(signal trasnduction)이 어떻게 발생하는지는 불분명 하지만, 근래의 연구에서는 신호에 도데카머(dodecamer)를 포함하는 고차수 복합체의 형성(formation of a higher order complex)이 필요함이 제안되고 있다. IL-3R 베타 사슬은 IL-5 및 GM-CSF 수용체에 의하여 공유된다. 인터루킨-3 수용체(IL-3 receptor)를 발현하는 것으로 알려진 세포에는 단핵구(monocytes), 대식세포(macrophage), 중성구(neutrophils), 호염구(basophils), 비만세포(mast cells), 호산구(eosinophils), 거핵구(megakaryocyte), 적혈구 세포(erythorid cells) 및 CD5⁺ B 세포 아집단(B cell sub-populations)을 포함하는 더 성숙된 다양한 조혈계(hematopoietic lineages) 뿐만 아니라, 조혈 전구 세포, 비만 세포(mast cells), 호염구(basophis), 혈액 단핵구(blood monocyte)가 포함된다. 비-조혈 세포(non-hematopoietic cells)는 또한 내피세포(endothelial cells), 기질세포(stromal cells), 수지상 세포(dendritic cells), 라이디그 세포(Leydig cells)를 포함하는 수용체를 발현하는 것으로 보인다.

인터루킨-3(IL-3)은 면역(immune)과 조혈 체계(hematopoietic system) 간의 잠재적으로 중요한 연결(potentially important connection)을 제공한다. 이러한 사실은 특히 면역 반응 중 비만세포(mast cell)와 호염구(basophils)의 생성과 작용(production and fucntion)에 중요할 수 있다. 인터루킨-3(IL-3)은 대식계 집단(macrophage lineage population)의 성장과 활성화를 촉진시킬 수 있고, 수지상 세포(dendritic cells)의 생성을 도울 수 있다. 상기한 바와 같이, 인터루킨-3 신호(IL-3 signalling)은 마우스에서는 부가적인 베타 서브유닛(beta-subunit)이 존재한다 할지라도 일반적인 수용체 베타 서브유닛(common receptor beta-subunit, IL-3Rβ)과 특이적 리간드-결합 알파 서브유닛(specific ligand-binding alpha-subunit, IL-3Rα)에 의해 매개된다.

류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis, RA)와 같은 만성 염증 상태(chronic inflammatory conditions)에서 인터루킨-3(IL-3)의 역할에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 한 연구에서는 류마티스성 관절염(RA) 환자의 활막(synovium)에서 IL-3 mRNA가 발현되지 못한다고 하였으나, 추후의 연구에서는 발견되었다; 전부는 아니지만 다수의 류마티스성 관절염(RA) 환자에서 혈중 탐지 가능한 인터루킨-3(IL-3)가 발견되었으며 인터루킨-3 유전자 프로모터(IL-3 gene promoter)에서의 단일 뉴클레오타이드 다형(single-nucleotide polymorphism)과 류마티스성 관절염(RA) 사이에 관련성이 나타났다. 그러나, 랫드 관절염 모델(rat arthritis model)에서 관절염이 진행되는 동안 인터루킨-3 수준은 감소하였으며, 인터루킨-3 투여로 마우스의 염증성 관절염(murine inflammatory arthritis)을 억제하는 것이 최근에 보고되었다.

본 발명에 있어서, 본 발명자들은 인터루킨-3(IL-3)과 인터루킨-3 수용체(IL-3R) 사이에서의 리간드/수용체 상호작용을 막거나 방해함으로써 류마티스성 관절염(RA)과 같은 만성 염증 상태(chronic inflammatory conditions)의 작용이 억제될 수 있음을 발견하였다. 인터루킨-3 투여가 염증 반응(inflammatory response)을 축소시키고 간접적으로는 염증성 관절염(inflammatory arthritis)에서의 연골과 골 손실(cartilage and bone loss)을 저지시킬 가능성을 언급한 최근의 보고를 고려했을 때, 이러한 결과는 아주 놀라운 것이며, 예상하지 못한 것이다.

본 발명 명세서의 참고문헌은 발명의 상세한 설명 마지막에 열거되어 있다.

본 발명 명세서에 기재된 문헌(또는 그것에서 유래된 정보) 또는 앞서서 알려진 내용은 본 발명 명세서가 관련된 연구분야(field of endeavour)에서 보편적이고 일반적인 지식의 부분을 형성하는 것임을 승인, 허가 또는 제안하는 것이 아니며 또한 그렇게 받아들여져서도 안된다.

문맥상 다르게 해석할 필요가 없다면, 아래의 본 발명 명세서와 청구범위에서 일관되게 "포함(comprise)"이라는 단어와 그 변형인 "포함하다(comprises)"와 "포함하는(comprising)"들은, 언급된 정수(integer) 또는 단계(steps) 또는 정수와 단계의 그룹을 포함(inclusion)한다는 것이지 어떠한 다른 정수 또는 단계 또는 정수와 단계의 그룹을 배제하는 것이 아님을 의미하는 것으로 이해되어야 할 것이다.

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도 1은 항-IL-3-단일클론항체(anti-IL-3 mAb) 또는 PBS를 투여한 마우스에서 콜라겐-유도 관절염(collagen-induced arthritis, CIA)의 진행을 나타낸다(대조군); 결과는 mean±SEM 으로 표시하였다; n=10 마우스 치료군, n=6 마우스 대조군.
도 2는 단핵구(PBMC로부터 분리된 CD14+)의 세포 생존율에 대한 인터루킨-3 신호(IL-3 signalling)의 효과를 나타낸다; 단핵구는 ~1.8×10⁶ cells per 6cm IWAKI(저부착)의 밀도로 TC 디시(TC dish)에 도말 되었으며, 7일간 RPMI + 10% FBS에서 배양되었고: 각각 IL-3(3ng/ml) 단독, IL-3(3ng/ml) + IL-3-R 항체, 또는 IL-3(0.3ng/ml) 단독, 또는 IL-3(0.3ng/ml) + IL-3-R 항체이다; IL-3-R 항체는 1㎍/ml 로 각각 사용되었다; 4일째에 새로운 IL-3와 IL-3-R 항체가 첨가되었다; 7일째에 세포를 제거하고 수를 세었다.
도 3은 인터루킨-3(IL-3)이 용량-의존적으로 호염구 활성 마커 CD203C를 유발시킴을 나타낸다; 심마진 환자(urticaria patients, URT)와 정상 공여자(normal donor, NOR)로부터 PBMC를 분리하여 다클론 IgE, FMLP, FMLP 및 IL-3 또는 증가된 농도의 인터루킨-3로 자극하였다; 호염구를 동정하기 위한 항체 칵테일(antibody cocktail) 및 호염구 활성 마커 CD203c에 대한 항체로 염색한 후, CD203+ve 호염구의 퍼센트를 계산하였고, 유세포 분석기로 분석하였다.
도 4는 항-IL-3 항체가 IL-3-유도 호염구 활성화를 차단함을 나타낸다; 정상 공여자로부터 PBMC를 분리하였고, 중화된 항-IL-3R 항체 CSL 360(neutralizing anti IL-3R antibody CSL 360)의 존재 또는 부재 상태에서 IL-3 농도를 증가시켜 자극하였다; 호염구를 동정하기 위한 항체 칵테일(antibody cocktail) 및 호염구 활성 마커 CD203c에 대한 항체로 염색한 후, CD203+ve 호염구의 퍼센트를 계산하였고, 유세포 분석기로 분석하였다.
도 5는 항-CD123 단일클론항체 CSL 362(anti-CD123 monoclonal antibody CSL 362)가 호염구를 시간-의존적으로 제거시킴을 나타낸다; 정상 공여자로부터 PBMC를 분리하여, 다양한 시간(표시되어 있음)으로 항체 없이 또는 항-CD123 항체(CSL 362)를 제거된 상태로 배양하였다; 호염구를 동정하기 위해 항체 칵테일로 염색한 후에, 남아있는 호염구의 퍼센트를 계산하였고, 유세포 분석기로 분석하였다.
도 6은 항-CD123 단일클론항체(anti-CD123 mAb)가 24시간 이내에 호염구를 재생가능하게 제거시킴을 나타낸다; 3명의 정상 공여자로부터 PBMC를 분리하였고, 항체 없이 또는 항-CD123 항체(CSL362)를 제거시킨 상태로 24시간 동안 배양하였다; 호염구를 동정하기 위해 항체 칵테일로 염색한 후에, 남아있는 호염구의 퍼센트를 계산하였고, 유세포 분석기로 분석하였다.
도 7은 항-CD123 단일클론항체(anti-CD123 mAb)가 24시간 내에 NK 세포를 활성화, 촉진시킴을 나타낸다; 3명의 정상 공여자로부터 PBMC를 분리하였고 항체 없이(직선) 또는 항-CD123 항체(CSL362)를 제거시킨 상태(점선)로 24시간 동안 배양하였다; NK 세포(CD56+ve cells)의 활성은 CD16의 하향조절(down-regulation)로 측정된다; PBMC는 NK 세포를 식별하기 위해 항-CD56 항체로, 그리고 항-CD16 항체로 염색되었다; CD16 염색의 소실은 항체없는 대조군과 비교하여 유세포 분석기로 결정하였다.
도 8은 항-IL-3Rα항체의 생체내 투여에 의한 말초 혈액에서의 마우스 호염구의 제거를 나타낸다; BALB/c 마우스에 항-IL-3Rα항체(1C2), 항-CD200R3(Ba103) 또는 아이소타입 대조군 항체 마우스 IgG2a(mIgG2a) 또는 랫드 IgG2b(rIgG2b)를 정맥내 투여하였다; 마우스당 18㎍로 주사된 1C2를 제외하고는 모든 항체를 마우스당 30㎍로 투여하였다; 말초혈 세포를 항체 투여 24시간 후에 분리하였고 호염구를 동정하기 위해 FcεR1α 및 CD49b 발현을 염색하였다; 유세포 분석의 대표적 염색 프로파일(representative staining profile)은 (a)로 표시되었다; 호염구 집단은 박스화되어 있다; 마우스당 호염구의 백분율은 유세포분석으로 계산되었으며, 그룹당 3마리 마우스의 mean(+SEM)으로 표시하였다(b); ***:p<0.001, **:p<0.01.

본 발명의 요약

한 측면에서, 본 발명은 환자에서 만성 염증 상태(chronic inflammatory condition)의 치료 방법을 제공하는 것으로서, 환자에서 인터루킨-3 신호 현상(IL-3 signalling events)을 차단 또는 억제하는 약제를 투여하는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 환자에서 만성 염증 상태(chronic inflammatory condition)의 치료 또는 치료제의 제조, 인터루킨-3 신호 현상(IL-3 signalling events)을 차단 또는 억제하는 약제의 용도를 제공하는 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 환자에서 만성 염증 상태(chronic inflammatory condition)의 치료를 위한 약제를 제공하는 것으로서, 여기에서 약제는 환자에게 인터루킨-3 신호 현상(IL-3 signalling events)을 차단 또는 억제하는 것이다.

본 발명의 다른 측면에서, 약제는 한 개 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제(exipients) 및 또는 희석제(diluent)로 이루어진 약학적 조성물로 제형화 될 수 있으며, 또는 환자에서 만성 염증 상태(chronic inflammatory condition)의 치료 방법에 따른 약제의 사용 지시서를 선택적으로 약제 사용 설명서를 포함하는 키트(kit)로 제공될 수 있다.

만성 염증 상태는 예를 들면, 관절염(arthritis)일 수 있고, 더 바람직하게는 류마티스성 관절염(RA)과 같은 염증성 관절염(inflammatory arthritis)일 수 있다.

바람직하게는, 환자에서 IL-3/IL-3R 또는 IL-3/IL-3R 알파 상호작용을 차단 또는 억제하는 약제일 수 있다. 또한 바람직하게는 환자는 인간일 수 있다.

발명의 상세한 설명

바람직하게는 약제는 환자에서 IL-3/IL-3R 또는 IL-3/IL-3R 알파 상호작용을 차단 또는 억제하는 것일 수 있다.

본 발명에 따라 치료될 수 있는 만성 염증 상태(chronic inflammatory conditions)는 이 분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있으며, 특히 관절염, 더욱 상세하게는 성인 및 소아 류마티스성 관절염(RA)과 같은 염증성 관절염을 포함할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니지만 만성 폐 폐색증(chronic obstructive pulmonary disease, COPD); 크론병(Crohn's disease) 및 궤양성 결장염(ulcerative colitis)와 같은 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease); 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, CIDP); 죽상경화증(atherosclerosis); 경피증(scleroderma); 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosis, SLE); 쉐그렌 증후군(Sjogren's syndrome); 통풍(gout); 골 관절염(osteoarthritis); 류마티스성 다발성 근육통(polymyalgia rheumatica); 강직성 척추염(ankylosing spondylitis)를 포함하는 혈청음성 척추관절병증(seronegative spondyloarthropathy); 라이터 증후군(Reiter's disease), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease, MCTD); 만성 라임 관절염(chronic Lyme arthritis); 스틸 병(Still's disease); 만성 심마진(chronic urticaria); 류마티스성 관절염이 연관된 포도막염(uveitis) 및 수의근(voluntary muscle)과 다른 근육의 염증의 결과로 나타나는 질환들을 포함할 수 있다.

본 발명의 명세서에서 "치료(treatment)"의 의미는 가장 광범위한 의미로 해석되어야 할 것이며, 치료적 처지(therapeutic treatment)와 함께 예방 또는 방지 수단(prophylactic or preventative measures)도 포함되는 것이다. 치료가 필요한 환자에는 만성 염증 상태(chronic inflammatory condition)으로 이미 고통받고 있는 사람만이 아니라 그러한 현상을 예방해야 할 사람도 포함된다. 만성 염증 상태에서 부분적 또는 완전히 회복된 환자들도 치료가 필요할 수 있다. "치료(treatment)" 라는 용어는 환자가 반드시 완전히 회복될 때까지 치료 받는다는 것을 의미하는 것은 아니다. 따라서 치료에는 어떠한 특정 만성 염증 상태의 증상의 완화 또는 호전뿐만 아니라 특정 만성 염증 상태의 발병(onset), 발전(development) 또는 진행(progress)을 정지 또는 최소한 지연시키거나, 위험 정도를 감소시키거나, 또는 제거시키는 것이 포함된다.

본 발명에 따른 투여되는 약제(agent)는 환자에서 인터루킨-3 신호 현상(IL-3 signalling events)의 활성화를 차단 또는 억제시키는 것으로서, IL-3/IL-3R 또는 IL-3/IL-3R 알파 상호작용을 차단 또는 억제시키는 방법이 바람직하다. 여기에서 사용되는 바와 같이, "환자에서 인터루킨-3 신호 현상의 차단 또는 억제(blocks or inhibits IL-3 signalling events in the patien)"의 의미는 인터루킨-3 개시 신호(IL-3 initiated signalling)의 수준을 낮추도록 유도하는 어떠한 개입(intervention)도 포함한다. 이러한 조정, 개입에는 인터루킨-3 신호 활성을 특징적으로 차단 또는 억제하는 약제(예를 들면 IL-3, IL-3Rα, IL-3Rβ를 표적으로 하는 약제)의 사용뿐 아니라, 인터루킨-3 신호가 가능한 세포를 선택적으로 공격하도록 하거나 공격함으로써 세포 사멸(cell death)을 유도하도록 하는 약제(예를 들면 IL-3R를 목표로 하여 항-세포 모이어티(anti-cellular moiety)를 운반하는 약제)의 사용을 포함한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 약제는 IL-3 또는 IL-3R 알파 또는 IL-3R 베타인 IL-3R에 선택적으로 결합하는 항원 결합 분자(antigen binding molecule)일 수 있다.

여기서 사용되는 바와 같이 "항원 결합 분자(antigen binding molecule)"는 키메라(chimeric), 인간화된(humanized) 또는 인간 단일클론항체(human monoclonal antibody) 등의 단일클론항체(monoclonal antibodies)를 포함하는 온전한(intact) 면역글로불린(immunoglobulin)을 의미하며, 예를 들면 숙주세포 단백질(host cell protein)과 같이 면역글로불린의 결합 상대에 특이적으로 결합하기 위해, 온전한 면역글로불린과 경쟁하는 면역글로불린의 항원-결합(예를 들면 Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')₂ 단편을 포함할 수 있다) 및/또는 다양한 도메인을 포함하는 단편(variable-domain-comprising fragments)를 의미하는 것이다. 구조와 관계없이, 항원-부착 단편(antigen-binding fragments)은 온전한 면역글로불린에 의해 인식되는 동일 항원에 부착된다. 항원-부착 단편은 합성에 의하여, 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있으며 또는 재조합 DNA 기술에 의해 유전공학적으로 처리될 수 있다. 항원 결합 분자 및 단편의 제조 방법은 이 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Antibodies, A Laboratory Manual, Edited by E. Harlow and D. Lane(1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York에 기술되어 있고, 본 발명에 인용문헌으로 포함되어 있다.

바람직하게는 항원 결합 분자(antigen binding molecule)는 단일클론항체 일 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 항원 결합 분자는 변형 Fc 영역(modified Fc region), 특히 Fc 수용체(Fc receptors)에 대한 강화된 결합 친화도와 같은 강화 작동기능(enhanced effector functions)이 제공되도록 변형된 Fc 영역; 항체 의존성 세포매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC); 항체-의존성 세포-매개 식세포 작용(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis, ADCP) 및 보체-의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)로 구성될 수 있다. 항체의 IgG 클라스(class)에서는 다양한 면역 세포에서 나타나는 Fcγ 수용체(Fcγ receptors, FcγRs)를 의미하는 수용체 패밀리(family of receptors)와 Fc 영역(Fc region)이 맞물림으로써 이들 작동 기능이 좌우된다. Fc/FcγR 복합체가 형성되어 이들 세포를 부착된 항체 위치로 동원시킴으로써 전형적으로 신호와 뒤이어 면역 반응이 일어난다. 작동기능을 강화하기 위하여, 특히 "모체(parent)" Fc region 과 연관된 ADCC 및/또는 CDC 활성을 변화시키기 위하여 항체 Fc 영역에 대한 FcγRs의 부착 친화성을 최적화시키는 방법은 이 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 예로써 국제공개번호 WO 2009/070844에 기술되어 있다. 이들 방법에는 연관된 Fc 수용체와의 작용을 강화시키고 ADCC 및 ADCP를 촉진시킬 잠재력을 증가시키기 위하여 항체의 Fc 영역을 변형시키는 것이 포함될 수 있다. Fc 영역의 보존된 Asn²⁹⁷에서 IgG1에 공유결합으로 부착된 올리고당(oligosaccharide)의 변형 후에 ADCC의 활성이 강화된다고 기술되어 있다.

여기에서 사용되는 "선택적 결합(binds selectively)"이라는 용어는, 항원 결합 분자, 예를 들면 항체 또는 항체 단편과 그 부착 상대방, 예를 들면 항원의 상호작용과 관련해서, 상호작용은 결합 상대방(binding partner)에 있는 특정 구조, 예를 들면 항원성 결정 부위(antigenic determinant) 또는 에피토프(epitope)의 존재에 의존한다는 의미이다. 다른 말로 하면, 항체 또는 항체 단편은 결합 상대방이 다른 분자 또는 생물체에 존재한다 하더라도 결합 상대방을 인식하거나 우선적으로 결합한다는 것이다.

어떠한 특정 학설에 구속되지 않기를 바라면서, 본 발명의 실시예에서 IL-3 또는 IL-3R 알파 또는 IL-3R 베타인 IL-3R에 선택적으로 결합함으로써, 항체 또는 항체 단편 같은 항원 결합 분자는 리간드/수용체 상호작용을 차단 또는 억제하며 그 때문에 인터루킨-3 신호 활성을 방해한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 항원 결합 분자는 인터루킨-3 수용체 알파에 선택적으로 부착하는 단일클론 항체일 수 있다. 그래서, 항원 부착 분자는 CD124에 대한 단일클론항체 7G3일 수도 있으며, 이것은 이전에 백혈병 세포주(leukaemic cell lines)와 일차 세포(primary cells) 모두의 인터루킨-3 매개 증식 및 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다(미국 특허 번호 6,177,678 로페즈 참조). 대안적으로, 약제가 단일클론항체 CSL 360일 수도 있으며, 이것은 인간 IgG1 불변 부위(Human IgG1 constant region)에 마우스 단일클론 항체 7G3의 경쇄가변 및 중쇄가변 부위(light variable and heavy variable region)을 이식함으로써 얻는 혼성 항체(chimeric antibody)일 수 있다(국제공개번호 WO 2009/070844 참조). 7G3와 비슷하게, CSL 360은 높은 친화성으로 CD123(인간 IL-3Rα)에 결합하여 수용체에 결합하기 위해 인터루킨-3와 경쟁하며, 그 생물학적 활성을 차단한다. CSL360 역시 사람의 치료제로서 사용 가능성에 장점을 가지는데, 사람에서 작동 활성(effector activity)를 개시할 수도 있는 human IgG1 Fc 부위 때문이다. 더구나, 사람에서 그것은 마우스 7G3 등가체(mouse 7G3 equivalent)와 비교하여 감소된 제거(clearance)를 나타낼 수 있고, 면역성이 더 적을 가능성이 있다. 이러한 항원 결합 분자의 다른 예로서, 항원 결합 분자는 강화작동기능을 가진 7G3 또는 CSL360의 인간화 항체 변이체(humanised antibody variants of 7G3 또는 CSL360), 완전 인간 항-CD123항체(fully human anti-CD123 antibodies) 및 항-CD123 항체를 포함할 수 있으며, 예를 들면 국제공개번호 WO 2009/070844의 실시예 4에 기술되어 있다.

본 발명의 또 다른 일실시예에 있어서, 약제가 인터루킨-3 수용체에 결합하지만 인터루킨-3 신호 활성을 발생시키지 않거나 최소한 감소시키지 않는 IL-3 돌연변이 일 수도 있다. 일반적으로 이들 'IL-3 돌연변이(IL-3 muteins)'에는 한 개 또는 그 이상의 인접(contiguous) 또는 비 인접(non-contiguous) 아미노산 잔기(amino acid residues)의 부가(addtition), 삭제(deletion) 및/또는 치환(susbstitution)으로 인해 달라지는 천연 또는 인조 돌연변이(natural or artificial mutans)를 포함할 수 있다. 인터루킨-3 수용체(IL-3R)에 결합하지만 인터루킨-3 신호 활성 감소를 나타내는 인터루킨-3 돌연변이(IL_3 mutein)의 예로는 16/84 C -> A 돌연변이가 있다. 인터루킨-3 돌연변이(IL-3 mutein)에는, 예를 들면 생체내 반감기가 증가되는 것으로 변화하는 한 개 또는 그 이상의 잔기가 존재하는 변형 폴리펩타이드(modified polypeptides)도 포함될 수 있다. 이것은 PEG 그룹(group)과 같은 다른 요소(other elements)가 결합됨으로써 이루어질 수 있다. 폴리펩타이드의 페길화(PEGylation) 방법은 이 분야에서 잘 알려져 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 약제는 인터루킨-3에 결합할 수 있는 가용성 수용체(soluble receptor)일 수 있다. 이러한 가용성 수용체(soluble receptor)의 예로써, 인터루킨-3 수용체 알파(IL-3R alpha)의 세포외 부분 또는 인터루킨-3 수용체 베타(IL-3R beta)에 혼성된 인터루킨-3 수용체 알파(IL-3R alpha)의 세포외 부분(extracellular portion)으로 구성된 혼성 단백질(fusion protein)이 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 약제는 인터루킨-3 신호로 세포 사멸을 유발할 수 있는 세포를 목표로 할 수 있는 항-세포 모이어티(anti-cellular moiety)를 포함할 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 약제는 IL-3 또는 IL-3R, IL-3R 알파 또는 IL-3R 베타에 선택적으로 결합할 수 있는 항원 결합 분자에 컨쥬게이트된 항-세포 모이어티를 포함할 수 있다. 다른 실시예에 있어서 약제는 IL-3 돌연변이에 컨쥬게이트된 항세포 모이어티를 포함할 수 있다. 적절항 항-세포 모이어티의 예는 화학요법제(chemotherapeutics), 방사성 동위원소(radioisotopes) 또는 세포독소(cytotoxins)를 포함할 수 있다. 화합요법제는 스테로이드와 같은 호르몬, 시토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside), 플루오르우라실(fluorouracil), 메토트렉세이트(methotrexate) 또는 아미노프테린(aminopterin)과 같은 항 대사제(anti-metabolite); 안트라사이클린(anthracycline); 미토마이신 C(mitomycin C); 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid); 디메콜신(demecolcine); 에토포시드(etoposide); 미트라마이신(mithramycin); 칼리키마이신(calicheamycin), CG1065 및 이들의 유도체 또는 클로람부실(chlorambucil) 또는 멜팔란(melphalan)과 같은 알킬화제(alkylating agent), 응고제(coagulant); 사이토카인(cytokine); 성장인자(growth factor); 세균 내독소(bacterial endotoxin) 또는 세균 내독소의 지질 A 모이어티(lipid A moiety)를 포함할 수 있다. 방사성 동위원소(radioisotopes)는 예를 들면, 211 아스타틴(211 Astatine), 212 비스무스(212 Bismuth), 213 비스무스(213 Bismuth)와 같은 α-방출제(α-emitters); 예를 들면 131 아이오다인(131 Iodine), 90 이트리움(90 Yttrium), 177 루테티움(177 Lutetium), 153 사마리움(153 samarium), 109 팔라듐(109 Palladium)와 같은 β- 방출제(β-emitters); 예를 들면 111 인듐(111 Indium)과 같은 아우거 방출제(Auger emitters)를 포함 할 수 있다. 세포독소(cytotoxins)에는 예를 들면 A 사슬 톡신(A chain toxin), 리보솜불활성화단백질(ribosome inactivating protein), α-사르신(α-sarcin), 아스퍼질린(aspergillin), 리스트릭토신(restrictocin), 리보뉴클레아제(ribonulcease), 디프테리아 독소(diphtheria toxin) 또는 슈도모나스 외독소(pseudomonas exotoxin)와 같은 식물-, 곰팡이-, 세균-유래 독소가 일반적으로 포함될 수 있으며, 예를 들면 가하라이드 F(Kahalalide F), 에크테이나시딘(Ecteinacidin, Yondelis^TM) 또는 바리올린(Variolin B)같은 해면(spnoges) 등의 해양 생물(marine organisms)로부터 유래된 세포독소도 포함될 수 있다.

약제는 유효한 용량으로 투여될 수 있다. "유효한 양(effective amount)"은 최소한 부분적으로라도 원하는 반응을 얻거나, 치료 받는 특정 상태의 진행을 지연, 억제 또는 완전히 정지시키는데 필요한 용량을 의미한다. 치료 받을 개인의 건강과 신체상태, 개인의 인종적 배경, 원하는 보호의 정도, 조성물의 제형, 의학적 상황의 평가, 다른 관련된 요소에 따라 그 용량은 다양해진다. 그 용량은 일반적인 실험으로 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위가 될 것으로 예상된다. 필요하다면, 1회 또는 수회에 걸쳐 약제를 투여할 수 있다. 실제 투여 용량은, 치료 받아야할 상태의 본질과 투여될 약제의 비율에 의해서 결정될 것이다.

본 발명이 영장류, 가축(예: 양, 돼지, 소, 말, 당나귀), 실험동물(예: 마우스, 토끼, 랫드, 기니피그), 반려 동물(예: 개, 고양이), 포획 야생동물 등의 포유동물의 치료와 예방에도 사용될 수 있지만, 바람직하게는 환자는 인간일 수 있다.

본 발명에 있어서, 약제는 비경구적 경로로 환자에게 투여되는 것이 바람직하다. 비경구투여는 주사(injection), 주입(infusion) 및 이와 비슷한 방법으로 소화관(즉, 장이 아니다)을 통하지 않는 모든 투여 경로를 포함할 수 있다. 주사투여에는 예를 들면 정맥(정맥내, intravenous), 동맥(동맥내, intraarterial), 근육(근육내, intramuscular), 피부아래(피하, subcutaneous)를 포함할 수 있다. 이 약제는 예를 들면, 피하(subcutaneously), 피내(intradermally), 또는 근육내(intramuscularly)로 원하는 약효를 얻기에 충분하도록 데포(depot) 또는 서방형(slow release formualation)으로 투여할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 환자에서 만성 염증 상태(chronic inflammatory condition)의 치료에서 또는 치료약의 제조에서의 인터루킨-3 신호 현상(IL-3 signalling events)을 차단 또는 억제하는 약제의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 환자에서 만성 염증 상태의 치료약을 제공하는데, 여기에서 약제는 환자에서 인터루킨-3 신호(IL-3 signalling events)를 차단 또는 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 이러한 측면에서, 상기 약제는 한 개 또는 그 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제(exipient) 및/또는 희석제(dilents)와 함께 약학적 조성물로 제형화될 수 있다.

비경구투여에 적합한 조성물은 바람직하게는 받는 사람의 혈액(blood of recipient)과 등장성인 활성성분의 무균 수성 제품(sterile aqueous preparation)을 포함할 수 있다. 이 수성 제품(aqueous preparation)은 적합한 현탁제 또는 습윤제를 사용하여, 알려진 방법에 따라 제형화 될 수 있다. 무균 주사용 제품(sterile injectable preparation)은, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethlene glycol) 및 젖산(lactic acid)과 같은, 비-독성 비경구-가능 희석제 또는 용매(non-toxic parenterally-acceptable diluent or solvent)에 녹인 무균 주사용 용액 또는 현탁액이 될 수도 있을 것이다. 사용할 수 있는 가능한 비클과 용매(vehicles and solvents)에는 물, 링거 용액(Ringer's solution), 슈크로스, 말토스, 트레할로스, 글루코오스와 같은 적합한 탄수화물과 등장성 염화나트륨 용액(isotonic sodium chloride solution)이 포함될 수 있다. 또한 무균 불휘발성유(sterile, fixed oil)가 용매 또는 현탁 배지(solvent or suspending medium)로서 편리하게 사용될 수 있다. 이러한 목적으로 합성 모노- 또는 디-글리세라이드(synthetic mono- or di-glycerides)를 포함하여 어떠한 자극 없는 불휘발성유(bland fixed oil)도 사용될 수 있다. 또한 주사용 제품에 올레산(oleic acid)와 같은 지방산(fatty acids)도 사용된다.

이 분야의 숙련자에 이러한 치료 성분의 구성은 잘 알려져 있다. 약학적으로 적합한 허용가능한 전달제 및/또는 희석제(carriers and/or diluents)에는; 어떠한 그리고 모든 종래의 용매(solvents), 분산 매체(dispersion media), 충전물(fillers), 고형 전달체(solid carriers), 수용액(aqueous solutions), 코팅제(coatings), 항세균성 및 항진균성 약제, 등장성 및 흡수 지연 약제(isotonic and absorption delaying agents) 그리고 이와 비슷한 것들이 포함된다. 약학적으로 활성 물질로서 이러한 매개체와 약제(media and agents)의 사용은 이 분야에서 잘 알려져 있으며, Remingtons's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA. 에 기술되어 있다. 어떠한 종래의 매개체 또는 약제가 활성성분(active ingredient)와 병용 투여할 수 없는 경우를 제외하고는, 본 발명의 약학적 조성물의 사용이 고려될 수 있다. 추가적 활성 성분을 조성에 혼합시킬 수 있을 것이다.

발명의 다른 측면으로서; (ⅰ)위에서 기술한 약제, 선택적으로 (ⅱ)환자에서 만성 염증상태의 치료방법에 따른 약제 사용지시서를 포함하는 키트(kit)가 포함될 수 있다.

본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 자세히 설명한다. 그러나 본 발명이 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다.

실시예 1

질병의 진행에 대한 중화 단일클론항체(neutralizing monoclonal antibody;mAb)의 마우스 IL-3(murine IL-3)에 대한 효과는 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)의 마우스 모델(murine model)로서 가장 널리 사용되는 콜라겐-유도 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 모델로 시험되었다.

8-12주령 수컷 DBA/1 마우스 아쥬반트(adjuvant)에 들어있는 타입 Ⅱ(type Ⅱ) 콜라겐을 8-12주령 수컷 DBA/1 마우스 10마리 그룹에 0일과 21일에 피내주사하여 면역화 하였다.

마우스는 사지(limbs)의 발적과 종창(redness and swelling)으로 평가하였으며, 임상 점수(clinical score)는 아래의 점수 시스템을 사용하여 각각의 사지에 표시하였다: 0-정상(normal); 1-약간의 종창 및/또는 홍반(slight swelling and/or erythema); 2-광범위한 종창 및/또는 홍반(extensive swelling and/or erythema); 3-심한 종창(severe swelling); 4- 심한 종창 및/또는 강직(severe swelling and/or rigidity). 관절염의 심한 정도(severity of arthritis)는 사지 모두의 임상 점수 총계 평균으로 표시하였다(마우스당 0-16범위).

마우스를 21, 23, 25, 28 및 30일에 250㎍ 항-IL-3 단일클론항체(Southern Biotech)/마우스 또는 PBS로 처치하였다. 도 1에서 보이는 것과 같이, 항-IL-3 처치군에서 질병의 심한 정도가 억제 되었다.

이 실험에서 대조군 마우스에서 빠르게 도달한 안정기(plateau)와 함께 매우 심각한 질병의 매우 빠른 유도가 있었기 때문에 이 실험은 매우 고무적이다. 이 안정기(plateau)는 일반적으로 일주일 후에 도달한다.

상대적으로 급성인 마우스 CIA에 관한 문헌 자료는 중화 항-IL-3는 질환 유도 직후 필요하며, 질환 발병 이후, 늦어진다면 비효과적임을 나타낸다. 이러한 사실이 염증에서 IL-3가 반드시 타겟이 아닐 수도 있음을 의미하는 것은 아니다. 본 발명자들은 류마티스성 관절염과 같은 활동성 질환에 배경 염증/자가면역(background inflammatory/autoimmune events)이 어떤 작용을 하는지 및 이 활동이 동물모델에서 얼마나 긴밀하게 반영되는지를 아직 이해하지 못한다. 류마티스성 관절염과 같은 만성 상태에서도 "급성 발병(acute onset)" 질환을 나타내는 환자가 있을 수 있다. 또한, 예를 들면 류마티스성 관절염(RA)에서도 항-인터루킨-3 치료(anti-IL-3 therapy)가 도움될 수도 있는데, 이 질환이 질환 악화로 되돌아갈 수 있는 가능성을 제공하기도 하기 때문이다. 통상 사용되는 항-염증 글루코코르티코이드(anti-inflammatory glucocorticoids)가 전사 수준(transcriptional level)에서 염증 매개 유전자 발현을 하향-조절(down-regulating)하는 것으로 많이 알려져 있는데, 시험관 내에, 유발 자극에 뒤이어 투여하면 대용 염증 평가(surrogate inflammation assays)에서 작용하지 않는다는 것을 유념해야 한다.

실시예 2

본 발명자들은 CD14⁺ 단핵구에서 전 염증성 사이토카인으로서, 인터루킨-3 신호(IL-3 signalling)의 역할을 조사하였다. 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclaear cells, PBMC)는 레드 크로스 도너 버피 팩(Red cross donor buffy pack)으로부터 분리되었다. CD14+ 단핵구는 유세포 분석 평가 결과 약 80%의 세포가 CD14+ 인 것으로 음성 선택(negative selection)(MACS 분리)으로 정제되었다. 단핵구를 6cm IWAKI 당 ~1.8×10⁶ 세포의 농도(density of ~1.8×10⁶ cells per 6cm IWAKI; low adherence)로 TC 디시에 플레이팅하고 7일간 IL-3(3ng/ml), IL-3(3ng/ml) + IL-3-R 항체, IL-3(0.3ng/ml) 또는 IL-3(0.3ng/ml) + IL-3-R 항체와 RPMI +10%FCS에서 배양되었다. IL-3-R 항체는 각각 1㎍/ml 사용되었다. 4일째에 새로운 IL-3 와 IL-3-R 항체가 더 첨가되었다. 7일째에 세포를 제거하고 RNA 용해 버퍼에서 용해되기 전에 수를 세었다. 그 결과 IL-3 단핵구에 용량 의존적으로 전-생존 자극제(pro-survival stimulus)로 작용하고, 이 효과는 항-인터루킨-3-수용체 항체(anti-IL-3-R antibody)에 의해서 극복됨을 나타낸다(도 2). 그러므로 CD14+ 단핵구에서 IL-3 신호를 차단 또는 억제하는 것은 그 염증 장소(site of inflammation)에서의 재발과 축적을 예방함으로써 염증을 조절할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

실시예 3

두드러기(hives)로 알려진 심마진(urticaria)은 몇 cm에서 작게는 몇 mm의 크기로 나타나는 재발성 발진(recurrent wheals)으로 표시되는 염증 상태이다. 일반적으로 그 발진은 옅은 중앙부위와 함께 분홍색을 나타내고, 화끈거리거나 따금따금한 느낌(burning or prickly sensation)을 수반할 수 있다. 심마진은 어느 연령에서나 나타나며 생애의 어떤 시점에서 인구의 1~5%가 심마진을 보인다. 만성 심마진은 중증 아토피성 피부염(severe atopic dermatitis), 건선(psoriasis), 또는 여드름(acne) 환자와 비슷하게, 삶의 질에 커다란 영향을 미친다. 대부분의 만성 심마진은 특발성 질환(idiopathic in nature)이지만, 많은 경우에(35~505) 높은 친화성 IgE 수용체(FcεR1) 또는 IgE 자체에 대한 자가-항체(auto-antibodies)가 나타나는 것이 점점 명확해 지고 있는데, 이것은 만성 심마진이 자가 면역 질환일 수도 있음을 암시하는 것이다. 비만 세포(mast cells)와 호염구(basophils)가 심마진 환자에서 FcεR1을 발현하고, 자가-항체에 반응하는 것이 주 형태이다. 활성화되면 비만세포와 호염구는 많은 양의 히스타민(histamine)을 방출하는데, 이것이 심마진 발진을 형성시키는 주요 작동 분자(main effector molecule)이다. 비만세포와 호염구는 IL-3 수용체를 발현시키며,IL-3는 IgE 와 C5a와 같은 유발인자에 노출되면 히스타민과 같은 작동 분자의 수준을 증가시키도록 할 수 있다.

7개의 심마진 환자 시료에서 얻은 PBMC와 4개의 정상 공여자 시료를 분석하였다. IL-3 은 인간 호염구를 생체 외에서 활성화 할 수 있고(도 3), 중화 항-IL-3R 알파 항체(CSL360- 국제공개번호 WO 2009/070844 참조)는 IL-3 유도 인간 호염구 활성화를 억제할 수 있다(도 4). ADCC 최적화 항-IL-3 수용체 알파 항체(ADCC optimized anti-IL-3Rα antibody, CSL362-국제공개번호 WO 2009/070844 에 기재된 바와 같이 인간화되고 친화성 성숙된 항-CD123mAB 168-26의 아푸코실화 변이제(afucosylated variant))는 시간-의존적으로 PBMC로부터의 인간 호염구를 감소시킬 수 있다(도 5). 호염구가 완전히 또는 거의 완전히 제거되는 것은 CSL 362 첨가 후 24시간 이내에 3명의 독립적인 공여자에서 관찰되었다(도 6). NK 세포 활성은 CSL362 첨가 후 24시간 이내에 관찰되었는데, 이것은 호염구 제거가 NK세포 매개 ADCC에 의한 것임을 암시하는 것이다(도 7).

실시예 4

본 실시예는 항-IL-3 수용체 항체가 생체 내에서 호염구의 활성 숫자와 수준에도 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다. 암컷 BALB/c 마우스(생후 10~12주)에, 항-IL-3R 알파 항체 1C2(실시예 5 참조), 대조군 마우스에 IgG2a를 꼬리정맥(tail vein) 주사하였다. CD200R3를 목표로 하고 특별히 마우스 호염구를 제거하는 것으로 알려진 상용항체(commercial antibody Ba 103과 대조항체 랫드) IgG2b를 대조군으로서 같이 검사하였다. 1C2에 18㎍을 투여한 것을 제외하고는, 모든 항체에 200㎕의 PBS에 들어있는 30㎍의 양으로 주사하였다. 1일 후에, 말초 혈액과 복막 세포(peritoneal cells)를 분리하고 세포의 단일 현탁액(single suspension of cells)을 준비하였다. 세포들의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 항-FcγRⅡ-Ⅲ 로 전-배양 하였다. 세포들은 호염구(FcεRIα⁺ CD49b⁺)를 동정하기 위하여 세포를 FITC-컨쥬게이트된 항-FcεRIα(FITC-conjugated anti FcεRIα) 및 PE-컨쥬게이트된 항-CD496 단일클론항체(PE-conjugated anti-CD496 monoclonal antibody)로 염색하였다. FcεRIα 및 CD496 항체와 아이소타입 대조군(isotype control)으로서 FITC-햄스터 IgG 및 PE-랫드 IgM을 각각 사용하였다. 데브리스(debris)를 포워드 스캐터(Foward scatter, FSC) 대(versus) 사이드 스캐터(side scatter, SSC)를 사용하여 모으고, 사멸 세포(dead cells)는 7-아미노-악티노마이신 D(7-amino-actinoomycin D; 7AAD) 염색으로 판별하였다. 염색된 세포는 FACSCanto^TM(BD Biosciences)로 분석하였고 자료는 플로우조 소프트웨어(FlowJo software)로 분석하였다.

18㎍ 항-IL-3 수용체 알파 항체 1C2를 단일 정맥 내 주사하면, 말초 혈액 내에서 호염구 빈도(basophils frequency)가 같은 형태 대조군 처치 마우스(isotype control(mouse IgG2a)-treated mice)에서 약 23%수준으로 현저한 감소를 유발한다(도 8). 이러한 제거 효능(depletion efficacy)은 30㎍ Ba103 투여 결과와 비교된다. 호염구에 대한 효과와는 달리, 항-IL-3Rα 또는 Ba103 항체로 처치한 마우스에서 복막 비만세포의 빈도에서는 유의적인 감소가 나타나지 않았다. 비만세포에 대한 Ba103 항체 소견은 오바타등(Obata and colleagues)의 연구와 일치한다.

실시예 5

1) 마우스 IL -3 수용체 특이적 단일클론 항체( murin IL -3 receptor specific monoclonal antibody )의 생성

마우스 IL-3 수용체 알파(mIL-3Rα)에 특이적으로 인식되는 항체서열은 필라멘트형 박테리오파지 M13(filamentous bacteriophage M13; Dyax Corp.)의 표면의 gⅢ 단백질에 융합된 Fab 단편(fragments)으로 표시되는 인간 항체 서열의 라이브러리로부터 분리하였다. 항-mIL-3Rα 파지 디스플레이 항체 단편(anti-mIL-3Rα phage-displayed antibody fragments)는, R&D 시스템 Inc. 로부터 공급받은 짧은 폴리펩타이드 링커(서열 : IEGRID)를 가지는 인간 IgG1(Fc 단편)의 잔기(residues) 100-330에 용해된 마우스 IL-3 수용체 알파의 아미노산 17-331로 구성된 상업적으로 얻을 수 있는 정제된 재조합 융합 단백질로 파지 라이브러리(phage library)의 배양에 의하여 분리하였다. 특이적-결합 파지는 표준 방법에 의하여 배양하고 개별 클론(individual clone)으로 분리하였다. 개별 클론(individual clone)은 최초 타겟(original target, mIL-3Rα-Fc fusion) 및 C-말단 헥사-히스티딘 태그(C-terminal hexa-histidine tag; msIL-3R-6His)를 가지는 잔기(residues) 1-331로 표시되는 mIL-3Rα의 세포외 도메인(extracellular domain)에 특이적으로 결합하는지 시험하였다. 이들 타겟에 결합하고 대조군에는 결합하지 않는 파지 클론(phage clones)를 이후의 분석을 위해 선별하였다. 인코딩된 항체(encoded antibody)의 두 개의 폴리펩타이드 사슬을 DNA 시퀀싱(sequencing)하여 유일한 클론(unique clones)을 동정하였고, 마우스 IL-3 수용체 헥사 히스티딘(mIL-3R-6His)에 대한 이들 클론의 결합 친화성은 경쟁적 ELISA로 정량화 하였다. 이후의 분석을 위하여 허용가능한 친화성을 가진 클론을 혼성 항체(인간 가변 부위 및 마우스 IgG2a/카파(kappa) 불변 부위)로 재-조작과 발현(re-engineering and expression)을 위하여 선별하였다.

2)일시적 발현을 위한 포유동물 발현 벡터 제조( Mammalian expression vector construction for transient expression )

마우스 IL-3 수용체 알파 특이적 항체에 대한 중사슬 및 경사슬 가변 부위는 표준 분자 생물학 방법(standard molecular biology techniques)를 사용하는 파지미드 벡터(phagemid vector)로부터 PCT 증폭하였다. 중사슬 가변 부위(heavy chain variable region)는 그 후 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1(+)-mIgG2a로 클론하였는데, 이것은 마우스 IgG2a 불변 부위 및 말단 정지 코돈(murine IgG2a constant region and a terminal stop codon)을 포함하도록 변형된 pcDNA 3.1(+) 발현 벡터(Invitrogen)에 근거한 것이다. 경사슬 가변 부위(light chian variable region)는 발현 벡터 pcDNA3.1(+)-mκ로 클론하였는데, 이것은 마우스 카파 불변 부위(murine Kappa constant region)를 포함하도록 변형된 pcDNA 3.1(+) 발현 벡터에 근거한 것이다. 발현벡터는 또한 코작 번역 개시 서열(Kozak translation initiation sequence), ATG 코돈 및 적절한 신호 펩타이드(signal peptide)를 포함한다.

3) 세포 배양( cell culture )

무-혈청 현탁액 적응 293 T 세포(serum-free suspension adapted 293-T cells)은, Genechoice Inc. 로부터 얻었다. 세포들은 페니실린/스트렙토마이신/펑긴존 시약(penicillin/streptomycin/fungizone reagent; Invitrogen)이 보충된 프리스타일 발현 배지(Freestyle^TM Expression Medium; Invitrogen) 내에서 배양되었다. 형질전환 시키기 전에 세포들은 8% 이산화탄소 환경에서 37℃ 가습 배양기에서 보존하였다.

4) 일시적 형질감염( Transient Transfection )

293-T 세포를 사용하는 항-마우스 IL-3R 알파 발현 플라스미드의 일시적 형질감염은 제조사의 지시에 따라서 293 펙틴 트랜스펙션 시약(293 fectin transfection reagent; Invitrogen)을 사용하여 수행하였다. 경사슬 및 중사슬 발현 벡터는 293-T 세포와 결합하고 공-형질감염(co-transfected)하였다. 세포들(1,000ml)은 1ml당 1×10⁶개의 살아있는 세포의 최종 농도로 형질감염시켰고 Cellbag 2L(Wave Biotech/GE Healthcare)에서 2/10 Wave Bioreactor system 2/10 또는 20/50(Wave Biotech/GE Healthcare)로 8% 이산화탄소, 37℃ 환경에서 5일간 배양하였다. 배양 조건은 8°각도로 1분당 35락(35rocks per minute)이었다. Pluronic^?F-68(invitrogen)을 0.1%v/v 최종농도로 형질감염 후(post-transfection) 4시간에 첨가하였다. 형질감염 후 24시간 이내에 배양세포 0.5% v/v의 최종 농도로 트립토 N1(Tryptone N1)(Organotechnie, France)을 보충하였다. 배양 세포 상등액은 2500rpm으로 원심분리하여 배양세포 상등액을 얻었고, 정제 전에 0.45μM 필터(Nalgene)에 통과시켰다.

5) 단백질 발현 분석( Analysis of protein expression )

5일 후 배양 상등액 20㎕를 4-20% 트리스-글리신 SDS 폴리아크릴아마이드겔(Tris-Glycine SDS polyacrylamide gel)에서 전기영동하였고 항체를 쿠마시 블루시약(coomassie blue reagent)으로 염색하였다.

6) 항체 정제( antibody purification )

항-mIL-3Rα항체는 4℃에서 프로테인 A 친화성 크로마토그라피(protein A affinity chromatography)를 사용하여 정제하였는데, 여기에는 MabSelect 레진(5ml, GE Healthcare, UK)가 30ml 폴리프렙 엠티 컬럼(poly-prep empty column; Bio-Rad, CA)에 넣어져 있다. 레진(resin)은 먼저 컬럼의 10배 부피의 무발열성(pyrogen free) GIBCO 증류수(Distelled water)(Invitrogen, CA)를 사용하여 에탄올(storage ethanol)을 제거하기 위해 세척한 후, 5 컬럼 부피의 무 발열성 포스페이트 버퍼 생리 식염수(phosphate buffered saline; PBS, GIBCO PBS, Invitrogen, CA)로 평형화 시켰다. 여과된 조건의 세포 배양 배지 1L를 레진 위에 중력 피드(gravity feed) 방법으로 로딩하였다. 그 후 비특이적 단백질을 제거하기 위하여 컬럼 5배 부피의 무 발열성(pyrogen free) PBS로 레진을 세척하였다. 결합된 항체는 컬럼의 두 배 부피의 1M 글리신 pH 2.8(0.1M glycine pH 2.8;Sigma, MO)로부터 용출하여 컬럼의 0.2배 부피의 2M Tris-HCL pH 8.0(Sigma,MO)로 중화하였다. 용출된 항체(eluted antibody)는 5L PBS에 대한 12ml 컷오프 3.5kD 슬라이드 A-라이저카세트 MW(Slide A-Lyzer cassette MW cutoff 3.5kD, Pierce, IL)에서 4℃에서 18시간 투석되었다. 항체 농도는 분광측정기(Ultraspec 300; GE healthcare, UK)를 사용하여 280nm에서 흡광도를 측정하였다. 항체의 순도는 SDS-PAGE로 분석하였는데 이것의 제조사의 지시에 따라서 감소 샘플 버퍼(reducing sample buffer, Invitrogen, CA)에 있는 2㎍ 단백질을 Novex 10-20% 트리스 글라이신 겔(Tris glycine gel, Invitrogen, CA)에 로딩하고, 쿠마시 염색약으로 시각화하기 전에 트리스 글라이신 SDS-진행 버퍼(Tris Glycine SDS running buffer)를 사용하여 X cell SureLock Mini-Cell(Invitrogen, CA)에 일정 전압 150V를 90분간 가하였다.

Claims

인터루킨-3 신호 현상(Interleukin-3 signalling events)을 차단 또는 억제하는 약제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 만성 염증 상태(chronic inflammatory condition) 치료 방법.
제 1항에 있어서, 상기 약제는 인터루킨-3(IL-3)/인터루킨-3수용체(Interleukin-3 receptor, IL-3R) 또는 인터루킨-3(IL-3)/인터루킨-3 수용체 알파(IL-3R alpha) 상호작용을 차단 또는 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 약제는 선택적으로 IL-3 또는 IL-3R, IL-3R 알파 또는 IL-3R 베타(IL-3R beta)와 결합하는 항원 결합 분자(antigen binding molecule)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 항원 결합 분자(antigen binding molecule)는 단일클론항체(monoclonal antibody), 또는 항원 결합 및/또는 가변-도메인(vairble-domain)을 포함하는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 IL-3에 선택적으로 결합하는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 IL-3R 알파에 선택적으로 결합하는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 약제는 항-세포 모이어티(anti-cellular moiety)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 항-세포 모이어티는 α-방출제(α-emitter), 특히 211 아스타틴(211 Astatine), β-방출제(β-emitter), 특히 131 아이오딘(131 Iodine) 및 아우거 방출제(Auger emitter)로 이루어진 군으로부터 선택된 방사성 동위원소(radioisotope)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 약제는 IL-3R에 결합하지만 IL-3 신호 활성을 유도하지 않는 IL-3 돌연변이(IL-3 mutein)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 약제는 IL-3에 결합할 수 있는 가용성 수용체(soluble receptor)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 약제는 IL-3R 알파의 세포외 부분(extracellular portion) 또는 IL-3R 베타의 세포외 부분에 융합된 IL-3R 알파의 세포외 부분을 포함하는 융합 폴리펩타이드(fusion polypeptide)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만성 염증 상태(chronic inflammatory condition)는 관절염, 특히 염증성 관절염인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 만성 염증 상태는 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis, RA)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
환자에서 만성 염증 상태를 치료하기 위한 IL-3 신호 현상(IL-3 signalling events)을 차단 또는 억제하는 약제의 용도 또는 약제의 제조를 위한 용도.
제 15항에 있어서, 상기 약제는 환자에서 인터루킨-3(IL-3)/인터루킨-3수용체(Interleukin-3 receptor, IL-3R) 또는 인터루킨-3(IL-3)/인터루킨-3 수용체 알파(IL-3R alpha) 상호작용을 차단 또는 억제하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 약제는 선택적으로 IL-3 또는 IL-3R, IL-3R 알파 또는 IL-3R 베타(IL-3R beta)와 결합하는 항원 결합 분자(antigen binding molecule)인 것을 특징으로 하는 용도.
제 17항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 단일클론항체(monoclonal antibody), 또는 항원 결합 및/또는 가변-도메인(vairble-domain)을 포함하는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 용도.
제 18항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 IL-3에 선택적으로 결합하는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 용도.
제 18항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 IL-3R 알파에 선택적으로 결합하는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 용도.
제 15항에 있어서, 상기 약제는 항-세포 모이어티(anti-cellular moiety)를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 21항에 있어서, 상기 항-세포 모이어티는 α-방출제(α-emitter), 특히 211 아스타틴(211 Astatine), β-방출제(β-emitter), 특히 131 아이오딘(131 Iodine) 및 아우거 방출제(Auger emitter)로 이루어진 군으로부터 선택된 방사성 동위원소(radioisotope)인 것을 특징으로 하는 용도.
제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 약제는 IL-3R에 결합하지만 IL-3 신호 활성을 유도하지 않는 IL-3 돌연변이(IL-3 mutein)인 것을 특징으로 하는 용도.
제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 약제는 IL-3에 결합할 수 있는 가용성 수용체(soluble receptor)인 것을 특징으로 하는 용도.
제 24항에 있어서, 상기 약제는 IL-3R 알파의 세포외 부분(extracellular portion) 또는 IL-3R 베타의 세포외 부분에 융합된 IL-3R 알파의 세포외 부분을 포함하는 융합 폴리펩타이드(fusion polypeptide)인 것을 특징으로 하는 용도.
환자에서 IL-3 신호 현상(IL-3 signalling events)을 차단 또는 억제하는 만성 염증 상태 치료용 약제.
제 26항에 있어서, 상기 약제는 환자에서 인터루킨-3(IL-3)/인터루킨-3수용체(Interleukin-3 receptor, IL-3R) 또는 인터루킨-3(IL-3)/인터루킨-3 수용체 알파(IL-3R alpha) 상호작용을 차단 또는 억제하는 것을 특징으로 하는 만성 염증 상태 치료용 약제.
제 26항 또는 제 27항에 있어서, 상기 약제는 선택적으로 IL-3 또는 IL-3R, IL-3R 알파 또는 IL-3R 베타(IL-3R beta)와 결합하는 항원 결합 분자(antigen binding molecule)인 것을 특징으로 하는 만성 염증 상태 치료용 약제.
제 28항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 단일클론항체(monoclonal antibody), 또는 항원 결합 및/또는 가변-도메인(vairble-domain)을 포함하는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 만성 염증 상태 치료용 약제.
제 29항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 IL-3에 선택적으로 결합하는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 만성 염증 상태 치료용 약제.
제 29항에 있어서, 상기 항원 결합 분자는 IL-3R 알파에 선택적으로 결합하는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 만성 염증 상태 치료용 약제.
제 26항에 있어서, 상기 약제는 항-세포 모이어티(anti-cellular moiety)를 포함하는 것을 특징으로 하는 만성 염증 상태 치료용 약제.
제 32항에 있어서, 상기 항-세포 모이어티는 α-방출제(α-emitter), 특히 211 아스타틴(211 Astatine), β-방출제(β-emitter), 특히 131 아이오딘(131 Iodine) 및 아우거 방출제(Auger emitter)로 이루어진 군으로부터 선택된 방사성 동위원소(radioisotope)인 것을 특징으로 하는 만성 염증 상태 치료용 약제.
제 26항에 있어서, 상기 약제는 IL-3R에 결합하지만 IL-3 신호 활성을 유도하지 않는 IL-3 돌연변이(IL-3 mutein)인 것을 특징으로 하는 만성 염증 상태 치료용 약제.
제 26항 또는 제 27항에 있어서, 상기 약제는 IL-3에 결합할 수 있는 가용성 수용체(soluble receptor)인 것을 특징으로 하는 만성 염증 상태 치료용 약제.
제 35항에 있어서, 상기 약제는 IL-3R 알파의 세포외 부분(extracellular portion) 또는 IL-3R 베타의 세포외 부분에 융합된 IL-3R 알파의 세포외 부분을 포함하는 융합 폴리펩타이드(fusion polypeptide)인 것을 특징으로 하는 만성 염증 상태 치료용 약제.
하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제와 함께 제 26항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 따른 약제를 포함하는 약학적 조성물.
(ⅰ)제 26항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 따른 약제, 및 선택적으로 (ⅱ) 환자에서 만성 염증 상태 치료 방법에 따른 상기 약제 사용 지시서를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트(kit).