JP2010503413A - Pcr阻害物質の存在下におけるdna増幅のためのtaqポリメラーゼ変異体酵素の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は2006年9月14日出願の米国特許仮出願第60/825,692号の優先権を主張し、その仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願の開示の一部である配列表は、コンピューターにより読み取り可能な形態を含み、EFS-Webを介して電子的に提出したものであり、本発明のヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列を含む。配列表の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は一般に、標準的およびリアルタイムPCRにおける遺伝子の検出に関する。
色素耐性;色素および血液耐性;色素および土壌耐性;およびまたは色素、血液および土壌耐性の変異体ポリメラーゼ酵素を利用するサンプルの簡便なリアルタイムPCR分析法を本明細書において開示する。
本発明は少なくとも部分的に、PCR阻害物質に対して耐性の変異体DNAポリメラーゼ酵素の発見に基づいている。様々な実施形態において、変異体DNAポリメラーゼ酵素は、例えば、血液、土壌および/または高濃度の色素(例えば、リアルタイムPCRにおいて用いる蛍光色素)に存在するものを含むPCR阻害物質に対して耐性である。変異体DNAポリメラーゼ酵素のいくつかの実施形態は3つの全ての特性を示す;よって、上昇した濃度のこれらの阻害物質のいずれか、またはそれらの組み合わせの存在下において、それらの酵素は核酸分子を増幅することができる。血液、土壌および/または色素耐性の変異体ポリメラーゼ酵素を利用する、血液および土壌含有サンプルの標準的およびリアルタイムPCR分析法を本明細書において提供する。
本発明の一局面は、ポリメラーゼ変異体(例えば、変異体Taq DNAポリメラーゼまたは変異体Klentaq DNAポリメラーゼ)を用いることにより、リアルタイムPCR(qPCR)に用いる色素(例えば蛍光色素)の阻害作用を克服し、qPCRにおける遺伝子検出を改善する方法を提供する。色素耐性は、当分野において既知の、および本明細書に記載のアッセイによって容易に測定することができる(例えば、図1、2および8を参照のこと)。
血液耐性ポリメラーゼは、その用語を本明細書において用いる場合、一般に、反応混合物中に約1%〜約25%の全血(体積/体積)を含有するPCRアッセイにおいて、増幅活性を示し得る。例えば、全血は、明細書に記載の血液耐性DNAポリメラーゼを含むPCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%または25%を構成し得る。対照的に、完全長Taq酵素(配列番号4)は通常、反応混合物中約0.004%〜約0.2%の全血(体積/体積)の血液濃度範囲において完全に阻害される。
本明細書に記載の変異体DNAポリメラーゼの様々な実施形態は、土壌および土壌抽出物に見られる阻害物質に対して耐性である。かかる土壌および土壌抽出物における阻害物質には、限定しないが、以下が含まれる:フミン酸、フルボ酸、多糖類および金属イオン。土壌耐性ポリメラーゼは、その用語を本明細書において用いる場合、一般に、反応混合物中に約1%〜約90%の土壌または土壌抽出物(体積/体積)を含有するPCRアッセイにおいて増幅活性を示し得る。例えば、土壌または土壌抽出物は、本明細書に記載の土壌耐性DNAポリメラーゼを含むPCRアッセイ混合物の全体積の約85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%または1%以下を構成し得る。アッセイ混合物中の土壌または土壌抽出物の量は、土壌または土壌抽出物における阻害物質のレベルに依拠し得る。一般に、本明細書に記載の変異体DNAポリメラーゼは、従来のDNAポリメラーゼと比較して、少なくとも1桁高い濃度のこれらの阻害物質に耐えることができる。サンプル中の阻害物質のレベルを測定するアッセイは当分野において既知である。土壌耐性は本明細書に記載のアッセイによって容易に測定することができる。
好ましくは、変異体ポリメラーゼ酵素は、例えば、色素および血液および/または土壌を含有するPCR反応において起こり得るような、血液および色素(例えば蛍光色素)の両阻害;土壌および色素の両阻害;または血液、土壌および色素の阻害に対して耐性である。さらにより好ましくは、変異体酵素、血液および蛍光色素の組み合わせにより、これまで不可能であった増幅および最適な検出が可能となる相乗効果が得られる。変異体酵素の好ましい二重の阻害耐性の表現型(つまり、血液および色素耐性)により、血液を含有するサンプルのリアルタイム検出が可能になる。さらに、血液の存在下において、血液および色素耐性変異体ポリメラーゼは、より高い初期濃度の色素に耐えることができる(例えば、SYBR Green色素において約64X〜約256Xの耐性)。
本明細書に記載のPCR阻害物質に耐性のDNAポリメラーゼは、当業者に既知の様々なポリメラーゼ反応において用いることができる(例えば、Dorak (2006)「Real-Time PCR(リアルタイムPCR)」、Taylor&Francis、ISBN 041537734X;Bustin編(2004)、「A-Z of Quantitative PCR(定量的PCRのAからZ)」、International University Line、ISBN 0963681788を参照のこと)。例えば、本発明の耐性ポリメラーゼは、PCR反応、プライマー伸長反応などにおいて利用することができる。本明細書に記載の変異体ポリメラーゼ酵素の使用は一般に、例えば、より多い量の蛍光色素を加える以外には、典型的なプロトコールに、全くまたは実質的な変更を必要としない。よって、本明細書に記載の方法は、精製されたテンプレート核酸およびプライマーを用いる、あらゆる標準的リアルタイムPCRにおいて、遺伝子の検出を改善するのに適用することができる。
本発明に有用な変異体酵素の例には、限定しないが、以下が含まれる:KlenTaq-10(配列番号1)(米国特許出願公開第2006/0084074号明細書に記載されている;参照によりその全体が本明細書に特に組み込まれる)および完全長Taq酵素変異体、FLAC-22(配列番号2)、ならびに、以下に記載のような、これらの参照配列の変異体ポリペプチド。
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに説明するために提供する。以下の実施例に開示される技術は、本発明者らが本発明の実施において良好に機能するものであることを見出した解決法を代表するものであり、よってその実施の様式の例を構成すると考え得ることが、当業者であれば理解できるはずである。しかしながら、当業者であれば、本発明の開示を踏まえて、開示する特定の実施形態に多くの改変を行うことができること、そしてなおも本発明の精神および範囲を逸脱せずに同種のまたは同様の結果を得ることができることが、理解できるはずである。用いられる動詞の時制にかかわらず、実施例に記載のいずれかの方法が実際に実行されても、されなくてもよい、または実施例に記載のいずれかの組成物が実際に形成されても、されなくてもよいと解されたい。
Claims (39)
- リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において標的核酸を増幅する方法であって、以下の工程を含む方法:
以下を含むアッセイ混合物を作製する工程:
標的核酸を含むサンプル;
標的核酸に特異的なプライマー;
緩衝液;
少なくとも1つの色素;および
PCR阻害物質に耐性の少なくとも1つのポリメラーゼ;
ここで、該少なくとも1つのポリメラーゼは色素耐性ポリメラーゼである;ならびに
リアルタイムPCRにおいてアッセイ混合物中の標的核酸を増幅する工程。 - 少なくとも1つのポリメラーゼが、色素耐性および血液耐性ポリメラーゼである、請求項1の方法。
- 少なくとも1つのポリメラーゼが、色素耐性および土壌耐性ポリメラーゼである、請求項1の方法。
- 少なくとも1つのポリメラーゼが、色素耐性、血液耐性および土壌耐性ポリメラーゼである、請求項1の方法。
- 少なくとも1つのポリメラーゼが、配列番号1を含むポリペプチド配列、または配列番号1に対して少なくとも95%の同一性を有するポリペプチド配列、を有する、請求項1の方法。
- 少なくとも1つのポリメラーゼが、配列番号1に対して少なくとも99%の同一性を有するポリペプチド配列を有する、請求項5の方法。
- 配列番号1に対して少なくとも99%の同一性を有するポリペプチド配列を有する少なくとも1つのポリメラーゼが、626位、707位および708位からなる群から選択されるアミノ酸残基の位置において少なくとも1つのアミノ酸置換を有する、請求項6の方法。
- 少なくとも1つのポリメラーゼが、配列番号2を含むポリペプチド配列、または配列番号1に対して少なくとも95%の同一性を有するポリペプチド配列、を有する、請求項1の方法。
- 少なくとも1つのポリメラーゼが、配列番号2に対して少なくとも99%の同一性を有するポリペプチド配列を有する、請求項8の方法。
- 配列番号2に対して少なくとも99%の同一性を有するポリペプチド配列を有する少なくとも1つのポリメラーゼが、626位、707位および708位からなる群から選択されるアミノ酸残基の位置において少なくとも1つのアミノ酸置換を有する、請求項9の方法。
- 前記サンプルが全血をさらに含む、請求項1〜10のいずれかの方法。
- 全血が、PCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約1%〜約25%である、請求項11の方法。
- 全血が、PCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約3%〜約20%である、請求項12の方法。
- 全血が、PCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約5%〜約15%である、請求項13の方法。
- 前記サンプルが土壌または土壌抽出物をさらに含む、請求項1〜14のいずれかの方法。
- 土壌または土壌抽出物が、PCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約1%〜約90%である、請求項15の方法。
- 土壌または土壌抽出物がフミン酸を含み、反応体積50μLにつきフミン酸が約25ng以下となるのに相当する量にて土壌または土壌抽出物がアッセイ混合物中に存在する、請求項16の方法。
- 反応体積50μLにつきフミン酸が約20ng以下となるのに相当する量にて土壌または土壌抽出物がアッセイ混合物中に存在する、請求項17の方法。
- 反応体積50μLにつきフミン酸が約10ng以下となるのに相当する量にて土壌または土壌抽出物がアッセイ混合物中に存在する、請求項18の方法。
- 前記少なくとも1つの色素が少なくとも1つの蛍光色素である、請求項1〜19のいずれかの方法。
- 少なくとも1つの蛍光色素が、SYBR Green、臭化エチジウム、PICO、TOTO、YOYOまたはLC Greenからなる群から選択される、請求項20の方法。
- 少なくとも1つの蛍光色素がSYBR Greenである、請求項21の方法。
- 色素が少なくとも約0.5X〜約256XにてPCRアッセイ混合物中に存在し、ここでXはPCRにおいて用いる濃度についての生産者による単位である、請求項1〜22のいずれかの方法。
- 色素が少なくとも約0.5X〜約128XにてPCRアッセイ混合物中に存在する、請求項23の方法。
- 色素が少なくとも約0.5X〜約64XにてPCRアッセイ混合物中に存在する、請求項24の方法。
- アッセイ混合物がベタインをさらに含む、請求項1〜25のいずれかの方法。
- 配列番号2のポリペプチド配列を含む単離ポリペプチド。
- 配列番号2に対して少なくとも95%の同一性を有するポリペプチド配列を含む単離ポリペプチドであって、色素、土壌および血液からなる群から選択される、またはそれらの組み合わせであるPCR阻害物質に耐性である単離ポリペプチド配列。
- ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において標的核酸を増幅する方法であって、以下の工程を含む方法:
以下を含むアッセイ混合物を作製する工程:
標的核酸を含むサンプル;
標的核酸に特異的なプライマー;
緩衝液;および
少なくとも1つのポリメラーゼ;
ここで、該少なくとも1つのポリメラーゼは請求項27〜28のいずれかの単離ポリペプチドである。 - サンプルが全血をさらに含む、請求項29の方法。
- 全血がPCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約1%〜約25%である、請求項30の方法。
- 全血がPCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約3%〜約20%である、請求項31の方法。
- 全血がPCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約5%〜約15%である、請求項32の方法。
- 前記サンプルが土壌または土壌抽出物をさらに含む、請求項29〜33のいずれかの方法。
- 土壌または土壌抽出物がPCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約1%〜約90%である、請求項34の方法。
- 土壌または土壌抽出物がフミン酸を含み、反応体積50μLにつきフミン酸が約25ng以下となるのに相当する量にて土壌または土壌抽出物がアッセイ混合物中に存在する、請求項35の方法。
- 反応体積50μLにつきフミン酸が約20ng以下となるのに相当する量にて土壌または土壌抽出物がアッセイ混合物中に存在する、請求項36の方法。
- 反応体積50μLにつきフミン酸が約10ng以下となるのに相当する量にて土壌または土壌抽出物がアッセイ混合物中に存在する、請求項37の方法。
- アッセイ混合物がベタインをさらに含む、請求項29〜38のいずれかの方法。
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