JP2014054254A - Ｐｃｒ阻害物質の存在下におけるｄｎａ増幅のためのｔａｑポリメラーゼ変異体酵素の使用 - Google Patents

Ｐｃｒ阻害物質の存在下におけるｄｎａ増幅のためのｔａｑポリメラーゼ変異体酵素の使用 Download PDF

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Abstract

【課題】ＰＣＲ阻害物質に耐性のＤＮＡポリメラーゼ、サンプル中に血液、土壌が存在するかあるいは存在しないかの両方の場合における標準的およびリアルタイムＰＣＲによる遺伝子検出にそれらポリメラーゼを使用する方法、ならびに色素の存在下におけるリアルタイムアッセイにそれらポリメラーゼを使用する方法の提供。
【解決手段】（ｉ）特定の配列からなるポリペプチド配列または、（ｉｉ）７０８位にアスパラギン（Ｎ）を含むそのポリペプチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、色素、土壌および血液からなる群から選択される、またはそれらの組み合わせであるＰＣＲ阻害物質に耐性である単離ポリペプチド、ならびに当該単離ポリペプチドであるポリメラーゼを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって標的核酸を増幅する方法。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は2006年9月14日出願の米国特許仮出願第60/825,692号の優先権を主張し、その仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
コンパクトディスクによる提出物の参照による組み込み
本出願の開示の一部である配列表は、コンピューターにより読み取り可能な形態を含み、EFS-Webを介して電子的に提出したものであり、本発明のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含む。配列表の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は一般に、標準的およびリアルタイムPCRにおける遺伝子の検出に関する。
標準的およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）アッセイは、多くの一般的なタイプのサンプルならびにPCRアッセイ自体の成分に見られる阻害物質により制限される。PCR阻害物質の例には、PCRに用いられる市販の色素に見られるもの、ならびに血液および土壌に見られるものが含まれる。
一般に用いられる蛍光色素、例えば、SYBR Greenは、約0.25〜1Xより高い濃度にて、Taqポリメラーゼ（GenBankアクセッション番号J04639；配列番号４）を有意に阻害することができる。色素によるTaqポリメラーゼのこの阻害は、感度および生成物特異性に制限を課し、色素依存性の偽陰性結果を引き起こし得る（例えば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照のこと）。
重要な臨床、診断および法医学における血液検体のPCRへの適用において、DNA検出の成功および感度は、Taqポリメラーゼの血液性阻害物質、例えば、ヘム、IgG画分および他の血液成分の存在によって制限される。単純な（plain）Taq酵素は、0.004％〜0.2％の血液（体積／体積）にて完全に阻害され得る（例えば、非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７を参照のこと）。この阻害を克服するために、最近は、費用が高くさらなる労働が必要な方法によってPCRの前に血液からDNAを精製している。にもかかわらず、B型肝炎の血液試験において報告されているように、血液からDNAを精製した後でさえも、痕跡量のPCR阻害物質によって14％という高さの偽陰性結果が生じるので（非特許文献８）、この阻害はいまだヒト血液のPCRに基づく多くの試験における重大な問題である。
土壌中の微生物の高感度で正確なPCR検出は、例えば、特定の農学的目的、感染症の制御およびバイオテロリズムに関する病原体試験において、必要である。土壌サンプルからの全DNAの直接抽出は、PCR分析に対する最も強力な土壌性阻害物質として知られるフミン酸の共抽出をもたらす。フミン質は、有機物が腐敗する間に産生される部分的に特徴決定されたポリフェノールの混合物を表す。他の阻害性成分には、フルボ酸、多糖類および金属イオンなどがあり、土壌サンプルに様々な濃度で存在し得る（例えば、非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２を参照のこと）。
土壌サンプルにおける一般的な技術的問題は、様々な阻害性物質の濃度が、土壌起源によって非常に多様であることであり、これによって一貫性のない結果が生じる可能性がある。この事実はPCR前にサンプルを処理する標準DNA精製プロトコールの開発をかなり困難にしている。血液とは異なり、粗製の土壌抽出物は、リアルタイムPCRにおいて、比較的少ししか、または全く蛍光消光作用を示さない。
特許文献１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、Taq DNAポリメラーゼの血液耐性変異体を記載しており、これは、標準的な、リアルタイムでないPCRにおいて血液中にてDNA標的を直接増幅するのに用いることができる。既存のプロトコールとは異なり、この方法はPCR前にDNA精製工程を必要とせず、よって重要な臨床血液検査の時間や費用が減少する。今日のPCR分析、特に臨床および法医学的分析は、リアルタイムPCRプロトコールの利用が増加しており、データの正確な定量化が可能となっている。しかしながら、血液はリアルタイムPCRにおいて検出された蛍光に対して強い消光作用を有し、かかる問題は以前はより高い蛍光色素濃度を用いることにより解決されている。
米国特許出願第11/005,559号
Monis et al. (2005) Anal Biochem 340, 24-34 Stubner (2002) J Microbiol Methods 50, 155-64 Nath et al. (2000) J Biochem Biophys Methods 42, 15-29 Gundry et al. (2003) Clin.Chem.2003; 49:396-406 Al-Soud et al. (2000) J. Clin. Microbiol. 38, 4463-70 Al-Soud et al. (2000) J. Clin. Microbiol. 38, 345-50 Al-Soud et al. (1998) Environ. Microbiol. 64, 3748-53 Kramvis et al. (1996) J Clin Microbiology 34, 2731-2733 Tsai et al. (1992) Environ.Microbiol. 58, 2292-2295 Watson et al (2000) Can.J.Microbiol. 46, 633-642 Yeates et al. (1998) Biol. Proced. Online 1, 40-47 LaMontagne et al. (2001) Journal of Microbiological Methods 49, 255-264
よって、阻害物質に耐性のDNAポリメラーゼ、サンプル中に血液および土壌が存在するおよび存在しない場合の両方において標準的およびリアルタイムPCRによる遺伝子検出にそれらポリメラーゼを使用する方法、ならびに色素の存在下におけるリアルタイムアッセイにそれらポリメラーゼを使用する方法が必要である。
概要
色素耐性；色素および血液耐性；色素および土壌耐性；およびまたは色素、血液および土壌耐性の変異体ポリメラーゼ酵素を利用するサンプルの簡便なリアルタイムPCR分析法を本明細書において開示する。
他の目的および特徴は、部分的には明らかであろうし、また部分的には以下に示す。
本発明は少なくとも部分的に、PCR阻害物質に対して耐性の変異体DNAポリメラーゼ酵素の発見に基づいている。様々な実施形態において、変異体DNAポリメラーゼ酵素は、例えば、血液、土壌および／または高濃度の色素（例えば、リアルタイムPCRにおいて用いる蛍光色素）に存在するものを含むPCR阻害物質に対して耐性である。変異体DNAポリメラーゼ酵素のいくつかの実施形態は3つの全ての特性を示す；よって、上昇した濃度のこれらの阻害物質のいずれか、またはそれらの組み合わせの存在下において、それらの酵素は核酸分子を増幅することができる。血液、土壌および／または色素耐性の変異体ポリメラーゼ酵素を利用する、血液および土壌含有サンプルの標準的およびリアルタイムPCR分析法を本明細書において提供する。
本明細書に示すように、様々な市販のDNAポリメラーゼ酵素は、血液、および血液の強い蛍光消光作用を克服するのに必要な高濃度の蛍光色素による、反応の二重の阻害によって、血液含有PCRアッセイにおいて機能するのに失敗する。粗製の土壌含有サンプルの場合には、色素に対してそのような消光作用がなくとも、主に強力な土壌由来のPCR阻害物質によって、市販の酵素も機能するのに失敗する。リアルタイムPCRアッセイにおける大量の血液および／または土壌に適応する能力は、本発明の様々な局面の利益の１つであり、これにより低遺伝子コピー数の標的DNAを検出する確率が増大する。さらに、本明細書に記載の変異体DNAポリメラーゼ酵素によって、多くの場合、現在利用可能なあらゆる市販のPCR酵素のプロトコールにおいて要求されているPCR前のDNA精製工程を省くことができる。臨床用途において、これにより、発症早期における検出が可能になり、偽陰性の診断数を減少させることができる。
よって、本明細書に記載の色素、血液および／または土壌耐性変異体DNAポリメラーゼ酵素は、一般的な遺伝子の、ならびに粗製の血液または土壌抽出物を含むおよび含まない検体における臨床的および法医学的適用の、改善された、低コストの、素早い、高感度のPCR検出（リアルタイムPCR検出を含む）において貴重なツールであることを意味している。
当業者であれば、以下に記載する図面が例証のみを目的とするものであることを理解するであろう。図面は決して本出願の教示の範囲を限定することを意図していない。
図1は、2倍ずつ減少する7種の濃度のSYBR Greenの存在下において行った、0.6kbpセレウス菌（Bacillus cereus）標的DNAの、野生型KlenTaqおよび変異体KlenTaq 10ポリメラーゼによるPCR増幅結果を示す一連の画像およびグラフである。図1Aはゲル電気泳動分析である。図1Bは融解曲線分析である。方法論に関するさらなる詳細は実施例1に記載している。 図2は、2倍ずつ減少する7種の濃度のSYBR Greenの存在下において行った、0.6kbpセレウス菌標的DNAの、変異体FLAC-22および市販の酵素Fast StartによるPCR増幅結果を示す一連の画像およびグラフである。図2Aはゲル電気泳動分析である。図2Bは融解曲線分析である。方法論に関するさらなる詳細は実施例3に記載している。 図3は、非常に高濃度から減少する量のSYBRに加えて5および10％の血液の存在下における、外来性0.6kbpセレウス菌標的DNAの、野生型KlenTaqおよび変異体KlenTaq10ポリメラーゼによるPCR増幅結果を示す一連の画像およびグラフである。図3Aはゲル電気泳動分析である。図3Bは融解曲線分析である。方法論に関するさらなる詳細は実施例3に記載している。 図4は、一定して5％の血液（陽性対照を除く）および減少する量のSYBR greenの存在下における、外来性0.32kbp、16S微生物標的DNAの、FLAC-22およびFast Start Taqポリメラーゼによる、PCR増幅結果を示す一連の画像およびグラフである。図4Aはゲル電気泳動分析である。図4Bは融解曲線分析である。方法論に関するさらなる詳細は実施例4に記載している。 図5は、2倍ずつ減少する6種の濃度のSYBR greenの存在下における、FLAC-22、KlenTaq-10、Fast Start、Jump StartおよびAmpliTaq Gold Taqポリメラーゼによる、PCR増幅結果を示す一連の画像およびグラフである。図5Aはゲル電気泳動分析である。図5Bは融解曲線分析である。方法論に関するさらなる詳細は実施例5に記載している。 図6は、蛍光色素に対する血液の消光作用を補う高濃度のSYBR Greenを用いた、Klentaq-10変異体酵素による、ヒト血液中の炭疽菌ゲノムの標的直鎖の成功したリアルタイムPCR検出を表す一連のグラフである。図6Aは、PCRサイクルの働きとして蛍光を示す定量グラフである。図6Bは、PCRサイクルの働きとして蛍光量の対数を示す標準曲線グラフである。図6Cは融解曲線グラフである。方法論に関するさらなる詳細は実施例6に記載している。 図7は、土壌中のPCR阻害物質に対するKlentaq-10の高い耐性を示す一連のグラフおよび画像である。様々な量の粗製の土壌抽出物を反応混合物に加え、土壌細菌であるセレウス菌由来の試験標的を、変異体酵素により成功裡に増幅したが、2つの市販の野生型Taq酵素では増幅されなかった。方法論に関するさらなる詳細は実施例7に記載している。 図8は、2つの新規な変異体酵素、Klentaq-10およびFLAC-22の土壌阻害耐性の特性を示す一連の画像およびグラフである。ヒト（CCR5遺伝子）標的のリアルタイムPCRアッセイをDNAテンプレートと混合した粗製の土壌抽出物の存在下において行った。2つの変異体酵素は、耐用性を示す、より高い土壌濃度において、それぞれの野生型酵素、KlentaqおよびTaqよりも優れていた。蛍光シグナルがリアルタイム検出において最適化されるSYBR Green濃度を判定した。方法論に関するさらなる詳細は実施例8に記載している。
本発明の一局面は、例えば、血液および色素、土壌および色素、または血液および土壌、加えて色素の組み合わせを含有する粗製のサンプルのリアルタイムPCRアッセイにおける阻害耐性変異体DNAポリメラーゼ酵素の使用である。一般に、PCR反応混合物に血液成分（例えば、ヘム）が存在すると、色素の蛍光がかなり消光し、よってより高い濃度の色素が必要となる。従来のDNAポリメラーゼによるPCRアッセイにおいて、血液およびより高い濃度の色素の両方は阻害性を示す。本明細書に記載の組成物および方法は、PCR反応混合物中に色素を有するリアルタイムPCRへの、血液または土壌含有サンプルの適用における、阻害耐性変異体ポリメラーゼ酵素の使用を提供する。
本発明の別の局面は、例えば、血液、土壌または血液および土壌の組み合せを含有する粗製のサンプルを用いる標準的（つまりリアルタイムでない）PCRアッセイにおける、阻害耐性変異体DNAポリメラーゼ酵素の使用である。
色素
本発明の一局面は、ポリメラーゼ変異体（例えば、変異体Taq DNAポリメラーゼまたは変異体Klentaq DNAポリメラーゼ）を用いることにより、リアルタイムPCR（qPCR）に用いる色素（例えば、蛍光色素）の阻害作用を克服し、qPCRにおける遺伝子検出を改善する方法を提供する。色素耐性は、当分野において既知の、および本明細書に記載のアッセイによって容易に測定することができる（例えば、図1、2および8を参照のこと）。
本明細書に記載の変異体ポリメラーゼ酵素の様々な実施形態は、増加した濃度の色素に耐えることができる。そのような増加した濃度には、限定しないが、以下が含まれる：アッセイに従来用いられている色素濃度に対し、約0.5X、1X、1.5X、2X、2.5X、3X、3.5X、4X、4.5X、5X、5.5X、6X、6.5X、7X、7.5X、8X、8.5X、9X、9.5X、10X、15X、20X、25X、30X、35X、40X、45X、50X、55X、60X、65X、70X、80X、90X、100X、150X、200X、250X以下の、またはそれ以上の濃度（例えば、図1A、1B、2A、2B、2Cおよび8を参照のこと）。例として、Xは、市販の製品（例えば、SYBR Green、Molecular Probes、Eugene、Oregon）において示されている、色素濃度についての標準的な生産者の単位であり得る。例えば、SYBR Greenにおいて、Xは約5〜約10μMの濃度に相当する。
変異体ポリメラーゼ酵素（例えば、変異体Taq DNAポリメラーゼ）の色素耐性により、標準的な色素濃度と比較して、例えば、より高い増幅率、より高い蛍光シグナルおよび／または増加した効率を提供することができる。色素耐性変異体酵素は、特に低遺伝子コピー数のPCR標的を有する場合に、増幅標的の検出を改善することができる。さらなる利益として、より高い色素阻害耐性によって、リアルタイム反応におけるバックグラウンドの蛍光またはPCR阻害物質の消光作用を克服するために十分な色素（例えば、SYBR色素）を用いることができ、これにより、阻害物質（例えば、血液および土壌中の成分）の中における標的遺伝子の検出が可能となる。
本明細書に記載の方法における使用のための色素には、限定しないが、以下が含まれる：SYBR Green（Molecular Probes、Eugene、Oregon）、LC Green（Idaho Technology、Salt Lake City、Utah）、PicoGreen（Molecular Probes、Eugene、Oregon）、TOTO（Molecular Probes、Eugene、Oregon）、YOYO（Molecular Probes、Eugene、Oregon）およびSYTO9（Molecular Probes、Eugene、Oregon）。
本明細書に記載の変異体ポリメラーゼは、それらの高い色素濃度への耐性により、限定しないが以下が含まれるqPCRに用いる市販購入し得る色素を用いた際に、一番よく売れている市販のPCR酵素を含む他の従来のポリメラーゼ酵素よりも優れている：SYBR Green（例えば、図1A、2A、2Bおよび8を参照のこと）、LC Green（Idaho Technology、Salt Lake City、Utah）、PICO、TOTO（Molecular Probes、Eugene、Oregon）、YOYO（Molecular Probes、Eugene、Oregon）、SYTO（Molecular Probes、Eugene、Oregon）および臭化エチジウム。これらの色素のいくつかは、PCRにおける従来のTaq酵素に対してSYBR Greenよりもさらにより高い阻害性を示す。
血液
血液耐性ポリメラーゼは、その用語を本明細書において用いる場合、一般に、反応混合物中に約1％〜約25％の全血（体積／体積）を含有するPCRアッセイにおいて、増幅活性を示し得る。例えば、全血は、明細書に記載の血液耐性DNAポリメラーゼを含むPCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％または25％を構成し得る。対照的に、完全長Taq酵素（配列番号4）は通常、反応混合物中約0.004％〜約0.2％の全血（体積／体積）の血液濃度範囲において完全に阻害される。
血液耐性は、本明細書に記載の、および当分野において既知のアッセイによって容易に測定することができる（例えば、米国特許出願公開第2006/0084074号明細書を参照のこと）。
土壌
本明細書に記載の変異体DNAポリメラーゼの様々な実施形態は、土壌および土壌抽出物に見られる阻害物質に対して耐性である。かかる土壌および土壌抽出物における阻害物質には、限定しないが、以下が含まれる：フミン酸、フルボ酸、多糖類および金属イオン。土壌耐性ポリメラーゼは、その用語を本明細書において用いる場合、一般に、反応混合物中に約1％〜約90％の土壌または土壌抽出物（体積／体積）を含有するPCRアッセイにおいて増幅活性を示し得る。例えば、土壌または土壌抽出物は、本明細書に記載の土壌耐性DNAポリメラーゼを含むPCRアッセイ混合物の全体積の約85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％または1％以下を構成し得る。アッセイ混合物中の土壌または土壌抽出物の量は、土壌または土壌抽出物における阻害物質のレベルに依拠し得る。一般に、本明細書に記載の変異体DNAポリメラーゼは、従来のDNAポリメラーゼと比較して、少なくとも1桁高い濃度のこれらの阻害物質に耐えることができる。サンプル中の阻害物質のレベルを測定するアッセイは当分野において既知である。土壌耐性は本明細書に記載のアッセイによって容易に測定することができる。
土壌サンプルから全DNAを直接抽出すると、PCR分析にとって最も強力な土壌阻害物質として知られるフミン酸の共抽出が起こる。フミン質は、有機物が腐敗する間に産生される、部分的に特徴決定されたポリフェノールの混合物を表す。従来のDNAポリメラーゼ酵素は、反応体積50μLにつき約1ngのフミン酸によって阻害される。本明細書に記載の変異体DNAポリメラーゼの様々な実施形態は、例えば、様々なレベルのフミン酸を含有する土壌または土壌抽出物に耐性である。好ましくは、PCRアッセイ混合物において用いられる土壌または土壌抽出物の体積は、反応体積50μLにつきフミン酸が約25ng以下となるのに相当する、土壌または土壌抽出物の量である。サンプル中のフミン酸の量を測定するアッセイは、当分野において既知である。好ましくは、PCRアッセイ混合物に用いられる土壌または土壌抽出物の体積は、反応体積50μLにつきフミン酸が約20ng以下、より好ましくは反応体積50μLにつきフミン酸が約10ng以下となるのに相当する土壌または土壌抽出物の量である。
組合せ
好ましくは、変異体ポリメラーゼ酵素は、例えば、色素および血液および／または土壌を含有するPCR反応において起こり得るような、血液および色素（例えば、蛍光色素）の両阻害；土壌および色素の両阻害；または血液、土壌および色素の阻害に対して耐性である。さらにより好ましくは、変異体酵素、血液および蛍光色素の組み合わせにより、これまで不可能であった増幅および最適な検出が可能となる相乗効果が得られる。変異体酵素の好ましい二重の阻害耐性の表現型（つまり、血液および色素耐性）により、血液を含有するサンプルのリアルタイム検出が可能になる。さらに、血液の存在下において、血液および色素耐性変異体ポリメラーゼは、より高い初期濃度の色素に耐えることができる（例えば、SYBR Green色素において約64X〜約256Xの耐性）。
通常の（つまり低い）色素濃度（例えば、SYBR Greenにおいて1Xまたはより低い濃度）を用いる場合、血液と蛍光色素間の干渉によって、増幅産物の検出が少なくとも部分的に絶たれることを本明細書において実証する。高濃度の色素を反応物に添加することは（本明細書に記載の色素耐性変異体ポリメラーゼの使用によって可能となる）、色素蛍光に対する血液成分（例えば、ヘム）の消光作用を克服するのに役立ち得る。
PCR
本明細書に記載のPCR阻害物質に耐性のDNAポリメラーゼは、当業者に既知の様々なポリメラーゼ反応において用いることができる（例えば、Dorak (2006)「Real-Time PCR（リアルタイムPCR）」、Taylor＆Francis、ISBN 041537734X；Bustin編（2004）、「A-Z of Quantitative PCR（定量的PCRのAからZ）」、International University Line、ISBN 0963681788を参照のこと）。例えば、本発明の耐性ポリメラーゼは、PCR反応、プライマー伸長反応などにおいて利用することができる。本明細書に記載の変異体ポリメラーゼ酵素の使用は一般に、例えば、より多い量の蛍光色素を加える以外には、典型的なプロトコールに、全くまたは実質的な変更を必要としない。よって、本明細書に記載の方法は、精製されたテンプレート核酸およびプライマーを用いる、あらゆる標準的リアルタイムPCRにおいて、遺伝子の検出を改善するのに適用することができる。
本明細書に記載の様々なPCRアッセイ混合物において使用する緩衝液は、一般に、酵素活性の機能に適合し、細胞および／または生物学的高分子の正常な生理学的および生化学的機能を保持することができる、生理学的に適合性の緩衝液である。典型的には、生理学的に適合性の緩衝液は、緩衝剤（例えば、TRIS、MES、PO4、HEPESなど）、キレート化剤（例えば、EDTA、EGTAなど）、塩（例えば、硫酸アンモニウム、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、NaOAc、KOAc、Mg(OAc)2など）および必要に応じて安定化剤（例えば、スクロース、グリセリン、Tween20など）を含むであろう。
本明細書に記載の方法に様々なPCR添加剤を利用することができる。例えば、血液および／または土壌による阻害を克服するさらなる目的のために、PCRアッセイにベタインを加えることができる。ベタインは終濃度約1M〜約2Mにて含ませることができる。一般に、従来のDNAポリメラーゼとともに用いる場合、ベタイン単独では、例えば、色素、血液および／または土壌の阻害を克服するのに不十分である。
変異体ポリメラーゼ
本発明に有用な変異体酵素の例には、限定しないが、以下が含まれる：KlenTaq-10（配列番号1）（米国特許出願公開第2006/0084074号明細書に記載されている；参照によりその全体が本明細書に特に組み込まれる）および完全長Taq酵素変異体、FLAC-22（配列番号2）、ならびに、以下に記載のような、これらの参照配列の変異体ポリペプチド。
以下の論述において、ポリペプチド間の関係を明確にするために、野生型Taqの番号付けをこの説明文において用いる。切断されたポリメラーゼポリペプチド（例えば、配列番号1のKlentaq-10；配列番号3のKlentaq-1）において、配列番号1または配列番号3の配列表に記されている位置番号1は、配列番号4の完全長Taqに記されている位置番号279に相当する。同様に、配列番号1または配列番号3の位置番号2は、配列番号4の位置番号280に相当する。
KlenTaq-1（配列番号3）は、完全長Taq（配列番号4）の278個のＮ末端欠失を有し、アミノ酸279と280にMet/Gly置換を有する（野生型Taqの番号付けにおいて）。Klentaq-1は、野生型Taqから切断によって直接得られる場合、「野生型」Klentaqであることを注記しておく。
KlenTaq-10（配列番号1）は、完全長野生型Taq（配列番号4）の278個のＮ末端欠失を有し、E626K、I707LおよびE708Kの置換を有する（野生型Taqの番号付けにおいて）。
FLAC22（配列番号2）は、完全長Taq（配列番号4）にE626K、I707LおよびE708Nの置換を有する（野生型Taqの番号付けにおいて）ものである。
上記の配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有する変異体ポリペプチド（またはコードするポリヌクレオチド）も、かかる変異体が色素耐性ポリメラーゼ活性；色素および血液耐性ポリメラーゼ活性；色素および土壌耐性ポリメラーゼ活性；または色素、血液および土壌耐性ポリメラーゼ活性を保持する限りは、本発明の範囲内に含まれる。例えば、色素耐性ポリメラーゼ活性；色素および血液耐性ポリメラーゼ活性；色素および土壌耐性ポリメラーゼ活性；または色素、血液および土壌耐性ポリメラーゼ活性を有する変異体ポリペプチド（またはコードするポリヌクレオチド）は、本明細書に開示の配列に対して少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または99.9％の配列同一性を有し得る。好ましくは、色素耐性ポリメラーゼ活性；色素および血液耐性ポリメラーゼ活性；色素および土壌耐性ポリメラーゼ活性；または色素、血液および土壌耐性ポリメラーゼ活性を有する変異体ポリペプチド（またはコードするポリヌクレオチド）は、本明細書に開示の配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する。より好ましくは、色素；色素および血液；色素および土壌；または色素、血液および土壌耐性ポリメラーゼ活性を有する変異体ポリペプチド（またはコードするポリヌクレオチド）は、本明細書に開示の配列に対して少なくとも99％の配列同一性を有する。全ての変異体は特定の触媒活性（例えば、色素、血液および／または土壌耐性ポリメラーゼ活性）を有するべきであり、参照配列に対して上記にて要求される同一性の度合を有するべきであるので、配列番号1および配列番号2は、これらの個別の各配列の変異体ポリペプチドの代表である。
変異体DNAポリメラーゼの配列に対して上記の要求される同一性の度合（％）を有し、要求される耐性表現型を保持する変異体ポリペプチドの設計、作製および試験は、当分野の技術の範囲内である。例えば、変異体の定向進化および素早い単離は、限定しないが以下を含む参考文献に記載されている方法に従って行うことができる：Link et al. (2007) Nature Reviews 5 (9), 680-688；Sanger et al. (1991) Gene 97 (1), 119-123；Ghadessy et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98 (8) 4552-4557。よって、当業者は、例えば、本明細書に記載の変異体DNAポリメラーゼに対して少なくとも95-99％の同一性を有する多数のポリペプチド変異体を作製することができ、そして当分野においてルーチン的な方法に従って、色素耐性、血液耐性および／または土壌耐性などの表現型について、それらをスクリーニングすることができるであろう。一般に、同類置換（conservative substitution）は、要求される活性が保持される限りは、どの位置に作製されてもよい。本明細書に記載の表現型に関係することが知られるアミノ酸の位置には、限定しないが、626、707および708（野生型Taqの番号付けにおける）が含まれる（実施例9を参照のこと）。例えば、708における好ましい置換には、切断型および完全長変異体TaqポリメラーゼにおいてKとL；完全長変異体TaqポリメラーゼにおいてN、QとI；ならびに切断型変異体TaqポリメラーゼにおいてWが含まれる。より好ましい置換にはE708RおよびE708Lが含まれる。
アミノ酸配列の同一性の度合（％）は、参照配列と候補配列の2配列を整列させた場合に、参照配列と比較して、候補配列のアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基の割合と理解する。アミノ酸の同一性の度合を決定するには、配列を整列させ、必要であれば、最大の配列同一性の度合が得られるようにギャップを導入する；同類置換は配列同一性の部分とは考えない。同一性の度合を決定するアミノ酸配列のアライメント手順は、当業者によく知られている。一般に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST2、ALIGN2またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアが、ペプチド配列のアライメントにしばしば用いられている。当業者であれば、比較する完全長配列に対して最大のアライメントを得るのに必要ないずれかのアルゴリズムなどの、アライメント測定のための適切なパラメータを決定することができる。アミノ酸配列をアライメントすれば、所定のアミノ酸配列Bへの、配列Bとの、または、配列Bに対する、所定のアミノ酸配列Aのアミノ酸配列の同一性の度合（％）（あるいは、所定のアミノ酸配列Bに、配列Bと、または、配列Bに対して、あるアミノ酸配列の同一性の度合（％）を有する、または構成する、所定のアミノ酸配列Aと表すこともできる）は、以下のように計算することができる：アミノ酸配列の同一性の度合（％）＝X/Y100、ここでXは配列アライメントプログラムまたはアルゴリズムのAとBのアライメントによって、同一のマッチとスコアされたアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと同じでない場合、AのBに対するアミノ酸配列の同一性の度合は、BのAに対するアミノ酸配列の同一性の度合と等しくないであろう。
本明細書に記載の変異体DNAポリメラーゼは、当分野に既知の方法によって産生することができる。例えば、特定のアミノ酸の変化により記載の変異体DNAポリメラーゼをもたらすオリゴヌクレオチドは、標準的合成技術（例えば、自動DNA合成装置）により調製することができ、また部位特異的突然変異誘発におけるPCRプライマーとして用いることができる。その後、変異体DNAポリメラーゼポリペプチドのコードDNA配列からの標準的な発現手順を行うことができる。あるいは、変異体DNAポリメラーゼポリペプチドは、当分野に既知の方法に従って直接的に合成することができる。
本発明を詳しく記載したが、添付の特許請求の範囲に規定する本発明の範囲を逸脱せずに、修飾、改変および等価な具体化が可能なことは明らかであろう。さらに、本発明の開示におけるあらゆる実施例は非限定的な例として提供すると解されたい。
実施例
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに説明するために提供する。以下の実施例に開示される技術は、本発明者らが本発明の実施において良好に機能するものであることを見出した解決法を代表するものであり、よってその実施の様式の例を構成すると考え得ることが、当業者であれば理解できるはずである。しかしながら、当業者であれば、本発明の開示を踏まえて、開示する特定の実施形態に多くの改変を行うことができること、そしてなおも本発明の精神および範囲を逸脱せずに同種のまたは同様の結果を得ることができることが、理解できるはずである。用いられる動詞の時制にかかわらず、実施例に記載のいずれかの方法が実際に実行されても、されなくてもよい、または実施例に記載のいずれかの組成物が実際に形成されても、されなくてもよいと解されたい。
以下のオリゴヌクレオチドプライマーをリアルタイムPCR反応に用い、投入ゲノムDNA 20pgから、0.6kbpのセレウス菌特異的標的を増幅した：フォワード5'-AGG GTC ATT GGA AAC TGG G-3'（配列番号5）およびリバース5'-CGT GTT GTA GCC CAG GTC ATA-3'（配列番号6）。各プライマーの終濃度は、一般的なマスターミックスにおいて用いて0.2uMであった。用いた各酵素の量は、反応液50ulにつき2.5ユニットであった。野生型KlenTaqおよび変異体KlenTaq-10を、SYBR green蛍光色素の、16X濃度から開始して2倍ずつの一連の7種の希釈により検証した。40サイクル後、生成物を2％アガロースゲル電気泳動（例えば、図1Aを参照のこと）および解離温度プロファイル（例えば、図1Bを参照のこと）の両方において分析した。
結果は、KlenTaq-10は4X SYBRの存在下において0.6kbpセレウス菌標的DNAを増幅することができ、一方野生型は1Xよりも高い濃度において増幅することができなかったことを示している（例えば、図1を参照のこと）。PCR後融解曲線分析は、蛍光の検出および生成物の特異性を裏付けている。
以下のオリゴヌクレオチドプライマーをリアルタイムPCR反応に用いて、投入ゲノムDNA 20pgから、0.6kbpのセレウス菌特異的標的を増幅した：フォワード5'-AGG GTC ATT GGA AAC TGG G-3'（配列番号5）およびリバース5'-CGT GTT GTA GCC CAG GTC ATA-3'（配列番号6）。各プライマーの終濃度は、一般的なマスターミックスにおいて用いて0.2uMであった。用いた各酵素の量は、反応液50ulにつき2.5ユニットであった。FLAC-22およびFast Start Taqを、SYBR green蛍光色素の、6.4X濃度から開始して、2倍ずつの一連の7種の希釈により検証した。40サイクル後、生成物を2％アガロースゲル電気泳動（例えば、図2Aを参照のこと）および解離温度プロファイル（例えば、図2Bを参照のこと）の両方において分析した。
結果は、FLAC-22は1.6X SYBRの存在下において0.6kbpのセレウス菌標的DNAを増幅でき、一方Fast Start Taqは0.2Xよりも高い濃度において増幅できなかったことを示した（例えば、図3を参照のこと）。PCR後融解曲線分析は、蛍光の検出および生成物の特異性を裏付けている。
以下のオリゴヌクレオチドプライマーをリアルタイムPCR反応に用いて、投入ゲノムDNA 20pgから、0.6kbpのセレウス菌特異的標的を増幅した：フォワード5'-AGG GTC ATT GGA AAC TGG G-3'（配列番号5）およびリバース5'-CGT GTT GTA GCC CAG GTC ATA-3'（配列番号6）。各プライマーの終濃度は、一般的なマスターミックスにおいて用いて0.2uMであった。用いた各酵素の量は、反応液50ulにつき2.5ユニットであった。野生型KlenTaqおよびKlenTaq-10について、全反応液体積の5％および10％の2つの血液濃度、およびSYBR green蛍光色素の、6.4X濃度から開始して、2倍ずつの一連の6種の希釈により、2重に検証した。40サイクル後、生成物を、2％アガロースゲル電気泳動（例えば、図3Aを参照のこと）および解離温度プロファイル（例えば、図3Bを参照のこと）の両方において分析した。
通常の、すなわち血液を含まない環境下において、これらの条件は非常に阻害性であることが予想された。しかしここでの結果は、KlenTaq 10は野生型KlenTaqと比較して少なくとも2倍高いSYBR濃度において増幅することができたことを示している（例えば、図3を参照のこと）。PCR後融解曲線分析は、10％血液の存在下において、少なくとも8X SYBR greenがリアルタイムPCR検出に必要であり、5％血液サンプルにおいては少なくとも2X SYBRが必要であることを裏付けている。結果は、SYBR greenに対するKlenTaq 10の耐性は、反応液中に血液が存在しない場合の4Xと比較して少なくとも64Xに増加していることも示している。
以下のオリゴヌクレオチドプライマーをリアルタイムPCR反応に用いて、0.32kbp 16S微生物標的を増幅した：フォワード5'-GGA TGC AAG CGT TAT CCG GAA TG-3'（配列番号7）およびリバース5'-CAT TCT TGC GAA CGT ACT CCC CA-3'（配列番号8）。各プライマーの終濃度は、一般的なマスターミックスにおいて用いて0.2uMであった。用いた各酵素の量は、反応液50ulにつき2.5ユニットであった。FLAC-22およびFast Start Taqsを、5％血液、ならびにSYBR green蛍光色素の、32X濃度から出発して2倍ずつの一連の4種の希釈および対照としてSYBRを含まないものにより、2重に検証した。陽性対照として血液もSYBRも含有しない反応液も含めた。40サイクル後、生成物を、2％アガロースゲル電気泳動（例えば、図4Aを参照のこと）および解離温度プロファイル（例えば、図4Bを参照のこと）の両方において分析した。
血液がない場合、これらのSYBR濃度は非常に阻害性であることが予想された。しかし、ここでの結果は、FLAC-22はあらゆる濃度のSYBRにおいて増幅することができ、一方Fast Startは血液およびSYBRの両方によって阻害され、血液も色素も含有しない陽性対照のみ増幅することができたことを示している（例えば、図4を参照のこと）。PCR後融解曲線分析は5％血液の存在下において、少なくとも4X SYBR greenがFLAC-22のリアルタイムPCR検出に必要であることを実証しており、一方Fast Startサンプルは生成物の正しい融解温度を全く示さなかった。ここでも、FLAC-22のSYBR greenに対する耐性は、反応液中に血液を含まない2Xと比較して少なくとも32Xに増加した。
以下のオリゴヌクレオチドプライマーをリアルタイムPCR反応に用いて、0.25kbpのLambda特異的標的を増幅した：フォワード5'-GGG CGG CGA CCT CGC GGG TTT TCG C-3'（配列番号9）およびリバース5'-CTG AAT GGT ACG GAT ACT CGC ACC G-3'（配列番号10）。各プライマーの終濃度は一般的なマスターミックスにおいて用いて0.2uMであった。用いた各酵素の量は、反応液50ulにつき2.5ユニットであった。FLAC-22、KlenTaq-10、Fast Start、JumpStartおよびAmpliTaq Goldポリメラーゼを、SYBR green蛍光色素の、4X濃度から開始して2倍ずつの一連の7種の希釈により検証した。35サイクル後、生成物を2％アガロースゲル電気泳動（例えば、図5Aを参照のこと）および解離温度プロファイル（例えば、図5Bを参照のこと）の両方において分析した。
結果は、FLAC-22は、2X SYBRの存在下において、加えた精製されたDNAテンプレートから0.25kbpのlambda標的を増幅でき；KlenTaq-10は少なくとも4X SYBRにおいて増幅でき；しかし、市販のTaqポリメラーゼは0.5Xより高い濃度において増幅できなかったことを示した（例えば、図5を参照のこと）。PCR後融解曲線分析は、蛍光の検出および生成物の特異性を裏付けている。
ヒト全血を炭疽菌（Bacillus anthracis）DNAと予め混合し、直接PCRにかけた。融解曲線プロファイルが示すところによると、5％血液において、Klentaq-10は標的を特異的に増幅した。さらに、定量曲線は、投入DNA量と高度に比例関係にあり、その結果、標準曲線は一般的な曲線をたどっていた。血液の蛍光色素に対する消光作用を補うのに、SYBR Greenの32Xという高濃度が用いられた。
2つの市販のTaq酵素、Fast Start Taq（Roche）およびJump Start Tag（Sigma）およびKT-10変異体酵素を用いて、粗製の土壌抽出物からセレウス菌内在性600bp標的を増幅した。反応液は、土壌抽出物の4種の希釈物を含有した：16％、8％、4％および2％（例えば、図7D-E、それぞれレーン1-4を参照のこと）。レーン5における反応液は、土壌抽出物を含まず、精製されたセレウス菌DNA 5ngを含有する陽性対照であった。PCRはリアルタイムサイクラーOpticon-2において行い、増幅産物をSYBR Green色素蛍光（上のパネル）およびゲル電気泳動（下のパネル）の両方により分析した。ピンクの曲線は対照反応物に相当し、黄色、青、緑および赤の曲線は増加する濃度の土壌を用いた反応を反映している。この実施例は、PCR前に土壌からのDNA精製を必要とする2つの市販のTaqよりも優れた、変異体Klentaq-10酵素の土壌耐性特性を実証している。
この実施例は、2つの新規な変異体酵素は、血液およびSYBR耐性に加え、土壌中に存在するPCR阻害物質に対しても高い耐性を有することを実証する。粗製の土壌抽出物および様々な量のSYBRと混合したヒトDNA 4ngから、630bpのCCR5遺伝子標的を増幅した。Klentaq-10変異体酵素をその野生型前駆体と比較し、FLAC-22を野生型Fast Start Taqポリメラーゼ（Roche）と比較した。蛍光シグナルがリアルタイム検出において最適化されるSYBR Green蛍光色素濃度を判定した。リアルタイムサイクラーOpticon2においてPCRを行い、増幅産物をゲル電気泳動（下のパネル）およびSYBR Green色素融解曲線プロファイル（上のパネル）の両方によって分析した。
土壌耐性変異体酵素は、非常に低いバックグラウンドシグナルの特異的な融解曲線を示した。対照的に、野生型KlentaqおよびFast Start Taqは、非常に低いSYBR濃度において融解曲線を示し、より多い土壌の存在下においてはシグナルはバックグランドの中に失われてしまった可能性がある。結果は、2つの新規な変異体酵素が、PCR阻害物質を含有する粗製の土壌サンプルのリアルタイムPCRにおいて、PCR前にDNA精製工程の必要なく、容易に働くことができることを実証している。
野生型Taq Glu708の単一のアミノ酸変化は、選択された変異体の質である、血液および土壌耐性の両方に関係していた。機能分析によって、その位置における同じアミノ酸置換が血液および土壌耐性特性の両方に最適であることが明らかになった。
Taqのコドン708に飽和的突然変異誘発を行い、この重要な位置において可能なあらゆる置換の全範囲を機能的に試験した。全ての708変異体のうち、Klentaq-10（配列番号1）およびFLAC-22（配列番号2）は、PCR阻害物質に対する阻害物質耐性のあらゆる局面において優れていることが判明した。
708改変の分析において、KlenTaqおよびTaq DNAポリメラーゼについて、特定の特異性が示された。KおよびL置換は両酵素（変異体Klentaq10および12ならびに対応するFLAC-10およびFLAC-12）において有効であり、一方N、Q、I（FLAC-22、3および4）はTaqにおいてのみ機能性であり、W置換はKlenTaq（Klentaq-7）においてのみ良好であった。
KlenTaq 7（E708W）およびKlentaq-12変異体（G708TrpおよびGlu708Leu）は血液に対して比較的高い耐性を示すが、土壌阻害物質に対してはそうではなく、一方、別のKlenTaq変異体（Klentaq 11、E708R）は主に土壌耐性であったので、2つの表現型は堅固には結びついていなかった。SYBR耐性によると、性能の順序においてKlentaq-10およびFLAC-22の次に来るのはKlentaq-11（E708R）およびKlentaq-12（E708L）であった。
残基708の重要性が、可能な20の置換のうちの2つ、PおよびCがKlenTaqおよびTaq酵素の両方を不活性化したという事実から確認された。

Claims (39)

  1. リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）において標的核酸を増幅する方法であって、以下の工程を含む方法：
    以下を含むアッセイ混合物を作製する工程：
    標的核酸を含むサンプル；
    標的核酸に特異的なプライマー；
    緩衝液；
    少なくとも１つの色素；および
    PCR阻害物質に耐性の少なくとも１つのポリメラーゼ；
    ここで、該少なくとも１つのポリメラーゼは色素耐性ポリメラーゼである；ならびに
    リアルタイムPCRにおいてアッセイ混合物中の標的核酸を増幅する工程。
  2. 少なくとも１つのポリメラーゼが、色素耐性および血液耐性ポリメラーゼである、請求項１の方法。
  3. 少なくとも１つのポリメラーゼが、色素耐性および土壌耐性ポリメラーゼである、請求項１の方法。
  4. 少なくとも１つのポリメラーゼが、色素耐性、血液耐性および土壌耐性ポリメラーゼである、請求項１の方法。
  5. 少なくとも１つのポリメラーゼが、配列番号１を含むポリペプチド配列、または配列番号１に対して少なくとも95％の同一性を有するポリペプチド配列、を有する、請求項１の方法。
  6. 少なくとも１つのポリメラーゼが、配列番号１に対して少なくとも99％の同一性を有するポリペプチド配列を有する、請求項５の方法。
  7. 配列番号１に対して少なくとも99％の同一性を有するポリペプチド配列を有する少なくとも１つのポリメラーゼが、626位、707位および708位からなる群から選択されるアミノ酸残基の位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項６の方法。
  8. 少なくとも１つのポリメラーゼが、配列番号２を含むポリペプチド配列、または配列番号１に対して少なくとも95％の同一性を有するポリペプチド配列、を有する、請求項１の方法。
  9. 少なくとも１つのポリメラーゼが、配列番号２に対して少なくとも99％の同一性を有するポリペプチド配列を有する、請求項８の方法。
  10. 配列番号２に対して少なくとも99％の同一性を有するポリペプチド配列を有する少なくとも１つのポリメラーゼが、626位、707位および708位からなる群から選択されるアミノ酸残基の位置において少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項９の方法。
  11. 前記サンプルが全血をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかの方法。
  12. 全血が、PCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約1％〜約25％である、請求項１１の方法。
  13. 全血が、PCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約3％〜約20％である、請求項１２の方法。
  14. 全血が、PCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約5％〜約15％である、請求項１３の方法。
  15. 前記サンプルが土壌または土壌抽出物をさらに含む、請求項１〜１４のいずれかの方法。
  16. 土壌または土壌抽出物が、PCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約1％〜約90％である、請求項１５の方法。
  17. 土壌または土壌抽出物がフミン酸を含み、反応体積50μＬにつきフミン酸が約25ｎｇ以下となるのに相当する量にて土壌または土壌抽出物がアッセイ混合物中に存在する、請求項１６の方法。
  18. 反応体積50μＬにつきフミン酸が約20ｎｇ以下となるのに相当する量にて土壌または土壌抽出物がアッセイ混合物中に存在する、請求項１７の方法。
  19. 反応体積50μＬにつきフミン酸が約10ｎｇ以下となるのに相当する量にて土壌または土壌抽出物がアッセイ混合物中に存在する、請求項１８の方法。
  20. 前記少なくとも１つの色素が少なくとも１つの蛍光色素である、請求項１〜１９のいずれかの方法。
  21. 少なくとも１つの蛍光色素が、SYBR Green、臭化エチジウム、PICO、TOTO、YOYOまたはLC Greenからなる群から選択される、請求項２０の方法。
  22. 少なくとも１つの蛍光色素がSYBR Greenである、請求項２１の方法。
  23. 色素が少なくとも約0.5Ｘ〜約256ＸにてPCRアッセイ混合物中に存在し、ここでＸはPCRにおいて用いる濃度についての生産者による単位である、請求項１〜２２のいずれかの方法。
  24. 色素が少なくとも約0.5Ｘ〜約128ＸにてPCRアッセイ混合物中に存在する、請求項２３の方法。
  25. 色素が少なくとも約0.5Ｘ〜約64ＸにてPCRアッセイ混合物中に存在する、請求項２４の方法。
  26. アッセイ混合物がベタインをさらに含む、請求項１〜２５のいずれかの方法。
  27. 配列番号２のポリペプチド配列を含む単離ポリペプチド。
  28. 配列番号２に対して少なくとも95％の同一性を有するポリペプチド配列を含む単離ポリペプチドであって、色素、土壌および血液からなる群から選択される、またはそれらの組み合わせであるPCR阻害物質に耐性である単離ポリペプチド配列。
  29. ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）において標的核酸を増幅する方法であって、以下の工程を含む方法：
    以下を含むアッセイ混合物を作製する工程：
    標的核酸を含むサンプル；
    標的核酸に特異的なプライマー；
    緩衝液；および
    少なくとも１つのポリメラーゼ；
    ここで、該少なくとも１つのポリメラーゼは請求項２７〜２８のいずれかの単離ポリペプチドである。
  30. サンプルが全血をさらに含む、請求項２９の方法。
  31. 全血がPCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約1％〜約25％である、請求項３０の方法。
  32. 全血がPCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約3％〜約20％である、請求項３１の方法。
  33. 全血がPCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約5％〜約15％である、請求項３２の方法。
  34. 前記サンプルが土壌または土壌抽出物をさらに含む、請求項２９〜３３のいずれかの方法。
  35. 土壌または土壌抽出物がPCRアッセイ混合物の全体積の少なくとも約1％〜約90％である、請求項３４の方法。
  36. 土壌または土壌抽出物がフミン酸を含み、反応体積50μＬにつきフミン酸が約25ｎｇ以下となるのに相当する量にて土壌または土壌抽出物がアッセイ混合物中に存在する、請求項３５の方法。
  37. 反応体積50μＬにつきフミン酸が約20ｎｇ以下となるのに相当する量にて土壌または土壌抽出物がアッセイ混合物中に存在する、請求項３６の方法。
  38. 反応体積50μＬにつきフミン酸が約10ｎｇ以下となるのに相当する量にて土壌または土壌抽出物がアッセイ混合物中に存在する、請求項３７の方法。
  39. アッセイ混合物がベタインをさらに含む、請求項２９〜３８のいずれかの方法。
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