WO2021242041A1 - 유전자 변이에 대한 구분성이 향상된 dna 중합효소 변이체 - Google Patents

유전자 변이에 대한 구분성이 향상된 dna 중합효소 변이체 Download PDF

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WO2021242041A1
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mutant
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김재종
임시규
유정현
이보미
김슬기
차선호
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(주)제노텍
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a DNA polymerase variant belonging to family A and its use, wherein when the base at the 3' end of the primer is complementary to the template, polymerization occurs smoothly, and when it is non-complementary, polymerization is inhibited, thereby discriminating between the two cases (discrimination) ) is facilitated, a PCR method using the variant, and a PCR kit comprising the variant.
  • the present invention is useful for single nucleotide polymorphism analysis (SNP genotyping) and somatic mutation detection.
  • genetic mutations that are involved in traits, drug metabolism, immunological reactions, genetic diseases and diseases such as cancer, i.e., genetic mutations such as single nucleotide polymorphisms, additions, deletions, etc. It is very important in the implementation of precision medicine, such as the determination of treatment, prognosis of treatment, and observation of recurrence (Auton, Brooks et al. 2015, Zhang, Qin et al. 2004, Poste 2001, Nakagawa and Fujita 2018, Martincorena and Campbell 2015). In addition, the identification or discrimination of genetic variation is very useful in breeding and selection of species in the field of agro-food, and discrimination of origin and variety.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • qPCR quantitative real time PCR
  • Real-time PCR which is a qualitative and quantitative detection technique for nucleic acids
  • the composition added to the PCR solution is mainly a method of increasing the reactivity of PCR, generation of primer dimers, or generation of a non-specific PCR product generated by binding of a primer to a non-specific target, or a high GC ratio and specific high-order
  • An additive composition for use in resolving a decrease in PCR efficiency due to structure formation or the like has been studied.
  • Examples of such a composition include dimethylsulfoxide (DMSO), betaine, and the like.
  • HotStart PCR a number of methods have been reported to block the reaction proceeding at a low temperature and to prevent non-specific amplification by allowing the PCR to proceed at a high temperature.
  • the HotStart PCR method is a method of adding a DNA polymerase (DNAP)-specific monoclonal antibody [Biotechniques (1994) 16(6):1134-1137], a single-stranded oligonucleotide that inhibits the activity of DNA polymerase.
  • DNAP DNA polymerase
  • aptamer US/005693502A (1997) (Gold and Jayasena 1997); J. Mol. Biol.
  • a special probe and primer are for specifically detecting an amplified target product, and a method using a high specificity probe has been developed.
  • a DNA-binding phosphor such as SYBR green I or SYTO9
  • target sequence specific probes include a TaqMan probe (dual labelled signaling hydrolysis probe) [P Natl Acad Sci USA 88, 7276-280 (1991) (Holland) , Abramson et al.
  • a method using a primer with high specificity or a special oligonucleotide blocker has been developed.
  • an additional artificial mutant sequence is added to the 3' end in addition to one mutated sequence centering on AS-PCR (allele specific PCR), which is distinguished by a base difference at the 3' end.
  • AS-PCR allele specific PCR
  • Methods such as ARMS-PCR (amplification refractory mutation system PCR) [Mol Cell Probes. 18. 349-352 (2004) (Jarry, Masson et al. 2004); Nucleic Acids Res 17. 2503-2516 (1989) (Newton, Graham et al. 1989); Nat Biotechnol. 17.
  • a number of DNA polymerases have been developed for easy use in PCR to suppress non-specific signals or to increase the differentiation of alleles. It is common to use a thermostable DNA polymerase for PCR technology.
  • heat-resistant polymerases used in PCR technology include a group of thermostable bacteria-derived enzymes including Taq DNA polymerase belonging to group A, and archaea including Pfu DNA polymerase belonging to group B. It is mainly selected from a group of derived enzymes.
  • group A DNA polymerases including Taq DNA polymerase generally have 5' ⁇ 3' nuclease activity, and this 5' ⁇ 3' nuclease activity includes exonuclease activity and endonuclease activity. All of the enzyme activity is present, and this endonuclease active moiety is also referred to as flap endonuclease 1 (FEN1).
  • This activity is very important for the release of a specific signal through degradation of a hydrolysis probe (eg TaqMan probe). Since Taq DNA polymerase does not have 3' ⁇ 5' exonuclease activity, it is very suitable for PCR using a primer whose 3' terminal end is non-complementary to the template DNA. In the case of an AS (allele specific) primer or ARMS (amplification refractory mutation system) primer whose 3' end is non-complementary, the amplification efficiency of mutant and wild-type or both alleles is determined according to the match or mismatch of the 3' base of the primer and yields relatively good clinical results. However, sometimes a primer with a mismatched 3' is also partially amplified, so a discrimination error often occurs in high-sensitivity diagnostics for detecting mutations incorporated in a large number of wild-types.
  • AS allele specific
  • ARMS amplification refractory mutation system
  • Taq DNA polymerase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is widely used. Unless otherwise stated below, the amino acid sequence of the DNA polymerase follows SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 wild-type Taq DNA polymerase
  • Taq DNA polymerase is a thermostable enzyme belonging to Family A, which includes E. coli DNA polymerase I.
  • Taq polymerase is divided into a small fragment 5' nuclease domain (1-288 aa) and a large fragment polymerase domain (289-832) (Stoffel fragment or KlenTaq), and the polymerase domain of Taq DNA polymerase is The palm subdomain, the finger subdomain and the thumb subdomain form a structure shaped like a human right hand and can bind well with the DNA double helix (Ollis, Brick et al. 1985) ( Kim, Eom et al. 1995) (Eom, Wang et al. 1996).
  • nucleotide binding pocket region (residues 611-617) and steric gate-associated amino acid residues (residues 615) and the palm domain ( Palm domain), the third ⁇ -sheet region (residues 597-609) (Ong, Loakes et al. 2006), the motif C region (Strerath, Gloeckner et al. 2007), and the P' domain region (residues 704-717) (Kermekchiev, Kirilova et al. 2009).
  • reagents such as DMSO and betaine to increase amplification efficiency, monoclonal antibody for DNA polymerase inhibition, oligonucleic acid that inhibits DNA polymerase activity at low temperatures such as room temperature, also known as aptamer, often increases DNA amplification efficiency and suppresses non-specific PCR product amplification or primer dimer formation. However, when these are added, it is difficult to increase the allele differentiation.
  • the most accessible and efficient method to date is a method of improving the allele discrimination by using an AS primer or an ARMS primer so that the allele can be distinguished through the presence or absence of a 3' mismatch according to the mutation sequence of the allele.
  • an AS primer with one base mismatch is used, the allele differentiation is often low compared to high PCR efficiency, and for an ARMS primer with two or more base mismatches, the allele differentiation is lower compared to using an AS primer.
  • the limit of detection (LOD) is frequently lowered.
  • mutant DNA polymerase with improved 3' mismatch and 3' match distinction is being conducted, but despite many efforts, a very successful mutant has not been obtained so far.
  • the selected mutant DNA polymerase was not commercially available because the enzyme activity was frequently lowered and the detection sensitivity was also lowered accordingly.
  • an object of the present invention is to provide a DNA polymerase with good differentiation in order to solve the above problems and effectively detect genetic mutations such as SNPs.
  • the present inventors set a mutation target region among enzymes, and intensively prepared and searched various mutants for this region, thereby securing excellent mutants.
  • SEQ ID NO: 2 (TZ05 DNA polymerase)
  • SEQ ID NO: 7 loop region of wild-type Taq DNA polymerase
  • This loop region (residues 497 to 514 or a position corresponding thereto) may be selected from a portion of a DNA polymerase, and more specifically, may be selected from a portion of an amino acid sequence constituting DNA polymerase family A.
  • the ⁇ -helices Ha and Hb regions of Taq DNA polymerase are regions with somewhat conserved sequence (>80%), conserved (>90%), or highly conserved (>95%) regions in polymerase family A. Between the two helices there is a loop region (residues 497-514 of wild-type Taq DNA polymerase or a corresponding position), and this region may be selected for the purpose of the present invention.
  • the loop region searched for in the present invention is a region related to DNA binding as shown in the examples of the present invention.
  • This loop region is related to a phenomenon in which DNA polymerase is not decomposed in a state in which DNA and DNA polymerase are bound, as in the example of the present invention.
  • This loop region is related to DNA polymerase not being degraded at a high KCl concentration, that is, at a KCl concentration of 200 mM or more, as exemplified in the present invention.
  • the loop region is a region related to DNA binding, more specifically, primer binding.
  • the loop region is predicted to be a binding region between the Taq DNA polymerase and the primer, which is a substrate, as a result of the structural study of the polymerase.
  • the Taq DNA polymerase mutant (eg, "K511A" mutant) prepared by mutation of this site has improved the PCR distinction between 3' match and 3' mismatch. This indicates that the loop region shown in is a region associated with primer binding.
  • loop region of residues 497-514 or a corresponding position of the wild-type Taq DNA polymerase presented in the present invention has not been reported as a region related to primer binding before the present application.
  • the present inventors used the loop region to achieve the object of the present invention, which is to increase the substrate specificity of a DNA polymerase or to lower the substrate specificity.
  • PCR is more efficient when a 3' match primer is added than when a 3' mismatch primer is added, depending on whether the base 3' end of the primer matches or mismatches the template in the bond between the template and the primer. progress and/or lower errors during polymerization.
  • examples of lowering substrate specificity include facilitating the use of pseudo-substrates or modified substrates such as rNTPs and hydrophobic base analogues in addition to dNTPs, which are normal substrates, and/or increasing polymerization errors. .
  • the main object of the present invention is to select variants that increase the distinction of PCR when the base 3' end of the primer matches the template and when the base 3' end of the primer mismatches the template. provides an area.
  • discrimination refers to discriminating gene mutations or allelic mutations such as SNPs present in a target gene sequence from normal genes, specifically It refers to the difference in the degree of amplification of the target gene in real-time PCR when the 3' end base of the gene or mutant gene template and the primer match and when there is a mismatch.
  • one or more amino acids selected from amino acids constituting the loop region are substituted from the original amino acid to another amino acid according to the present invention.
  • the object of the present invention can be achieved through a plurality of representative amino acid mutations in this loop region.
  • the object of the present invention can be achieved by substituting an amino acid selected from among the polar amino acids belonging to the loop region (residues 497-514 of wild-type Taq DNA polymerase or a site corresponding thereto) to another amino acid.
  • the polar amino acid is specifically the positive amino acid residue arginine (Arg or A), histidine (His or H), lysine (Lys or K), or the negative amino acid residue aspartic acid (Asp or D), glutamic acid (Glu or E).
  • the present invention can achieve the object of the present invention by substituting amino acids selected from among K505, E507, K508, K511 and R512 in Taq DNA polymerase.
  • DNA polymerase variants with improved differentiation can be generated by selecting a region corresponding to the loop region (SEQ ID NO: 7) of Taq DNA polymerase.
  • SEQ ID NO: 7 the loop region of Taq DNA polymerase.
  • Z05 DNA polymerase SEQ ID NO: 2
  • an amino acid region corresponding to the loop region (499-517) in Z05 DNA polymerase (SEQ ID NO: 2), preferably one selected from among R501, K507, K510, K513 and R515, which belongs to the loop region and is a charged amino acid A variant may be generated by substituting the above amino acids, and Q509 of Z05 DNA polymerase corresponding to E507 of Taq DNA polymerase may also be a subject of substitution.
  • Polymerase mutation refers to selecting one or more amino acids from a series of amino acids constituting a polymerase and selecting from 19 amino acids naturally used by living organisms (excluding the original among 20) instead of amino acids existing in the original sequence refers to the conversion of an amino acid into a single amino acid, chemically or enzymatically modifying an amino acid (eg, glycosylation, amination, acylation, hydroxylation, etc.), or deletion, addition In the present invention, it refers to substitution with one of 19 other natural amino acids in the original amino acid.
  • the 20 amino acids in nature are alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N), aspartic acid (Asp or D), cysteine (Cys or C), glutamine (Gln or Q, glutamic acid ( Glu or E), Glycine (Gly or G), Histidine (His or H), Isoleucine (Ile or I), Leucine (Leu or L), Lysine (Lys or K), Methionine (Met or M), Phenylalanine (Phe) or F), proline (Pro or P), serine (ser or S), threonine (Thr or T), tryptophan (Trp or W), tyrosine (Tyr or Y), valine (Val or V).
  • DNA polymerase mutation for achieving the object of the present invention can generally be achieved by changing the gene sequence encoding the polymerase.
  • the triple codon sequence of the amino acid to be changed is not limited to the present invention.
  • DNA polymerase mutation for achieving the object of the present invention does not limit the scope of the present invention to the technology of expressing DNA polymerase.
  • the type of protein expression and cloning vector, the type of promoter for expression, tagging to facilitate purification (His tag, etc.) optimization of the gene sequence to the host cell, the type of host cell (bacteria, yeast, Birds, invertebrate cells (insects), plant cells, mammalian cells and in vitro translation systems (in-vitro translation system, etc.) it is not going to be
  • the method for obtaining a DNA polymerase variant for achieving the object of the present invention is not limited to the present invention.
  • the present invention is not limited because specific methods such as apparatus for chromatography, buffer, type of resin, type of column, precipitation method, filtration method, etc. are different from those exemplified in the present invention.
  • PCR primers include allele specific primers (AS primers) or ARMS (amplification refractory mutation system) primers.
  • 3' mismatch refers to a mismatch between the 3' end of the primer and the template, and at least one of 7 bases or 5 bases at the 3' end of the primer is complementary to the template (or target gene) It means not, and more specifically, includes the case where the last base at the 3' end of the primer is non-complementary to the base of the template.
  • the term "3' match” refers to a complementary match between the 3' end of the primer and the template (or target gene), and includes cases in which the last base at the 3' end of the primer is complementary to the base of the template. .
  • the DNA polymerase in the present invention is preferably an enzyme belonging to the polymerase group A (E. coli Pol I family).
  • the polymerase is heat-resistant bacterium, preferably a heat-resistant eubacteria (eubacteria) may be selected from DNA polymerase derived, more preferably sseomeoseu (Thermus) species, Motor the (Thermotoga) species, Thermococcus Rhodococcus (Thermococcus) written species, Deinococcus species, Bacillus ( Bacillus ) It may be selected from DNA polymerases derived from species, etc. In addition, this DNA polymerase is applicable to several biotechnological methods including PCR.
  • the object of the present invention can be achieved through mutation of a loop region or a corresponding region of a DNA polymerase.
  • the object of the present invention can be achieved through mutation of the loop region (residues 497-514) of Taq DNA polymerase and the corresponding loop region of family A DNA polymerase.
  • An object of the present invention is to be achieved through mutation of one or more non-charged amino acids through mutation of the loop region (497-514) of Taq DNA polymerase or the loop region of the corresponding family A DNA polymerase.
  • the object of the present invention can be achieved through mutation of one or more charged amino acids through mutation of the loop region (497-514) of Taq DNA polymerase or the loop region of the corresponding family A DNA polymerase.
  • the object of the present invention can be achieved through mutation of one or more positively charged amino acids through mutation in the loop region (497-514) of Taq DNA polymerase or the loop region of the corresponding family A DNA polymerase. .
  • the object of the present invention can be achieved by substituting K at position 505 of Taq DNA polymerase or an amino acid belonging to the corresponding loop region of family A DNA polymerase.
  • the object of the present invention can be achieved by substituting E at position 507 of Taq DNA polymerase or an amino acid belonging to the loop region of the corresponding family A DNA polymerase.
  • the object of the present invention can be achieved by substituting R at position 508 of Taq DNA polymerase or the corresponding amino acid belonging to the loop region of family A DNA polymerase.
  • the object of the present invention can be achieved by substituting K at position 511 of Taq DNA polymerase or an amino acid belonging to the loop region of the corresponding family A DNA polymerase.
  • the object of the present invention can be achieved by substituting R at position 512 of Taq DNA polymerase or an amino acid belonging to the loop region of the corresponding family A DNA polymerase.
  • the mutations tested are G499R, K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, E507G, E507K, E507Q, K508A, K508S, K508R, K511A, K511R, R512K, R512W, etc.
  • K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, K508A, K508S, K508R, K511A, K511R, R512K or R512W mutant Taq DNA polymerase is a positively charged amino acid substituted with another amino acid.
  • the effect and originality of the present invention can be explained by examining the relationship between the activity and structure of the variant in the loop region of the present invention and the electrostatic interaction between the primer and amino acids in the loop region.
  • the variant region according to an example of the present invention is a loop region (497-514; SEQ ID NO: 7) of Taq DNA polymerase (SEQ ID NO: 1) or a loop region of a corresponding family A DNA polymerase.
  • This loop region is a DNA binding region.
  • the region cleaved by the E. coli protease (OmpT) described in the example of the present invention is this loop region, and since cleavage by the protease is inhibited in this region while DNA is bound, this loop region is a DNA binding region. It was confirmed in the invention.
  • this loop region corresponds to the tip of the thumb domain, which has not been previously intensively searched for DNA polymerase modification, with Ha (487-496) and Hb (515-521) ( Kim, Eom et al. 1995) (Li, Korolev et al. 1998) (Fig. 1), and this site is predicted to bind to the phosphate backbone of the primer.
  • the region intensively searched for is the loop region (497-514) between Ha (487-496) and Hb (515-521) of Taq DNA polymerase.
  • This region is a region related to binding to a DNA primer as described in the present invention examples.
  • the binding region of the primer for DNA polymerization was considered as a mutation target to develop an enzyme that distinguishes 3' match and 3' mismatch, which is the main object of the present invention.
  • the intensive search for the loop region provides a very important way for the development of new enzymes with increased differentiation between the match and mismatch between the base at the 3' end of the primer and the template DNA.
  • the amino acid residue to be mutated is arginine (Arg or A), histidine (His or H), lysine (Lys or K), or negative amino acid residues aspartic acid (Asp or D), glutamic acid (Glu or E).
  • amino acid residues play a very important role in which charged residues play a very important role in determining the binding affinity between DNA, in particular a primer and a DNA polymerase, and therefore, one or more mutations of these may change the binding affinity of DNA, in particular a primer, to an enzyme, resulting in distinct differentiation.
  • This increase and/or the PCR amplification activity may be increased and/or the specificity of the substrate may be changed.
  • Negatively charged amino acids present in this loop region or newly introduced may interfere with binding between the loop and the DNA primer phosphate backbone, thereby reducing DNA polymerase activity.
  • a positively charged amino acid existing in the loop region or newly introduced may facilitate binding of the loop region to the primer phosphate backbone, thereby improving DNA polymerase activity.
  • polymerase activity is maintained or improved through amino acid mutation of the loop region between the Ha and Hb domains of a family A thermostable DNA polymerase including Taq DNA polymerase, while the base match or miss between the template and the primer A DNA polymerase variant with improved differentiation according to a match is provided.
  • Such a DNA polymerase variant is used in real-time PCR and is useful for single nucleotide polymorphism analysis (SNP genotyping) and somatic mutation detection.
  • such a DNA polymerase mutant can be used in a PCR kit to improve differentiation.
  • FIG. 1 shows a region of a DNA polymerase in which amino acids binding to a primer are concentrated. Comparison of the loop region (residues 497-514) of Taq DNA polymerase and its neighboring regions among the DNA polymerase regions of T. aquaticus , T. sp Z05 , T. maritima , E. coli , B. caldotenax , G. stearothermophilus will be.
  • FIG. 2 is an SDS-PAGE photograph of Taq DNA polymerase.
  • A E. coli These are the results of digestion of wild-type Taq DNA polymerase expressed in MV1184. The red arrow indicates the protein band resulting from degradation. DEAE column chromatography purification was washed with buffer A to remove KCl. S is the standard product for wild-type Taq DNA polymerase. 0, no filtration; 1x, filter once; 2x, 2 times filtration; S Standard Taq DNA Polymerase.
  • B E.
  • 3 is an SDS-PAGE photograph of a Taq DNA polymerase degradation product. 1: Untreated group, 2: Decomposition treated group.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a Taq DNA polymerase cleavage site and an OmpT recognition site (P).
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the structure of a loop (loop) structure of Taq DNA polymerase and a close structure of DNA.
  • ⁇ -helix Ha (residues 487-496, blue region) present in the thumb subdomain of Taq DNA polymerase
  • ⁇ -helix Hb (residues 515-521, blue region)
  • ⁇ -helix I (527- 552 residues, purple region)
  • loops (497-514 residues, between the two blue regions, uncharged amino acid residues (green region), numbers indicate amino acid residue positions in Taq DNA polymerase).
  • FIG. 6 shows real-time PCR results using a K511A Taq DNA polymerase mutant and a wild-type Taq DNA polymerase.
  • normal DNA w
  • mutant DNA m
  • the number means the value obtained by subtracting the Ct value of real-time PCR using mutant DNA from the Ct value of real-time PCR using normal DNA.
  • WT results using wild-type Taq DNA polymerase
  • K511A results using K511A mutant Taq DNA polymerase.
  • 7A and 7B are real-time PCR results for confirming the differentiation of Taq DNA polymerase variants including representative mutations at each site. Mutation discrimination of BRAR-V600E and EGFR-T790M was tested with a controlled-restricted sample from the E. coli BL21 (DE3) strain expressing each mutant protein. WT: As a result of using wild-type Taq DNA polymerase, G499R, K505G, E507K, K508S, K511A, and R512W are results using the corresponding Taq DNA polymerase variant, respectively.
  • FIG. 8 shows real-time PCR results using CS2-K511A and K511A Taq DNA polymerase mutants and wild-type Taq DNA polymerase.
  • Normal DNA (w) and mutant DNA (m) of EGFR-T790M were used as templates.
  • the forward primer used at this time was EGFR-ARMS-F.
  • WT wild-type Taq DNA polymerase
  • K511A K511A mutant Taq DNA polymerase
  • CS2-K511A CS2-K511A mutant Taq DNA polymerase.
  • one or more amino acids in the loop region between the Ha and Hb sequences are mutated in a DNA polymerase having 80% or more homology with Taq DNA polymerase consisting of SEQ ID NO: 1 or a Klenow fragment thereof , It relates to a DNA polymerase mutant that maintains polymerization activity compared to wild-type DNA polymerase and has improved allele or genetic mutation discrimination.
  • the present invention relates to a DNA polymerase variant, wherein the mutation is a substitution, insertion or deletion of an amino acid.
  • the present invention relates to a DNA polymerase variant, wherein the loop region is positions 497-514 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto.
  • the present invention provides that the mutation is 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 505, 506, 509, 510, 511, 512, 513, 514 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto from the group consisting of It relates to a DNA polymerase variant in which amino acids at one or more selected positions are mutated.
  • the present invention relates to a DNA polymerase variant further comprising one or more mutations of I707L and E708K or one or more mutations in the corresponding positions in addition to the mutations at the above positions.
  • the present invention provides that the DNA polymerase having 80% or more homology with the Taq DNA polymerase consisting of SEQ ID NO: 1 is 90% or more, or 91% or more, or 92% or more, or 93% or more, or 94% or more It relates to a DNA polymerase variant having homology, more preferably at least 95%, or at least 96%, or at least 97% homology.
  • the present invention relates to a DNA polymerase variant in which one or more of the charged amino acids present at positions 497, 505, 511 and 512 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto are mutated.
  • the present invention relates to a DNA polymerase variant in which one or more of the positively charged amino acids present at positions 505, 511 and 512 or a position corresponding thereto of SEQ ID NO: 1 are mutated.
  • the present invention relates to a DNA polymerase variant in which one or more amino acids present at positions 504, 507, 508, 707, 708 or a position corresponding thereto of SEQ ID NO: 1 in addition to the above amino acid mutation positions are further mutated.
  • the present invention is selected from the corresponding mutations in G499R, K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, E507A, E507G, E507S, E507R, E507Q, K508A, K508G, K508S, K511A, K511S, R512K, R512W or equivalent positions It relates to a DNA polymerase variant comprising one or more mutations.
  • the present invention relates to a DNA polymerase variant comprising a mutation of three amino acids K511A, I707L and E708K or a mutation in a position corresponding thereto.
  • the present invention relates to a method of performing a real-time polymerase chain reaction with improved allele or gene mutation discrimination using the DNA polymerase mutant.
  • the present invention relates to a polymerase chain reaction kit containing the DNA polymerase variant.
  • a vector pJR-Taq constructed such that the Taq DNA polymerase gene was located downstream of the lac promoter in plasmid pUC18 was used.
  • Each variant was constructed as a site-directed mutation using the vector pJR-Taq as a template.
  • a corresponding Taq DNA polymerase mutant was made through site-directed mutagenesis as follows using primers (SEQ ID NOs: 8-93) to amino acids for mutation. After PCR was performed using Pfu DNA polymerase (Enzynomics, Korea), the restriction enzyme Dpn I (Enzynomics, Korea) was treated to remove the unmutated template DNA, and the mutated plasmid was transformed into E. coli DH5 ⁇ to transform A plasmid was obtained.
  • the nucleotide sequence variation of the target sequence region of the obtained plasmid was confirmed by nucleotide sequence analysis.
  • By cutting the vector of each mutant plasmid was obtained in order to minimize the sequence variation in the other parts other Taq DNA polymerase gene with Kpn I / BamH I to obtain a fragment of about 1.3 kb, a pJR-Taq with Kpn I / BamH I After cutting and linking with a 3.8 kb fragment from which 1.3 kb was removed, it was transformed into E. coli DH5 ⁇ to prepare a vector for expression of each mutant.
  • E. coli MV1184 ompT +
  • E. coli DH5 ⁇ DE3
  • ompT - E. coli DH5 ⁇
  • E. coli was pre-cultured in LB (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) medium at 37°C for 8 hours, and 2X YT medium (1.6% tryptone, 1.0% yeast extract, 0.5% NaCl) was inoculated with 1% of the pre-culture solution, and the main culture was performed at 37°C. When the OD 600 value of the culture solution reached 0.4 to 0.6, 0.5 mM IPTG was added and cultured for about 4 hours.
  • the culture solution was cooled by immersing it in ice water, and then centrifuged (10,000 xg, 10 min, 4°C) to recover the cells.
  • the recovered cells are suspended in buffer A [50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1 ⁇ M PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)] of 1/10 (v/v) of the culture medium and centrifuged to recover. After removing the medium components by repeating twice, it was prepared by resuspending in buffer A of 1/20 to 1/40 (v/v) of the culture solution.
  • Taq DNA polymerase was prepared from the cell suspension (Experimental Example 2) obtained in 100 ml of the culture medium. The cell suspension was disrupted using an ultrasonic disruptor (2 mm tip, amplitude 25%, 9.9 s/3 s (on/off), 5 min) and then centrifuged (10,000 xg, 10 min, 4°C) to supernatant. was recovered. RNase was added to the supernatant so as to be 50 ⁇ g/ml, reacted at 37°C for 30 minutes, heat-treated at 75°C for 20 minutes, and centrifuged (10000 xg, 10 min, 4°C) to recover the supernatant (4.0 ml) and prepare the crude sample was secured. This sample was used for comparison of Taq DNA polymerase activity after protein quantification.
  • Taq DNA polymerase was purified with high purity from the cell suspension obtained in 4.5 L culture medium. After disrupting the cells of the cell suspension (100 ml) using an ultrasonic disrupter (13 mm tip, amplitude 90%, 5.5 s/9.9 s (on/off), 1 h), centrifugation (10,000 x g, 10 min, 4 °C) to recover the supernatant. Streptomycin sulfate was added thereto to a concentration of 5%, stirred for 30 minutes, and centrifuged (10,000 x g, 10 min, 4° C.) to recover the supernatant. This solution was heat-treated at 75° C.
  • the decontaminated solution was filtered through a 0.45 ⁇ m syringe filter (Sartorius) and purified by FPLC (AKTA, UPC-900).
  • FPLC FPLC
  • Column chromatography was performed in the following order: DEAE sephacel (30 ml in XK26/20 column, GE healthcare), SP sepharose (20 ml in XK16/20 column, GE healthcare), and heparin sepharose (10 ml in HR16 column, GE healthcare).
  • buffer A DEAE sephacel and heparin sepharose column
  • buffer B 20 mM HEPES (pH 6.9), 1 mM EDTA, 1 uM PMSF] (Q sepharose column)
  • elution is performed using 1 M KCl Proteins were eluted with a gradient using both A and B buffers.
  • the eluted fraction containing Taq DNA polymerase was recovered from each column step and filtered with VIVASPIN20 (MW: 50,000). This filtration process is performed for washing and concentration for decontamination or activity test. After concentrating the fractions recovered from each column with VIVASPIN20 (MW:50,000), it is repeated twice with about 15 ml of buffer A or B in the next step. Washed and filtered.
  • next column it was dissolved with 10 to 20 ml of the same buffer and applied to the next column, or dissolved with an appropriate solution according to the test and tested.
  • Each purification step or final purified Taq DNA polymerase was quantified and compared using SDS-PAGE (12% polyacryl amide gel electrophoresis) and Bradford assay reagent (Sigma) using bovine serum albumin as a standard protein.
  • composition and conditions of PCR used in Examples of the present invention are as follows.
  • the template DNA used for PCR was each target detection gene BRAF c.1799 rc. Normal (SEQ ID NO: 3) or mutant sequence (SEQ ID NO: 4) of A>T (p.V600E) (hereinafter BRAF-V600E) and EGFR c.2369 C>T (p.T790M) (hereinafter BRAF-T790M) normal ( SEQ ID NO: 5) or mutant sequence (SEQ ID NO: 6) is synthesized and inserted into pTOP Blunt V2 (Enzynomics, Korea), transformed into E. coli, and then cultured and purified plasmid DNA is cut with restriction enzymes and purified After quantification, 2 x 10 7 copy/reaction was used.
  • Forward primer 5'- GGGACCCACTCCATCGAGATTTCT-3' (BRAF-AS-F; SEQ ID NO: 94); reverse primer 5'-AACTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAG-3' (BRAF-R; SEQ ID NO: 95); Signal probe 5'-FAM-CTGTGAGGTCTTCATGAAG-BHQ1-3' (BRAF-P; SEQ ID NO: 96) was used, and in order to confirm EGFR-T790M mutation discrimination, forward primer 5'-AGCCGAAGGGCATGAGCTGCA-3' (EGFR-AS- F; SEQ ID NO: 97) or 5'-AGCCGAAGGGCATGAGCTACA-3' (EGFR-ARMS-F; SEQ ID NO: 98); reverse primer 5'-AGTGTGGACAACCCCCACGTGTGC-3' (EGFR-R; SEQ ID NO: 99); The signal probe 5'-FAM-CGGTGGAGGTGAGGCAGATG-BHQ1-3' (EGFR-P; SEQ
  • the forward primer is designed such that the final 3' terminal base is matched with the mutant gene or the normal gene and the final terminal base are mismatched (mismatched) to detect mutations in the target detection genes BRAF-T790M and BRAF-V600E. or ARMS primer. 10 pmol/reaction was used for each primer and 20 pmol/reaction was used for the probe.
  • PCR for BRAF-V600E classification is performed 50 times at 95 °C (5 minutes), then 95 °C, 30 seconds - 55 °C (1 minute), and PCR for EGFR-T790M classification is 95 °C (5 minutes) After that, 95°C (30 sec) - 55°C (40 sec) was repeated 50 times.
  • the buffer solution is 10 mM Tris, pH 9.0, 1.5 mM MgCl 2 , 1 mM dNTPs, 60 mM KCl, 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ), and the CFX96 real-time PCR detection system (Bio-Rad, Hercules , CA, USA) to perform PCR.
  • concentration of KCl is changed or betaine is added, or the type of enzyme (according to whether it is a wild-type or mutant Taq DNA polymerase) or the amount of the enzyme is used differently.
  • Example 1 Decomposition of Taq DNA Polymerase according to E. coli-expressing parent strain
  • the fraction of the DEAE sephacel chromatography purification step of the Taq DNA polymerase mutant containing the cultured and purified E507K mutation was obtained.
  • 50 ⁇ l of this fraction sample (about 4 ⁇ g protein/ ⁇ l) was divided into buffer A without KCl (0 M KCl) and buffer A containing 100, 300, and 500 mM KCl in buffer A.
  • VIVASPIN20 MW: 50,000, 50 ml capacity
  • Example 4> the fraction of the DEAE sephacel chromatography purification step of Taq DNA polymerase containing E507K mutation was obtained. About 50 ⁇ l (about 4 ⁇ g protein/ ⁇ l) of this fraction sample was mixed with the fraction (BP) obtained after Taq DNA polymerase was eluted by DEAE column chromatography in a double volume (100 ⁇ l) ⁇ Experiment The filtration process was performed as in Example 4>. After performing the filtration process using VIVASPIN20 (MW: 50,000) as buffer A, the sample recovered by dissolving 250 ul of buffer A was confirmed for protein degradation by SDS-PAGE.
  • VIVASPIN20 MW: 50,000
  • the decomposition inhibitor is presumed to be a nucleic acid such as DNA rather than an unknown protein.
  • each 0.4, 2.0, 10. or 50 ⁇ g DNA (salmon sperm nucleic acid, Sigma) was mixed with 50 ul of the fraction of the DEAE sephacel chromatography purification step of the Taq DNA polymerase mutant containing the E507K mutation.
  • the same filtration process as above was performed with buffer A.
  • Taq DNA polymerase was not degraded as in the BP treatment group. This clearly indicates that the nucleic acid inhibits the degradation of Taq DNA polymerase by proteolytic enzymes. That is, these results suggest that the degradation site of Taq DNA polymerase is related to a site important for binding to DNA or a site for binding to DNA.
  • the two fragments were electrophoresed on SDS-PAGE gel, and the protein fragments were recovered and the amino acid sequence was analyzed.
  • the exact position of the cleavage could not be specified, but the 60 KDa fragment was the N-terminal fragment of Taq polymerase, 33 KDa.
  • the fragment was identified as a C-terminal fragment, and the 33 KDa N-terminal sequence was analyzed to confirm a more accurate cleavage site based on this.
  • the N-terminal sequence of the 33 KDa fragment was R-S-T-S... It was confirmed that The corresponding sequence on Taq DNA polymerase was R512-S513-T514-S515, and thus the cleavage site was determined between K511 and R512 (Fig. 4).
  • the cleavage sites K511 and R512 consist of two consecutive positively charged amino acids. These consecutive positively charged amino acids are well known as the preferred cleavage site for E. coli membrane protease OmpT. It has been reported that protein cleavage by OmpT is significantly inhibited when negatively charged amino acids exist in several amino acid residues (P6 to P'6) on both sides of the OmpT cleavage site (Hritonenko and Stathopoulos 2007, Schechter and Berger 2012).
  • the Taq DNA polymerase mutant containing the E507K mutation is more easily degraded than the wild-type Taq DNA polymerase, which means that E507, which corresponds to the P5 position of the OmpT recognition site, is a negatively charged amino acid glutamic acid (glu, E ) to the positively charged amino acid lysine (lys, K).
  • the E507K mutant Taq DNA polymerase has a greater substrate affinity for OmpT than the wild-type Taq DNA polymerase, so that the peptide bond of adjacent consecutive positively charged amino acid residues K511 and R512 [P1(K) - P1'(R)] is OmpT protease It is described as being easily cleaved by (Fig. 4).
  • the K511-R512 site which is the site of degradation, confirmed in ⁇ Example 4>, has a small ⁇ -helical structure corresponding to the end of the thumb domain of Taq DNA polymerase Ha (487-496) and Hb It is in the loop region 497-514 between 515-521 ( FIGS. 1 and 5 ).
  • Ha and Hb are conserved regions with high homology between family A DNA polymerases, whereas the loop region consists of relatively less conserved regions than these, but very interestingly This region is characterized by few negatively charged amino acids and a large number of positively charged amino acids.
  • the structure of the loop region was determined using 3KTQ information, which is the crystal structure DB of Taq DNA polymerase and DNA in the protein database (PDB, https://www.rcsb.org/ ), to PyMOL ( https://pymol.org /2/) I looked closely at the program. As a result, it was confirmed that this loop structure surrounds the backbone region of the primer (FIG. 5). This structure shows the relevance of the inhibition of the degradation of Taq DNA polymerase by DNA.
  • this loop region is closely related to DNA binding including primers.
  • the loop region of Taq DNA polymerase interacting with the primer can be a very important site for the development of enzyme variants that increase the efficiency of PCR or increase the differentiation.
  • Amino acids in the loop region may be an important engineering target region, and in particular, a charged amino acid present in this region may be selected as a primary modification target. Since the positively charged amino acids of the loop region are capable of electrostatic interaction with the negative charge of the phosphate backbone of the primer, their mutation can be expected to change the activity of Taq DNA polymerase, especially the characteristic of the polymerase that shows differentiation. .
  • K511 and R512 which are positively charged amino acids, which are cleavage regions, among several amino acids present in the loop region.
  • K511 and R512 were changed to alanine (A), a representative uncharged amino acid, by the site-directed mutagenesis method of ⁇ Experimental Example 1> to prepare K511A and R512A Taq DNA polymerase mutants.
  • This mutant was expressed in E. coli BL21 (DE3) and each mutant Taq DNA polymerase was adjusted for activity by PCR.
  • the K511A mutant had high activity comparable to that of the wild-type Taq DNA polymerase, but the R512A mutant In the case of , Taq DNA polymerase activity was not shown. From these results, it was estimated that arginine, a positively charged amino acid at the R512 position rather than K511, plays a very important role in binding to the primer.
  • the K511A Taq DNA polymerase mutant prepared in ⁇ Example 6> was cultured as in ⁇ Experimental Example 2> and ⁇ Experimental Example 4>, and purified by SDS-PAGE to a purity of 95% or more. Real-time PCR was performed on the purified K511A Taq DNA polymerase as in ⁇ Experimental Example 6>. Under the PCR conditions performed, K511A Taq DNA polymerase showed significantly higher differentiation than wild-type Taq DNA polymerase.
  • BRAF-V600E [A and T base separation (template DNA; SEQ ID NOs: 5, 6)] of the K511A variant 3'- Mismatch discrimination was confirmed.
  • high discrimination between match and mismatch was shown in real-time PCR using K511A Taq DNA polymerase ( FIG. 6 ).
  • the activity change of the K511A mutant was confirmed by comparing it with that of the wild-type Taq DNA polymerase (Table 3). Wild-type Taq DNA polymerase maintained a relatively high activity even at a high KCl concentration, and the discrimination between match and mismatch tended to increase as the enzyme concentration increased. In particular, in the case of the K511A mutant, the activity was maintained up to a KCl concentration of about 80 mM when BRAF-V600E was detected and up to a KCl concentration of about 100 mM when EGFR-T790M was detected.
  • the appropriate concentration ranges of KCl and betaine for optimal differentiation of match and mismatch PCR using the K511A mutant may vary depending on the target template and primer or PCR conditions.
  • Mt denotes a mutant DNA template
  • Wt denotes a wild-type DNA template
  • the mutant was cultured using E. coli BL21 (DE3) as the parent strain according to ⁇ Experimental Example 2>, and adjusted according to ⁇ Experimental Example 3>, and the activity was tested for this modifier sample according to ⁇ Experimental Example 5>.
  • Each conditioned Taq DNA polymerase sample was quantified by Bradford assay and diluted 2-fold (300 ng), 4-fold (150 ng), 16-fold (75 ng), 32-fold (37.5 ng) starting with approximately 600 ng of protein. to evaluate by performing a PCR reaction (Table 3).
  • WT wild-type
  • ⁇ Ct Ct of mutant template - Ct of wild type template
  • ⁇ Ct Taq DNA polymerase variants.
  • the test was evaluated by the mutation discrimination of BRAF-V600E. If ⁇ Ct is less than 1, -; 1 or more and less than 3 +; If 3 or more and less than 6, ++; If it is 6 or more, it is expressed as +++. If not measured, it is expressed as nd.
  • variants with relatively high differentiation were K511R and R512K
  • variants with very high differentiation (+++) were K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, K508S, K508R, K511A, R512W. was (Table 3 and Figure 7a, Figure 7b).
  • the presence of negatively charged amino acids in the loop region which is the concentrated mutation region of the present invention, interferes with binding between the phosphate of the DNA backbone and the loop region, resulting in a decrease in activity
  • the presence of a positively charged amino acid in the region induces a strong bond between the protein and the primer, which is believed to help maintain stable activity.
  • the positively charged amino acid of the loop region is substituted with the uncharged amino acid, the loss of activity is not large and it is confirmed that the differentiation is improved.
  • a mutant strain CS2-K511A introducing I707L and E708K mutations, which are reported sites as cold sensitive mutants was prepared according to the method of ⁇ Example 6>. . It was cultured as in ⁇ Experimental Example 2> and ⁇ Experimental Example 4> and purified to a purity of 95% or more by SDS-PAGE. Real-time PCR was performed on the purified CS2-K511A Taq DNA polymerase as in ⁇ Experimental Example 6>. However, in this case, EGFR-ARMS-F was used as the forward primer. In the PCR conditions performed, CS2-K511A Taq DNA polymerase showed very high discrimination between match and mismatch in real-time PCR compared to wild-type Taq DNA polymerase (Table 3 and FIG. 8).
  • the DNA polymerase mutant with improved differentiation of the present invention maintains or improves polymerase activity, and improves differentiation according to base match or mismatch between the template and the primer, so the presence and amplification of a complementary position or a non-complementary mutation site Since it is easy to check whether or not it exists, it is easy to detect alleles in a sample containing a small amount of multiple varieties, so it is easy to detect a mutant gene in a sample containing a trace amount of mutation, and it is used for genetic testing of agricultural, fishery, livestock products, etc. or for diagnosis in the medical field. Widely available.

Abstract

본 발명은 패밀리 A에 속하는 DNA 중합효소 변이체 및 그 이용에 관한 것으로서, 프라이머 3' 말단의 염기가 주형과 상보적일 때는 중합이 원활하게 일어나며, 비상보적일 때는 중합이 억제되어 두 경우의 구별 (discrimination)이 용이하게 되는 DNA 중합효소 변이체, 이 변이체를 이용한 PCR 방법 및 이 변이체를 포함하는 PCR 킷트에 관한 것이다. 본 발명은 단일염기다형성 분석 (SNP genotyping) 및 체세포 돌연변이 검출 (somatic mutation detection) 등에 유용하다.

Description

유전자 변이에 대한 구분성이 향상된 DNA 중합효소 변이체
본 발명은 패밀리 A에 속하는 DNA 중합효소 변이체 및 그 이용에 관한 것으로서, 프라이머 3' 말단의 염기가 주형과 상보적일 때는 중합이 원활하게 일어나며, 비상보적일 때는 중합이 억제되어 두 경우의 구별 (discrimination)이 용이하게 되는 DNA 중합효소 변이체, 이 변이체를 이용한 PCR 방법 및 이 변이체를 포함하는 PCR 킷트에 관한 것이다. 본 발명은 단일염기다형성 분석 (SNP genotyping) 및 체세포 돌연변이 검출 (somatic mutation detection) 등에 유용하다.
인간 등 여러 생명체의 형질, 약물대사, 면역학적 반응, 유전병과 암과 같은 질환 등에 관여하는 유전적 변이 즉, 단일염기 다형성, 부가, 결실 등의 유전적 변이를 확인하는 것은 치료의 예측, 치료 방법의 결정, 치료 예후 및 재발의 관찰 등 정밀의료 구현에 있어서 매우 중요하다 (Auton, Brooks et al. 2015, Zhang, Qin et al. 2004, Poste 2001, Nakagawa and Fujita 2018, Martincorena and Campbell 2015). 또한, 유전적 변이 확인 또는 구별은 농식품 분야에서 종의 육종 및 선별, 원산지 및 품종의 판별 등에도 매우 유용하다.
유전적 변이는 생명체에게 태생적으로 존재하거나 또는 성장과정 중에 환경적인 또는 내생적인 원인으로 발생할 수 있다. 인체 등의 유전적 변이 형태 중 가장 흔한 것은 단일염기 다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)이다. 이하 발명의 설명에서는 다양한 유전적 변이를 대표하여 SNPs를 예로 들어 설명한다.
인간을 포함하는 생명체가 지닌 SNPs의 판별에 사용되는 방법 중 가장 보편적이며 경제적이고 간편한 방법은 중합효소를 활용한 유전자 증폭기술 즉, PCR (polymerase chain reaction) 기술이며, 특히 PCR 과정에서 실시간으로 유전자 변이량을 측정할 수 있는 정량적 실시간 PCR (quantitative real time PCR; "qPCR" 또는 "실시간 PCR")이 유용하다. 핵산의 정성적 및 정량적인 검출 기법인 실시간 PCR은 보건, 농업, 식품, 환경 등의 다양한 분야에서 응용되고 있다. 1990년 초 개발된 실시간 PCR은 지속적으로 기술적 한계점을 개선하여 좀 더 정확하고 정밀한 기법으로 발전해 오고 있다.
실시간 PCR을 이용한 유전자 판별 킷트 개발에 있어서 비특이적 신호의 발생, 그리고 돌연변이와 야생형 유전자 서열의 낮은 구분성은 실시간 PCR의 대표적인 기술적 한계로 여겨진다.
특히 암, 병원체 검출 등의 진단기술로서 실시간 PCR 기술의 개발을 위해서는 비특이적 신호의 제어가 필수적이다. 비특이적 신호로 인하여 위양성이 나타나는 경우 검사의 신뢰도가 저하가 되며, 특히 극소량의 검출이 필요한 비침습성 또는 최소 침습성 액체생검 (liquid biopsy)과 같은 진단 기술에서는 소량의 표적 변이를 정확하게 진단하기 위하여 PCR 효율성의 증대와 특이성 (specificity)을 높이는 기술이 필요하다. PCR의 효율성과 특이성을 높이기 위해 PCR 용액에 첨가하는 조성물을 개발하거나, 특별한 프로브 (probes) 또는 프라이머 (primers)를 고안하거나, 효소를 개량하는 방법이 모색되어 왔다.
PCR 용액에 첨가하는 조성물로는 주로 PCR의 반응성을 높이는 방법, 프라이머 다이머 (primer dimers)의 생성, 또는 사용하는 프라이머가 비특이적 표적에 결합하여 생성되는 비특이적 PCR 산물의 생성, 또는 높은 GC 비율 및 특이 고차구조 형성에 등에 의한 PCR 효율의 감소를 해소하는 용도의 첨가 조성물이 연구되어 왔다. 이러한 조성물로는 DMSO (dimethylsulfoxide), 베타인 (betaine) 등이 있다.
그리고 일명 HotStart PCR을 위해 낮은 온도에서 진행되는 반응을 차단하고 고온에서 PCR이 진행되도록 하여 비특이적 증폭을 막는 방법이 다수 보고되었다. 그 중 HotStart PCR 방법으로는 DNA 중합효소 (DNAP) 특이적 단일클론 항체를 첨가하는 방법 [Biotechniques (1994) 16(6):1134-1137], DNA 중합효소의 활성을 억제하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드인 일명 앱타머 (aptamer)를 첨가하는 방법 [US/005693502A (1997) (Gold and Jayasena 1997); J. Mol. Biol. 271:100-111 (1997) (Lin and Jayasena 1997); Nucleic Acids Research Supplement No.3: 309-310 (2003) (Ikebukuro and Noma 2003)], 또는 DNA 중합효소와 낮은 온도에서 결합능력을 지니며, DNA 중합효소의 활성을 억제하지만, 특정온도 이상의 PCR 조건에서는 이중나선을 형성하지 아니하여 DNA 중합효소 활성을 억제하지 않는 이중 가닥 뉴클레오타이드를 사용하여 비특이적 DNA 합성을 억제하는 방법 [J. Mol Biol. 264(2):268-278 (1996) (Dang and Jayasena 1996); US 8,043,816 B2 (2011) (Astatke, Chatterjee et al. 2011) ]이 알려져 있다.
특별한 프로브 및/또는 프라이머를 사용하여 PCR의 효율성과 특이성을 높이는 방법에서 특별한 프로브와 프라이머는 증폭된 표적 산물을 특이적으로 검출하기 위한 것으로, 특이도가 높은 프로브를 사용하는 방법이 개발되었다. SYBR green I 또는 SYTO9와 같은 DNA 결합 형광체를 실시간 PCR에 사용하면 증폭된 산물 전체가 검출되므로 비특이적 신호가 종종 발생하는 문제점이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 표적 서열 특이적 프로브 (target sequence specific probes)가 개발되었고, 이러한 프로브로는 TaqMan 프로브 (dual labelled signaling hydrolysis probe) [P Natl Acad Sci USA 88, 7276-280 (1991) (Holland, Abramson et al. 1991)]와 분자 비콘 (molecular beacons) [Methods. 25, 463-71 (2001) (Mhlanga and Malmberg 2001)], 스콜피온 프로브 (scorpion probes) [Nat Biotechnol. 17, 804-07 (1999) (Baner, Nilsson et al. 1998)], LUX (light upon extension) 프라이머 [Nucleic acids research. 30, e37 (2002) (Nazarenko, Lowe et al. 2002)], 앰플리플루오르 프라이머 (Amplifluor primers) [BioTechniques. 26, 552-58 (1999) (Uehara, Nardone et al. 1999)] 등이 있다.
또한, 표적 변이 유전자를 선택적으로 증폭하기 위하여 특이도가 높은 프라이머 또는 특수 올리고뉴클레오타이드 블로커 (oligonucleotides blocker)를 사용하는 방법 등이 개발되었다. 특이도가 높은 프라이머를 사용하는 방법으로는 3' 말단 하나의 염기 차이에 의해 구분이 되는 AS-PCR (allele specific PCR)을 중심으로 3' 말단에 변이 서열 하나 외에 추가의 인위적인 변이 서열을 첨가하는 ARMS-PCR (amplification refractory mutation system PCR)과 같은 방법 [Mol Cell Probes. 18. 349-352 (2004) (Jarry, Masson et al. 2004); Nucleic Acids Res 17. 2503-2516 (1989) (Newton, Graham et al. 1989); Nat Biotechnol. 17. 804-807 (1999) (Whitcombe, Theaker et al. 1999); Cytokine 71, 278-282 (2015) (Bergallo, Gambarino et al. 2015)]이 있으며, 최근에는 어닐링의 안정성을 높이면서도 주형과 프라이머 간의 미스매치 구별을 유지하도록 두 개의 부분으로 분리된 프라이머를 사용하는 방법인 SeeGene 사의 DPO (dual-priming oligonucleotide) [J. Am. Chem. Soc. 126, 4550-4556 (2004) (Sherrill, Marshall et al. 2004); Biomol. Detect. Quantif. 1 3-7 (2014) (Reddington, Tuite et al. 2014); J. Clin. Microbiol. 49. 3154-3162 (2011) (Higgins, Beniprashad et al. 2011)]와 Swift Biosciences의 myT 프라이머 (http://www.swiftbiosci.com/technology/myt-primers)가 개발되었다.
비특이적인 신호를 억제하거나 또는 대립 유전자의 구분성을 높이는 PCR에 용이하게 사용하기 위한 DNA 중합효소 개발도 다수 이루어졌다. PCR 기술에는 내열성 DNA 중합효소를 사용하는 것이 일반적이다.
DNA 중합효소는 7가지 이상의 군 (family)으로 구분되지만 PCR 기술에 이용되는 내열성 중합효소는 A군에 속하는 Taq DNA 중합효소를 비롯한 내열성 세균 유래 효소군과 B군에 속하는 Pfu DNA 중합효소를 비롯한 고세균 유래 효소군에서 주로 선택된다. 그 중 Taq DNA 중합효소를 비롯한 A군의 DNA 중합효소는 일반적으로 5'→3' 뉴클레이즈 활성을 가지고 있으며, 이 5'→3' 뉴클레이즈 활성에는 엑소뉴클레이즈 활성 및 엔도뉴클레이즈 활성이 모두 있고, 이 엔도뉴클레이즈 활성 부분을 플랩 엔도뉴클레이즈 1 (Flap Endonuclease 1; FEN1)이라고도 한다. 이 활성은 가수분해 프로브 (예컨대 TaqMan probe)의 분해를 통한 특이 신호 (specific signal)의 방출에 매우 중요하다. Taq DNA 중합효소는 3'→5' 엑소뉴클레이즈 활성이 없으므로 3' 최종 말단이 주형 DNA와 비상보적인 프라이머를 사용하는 PCR에 매우 적합하다. 3' 말단이 비상보적인 AS (allele specific) 프라이머 또는 ARMS (amplification refractory mutation system) 프라이머의 경우 프라이머 3' 염기 (base)의 매치 또는 미스매치에 따라 돌연변이와 야생형 또는 두 대립 유전자의 증폭 효율이 결정되며 비교적 좋은 임상적 결과를 도출한다. 하지만, 때로 3'이 미스매치된 프라이머의 경우도 일부 증폭되므로 다수의 야생형에 혼입된 돌연변이 검출을 위한 고감도 진단에서 종종 판별 오류가 일어나게 된다.
분자진단을 위한 실시간 PCR에는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Taq DNA 중합효소가 널리 사용된다. 아래에서 별도 언급이 없는 경우 DNA 중합효소의 아미노산 서열은 서열번호 1을 따른다.
서열변호 1 (야생형 Taq DNA 중합효소)
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE
Taq DNA 중합효소는 E. coli DNA 중합효소 I이 포함되는 Family A에 속하는 내열성 효소이다. Taq 중합효소는 작은 단편인 5' 뉴클레이즈 도메인 (1-288 aa)과 큰 단편인 중합효소 도메인 (289-832)(Stoffel fragment 또는 KlenTaq)으로 나누어지고, Taq DNA 중합효소의 중합효소 도메인은 손바닥 (Palm) 서브도메인, 손가락 (Finger) 서브도메인 및 엄지 (Thumb) 서브도메인이 인간의 오른손 모양의 구조를 형성하여 DNA 이중나선구조와 잘 결합할 수 있다 (Ollis, Brick et al. 1985) (Kim, Eom et al. 1995) (Eom, Wang et al. 1996).
DNA 중합효소 I에 대한 다수의 결정 구조 연구를 통해 프라이머, 프로브, NTP 및 Mg++ 등의 결합 부위와 활성 부위의 위치를 고려한 다양한 아미노산 잔기에 대한 변이 연구가 있었다. 주요 탐색 영역으로 모티프 A 영역 (605-617 잔기) (Patel and Loeb 2000) (Suzuki, Yoshida et al. 2000), O-나선 영역 (659-671 잔기) (Suzuki, Yoshida et al. 2000), 핑거 도메인의 Pα-나선 영역 (704-707 잔기) (Kermekchiev, Tzekov et al. 2003), 뉴클레오타이드 결합 포켓 영역 (611-617 잔기)과 입체 게이트 (steric gate) 관련 아미노산 잔기 (615 잔기) 및 손바닥 도메인 (Palm domain)의 세 번째 β-시트 영역 (597-609 잔기) (Ong, Loakes et al. 2006), 모티프 C 영역 (Strerath, Gloeckner et al. 2007), 그리고 P' 도메인 영역 (704-717 잔기) (Kermekchiev, Kirilova et al. 2009)이 있다.
이러한 부위에 대해 다수의 연구를 통해 효소 활성이 증가한 돌연변이체 (Ignatov, Miroshnikov et al. 1998), Hot start PCR에 이용 가능한 저온 활성이 약한 변이체 (cold sensitive variant) (Kermekchiev, Tzekov et al. 2003) (Wu, Walsh et al. 2015) (Modeste, Mawby et al. 2019), 역전사 PCR, 중아황산염 (bisulfite) PCR, 오류 경향 PCR (error prone PCR) 등에 이용 가능하도록 rNTP, 소수성 염기 유사체 (hydrophobic base analogues) 등의 다양한 기질에 대한 이용성이 확장된 변이체 (Suzuki, Yoshida et al. 2000) (Ong, Loakes et al. 2006) ) (Strerath, Gloeckner et al. 2007) (Loakes, Gallego et al. 2009) (Schultz, Gochi et al. 2015) (Fa, Radeghieri et al. 2004) (Loakes, Gallego et al. 2009) [US 9267130B2 (2016) (Martin, Simpson et al. 2016)] US2012/0258501 A1 (Bauer, Myers et al. 2012). 연장 (Elongation) 능력이 개선된 변이체 (Yamagami, Ishino et al. 2014), 혈액, 토양 등 다양한 시료에 포함된 성분에 의한 PCR 억제에 대해 내성을 나타내는 변이체 (Kermekchiev, Kirilova et al. 2009) 등이 개발되었다.
이들과 더불어 대립형질 또는 돌연변이 특이 프라이머의 3' 말단 서열의 일치와 불일치를 구별하는 능력이 증대된 중합효소가 보고되었다 [PLos One. 9(5):e96640 (2014) (Drum, Kranaster et al. 2014) (Raghunathan and Marx 2019); KR 10-2017-0088373 (2017) (이병철 2017); US 0034879A1 (2013) (Skiragaila, Tubeleviciute et al. 2013); WO 082449A2 (2015) (Marx, drum et al. 2015); US 9,267,120 B2 (2016) (Reichert, Bauer et al. 2016); US 8,759,061 B1 (Marx, Summerer et al. 2014) Chembiochem 8 (4) 395-401 (2007) (Strerath, Gloeckner et al. 2007).
이 연구들에서는 프라이머와 주형, 그리고 효소 내로 들어오는 뉴클레오타이드와 구조상 결합되는 것으로 추정되는 아미노산 잔기를 대상으로 집중적으로 변이를 확보하고자 했고 놀랄 만한 성과를 거두었다. 특히, K508W, R536K, R587K, R660V 돌연변이체 (Drum, Kranaster et al. 2014)와 Mut_ADL 변이체 (변이부위 N483K, E507K, S515N, K540G, A570E, D578G, V586G, I614M) (Raghunathan and Marx 2019) 등은 높은 구분성을 보였고, 활성 또한 비교적 야생형 Taq 중합효소와 비견할 만한 활성을 가지고 있어 충분히 상업적 응용성을 갖추었다고 평가된다.
그러나 중합효소에 대한 돌연변이체 개발이 20년 이상 진행되어 왔으나, 위와 같은 연구를 제외하고는 높은 구분성을 가지는 중합효소의 개발은 성공적이지 못하였다. 효율적인 라이브러리 구축 전략 (CSR, spCSR, phage display)과 지향 진화 (direct evolution)와 같은 매우 용이한 변이체 제작 및 선별 시스템 등이 개발되었지만, 저해제의 첨가를 이용한 고내성 효소 선별 또는 비표준 기질 (noncanonical substrates) 등을 이용할 수 있는 효소의 선별과 같은 선택압 (selection pressure) 또는 선별 시스템 (screening system)의 설정이 구분성이 높은 효소의 선별에는 별로 유용하지 않았기 때문이다.
그러므로 정확한 표적을 기반으로 한 변이를 통해 효소를 선별하는 것이 구분성이 우수한 효소 선별 가능성을 높이는데 매우 중요하다. 그러므로 구분성과 연관된 중합효소의 구조 영역의 발굴은 구분성이 우수한 효소 개발을 담보할 수 있을 것이다.
암 진단 등을 위한 임상시료 중 생체 조직, 혈액, 분변, 타액 등의 검체 내 변이 유전자의 검출에는 극소량의 변이 DNA 외에 다수의 야생형 DNA가 혼입되어 있어 돌연변이 DNA를 특이적으로 검출하기는 매우 어렵다. 다수의 야생형에 혼입되어 1% 이하의 극미량으로 존재하는 변이를 검출할 수 있는 특이도 (specificity)를 보장할 수 있어야 하며, 임상적 적용을 위해서는 높은 견고성 (robustness)이 있어야 한다. 특히, 야생형 서열에 대한 낮은 위양성 및 돌연변이 서열에 대한 높은 특이도를 보여야 한다. 그러한 이유로, 암진단 등의 고감도 진단에 적합하도록 PCR 효율성과 특이성을 높이기 위해 PCR 용액 첨가 조성물을 개발하거나, 특별한 프로브 및/또는 프라이머를 고안하거나, 효소를 개량하는 방법이 모색되어 왔다.
DMSO, 베타인 등의 증폭효율 증대를 위한 시약, DNA 중합효소 억제용 단일클론 항체, 실온과 같은 낮은 온도에서 DNA 중합효소 활성을 억제하는 올리고핵산, 일명 앱타머의 첨가는 종종 DNA 증폭 효율을 증대하고, 비특이적 PCR 산물 증폭이나 프라이머 다이머(dimer) 형성을 억제한다. 그러나 이들을 첨가했을 때 대립 유전자의 구분성을 증대시키기 어렵다.
또한, 특이적 프라이머와 프로브 등의 사용으로 특히 단일염기 변이를 구분하는 것은 기술적으로 쉽지 않고, 보편적 적용에 한계가 있을 뿐 아니라, 특이적 프라이머나 프로브의 설계에 많은 노력과 비용이 요구된다.
현재까지 가장 접근이 쉽고 효율적인 방법은 대립 유전자의 변이 서열에 따른 3' 미스매치 유무를 통해 대립 유전자를 구분할 수 있도록 AS 프라이머 또는 ARMS 프라이머를 사용하여 대립 유전자의 구분성을 향상시키는 방법이 있다. 하나의 염기가 미스매치되는 AS 프라이머를 사용하는 경우 높은 PCR 효율에 비해 종종 대립 유전자의 구분성이 낮으며, 두 개 이상의 염기가 미스매치된 ARMS 프라이머의 경우 AS 프라이머 사용에 비해 대립 유전자의 구분성은 좋아지지만 PCR 증폭 효율이 낮아지므로 빈번하게 검출한계 (LOD; limit of detection)가 저하된다.
그러므로 3' 미스매치와 3' 매치의 구분성을 높인 돌연변이 DNA 중합효소를 사용하여 돌연변이 서열의 검출 특이도를 높이려는 연구가 계속되고 있으나, 많은 노력에도 불구하고 지금까지는 그다지 성공적인 변이체를 확보하지 못했다. 또한, 선별된 돌연변이 DNA 중합효소는 빈번하게 효소 활성이 저하되고 이에 따라 검출 감도도 저하되어 상업적으로 이용이 저조했다.
효율적으로 대립 유전자 또는 돌연변이 서열을 검출하기 위하여 중합효소의 활성이 저하되지 않으면서도, 사용하는 프라이머 3' 말단과 주형 DNA 간의 매치와 미스매치의 구분성을 높이는 효소의 개발이 지속적으로 요구된다.
따라서, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해소하고, SNPs 등의 유전자 변이를 효과적으로 검출하기 위하여, 구분성이 좋은 DNA 중합효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명의 목적은 더욱 구체적으로 주형과 프라이머 3' 사이의 미스매치와 매치의 구분성을 높이는 것이며, 이를 달성하기 위한 DNA 중합효소 변이체를 제공하는 것이고, 구체적으로 패밀리 A 계열의 DNA 중합효소를 제공하는 것이고, 더욱 구체적으로는 Taq DNA 중합효소를 포함하는 내열성 DNA 중합효소를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 DNA 중합효소 변이체를 이용한 PCR 수행방법 및 PCR 킷트를 제공하는 것이다.
구분성이 높은 DNA 중합효소 변이체를 얻기 위하여 본 발명자들은 효소 중 변이 표적 영역을 설정하고, 이 부위에 대해 집중적으로 다양한 변이체를 제작하여 탐색함으로써 우수한 변이체를 확보하였다.
본 발명에서 우리는 놀랄 만한 수준의 유전자 변이 구분성 또는 대립 유전자 구분성을 보이는 DNA 중합효소를 제공하려고 한다.
본 발명에서 탐색된 하나의 영역은 엄지 도메인 (Thumb domain)의 끝 부분 (Tip)에 해당하는 Ha (487-496) 및 Hb(515-521) (Kim, Eom et al. 1995) (Li, Korolev et al. 1998) 사이의 루프 영역 (497~514) (이하 루프(loop) 영역) (도 1)에 속하는 부분이다. 이 루프 영역은 음전하로 하전된 아미노산은 거의 없으며, 양전하로 하전된 아미노산이 다수 있어 높은 pI 값을 나타낸다. 또한, 이 영역은 매치와 미스매치의 구분성이 높은 효소로 알려진 T. sp. Z05 (서열번호 2) DNA 중합효소 (Z05)의 루프 영역과 단지 세 개의 아미노산 (R501, L505, Q509)만 차이가 있다.
서열번호 2 (TZ05 DNA 중합효소)
MKAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAVFVVFDAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGFEADDVLATLAKKAEREGYEVRILTADRDLYQLVSDRVAVLHPEGHLITPEWLWEKYGLKPEQWVDFRALVGDPSDNLPGVKGIGEKTALKLLKEWGSLENILKNLDRVKPESVRERIKAHLEDLKLSLELSRVRSDLPLEVDFARRREPDREGLRAFLERLEFGSLLHEFGLLEAPAPLEEAPWPPPEGAFVGFVLSRPEPMWAELKALAACKEGRVHRAKDPLAGLKDLKEVRGLLAKDLAVLALREGLDLAPSDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEDAAHRALLAERLQQNLLERLKGEEKLLWLYQEVEKPLSRVLAHMEATGVRLDVAYLKALSLELAEEIRRLEEEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELRLPALGKTQKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQHRELTKLKNTYVDPLPGLVHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPIRTPLGQRIRRAFVAEAGWALVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGKDIHTQTASWMFGVSPEAVDPLMRRAAKTVNFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAVAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRKRGYVETLFGRRRYVPDLNARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPHLREMGARMLLQVHDELLLEAPQARAEEVAALAKEAMEKAYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKG
서열번호 7 (야생형 Taq DNA 중합효소의 루프 영역)
497-ELGLPAIGKTEKTGKRST-514
이 루프 영역 (497~514 잔기 또는 이에 상응하는 위치)은 DNA 중합효소의 일부분에서 선택될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 DNA 중합효소 패밀리 A를 구성하고 있는 아미노산 서열 일부분에서 선택될 수 있다.
Taq DNA 중합효소의 α-나선 Ha와 Hb 영역은 중합효소 패밀리 A에서 서열이 어느 정도 보존된 영역 (80% 이상), 보존된 영역 (90% 이상) 또는 매우 보존된 영역 (95% 이상)이며 두 나선 사이에 루프 영역 (야생형 Taq DNA 중합효소의 497~514 잔기 또는 이에 상응하는 위치)이 있으며, 이 영역은 본 발명의 목적을 이루기 위해 선택될 수 있다.
본 발명에서 탐색된 루프 영역은 본 발명의 예시에서 제시하는 것과 같이 DNA 결합과 관계된 영역이다.
이 루프 영역은 본 발명의 예시와 같이 DNA와 DNA 중합효소가 결합한 상태에서 DNA 중합효소가 분해되지 않는 현상과 관련이 있다.
이 루프 영역은 본 발명의 예시와 같이 높은 KCl 농도, 즉 KCl 농도 200 mM 이상에서 DNA 중합효소가 분해되지 않는 것과 관련이 있다.
본 발명의 예시와 같이 Taq DNA 중합효소 또는 그 변이체의 분해가 DNA에 의해 억제되므로 루프 영역이 DNA 결합, 더욱 구체적으로는 프라이머 결합과 관계된 영역임을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 예시와 같이 루프 영역은 중합효소의 구조 연구 결과, Taq DNA 중합효소와 기질인 프라이머의 결합 영역으로 예측된다.
또한, 본 발명의 일례에서 구현된 것처럼 이 부위의 변이에 의해 제조된 Taq DNA 중합효소 변이체 (예컨대, "K511A" 변이체)는 3' 매치와 3' 미스매치의 PCR 구분성을 높인 것으로 나타나 본 발명에서 제시한 루프 영역이 프라이머 결합과 연관된 영역임을 말해준다.
본 발명에서 제시한 야생형 Taq DNA 중합효소의 497-514 잔기 또는 이에 상응하는 위치의 루프 영역은 본 출원 이전까지 프라이머 결합과 관계된 영역으로 보고된 적이 없다.
본 발명자들은 본 발명의 목적인 DNA 중합효소의 기질 특이성을 높이거나, 기질 특이성을 낮추는 목적을 달성하는 데 루프 영역을 이용하였다.
기질의 특이성을 높인다 함은 주형과 프라이머 간 결합에서 프라이머의 3' 말단 염기가 주형과 매치되는지 미스매치되는지에 따라 3' 매치 프라이머를 넣은 경우 3' 미스매치 프라이머를 넣은 경우보다 PCR이 더 효율적으로 진행되고/되거나 중합과정 중의 오류가 낮아지는 것을 말한다.
반대로, 기질 특이성을 낮추는 것으로는 정상적인 기질인 dNTPs 외에 rNTP, 소수성 염기 유사체 (hydrophobic base analogues) 등의 유사기질 또는 변형 기질의 사용이 용이해지는 것 및/또는 중합 오류가 많아지는 것을 예시로 들 수 있다.
본 발명자들은 본 발명의 주요한 목적인 프라이머의 3' 말단 염기가 주형과 매치되는 경우와 프라이머의 3' 말단 염기가 주형과 미스매치되는 경우 PCR의 구분성을 높이는 변이체를 선별하는 데에 본 발명에서 루프 영역을 제공한다.
본 발명의 설명, 실시예 및 청구범위에서 말하는 "구분성 (discrimination)"이라 함은 표적 유전자 서열에 존재하는 유전자 변이 또는 SNPs 등의 대립 유전자 변이를 정상 유전자와 구분하는 것을 말하며, 구체적으로는 정상 유전자 또는 변이 유전자 주형과 프라이머의 3' 말단 염기가 매치되는 경우와 미스매치되는 경우 실시간 PCR에서 표적 유전자의 증폭 정도의 차이를 말하는 것이다. 증폭 정도의 차이는 PCR 수행 후 전기영동하여 확인하거나 실시간 PCR로 3' 매치와 미스매치 간의 Ct (또는 Cq) 값의 차이 (ΔCt = 3' 미스매치의 Ct 값 - 3' 매치의 Ct 값) 등으로 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 루프 영역 (야생형 Taq DNA 중합효소의 497-514 잔기 또는 이에 상응하는 부위)을 구성하고 있는 아미노산 중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산을 원래의 아미노산에서 다른 아미노산으로 치환함으로써 본 발명의 목적을 달성할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 이 루프영역의 다수의 대표적인 아미노산 변이를 통해 본 발명의 목적을 달성할 수 있음을 보여준다.
본 발명의 일 실시예에서는 루프영역 (야생형 Taq DNA 중합효소의 497-514 잔기 또는 이에 상응하는 부위)에 속하는 극성 아미노산 중에서 선택된 아미노산에서 다른 아미노산으로의 치환으로 본 발명의 목적을 달성할 수 있음을 보여준다. 상기 극성 아미노산은 구체적으로는 양극성을 띠는 아미노산 잔기 아르기닌 (Arg 또는 A), 히스티딘 (His 또는 H), 라이신 (Lys 또는 K), 또는 음극성을 띠는 아미노산 잔기 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 E) 중에서 선택될 수 있다.
더욱 구체적으로는 본 발명은 Taq DNA 중합효소에서 K505, E507, K508, K511 및 R512 중에서 선택된 아미노산의 치환으로 본 발명의 목적을 달성할 수 있다.
또한, 패밀리 A에 속하는 다른 내열성 DNA 중합효소에서도 Taq DNA 중합효소의 루프 영역(서열번호 7)에 상응하는 영역을 선택하여 구분성을 향상시킨 DNA 중합효소 변이체를 생성할 수 있다. 구체적인 일례를 들면 Z05 DNA 중합효소 (서열번호 2)의 경우 상기 Taq DNA 중합효소의 루프 영역 (497-514)에 상응하는 영역으로서 루프 영역 (499-517)을 선택하여 중합효소 변이체를 생성하는 것이 가능하다.
더욱 구체적으로, Z05 DNA 중합효소 (서열번호 2)에서 루프 영역 (499-517)에 상응하는 아미노산 부위, 바람직하게는 루프 영역에 속하며 하전된 아미노산인 R501, K507, K510, K513 및 R515 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 치환하여 변이체를 생성할 수 있으며, Taq DNA 중합효소의 E507에 상응하는 Z05 DNA 중합효소의 Q509 또한 치환의 대상이 될 수 있다.
중합효소의 변이라 함은 중합효소를 구성하고 있는 일련의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 선택하여 원래 서열에 존재하는 아미노산 대신 다른 자연적으로 생명체가 이용하는 아미노산 19개 중 (20개 중 원래 것을 제외한) 선택되는 하나의 아미노산으로의 변환을 의미하거나, 아미노산을 화학적 또는 효소적으로 변형 (예컨대 당화 (glycosylation), 아민화 (amination), 아실화 (acylation), 수산화 (hydroxylation) 등)하거나, 또는 결실, 추가를 포함하는 것이며, 본 발명에서는 원래의 아미노산에서 다른 자연의 19개 아미노산 중 하나로 치환되는 것을 말한다. 자연의 20개의 아미노산은 알라닌 (Ala 또는 A), 아르기닌 (Arg 또는 R), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 시스테인 (Cys 또는 C), 글루타민 (Gln 또는 Q, 글루탐산 (Glu 또는 E), 글라이신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소류신 (Ile 또는 I), 류신 (Leu 또는 L), 라이신 (Lys 또는 K), 메티오닌 (Met 또는 M), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 프롤린 (Pro 또는 P), 세린 (ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 트립토판 (Trp 또는 W), 티로신 (Tyr 또는 Y), 발린(Val 또는 V)을 말한다.
본 발명의 목적을 이루기 위한 DNA 중합효소 변이는 일반적으로 중합효소를 암호화(coding) 하고 있는 유전자 서열을 변경함으로써 달성할 수 있다. 변경하는 아미노산의 삼중 코돈 (triple codon) 서열은 본 발명을 제한하지 아니한다.
또한, 본 발명의 목적을 이루기 위한 DNA 중합효소 변이는 DNA 중합효소를 발현하는 기술이 본 발명의 범위를 제한하지 아니한다. 예로 들면, 단백질 발현 및 클로닝 벡터의 종류, 발현을 위한 프로모터의 종류, 정제를 용이하게 하기 위한 태깅 (His 태그 등), 유전자 서열을 숙주 세포에 최적화하는 것, 숙주 세포의 종류 (세균, 효모, 조류, 무척추 동물세포　(곤충), 식물세포, 포유류 세포와 체외 번역 시스템 (in-vitro translation system) 등)와 같은 것으로 인하여 본 발명의 구체적인 실시예와 다른 예시라 하더라도 이로 인하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 목적을 이루기 위한 DNA 중합효소 변이체를 수득하는 방법이 본 발명을 제한하지 아니한다. 예를 들어, 크로마토그래피를 위한 장치, 완충액, 수지 종류, 컬럼의 종류, 침전 방법, 여과 방법 등의 구체적 방법이 본 발명의 예시와 다르다고 해서 본 발명을 제한하지는 않는다.
또한, 본 발명의 실시예에서 설명되는 프라이머는 본 발명을 설명하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명에서 PCR 프라이머로는 대립유전자 특이적 프라이머 (Allele specific primer; AS 프라이머) 또는 ARMS (amplification refractory mutation system) 프라이머를 포함한다.
본 발명에서 "3' 미스매치"라 함은 프라이머의 3' 말단과 주형 간의 미스매치를 말하며, 프라이머의 3' 말단에서 7염기 또는 5염기 중 하나 이상의 염기가 주형 (또는 목적 유전자)과 상보적이지 않음을 의미하며, 더욱 구체적으로는 프라이머 3' 말단의 마지막 염기가 주형의 염기와 비상보적인 경우를 포함하는 것이다.
본 발명에서 "3' 매치"라 함은 프라이머의 3' 말단과 주형 (또는 목적 유전자) 간의 상보적 매치를 말하며, 프라이머의 3' 말단의 마지막 염기가 주형의 염기와 상보적인 경우를 포함하는 것이다.
본 발명에서의 DNA 중합효소는 바람직하게는 중합효소 A 군 (E. coli Pol I 계열)에 속하는 효소이다. 이 중합효소는 내열성 세균, 바람직하게는 내열성 진정세균 (eubacteria) 유래의 DNA 중합효소에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 써머스 (Thermus) 종, 써모토가 (Thermotoga) 종, 써모코커스 (Thermococcus) 종, 데이노코커스 (Deinococcus) 종, 바실러스 (Bacillus) 종 등 유래의 DNA 중합효소에서 선택될 수 있다. 또한, 이 DNA 중합효소는 PCR을 포함하는 여러 생명공학적 방법에 적용 가능한 것이다.
본 발명의 목적은 DNA 중합효소의 루프 영역 또는 이에 상응하는 영역의 변이를 통해 달성할 수 있다.
좀 더 구체적으로 본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 루프 영역 (497~514 잔기)과 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역 변이를 통해 달성할 수 있다.
본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 루프 영역 (497~514) 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역 변이를 통해 하나 이상의 비하전 아미노산 (non-charged amino acid)의 변이를 통해 달성할 수 있다.
본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 루프 영역 (497~514) 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역 변이를 통해 하나 이상의 하전 (charged) 아미노산의 변이를 통해 달성할 수 있다.
본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 루프 영역 (497~514) 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역 변이를 통해 하나 이상의 양전하 아미노산 (positive charged amino acid)의 변이를 통해 달성할 수 있다.
본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 505 위치의 K 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역에 속하는 아미노산을 치환하여 달성할 수 있다.
본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 507 위치의 E 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역에 속하는 아미노산을 치환하여 달성할 수 있다.
본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 508 위치의 R 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역에 속하는 아미노산을 치환하여 달성할 수 있다.
본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 511 위치의 K 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역에 속하는 아미노산을 치환하여 달성할 수 있다.
본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 512 위치의 R 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역에 속하는 아미노산을 치환하여 달성할 수 있다.
본 발명의 일례로 시험된 변이는 G499R, K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, E507G, E507K, E507Q, K508A, K508S, K508R, K511A, K511R, R512K, R512W 등이며, 바람직하게는 이들 중 변이의 구분성이 높은 변이주로서 양전하 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, K508A, K508S, K508R, K511A, K511R, R512K 또는 R512W 변이 Taq DNA 중합효소이다.
이러한 효소가 발명의 목적을 달성한 이유를 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 루프 영역 내의 변이체의 활성과 구조와의 관계, 프라이머와 루프 영역 내 아미노산의 정전기적 결합 (electrostatic interaction) 연관성을 살펴보면 발명의 효과와 독창성을 설명할 수 있다.
본 발명의 일례에 의한 변이 영역은 Taq DNA 중합효소 (서열번호 1)의 루프 영역 (497~514; 서열번호 7) 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역이다. 이 루프 영역은 DNA 결합 영역이다. 본 발명의 일례에서 설명한 E. coli의 프로테아제 (OmpT)에 의해 절단되는 영역이 이 루프 영역이며, 이 영역은 DNA가 결합된 상태에서 프로테아제에 의한 절단이 억제되므로 이 루프 영역이 DNA 결합 영역임을 본 발명에서 확인하였다.
이 루프 영역은 놀랍게도 DNA 중합효소의 변형을 위해 기존에 집중적으로 탐색이 이루어지지 않은 엄지 도메인 (Thumb domain)의 끝 부분 (Tip)에 해당하는 Ha (487-496)와 Hb (515-521) (Kim, Eom et al. 1995) (Li, Korolev et al. 1998) 사이에 존재하며 (도 1), 이 부위는 프라이머의 인산 골격과 결합하는 것으로 예측된다.
본 발명의 일례에서 집중적으로 탐색된 영역은 Taq DNA 중합효소의 Ha (487-496)와 Hb (515-521) 사이의 루프 영역 (497~514)이다.
이 영역은 본 발명자들의 발명의 예시에서 설명하는 것과 같이 DNA 프라이머와의 결합과 관련이 있는 영역이다.
DNA 중합을 위한 프라이머의 결합 영역은 본 발명의 주요 목적인 3' 매치 및 3' 미스매치를 구분하는 효소를 개발하기 위한 돌연변이 대상으로 고려되었다.
본 발명에서 루프 영역의 집중적인 탐색은 프라이머 3' 말단의 염기와 주형 DNA의 매치 및 미스매치 간의 구분성이 증가된 새로운 효소의 개발에 매우 중요한 길을 제공한다.
본 발명의 일례에서 변이 대상 아미노산 잔기는 Ha (487-496) 와 Hb (515-521) 사이의 루프 영역 (497~514) 중에 양극성을 띠는 아미노산 잔기인 아르기닌 (Arg 또는 A), 히스티딘 (His 또는 H), 라이신 (Lys 또는 K), 또는 음극성을 띠는 아미노산 잔기인 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 E) 중에서 우선적으로 선택될 수 있다.
이들 아미노산 잔기는 하전된 잔기가 DNA, 특히 프라이머와 DNA 중합효소 간의 결합력을 결정하는 데 매우 중요한 역할을 하며, 그러므로 이들의 하나 이상의 변이는 DNA, 특히 프라이머의 효소와의 결합력을 변화시킴으로 인해 구분성이 증가하거나 및/또는 PCR 증폭활성이 높아지거나 및/또는 기질의 특이성이 변화될 수 있다.
이 루프 영역 내에 존재하는 또는 새로 도입하는 음전하 아미노산은 루프와 DNA 프라이머 인산 골격 간의 결합을 방해하여 DNA 중합효소 활성을 감소시킬 수 있다.
이 루프 영역 내에 존재하고 있는 또는 새로 도입하는 양전하 아미노산은 루프 영역과 프라이머 인산 골격의 결합을 용이하게 하여 DNA 중합효소 활성을 향상시킬 수 있다.
이 루프 영역 내에 존재하는 양전하 아미노산을 비전하 아미노산으로 치환하는 경우, DNA 중합효소 활성은 높게 유지되면서 구분성도 우수한 효소를 만들 수 있다.
본 발명에 따르면, Taq DNA 중합효소를 포함하는 패밀리 A 열안정성 DNA 중합효소의 Ha 및 Hb 도메인 사이의 루프 영역의 아미노산 변이를 통하여 중합효소 활성은 유지하거나 향상되면서, 주형과 프라이머 간의 염기 매치 또는 미스매치에 따른 구분성이 향상된 DNA 중합효소 변이체가 제공된다.
이와 같은 DNA 중합효소 변이체는 실시간 PCR에 사용되어 단일염기다형성 분석 (SNP genotyping) 및 체세포 돌연변이 검출 (somatic mutation detection) 등에 유용하다.
또한, 이와 같은 DNA 중합효소 변이체를 PCR 킷트에 이용하여 구분성을 향상시킬 수 있다.
도 1은 프라이머와 결합하는 아미노산이 집중된 DNA 중합효소의 영역을 나타낸다. T. aquaticus, T. sp Z05, T. maritima, E. coli, B. caldotenax, G. stearothermophilus의 DNA 중합효소 영역 중 Taq DNA 중합효소의 루프 영역 (497~514 잔기)과 그 인근 영역을 비교한 것이다.
도 2는 Taq DNA 중합효소의 SDS-PAGE 사진이다. (A) E. coli MV1184에서 발현한 야생형 Taq DNA 중합효소의 분해 결과이다. 붉은색 화살표는 분해되어 생긴 단백질 띠를 나타낸다. DEAE 컬럼 크로마토그래피 정제물에서 KCl을 제거하기 위해 완충액 A를 사용하여 세척하였다. S는 야생형 Taq DNA 중합효소 표준제품이다. 0, 여과 미실시; 1x, 1회 여과; 2x, 2회 여과; S 표준 Taq DNA 중합효소. (B) E. coli MV1184에서 발현한 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소 변이체의 DEAE 컬럼 크로마토그래피 정제품을 KCl이 각각 0, 100, 300, 500 mM 포함된 완충액 A를 사용하여 여과한 시료의 SDS-PAGE 사진이다. (C) E. coli MV1184에서 발현한 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소 변이체의 DEAE 컬럼 크로마토그래피 정제품에 연어 정자 DNA를 각각 0, 0.4, 2.0, 10, 50 ug을 혼합하거나 DEAE 컬럼 크로마토그래피에서 Taq DNA 중합효소가 용리된 이후의 분획들의 모음 (BP)을 혼합한 후 완충액 A를 사용하여 여과한 시료의 SDS-PAGE 사진이다. M, 단백질 분자량 마커; C, 무처리 시험구; BP, BP를 혼합한 시료.
도 3은 Taq DNA 중합효소 분해 산물의 SDS-PAGE 사진이다. 1: 미처리구, 2: 분해 처리구.
도 4는 Taq DNA 중합효소 절단 위치 (cleavage site) 및 OmpT 인식 부위 (P)를 나타내는 모식도이다.
도 5는 Taq DNA 중합효소의 루프 (loop) 구조와 DNA와의 밀접 구조를 나타내는 모식도이다. Taq DNA 중합효소의 엄지 서브도메인 (Thumb subdomain)에 존재하는 α-나선 Ha(487-496 잔기, 푸른색 영역) α-나선 Hb(515-521 잔기, 푸른색 영역) α-나선 I (527-552 잔기, 자주색 영역)과 루프 (497~514 잔기, 두 푸른색 영역의 사이, 비전하 아미노산 잔기 (녹색 영역), 숫자는 Taq DNA 중합효소의 아미노산 잔기 위치를 나타낸다.
도 6은 K511A Taq DNA 중합효소 변이체와 야생형 Taq DNA 중합효소를 사용한 실시간 PCR 결과를 나타낸다. 주형으로는 BRAF-V600E 및 EGFR-T790M의 정상 DNA(w)와 변이 DNA(m)를 사용하였다. 숫자는 정상 DNA를 사용한 실시간 PCR의 Ct 값에서 변이 DNA를 사용한 실시간 PCR의 Ct 값을 뺀 값을 의미한다. WT: 야생형 Taq DNA 중합효소를 사용한 결과, K511A: K511A 변이 Taq DNA 중합효소를 사용한 결과.
도 7a와 도 7b는 각 부위의 대표적인 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소 변이체들의 구분성 확인을 위한 실시간 PCR 결과이다. 각 변이 단백질이 발현된 E. coli BL21 (DE3) 균주로부터 조정제한 시료로 BRAR-V600E 및 EGFR-T790M의 변이 구분성을 시험하였다. WT: 야생형 Taq DNA 중합효소를 사용한 결과, G499R, K505G, E507K, K508S, K511A, R512W는 각각 해당 Taq DNA 중합효소 변이체를 사용한 결과이다.
도 8은 CS2-K511A 및 K511A Taq DNA 중합효소 변이체와 야생형 Taq DNA 중합효소를 사용한 실시간 PCR 결과를 나타낸다. 주형으로는 EGFR-T790M의 정상 DNA(w)와 변이 DNA(m)를 사용하였다. 이때 사용한 전방 프라이머는 EGFR-ARMS-F이다. WT: 야생형 Taq DNA 중합효소, K511A: K511A 변이 Taq DNA 중합효소, CS2-K511A: CS2-K511A 변이 Taq DNA 중합효소.
본 발명은 서열번호 1로 구성된 Taq DNA 중합효소와 80% 이상의 상동성을 가지는 DNA 중합효소 또는 이들의 클레나우 단편 (Klenow fragment)에서 Ha 및 Hb 서열 사이의 루프 영역의 아미노산이 한 개 이상 변이되고, 야생형 DNA 중합효소와 비교하여 중합 활성은 유지되며, 대립 유전자 또는 유전자 변이 구분성이 향상된 DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 변이가 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실인, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 루프 영역이 서열번호 1의 497~514 위치 또는 이에 상응하는 위치인, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 변이가 서열번호 1의 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 505, 506, 509, 510, 511, 512, 513, 514 또는 이에 상응하는 위치로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 위치의 아미노산이 변이된, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 위치의 변이에 더하여 I707L 및 E708K 중 하나 이상의 변이 또는 이에 상응하는 위치의 하나 이상의 변이가 더 포함된, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 80% 이상의 상동성을 가지는 DNA 중합효소가 서열번호 1로 구성된 Taq DNA 중합효소와 90% 이상, 또는 91% 이상, 또는 92% 이상, 또는 93% 이상, 또는 94% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 또는 96% 이상, 또는 97% 이상의 상동성을 가지는, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 497, 505, 511 및 512 위치 또는 이에 상응하는 위치에 존재하는 하전된 아미노산 중 하나 이상이 변이된, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 505, 511 및 512 위치 또는 이에 상응하는 위치에 존재하는 양전하로 하전된 아미노산 중 하나 이상이 변이된, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 아미노산 변이 위치에 더하여 서열번호 1의 504, 507, 508, 707, 708 위치 또는 이에 상응하는 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산이 더 변이된, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 G499R, K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, E507A, E507G, E507S, E507R, E507Q, K508A, K508G, K508S, K511A, K511S, R512K, R512W 또는 이에 상응하는 위치의 상응 변이에서 선택되는 하나 이상의 변이가 포함된 DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 K511A, I707L 및 E708K 세 아미노산의 변이 또는 이에 상응하는 위치의 변이를 포함하는 DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 중합효소 변이체를 이용하여 대립 유전자 또는 유전자 변이 구분성이 개선된 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 중합효소 변이체가 포함된 중합효소 연쇄반응 킷트에 관한 것이다.
이하 실험예 및 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 본 발명의 범위가 이하의 실험예 및 실시예의 기재범위로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
<실험예 1> 위치 지정 돌연변이 (Site directed mutagenesis)와 Taq DNA 중합효소 돌연변이체 제작
단백질 발현을 위해 Taq DNA 중합효소 유전자를 플라스미드 pUC18 내의 lac 프로모터 하류에 위치하도록 구축한 벡터 pJR-Taq을 사용하였다. 각 변이체는 벡터 pJR-Taq을 주형으로 하여 위치 지정 돌연변이로 구축하였다. 변이를 위한 아미노산에 프라이머 (서열번호 8-93)를 사용하여 하기와 같이 위치 지정 돌연변이를 통해 해당하는 Taq DNA 중합효소 변이체를 만들었다. Pfu DNA 중합효소 (Enzynomics, Korea)를 이용하여 PCR을 수행한 후 제한효소 DpnI (Enzynomics, Korea)을 처리하여 변이되지 않은 주형 DNA를 제거하고 변이된 플라스미드를 E. coli DH5α에 형질전환하여 변이 플라스미드를 확보하였다. 확보한 플라스미드의 목적 서열 부위의 염기서열 변이를 염기서열 분석으로 확인하였다. 벡터 중 Taq DNA 중합효소 유전자 외 다른 부위의 서열 변이를 최소화하기 위해 확보한 각각의 변이 플라스미드를 KpnI/BamHI으로 절단하여 약 1.3 kb의 단편을 얻고, KpnI/BamHI으로 pJR-Taq을 절단하여 1.3 kb가 제거된 단편 3.8 kb 와 연결하여 E. coli DH5α에 형질전환하여 각각의 변이체 발현용 벡터를 제작하였다.
site variant Oligo Name Sequence(5'→3') Seq.No.
G499 G499R G499R-F tttgacgagctaagacttcccgccatcggc 8
G499R-R gccgatggcgggaagtcttagctcgtcaaa 9
K505 K505A K505A-F cccgccatcggcgctacggagaagaccggc 10
K505A-R gccggtcttctccgtagcgccgatggcggg 11
K505E K505E-F cccgccatcggcgaaacggagaagaccggc 12
K505E-R gccggtcttctccgtttcgccgatggcggg 13
K505S K505S-F cccgccatcggctctacggagaagaccggc 14
K505S-R gccggtcttctccgtagagccgatggcggg 15
K505G K505G-F cccgccatcggcggtacggagaagaccggc 16
K505G-R gccggtcttctccgtaccgccgatggcggg 17
K505R K505R-F cccgccatcggcagaacggagaagaccggc 18
K505R-R gccggtcttctccgttctgccgatggcggg 19
K505F K505F-F cccgccatcggcttcacggagaagaccggc 20
K505F-R gccggtcttctccgtgaagccgatggcggg 21
K505I K505I-F cccgccatcggcattacggagaagaccggc 22
K505I-R gccggtcttctccgtaatgccgatggcggg 23
K505L K505L-F cccgccatcggccttacggagaagaccggc 24
K505L-R gccggtcttctccgtaaggccgatggcggg 25
K505M K505M-F cccgccatcggcatgacggagaagaccggc 26
K505M-R gccggtcttctccgtcatgccgatggcggg 27
K505W K505W-F cccgccatcggctggacggagaagaccggc 28
K505W-R gccggtcttctccgtccagccgatggcggg 29
E507 E507A E507A-F atcggcaagacggctaagaccggcaagcgc 30
E507A-R gcgcttgccggtcttagccgtcttgccgat 31
E507K E507K-F atcggcaagacgaagaagaccggcaagcgc 32
E507K-R gcgcttgccggtcttcttcgtcttgccgat 33
E507S E507S-F atcggcaagacgtctaagaccggcaagcgc 34
E507S-R gcgcttgccggtcttagacgtcttgccgat 35
E507G E507G-F atcggcaagacgggtaagaccggcaagcgc 36
E507G-R gcgcttgccggtcttacccgtcttgccgat 37
E507Q E507Q-F atcggcaagacgcagaagaccggcaagcgc 38
E507Q-R gcgcttgccggtcttctgcgtcttgccgat 39
K511 K511A K511A-F gagaagaccggcgctcgctccaccagcgcc 40
K511A-R ggcgctggtggagcgagcgccggtcttctc 41
K511R K511R-F gagaagaccggcagacgctccaccagcgcc 42
K511R-R ggcgctggtggagcgtctgccggtcttctc 43
K511E K511E-F gagaagaccggcgaacgctccaccagcgcc 44
K511E-R ggcgctggtggagcgttcgccggtcttctc 45
K511S K511S-F gagaagaccggctctcgctccaccagcgcc 46
K511S-R ggcgctggtggagcgagagccggtcttctc 47
K511G K511G-F gagaagaccggcggtcgctccaccagcgcc 48
K511G-R ggcgctggtggagcgaccgccggtcttctc 49
K511V K511V-F gagaagaccggcgttcgctccaccagcgcc 50
K511V-R ggcgctggtggagcgaacgccggtcttctc 51
K511I K511I-F gagaagaccggcattcgctccaccagcgcc 52
K511I-R ggcgctggtggagcgaatgccggtcttctc 53
K511L K511L-F gagaagaccggccttcgctccaccagcgcc 54
K511L-R ggcgctggtggagcgaaggccggtcttctc 55
K511M K511M-F gagaagaccggcatgcgctccaccagcgcc 56
K511M-R ggcgctggtggagcgcatgccggtcttctc 57
K511F K511F-F gagaagaccggcttccgctccaccagcgcc 58
K511F-R ggcgctggtggagcggaagccggtcttctc 59
K511Y K511Y-F gagaagaccggctatcgctccaccagcgcc 60
K511Y-R ggcgctggtggagcgatagccggtcttctc 61
K511W K511W-F gagaagaccggctggcgctccaccagcgcc 62
K511W-R ggcgctggtggagcgccagccggtcttctc 63
R512 R512A R512A-F aagaccggcaaggcctccaccagcgccgcc 64
R512A-R ggcggcgctggtggaggccttgccggtctt 65
R512E R512E-F aagaccggcaaggaatccaccagcgccgcc 66
R512E-R ggcggcgctggtggattccttgccggtctt 67
R512S R512S-F aagaccggcaagtcttccaccagcgccgcc 68
R512S-R ggcggcgctggtggaagacttgccggtctt 69
R512G R512G-F aagaccggcaagggttccaccagcgccgcc 70
R512G-R ggcggcgctggtggaacccttgccggtctt 71
R512K R512K-F aagaccggcaagaagtccaccagcgccgcc 72
R512K-R ggcggcgctggtggacttcttgccggtctt 73
R512F R512F-F aagaccggcaagttctccaccagcgccgcc 74
R512F-R ggcggcgctggtggagaacttgccggtctt 75
R512I R512I-F aagaccggcaagatttccaccagcgccgcc 76
R512I-R ggcggcgctggtggaaatcttgccggtctt 77
R512L R512L-F aagaccggcaagctttccaccagcgccgcc 78
R512L-R ggcggcgctggtggaaagcttgccggtctt 79
R512M R512M-F aagaccggcaagatgtccaccagcgccgcc 80
R512M-R ggcggcgctggtggacatcttgccggtctt 81
R512V R512V-F aagaccggcaaggtttccaccagcgccgcc 82
R512V-R ggcggcgctggtggaaaccttgccggtctt 83
R512W R512W-F aagaccggcaagtggtccaccagcgccgcc 84
R512W-R ggcggcgctggtggaccacttgccggtctt 85
R512Y R512Y-F aagaccggcaagtattccaccagcgccgcc 86
R512Y-R ggcggcgctggtggaatacttgccggtctt 87
R512H R512H-F aagaccggcaagcactccaccagcgccgcc 88
R512H-R ggcggcgctggtggagtgcttgccggtctt 89
I707 I707L I707L-F gtgcgggcctggcttgagaagaccctggag 90
I707L-R ctccagggtcttctcaagccaggcccgcac 91
E708 E708K E708K-F cgggcctggattaagaagaccctggaggag 92
E708K-R ctcctccagggtcttcttaatccaggcccg 93
< 실험예 2> Taq DNA 중합효소의 발현을 위한 배양
Taq DNA 중합효소 발현을 위한 벡터들은 E. coli MV1184 (ompT +) 또는 E. coli DH5α (DE3) (ompT -)에 도입하여 사용하였다. Taq DNA 중합효소 발현을 위해 E. coli를 LB (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) 배지에서 37℃로 8시간 전배양하고, 2X YT 배지 (1.6% tryptone, 1.0% yeast extract, 0.5% NaCl)에 전배양액 1%를 접종하여 37℃에서 본배양을 수행하였다. 배양액의 O.D. 600 값이 0.4 ~ 0.6이 되었을 때, 0.5 mM IPTG를 첨가하여 약 4시간 배양하였다. 배양이 완료된 배양액을 얼음물에 담가 냉각한 다음 원심분리 (10,000 x g, 10 min, 4℃)하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 배양액의 1/10 (v/v)의 완충액 A [50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1 μM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)]로 현탁한 후 원심분리하여 회수하는 방법을 2회 반복하여 배지 성분을 제거한 후, 배양액의 1/20~1/40 (v/v)의 완충액 A에 재현탁하여 준비하였다.
<실험예 3> Taq DNA 중합효소의 조정제 시료 제조
배양액 100 ml에서 확보된 균체 현탁액 (실험예 2)으로부터 Taq DNA 중합효소를 조정제하였다. 균체 현탁액을 초음파 파쇄기를 이용하여 (2 mm tip, amplitude 25%, 9.9 s/3 s (on/off), 5 min) 균체를 파쇄한 후 원심분리 (10,000 x g, 10 min, 4℃)하여 상등액을 회수하였다. 상등액에 RNase를 50 μg/ml 되도록 첨가하여 37℃에서 30분간 반응 후, 75℃에서 20분간 열처리하였고, 원심분리(10000 x g, 10 min, 4℃)하여 상등액 (4.0 ml)을 회수하여 조정제 시료를 확보하였다. 이 시료를 단백질 정량후 Taq DNA 중합효소 활성 비교 실험에 사용하였다.
<실험예 4> Taq DNA 중합효소의 고순도 정제
4.5 L 배양액에서 확보된 균체 현탁액으로부터 Taq DNA 중합효소를 고순도로 정제하였다. 초음파 파쇄기 (13 mm tip, amplitude 90%, 5.5 s/9.9 s (on/off), 1 h)를 이용하여 균체 현탁액 (100 ml)의 균체를 파쇄한 후 원심분리 (10,000 x g, 10 min, 4℃)하여 상등액을 회수하였다. 여기에 5%가 되게 스트렙토마이신 황산염 (streptomycin sulfate)을 첨가하여 30분 동안 교반 후 원심분리 (10,000 x g, 10 min, 4℃)하여 상등액을 회수하였다. 이 액을 75℃에서 20분간 열처리하고 다시 시료를 원심분리 (10,000 x g, 10 min, 4℃)하여 얻어진 상등액을 0.45 μm 주사기 필터 (Sartorius)로 여과하였다. 여과 용액에 Taq DNA 중합효소 단백질 석출을 위해 포화도 65%가 되도록 황산 암모늄을 첨가하여 4℃에서 한 시간 지난 후 침전물을 원심분리 (10,000 x g, 10 min, 4℃)로 회수하여 10 ml의 완충액 A로 현탁하였다. 현탁액을 투석막 (dialysis membrane, Spectra/Por, MWCO: 12-14 KDa)에 넣고, 4 L의 완충액 A에서 하룻밤 투석하여 염을 제거하였다. 제염된 용액을 0.45 μm 주사기 필터 (Sartorius)로 여과하여 FPLC (AKTA, UPC-900)로 정제하였다. 컬럼 크로마토그래피는 DEAE sephacel (30 ml in XK26/20 column, GE healthcare), SP sepharose (20 ml in XK16/20 column, GE healthcare), heparin sepharose (10 ml in HR16 column, GE healthcare)의 순으로 진행하였다. 이때 컬럼의 평형화를 위해서 완충액 A (DEAE sephacel과 heparin sepharose 컬럼)와 완충액 B [20 mM HEPES(pH 6.9), 1 mM EDTA, 1 uM PMSF] (Q sepharose 컬럼)를 사용하고, 용리는 1 M KCl이 든 A와 B 완충액을 사용하여 농도구배로 단백질을 용리하였다. 각 컬럼 단계에서 Taq DNA 중합효소가 포함된 용리 분획을 회수하여 VIVASPIN20 (MW:50,000)으로 여과공정을 수행하였다. 이 여과공정은 제염 또는 활성시험을 위한 세척과 농축을 위해 수행하며, 각 컬럼에서 회수한 분획을 VIVASPIN20 (MW:50,000)으로 농축한 후 다음 단계의 완충액 A 또는 B 약 15 ml로 2회 반복하여 세척, 여과하였다.
다음 단계 컬럼을 위해서 10 내지 20 ml의 동일 완충액으로 용해하여 다음 컬럼에 적용하거나, 시험에 따라 적절한 용액으로 용해하여 시험하였다.
얻어진 각 정제단계 또는 최종 정제된 Taq DNA 중합효소는 SDS-PAGE (12% polyacryl amide gel electrophoresis) 와 Bradford assay reagent (Sigma사)를 사용하여 소 혈청 알부민을 표준 단백질로 하여 정량, 비교하였다.
조정제 또는 정제된 Taq DNA 중합효소는 최종농도 50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 0.5 mM EDTA, 1 μM PMSF, 4 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 50% 글리세롤을 포함하는 저장완충액과 혼합하여 -70℃에 보관하면서 시험에 사용하였다.
<실험예 5> 변이체 Taq DNA 중합효소 활성 비교
정량된 단백질 양을 일정하게 맞추어 일반 PCR (conventional PCR) 방법을 수행한 후 전기영동하여 Taq DNA 중합효소 변이체와 아생형 Taq DNA 중합효소의 활성을 비교 측정하였다. 람다 파지 DNA (10 pg, 바이오니아)를 주형으로 사용하며, 각 10 pmol의 lambda-F (5'-GGTGCTTTATGACTCTGCCGC)과 lambda-R (5'- AGCGCCCTTCCTGGTATGC)를 프라이머로 사용하고, PCR 완충액 [10 mM Tris-Cl (pH 9.0), 1.5 mM MgCl2, 40 mM KCl, 0.6 M Methyl-α-D-glucopyranoside, 0.03 % tween 20, 3 mM dNTP]에서 94℃ (5분) 후, 94℃ (30초)-55℃ (30초)-72℃ (30초)를 30회 반복 반응하고 72℃ (7분) 반응 후 종료하여 DNA 증폭 산물(500 bp)의 생성을 전기영동으로 확인하였다.
<실험예 6> 구분성 확인을 위한 실시간 PCR
아래 실시예에 별도 언급이 없을 경우 본 발명의 실시예에 사용한 PCR의 조성물 및 조건은 아래와 같다.
PCR에 사용한 주형 DNA는 각 목적 검출 유전자 BRAF c.1799 rc. A>T (p.V600E) (이하 BRAF-V600E)의 정상 (서열번호 3) 또는 돌연변이 서열(서열번호 4) 및 EGFR c.2369 C>T (p.T790M) (이하 BRAF-T790M) 정상 (서열번호 5) 또는 돌연변이 서열 (서열번호 6)의 DNA를 합성하여 pTOP Blunt V2 (Enzynomics, Korea)에 삽입, 제작하여 대장균에 형질전환한 후, 배양하여 정제된 플라스미드 DNA를 제한효소로 절단, 정제 후 정량하여 2 x 107 copy/reaction이 되도록 하여 사용하였다.
서열번호 3 (BRAF V600 정상 (rc))
AAAATATTCGTTTTAAGGGTAAAGAAAAAAGTTAAAAAATCTATTTACATAAAAAATAAGAACACTGATTTTTGTGAATACTGGGAACTATGAAAATACTATAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAGGGCCAAAAATTTAATCAGTGGAAAAATAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTC A CTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGGAAAACAGTAGATCTCATTTTCCTATCAGAGCAAGCATTATGAAGAGTTTAGGTAAGAGATCTAATTTCTATAATTCTGTAATATAATATTCTTTAAAACATAGTACTTCATCTTTCCTCTTAGAGTCAATAAGTATGTCTAAAACAATGATTAGTTCTATTTAGCCTATATA
서열번호 4 (BRAF V600E 돌연변이 (rc))
AAAATATTCGTTTTAAGGGTAAAGAAAAAAGTTAAAAAATCTATTTACATAAAAAATAAGAACACTGATTTTTGTGAATACTGGGAACTATGAAAATACTATAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAGGGCCAAAAATTTAATCAGTGGAAAAATAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTC T CTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGGAAAACAGTAGATCTCATTTTCCTATCAGAGCAAGCATTATGAAGAGTTTAGGTAAGAGATCTAATTTCTATAATTCTGTAATATAATATTCTTTAAAACATAGTACTTCATCTTTCCTCTTAGAGTCAATAAGTATGTCTAAAACAATGATTAGTTCTATTTAGCCTATATA
서열번호 5 (EGFR T790 정상)
CACGCACACACATATCCCCATGGCAAACTCTTGCTATCCCAGGAGCGCAGACCGCATGTGAGGATCCTGGCTCCTTATCTCCCCTCCCCGTATCTCCCTTCCCTGATTACCTTTGCGATCTGCACACACCAGTTGAGCAGGTACTGGGAGCCAATATTGTCTTTGTGTTCCCGGACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTGC G TGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGCAGGCGGCACACGTGGGGGTTGTCCACGCTGGCCATCACGTAGGCTTCCTGGAGGGAGGGAGAGGCACGTCAGTGTGGCTTCGCATGGTGGCCAGAAGGAGGGGCACATGGACCCCTTCCAGGTGAAGACGCATGAATGCGATCTTGAGTTTCAAAATACGTACTCATGGAGGAAAAGCTGTGCCTGCAAAAGACCTAGC
서열번호 6 (EGFR T790M 돌연변이)
CACGCACACACATATCCCCATGGCAAACTCTTGCTATCCCAGGAGCGCAGACCGCATGTGAGGATCCTGGCTCCTTATCTCCCCTCCCCGTATCTCCCTTCCCTGATTACCTTTGCGATCTGCACACACCAGTTGAGCAGGTACTGGGAGCCAATATTGTCTTTGTGTTCCCGGACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTGC A TGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGCAGGCGGCACACGTGGGGGTTGTCCACGCTGGCCATCACGTAGGCTTCCTGGAGGGAGGGAGAGGCACGTCAGTGTGGCTTCGCATGGTGGCCAGAAGGAGGGGCACATGGACCCCTTCCAGGTGAAGACGCATGAATGCGATCTTGAGTTTCAAAATACGTACTCATGGAGGAAAAGCTGTGCCTGCAAAAGACCTAGC
BRAF-V600E 변이의 구분성을 확인하기 위해서 전방 프라이머 5’- GGGACCCACTCCATCGAGATTTCT-3' (BRAF-AS-F; 서열번호 94); 후방 프라이머 5'- AACTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAG-3' (BRAF-R; 서열번호 95); 시그널 프로브 5’-FAM - CTGTGAGGTCTTCATGAAG - BHQ1-3' (BRAF-P; 서열번호 96)를 사용하고, EGFR- T790M 변이 구분성을 확인하기 위해서는 전방 프라이머 5'-AGCCGAAGGGCATGAGCTGCA-3' (EGFR-AS-F; 서열번호 97) 또는 5'-AGCCGAAGGGCATGAGCTACA-3' (EGFR-ARMS-F; 서열번호 98); 후방 프라이머 5’-AGTGTGGACAACCCCCACGTGTGC-3' (EGFR-R; 서열번호 99); 시그널 프로브 5’-FAM- CGGTGGAGGTGAGGCAGATG-BHQ1-3' (EGFR-P; 서열번호 100)를 사용하였다. 특히 전방 프라이머는 각 목적 검출 유전자 BRAF-T790M과 BRAF-V600E 돌연변이 검출을 위해 최종 3' 말단 염기가 변이유전자와 매치되거나 (matched) 또는 정상 유전자와 최종 말단 염기가 미스매치되도록 (mismatched) 설계된 AS 프라이머 혹은 ARMS 프라이머이다. 각 프라이머는 10 pmol/reaction, 프로브는 20 pmol/reaction을 사용하였다.
BRAF-V600E 구분을 위한 PCR은 95℃ (5분) 후, 95℃, 30초 - 55℃ (1분)으로 50회 반복하여 수행하며, EGFR-T790M 구분을 위한 PCR은 95℃ (5분) 후, 95℃ (30초) - 55℃ (40초)로 50회 반복하여 수행하였다.
PCR 수행시 완충용액은 10 mM Tris, pH 9.0, 1.5 mM MgCl2, 1 mM dNTPs, 60 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4)이 되도록 하여 CFX96 실시간 PCR 탐지 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 PCR을 수행한다. 다만, 실시예에 따라 KCl의 농도를 달리하거나 베타인 등을 첨가하거나, 효소의 종류 (야생형인지 또는 변이체 Taq DNA 중합효소인지에 따라) 또는 효소의 양을 달리하여 사용한다. 발명된 DNA 중합효소 변이체의 매치와 미스매치의 구분성은 ΔCt (ΔCt= 주형 변이체의 Ct 값 - 야생형 주형의 Ct 값)로 평가한다.
<실시예 1> 대장균 발현 모균주에 따른 Taq DNA 중합효소의 분해
상기 <실험예 2> 와 같이 배양 및 발현된 Taq DNA 중합효소를 <실험예 4>의 DEAE 컬럼 크로마토그래피 정제단계에서 Taq DNA 중합효소를 분획을 완충용액 A로 VIVASPIN20 (MW:50,000)을 이용하여 여과공정을 수행하였다. SDS-PAGE로 단백질을 확인하였다. 이 과정 중에 OmpT 변이주인 E. coli BL21 (DE3)(ompT -)에서 발현한 Taq DNA 중합효소의 분해가 일어나지 아니하였으나, OmpT 변이주가 아닌 E. coli MV1184 (ompT +)에서 발현한 야생형 Taq DNA 중합효소 (서열번호 1)가 정제 중에 일부 분해됨을 확인하였다 (도 2의 A). 동일한 과정 수행시, 특히 E. coli MV1184 (ompT +)에서 발현된 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소의 정제 과정 중 더욱 많은 분해가 일어남을 확인하였다 (도 2의 B). 즉, 정제 과정에서의 Taq DNA 중합효소의 분해는 발현 모균주에 따라 명백히 다른 양태를 보였으며, E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소에서 더욱 확연하게 분해 현상이 일어났다.
<실시예 2> 높은 농도의 KCl에 의한 Taq DNA 중합효소의 분해 억제
이러한 분해는 <실험예 4>의 정제과정 중에 DEAE 컬럼 크로마토그래피에서 수득한 Taq DNA 중합효소를 완충액 A를 사용하여 VIVASPIN20 (MW:50,000)으로 여과하는 세척과정 중에 급격하게 일어났다.
<실험예 2> 또는 <실험예 4>와 같이 배양, 정제된 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소 변이체의 DEAE sephacel 크로마토그래피 정제단계의 분획을 확보하였다. 이 분획 시료 50 μl (약 4 μg 단백질/μl) 을 KCl이 없는 완충액 A만 사용하는 것 (0 M KCl)과 완충액 A에 100, 300, 500 mM의 KCl이 함유된 완충액 A를 사용하는 것으로 나누어 VIVASPIN20 (MW:50,000, 50 ml 용량)으로 여과공정을 수행한 후 각 여과 시험구와 동일한 농도의 KCl이 든 완충액 A로 각각 용해하여 수득하였다. 각 시험구의 용해 Taq DNA 중합효소를 SDS-PAGE로 확인한 결과 0 mM KCl의 경우 분해되어 약 33 KDa과 약 60 KDa의 단백질 단편이 새로 관찰되었고, 원래의 DNA 중합효소는 매우 감소하였다. 그러나, 100 mM 이상의 KCl이 포함된 완충액 A를 사용한 여과의 경우는 미처리구와 차이가 없었다. 이로 보아 Taq DNA 중합효소 분해가 고농도 KCl에 의해 억제되는 것을 알 수 있었다 (도 2의 B).
<실시예 3> DNA에 의한 Taq DNA 중합효소의 분해 억제
<실험예 2> 또는 <실험예 4>와 같이 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소의 DEAE sephacel 크로마토그래피 정제단계의 분획을 확보하였다. 이 분획 시료 약 50 μl (약 4 μg 단백질/μl)의 시료에 DEAE 컬럼 크로마토그래피에서 Taq DNA 중합효소가 용리된 후 수득한 분획 (BP)을 2배 부피 (100 μl)로 혼합한 후 <실험예 4> 와 같이 여과공정을 수행하였다. 완충액 A로 VIVASPIN20 (MW:50,000)을 사용하여 여과공정을 수행한 후 완충액 A 250 ul로 녹여 회수한 시료를 SDS-PAGE로 단백질의 분해를 확인하였다. 그 결과 놀랍게도 BP를 혼합하지 않은 시료는 Taq DNA 중합효소의 분해가 일어났으나, BP를 혼합한 시료는 분해가 일어나지 않았다. 이때 사용한 BP는 Bradford 측정 및 SDS-PAGE 분석 결과, 단백질이 거의 포함되어 있지 않았으나, 핵산 (~50 ng/μl)이 다량 포함되어 있었다. 이로 유추해 볼 때 분해의 억제인자는 미지의 단백질이라기보다는 DNA와 같은 핵산으로 추정된다.
이러한 결과에 따라, 상기 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소 변이체의 DEAE sephacel 크로마토그래피 정제단계의 분획 50 ul에 각 0.4, 2.0, 10. 또는 50 μg DNA (salmon sperm nucleic acid, Sigma)를 혼합하여 준비한 시료로 상기와 동일한 여과공정을 완충액 A로 수행하였다. 그 결과 2.0 μg 이상의 DNA를 처리한 시험구에서는 BP 처리구와 같이 Taq DNA 중합효소가 분해되지 아니하였다. 이는 명백히 핵산이 단백질 분해효소에 의한 Taq DNA 중합효소의 분해를 억제하는 것이다. 즉, 이러한 결과들은 Taq DNA 중합효소의 분해 부위가 DNA와의 결합에 중요한 부위 또는 DNA와 결합하는 부위와 연관되어 있음을 의미한다.
<실시예 4> Taq DNA 중합효소의 분해 위치의 결정
<실험예 2> 또는 <실험예 4>와 같이 배양, 정제된 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소 변이체의 DEAE 컬럼크로마토그래피 단계에서 수득한 시료 (순도 96% 이상)를 완충액 A로 <실혐예 4>의 여과공정을 세척하고, 완충액 A로 회수하여 ~10℃에서 완전히 분해가 일어나도록 하였다 (도 3). 분해된 산물을 SDS-PAGE로 확인하였을 때 큰 절편(large fragment)은 약 60 KDa, 작은 절편(small fragment)은 약 33 KDa 크기였다.
두 개의 절편이 전기영동된 SDS-PAGE 젤을 잘라 단백질 절편을 회수하여 아미노산 서열을 분석한 결과, 명확한 절단의 위치는 특정하지 못했으나 60 KDa 단편이 Taq 중합효소의 N-말단 단편으로, 33 KDa 단편이 C-말단 단편으로 확인되었으며, 이를 토대로 좀 더 정확한 절단위치를 확인하기 위하여 33 KDa의 N-말단 서열을 분석하였다. 그 결과, 33 KDa 단편의 N 말단 서열이 R-S-T-S… 임을 확인하였다. 이에 상응하는 Taq DNA 중합효소 상의 서열은 R512-S513-T514-S515이며 이에 따라 절단부위가 K511과 R512 사이로 결정되었다 (도 4).
흥미롭게도 절단 위치인 K511과 R512는 연속되는 두 개의 양전하 아미노산으로 구성되어 있다. 이러한 연속되는 양전하 아미노산은 대장균의 막성 프로테아제인 OmpT가 선호하는 절단부위로 잘 알려져 있다. OmpT의 절단부위 양옆에 있는 수 개의 아미노산 잔기 (P6 ~ P'6)에 음전하 아미노산이 존재할 경우 OmpT에 의한 단백질 절단이 현저하게 억제됨이 보고되어 있다 (Hritonenko and Stathopoulos 2007, Schechter and Berger 2012).
상기 실시예 1~3에 따르면, 야생형 Taq DNA 중합효소보다 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소 변이체가 더욱 잘 분해되는데, 이는 OmpT 인식 부위 P5 위치에 해당하는 E507이 음전하 아미노산인 글루탐산 (glu, E)에서 양전하 아미노산인 라이신 (lys, K)으로 바뀌었기 때문으로 보인다. 즉, E507K 변이 Taq DNA 중합효소가 야생형 Taq DNA 중합효소보다 OmpT에 대한 기질 친화력이 커져 인접한 연속되는 양전하 아미노산 잔기인 K511과 R512 [P1(K) - P1'(R)]의 펩타이드 결합이 OmpT 프로테아제에 의해 쉽게 절단된 것으로 설명된다 (도 4).
<실시예 2>에서 높은 농도의 KCl에서 DNA 중합효소의 분해 억제는 KCl에 의한 OmpT 프로테아제 분해활성의 저해로 추정된다.
또한, <실시예 3>에서 DNA에 의해 DNA 중합효소의 분해가 억제되었는데 (도3), 이로 볼 때 OmpT 프로테아제가 인식 (interaction) 또는 절단하는 DNA 중합효소 부위는 DNA와 결합하는 영역임을 알 수 있다. 따라서, 그러므로 Taq DNA 중합효소 절단부위 (511 및 512) 및 그 주변부위는 DNA와 결합하는 영역임을 분명하게 알 수 있다.
<실시예 5> Taq DNA 중합효소의 구조와 분해 부위
<실시예 4>에서 확인한, 분해가 일어나는 부위인 K511-R512 부위는 Taq DNA 중합효소의 엄지 도메인 (Thumb domain)의 끝 부분에 해당하는 작은 α-나선 구조를 가지는 Ha (487-496) 와 Hb (515-521) 사이의 루프 영역 (497~514) 안에 존재한다 (도 1 및 도 5).
Ha 및 Hb는 패밀리 A DNA 중합효소들 간에 높은 유사성 (homology)을 가지는 보존된 (conserved) 영역이며, 이에 비해 루프 영역은 이들보다 상대적으로 낮은 보존 (less conserved) 영역으로 구성되어 있으나, 매우 흥미롭게도 이 영역에는 음전하 아미노산이 거의 없고 양전하 아미노산이 다수 포함되어 있는 특징이 있다.
Taq DNA 중합효소의 엄지 도메인에 존재하는 Ha (487-496) 와 Hb (515-521) 사이의 루프 구조는 프라이머 영역 근처에 존재하는 것으로 예측하였으나 (Kim, Eom et al. 1995), 이 영역의 중요성은 이 발명 이전까지는 주목받지 못했다. 그 이유는 이 영역이 결정구조 형성시 높은 비정형성 (highly disordered state)을 보여 프라이머를 비롯한 기질과의 구조적 연관성을 명확히 규명하지 못했기 때문이다.
루프 부위의 구조를 단백질 데이터베이스 (PDB, https://www.rcsb.org/)에 있는 Taq DNA 중합효소와 DNA의 결합의 결정구조 DB인 3KTQ 정보를 사용하여 PyMOL (https://pymol.org/2/) 프로그램으로 면밀히 살펴보았다. 그 결과, 이 루프 구조가 프라이머의 골격 (backbone) 부위를 감싸고 있는 것을 확인하였다 (도 5). 이러한 구조는 DNA에 의한 Taq DNA 중합효소의 분해 억제의 관련성을 잘 보여주는 것이다.
이러한 구조적 특성과 Taq DNA 중합효소의 분해 특성으로 볼 때, 이 루프 영역이 프라이머를 비롯한 DNA 결합과 밀접한 연관성이 있음을 확인할 수 있다.
프라이머와 상호작용하는 Taq DNA 중합효소의 루프 부위는 PCR의 효율성을 높이거나 구분성을 증대하는 효소 변이체의 개발에 매우 중요한 부위가 될 수 있다. 루프 영역의 아미노산은 중요한 변형 (engineering) 대상 영역이 될 수 있으며, 특히 이 영역에 존재하는 하전된 아미노산이 1차적인 변형 대상으로 선택될 수 있다. 루프 영역의 양전하 아미노산은 프라이머의 인산 골격의 음전하와 정전기적 결합 (electrostatic interaction)이 가능하므로 이들의 변이는 Taq DNA 중합효소의 활성 변화, 특히 구분성을 나타내는 중합효소의 특성의 변화를 기대할 수 있다.
<실시예 6> K511A 변이체 및 R512A 변이체의 제작 및 활성 검증
<실시예 5>의 추론에 따라서 루프 영역 내에 존재하는 여러 아미노산 중에 우선 절단 영역인 양전하 아미노산인 K511과 R512를 변형하여 본 발명의 주요 목적인 구분성과 연관된 변이주의 선별이 가능함을 확인하고자 하였다. K511과 R512를 <실험예 1>의 부위 지시 돌연변이 방법으로 대표적인 비전하 아미노산인 알라닌 (A)으로 변경하여 K511A 및 R512A Taq DNA 중합효소 변이체를 제작하였다. 이 변이체를 E. coli BL21 (DE3)에서 발현하고 각 변이 Taq DNA 중합효소를 조정제하여 PCR로 활성을 측정한 결과 K511A 변이주의 경우 야생형 Taq DNA 중합효소와 비교될 만한 높은 활성을 가지고 있었으나, R512A 변이주의 경우 Taq DNA 중합효소의 활성이 나타나지 않았다. 이 결과를 볼 때 K511보다 R512 위치의 양전하 아미노산인 아르기닌이 프라이머와의 결합에 매우 중요한 역할을 하고 있을 것으로 추정되었다.
<실시예 7> K511A 변이체의 매치와 미스매치 구분성 확인
<실시예 6>에서 제작한 K511A Taq DNA 중합효소 변이체를 <실험예 2> 및 <실험예 4>와 같이 배양하고 SDS-PAGE에서 95% 이상의 순도로 정제하였다. 정제된 K511A Taq DNA 중합효소에 대해 <실험예 6>과 같이 실시간 PCR을 수행하였다. 수행된 PCR 조건에서 K511A Taq DNA 중합효소는 야생형 Taq DNA 중합효소에 비해 현저히 높은 구분성을 보였다. BRAF-V600E [A와 T 염기 구분 (주형 DNA; 서열번호 5, 6)], EGFR-790M [C 와 T 염기 구분 (주형 DNA; 서열번호 3, 4)]을 대상으로 K511A 변이체의 3'-미스매치 구분성을 확인하였다. 그 결과, K511A Taq DNA 중합효소를 사용한 실시간 PCR에서 매치와 미스매치 간에 높은 구분성을 나타내었다 (도 6).
<실시예 8> K511A Taq을 사용한 PCR에서 KCl과 베타인의 영향
<실시예7>과 같이 정제한 K511A Taq DNA 중합효소 변이체에 KCl 농도를 0 에서 180 mM 까지 점차 높이면서 K511A 변이체의 활성 변화를 야생형 Taq DNA 중합효소와 비교하면서 확인하였다 (표 3). 야생형 Taq DNA 중합효소의 경우 높은 KCl 농도에서도 비교적 높은 활성을 유지하였으며, 효소 농도의 증가에 따라 매치와 미스매치의 구분성 (discrimination)이 증대되는 경향이 있었다. 특히 K511A 변이체의 경우 BRAF-V600E 검출시 KCl 농도 약 80 mM까지, EGFR-T790M 검출시 KCl 농도 약 100 mM까지 활성이 유지되었으며, 두 경우 모두 효소 변이체 농도가 높을수록 구분성이 커지고 낮을수록 구분성이 낮아졌다. 또한, 베타인 (1.25 M)이 첨가된 조건에서는 K511A 변이체의 활성이 조금 더 강해지며, KCl의 농도 범위가 더 확장되어 BRAF-V600E 검출시 KCl 약 100 mM 이상, EGFR-T790M 검출시 KCl 약 120 mM 이상에서도 높은 활성을 나타내었다.
이러한 실시예의 결과들을 볼 때 K511A 변이체를 사용한 매치와 미스매치 PCR의 최적의 구분성을 위한 적절한 KCl 및 베타인의 농도 범위는 표적 주형과 프라이머 또는 PCR 조건에 따라 달라질 수 있다.
BRAF (V600E) DNA
Polymerase		 Ct value No betaine Add betaine (1.25 M)
KCl (mM) KCl (mM)
60 80 100 60 80 100
wild type
Taq DNA
polymerase		 Ct of Mt 18.38 18 16.3 17.7 17.56 17.04
Ct of Wt 25.54 26.62 28.57 22.68 22.97 23.92
△Ct 7.16 8.62 12.27 4.98 5.41 6.88
K511A
Taq DNA
polymerase		 Ct of Mt 15.25 14.84 no signal 16.41 15.78 16.57
Ct of Wt 31.52 33.36 no signal 29.64 30.68 no signal
△Ct 16.27 18.52 nd 13.23 14.9 >16.57
EGFR (T790M) DNA
Polymerase		 Ct value KCl (mM) KCl (mM)
80 100 120 80 100 120
wild type
Taq DNA
polymerase		 Ct of Mt 16.91 16.14 15.82 16.98 16.66 16.98
Ct of Wt 19.9 20.64 21.14 18.03 18.34 18.71
△Ct 2.99 4.5 5.32 1.05 1.68 1.73
K511A
Taq DNA
polymerase		 Ct of Mt 15.6 18.58 no signal 16.19 16.02 16.08
Ct of Wt 23.96 40.08 no signal 22.48 23.94 25.78
△Ct 8.36 21.5 nd 6.29 7.92 9.7
위 표에서 Mt는 돌연변이 DNA 주형, Wt는 야생형 DNA주형을 의미함.
< 실시예 9> 루프 영역 하전된 아미노산 변이체 제작 및 그 활성
루프 영역 중 하전된 아미노산인 G499, K505, E507, K508, K511, R512를 선택하여 20개의 아미노산 중 대표적인 아미노산 몇 종류 [A, G, S, K (또는 R), E]로 치환한 다수의 변이체를 만들어 활성과 변이 구분성을 시험하였다. 각 변이체의 제작은 각 변이체 제작용 프라이머 세트를 사용하여 <실험예 1>에 따라 수행하였다.
변이체는 <실험예 2>에 따라 E. coli BL21(DE3)를 모균주로 하여 배양하고 <실험예3>에 따라 조정제 하였으며, 이 조정제 시료에 대해 <실험예 5>에 따라 활성을 시험하였다. 조정제된 각 Taq DNA 중합효소 시료를 브래드포드 분석법으로 정량하여 약 600 ng의 단백질을 시작으로 2배 (300 ng), 4배 (150 ng), 16배(75 ng) 32배 (37.5 ng) 희석하여 PCR 반응을 수행하여 평가하였다 (표 3).
그 결과 K505, K508, K511, R512의 양전하 아미노산을 음전하 아미노산인 글루탐산으로 바꾸었을 때, 즉, K505E, K508E, K511E 및 R512E 변이체의 경우 DNA 중합효소 활성이 나타나지 않았다. 그러나, 같은 양전하 아미노산으로 치환한 경우 중합효소 활성이 여전히 매우 높았다.
이러한 결과를 볼 때, 양전하 아미노산인 라이신 (K)과 아르기닌 (R)이 활성에 매우 중요한 영역임을 확인할 수 있었다. 이러한 중합효소 활성의 소실은 양전하 아미노산이 음전하 아미노산으로 바뀜으로 인하여 루프 부위와 프라이머를 비롯한 DNA 골격의 인산 간의 결합이 약화하여 나타난 결과로 추정된다. 이와 반대로 루프 부위 내의 유일한 음전하 아미노산인 글루탐산 (E507)이 라이신 (K)으로 변경된 변이체는 활성의 감소가 없거나 오히려 활성이 높아지는 것으로 확인되었다. 또한, 비전하 아미노산인 G499를 양전하 아미노산인 아르기닌 (R)으로 치환환 경우에는 높은 효소 활성을 나타내었다.
중합효소 희석배수 활성* 구분성**
1 2 4 8 16 32
WT O O O O O O/X +++
K505G O O X + +++
K505I O O 0 X +++ +++
K505L O O O X +++ +++
K505M O O O X +++ +++
K505W O X + nd
K505F O O O O X +++ +++
E507A O O O O O X +++ nd
E507G O O O O O X +++ +
E507S O O O O O X +++ nd
E507K O O O O O O/X +++ -
K508A O O X + +++
K508G O O O X ++ nd
K508S O O X ++ +++
K508R O O O O O O/X +++ +
K511A O O O X ++ +++
K511S O X + nd
K511R O O O O X +++ ++
K511M O X + nd
R512K O O O O X +++ ++
R512F O X + nd
R512I O X + nd
R512L O X + nd
R512W O X + +++
R512Y O X + nd
CS2-K511A O O X ++ +++
* 1/8 이상 희석에서 활성이 있는 경우, +++; 1/2 이상 1/8 미만 희석에서 활성이 있는 경우, ++; 1/2 미만에서만 활성이 있는 경우, +; 원액에서 활성이 검출되지 않은 경우, - 로 표시하였다.
** 구분성은 ΔΔCt로 나타내었다. ΔΔCt = 야생형 (WT) Taq DNA 중합효소를 사용한 ΔCt (ΔCt= Ct of mutant template - Ct of wild type template) - Taq DNA 중합효소 변이체를 사용한 ΔCt. 시험은 BRAF-V600E의 변이 구분성으로 평가함. ΔΔCt 가 1 미만일 경우, -; 1 이상 ~ 3 미만일 경우 +; 3 이상 ~ 6 미만일 경우, ++; 6 이상일 경우, +++로 표시하였다. 측정되지 않은 경우, nd로 표시하였다.
<실시예 10> DNA 중합효소 변이체의 실시간 PCR 구분성 비교
<실시예 8>과 같이 조정제된 여러 Taq DNA 중합효소 변이체 중에 활성이 ++ 이상인 Taq DNA 중합효소 변이체 조정제 시료에 대하여 실험예 6에 따라 구분성 확인을 위한 실시간 PCR을 수행하였다. 그 결과를 표 3의 구분성에 표시하였다. 구분성은 ΔΔCt (ΔΔCt = ΔCt of wild type Taq - ΔCt of mutant Taq, ΔCt= Ct of mutant template - Ct of wild type template) 값을 비교하여 평가하였다.
시험 변이체 중에 비교적 높은 구분성이 있는 변이체 (++)는 K511R, R512K이고, 매우 높은 구분성을 나타내는 변이체 (+++)는 K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, K508S, K508R, K511A, R512W였다 (표 3 및 도 7a, 도 7b).
실시예 8에서 음전하 아미노산으로의 치환시 변이체들 (K505E, K508E, K511E, R512E)의 활성이 현저히 감소하였으며, 이와 유사하게 음전하 아미노산 제거시 (E507G, E507K, E507Q) 활성은 비교적 높으나 구분성은 크게 높아지지 않았다. 흥미롭게도 양전하 아미노산인 K와 R을 상호 치환할 경우 즉, K511R 및 R512K 변이체는 활성이 유지되었으며, 구분성도 약간 증가하였다. 각 변이체 중에서 높은 구분성을 보이는 변이체는 비하전 아미노산으로 치환된 변이체인 K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, K508S, K511A, R512W 등으로 확인되었다.
이러한 결과로 유추해 볼 때, 본 발명의 집중 변이 영역인 루프 영역의 음전하 아미노산의 존재는 DNA 골격 (backbone)의 인산과 루프 영역과의 결합을 방해하여 활성의 감소를 초래하는 것으로 추론되며, 루프 영역의 양전하 아미노산의 존재는 단백질과 프라이머의 견고한 결합을 유도하여 안정적인 활성의 유지에 도움을 주는 것으로 판단된다. 루프 영역의 양전하 아미노산을 비전하 아미노산으로 치환하는 경우 활성의 소실은 크지 않고, 구분성을 높이는 것으로 확인된다.
<실시예 11> K511A 변이체에 추가변이 도입변이체의 구분성 확인
K511A Taq DNA 중합효소 변이체에 추가로 저온에서 활성이 억제되는 돌연변이체 (cold sensitive mutant)로 보고된 부위인 I707L 및 E708K 변이를 도입한 변이주 CS2-K511A를 <실시예 6>의 방법에 따라 제작하였다. <실험예 2> 및 <실험예 4>와 같이 배양하고 SDS-PAGE에서 95% 이상의 순도로 정제하였다. 정제된 CS2-K511A Taq DNA 중합효소에 대해 <실험예 6>과 같이 실시간 PCR을 수행하였다. 단, 이때 전방 프라이머는 EGFR-ARMS-F를 사용하였다. 수행된 PCR 조건에서 CS2-K511A Taq DNA 중합효소는 야생형 Taq DNA 중합효소에 비해 실시간 PCR에서 매치와 미스매치 간에 매우 높은 구분성을 나타내었다 (표 3 및 도 8).
본 발명의 구분성이 향상된 DNA 중합효소 변이체는 중합효소 활성은 유지하거나 향상되면서, 주형과 프라이머 간의 염기 매치 또는 미스매치에 따른 구분성이 향상되므로, 상보적 위치 또는 비상보적 변이 위치의 존재 및 증폭 여부를 쉽게 확인할 수 있으므로, 소량 다품종이 혼합된 시료 중의 대립 유전자 검출이 용이하여 미량의 돌연변이를 포함하는 시료 중의 돌연변이 유전자 검출이 용이하며, 농, 수, 축산물 등의 유전자 검사나 의학 분야의 진단 등에 폭넓게 이용할 수 있다.
전자파일 첨부하였음.
본 발명은 대한민국 농림축산식품부의 지원으로 수행한 과제의 결과임을 밝힌다 (과제 고유번호: 1545019806, 과제명: FenDEL 기반 품종검사 제품용 실시간 유전자 분석기술 개발).

Claims (14)

  1. 서열번호 1로 구성된 Taq DNA 중합효소와 80% 이상의 상동성을 가지는 DNA 중합효소 또는 이들의 클레나우 단편 (Klenow fragment)에서 Ha 및 Hb 서열 사이의 루프 영역의 아미노산이 한 개 이상 변이되고, 야생형 DNA 중합효소와 비교하여 중합 활성은 유지되며, 대립 유전자 또는 유전자 변이 구분성이 향상된 DNA 중합효소 변이체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 루프 영역은 서열번호 1의 497~514 위치 또는 이에 상응하는 위치인, DNA 중합효소 변이체.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 변이는 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실인, DNA 중합효소 변이체.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 80% 이상의 상동성을 가지는 DNA 중합효소는 서열번호 1로 구성된 Taq DNA 중합효소와 90% 이상의 상동성을 가지는, DNA 중합효소 변이체.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 80% 이상의 상동성을 가지는 DNA 중합효소는 서열번호 1로 구성된 Taq DNA 중합효소와 95% 이상의 상동성을 가지는, DNA 중합효소 변이체.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 변이는 서열번호 1의 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 505, 506, 509, 510, 511, 512, 513, 514 또는 이에 상응하는 위치로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 일어나는, DNA 중합효소 변이체.
  7. 청구항 6에 있어서,
    497, 505, 511, 512 위치 또는 이에 상응하는 위치에 존재하는 하전된 아미노산 중 하나 이상이 변이된, DNA 중합효소 변이체.
  8. 청구항 6에 있어서,
    505, 511 및 512 위치 또는 이에 상응하는 위치에 존재하는 양전하로 하전된 아미노산 중 하나 이상이 변이된, DNA 중합효소 변이체.
  9. 청구항 6에 있어서,
    504, 507, 508 위치 또는 이에 상응하는 위치 중 하나 이상의 아미노산이 더 변이된, DNA 중합효소 변이체.
  10. 청구항 6에 있어서,
    G499R, K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, E507A, E507G, E507S, E507R, E507Q, K508A, K508G, K508S, K511A, K511S, R512K, R512W에서 선택되는 하나 이상의 변이 또는 이에 상응하는 위치의 하나 이상의 변이가 포함된, DNA 중합효소 변이체.
  11. 청구항 6에 있어서,
    I707L 및 E708K 중 하나 이상의 변이 또는 이에 상응하는 위치의 하나 이상의 변이가 더 포함된, DNA 중합효소 변이체.
  12. 청구항 6에 있어서,
    K511A, I707L 및 E708K의 세 아미노산 변이 또는 이에 상응하는 위치의 변이를 포함하는 DNA 중합효소 변이체.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 선택된 어느 한 항의 DNA 중합효소 변이체를 이용하여 대립 유전자 또는 유전자 변이 구분성이 개선된 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 12 중 선택된 어느 한 항의 DNA 중합효소 변이체가 포함된 중합효소 연쇄반응 킷트.
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