KR20210147952A

KR20210147952A - 유전자 변이에 대한 구분성이 향상된 dna 중합효소 변이체

Info

Publication number: KR20210147952A
Application number: KR1020210068144A
Authority: KR
Inventors: 김재종; 임시규; 유정현; 이보미; 김슬기; 차선호
Original assignee: (주) 제노텍
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2021-05-27
Publication date: 2021-12-07

Abstract

본 발명은 패밀리 A에 속하는 DNA 중합효소 변이체 및 그 이용에 관한 것으로서, 프라이머 3' 말단의 염기가 주형과 상보적일 때는 중합이 원활하게 일어나며, 비상보적일 때는 중합이 억제되어 두 경우의 구별 (discrimination)이 용이하게 되는 DNA 중합효소 변이체, 이 변이체를 이용한 PCR 방법 및 이 변이체를 포함하는 PCR 킷트에 관한 것이다. 본 발명은 단일염기다형성 분석 (SNP genotyping) 및 체세포 돌연변이 검출 (somatic mutation detection) 등에 유용하다.

Description

유전자 변이에 대한 구분성이 향상된 DNA 중합효소 변이체 {DNA polymerase variants that show high discrimination against genetic variation}

인간 등 여러 생명체의 형질, 약물대사, 면역학적 반응, 유전병과 암과 같은 질환 등에 관여하는 유전적 변이 즉, 단일염기 다형성, 부가, 결실 등의 유전적 변이를 확인하는 것은 치료의 예측, 치료 방법의 결정, 치료 예후 및 재발의 관찰 등 정밀의료 구현에 있어서 매우 중요하다 (Auton, Brooks et al. 2015, Zhang, Qin et al. 2004, Poste 2001, Nakagawa and Fujita 2018, Martincorena and Campbell 2015). 또한, 유전적 변이 확인 또는 구별은 농식품 분야에서 종의 육종 및 선별, 원산지 및 품종의 판별 등에도 매우 유용하다.

유전적 변이는 생명체에게 태생적으로 존재하거나 또는 성장과정 중에 환경적인 또는 내생적인 원인으로 발생할 수 있다. 인체 등의 유전적 변이 형태 중 가장 흔한 것은 단일염기 다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)이다. 이하 발명의 설명에서는 다양한 유전적 변이를 대표하여 SNPs를 예로 들어 설명한다.

인간을 포함하는 생명체가 지닌 SNPs의 판별에 사용되는 방법 중 가장 보편적이며 경제적이고 간편한 방법은 중합효소를 활용한 유전자 증폭기술 즉, PCR (polymerase chain reaction) 기술이며, 특히 PCR 과정에서 실시간으로 유전자 변이량을 측정할 수 있는 정량적 실시간 PCR (quantitative real time PCR; "qPCR" 또는 "실시간 PCR")이 유용하다. 핵산의 정성적 및 정량적인 검출 기법인 실시간 PCR은 보건, 농업, 식품, 환경 등의 다양한 분야에서 응용되고 있다. 1990년 초 개발된 실시간 PCR은 지속적으로 기술적 한계점을 개선하여 좀 더 정확하고 정밀한 기법으로 발전해 오고 있다.

실시간 PCR을 이용한 유전자 판별 킷트 개발에 있어서 비특이적 신호의 발생, 그리고 돌연변이와 야생형 유전자 서열의 낮은 구분성은 실시간 PCR의 대표적인 기술적 한계로 여겨진다.

특히 암, 병원체 검출 등의 진단기술로서 실시간 PCR 기술의 개발을 위해서는 비특이적 신호의 제어가 필수적이다. 비특이적 신호로 인하여 위양성이 나타나는 경우 검사의 신뢰도가 저하가 되며, 특히 극소량의 검출이 필요한 비침습성 또는 최소 침습성 액체생검 (liquid biopsy)과 같은 진단 기술에서는 소량의 표적 변이를 정확하게 진단하기 위하여 PCR 효율성의 증대와 특이성 (specificity)을 높이는 기술이 필요하다. PCR의 효율성과 특이성을 높이기 위해 PCR 용액에 첨가하는 조성물을 개발하거나, 특별한 프로브 (probes) 또는 프라이머 (primers)를 고안하거나, 효소를 개량하는 방법이 모색되어 왔다.

PCR 용액에 첨가하는 조성물로는 주로 PCR의 반응성을 높이는 방법, 프라이머 다이머 (primer dimers)의 생성, 또는 사용하는 프라이머가 비특이적 표적에 결합하여 생성되는 비특이적 PCR 산물의 생성, 또는 높은 GC 비율 및 특이 고차구조 형성에 등에 의한 PCR 효율의 감소를 해소하는 용도의 첨가 조성물이 연구되어 왔다. 이러한 조성물로는 DMSO (dimethylsulfoxide), 베타인 (betaine) 등이 있다.

그리고 일명 HotStart PCR을 위해 낮은 온도에서 진행되는 반응을 차단하고 고온에서 PCR이 진행되도록 하여 비특이적 증폭을 막는 방법이 다수 보고되었다. 그 중 HotStart PCR 방법으로는 DNA 중합효소 (DNAP) 특이적 단일클론 항체를 첨가하는 방법 [Biotechniques (1994) 16(6):1134-1137], DNA 중합효소의 활성을 억제하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드인 일명 앱타머 (aptamer)를 첨가하는 방법 [US/005693502A (1997) (Gold and Jayasena 1997); J. Mol. Biol. 271:100-111 (1997) (Lin and Jayasena 1997); Nucleic Acids Research Supplement No.3: 309-310 (2003) (Ikebukuro and Noma 2003)], 또는 DNA 중합효소와 낮은 온도에서 결합능력을 지니며, DNA 중합효소의 활성을 억제하지만, 특정온도 이상의 PCR 조건에서는 이중나선을 형성하지 아니하여 DNA 중합효소 활성을 억제하지 않는 이중 가닥 뉴클레오타이드를 사용하여 비특이적 DNA 합성을 억제하는 방법 [J. Mol Biol. 264(2):268-278 (1996) (Dang and Jayasena 1996); US 8,043,816 B2 (2011) (Astatke, Chatterjee et al. 2011) ]이 알려져 있다.

특별한 프로브 및/또는 프라이머를 사용하여 PCR의 효율성과 특이성을 높이는 방법에서 특별한 프로브와 프라이머는 증폭된 표적 산물을 특이적으로 검출하기 위한 것으로, 특이도가 높은 프로브를 사용하는 방법이 개발되었다. SYBR green I 또는 SYTO9와 같은 DNA 결합 형광체를 실시간 PCR에 사용하면 증폭된 산물 전체가 검출되므로 비특이적 신호가 종종 발생하는 문제점이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 표적 서열 특이적 프로브 (target sequence specific probes)가 개발되었고, 이러한 프로브로는 TaqMan 프로브 (dual labelled signaling hydrolysis probe) [P Natl Acad Sci USA 88, 7276-280 (1991) (Holland, Abramson et al. 1991)]와 분자 비콘 (molecular beacons) [Methods. 25, 463-71 (2001) (Mhlanga and Malmberg 2001)], 스콜피온 프로브 (scorpion probes) [Nat Biotechnol. 17, 804-07 (1999) (Baner, Nilsson et al. 1998)], LUX (light upon extension) 프라이머 [Nucleic acids research. 30, e37 (2002) (Nazarenko, Lowe et al. 2002)], 앰플리플루오르 프라이머 (Amplifluor primers) [BioTechniques. 26, 552-58 (1999) (Uehara, Nardone et al. 1999)] 등이 있다.

또한, 표적 변이 유전자를 선택적으로 증폭하기 위하여 특이도가 높은 프라이머 또는 특수 올리고뉴클레오타이드 블로커 (oligonucleotides blocker)를 사용하는 방법 등이 개발되었다. 특이도가 높은 프라이머를 사용하는 방법으로는 3' 말단 하나의 염기 차이에 의해 구분이 되는 AS-PCR (allele specific PCR)을 중심으로 3' 말단에 변이 서열 하나 외에 추가의 인위적인 변이 서열을 첨가하는 ARMS-PCR (amplification refractory mutation system PCR)과 같은 방법 [Mol Cell Probes. 18. 349-352 (2004) (Jarry, Masson et al. 2004); Nucleic Acids Res 17. 2503-2516 (1989) (Newton, Graham et al. 1989); Nat Biotechnol. 17. 804-807 (1999) (Whitcombe, Theaker et al. 1999); Cytokine 71, 278-282 (2015) (Bergallo, Gambarino et al. 2015)]이 있으며, 최근에는 어닐링의 안정성을 높이면서도 주형과 프라이머 간의 미스매치 구별을 유지하도록 두 개의 부분으로 분리된 프라이머를 사용하는 방법인 SeeGene 사의 DPO (dual-priming oligonucleotide) [J. Am. Chem. Soc. 126, 4550-4556 (2004) (Sherrill, Marshall et al. 2004); Biomol. Detect. Quantif. 1 3-7 (2014) (Reddington, Tuite et al. 2014); J. Clin. Microbiol. 49. 3154-3162 (2011) (Higgins, Beniprashad et al. 2011)]와 Swift Biosciences의 myT 프라이머 (http://www.swiftbiosci.com/technology/myt-primers)가 개발되었다.

비특이적인 신호를 억제하거나 또는 대립 유전자의 구분성을 높이는 PCR에 용이하게 사용하기 위한 DNA 중합효소 개발도 다수 이루어졌다. PCR 기술에는 내열성 DNA 중합효소를 사용하는 것이 일반적이다.

DNA 중합효소는 7가지 이상의 군 (family)으로 구분되지만 PCR 기술에 이용되는 내열성 중합효소는 A군에 속하는 Taq DNA 중합효소를 비롯한 내열성 세균 유래 효소군과 B군에 속하는 Pfu DNA 중합효소를 비롯한 고세균 유래 효소군에서 주로 선택된다. 그 중 Taq DNA 중합효소를 비롯한 A군의 DNA 중합효소는 일반적으로 5'→3' 뉴클레이즈 활성을 가지고 있으며, 이 5'→3' 뉴클레이즈 활성에는 엑소뉴클레이즈 활성 및 엔도뉴클레이즈 활성이 모두 있고, 이 엔도뉴클레이즈 활성 부분을 플랩 엔도뉴클레이즈 1 (Flap Endonuclease 1; FEN1)이라고도 한다. 이 활성은 가수분해 프로브 (예컨대 TaqMan probe)의 분해를 통한 특이 신호 (specific signal)의 방출에 매우 중요하다. Taq DNA 중합효소는 3'→5' 엑소뉴클레이즈 활성이 없으므로 3' 최종 말단이 주형 DNA와 비상보적인 프라이머를 사용하는 PCR에 매우 적합하다. 3' 말단이 비상보적인 AS (allele specific) 프라이머 또는 ARMS (amplification refractory mutation system) 프라이머의 경우 프라이머 3' 염기 (base)의 매치 또는 미스매치에 따라 돌연변이와 야생형 또는 두 대립 유전자의 증폭 효율이 결정되며 비교적 좋은 임상적 결과를 도출한다. 하지만, 때로 3'이 미스매치된 프라이머의 경우도 일부 증폭되므로 다수의 야생형에 혼입된 돌연변이 검출을 위한 고감도 진단에서 종종 판별 오류가 일어나게 된다.

분자진단을 위한 실시간 PCR에는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 Taq DNA 중합효소가 널리 사용된다. 아래에서 별도 언급이 없는 경우 DNA 중합효소의 아미노산 서열은 서열번호 1을 따른다.

서열변호 1 (야생형 Taq DNA 중합효소)

MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE

Taq DNA 중합효소는 E. coli DNA 중합효소 I이 포함되는 Family A에 속하는 내열성 효소이다. Taq 중합효소는 작은 단편인 5' 뉴클레이즈 도메인 (1-288 aa)과 큰 단편인 중합효소 도메인 (289-832)(Stoffel fragment 또는 KlenTaq)으로 나누어지고, Taq DNA 중합효소의 중합효소 도메인은 손바닥 (Palm) 서브도메인, 손가락 (Finger) 서브도메인 및 엄지 (Thumb) 서브도메인이 인간의 오른손 모양의 구조를 형성하여 DNA 이중나선구조와 잘 결합할 수 있다 (Ollis, Brick et al. 1985) (Kim, Eom et al. 1995) (Eom, Wang et al. 1996).

DNA 중합효소 I에 대한 다수의 결정 구조 연구를 통해 프라이머, 프로브, NTP 및 Mg⁺⁺ 등의 결합 부위와 활성 부위의 위치를 고려한 다양한 아미노산 잔기에 대한 변이 연구가 있었다. 주요 탐색 영역으로 모티프 A 영역 (605-617 잔기) (Patel and Loeb 2000) (Suzuki, Yoshida et al. 2000), O-나선 영역 (659-671 잔기) (Suzuki, Yoshida et al. 2000), 핑거 도메인의 Pα-나선 영역 (704-707 잔기) (Kermekchiev, Tzekov et al. 2003), 뉴클레오타이드 결합 포켓 영역 (611-617 잔기)과 입체 게이트 (steric gate) 관련 아미노산 잔기 (615 잔기) 및 손바닥 도메인 (Palm domain)의 세 번째 β-시트 영역 (597-609 잔기) (Ong, Loakes et al. 2006), 모티프 C 영역 (Strerath, Gloeckner et al. 2007), 그리고 P' 도메인 영역 (704-717 잔기) (Kermekchiev, Kirilova et al. 2009)이 있다.

이러한 부위에 대해 다수의 연구를 통해 효소 활성이 증가한 돌연변이체 (Ignatov, Miroshnikov et al. 1998), Hot start PCR에 이용 가능한 저온 활성이 약한 변이체 (cold sensitive variant) (Kermekchiev, Tzekov et al. 2003) (Wu, Walsh et al. 2015) (Modeste, Mawby et al. 2019), 역전사 PCR, 중아황산염 (bisulfite) PCR, 오류 경향 PCR (error prone PCR) 등에 이용 가능하도록 rNTP, 소수성 염기 유사체 (hydrophobic base analogues) 등의 다양한 기질에 대한 이용성이 확장된 변이체 (Suzuki, Yoshida et al. 2000) (Ong, Loakes et al. 2006) ) (Strerath, Gloeckner et al. 2007) (Loakes, Gallego et al. 2009) (Schultz, Gochi et al. 2015) (Fa, Radeghieri et al. 2004) (Loakes, Gallego et al. 2009) [US 9267130B2 (2016) (Martin, Simpson et al. 2016)] US2012/0258501 A1 (Bauer, Myers et al. 2012). 연장 (Elongation) 능력이 개선된 변이체 (Yamagami, Ishino et al. 2014), 혈액, 토양 등 다양한 시료에 포함된 성분에 의한 PCR 억제에 대해 내성을 나타내는 변이체 (Kermekchiev, Kirilova et al. 2009) 등이 개발되었다.

이들과 더불어 대립형질 또는 돌연변이 특이 프라이머의 3' 말단 서열의 일치와 불일치를 구별하는 능력이 증대된 중합효소가 보고되었다 [PLos One. 9(5):e96640 (2014) (Drum, Kranaster et al. 2014) (Raghunathan and Marx 2019); KR 10-2017-0088373 (2017) (이병철 2017); US 0034879A1 (2013) (Skiragaila, Tubeleviciute et al. 2013); WO 082449A2 (2015) (Marx, drum et al. 2015); US 9,267,120 B2 (2016) (Reichert, Bauer et al. 2016); US 8,759,061 B1 (Marx, Summerer et al. 2014) Chembiochem 8 (4) 395-401 (2007) (Strerath, Gloeckner et al. 2007).

이 연구들에서는 프라이머와 주형, 그리고 효소 내로 들어오는 뉴클레오타이드와 구조상 결합되는 것으로 추정되는 아미노산 잔기를 대상으로 집중적으로 변이를 확보하고자 했고 놀랄 만한 성과를 거두었다. 특히, K508W, R536K, R587K, R660V 돌연변이체 (Drum, Kranaster et al. 2014)와 Mut_ADL 변이체 (변이부위 N483K, E507K, S515N, K540G, A570E, D578G, V586G, I614M) (Raghunathan and Marx 2019) 등은 높은 구분성을 보였고, 활성 또한 비교적 야생형 Taq 중합효소와 비견할 만한 활성을 가지고 있어 충분히 상업적 응용성을 갖추었다고 평가된다.

그러나 중합효소에 대한 돌연변이체 개발이 20년 이상 진행되어 왔으나, 위와 같은 연구를 제외하고는 높은 구분성을 가지는 중합효소의 개발은 성공적이지 못하였다. 효율적인 라이브러리 구축 전략 (CSR, spCSR, phage display)과 지향 진화 (direct evolution)와 같은 매우 용이한 변이체 제작 및 선별 시스템 등이 개발되었지만, 저해제의 첨가를 이용한 고내성 효소 선별 또는 비표준 기질 (noncanonical substrates) 등을 이용할 수 있는 효소의 선별과 같은 선택압 (selection pressure) 또는 선별 시스템 (screening system)의 설정이 구분성이 높은 효소의 선별에는 별로 유용하지 않았기 때문이다.

그러므로 정확한 표적을 기반으로 한 변이를 통해 효소를 선별하는 것이 구분성이 우수한 효소 선별 가능성을 높이는데 매우 중요하다. 그러므로 구분성과 연관된 중합효소의 구조 영역의 발굴은 구분성이 우수한 효소 개발을 담보할 수 있을 것이다.

대한민국 공개특허공보 10-2019-0007214 (2019.01.22.) "유전자 변이 특이적 증폭 효율이 증가된 DNA 중합효소" US 8,043,816 B2 (2011.10.25.) "Compositions and methods for temperature-dependent nucleic acid synthesis" US 2012/0258501 A1 (2012.10.11.) "DNA polymerase with improved activity" US 5,693,502 A (1997.12.02.) "Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerase" US 9,267,130 B2 (2016.02.23.) "Polypeptides having nucleic acid binding activity and compositions and methods for nucleic acid amplification" WO 2015/082449 A2 (2015.06.11.) "Mutated DNA polymerases with high selectivity and activity" US 8,759,061 B1 (2014.06.24.) "Mutated DNA polymerses with increased mispairing discrimination" US 9,267,120 B2 (2016.02.23.) "DNA polymerases with increased 3'-mismatch discrimination" US 2013/0034879 A1 (2013.02.07.) "DNA polymerases" US 6,265,193 B1(2001. 06.24) “DNA polymerase having improved labeled nucleotide incorporation properties”

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암 진단 등을 위한 임상시료 중 생체 조직, 혈액, 분변, 타액 등의 검체 내 변이 유전자의 검출에는 극소량의 변이 DNA 외에 다수의 야생형 DNA가 혼입되어 있어 돌연변이 DNA를 특이적으로 검출하기는 매우 어렵다. 다수의 야생형에 혼입되어 1% 이하의 극미량으로 존재하는 변이를 검출할 수 있는 특이도 (specificity)를 보장할 수 있어야 하며, 임상적 적용을 위해서는 높은 견고성 (robustness)이 있어야 한다. 특히, 야생형 서열에 대한 낮은 위양성 및 돌연변이 서열에 대한 높은 특이도를 보여야 한다. 그러한 이유로, 암진단 등의 고감도 진단에 적합하도록 PCR 효율성과 특이성을 높이기 위해 PCR 용액 첨가 조성물을 개발하거나, 특별한 프로브 및/또는 프라이머를 고안하거나, 효소를 개량하는 방법이 모색되어 왔다.

DMSO, 베타인 등의 증폭효율 증대를 위한 시약, DNA 중합효소 억제용 단일클론 항체, 실온과 같은 낮은 온도에서 DNA 중합효소 활성을 억제하는 올리고핵산, 일명 앱타머의 첨가는 종종 DNA 증폭 효율을 증대하고, 비특이적 PCR 산물 증폭이나 프라이머 다이머(dimer) 형성을 억제한다. 그러나 이들을 첨가했을 때 대립 유전자의 구분성을 증대시키기 어렵다.

또한, 특이적 프라이머와 프로브 등의 사용으로 특히 단일염기 변이를 구분하는 것은 기술적으로 쉽지 않고, 보편적 적용에 한계가 있을 뿐 아니라, 특이적 프라이머나 프로브의 설계에 많은 노력과 비용이 요구된다.

현재까지 가장 접근이 쉽고 효율적인 방법은 대립 유전자의 변이 서열에 따른 3' 미스매치 유무를 통해 대립 유전자를 구분할 수 있도록 AS 프라이머 또는 ARMS 프라이머를 사용하여 대립 유전자의 구분성을 향상시키는 방법이 있다. 하나의 염기가 미스매치되는 AS 프라이머를 사용하는 경우 높은 PCR 효율에 비해 종종 대립 유전자의 구분성이 낮으며, 두 개 이상의 염기가 미스매치된 ARMS 프라이머의 경우 AS 프라이머 사용에 비해 대립 유전자의 구분성은 좋아지지만 PCR 증폭 효율이 낮아지므로 빈번하게 검출한계 (LOD; limit of detection)가 저하된다.

그러므로 3' 미스매치와 3' 매치의 구분성을 높인 돌연변이 DNA 중합효소를 사용하여 돌연변이 서열의 검출 특이도를 높이려는 연구가 계속되고 있으나, 많은 노력에도 불구하고 지금까지는 그다지 성공적인 변이체를 확보하지 못했다. 또한, 선별된 돌연변이 DNA 중합효소는 빈번하게 효소 활성이 저하되고 이에 따라 검출 감도도 저하되어 상업적으로 이용이 저조했다.

효율적으로 대립 유전자 또는 돌연변이 서열을 검출하기 위하여 중합효소의 활성이 저하되지 않으면서도, 사용하는 프라이머 3' 말단과 주형 DNA 간의 매치와 미스매치의 구분성을 높이는 효소의 개발이 지속적으로 요구된다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해소하고, SNPs 등의 유전자 변이를 효과적으로 검출하기 위하여, 구분성이 좋은 DNA 중합효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 목적은 더욱 구체적으로 주형과 프라이머 3' 사이의 미스매치와 매치의 구분성을 높이는 것이며, 이를 달성하기 위한 DNA 중합효소 변이체를 제공하는 것이고, 구체적으로 패밀리 A 계열의 DNA 중합효소를 제공하는 것이고, 더욱 구체적으로는 Taq DNA 중합효소를 포함하는 내열성 DNA 중합효소를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 DNA 중합효소 변이체를 이용한 PCR 수행방법 및 PCR 킷트를 제공하는 것이다.

구분성이 높은 DNA 중합효소 변이체를 얻기 위하여 본 발명자들은 효소 중 변이 표적 영역을 설정하고, 이 부위에 대해 집중적으로 다양한 변이체를 제작하여 탐색함으로써 우수한 변이체를 확보하였다.

본 발명에서 우리는 놀랄 만한 수준의 유전자 변이 구분성 또는 대립 유전자 구분성을 보이는 DNA 중합효소를 제공하려고 한다.

본 발명에서 탐색된 하나의 영역은 엄지 도메인 (Thumb domain)의 끝 부분 (Tip)에 해당하는 Ha (487-496) 및 Hb(515-521) (Kim, Eom et al. 1995) (Li, Korolev et al. 1998) 사이의 루프 영역 (497~514) (이하 루프(loop) 영역) (도 1)에 속하는 부분이다. 이 루프 영역은 음전하로 하전된 아미노산은 거의 없으며, 양전하로 하전된 아미노산이 다수 있어 높은 pI 값을 나타낸다. 또한, 이 영역은 매치와 미스매치의 구분성이 높은 효소로 알려진 T. sp. Z05 (서열번호 2) DNA 중합효소 (Z05)의 루프 영역과 단지 세 개의 아미노산 (R501, L505, Q509)만 차이가 있다.

서열번호 2 (TZ05 DNA 중합효소)

MKAMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFFALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGYKAVFVVFDAKAPSFRHEAYEAYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGFTRLEVPGFEADDVLATLAKKAEREGYEVRILTADRDLYQLVSDRVAVLHPEGHLITPEWLWEKYGLKPEQWVDFRALVGDPSDNLPGVKGIGEKTALKLLKEWGSLENILKNLDRVKPESVRERIKAHLEDLKLSLELSRVRSDLPLEVDFARRREPDREGLRAFLERLEFGSLLHEFGLLEAPAPLEEAPWPPPEGAFVGFVLSRPEPMWAELKALAACKEGRVHRAKDPLAGLKDLKEVRGLLAKDLAVLALREGLDLAPSDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEDAAHRALLAERLQQNLLERLKGEEKLLWLYQEVEKPLSRVLAHMEATGVRLDVAYLKALSLELAEEIRRLEEEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELRLPALGKTQKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQHRELTKLKNTYVDPLPGLVHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPIRTPLGQRIRRAFVAEAGWALVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGKDIHTQTASWMFGVSPEAVDPLMRRAAKTVNFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAVAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRKRGYVETLFGRRRYVPDLNARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPHLREMGARMLLQVHDELLLEAPQARAEEVAALAKEAMEKAYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKG

서열번호 7 (야생형 Taq DNA 중합효소의 루프 영역)

497-ELGLPAIGKTEKTGKRST-514

이 루프 영역 (497~514 잔기 또는 이에 상응하는 위치)은 DNA 중합효소의 일부분에서 선택될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 DNA 중합효소 패밀리 A를 구성하고 있는 아미노산 서열 일부분에서 선택될 수 있다.

Taq DNA 중합효소의 α-나선 Ha와 Hb 영역은 중합효소 패밀리 A에서 서열이 어느 정도 보존된 영역 (80% 이상), 보존된 영역 (90% 이상) 또는 매우 보존된 영역 (95% 이상)이며 두 나선 사이에 루프 영역 (야생형 Taq DNA 중합효소의 497~514 잔기 또는 이에 상응하는 위치)이 있으며, 이 영역은 본 발명의 목적을 이루기 위해 선택될 수 있다.

본 발명에서 탐색된 루프 영역은 본 발명의 예시에서 제시하는 것과 같이 DNA 결합과 관계된 영역이다.

이 루프 영역은 본 발명의 예시와 같이 DNA와 DNA 중합효소가 결합한 상태에서 DNA 중합효소가 분해되지 않는 현상과 관련이 있다.

이 루프 영역은 본 발명의 예시와 같이 높은 KCl 농도, 즉 KCl 농도 200 mM 이상에서 DNA 중합효소가 분해되지 않는 것과 관련이 있다.

본 발명의 예시와 같이 Taq DNA 중합효소 또는 그 변이체의 분해가 DNA에 의해 억제되므로 루프 영역이 DNA 결합, 더욱 구체적으로는 프라이머 결합과 관계된 영역임을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 예시와 같이 루프 영역은 중합효소의 구조 연구 결과, Taq DNA 중합효소와 기질인 프라이머의 결합 영역으로 예측된다.

또한, 본 발명의 일례에서 구현된 것처럼 이 부위의 변이에 의해 제조된 Taq DNA 중합효소 변이체 (예컨대, "K511A" 변이체)는 3' 매치와 3' 미스매치의 PCR 구분성을 높인 것으로 나타나 본 발명에서 제시한 루프 영역이 프라이머 결합과 연관된 영역임을 말해준다.

본 발명에서 제시한 야생형 Taq DNA 중합효소의 497-514 잔기 또는 이에 상응하는 위치의 루프 영역은 본 출원 이전까지 프라이머 결합과 관계된 영역으로 보고된 적이 없다.

본 발명자들은 본 발명의 목적인 DNA 중합효소의 기질 특이성을 높이거나, 기질 특이성을 낮추는 목적을 달성하는 데 루프 영역을 이용하였다.

기질의 특이성을 높인다 함은 주형과 프라이머 간 결합에서 프라이머의 3' 말단 염기가 주형과 매치되는지 미스매치되는지에 따라 3' 매치 프라이머를 넣은 경우 3' 미스매치 프라이머를 넣은 경우보다 PCR이 더 효율적으로 진행되고/되거나 중합과정 중의 오류가 낮아지는 것을 말한다.

반대로, 기질 특이성을 낮추는 것으로는 정상적인 기질인 dNTPs 외에 rNTP, 소수성 염기 유사체 (hydrophobic base analogues) 등의 유사기질 또는 변형 기질의 사용이 용이해지는 것 및/또는 중합 오류가 많아지는 것을 예시로 들 수 있다.

본 발명자들은 본 발명의 주요한 목적인 프라이머의 3' 말단 염기가 주형과 매치되는 경우와 프라이머의 3' 말단 염기가 주형과 미스매치되는 경우 PCR의 구분성을 높이는 변이체를 선별하는 데에 본 발명에서 루프 영역을 제공한다.

본 발명의 설명, 실시예 및 청구범위에서 말하는 "구분성 (discrimination)"이라 함은 표적 유전자 서열에 존재하는 유전자 변이 또는 SNPs 등의 대립 유전자 변이를 정상 유전자와 구분하는 것을 말하며, 구체적으로는 정상 유전자 또는 변이 유전자 주형과 프라이머의 3' 말단 염기가 매치되는 경우와 미스매치되는 경우 실시간 PCR에서 표적 유전자의 증폭 정도의 차이를 말하는 것이다. 증폭 정도의 차이는 PCR 수행 후 전기영동하여 확인하거나 실시간 PCR로 3' 매치와 미스매치 간의 Ct (또는 Cq) 값의 차이 (ΔCt = 3' 미스매치의 Ct 값 - 3' 매치의 Ct 값) 등으로 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 루프 영역 (야생형 Taq DNA 중합효소의 497-514 잔기 또는 이에 상응하는 부위)을 구성하고 있는 아미노산 중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산을 원래의 아미노산에서 다른 아미노산으로 치환함으로써 본 발명의 목적을 달성할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 이 루프영역의 다수의 대표적인 아미노산 변이를 통해 본 발명의 목적을 달성할 수 있음을 보여준다.

본 발명의 일 실시예에서는 루프영역 (야생형 Taq DNA 중합효소의 497-514 잔기 또는 이에 상응하는 부위)에 속하는 극성 아미노산 중에서 선택된 아미노산에서 다른 아미노산으로의 치환으로 본 발명의 목적을 달성할 수 있음을 보여준다. 상기 극성 아미노산은 구체적으로는 양극성을 띠는 아미노산 잔기 아르기닌 (Arg 또는 A), 히스티딘 (His 또는 H), 라이신 (Lys 또는 K), 또는 음극성을 띠는 아미노산 잔기 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 E) 중에서 선택될 수 있다.

더욱 구체적으로는 본 발명은 Taq DNA 중합효소에서 K505, E507, K508, K511 및 R512 중에서 선택된 아미노산의 치환으로 본 발명의 목적을 달성할 수 있다.

또한, 패밀리 A에 속하는 다른 내열성 DNA 중합효소에서도 Taq DNA 중합효소의 루프 영역(서열번호 7)에 상응하는 영역을 선택하여 구분성을 향상시킨 DNA 중합효소 변이체를 생성할 수 있다. 구체적인 일례를 들면 Z05 DNA 중합효소 (서열번호 2)의 경우 상기 Taq DNA 중합효소의 루프 영역 (497-514)에 상응하는 영역으로서 루프 영역 (499-517)을 선택하여 중합효소 변이체를 생성하는 것이 가능하다.

더욱 구체적으로, Z05 DNA 중합효소 (서열번호 2)에서 루프 영역 (499-517)에 상응하는 아미노산 부위, 바람직하게는 루프 영역에 속하며 하전된 아미노산인 R501, K507, K510, K513 및 R515 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 치환하여 변이체를 생성할 수 있으며, Taq DNA 중합효소의 E507에 상응하는 Z05 DNA 중합효소의 Q509 또한 치환의 대상이 될 수 있다.

중합효소의 변이라 함은 중합효소를 구성하고 있는 일련의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 선택하여 원래 서열에 존재하는 아미노산 대신 다른 자연적으로 생명체가 이용하는 아미노산 19개 중 (20개 중 원래 것을 제외한) 선택되는 하나의 아미노산으로의 변환을 의미하거나, 아미노산을 화학적 또는 효소적으로 변형 (예컨대 당화 (glycosylation), 아민화 (amination), 아실화 (acylation), 수산화 (hydroxylation) 등)하거나, 또는 결실, 추가를 포함하는 것이며, 본 발명에서는 원래의 아미노산에서 다른 자연의 19개 아미노산 중 하나로 치환되는 것을 말한다. 자연의 20개의 아미노산은 알라닌 (Ala 또는 A), 아르기닌 (Arg 또는 R), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 시스테인 (Cys 또는 C), 글루타민 (Gln 또는 Q, 글루탐산 (Glu 또는 E), 글라이신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소류신 (Ile 또는 I), 류신 (Leu 또는 L), 라이신 (Lys 또는 K), 메티오닌 (Met 또는 M), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 프롤린 (Pro 또는 P), 세린 (ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 트립토판 (Trp 또는 W), 티로신 (Tyr 또는 Y), 발린(Val 또는 V)을 말한다.

본 발명의 목적을 이루기 위한 DNA 중합효소 변이는 일반적으로 중합효소를 암호화(coding) 하고 있는 유전자 서열을 변경함으로써 달성할 수 있다. 변경하는 아미노산의 삼중 코돈 (triple codon) 서열은 본 발명을 제한하지 아니한다.

또한, 본 발명의 목적을 이루기 위한 DNA 중합효소 변이는 DNA 중합효소를 발현하는 기술이 본 발명의 범위를 제한하지 아니한다. 예로 들면, 단백질 발현 및 클로닝 벡터의 종류, 발현을 위한 프로모터의 종류, 정제를 용이하게 하기 위한 태깅 (His 태그 등), 유전자 서열을 숙주 세포에 최적화하는 것, 숙주 세포의 종류 (세균, 효모, 조류, 무척추 동물세포　(곤충), 식물세포, 포유류 세포와 체외 번역 시스템 (in-vitro translation system) 등)와 같은 것으로 인하여 본 발명의 구체적인 실시예와 다른 예시라 하더라도 이로 인하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 목적을 이루기 위한 DNA 중합효소 변이체를 수득하는 방법이 본 발명을 제한하지 아니한다. 예를 들어, 크로마토그래피를 위한 장치, 완충액, 수지 종류, 컬럼의 종류, 침전 방법, 여과 방법 등의 구체적 방법이 본 발명의 예시와 다르다고 해서 본 발명을 제한하지는 않는다.

또한, 본 발명의 실시예에서 설명되는 프라이머는 본 발명을 설명하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

본 발명에서 PCR 프라이머로는 대립유전자 특이적 프라이머 (Allele specific primer; AS 프라이머) 또는 ARMS (amplification refractory mutation system) 프라이머를 포함한다.

본 발명에서 "3' 미스매치"라 함은 프라이머의 3' 말단과 주형 간의 미스매치를 말하며, 프라이머의 3' 말단에서 7염기 또는 5염기 중 하나 이상의 염기가 주형 (또는 목적 유전자)과 상보적이지 않음을 의미하며, 더욱 구체적으로는 프라이머 3' 말단의 마지막 염기가 주형의 염기와 비상보적인 경우를 포함하는 것이다.

본 발명에서 "3' 매치"라 함은 프라이머의 3' 말단과 주형 (또는 목적 유전자) 간의 상보적 매치를 말하며, 프라이머의 3' 말단의 마지막 염기가 주형의 염기와 상보적인 경우를 포함하는 것이다.

본 발명에서의 DNA 중합효소는 바람직하게는 중합효소 A 군 (E. coli Pol I 계열)에 속하는 효소이다. 이 중합효소는 내열성 세균, 바람직하게는 내열성 진정세균 (eubacteria) 유래의 DNA 중합효소에서 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 써머스 (Thermus) 종, 써모토가 (Thermotoga)종, 써모코커스 (Thermococcus) 종, 데이노코커스 (Deinococcus) 종, 바실러스 (Bacillus) 종 등 유래의 DNA 중합효소에서 선택될 수 있다. 또한, 이 DNA 중합효소는 PCR을 포함하는 여러 생명공학적 방법에 적용 가능한 것이다.

본 발명의 목적은 DNA 중합효소의 루프 영역 또는 이에 상응하는 영역의 변이를 통해 달성할 수 있다.

좀 더 구체적으로 본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 루프 영역 (497~514 잔기)과 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역 변이를 통해 달성할 수 있다.

본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 루프 영역 (497~514) 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역 변이를 통해 하나 이상의 비하전 아미노산 (non-charged amino acid)의 변이를 통해 달성할 수 있다.

본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 루프 영역 (497~514) 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역 변이를 통해 하나 이상의 하전 (charged) 아미노산의 변이를 통해 달성할 수 있다.

본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 루프 영역 (497~514) 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역 변이를 통해 하나 이상의 양전하 아미노산 (positive charged amino acid)의 변이를 통해 달성할 수 있다.

본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 505 위치의 K 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역에 속하는 아미노산을 치환하여 달성할 수 있다.

본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 507 위치의 E 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역에 속하는 아미노산을 치환하여 달성할 수 있다.

본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 508 위치의 R 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역에 속하는 아미노산을 치환하여 달성할 수 있다.

본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 511 위치의 K 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역에 속하는 아미노산을 치환하여 달성할 수 있다.

본 발명의 목적은 Taq DNA 중합효소의 512 위치의 R 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역에 속하는 아미노산을 치환하여 달성할 수 있다.

본 발명의 일례로 시험된 변이는 G499R, K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, E507G, E507K, E507Q, K508A, K508S, K508R, K511A, K511R, R512K, R512W 등이며, 바람직하게는 이들 중 변이의 구분성이 높은 변이주로서 양전하 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, K508A, K508S, K508R, K511A, K511R, R512K 또는 R512W 변이 Taq DNA 중합효소이다.

이러한 효소가 발명의 목적을 달성한 이유를 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 루프 영역 내의 변이체의 활성과 구조와의 관계, 프라이머와 루프 영역 내 아미노산의 정전기적 결합 (electrostatic interaction) 연관성을 살펴보면 발명의 효과와 독창성을 설명할 수 있다.

본 발명의 일례에 의한 변이 영역은 Taq DNA 중합효소 (서열번호 1)의 루프 영역 (497~514; 서열번호 7) 또는 이에 상응하는 패밀리 A DNA 중합효소의 루프 영역이다. 이 루프 영역은 DNA 결합 영역이다. 본 발명의 일례에서 설명한 E. coli의 프로테아제 (OmpT)에 의해 절단되는 영역이 이 루프 영역이며, 이 영역은 DNA가 결합된 상태에서 프로테아제에 의한 절단이 억제되므로 이 루프 영역이 DNA 결합 영역임을 본 발명에서 확인하였다.

이 루프 영역은 놀랍게도 DNA 중합효소의 변형을 위해 기존에 집중적으로 탐색이 이루어지지 않은 엄지 도메인 (Thumb domain)의 끝 부분 (Tip)에 해당하는 Ha (487-496)와 Hb (515-521) (Kim, Eom et al. 1995) (Li, Korolev et al. 1998) 사이에 존재하며 (도 1), 이 부위는 프라이머의 인산 골격과 결합하는 것으로 예측된다.

본 발명의 일례에서 집중적으로 탐색된 영역은 Taq DNA 중합효소의 Ha (487-496)와 Hb (515-521) 사이의 루프 영역 (497~514)이다.

이 영역은 본 발명자들의 발명의 예시에서 설명하는 것과 같이 DNA 프라이머와의 결합과 관련이 있는 영역이다.

DNA 중합을 위한 프라이머의 결합 영역은 본 발명의 주요 목적인 3' 매치 및 3' 미스매치를 구분하는 효소를 개발하기 위한 돌연변이 대상으로 고려되었다.

본 발명에서 루프 영역의 집중적인 탐색은 프라이머 3' 말단의 염기와 주형 DNA의 매치 및 미스매치 간의 구분성이 증가된 새로운 효소의 개발에 매우 중요한 길을 제공한다.

본 발명의 일례에서 변이 대상 아미노산 잔기는 Ha (487-496) 와 Hb (515-521) 사이의 루프 영역 (497~514) 중에 양극성을 띠는 아미노산 잔기인 아르기닌 (Arg 또는 A), 히스티딘 (His 또는 H), 라이신 (Lys 또는 K), 또는 음극성을 띠는 아미노산 잔기인 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 E) 중에서 우선적으로 선택될 수 있다.

이들 아미노산 잔기는 하전된 잔기가 DNA, 특히 프라이머와 DNA 중합효소 간의 결합력을 결정하는 데 매우 중요한 역할을 하며, 그러므로 이들의 하나 이상의 변이는 DNA, 특히 프라이머의 효소와의 결합력을 변화시킴으로 인해 구분성이 증가하거나 및/또는 PCR 증폭활성이 높아지거나 및/또는 기질의 특이성이 변화될 수 있다.

이 루프 영역 내에 존재하는 또는 새로 도입하는 음전하 아미노산은 루프와 DNA 프라이머 인산 골격 간의 결합을 방해하여 DNA 중합효소 활성을 감소시킬 수 있다.

이 루프 영역 내에 존재하고 있는 또는 새로 도입하는 양전하 아미노산은 루프 영역과 프라이머 인산 골격의 결합을 용이하게 하여 DNA 중합효소 활성을 향상시킬 수 있다.

이 루프 영역 내에 존재하는 양전하 아미노산을 비전하 아미노산으로 치환하는 경우, DNA 중합효소 활성은 높게 유지되면서 구분성도 우수한 효소를 만들 수 있다.

본 발명은 서열번호 1로 구성된 Taq DNA 중합효소와 80% 이상의 상동성을 가지는 DNA 중합효소 또는 이들의 클레나우 단편 (Klenow fragment)에서 Ha 및 Hb 서열 사이의 루프 영역의 아미노산이 한 개 이상 변이되고, 야생형 DNA 중합효소와 비교하여 중합 활성은 유지되며, 대립 유전자 또는 유전자 변이 구분성이 향상된 DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 변이가 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실인, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 루프 영역이 서열번호 1의 497~514 위치 또는 이에 상응하는 위치인, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 변이가 서열번호 1의 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 505, 506, 509, 510, 511, 512, 513, 514 또는 이에 상응하는 위치로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 위치의 아미노산이 변이된, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 위치의 변이에 더하여 I707L 및 E708K 중 하나 이상의 변이 또는 이에 상응하는 위치의 하나 이상의 변이가 더 포함된, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 80% 이상의 상동성을 가지는 DNA 중합효소가 서열번호 1로 구성된 Taq DNA 중합효소와 90% 이상, 또는 91% 이상, 또는 92% 이상, 또는 93% 이상, 또는 94% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 또는 96% 이상, 또는 97% 이상의 상동성을 가지는, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 497, 505, 511 및 512 위치 또는 이에 상응하는 위치에 존재하는 하전된 아미노산 중 하나 이상이 변이된, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 505, 511 및 512 위치 또는 이에 상응하는 위치에 존재하는 양전하로 하전된 아미노산 중 하나 이상이 변이된, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 아미노산 변이 위치에 더하여 서열번호 1의 504, 507, 508, 707, 708 위치 또는 이에 상응하는 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산이 더 변이된, DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 G499R, K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, E507A, E507G, E507S, E507R, E507Q, K508A, K508G, K508S, K511A, K511S, R512K, R512W 또는 이에 상응하는 위치의 상응 변이에서 선택되는 하나 이상의 변이가 포함된 DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 K511A, I707L 및 E708K 세 아미노산의 변이 또는 이에 상응하는 위치의 변이를 포함하는 DNA 중합효소 변이체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 중합효소 변이체를 이용하여 대립 유전자 또는 유전자 변이 구분성이 개선된 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 DNA 중합효소 변이체가 포함된 중합효소 연쇄반응 킷트에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, Taq DNA 중합효소를 포함하는 패밀리 A 열안정성 DNA 중합효소의 Ha 및 Hb 도메인 사이의 루프 영역의 아미노산 변이를 통하여 중합효소 활성은 유지하거나 향상되면서, 주형과 프라이머 간의 염기 매치 또는 미스매치에 따른 구분성이 향상된 DNA 중합효소 변이체가 제공된다.

이와 같은 DNA 중합효소 변이체는 실시간 PCR에 사용되어 단일염기다형성 분석 (SNP genotyping) 및 체세포 돌연변이 검출 (somatic mutation detection) 등에 유용하다.

또한, 이와 같은 DNA 중합효소 변이체를 PCR 킷트 이용하여 구분성을 향상시킬 수 있다.

도 1은 프라이머와 결합하는 아미노산이 집중된 DNA 중합효소의 영역을 나타낸다. T. aquaticus, T. sp Z05, T. maritima, E. coli, B. caldotenax, G. stearothermophilus의 DNA 중합효소 영역 중 Taq DNA 중합효소의 루프 영역 (497~514 잔기)과 그 인근 영역을 비교한 것이다.
도 2는 Taq DNA 중합효소의 SDS-PAGE 사진이다. (A) E. coli MV1184에서 발현한 야생형 Taq DNA 중합효소의 분해 결과이다. 붉은색 화살표는 분해되어 생긴 단백질 띠를 나타낸다. DEAE 컬럼 크로마토그래피 정제물에서 KCl을 제거하기 위해 완충액 A를 사용하여 세척하였다. S는 야생형 Taq DNA 중합효소 표준제품이다. 0, 여과 미실시; 1x, 1회 여과; 2x, 2회 여과; S 표준 Taq DNA 중합효소. (B) E. coli MV1184에서 발현한 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소 변이체의 DEAE 컬럼 크로마토그래피 정제품을 KCl이 각각 0, 100, 300, 500 mM 포함된 완충액 A를 사용하여 여과한 시료의 SDS-PAGE 사진이다. (C) E. coli MV1184에서 발현한 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소 변이체의 DEAE 컬럼 크로마토그래피 정제품에 연어 정자 DNA를 각각 0, 0.4, 2.0, 10, 50 ug을 혼합하거나 DEAE 컬럼 크로마토그래피에서 Taq DNA 중합효소가 용리된 이후의 분획들의 모음 (BP)을 혼합한 후 완충액 A를 사용하여 여과한 시료의 SDS-PAGE 사진이다. M, 단백질 분자량 마커; C, 무처리 시험구; BP, BP를 혼합한 시료.
도 3은 Taq DNA 중합효소 분해 산물의 SDS-PAGE 사진이다. 1: 미처리구, 2: 분해 처리구.
도 4는 Taq DNA 중합효소 절단 위치 (cleavage site) 및 OmpT 인식 부위 (P)를 나타내는 모식도이다.
도 5는 Taq DNA 중합효소의 루프 (loop) 구조와 DNA와의 밀접 구조를 나타내는 모식도이다. Taq DNA 중합효소의 엄지 서브도메인 (Thumb subdomain)에 존재하는 α-나선 Ha(487-496 잔기, 푸른색 영역) α-나선 Hb(515-521 잔기, 푸른색 영역) α-나선 I (527-552 잔기, 자주색 영역)과 루프 (497~514 잔기, 두 푸른색 영역의 사이, 비전하 아미노산 잔기 (녹색 영역), 숫자는 Taq DNA 중합효소의 아미노산 잔기 위치를 나타낸다.
도 6은 K511A Taq DNA 중합효소 변이체와 야생형 Taq DNA 중합효소를 사용한 실시간 PCR 결과를 나타낸다. 주형으로는 BRAF-V600E 및 EGFR-T790M의 정상 DNA(w)와 변이 DNA(m)를 사용하였다. 숫자는 정상 DNA를 사용한 실시간 PCR의 Ct 값에서 변이 DNA를 사용한 실시간 PCR의 Ct 값을 뺀 값을 의미한다. WT: 야생형 Taq DNA 중합효소를 사용한 결과, K511A: K511A 변이 Taq DNA 중합효소를 사용한 결과.
도 7은 각 부위의 대표적인 변이를 포함하는 Taq DNA 중합효소 변이체들의 구분성 확인을 위한 실시간 PCR 결과이다. 각 변이 단백질이 발현된 E. coli BL21 (DE3) 균주로부터 조정제한 시료로 BRAR-V600E 및 EGFR-T790M의 변이 구분성을 시험하였다. WT: 야생형 Taq DNA 중합효소를 사용한 결과, G499R, K505G, E507K, K508S, K511A, R512W는 각각 해당 Taq DNA 중합효소 변이체를 사용한 결과이다.
도 8은 CS2-K511A 및 K511A Taq DNA 중합효소 변이체와 야생형 Taq DNA 중합효소를 사용한 실시간 PCR 결과를 나타낸다. 주형으로는 EGFR-T790M의 정상 DNA(w)와 변이 DNA(m)를 사용하였다. 이때 사용한 전방 프라이머는 EGFR-ARMS-F이다. WT: 야생형 Taq DNA 중합효소, K511A: K511A 변이 Taq DNA 중합효소, CS2-K511A: CS2-K511A 변이 Taq DNA 중합효소.

이하 실험예 및 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 본 발명의 범위가 이하의 실험예 및 실시예의 기재범위로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

< 실험예 1> 위치 지정 돌연변이 (Site directed mutagenesis )와 Taq DNA 중합효소 돌연변이체 제작

단백질 발현을 위해 Taq DNA 중합효소 유전자를 플라스미드 pUC18 내의 lac 프로모터 하류에 위치하도록 구축한 벡터 pJR-Taq을 사용하였다. 각 변이체는 벡터 pJR-Taq을 주형으로 하여 위치 지정 돌연변이로 구축하였다. 변이를 위한 아미노산에 프라이머 (서열번호 8-93)를 사용하여 하기와 같이 위치 지정 돌연변이를 통해 해당하는 Taq DNA 중합효소 변이체를 만들었다. Pfu DNA 중합효소 (Enzynomics, Korea)를 이용하여 PCR을 수행한 후 제한효소 DpnI (Enzynomics, Korea)을 처리하여 변이되지 않은 주형 DNA를 제거하고 변이된 플라스미드를 E. coli DH5α에 형질전환하여 변이 플라스미드를 확보하였다. 확보한 플라스미드의 목적 서열 부위의 염기서열 변이를 염기서열 분석으로 확인하였다. 벡터 중 Taq DNA 중합효소 유전자 외 다른 부위의 서열 변이를 최소화하기 위해 확보한 각각의 변이 플라스미드를 KpnI/BamHI으로 절단하여 약 1.3 kb의 단편을 얻고, KpnI/BamHI으로 pJR-Taq을 절단하여 1.3 kb가 제거된 단편 3.8 kb 와 연결하여 E. coli DH5α에 형질전환하여 각각의 변이체 발현용 벡터를 제작하였다.

부위	변이체	Oligo Name	Sequence(5'-3')	서열 번호
G499	G499R	G499R-F	tttgacgagctaagacttcccgccatcggc	8
G499	G499R	G499R-R	gccgatggcgggaagtcttagctcgtcaaa	9
K505	K505A	K505A-F	cccgccatcggcgctacggagaagaccggc	10
	K505A	K505A-R	gccggtcttctccgtagcgccgatggcggg	11
	K505E	K505E-F	cccgccatcggcgaaacggagaagaccggc	12
	K505E	K505E-R	gccggtcttctccgtttcgccgatggcggg	13
	K505S	K505S-F	cccgccatcggctctacggagaagaccggc	14
	K505S	K505S-R	gccggtcttctccgtagagccgatggcggg	15
	K505G	K505G-F	cccgccatcggcggtacggagaagaccggc	16
	K505G	K505G-R	gccggtcttctccgtaccgccgatggcggg	17
	K505R	K505R-F	cccgccatcggcagaacggagaagaccggc	18
	K505R	K505R-R	gccggtcttctccgttctgccgatggcggg	19
	K505F	K505F-F	cccgccatcggcttcacggagaagaccggc	20
	K505F	K505F-R	gccggtcttctccgtgaagccgatggcggg	21
	K505I	K505I-F	cccgccatcggcattacggagaagaccggc	22
	K505I	K505I-R	gccggtcttctccgtaatgccgatggcggg	23
	K505L	K505L-F	cccgccatcggccttacggagaagaccggc	24
	K505L	K505L-R	gccggtcttctccgtaaggccgatggcggg	25
	K505M	K505M-F	cccgccatcggcatgacggagaagaccggc	26
	K505M	K505M-R	gccggtcttctccgtcatgccgatggcggg	27
	K505W	K505W-F	cccgccatcggctggacggagaagaccggc	28
	K505W	K505W-R	gccggtcttctccgtccagccgatggcggg	29
E507	E507A	E507A-F	atcggcaagacggctaagaccggcaagcgc	30
	E507A	E507A-R	gcgcttgccggtcttagccgtcttgccgat	31
	E507K	E507K-F	atcggcaagacgaagaagaccggcaagcgc	32
	E507K	E507K-R	gcgcttgccggtcttcttcgtcttgccgat	33
	E507S	E507S-F	atcggcaagacgtctaagaccggcaagcgc	34
	E507S	E507S-R	gcgcttgccggtcttagacgtcttgccgat	35
	E507G	E507G-F	atcggcaagacgggtaagaccggcaagcgc	36
	E507G	E507G-R	gcgcttgccggtcttacccgtcttgccgat	37
	E507Q	E507Q-F	atcggcaagacgcagaagaccggcaagcgc	38
	E507Q	E507Q-R	gcgcttgccggtcttctgcgtcttgccgat	39
K511	K511A	K511A-F	gagaagaccggcgctcgctccaccagcgcc	40
	K511A	K511A-R	ggcgctggtggagcgagcgccggtcttctc	41
	K511R	K511R-F	gagaagaccggcagacgctccaccagcgcc	42
	K511R	K511R-R	ggcgctggtggagcgtctgccggtcttctc	43
	K511E	K511E-F	gagaagaccggcgaacgctccaccagcgcc	44
	K511E	K511E-R	ggcgctggtggagcgttcgccggtcttctc	45
	K511S	K511S-F	gagaagaccggctctcgctccaccagcgcc	46
	K511S	K511S-R	ggcgctggtggagcgagagccggtcttctc	47
	K511G	K511G-F	gagaagaccggcggtcgctccaccagcgcc	48
	K511G	K511G-R	ggcgctggtggagcgaccgccggtcttctc	49
	K511V	K511V-F	gagaagaccggcgttcgctccaccagcgcc	50
	K511V	K511V-R	ggcgctggtggagcgaacgccggtcttctc	51
	K511I	K511I-F	gagaagaccggcattcgctccaccagcgcc	52
	K511I	K511I-R	ggcgctggtggagcgaatgccggtcttctc	53
	K511L	K511L-F	gagaagaccggccttcgctccaccagcgcc	54
	K511L	K511L-R	ggcgctggtggagcgaaggccggtcttctc	55
	K511M	K511M-F	gagaagaccggcatgcgctccaccagcgcc	56
	K511M	K511M-R	ggcgctggtggagcgcatgccggtcttctc	57
	K511F	K511F-F	gagaagaccggcttccgctccaccagcgcc	58
	K511F	K511F-R	ggcgctggtggagcggaagccggtcttctc	59
	K511Y	K511Y-F	gagaagaccggctatcgctccaccagcgcc	60
	K511Y	K511Y-R	ggcgctggtggagcgatagccggtcttctc	61
	K511W	K511W-F	gagaagaccggctggcgctccaccagcgcc	62
	K511W	K511W-R	ggcgctggtggagcgccagccggtcttctc	63
R512	R512A	R512A-F	aagaccggcaaggcctccaccagcgccgcc	64
	R512A	R512A-R	ggcggcgctggtggaggccttgccggtctt	65
	R512E	R512E-F	aagaccggcaaggaatccaccagcgccgcc	66
	R512E	R512E-R	ggcggcgctggtggattccttgccggtctt	67
	R512S	R512S-F	aagaccggcaagtcttccaccagcgccgcc	68
	R512S	R512S-R	ggcggcgctggtggaagacttgccggtctt	69
	R512G	R512G-F	aagaccggcaagggttccaccagcgccgcc	70
	R512G	R512G-R	ggcggcgctggtggaacccttgccggtctt	71
	R512K	R512K-F	aagaccggcaagaagtccaccagcgccgcc	72
	R512K	R512K-R	ggcggcgctggtggacttcttgccggtctt	73
	R512F	R512F-F	aagaccggcaagttctccaccagcgccgcc	74
	R512F	R512F-R	ggcggcgctggtggagaacttgccggtctt	75
	R512I	R512I-F	aagaccggcaagatttccaccagcgccgcc	76
	R512I	R512I-R	ggcggcgctggtggaaatcttgccggtctt	77
	R512L	R512L-F	aagaccggcaagctttccaccagcgccgcc	78
	R512L	R512L-R	ggcggcgctggtggaaagcttgccggtctt	79
	R512M	R512M-F	aagaccggcaagatgtccaccagcgccgcc	80
	R512M	R512M-R	ggcggcgctggtggacatcttgccggtctt	81
	R512V	R512V-F	aagaccggcaaggtttccaccagcgccgcc	82
	R512V	R512V-R	ggcggcgctggtggaaaccttgccggtctt	83
	R512W	R512W-F	aagaccggcaagtggtccaccagcgccgcc	84
	R512W	R512W-R	ggcggcgctggtggaccacttgccggtctt	85
	R512Y	R512Y-F	aagaccggcaagtattccaccagcgccgcc	86
	R512Y	R512Y-R	ggcggcgctggtggaatacttgccggtctt	87
	R512H	R512H-F	aagaccggcaagcactccaccagcgccgcc	88
	R512H	R512H-R	ggcggcgctggtggagtgcttgccggtctt	89
I707	I707L	I707L-F	gtgcgggcctggcttgagaagaccctggag	90
I707	I707L	I707L-R	ctccagggtcttctcaagccaggcccgcac	91
E708	E708K	E708K-F	cgggcctggattaagaagaccctggaggag	92
E708	E708K	E708K-R	ctcctccagggtcttcttaatccaggcccg	93

< 실험예 2> Taq DNA 중합효소의 발현을 위한 배양

Taq DNA 중합효소 발현을 위한 벡터들은 E. coli MV1184 (ompT ⁺) 또는 E. coli DH5α (DE3) (ompT ^-)에 도입하여 사용하였다. Taq DNA 중합효소 발현을 위해 E. coli를 LB (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) 배지에서 37℃로 8시간 전배양하고, 2X YT 배지 (1.6% tryptone, 1.0% yeast extract, 0.5% NaCl)에 전배양액 1%를 접종하여 37℃에서 본배양을 수행하였다. 배양액의 O.D. 600 값이 0.4 ~ 0.6이 되었을 때, 0.5 mM IPTG를 첨가하여 약 4시간 배양하였다. 배양이 완료된 배양액을 얼음물에 담가 냉각한 다음 원심분리 (10,000 x g, 10 min, 4℃)하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 배양액의 1/10 (v/v)의 완충액 A [50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 1 μM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)]로 현탁한 후 원심분리하여 회수하는 방법을 2회 반복하여 배지 성분을 제거한 후, 배양액의 1/20~1/40 (v/v)의 완충액 A에 재현탁하여 준비하였다.

< 실험예 3> Taq DNA 중합효소의 조정제 시료 제조

배양액 100 ml에서 확보된 균체 현탁액 (실험예 2)으로부터 Taq DNA 중합효소를 조정제하였다. 균체 현탁액을 초음파 파쇄기를 이용하여 (2 mm tip, amplitude 25%, 9.9 s/3 s (on/off), 5 min) 균체를 파쇄한 후 원심분리 (10,000 x g, 10 min, 4℃)하여 상등액을 회수하였다. 상등액에 RNase를 50 μg/ml 되도록 첨가하여 37℃에서 30분간 반응 후, 75℃에서 20분간 열처리하였고, 원심분리(10000 x g, 10 min, 4℃)하여 상등액 (4.0 ml)을 회수하여 조정제 시료를 확보하였다. 이 시료를 단백질 정량후 Taq DNA 중합효소 활성 비교 실험에 사용하였다.

< 실험예 4> Taq DNA 중합효소의 고순도 정제

4.5 L 배양액에서 확보된 균체 현탁액으로부터 Taq DNA 중합효소를 고순도로 정제하였다. 초음파 파쇄기 (13 mm tip, amplitude 90%, 5.5 s/9.9 s (on/off), 1 h)를 이용하여 균체 현탁액 (100 ml)의 균체를 파쇄한 후 원심분리 (10,000 x g, 10 min, 4℃)하여 상등액을 회수하였다. 여기에 5%가 되게 스트렙토마이신 황산염 (streptomycin sulfate)을 첨가하여 30분 동안 교반 후 원심분리 (10,000 x g, 10 min, 4℃)하여 상등액을 회수하였다. 이 액을 75℃에서 20분간 열처리하고 다시 시료를 원심분리 (10,000 x g, 10 min, 4℃)하여 얻어진 상등액을 0.45 μm 주사기 필터 (Sartorius)로 여과하였다. 여과 용액에 Taq DNA 중합효소 단백질 석출을 위해 포화도 65%가 되도록 황산 암모늄을 첨가하여 4℃에서 한 시간 지난 후 침전물을 원심분리 (10,000 x g, 10 min, 4℃)로 회수하여 10 ml의 완충액 A로 현탁하였다. 현탁액을 투석막 (dialysis membrane, Spectra/Por, MWCO: 12-14 KDa)에 넣고, 4 L의 완충액 A에서 하룻밤 투석하여 염을 제거하였다. 제염된 용액을 0.45 μm 주사기 필터 (Sartorius)로 여과하여 FPLC (AKTA, UPC-900)로 정제하였다. 컬럼 크로마토그래피는 DEAE sephacel (30 ml in XK26/20 column, GE healthcare), SP sepharose (20 ml in XK16/20 column, GE healthcare), heparin sepharose (10 ml in HR16 column, GE healthcare)의 순으로 진행하였다. 이때 컬럼의 평형화를 위해서 완충액 A (DEAE sephacel과 heparin sepharose 컬럼)와 완충액 B [20 mM HEPES(pH 6.9), 1 mM EDTA, 1 uM PMSF] (Q sepharose 컬럼)를 사용하고, 용리는 1 M KCl이 든 A와 B 완충액을 사용하여 농도구배로 단백질을 용리하였다. 각 컬럼 단계에서 Taq DNA 중합효소가 포함된 용리 분획을 회수하여 VIVASPIN20 (MW:50,000)으로 여과공정을 수행하였다. 이 여과공정은 제염 또는 활성시험을 위한 세척과 농축을 위해 수행하며, 각 컬럼에서 회수한 분획을 VIVASPIN20 (MW:50,000)으로 농축한 후 다음 단계의 완충액 A 또는 B 약 15 ml로 2회 반복하여 세척, 여과하였다.

다음 단계 컬럼을 위해서 10 내지 20 ml의 동일 완충액으로 용해하여 다음 컬럼에 적용하거나, 시험에 따라 적절한 용액으로 용해하여 시험하였다.

얻어진 각 정제단계 또는 최종 정제된 Taq DNA 중합효소는 SDS-PAGE (12% polyacryl amide gel electrophoresis) 와 Bradford assay reagent (Sigma사)를 사용하여 소 혈청 알부민을 표준 단백질로 하여 정량, 비교하였다.

조정제 또는 정제된 Taq DNA 중합효소는 최종농도 50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 0.5 mM EDTA, 1 μM PMSF, 4 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 50% 글리세롤을 포함하는 저장완충액과 혼합하여 -70℃에 보관하면서 시험에 사용하였다.

< 실험예 5> 변이체 Taq DNA 중합효소 활성 비교

정량된 단백질 양을 일정하게 맞추어 일반 PCR (conventional PCR) 방법을 수행한 후 전기영동하여 Taq DNA 중합효소 변이체와 아생형 Taq DNA 중합효소의 활성을 비교 측정하였다. 람다 파지 DNA (10 pg, 바이오니아)를 주형으로 사용하며, 각 10 pmol의 lambda-F (5'-GGTGCTTTATGACTCTGCCGC)과 lambda-R (5'- AGCGCCCTTCCTGGTATGC)를 프라이머로 사용하고, PCR 완충액 [10 mM Tris-Cl (pH 9.0), 1.5 mM MgCl₂, 40 mM KCl, 0.6 M Methyl-α-D-glucopyranoside, 0.03 % tween 20, 3 mM dNTP]에서 94℃ (5분) 후, 94℃ (30초)-55℃ (30초)-72℃ (30초)를 30회 반복 반응하고 72℃ (7분) 반응 후 종료하여 DNA 증폭 산물(500 bp)의 생성을 전기영동으로 확인하였다.

< 실험예 6> 구분성 확인을 위한 실시간 PCR

아래 실시예에 별도 언급이 없을 경우 본 발명의 실시예에 사용한 PCR의 조성물 및 조건은 아래와 같다.

PCR에 사용한 주형 DNA는 각 목적 검출 유전자 BRAF c.1799 rc. A>T (p.V600E) (이하 BRAF-V600E)의 정상 (서열번호 3) 또는 돌연변이 서열(서열번호 4) 및 EGFR c.2369 C>T (p.T790M) (이하 BRAF-T790M) 정상 (서열번호 5) 또는 돌연변이 서열 (서열번호 6)의 DNA를 합성하여 pTOP Blunt V2 (Enzynomics, Korea)에 삽입, 제작하여 대장균에 형질전환한 후, 배양하여 정제된 플라스미드 DNA를 제한효소로 절단, 정제 후 정량하여 2 x 10⁷ copy/reaction이 되도록 하여 사용하였다.

서열번호 3 (BRAF V600 정상 (rc))

AAAATATTCGTTTTAAGGGTAAAGAAAAAAGTTAAAAAATCTATTTACATAAAAAATAAGAACACTGATTTTTGTGAATACTGGGAACTATGAAAATACTATAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAGGGCCAAAAATTTAATCAGTGGAAAAATAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTC A CTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGGAAAACAGTAGATCTCATTTTCCTATCAGAGCAAGCATTATGAAGAGTTTAGGTAAGAGATCTAATTTCTATAATTCTGTAATATAATATTCTTTAAAACATAGTACTTCATCTTTCCTCTTAGAGTCAATAAGTATGTCTAAAACAATGATTAGTTCTATTTAGCCTATATA

서열번호 4 (BRAF V600E 돌연변이 (rc))

AAAATATTCGTTTTAAGGGTAAAGAAAAAAGTTAAAAAATCTATTTACATAAAAAATAAGAACACTGATTTTTGTGAATACTGGGAACTATGAAAATACTATAGTTGAGACCTTCAATGACTTTCTAGTAACTCAGCAGCATCTCAGGGCCAAAAATTTAATCAGTGGAAAAATAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTC T CTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGGAAAACAGTAGATCTCATTTTCCTATCAGAGCAAGCATTATGAAGAGTTTAGGTAAGAGATCTAATTTCTATAATTCTGTAATATAATATTCTTTAAAACATAGTACTTCATCTTTCCTCTTAGAGTCAATAAGTATGTCTAAAACAATGATTAGTTCTATTTAGCCTATATA

서열번호 5 (EGFR T790 정상)

CACGCACACACATATCCCCATGGCAAACTCTTGCTATCCCAGGAGCGCAGACCGCATGTGAGGATCCTGGCTCCTTATCTCCCCTCCCCGTATCTCCCTTCCCTGATTACCTTTGCGATCTGCACACACCAGTTGAGCAGGTACTGGGAGCCAATATTGTCTTTGTGTTCCCGGACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTGC G TGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGCAGGCGGCACACGTGGGGGTTGTCCACGCTGGCCATCACGTAGGCTTCCTGGAGGGAGGGAGAGGCACGTCAGTGTGGCTTCGCATGGTGGCCAGAAGGAGGGGCACATGGACCCCTTCCAGGTGAAGACGCATGAATGCGATCTTGAGTTTCAAAATACGTACTCATGGAGGAAAAGCTGTGCCTGCAAAAGACCTAGC

서열번호 6 (EGFR T790M 돌연변이)

CACGCACACACATATCCCCATGGCAAACTCTTGCTATCCCAGGAGCGCAGACCGCATGTGAGGATCCTGGCTCCTTATCTCCCCTCCCCGTATCTCCCTTCCCTGATTACCTTTGCGATCTGCACACACCAGTTGAGCAGGTACTGGGAGCCAATATTGTCTTTGTGTTCCCGGACATAGTCCAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAGCTGC A TGATGAGCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGATGCCCAGCAGGCGGCACACGTGGGGGTTGTCCACGCTGGCCATCACGTAGGCTTCCTGGAGGGAGGGAGAGGCACGTCAGTGTGGCTTCGCATGGTGGCCAGAAGGAGGGGCACATGGACCCCTTCCAGGTGAAGACGCATGAATGCGATCTTGAGTTTCAAAATACGTACTCATGGAGGAAAAGCTGTGCCTGCAAAAGACCTAGC

BRAF-V600E 변이의 구분성을 확인하기 위해서 전방 프라이머 5’- GGGACCCACTCCATCGAGATTTCT-3' (BRAF-AS-F; 서열번호 94); 후방 프라이머 5'- AACTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAG-3' (BRAF-R; 서열번호 95); 시그널 프로브 5’-FAM - CTGTGAGGTCTTCATGAAG - BHQ1-3' (BRAF-P; 서열번호 96)를 사용하고, EGFR- T790M 변이 구분성을 확인하기 위해서는 전방 프라이머 5'-AGCCGAAGGGCATGAGCTGCA-3' (EGFR-AS-F; 서열번호 97) 또는 5'-AGCCGAAGGGCATGAGCTACA-3' (EGFR-ARMS-F; 서열번호 98); 후방 프라이머 5’-AGTGTGGACAACCCCCACGTGTGC-3' (EGFR-R; 서열번호 99); 시그널 프로브 5’-FAM- CGGTGGAGGTGAGGCAGATG-BHQ1-3' (EGFR-P; 서열번호 100)를 사용하였다. 특히 전방 프라이머는 각 목적 검출 유전자 BRAF-T790M과 BRAF-V600E 돌연변이 검출을 위해 최종 3' 말단 염기가 변이유전자와 매치되거나 (matched) 또는 정상 유전자와 최종 말단 염기가 미스매치되도록 (mismatched) 설계된 AS 프라이머 혹은 ARMS 프라이머이다. 각 프라이머는 10 pmol/reaction, 프로브는 20 pmol/reaction을 사용하였다.

BRAF-V600E 구분을 위한 PCR은 95℃ (5분) 후, 95℃, 30초 - 55℃ (1분)으로 50회 반복하여 수행하며, EGFR-T790M 구분을 위한 PCR은 95℃ (5분) 후, 95℃ (30초) - 55℃ (40초)로 50회 반복하여 수행하였다.

PCR 수행시 완충용액은 10 mM Tris, pH 9.0, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM dNTPs, 60 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄)이 되도록 하여 CFX96 실시간 PCR 탐지 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 PCR을 수행한다. 다만, 실시예에 따라 KCl의 농도를 달리하거나 베타인 등을 첨가하거나, 효소의 종류 (야생형인지 또는 변이체 Taq DNA 중합효소인지에 따라) 또는 효소의 양을 달리하여 사용한다. 발명된 DNA 중합효소 변이체의 매치와 미스매치의 구분성은 ΔCt (ΔCt= 주형 변이체의 Ct 값 - 야생형 주형의 Ct 값)로 평가한다.

< 실시예 1> 대장균 발현 모균주에 따른 Taq DNA 중합효소의 분해

상기 <실험예 2> 와 같이 배양 및 발현된 Taq DNA 중합효소를 <실험예 4>의 DEAE 컬럼 크로마토그래피 정제단계에서 Taq DNA 중합효소를 분획을 완충용액 A로 VIVASPIN20 (MW:50,000)을 이용하여 여과공정을 수행하였다. SDS-PAGE로 단백질을 확인하였다. 이 과정 중에 OmpT 변이주인 E. coli BL21 (DE3)(ompT ^-)에서 발현한 Taq DNA 중합효소의 분해가 일어나지 아니하였으나, OmpT 변이주가 아닌 E. coli MV1184 (ompT ⁺)에서 발현한 야생형 Taq DNA 중합효소 (서열번호 1)가 정제 중에 일부 분해됨을 확인하였다 (도 2의 A). 동일한 과정 수행시, 특히 E. coli MV1184 (ompT ⁺)에서 발현된 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소의 정제 과정 중 더욱 많은 분해가 일어남을 확인하였다 (도 2의 B). 즉, 정제 과정에서의 Taq DNA 중합효소의 분해는 발현 모균주에 따라 명백히 다른 양태를 보였으며, E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소에서 더욱 확연하게 분해 현상이 일어났다.

< 실시예 2> 높은 농도의 KCl에 의한 Taq DNA 중합효소의 분해 억제

이러한 분해는 <실험예 4>의 정제과정 중에 DEAE 컬럼 크로마토그래피에서 수득한 Taq DNA 중합효소를 완충액 A를 사용하여 VIVASPIN20 (MW:50,000)으로 여과하는 세척과정 중에 급격하게 일어났다.

<실험예 2> 또는 <실험예 4>와 같이 배양, 정제된 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소 변이체의 DEAE sephacel 크로마토그래피 정제단계의 분획을 확보하였다. 이 분획 시료 50 μl (약 4 μg 단백질/μl) 을 KCl이 없는 완충액 A만 사용하는 것 (0 M KCl)과 완충액 A에 100, 300, 500 mM의 KCl이 함유된 완충액 A를 사용하는 것으로 나누어 VIVASPIN20 (MW:50,000, 50 ml 용량)으로 여과공정을 수행한 후 각 여과 시험구와 동일한 농도의 KCl이 든 완충액 A로 각각 용해하여 수득하였다. 각 시험구의 용해 Taq DNA 중합효소를 SDS-PAGE로 확인한 결과 0 mM KCl의 경우 분해되어 약 33 KDa과 약 60 KDa의 단백질 단편이 새로 관찰되었고, 원래의 DNA 중합효소는 매우 감소하였다. 그러나, 100 mM 이상의 KCl이 포함된 완충액 A를 사용한 여과의 경우는 미처리구와 차이가 없었다. 이로 보아 Taq DNA 중합효소 분해가 고농도 KCl에 의해 억제되는 것을 알 수 있었다 (도 2의 B).

< 실시예 3> DNA에 의한 Taq DNA 중합효소의 분해 억제

<실험예 2> 또는 <실험예 4>와 같이 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소의 DEAE sephacel 크로마토그래피 정제단계의 분획을 확보하였다. 이 분획 시료 약 50 μl (약 4 μg 단백질/μl)의 시료에 DEAE 컬럼 크로마토그래피에서 Taq DNA 중합효소가 용리된 후 수득한 분획 (BP)을 2배 부피 (100 μl)로 혼합한 후 <실험예 4> 와 같이 여과공정을 수행하였다. 완충액 A로 VIVASPIN20 (MW:50,000)을 사용하여 여과공정을 수행한 후 완충액 A 250 ul로 녹여 회수한 시료를 SDS-PAGE로 단백질의 분해를 확인하였다. 그 결과 놀랍게도 BP를 혼합하지 않은 시료는 Taq DNA 중합효소의 분해가 일어났으나, BP를 혼합한 시료는 분해가 일어나지 않았다. 이때 사용한 BP는 Bradford 측정 및 SDS-PAGE 분석 결과, 단백질이 거의 포함되어 있지 않았으나, 핵산 (~50 ng/μl)이 다량 포함되어 있었다. 이로 유추해 볼 때 분해의 억제인자는 미지의 단백질이라기보다는 DNA와 같은 핵산으로 추정된다.

이러한 결과에 따라, 상기 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소 변이체의 DEAE sephacel 크로마토그래피 정제단계의 분획 50 ul에 각 0.4, 2.0, 10. 또는 50 μg DNA (salmon sperm nucleic acid, Sigma)를 혼합하여 준비한 시료로 상기와 동일한 여과공정을 완충액 A로 수행하였다. 그 결과 2.0 μg 이상의 DNA를 처리한 시험구에서는 BP 처리구와 같이 Taq DNA 중합효소가 분해되지 아니하였다. 이는 명백히 핵산이 단백질 분해효소에 의한 Taq DNA 중합효소의 분해를 억제하는 것이다. 즉, 이러한 결과들은 Taq DNA 중합효소의 분해 부위가 DNA와의 결합에 중요한 부위 또는 DNA와 결합하는 부위와 연관되어 있음을 의미한다.

< 실시예 4> Taq DNA 중합효소의 분해 위치의 결정

<실험예 2> 또는 <실험예 4>와 같이 배양, 정제된 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소 변이체의 DEAE 컬럼크로마토그래피 단계에서 수득한 시료 (순도 96% 이상)를 완충액 A로 <실혐예 4>의 여과공정을 세척하고, 완충액 A로 회수하여 ~10℃에서 완전히 분해가 일어나도록 하였다 (도 3). 분해된 산물을 SDS-PAGE로 확인하였을 때 큰 절편(large fragment)은 약 60 KDa, 작은 절편(small fragment)은 약 33 KDa 크기였다.

두 개의 절편이 전기영동된 SDS-PAGE 젤을 잘라 단백질 절편을 회수하여 아미노산 서열을 분석한 결과, 명확한 절단의 위치는 특정하지 못했으나 60 KDa 단편이 Taq 중합효소의 N-말단 단편으로, 33 KDa 단편이 C-말단 단편으로 확인되었으며, 이를 토대로 좀 더 정확한 절단위치를 확인하기 위하여 33 KDa의 N-말단 서열을 분석하였다. 그 결과, 33 KDa 단편의 N 말단 서열이 R-S-T-S… 임을 확인하였다. 이에 상응하는 Taq DNA 중합효소 상의 서열은 R512-S513-T514-S515이며 이에 따라 절단부위가 K511과 R512 사이로 결정되었다 (도 4).

흥미롭게도 절단 위치인 K511과 R512는 연속되는 두 개의 양전하 아미노산으로 구성되어 있다. 이러한 연속되는 양전하 아미노산은 대장균의 막성 프로테아제인 OmpT가 선호하는 절단부위로 잘 알려져 있다. OmpT의 절단부위 양옆에 있는 수 개의 아미노산 잔기 (P6 ~ P'6)에 음전하 아미노산이 존재할 경우 OmpT에 의한 단백질 절단이 현저하게 억제됨이 보고되어 있다 (Hritonenko and Stathopoulos 2007, Schechter and Berger 2012).

상기 실시예 1~3에 따르면, 야생형 Taq DNA 중합효소보다 E507K 변이가 포함된 Taq DNA 중합효소 변이체가 더욱 잘 분해되는데, 이는 OmpT 인식 부위 P5 위치에 해당하는 E507이 음전하 아미노산인 글루탐산 (glu, E)에서 양전하 아미노산인 라이신 (lys, K)으로 바뀌었기 때문으로 보인다. 즉, E507K 변이 Taq DNA 중합효소가 야생형 Taq DNA 중합효소보다 OmpT에 대한 기질 친화력이 커져 인접한 연속되는 양전하 아미노산 잔기인 K511과 R512 [P1(K) - P1'(R)]의 펩타이드 결합이 OmpT 프로테아제에 의해 쉽게 절단된 것으로 설명된다 (도 4).

<실시예 2>에서 높은 농도의 KCl에서 DNA 중합효소의 분해 억제는 KCl에 의한 OmpT 프로테아제 분해활성의 저해로 추정된다.

또한, <실시예 3>에서 DNA에 의해 DNA 중합효소의 분해가 억제되었는데 (도3), 이로 볼 때 OmpT 프로테아제가 인식 (interaction) 또는 절단하는 DNA 중합효소 부위는 DNA와 결합하는 영역임을 알 수 있다. 따라서, 그러므로 Taq DNA 중합효소 절단부위 (511 및 512) 및 그 주변부위는 DNA와 결합하는 영역임을 분명하게 알 수 있다.

< 실시예 5> Taq DNA 중합효소의 구조와 분해 부위

<실시예 4>에서 확인한, 분해가 일어나는 부위인 K511-R512 부위는 Taq DNA 중합효소의 엄지 도메인 (Thumb domain)의 끝 부분에 해당하는 작은 α-나선 구조를 가지는 Ha (487-496) 와 Hb (515-521) 사이의 루프 영역 (497~514) 안에 존재한다 (도 1 및 도 5).

Ha 및 Hb는 패밀리 A DNA 중합효소들 간에 높은 유사성 (homology)을 가지는 보존된 (conserved) 영역이며, 이에 비해 루프 영역은 이들보다 상대적으로 낮은 보존 (less conserved) 영역으로 구성되어 있으나, 매우 흥미롭게도 이 영역에는 음전하 아미노산이 거의 없고 양전하 아미노산이 다수 포함되어 있는 특징이 있다.

Taq DNA 중합효소의 엄지 도메인에 존재하는 Ha (487-496) 와 Hb (515-521) 사이의 루프 구조는 프라이머 영역 근처에 존재하는 것으로 예측하였으나 (Kim, Eom et al. 1995), 이 영역의 중요성은 이 발명 이전까지는 주목받지 못했다. 그 이유는 이 영역이 결정구조 형성시 높은 비정형성 (highly disordered state)을 보여 프라이머를 비롯한 기질과의 구조적 연관성을 명확히 규명하지 못했기 때문이다.

루프 부위의 구조를 단백질 데이터베이스 (PDB, https ://www.rcsb.org/)에 있는 Taq DNA 중합효소와 DNA의 결합의 결정구조 DB인 3KTQ 정보를 사용하여 PyMOL (https://pymol.org/2/) 프로그램으로 면밀히 살펴보았다. 그 결과, 이 루프 구조가 프라이머의 골격 (backbone) 부위를 감싸고 있는 것을 확인하였다 (도 5). 이러한 구조는 DNA에 의한 Taq DNA 중합효소의 분해 억제의 관련성을 잘 보여주는 것이다.

이러한 구조적 특성과 Taq DNA 중합효소의 분해 특성으로 볼 때, 이 루프 영역이 프라이머를 비롯한 DNA 결합과 밀접한 연관성이 있음을 확인할 수 있다.

프라이머와 상호작용하는 Taq DNA 중합효소의 루프 부위는 PCR의 효율성을 높이거나 구분성을 증대하는 효소 변이체의 개발에 매우 중요한 부위가 될 수 있다. 루프 영역의 아미노산은 중요한 변형 (engineering) 대상 영역이 될 수 있으며, 특히 이 영역에 존재하는 하전된 아미노산이 1차적인 변형 대상으로 선택될 수 있다. 루프 영역의 양전하 아미노산은 프라이머의 인산 골격의 음전하와 정전기적 결합 (electrostatic interaction)이 가능하므로 이들의 변이는 Taq DNA 중합효소의 활성 변화, 특히 구분성을 나타내는 중합효소의 특성의 변화를 기대할 수 있다.

< 실시예 6> K511A 변이체 및 R512A 변이체의 제작 및 활성 검증

<실시예 5>의 추론에 따라서 루프 영역 내에 존재하는 여러 아미노산 중에 우선 절단 영역인 양전하 아미노산인 K511과 R512를 변형하여 본 발명의 주요 목적인 구분성과 연관된 변이주의 선별이 가능함을 확인하고자 하였다. K511과 R512를 <실험예 1>의 부위 지시 돌연변이 방법으로 대표적인 비전하 아미노산인 알라닌 (A)으로 변경하여 K511A 및 R512A Taq DNA 중합효소 변이체를 제작하였다. 이 변이체를 E. coli BL21 (DE3)에서 발현하고 각 변이 Taq DNA 중합효소를 조정제하여 PCR로 활성을 측정한 결과 K511A 변이주의 경우 야생형 Taq DNA 중합효소와 비교될 만한 높은 활성을 가지고 있었으나, R512A 변이주의 경우 Taq DNA 중합효소의 활성이 나타나지 않았다. 이 결과를 볼 때 K511보다 R512 위치의 양전하 아미노산인 아르기닌이 프라이머와의 결합에 매우 중요한 역할을 하고 있을 것으로 추정되었다.

< 실시예 7> K511A 변이체의 매치와 미스매치 구분성 확인

<실시예 6>에서 제작한 K511A Taq DNA 중합효소 변이체를 <실험예 2> 및 <실험예 4>와 같이 배양하고 SDS-PAGE에서 95% 이상의 순도로 정제하였다. 정제된 K511A Taq DNA 중합효소에 대해 <실험예 6>과 같이 실시간 PCR을 수행하였다. 수행된 PCR 조건에서 K511A Taq DNA 중합효소는 야생형 Taq DNA 중합효소에 비해 현저히 높은 구분성을 보였다. BRAF-V600E [A와 T 염기 구분 (주형 DNA 서열번호, 5, 6)], EGFR-790M [C 와 T 염기 구분 (주형 DNA 서열번호 3, 4)]을 대상으로 K511A 변이체의 3'-미스매치 구분성을 확인하였다. 그 결과, K511A Taq DNA 중합효소를 사용한 실시간 PCR에서 매치와 미스매치 간에 높은 구분성을 나타내었다 (도 6).

< 실시예 8> K511A Taq을 사용한 PCR에서 KCl과 베타인의 영향

<실시예7>과 같이 정제한 K511A Taq DNA 중합효소 변이체에 KCl 농도를 0 에서 180 mM 까지 점차 높이면서 K511A 변이체의 활성 변화를 야생형 Taq DNA 중합효소와 비교하면서 확인하였다 (표 3). 야생형 Taq DNA 중합효소의 경우 높은 KCl 농도에서도 비교적 높은 활성을 유지하였으며, 효소 농도의 증가에 따라 매치와 미스매치의 구분성 (discrimination)이 증대되는 경향이 있었다. 특히 K511A 변이체의 경우 BRAF-V600E 검출시 KCl 농도 약 80 mM까지, EGFR-T790M 검출시 KCl 농도 약 100 mM까지 활성이 유지되었으며, 두 경우 모두 효소 변이체 농도가 높을수록 구분성이 커지고 낮을수록 구분성이 낮아졌다. 또한, 베타인 (1.25 M)이 첨가된 조건에서는 K511A 변이체의 활성이 조금 더 강해지며, KCl의 농도 범위가 더 확장되어 BRAF-V600E 검출시 KCl 약 100 mM 이상, EGFR-T790M 검출시 KCl 약 120 mM 이상에서도 높은 활성을 나타내었다.

이러한 실시예의 결과들을 볼 때 K511A 변이체를 사용한 매치와 미스매치 PCR의 최적의 구분성을 위한 적절한 KCl 및 베타인의 농도 범위는 표적 주형과 프라이머 또는 PCR 조건에 따라 달라질 수 있다.

BRAF (V600E)	중합효소	Ct value	betaine (-)			Add betaine (1.25 M)
			KCl ( mM )			KCl ( mM )
			60	80	100	60	80	100
	wild type Taq DNA polymerase	Ct of Mt	18.38	18	16.3	17.7	17.56	17.04
		Ct of Wt	25.54	26.62	28.57	22.68	22.97	23.92
		△Ct	7.16	8.62	12.27	4.98	5.41	6.88
	K511A Taq DNA polymerase	Ct of Mt	15.25	14.84	no signal	16.41	15.78	16.57
		Ct of Wt	31.52	33.36	no signal	29.64	30.68	no signal
		△Ct	16.27	18.52	nd	13.23	14.9	>16.57
EGFR (T790M)	중합효소	Ct value	KCl ( mM )			KCl ( mM )
	중합효소	Ct value	80	100	120	80	100	120
	wild type Taq DNA polymerase	Ct of Mt	16.91	16.14	15.82	16.98	16.66	16.98
		Ct of Wt	19.9	20.64	21.14	18.03	18.34	18.71
		△Ct	2.99	4.5	5.32	1.05	1.68	1.73
	K511A Taq DNA polymerase	Ct of Mt	15.6	18.58	no signal	16.19	16.02	16.08
		Ct of Wt	23.96	40.08	no signal	22.48	23.94	25.78
		△Ct	8.36	21.5	nd	6.29	7.92	9.7

위 표에서 Mt는 돌연변이 DNA 주형, Wt는 야생형 DNA주형을 의미함.

< 실시예 9> 루프 영역 하전된 아미노산 변이체 제작 및 그 활성

루프 영역 중 하전된 아미노산인 G499, K505, E507, K508, K511, R512를 선택하여 20개의 아미노산 중 대표적인 아미노산 몇 종류 [A, G, S, K (또는 R), E]로 치환한 다수의 변이체를 만들어 활성과 변이 구분성을 시험하였다. 각 변이체의 제작은 각 변이체 제작용 프라이머 세트를 사용하여 <실험예 1>에 따라 수행하였다.

변이체는 <실험예 2>에 따라 E. coli BL21(DE3)를 모균주로 하여 배양하고 <실험예3>에 따라 조정제 하였으며, 이 조정제 시료에 대해 <실험예 5>에 따라 활성을 시험하였다. 조정제된 각 Taq DNA 중합효소 시료를 브래드포드 분석법으로 정량하여 약 600 ng의 단백질을 시작으로 2배 (300 ng), 4배 (150 ng), 16배(75 ng) 32배 (37.5 ng) 희석하여 PCR 반응을 수행하여 평가하였다 (표 3).

그 결과 K505, K508, K511, R512의 양전하 아미노산을 음전하 아미노산인 글루탐산으로 바꾸었을 때, 즉, K505E, K508E, K511E 및 R512E 변이체의 경우 DNA 중합효소 활성이 나타나지 않았다. 그러나, 같은 양전하 아미노산으로 치환한 경우 중합효소 활성이 여전히 매우 높았다.

이러한 결과를 볼 때, 양전하 아미노산인 라이신 (K)과 아르기닌 (R)이 활성에 매우 중요한 영역임을 확인할 수 있었다. 이러한 중합효소 활성의 소실은 양전하 아미노산이 음전하 아미노산으로 바뀜으로 인하여 루프 부위와 프라이머를 비롯한 DNA 골격의 인산 간의 결합이 약화하여 나타난 결과로 추정된다. 이와 반대로 루프 부위 내의 유일한 음전하 아미노산인 글루탐산 (E507)이 라이신 (K)으로 변경된 변이체는 활성의 감소가 없거나 오히려 활성이 높아지는 것으로 확인되었다. 또한, 비전하 아미노산인 G499를 양전하 아미노산인 아르기닌 (R)으로 치환환 경우에는 높은 효소 활성을 나타내었다.

중합효소	희석배수						활성*	구분성**
중합효소	1	2	4	8	16	32	활성*	구분성**
WT	O	O	O	O	O	O/X	+++
K505G	O	O	X				+	+++
K505I	O	O	0	X			+++	+++
K505L	O	O	O	X			+++	+++
K505M	O	O	O	X			+++	+++
K505W	O	X					+	nd
K505F	O	O	O	O	X		+++	+++
E507A	O	O	O	O	O	X	+++	nd
E507G	O	O	O	O	O	X	+++	+
E507S	O	O	O	O	O	X	+++	nd
E507K	O	O	O	O	O	O/X	+++	-
K508A	O	O	X				+	+++
K508G	O	O	O	X			++	nd
K508S	O	O	X				++	+++
K508R	O	O	O	O	O	O/X	+++	+
K511A	O	O	O	X			++	+++
K511S	O	X					+	nd
K511R	O	O	O	O	X		+++	++
K511M	O	X					+	nd
R512K	O	O	O	O	X		+++	++
R512F	O	X					+	nd
R512I	O	X					+	nd
R512L	O	X					+	nd
R512W	O	X					+	+++
R512Y	O	X					+	nd
CS2-K511A	O	O	X				++	+++

* 1/8 이상 희석에서 활성이 있는 경우, +++; 1/2 이상 1/8 미만 희석에서 활성이 있는 경우, ++; 1/2 미만에서만 활성이 있는 경우, +; 원액에서 활성이 검출되지 않은 경우, - 로 표시하였다.

** 구분성은 ΔΔCt로 나타내었다. ΔΔCt = 야생형 (WT) Taq DNA 중합효소를 사용한 ΔCt (ΔCt= Ct of mutant template - Ct of wild type template) - Taq DNA 중합효소 변이체를 사용한 ΔCt. 시험은 BRAF-V600E의 변이 구분성으로 평가함. ΔΔCt 가 1 미만일 경우, -; 1 이상 ~ 3 미만일 경우 +; 3 이상 ~ 6 미만일 경우, ++; 6 이상일 경우, +++로 표시하였다. 측정되지 않은 경우, nd로 표시하였다.

< 실시예 10> DNA 중합효소 변이체의 실시간 PCR 구분성 비교

<실시예 8>과 같이 조정제된 여러 Taq DNA 중합효소 변이체 중에 활성이 ++ 이상인 Taq DNA 중합효소 변이체 조정제 시료에 대하여 실험예 6에 따라 구분성 확인을 위한 실시간 PCR을 수행하였다. 그 결과를 표 3의 구분성에 표시하였다. 구분성은 ΔΔCt (ΔΔCt = ΔCt of wild type Taq - ΔCt of mutant Taq, ΔCt= Ct of mutant template - Ct of wild type template) 값을 비교하여 평가하였다.

시험 변이체 중에 비교적 높은 구분성이 있는 변이체 (++)는 K511R, R512K이고, 매우 높은 구분성을 나타내는 변이체 (+++)는 K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, K508S, K508R, K511A, R512W였다 (표 3 및 도 7).

실시예 8에서 음전하 아미노산으로의 치환시 변이체들 (K505E, K508E, K511E, R512E)의 활성이 현저히 감소하였으며, 이와 유사하게 음전하 아미노산 제거시 (E507G, E507K, E507Q) 활성은 비교적 높으나 구분성은 크게 높아지지 않았다. 흥미롭게도 양전하 아미노산인 K와 R을 상호 치환할 경우 즉, K511R 및 R512K 변이체는 활성이 유지되었으며, 구분성도 약간 증가하였다. 각 변이체 중에서 높은 구분성을 보이는 변이체는 비하전 아미노산으로 치환된 변이체인 K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, K508S, K511A, R512W 등으로 확인되었다.

이러한 결과로 유추해 볼 때, 본 발명의 집중 변이 영역인 루프 영역의 음전하 아미노산의 존재는 DNA 골격 (backbone)의 인산과 루프 영역과의 결합을 방해하여 활성의 감소를 초래하는 것으로 추론되며, 루프 영역의 양전하 아미노산의 존재는 단백질과 프라이머의 견고한 결합을 유도하여 안정적인 활성의 유지에 도움을 주는 것으로 판단된다. 루프 영역의 양전하 아미노산을 비전하 아미노산으로 치환하는 경우 활성의 소실은 크지 않고, 구분성을 높이는 것으로 확인된다.

< 실시예 11> K511A 변이체에 추가변이 도입변이체의 구분성 확인

K511A Taq DNA 중합효소 변이체에 추가로 저온에서 활성이 억제되는 돌연변이체 (cold sensitive mutant)로 보고된 부위인 I707L 및 E708K 변이를 도입한 변이주 CS2-K511A를 <실시예 6>의 방법에 따라 제작하였다. <실험예 2> 및 <실험예 4>와 같이 배양하고 SDS-PAGE에서 95% 이상의 순도로 정제하였다. 정제된 CS2-K511A Taq DNA 중합효소에 대해 <실험예 6>과 같이 실시간 PCR을 수행하였다. 단, 이때 전방 프라이머는 EGFR-ARMS-F를 사용하였다. 수행된 PCR 조건에서 CS2-K511A Taq DNA 중합효소는 야생형 Taq DNA 중합효소에 비해 실시간 PCR에서 매치와 미스매치 간에 매우 높은 구분성을 나타내었다 (표 3 및 도 8).

<110> Genotech Corporation <120> DNA polymerase variants that show high discrimination against genetic variation <130> Genotech-DNApolymeraseVariants-200529 <160> 100 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 832 <212> PRT <213> Thermus Aquaticus <400> 1 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 <210> 2 <211> 834 <212> PRT <213> Thermus sp. <400> 2 Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe 50 55 60 Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln 85 90 95 Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu 100 105 110 Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys 115 120 125 Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg 130 135 140 Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu 145 150 155 160 Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys 165 170 175 Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp 180 185 190 Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu 195 200 205 Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg 210 215 220 Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp 225 230 235 240 Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu 245 250 255 Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly 275 280 285 Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro 290 295 300 Glu Gly Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp 305 310 315 320 Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Lys Glu Gly Arg Val His Arg 325 330 335 Ala Lys Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly 340 345 350 Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Asp 355 360 365 Leu Ala Pro Ser Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro 370 375 380 Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp 385 390 395 400 Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ala Glu Arg Leu Gln Gln 405 410 415 Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gly Glu Glu Lys Leu Leu Trp Leu Tyr 420 425 430 Gln Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala 435 440 445 Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Leu Glu 450 455 460 Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala 465 470 475 480 Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu 485 490 495 Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gln Lys Thr Gly 500 505 510 Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His 515 520 525 Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys 530 535 540 Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Gly Leu Val His Pro Arg Thr Gly 545 550 555 560 Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu 565 570 575 Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Thr Pro Leu 580 585 590 Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu 595 600 605 Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu 610 615 620 Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Lys Asp Ile 625 630 635 640 His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Ser Pro Glu Ala Val 645 650 655 Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu 660 665 670 Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr 675 680 685 Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys 690 695 700 Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly 705 710 715 720 Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn 725 730 735 Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn 740 745 750 Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val 755 760 765 Lys Leu Phe Pro His Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln 770 775 780 Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu 785 790 795 800 Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala 805 810 815 Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala 820 825 830 Lys Gly <210> 3 <211> 501 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 3 aaaatattcg ttttaagggt aaagaaaaaa gttaaaaaat ctatttacat aaaaaataag 60 aacactgatt tttgtgaata ctgggaacta tgaaaatact atagttgaga ccttcaatga 120 ctttctagta actcagcagc atctcagggc caaaaattta atcagtggaa aaatagcctc 180 aattcttacc atccacaaaa tggatccaga caactgttca aactgatggg acccactcca 240 tcgagatttc actgtagcta gaccaaaatc acctattttt actgtgaggt cttcatgaag 300 aaatatatct gaggtgtagt aagtaaagga aaacagtaga tctcattttc ctatcagagc 360 aagcattatg aagagtttag gtaagagatc taatttctat aattctgtaa tataatattc 420 tttaaaacat agtacttcat ctttcctctt agagtcaata agtatgtcta aaacaatgat 480 tagttctatt tagcctatat a 501 <210> 4 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 aaaatattcg ttttaagggt aaagaaaaaa gttaaaaaat 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cagaaggagg ggcacatgga 360 ccccttccag gtgaagacgc atgaatgcga tcttgagttt caaaatacgt actcatggag 420 gaaaagctgt gcctgcaaaa gacctagc 448 <210> 6 <211> 448 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cacgcacaca catatcccca tggcaaactc ttgctatccc aggagcgcag accgcatgtg 60 aggatcctgg ctccttatct cccctccccg tatctccctt ccctgattac ctttgcgatc 120 tgcacacacc agttgagcag gtactgggag ccaatattgt ctttgtgttc ccggacatag 180 tccaggaggc agccgaaggg catgagctgc atgatgagct gcacggtgga ggtgaggcag 240 atgcccagca ggcggcacac gtgggggttg tccacgctgg ccatcacgta ggcttcctgg 300 agggagggag aggcacgtca gtgtggcttc gcatggtggc cagaaggagg ggcacatgga 360 ccccttccag gtgaagacgc atgaatgcga tcttgagttt caaaatacgt actcatggag 420 gaaaagctgt gcctgcaaaa gacctagc 448 <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Thermus Aquaticus <400> 7 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 1 5 10 15 Ser Thr <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tttgacgagc taagacttcc cgccatcggc 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gccgatggcg ggaagtctta gctcgtcaaa 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cccgccatcg gcgctacgga gaagaccggc 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gccggtcttc tccgtagcgc cgatggcggg 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cccgccatcg gcgaaacgga gaagaccggc 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gccggtcttc tccgtttcgc cgatggcggg 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cccgccatcg gctctacgga gaagaccggc 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gccggtcttc tccgtagagc cgatggcggg 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cccgccatcg gcggtacgga gaagaccggc 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gccggtcttc tccgtaccgc cgatggcggg 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cccgccatcg gcagaacgga gaagaccggc 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gccggtcttc tccgttctgc cgatggcggg 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cccgccatcg gcttcacgga gaagaccggc 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gccggtcttc tccgtgaagc cgatggcggg 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cccgccatcg gcattacgga gaagaccggc 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gccggtcttc tccgtaatgc cgatggcggg 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cccgccatcg gccttacgga gaagaccggc 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gccggtcttc tccgtaaggc cgatggcggg 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 cccgccatcg gcatgacgga gaagaccggc 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gccggtcttc tccgtcatgc cgatggcggg 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 cccgccatcg gctggacgga gaagaccggc 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gccggtcttc tccgtccagc cgatggcggg 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 atcggcaaga cggctaagac cggcaagcgc 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gcgcttgccg gtcttagccg tcttgccgat 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 atcggcaaga cgaagaagac cggcaagcgc 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gcgcttgccg gtcttcttcg tcttgccgat 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 atcggcaaga cgtctaagac cggcaagcgc 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gcgcttgccg gtcttagacg tcttgccgat 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 atcggcaaga cgggtaagac cggcaagcgc 30 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gcgcttgccg gtcttacccg tcttgccgat 30 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 atcggcaaga cgcagaagac cggcaagcgc 30 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gcgcttgccg gtcttctgcg tcttgccgat 30 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 gagaagaccg gcgctcgctc caccagcgcc 30 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 ggcgctggtg gagcgagcgc cggtcttctc 30 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gagaagaccg gcagacgctc caccagcgcc 30 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 ggcgctggtg gagcgtctgc cggtcttctc 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gagaagaccg gcgaacgctc caccagcgcc 30 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 ggcgctggtg gagcgttcgc cggtcttctc 30 <210> 46 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 gagaagaccg gctctcgctc caccagcgcc 30 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 ggcgctggtg gagcgagagc cggtcttctc 30 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 gagaagaccg gcggtcgctc caccagcgcc 30 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 ggcgctggtg gagcgaccgc cggtcttctc 30 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gagaagaccg gcgttcgctc caccagcgcc 30 <210> 51 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 ggcgctggtg gagcgaacgc cggtcttctc 30 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 gagaagaccg gcattcgctc caccagcgcc 30 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 ggcgctggtg gagcgaatgc cggtcttctc 30 <210> 54 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gagaagaccg gccttcgctc caccagcgcc 30 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 ggcgctggtg gagcgaaggc cggtcttctc 30 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 gagaagaccg gcatgcgctc caccagcgcc 30 <210> 57 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 ggcgctggtg gagcgcatgc cggtcttctc 30 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 gagaagaccg gcttccgctc caccagcgcc 30 <210> 59 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 ggcgctggtg gagcggaagc cggtcttctc 30 <210> 60 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 gagaagaccg gctatcgctc caccagcgcc 30 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 ggcgctggtg gagcgatagc cggtcttctc 30 <210> 62 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 gagaagaccg gctggcgctc caccagcgcc 30 <210> 63 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 ggcgctggtg gagcgccagc cggtcttctc 30 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 aagaccggca aggcctccac cagcgccgcc 30 <210> 65 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 ggcggcgctg gtggaggcct tgccggtctt 30 <210> 66 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 aagaccggca aggaatccac cagcgccgcc 30 <210> 67 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 ggcggcgctg gtggattcct tgccggtctt 30 <210> 68 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 aagaccggca agtcttccac cagcgccgcc 30 <210> 69 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 ggcggcgctg gtggaagact tgccggtctt 30 <210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 aagaccggca agggttccac cagcgccgcc 30 <210> 71 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 ggcggcgctg gtggaaccct tgccggtctt 30 <210> 72 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 aagaccggca agaagtccac cagcgccgcc 30 <210> 73 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 ggcggcgctg gtggacttct tgccggtctt 30 <210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 aagaccggca agttctccac cagcgccgcc 30 <210> 75 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 ggcggcgctg gtggagaact tgccggtctt 30 <210> 76 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 aagaccggca agatttccac cagcgccgcc 30 <210> 77 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 ggcggcgctg gtggaaatct tgccggtctt 30 <210> 78 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 aagaccggca agctttccac cagcgccgcc 30 <210> 79 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 ggcggcgctg gtggaaagct tgccggtctt 30 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 aagaccggca agatgtccac cagcgccgcc 30 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 ggcggcgctg gtggacatct tgccggtctt 30 <210> 82 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 aagaccggca aggtttccac cagcgccgcc 30 <210> 83 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 ggcggcgctg gtggaaacct tgccggtctt 30 <210> 84 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 aagaccggca agtggtccac cagcgccgcc 30 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 ggcggcgctg gtggaccact tgccggtctt 30 <210> 86 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 aagaccggca agtattccac cagcgccgcc 30 <210> 87 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 ggcggcgctg gtggaatact tgccggtctt 30 <210> 88 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 aagaccggca agcactccac cagcgccgcc 30 <210> 89 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 ggcggcgctg gtggagtgct tgccggtctt 30 <210> 90 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 gtgcgggcct ggcttgagaa gaccctggag 30 <210> 91 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 ctccagggtc ttctcaagcc aggcccgcac 30 <210> 92 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 cgggcctgga ttaagaagac cctggaggag 30 <210> 93 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 93 ctcctccagg gtcttcttaa tccaggcccg 30 <210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 94 gggacccact ccatcgagat ttct 24 <210> 95 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 95 aactcttcat aatgcttgct ctgatag 27 <210> 96 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 96 ctgtgaggtc ttcatgaag 19 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 agccgaaggg catgagctgc a 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 agccgaaggg catgagctac a 21 <210> 99 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 agtgtggaca acccccacgt gtgc 24 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 100 cggtggaggt gaggcagatg 20

Claims

서열번호 1로 구성된 Taq DNA 중합효소와 80% 이상의 상동성을 가지는 DNA 중합효소 또는 이들의 클레나우 단편 (Klenow fragment)에서 Ha 및 Hb 서열 사이의 루프 영역의 아미노산이 한 개 이상 변이되고, 야생형 DNA 중합효소와 비교하여 중합 활성은 유지되며, 대립 유전자 또는 유전자 변이 구분성이 향상된 DNA 중합효소 변이체.
청구항 1에 있어서,
상기 루프 영역은 서열번호 1의 497~514 위치 또는 이에 상응하는 위치인, DNA 중합효소 변이체.
청구항 1에 있어서,
상기 변이는 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실인, DNA 중합효소 변이체.
청구항 1에 있어서,
상기 80% 이상의 상동성을 가지는 DNA 중합효소는 서열번호 1로 구성된 Taq DNA 중합효소와 90% 이상의 상동성을 가지는, DNA 중합효소 변이체.
청구항 1에 있어서,
상기 80% 이상의 상동성을 가지는 DNA 중합효소는 서열번호 1로 구성된 Taq DNA 중합효소와 95% 이상의 상동성을 가지는, DNA 중합효소 변이체.
청구항 1에 있어서,
상기 변이는 서열번호 1의 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 505, 506, 509, 510, 511, 512, 513, 514 또는 이에 상응하는 위치로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 일어나는, DNA 중합효소 변이체.
청구항 6에 있어서,
497, 505, 511, 512 위치 또는 이에 상응하는 위치에 존재하는 하전된 아미노산 중 하나 이상이 변이된, DNA 중합효소 변이체.
청구항 6에 있어서,
505, 511 및 512 위치 또는 이에 상응하는 위치에 존재하는 양전하로 하전된 아미노산 중 하나 이상이 변이된, DNA 중합효소 변이체.
청구항 6에 있어서,
504, 507, 508 위치 또는 이에 상응하는 위치 중 하나 이상의 아미노산이 더 변이된, DNA 중합효소 변이체.
청구항 6에 있어서,
G499R, K505G, K505I, K505L, K505M, K505F, E507A, E507G, E507S, E507R, E507Q, K508A, K508G, K508S, K511A, K511S, R512K, R512W에서 선택되는 하나 이상의 변이 또는 이에 상응하는 위치의 하나 이상의 변이가 포함된, DNA 중합효소 변이체.
청구항 6에 있어서,
I707L 및 E708K 중 하나 이상의 변이 또는 이에 상응하는 위치의 하나 이상의 변이가 더 포함된, DNA 중합효소 변이체.
청구항 6에 있어서,
K511A, I707L 및 E708K의 세 아미노산 변이 또는 이에 상응하는 위치의 변이를 포함하는 DNA 중합효소 변이체.
청구항 1 내지 청구항 12 중 선택된 어느 한 항의 DNA 중합효소 변이체를 이용하여 대립 유전자 또는 유전자 변이 구분성이 개선된 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 방법.
청구항 1 내지 청구항 12 중 선택된 어느 한 항의 DNA 중합효소 변이체가 포함된 중합효소 연쇄반응 킷트.